CN109104855A - 菠菜中非r基因介导的抗性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含位于染色体1上的命名为p10的霜霉病抗性贡献基因座的菠菜植物，并且其中所述基因座在纯合存在时提供对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性，并且其中p10基因座是如在从其代表性样品以保藏号42554保藏于NCIMB的种子生长的植物中发现的。在保藏的种子中，p10基因座位于具有SEQ ID No.7或8的标记SO00979和具有SEQ ID No.5或6的标记SO01770之间并且与如表1中以粗体和下划线所示的SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.3中的SNP连锁。为了具有抗性，菠菜植物以纯合状态包含p10基因座。

Description

菠菜中非R基因介导的抗性
发明领域
本发明涉及对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)具有抗性的植物和植物部分，特别是菠菜植物(Spinacia oleracea L.)。本发明还涉及能够产生菠菜霜霉菌抗性植物的种子。本发明进一步涉及获得具有改变的基因型的所述植物及其种子的方法，所述植物对菠菜霜霉菌具有抗性。
发明背景
菠菜(Spinacia oleracea L.)是来自苋科(Amaranthaceae)的开花植物，其生长作为蔬菜。菠菜的可食用部分是营养生长阶段的叶和叶柄。菠菜以松散、成束、预包装、罐装或冷冻的形式出售。菠菜有三种基本类型：工业菠菜、新鲜菠菜和亚洲菠菜。在这些类型中，可以识别三种不同的叶类型，即皱叶(savoy)、半皱叶和光滑类型。皱叶具有深绿色、褶皱和卷曲的叶。扁平或光滑叶的菠菜具有宽而光滑的叶。半皱叶是一种略带褶皱的叶的品种。主要销售的菠菜是幼叶(baby-leaf)。菠菜幼叶通常是扁叶类型，并且通常收获的叶不长于约8厘米。这些柔嫩的甜叶以松散形式出售而不是成束出售。它们经常用于沙拉，但也可以轻微烹饪。
霜霉病(在菠菜中由卵菌真菌菠菜霜霉菌(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)(以前称为P.effusa)引起)是菠菜种植者的主要威胁，因为它影响收获的植物部分，即叶。感染使叶不适于销售和食用，因为它本身表现为在较老的叶上的黄色病斑和在远轴叶上的灰色真菌生长的表型。感染可以非常迅速地传播，并且可以在温室和土壤栽培中均发生。菠菜霜霉菌孢子的最佳形成和萌发温度是9至12℃，并且它受到高相对湿度的促进。当孢子沉积在潮湿的叶表面上时，它们可以容易地萌发并感染叶。在8至20℃和≥80％相对湿度真菌生长是最佳的，并且在感染后6至13天内可以观察到菌丝体生长。菠菜霜霉菌的卵孢子可以在土壤中存活长达3年，或作为种子或活植物中的菌丝体存活。
近年来，已经鉴定了各种抗性基因或R基因，其为菠菜植物提供抗霜霉病的抗性，如例如US2013230635、WO2015036378、WO2015036469和EP2848114中所描述的。植物和病原体的共同进化导致了一场军备竞赛，其中R-基因介导的抗性可以由于病原体以不同的方式与替代的宿主靶标或相同的靶标相互作用和修饰其的能力而被破坏。在任何情况下，识别都会丢失，并且可以成功地建立感染，从而导致疾病。为了在植物中重建抗性，必须引入新的R基因，其能够识别替代致病因子的作用模式。
这表明这种R基因的持久性相对较低，特别是因为在过去几年中，新种类的菠菜霜霉病的发展迅速增加。
到目前为止，已经正式确定并鉴定了菠菜霜霉病(Pfs)的16种致病种，并且在该领域中观察到许多新的候选物。16种官方认可的菠菜霜霉菌(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)种类被命名为Pfs:1至Pfs:16(Irish等人Phtypathol.Vol.98pg.894-900,2008；Plantum NL(Dutch association for breeding,tissue culture,productionand trade of seed and young plants)press release,“Benoeming van Pfs:14,eennieuwe fysio van valse meeldauw in spinazie”,September 19,2012；Report JimCorrel(Univ.Arkansas)and Steven Koike(UC Cooperative Extension,MontereyCounty),“Race Pfs:14–Another new race of the spinach downy mildew pathogen”,September 18,2012；Plantum NL press release,“Denomination of Pfs:15,a new raceof downy mildew in spinach”,September 2,2014,Plantum NL press release,“Denomination of Pfs:16,a new race of downy mildew in spinach,March 15,2016)。