CN110592254B - 用于识别蓝茉莉叶烟草9号染色体的分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于识别蓝茉莉叶烟草9号染色体的分子标记，该分子标记是通过云烟87、附加有蓝茉莉叶烟草9号染色体的云烟87植株TP‑1以及蓝茉莉叶烟草基因组的DNA筛选获得的80对引物，这80对引物均可以在蓝茉莉叶烟草基因组总DNA、TP‑1的基因组总DNA扩增出特异条带，而在云烟87中不能扩增出相应条带，故该80对引物扩增出的特异条带可以作为云烟87基因组背景下N.plumbaginifolia的9号染色体的特异性标记。

Description

用于识别蓝茉莉叶烟草9号染色体的分子标记
技术领域
本发明涉及烟草育种，具体涉及一种用于识别蓝茉莉叶烟草9号染色体的分子标记。
背景技术
烟草黑胫病是由烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var nicotianae)引起的一种土传真菌病害，是影响烟草产量和品质的主要病害之一，其发生蔓延很快，往往在1～2周之内可以使整个烟田毁灭，破坏性极强，大田侵染后常造成烟株整株死亡，造成了巨大的经济损失(王万能，肖崇刚.烟草黑胫病的综合防治及其研究进展.广西农业科学,2003(2):42-43.)。防治烟草黑胫病最安全、经济有效的措施之一是培育抗病品种。蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)是烟草属中对黑胫病抗性较强的未被广泛栽培的野生烟草种，其对烟草黑胫病病原菌0号和1号小种均具有较强的抗性，是烟草黑胫病抗性育种的重要亲本。虽然，已有将蓝茉莉叶烟草的黑胫病抗性转入烟草的报道，但该类材料在生产中应用并不广泛，这与非目标基因的渐渗有关。所以利用蓝茉莉叶烟草培育含较少非目标基因的抗黑胫病新株系是烟草抗黑胫病育种的有效方法之一。但目前，烟草远缘杂交的研究并未得到较多关注。所以，利用蓝茉莉叶烟草培育含较少非目标基因的抗黑胫病新株系的工作非常滞后。远缘杂交育种过程中筛选含目标性状的异源染色体植株是主要的内容。因而利用蓝茉莉叶烟草培育优质抗黑胫病植株的主要内容就在获得远缘杂种的基础上筛选抗黑胫病的异源染色体植株。研究发现，通过远缘杂交将蓝茉莉叶烟草中携带黑胫病抗性基因的染色体，即其9号染色体转入主栽品种云烟87的基因组中，得到了N.tabacum-N.plumbaginifolia异源单体附加系TP-1(Jiangbo Dang,Jinying Wang,Yao Yang,etal.Resistance of Nicotiana tabacum to Phytophthora parasitica var.nicotianaeRace 0Is Enhanced by the Addition of N.plumbaginifolia Chromosome 9with aSlight Effect on Host Genomic Expression.Crop Science,2019(accepted))。由于目前关于蓝茉莉叶烟草的研究较少，其基因组信息也还未知，关于其9号染色体的特异标记也很少，不利于后续抗病材料的筛选及其抗性机制的研究。为了推进利用异源单体附加系材料N.tabacum-N.plumbaginifolia TP-1进行烟草黑胫病抗性育种，需开发更多的蓝茉莉烟草9号染色体特异性分子标记。鉴于此，寻找蓝茉莉烟草9号染色体特异性分子标记以推进利用异源单体附加系材料N.tabacum-N.plumbaginifolia TP-1进行烟草黑胫病抗性育种是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于为克服现有技术之缺陷，提供一种用于识别蓝茉莉叶烟草9号染色体的分子标记。
本发明用于识别蓝茉莉叶烟草9号染色体的分子标记，其特征在于：所述分子标记选自NP90001-NP900080这80对引物中的一种或几种组合，其中NP90001-NP900080的引物序列见下表1：
表1 80对引物
Figure BDA0002210933540000021
Figure BDA0002210933540000031
Figure BDA0002210933540000041
Figure BDA0002210933540000051
有益效果：
本发明提供一种用于识别蓝茉莉叶烟草9号染色体的分子标记，该分子标记是通过云烟87、附加有蓝茉莉叶烟草9号染色体的云烟87植株TP-1以及蓝茉莉叶烟草基因组的DNA筛选获得的80对引物，这80对引物均可以在蓝茉莉叶烟草基因组总DNA、TP-1的基因组总DNA扩增出特异条带，而在云烟87中不能扩增出相应条带，故该80对引物扩增出的特异条带可以作为云烟87基因组背景下N.plumbaginifolia的9号染色体的特异性标记。利用本发明N.plumbaginifolia的9号染色体的特异性标记可为筛选含有抗烟草黑胫病的蓝茉莉叶烟草9号染色体的抗源奠定基础，进而筛选新的抗烟草黑胫病种质资源，利用新的种质资源培育新的抗病品种，具有重要的经济和社会效益。
附图说明