在1990年至2014年间鉴定了种类4至15，而最近才发现了另一种新的霜霉菌分离株，称为UA201519B，随后由International Working Group on Peronospora(IWGP)正式命名为Pfs:16(Plantum NL(Dutch association for breeding,tissue culture,productionand trade of seed and young plants)press release,“Denomination of Pfs:16,anew race of downy mildew in spinach”,March 15,2016)。所有16个官方认可的Pfs种类都可以从Department of Plant Pathology,University of Arkansas,Fayetteville,AR72701,USA以及NAK Tuinbouw,Sotaweg 22,2371GD Roelofarendsveen,the Netherlands公开获得。
鉴于R基因介导的抗性提供相对低持久性的抗性以及霜霉病病原体正在进化并更快地适应这些R基因的事实，本领域需要可用的与R基因介导的抗性相比更持久的抗性来源。
除了R介导的防御机制之外，植物可以表现出更基础的抗性形式，其可以防止病原体感染植物。这种非R基因介导的抗性形式可以被认为是一种极其成功的防御形式，事实上它对大多数植物病原体相互作用是有效的。由于这种抗性不是基于R基因已知的宿主和病原体之间的相互作用和识别的类型，因此这种防御机制提供了针对比通常对R基因预期的更广谱的病原体种类的抗性。
发明概述
鉴于非R基因介导的抗性的显著优点，本发明的目的是提供一种抗霜霉病的菠菜植物，其中抗性是由赋予非R基因介导的抗性的染色体区间引起的。
在导致本发明的研究中，开发了新的菠菜植物，其在其基因组中具有能够提供非R基因介导的抗霜霉病抗性的基因座。提供广谱抗性的本发明的基因座被命名为p10基因座。
在本发明的上下文中由p10基因座赋予的广谱抗性定义为提供对霜霉病(菠菜霜霉菌)的以下种类的至少中等抗性：Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16。
赋予菠菜植物广谱抗性的p10基因座可通过从种子基因渗入获得，该种子的代表性样品以NCIMB保藏号42554保藏于NCIMB。
因此，本发明涉及包含p10基因座的菠菜植物，其在纯合存在时提供对菠菜霜霉菌种类Pfs:1至Pfs:16的至少中等抗性，并且其中该基因座是如在从其代表性样品以保藏号42554保藏于NCIMB的种子生长的植物中发现的。
携带命名为p10的新抗性来源的本发明的菠菜植物可与包含一种或多种显性R基因的其他菠菜植物杂交。以这种方式获得甚至更强的抗性并且减缓新抗性破坏霜霉病菌株的出现，从而增加显性R基因的持久性。因此，本发明涉及一种对菠菜霜霉菌种类Pfs:1至Pfs:16具有完全抗性的菠菜植物。这种菠菜植物适当地包含p10基因座和一种或多种R基因。
本发明的菠菜植物可通过使第一菠菜植物与第二菠菜植物杂交获得，其中所述菠菜植物中的一种或两种包含本发明的p10抗性基因座，以获得包含p10基因座的F1植物和任选更多代的菠菜植物。
详细描述
因此，本发明涉及一种菠菜植物，其包含对至少官方认可的菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的非R基因介导的广谱抗性，其中该抗性由命名为p10的新基因座引起，并且其中由p10基因座引起的抗性至少是中等水平。
与由显性R基因介导的抗性相反，本发明的p10基因座仅在纯合存在时提供抗性。因此，p10基因座赋予的抗性以适合隐性遗传的模式转移。由于其遗传性，p10抗性被认为是非R基因介导的抗性。此外，由于p10基因座提供的抗性分布，该抗性被认为是广谱抗性。
因此，在一个具体实施方案中，p10基因座是纯合存在的，由此提供了对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性。
在本发明的上下文中，中等抗性定义为在如本文所述的差异幼苗测试中仅显示萎黄病的症状或仅在子叶的尖端上发生孢子形成的植物。
此外，在本发明的上下文中，完全抗性定义为在本文所述的幼苗测试中未显示症状的植物。完全抗性也称为完整抗性。
可以使用如本文所述的幼苗测试来检测植物中p10基因座的存在。如实施例所示，抗性表型可在疾病抗性测定(例如本文所述的幼苗测试)中评估。
幼苗测试定义为其中将菠菜植物种植在含有生长培养基的托盘中并且任选在幼苗出苗后每周施肥两次的测试。在第一个真叶阶段用孢子囊悬浮液接种植物，所述孢子囊悬浮液具有约2.5×105/ml浓度的待测试的菠菜霜霉菌的致病种类或分离株之一。将接种的植物置于18℃、100％相对湿度的露水室中24小时，然后移至18℃的生长室中于12小时光周期下持续6天。6天后，将植物返回露水室24小时以诱导孢子形成，随后对疾病反应进行评分。优选地，每个种类测试30株植物。
进一步发现，本发明的p10基因座位于染色体1上，并且侧翼为标记SO01770和SO00979。
因此，本发明涉及包含p10基因座的菠菜植物，其中所述基因座位于染色体1上并且侧翼为标记SO01770和SO00979。
本发明的p10基因座位于染色体1上，并且在从其代表性样品以NCIMB保藏号42554保藏于NCIMB的种子生长的植物中，p10基因座的存在可使用标记SO00696和/或标记SO0305检测。当携带p10基因座的植物与参考品种Viroflay的完全易感植物(即不携带p10基因座)杂交时，分别在SEQ ID No.1和SEQ ID No.3中以粗体和下划线所示的标记SO00696和SO0305的SNP(参见表1)与p10基因座的存在连锁。在这样的杂交中，分别在SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.4中以粗体和下划线表示的标记SO00696和SO0305的SNP(参见表1)与p10基因座的不存在连锁。
因此，本发明涉及包含p10基因座的菠菜植物，其中所述基因座位于染色体1上并且与SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.3中存在的SNP标记连锁。
该保藏物对于SEQ ID No.1和SEQ ID No.3的SNP是纯合的。当保藏物与参考品种Viroflay的植物杂交时，这些SNP与p10基因座连锁。因此，该保藏物可以作为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3的SNP的参考。因此，品种Viroflay的植物对于SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的SNP是纯合的。
然而，技术人员知道，在标记不是与其连锁的性状的因果突变的情况下，重组可以使标记不与之连锁。因此，在其基因组中包含p10抗性基因座的本发明的植物不限于表1中所述的SEQ ID No.1至8的任何SNP的存在。
在一个实施方案中，本发明涉及包含p10基因座的菠菜植物用于产生与p10基因座连锁的标记的用途。这种菠菜植物可以是但不限于从其代表性样品以NCIMB保藏号42554在2016年2月24日保藏于NCIMB的种子生长的植物。
在另一个实施方案中，本发明涉及如表1中所定义的任何标记SO00696、SO00305、SO01770和SO00979用于产生与p10基因座连锁的新标记的用途。
本发明还涉及鉴定包含本发明的p10基因座的菠菜植物的方法，该方法包括在菠菜植物中检测与抗性相关的标记，其中所述标记在20厘摩、特别是15厘摩、更特别是10厘摩、甚至更特别是5厘摩和最特别是1厘摩内与选自如表1中所定义的标记的至少一种标记遗传连锁。该方法还可以包括选择包含赋予对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性的p10基因座的植物。
在另一个实施方案中，本发明涉及鉴定包含本发明的p10基因座的菠菜植物的方法，该方法包括在菠菜植物中检测与抗性相关的标记，其中所述标记在20厘摩、特别是15厘摩、更特别是10厘摩、甚至更特别是5厘摩和最特别是1厘摩内与选自如表1中所定义的SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的至少一种标记遗传连锁。该方法还可包括选择包含赋予对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性的p10基因座的植物。
在又一个实施方案中，本发明涉及鉴定包含本发明的p10基因座的菠菜植物的方法，该方法包括在菠菜植物中检测与抗性相关的标记，其中所述标记在20厘摩、特别是15厘摩、更特别是10厘摩、甚至更特别是5厘摩和最特别是1厘摩内与选自如表1中所定义的SEQID No.1和SEQ ID No.3的至少一种标记遗传连锁。该方法还可包括选择包含赋予对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性的p10基因座的植物。
在一个实施方案中，本发明涉及包含p10基因座的菠菜植物，该植物可通过使第一菠菜植物与第二菠菜植物杂交而获得，其中所述植物中的至少一种包含p10基因座，其中所述基因座为在从其代表性样品以保藏号NCIMB 42554保藏于NCIMB的种子生长的植物或其携带p10基因座的后代植物中发现的，以及优选在F2代中使用疾病测试例如如本文所述的幼苗测试和/或通过使用表1中的任何一种分子标记选择霜霉病抗性植物来选择抗性植物。
本领域技术人员可获得许多不同的标记系统，这些标记系统包括但不限于SNP、AFLP标记、RFLP标记、SSR、RAPD标记或同工酶标记。可以利用与p10基因座遗传连锁或相关的标记(例如Acquaah G.,Principles of Plant Genetics and Breeding,2012,WestSussex UK)。分离、开发和利用这些标记的方法是本领域已知的。
如本文所用，两个核酸序列(包括核酸标记序列和遗传决定子例如p10基因座的核酸序列)的连锁可以是遗传上的或物理上的或两者。
在不存在分子标记的情况下或者在分子标记和p10基因座之间发生重组并且标记因此不再对p10基因座的存在进行预测的情况下，遗传决定子与p10基因座的等同性仍然可能通过等位性测试确定。为了进行等位性测试，将对已知基因座纯合的材料(即测试植物)与对待测试的决定子纯合的材料杂交。后一种植物被称为供体植物。待测试的供体植物应该对待测试的决定子是纯合的或应该使得其对待测试的决定子是纯合的。技术人员知道如何获得对待测试的决定子是纯合的植物。当在供体植物和测试植物之间的杂交的F2中没有观察到与本发明基因座相关的表型的分离时，供体植物的决定子和测试植物的已知基因座被证明是等同的。应观察的表型是对霜霉病(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)以下种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性。测试植物可以是但不限于从其代表性样品以保藏号NCIMB 42554保藏于NCIMB的种子生长的植物。