图1是引物NP900041、NP00043、NP900048、NP900052、NP900012、NP900042、NP90001在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图2是引物NP90001、NP0002、NP90005、NP900055在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图3是引物NP900027、NP900026、NP00054、NP900071、NP900078、NP900079在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图4是引物NP900023、NP00032在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图5是引物NP900037、NP00011在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图6是引物NP900021、NP00022、NP900029、NP00057、NP900061、NP00073NP900075、NP00076在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图7是引物NP900018、NP00024、NP900028、NP00066、NP900067在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图8是引物NP900034、NP00044、NP900049、NP00051在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图9是引物NP90003、NP00020在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图10是引物NP90008、NP900050、NP00056在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图11是引物NP900036、NP00062在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图12是引物NP900016、NP00039、NP90007、NP00046、NP00047、NP900025、NP00031在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图13是引物NP900063、NP00064、NP900068、NP00069、NP00072、NP900074、NP00035、NP00053在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图14是引物NP90004、NP00065、NP900038、NP0006、NP00015、NP900070在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图15是引物NP900019、NP00059、NP900060、NP00077、NP00080、NP900040在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图16是引物NP900014、NP00030、NP900033、NP00045、NP00058在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1；
图17是引物NP90009、NP00010、NP900013、NP00017在不同烟草中的扩增电泳图，其中M表示Marker，Np表示N.plumbaginifolia，87表示云烟87，Nt表示TP-1。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所用原料及试剂均为市售产品，其中Marker购自于成都微克生物技术有限公司(品牌Takara，货号3427A，DL2000 DNA Marker)。
实施例
本发明识别蓝茉莉叶烟草9号染色体的标记，采用以下步骤获得：
(1)自转录组找出在N.plumbaginifolia和含N.plumbaginifolia的9号染色体的云烟87植株TP-1中特异表达，在云烟87中不表达的基因，设计出引物，并合成如下表2所示80对引物。
表2 80对引物
Figure BDA0002210933540000081
Figure BDA0002210933540000091
Figure BDA0002210933540000101
(2)提取N.plumbaginifolia、云烟87和TP-1的基因组DNA。
(3)以N.plumbaginifolia、云烟87和TP-1的基因组DNA为模版利用合成的引物进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳；扩增体系：3.4μL 10×buffer(含有Mg2+15mmol/L，Takara公司)，dNTP 0.4μL(2.5mmol/L，Takara公司)，rTaq 0.1μL(5U/μL，Takara公司)，1μL的DNA模板(25-50ng/uL)，正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，ddH2O 14.1μL，为20μL的PCR扩增体系。
(4)80对引物扩增条带如图1-17所示，统计能在N.plumbaginifolia和TP-1扩增出特异条带，而在云烟87中未扩增出相应条带的引物为特异引物。结果显示，这80对引物均可以在蓝茉莉叶烟草基因组总DNA、TP-1的基因组总DNA扩增出特异条带，而在云烟87中不能扩增出相应条带，故该80对引物扩增出的特异条带可以作为云烟87基因组背景下N.plumbaginifolia的9号染色体的特异性标记。

Claims (1)

1.识别蓝茉莉叶烟草9号染色体的各对引物在进行烟草黑胫病抗性育种中的应用，其特征在于，各对引物序列见下表1：
表1 77对引物
Figure FDA0004097104390000011
Figure FDA0004097104390000021
Figure FDA0004097104390000031
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