在一个实施方案中，本发明涉及包含导致对对霜霉病(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的广谱抗性的P10基因座的菠菜植物(Spinacia oleracea)，该基因座包含于或等同于在其代表性种子以保藏号NCIMB42554保藏于NCIMB的菠菜植物中发现的p10基因座，如可以使用等位性测试确定的，特别是如上文所述的。
在一个方面，本发明涉及包含p10基因座的菠菜植物，其可通过如下步骤获得：将菠菜植物与从保藏物NCIMB 42554的种子生长的植物杂交以产生F1后代，自交F1后代以产生F2后代并从F2后代中选择显示对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性的植物作为获得p10广谱抗性基因座的植物。
本发明进一步涉及包含p10广谱抗性基因座的菠菜植物，其中p10基因座在其被引入到对所有菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类易感的菠菜植物中时诱导由对种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性组成的抗性谱。
本申请上下文中的“性状”一词是指植物的表型，在本发明中是指特定的抗性谱。抗性谱是植物对其显示抗性的许多种类或分离株的组合。更具体地，词语“性状”是指由本发明的p10基因座的纯合存在引起的表型，其是对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性。术语“遗传决定子”或“基因座”用于引起本发明的性状的植物基因组中的遗传信息。当植物显示本发明的性状时，其基因组包含纯合的遗传决定子或基因座。在本发明的上下文中，“p10基因座”、“广谱抗性基因座”和“遗传决定子”可互换使用。
显然，提供本发明的性状的亲本不一定是直接从保藏的种子生长的植物。亲本也可以是来自该种子的后代植物或来自被鉴定为通过其他方式具有本发明的性状的种子的后代植物。
在一个实施方案中，本发明的植物，即包含p10基因座的植物，是农学上优良的菠菜植物。
在本发明的上下文中，农学上优良的菠菜植物是具有基因型的植物，所述基因型由于定向杂交和通过人为干预的选择而导致可区分和期望的农学性状(其允许生产者收获具有商业意义的产物)的积累。
在培育携带本发明的广谱抗性基因座的新菠菜植物的过程中，可以独立于p10基因座将期望的农学性状引入到所述菠菜植物中。如本文所用，“期望的性状”包括但不限于例如，改善的产率、叶形状、叶大小、叶数量、叶颜色、种子数、种子大小、植物活力、植物高度、抽苔速度和对一种或多种疾病或致病生物的抗性。这些期望的性状中的任何一种可以与p10基因座组合。
在另一个实施方案中，本发明的菠菜植物可以表现出对下列菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类中的一种或多种的完全抗性：Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16，这是由于存在一种或多种R基因(例如RPF1、RPF2、RPF3、RPF4、RPF5和RPF6)(Feng等人，Identification of new races and deviating strains of thespinach downy mildew pathogen Peronospora farinosa f.sp.spinaciae 2014PlantDisease 98(1):145-152)。菠菜植物可以进一步对以下疾病之一具有抗性或耐受性：CMV，毛盘孢属(Colletotrichum)，分枝孢子菌属(Cladosporium)和镰刀菌属(Fusarium)。除了任何上述抗性之外，本发明的菠菜植物可包含延迟或增强的抽苔表型。本发明的菠菜植物还可以包括以下叶形状之一：皱叶(savoy)、半皱叶和光滑叶。植物的叶可以独立于它们的形状而在叶的叶柄、叶脉中和/或叶脉之间包含升高浓度的红色色素β-花青苷(参见例如US20140272083)。除了上述性状以外，本发明的菠菜植物可以包含多叶特征(参见例如US20120054894)。例如，在一个实施方案中，本发明涉及由于存在两个R基因和p10基因座分别对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1-13和Pfs:15具有抗性和对Pfs:14和Pfs:16具有中等抗性并且进一步对CMV具有抗性的农学上杂种的菠菜品种，其显示缓慢的抽苔和具有光滑叶。这种农学优良杂种品种的另一个例子是由于存在两个R基因和p10基因座对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1-9和Pfs:11-16具有抗性和对Pfs:10具有中等抗性的品种，其具有快速生长的表型，但是相对缓慢的抽苔，并且非常适合于工业分段收获。
在又一个实施方案中，本发明的农学上优良的菠菜植物是近交系或杂种。
如本文所用，近交系的植物是这样的植物群体的植物，其是三轮或更多轮自交或回交的结果；或该植物是双单倍体。近交系可以是例如是用于生产商业杂种的亲代系。
如本文所用，杂种植物是这样的植物，其是具有不同基因型的两种不同植物之间杂交的结果。更特别地，杂种植物是两种不同近交系的植物之间杂交的结果，这样的杂种植物可以例如商业F1杂种品种的植物。
在一个实施方案中，包含p10基因座的植物是F1杂种品种。
此外，本发明涉及可以生长为包含p10基因座的菠菜植物的杂种种子，以及生产这种杂种种子的方法，其包括使第一亲本菠菜植物与第二亲本菠菜植物杂交并收获所得杂种种子，其中第一亲本植物和/或第二亲本植物纯合地包含p10基因座，以及将所述杂种种子生长成杂合或纯合地包含p10基因座的杂种菠菜植物。
根据其进一步的方面，本发明涉及包含p10基因座的繁殖材料。在一个实施方案中，繁殖材料适合有性繁殖。这种繁殖材料包括例如小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和/或卵细胞。在另一个实施方案中，繁殖材料适合于营养繁殖。这种繁殖材料包括例如插条、根、茎，细胞、原生质体和/或可再生细胞的组织培养物。适于制备组织培养物的植物部分特别是叶、花粉、胚芽、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根尖、花药、花、种子或茎。
在一个实施方案中，这样的繁殖材料由本发明的菠菜植物的种子形成，其中可从该种子生长的植物携带本发明的p10基因座。
在另一个实施方案中，这样的繁殖材料由本发明的菠菜植物的种子形成，其中可以从该种子生长的植物包含处于纯合状态的本发明的p10基因座。
本发明进一步涉及本发明的菠菜植物的细胞，该细胞包含本发明的p10基因座，其中所述基因座是如在其代表性种子以NCIMB保藏号42554保藏的菠菜植物中发现的。因此，所述细胞包含编码广谱抗性的遗传信息，特别是它包含与编码其代表性种子以NCIMB保藏号42554保藏的菠菜植物的所述广谱抗性性状的遗传信息基本相同优选完全相同的遗传信息。优选地，本发明的细胞是植物或植物部分的一部分，但细胞也可以是分离的形式。
本发明还涉及以NCIMB保藏号42554保藏的种子用于通过将从所述保藏的种子生长的植物与包含其他农艺学上期望的性状的另一植物杂交而将对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性转移至具有农学上有价值的菠菜植物中的用途。
本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织和种子的后代。这种后代本身可以是植物、细胞、组织或种子。如本文所用，词语“后代”意指来自与包含p10基因座的本发明的植物杂交的第一个和所有其他子代。“后代”包括以杂合或纯合状态携带p10基因座并且通过营养繁殖或增殖从其他植物或本发明的植物的后代获得的所有植物。在后代植物包含纯合形式的p10基因座的情况下，该植物表现出对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性。
所述后代植物包含含有p10基因座的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段可从其代表性种子以NCIMB保藏号42554保藏于NCIMB的菠菜植物获得。因此，抗性性状在菠菜植物的基因组中具有遗传基础，并且通过使用如本文所述的疾病抗性测定，菠菜植物可以被鉴定为本发明的植物。应理解，提供本发明的性状的亲本植物不一定是直接从保藏的种子生长的植物。亲本也可以是来自该种子的后代植物，或来自通过其他方式鉴定为具有(或已经获得)本发明的性状的种子的后代植物。
在一个实施方案中，本发明涉及携带本发明的性状的菠菜植物，其通过常规育种或遗传修饰(特别是通过顺式基因发生或转基因发生)从合适来源引入负责性状的遗传信息而获得所述性状。顺式基因发生是具有天然基因(其编码来自作物植物本身或来自性相容的供体植物的(农业)性状)的植物的遗传修饰。转基因发生是具有来自不可杂交的物种的基因或具有合成基因的植物的遗传修饰。
在一个实施方案中，从其获得遗传信息的来源由从保藏的种子生长的植物或其有性或无性植物后代形成。
本发明还涉及本发明的植物的种质。种质由生物体的所有遗传特征构成，并且根据本发明至少包括本发明的p10基因座。种质可在育种程序中用于开发抗霜霉病的菠菜植物。
在一个方面，本发明涉及产生菠菜植物的方法，所述菠菜植物包含由p10基因座引起的对霜霉病(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的广谱抗性，该方法包括：(a)使包含本发明的p10基因座的植物与另一植物杂交；(b)自交所得的F1以获得F2植物；(c)在F2中选择对霜霉病(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16具有至少中等抗性的植物；(d)任选地额外进行一轮或多轮自交或杂交，并随后选择包含对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)的所述广谱抗性的植物。本发明还包括通过该方法产生的菠菜植物。
更具体地，本发明涉及通过回交将p10基因座基因渗入到农学上优良的菠菜植物中的方法，其包括：(a)将包含p10基因座的菠菜植物与在其基因组中不包含所述基因座的农学上优良的菠菜植物杂交以产生F1后代；(b)在F1和/或F2中选择包含p10基因座的后代植物；(c)将包含p10基因座的后代植物与所述农学上优良的菠菜植物杂交以产生回交后代；(d)选择包含p10基因座的回交后代；(e)任选地，重复步骤(c)和(d)一次或多次。特别地，步骤(e)可以重复1至10次。本发明还包括通过该方法产生的菠菜植物。
更特别地，本发明提供了将期望的性状引入携带p10广谱抗性基因座的农学上优良菠菜植物的方法，其包括：(a)将所述农学上的优良菠菜植物与包含期望的性状的第二菠菜植物杂交以产生F1后代；(b)在F1和/或F2中选择包含所述p10基因座和期望的性状的后代植物；(c)将选择的后代植物与携带p10基因座的农学上优良的亲本杂交，以产生回交后代；(d)选择包含期望的性状和由p10基因座赋予的广谱抗性的回交后代；和(e)任选地连续重复步骤(c)和(d)一次或多次以产生回交后代的后代，其包含期望的性状和由p10基因座赋予的广谱抗性。本发明还包括通过该方法产生的菠菜植物。
显然，提供本发明的性状的亲本不一定是直接从保藏的种子生长的植物。亲本可以例如还是来自种子的后代植物或来自通过其他方式鉴定具有本发明的性状的种子的后代植物。
本发明还涉及本发明的菠菜植物的收获的叶，并涉及包含天然或加工形式的本发明菠菜植物的收获的叶的食品。
菠菜叶例如以包装形式出售，例如预先包装的菠菜叶，或作为包含菠菜叶的沙拉中的加工产品。这样的包装的提及是例如在美国专利No.5,523,136中制造的，其提供包装薄膜，以及由这种包装薄膜制成的包装，包括这样的含有叶状产品的包装，以及制造和使用这样的包装薄膜和包装的方法，它们适合于与本发明的菠菜叶一起使用。因此，本发明还提供了本发明的菠菜植物叶的用途和制备和使用本发明的菠菜植物叶的方法，以及衍生自本发明的菠菜植物的叶。本发明还涉及一种容器，其包含在生长基质中的一种或多种本发明的植物或一种或多种衍生自本发明的植物的菠菜植物，用于在家庭环境中从植物中收获叶。通过这种方式，当植物处于准备收获状态时，消费者可以采摘非常新鲜的叶用于沙拉。菠菜也可以作为已经煮熟或炒过和任选冷冻的食品出售。
本发明进一步涉及确定其代表性种子已经以NCIMB保藏号42554保藏的本发明的植物或其第一代后代植物的基因型的方法，其包括从所述植物和不含本发明的遗传决定子的参考植物获得核酸样品，并在所述样品的核酸中检测多种多态性。该方法可以另外包括将检测多种多态性的结果存储在计算机可读介质上的步骤。所述多种多态性指示和/或引起p10基因座的存在。
有多种方法从核酸样品中获得基因型数据。可以收集对某些表型性状(例如基因序列)特异的基因型数据，但也可以获得随机遗传变异的模式以构建所谓的DNA指纹。取决于所使用的技术，可以获得对携带本发明的抗性等位基因的菠菜植物而言独特的指纹。获得独特的DNA指纹取决于品种中存在的遗传变异和指纹技术的敏感性。本领域已知的提供良好指纹谱的技术称为AFLP指纹技术(一般参见美国专利No.5,874,215)，但是还有许多其他基于标记的技术，例如RFLP(或限制性片段长度多态性)，SSLP(或简单序列长度多态性)，RAPD(或多态性DNA的随机扩增)VNTR(或可变数目串联重复)，微卫星多态性，SSR(或简单序列重复)，STR(或短串联重复)，SFP(或单特征多态性)，DarT(或多样性阵列技术)，RAD标记(或限制性位点相关的DNA标记)(例如Baird等人，PloS One Vol.3e3376,2008；Semagn等人，African Journal of Biotechnology Vol.5 number 25 pp.2540-2568，2006年12月29日)。如今，基于序列的方法正在利用随机分布在基因组中的单核苷酸多态性(SNP)，作为基因分型的常用工具(例如，Elshire等人，PloS One Vol.6：e19379,2011；Poland等人PloSOne Vol 7：e32253；Truong等人，PloS One Vol.7 number 5：e37565,2012)。
利用任何上述基因分型技术，当将目标植物的基因型和/或序列与一种或多种参考植物的基因型和/或序列进行比较时，可以检测多态性。如本文所用，参考植物的基因型和/或序列可以衍生自但不限于以下任何一种：亲本系，密切相关的植物品种或物种，相关植物品种或物种的完整基因组序列，或一种或多种相关植物品种或物种的从头组装的基因组序列。例如，通过与一种或多种参考植物的基因型和/或序列比较携带赋予抗性的等位基因的菠菜植物(其代表性种子已根据NCIMB保藏号42554保藏)的基因型和/或序列，可以检测p10基因座存在与否的多态性。在该实例中用于比较的参考植物可以是，例如，但不限于，表2中提及的任何菠菜品种和/或其亲本系、祖先或其后代植物。
通过这些技术揭示的一种或多种多态性可用于建立基因型和表型之间的联系。因此，多态性可用于预测或鉴定某些表型特征，例如，p10基因座、个体甚至物种提供的抗性。多态性通常称为标记。本领域技术人员通常的做法是应用分子DNA技术来产生多态性并产生标记。
本发明的多态性可以提供在各种介质中以便于使用，例如，数据库或计算机可读介质，其还可以包含允许技术人员检查或查询多态性并获得有用信息的形式的描述性注释。
如本文所用，“数据库”是指可检索的收集数据的任何表示，包括计算机文件诸如文本文件、数据库文件、电子表格文件和图像文件、打印的表格和图形表示以及数字和图像数据集合的组合。在本发明的优选方面，“数据库”指的是可以存储计算机可搜索信息的存储器系统。
如本文所用，“计算机可读介质”指的是可以由计算机直接读取和访问的任何介质。这种介质包括但不限于：磁存储介质，例如软盘，硬盘，存储介质和磁带；光存储介质，例如CD-ROM；电存储介质，例如RAM，DRAM，SRAM，SDRAM，ROM；和PROM(EPROM，EEPROM，FlashEPROM)，以及这些类别的混合，例如磁/光存储介质。本领域技术人员可以容易地理解可以如何使用任何目前已知的计算机可读介质来创建包含计算机可读介质的制品，该计算机可读介质上记录有本发明的多态性。
如本文所使用的，“记录”是指用于将信息存储在可检索的数据库或计算机可读介质中的过程的结果。例如，技术人员可以容易地采用任何目前已知的用于在计算机可读介质上记录信息的方法来生成包含本发明的多态性的介质。本领域技术人员可以使用各种数据存储结构来创建计算机可读介质，其中数据存储结构的选择通常基于选择用于访问存储信息的装置。另外，各种数据处理器程序和格式可用于在计算机可读介质上存储本发明的多态性。
本发明进一步提供了一种系统，特别是基于计算机的系统，其包含本文所述的多态性。这样的系统被设计来鉴定本发明的多态性。如本文所用，“基于计算机的系统”是指用于分析多态性的硬件、软件和存储器。本领域技术人员可以容易地理解，任何一种当前可用的基于计算机的系统都适用于本发明。
保藏信息
根据布达佩斯条约的规定在2016年2月24日在NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,UK进行了保藏号为42554的保藏。
标记信息
SEQ ID No.1和SEQ ID No.3代表标记SO00696和SO00305的等位基因，其在保藏物NCIMB 42554的种子的基因组中与本发明的p10基因座连锁。因此，保藏物NCIMB 42554的种子的基因组中SEQ ID No.1和SEQ ID No.3的纯合存在与p10基因座赋予的抗性连锁，该抗性是对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性。
SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的序列分别代表完全易感品种Viroflay中存在的标记SO00696和SO00305的野生型等位基因。
对于标记SO00696和SO00305，与p10等位基因连锁的标记等位基因和与品种Viroflay植物中的易感等位基因连锁的标记等位基因之间不同的核苷酸在表1中标有下划线并以粗体显示。对于SO00696，这种差异是在第26位的SNP，其中SEQ ID No.1在第26位上具有G，SEQ ID No.2在第26位上具有A。对于SO00305，该差异是第33位的SNP，其中SEQ IDNo.3在第33位上具有T，和SEQ ID No.4在第33位上具有A。
在这些序列中指示的SNP(粗体和下划线的核苷酸)可以用作分子标记，用于检测参考品种Viroflay的植物和包含p10基因座的植物(其可以是从其代表性样品以NCIMB保藏号42554保藏于NCIMB的种子生长的植物)之间的杂交后代中p10基因座的存在。
标记SO01770和SO00979的两个标记等位基因之间不同的核苷酸在表1中标有下划线并且以粗体显示。在标记SO01770的情况下，标记等位基因(SEQ ID No.6)在其中标记等位基因(SEQ ID No.5)具有下划线和粗体显示的C(SEQ ID No.5的第58位)的位置具有单个核苷酸缺失。对于SO00979，这是第24位的SNP，其中SEQ ID No.7在第24位上具有T，SEQ IDNo.8在第24位上具有C。
表1.标记信息
在以下实施例中将进一步举例说明本发明。
实施例
实施例1
测试菠菜植物中的p10基因座
如Irish等人(2008；Phytopathol.98：894-900)所述使用差异集合测定对霜霉病感染的抗性。将纯合包含p10-基因座的本发明的菠菜植物与来自不同其他基因型的菠菜植物(参见表2)一起种植在含有Scotts Redi-Earth培养基的托盘中，并在出苗后用OsmocotePeter's(13-13-13)肥料(Scotts)一周施肥两次。在第一个真叶阶段用菠菜霜霉菌(Peronospora farinosa f.sp.spinaciae)的致病种类的孢子囊悬浮液(2.5×105/ml)接种植物。以这种方式，测试了16种致病种类(如表2所示)。
将接种的植物置于18℃、100％相对湿度的露水室中24小时，然后移至18℃的生长室中于12小时光周期下持续6天。6天后，将植物放回露水室中24小时以诱导孢子形成，并对它们进行疾病反应评分。
如Irish等人(2007；Plant Dis.91：1392-1396)所述，基于萎黄病的症状和子叶和真叶上病原体孢子形成的迹象，将植物评为抗性、中等抗性或易感性。既没有孢子形成也没有萎黄病的植物被认为是抗性的，仅表现出萎黄病或仅在子叶的尖端上发生孢子形成的植物被认为是中等抗性的，并且表现出覆盖子叶的实质部分的孢子形成的植物被认为是易感的。
表2显示了菠菜霜霉病种类的差异集合和各种菠菜品种(杂种)对这些致病种类中的每一种的抗性。易感反应评分为“+”(表明真菌成功感染，在整个子叶上发生孢子形成)，抗性表示为“-”(子叶上没有孢子形成)。弱的抗性反应表示为“(-)”，这实际上意味着感染水平降低(在幼苗测试中仅表现出萎黄病或仅在子叶尖上发生孢子形成的植物)。表2中的p10系是表现出本发明的广谱抗性的系。
表2
实施例2
将p10抗性基因座引入其他菠菜植物中
将本发明的植物(作为亲本)与品种Viroflay植物杂交，以获得F1。如实施例1中所述，测试F1群体的30株植物对霜霉菌种类13的抗性。30株植物中没有一株显示出本发明的抗性模式，即所有植物都对Pfs:13敏感。
将5株F1植物自交，并播种来自每株植物的40粒种子，获得196株植物的F2群体。如实施例1中所述测试F2植物对霜霉菌种类13的抗性。观察到42株植物显示出对Pfs:13的抗性或中等抗性。其余154株植物均对Pfs:13敏感。卡方检验证实F2群体中观察到的分离与p10基因座的1:3分离(如此处以对霜霉菌种类13的抗性所测定的)一致。换句话说，p10基因座以适合单基因隐性遗传的模式遗传。
表3
群体# 株系 R IR S
群体1 Pfs:1 30 0 0
群体2 Pfs:2 29 1 0
群体3 Pfs:3 26 0 0
群体4 Pfs:4 30 0 0
群体5 Pfs:5 30 0 0
群体6 Pfs:6 30 0 0
群体7 Pfs:7 30 0 0
群体8 Pfs:8 25 4 1
群体9 Pfs:9 21 1 3
群体10 Pfs:10 28 2 0
群体11 Pfs:11 29 1 0
群体12 Pfs:12 30 0 0
群体13 Pfs:13 30 0 0
群体14 Pfs:14 29 1 0
群体15 Pfs:15 25 4 1
群体16 Pfs:16 28 2 0
将F2群体中评分最好的植物自交以产生F3群体。将F3种源的16×30粒种子发芽，用于针对16种认可的霜霉菌种类进行测试(参见表3)。这些结果表明，p10基因座赋予的抗性确实是对至少Pfs:1-16的广谱抗性。
实施例3
p10抗性基因座至其他菠菜植物中的标记辅助的引入
将本发明的植物(作为亲本)与品种Viroflay植物杂交，以获得F1。
将4株F1植物自交，并播种来自每株植物的24粒种子，以形成总共96株植物的4个F2群体。
从这些植物中，使用标准可用方案提取和纯化DNA。
对这些样品，与两个亲本的DNA样品(作为阴性和阳性对照)一起，针对两个标记SO00696和SO00305进行KASPar测定(Kompetitive等位基因特异性PCR；参见例如Semagn等人，2014.Molecular Breeding 33(1):1-14)。
对于阳性对照，这些标记的评分与SEQ ID No.1和SEQ ID No.3中存在的SNP(如表1所示)一致。对于Viroflay(阴性对照)，这些标记的评分与SEQ ID No.2和SEQ ID No.4中存在的SNP(如表1所示)一致。
在形成F2群体的总共96株植物中，23株植物的评分符合阳性对照植物。剩余的73株植物显示出在阴性对照植物中发现的标记评分。
随后，将根据SEQ ID No.1和SEQ ID No.3中存在的SNP对其进行标记评分的23株植物自交以形成23个F3群体，每个群体含有120株植物。对每个F3群体进行幼苗测试(如实施例1中所述)。在幼苗测试中，测试植物对种类Pfs:3、Pfs:6、Pfs:10和Pfs:14的抗性。所有这些植物评分为对这四种霜霉菌种类的至少具有中等抗性。
PCT/RO/134表

Claims (15)

1.一种菠菜植物，其包含位于染色体1上的命名为p10的霜霉病抗性贡献基因座，并且其中所述基因座在纯合存在时提供对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)种类Pfs:1、Pfs:2、Pfs:3、Pfs:4、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:8、Pfs:9、Pfs:10、Pfs:11、Pfs:12、Pfs:13、Pfs:14、Pfs:15和Pfs:16的至少中等抗性，并且其中p10基因座是如在从其代表性样品以保藏号42554保藏于NCIMB的种子生长的植物中发现的。
2.权利要求1的菠菜植物，其中从其代表性样品以NCIMB保藏号42554保藏于NCIMB的种子生长的植物中的p10基因座位于具有SEQ ID No.7或8的标记SO00979和具有SEQ ID No.5或6的标记SO01770之间。
3.权利要求1的菠菜植物，其中从其代表性样品以NCIMB保藏号42554保藏于NCIMB的种子生长的植物中的p10基因座与如表1中以粗体和下划线所示的SEQ ID No.1和/或SEQ IDNo.3中的SNP连锁。
4.权利要求1的菠菜植物，其中p10基因座是纯合存在的。
5.权利要求1至4中任一项的菠菜植物，其中所述植物是农学上优良的菠菜植物。
6.权利要求1的菠菜植物，其中所述菠菜植物表现出对菠菜霜霉菌(Peronosporafarinosa f.sp.spinaciae)种类Pfs:1-16的完全抗性。
7.一种繁殖材料，其包含权利要求1-3中任一项所描述的p10基因座，其中所述繁殖材料包括小孢子、花粉、子房、胚珠、胚芽、胚囊、卵细胞、插条、根、根尖、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生组织细胞、原生质体、细胞或其组织培养物。
8.一种菠菜植物细胞，其中所述细胞包含权利要求1-3中任一项所描述的p10基因座。
9.一种菠菜种子，其在其基因组中包含权利要求1-3中任一项所描述的p10基因座。
10.权利要求1-6中任一项的菠菜植物的收获的叶。
11.一种食品，包含权利要求10的收获的叶。
12.一种容器，包括权利要求1-6中任一项的菠菜植物的收获的叶。
13.一种容器，其包含一种或多种权利要求1-6中任一项的菠菜植物，其任选地在用于从所述一种或多种菠菜植物收获叶的生长基质中。
14.一种选择包含权利要求1-3中任一项所描述的p10基因座的菠菜植物的方法，所述方法包括在菠菜植物中检测具有SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.3的标记，或与p10基因座相关的标记，其中所述标记在20厘摩、特别是15厘摩、更特别是10厘摩、甚至更特别是5厘摩和最特别是1厘摩内与如表1中所定义的具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7和/或SEQ ID No.8的标记遗传连锁，以及选择包含所述标记的菠菜植物作为包含p10基因座的菠菜植物。
15.权利要求14的方法，其还包括对菠菜霜霉菌(Peronosporafarinosaf.sp.spinaciae)抗性进行表型分析以选择对菠菜霜霉菌(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)具有抗性的菠菜植物。
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