JP2015070833A - イチゴ属植物の炭疽病抵抗性関連マーカーとその利用 - Google Patents
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Abstract
【課題】イチゴ属植物について多数のDNAマーカーを開発し、これら多数のDNAマーカーを用いることで炭疽病抵抗性を高精度に判定する、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー、及び、判定する方法の提供。【解決手段】イチゴ属植物の染色体における特定の塩基配列及び、他の特定の塩基配列により挟まれる連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを用いることで、炭疽病抵抗性を高精度に判定する方法。【選択図】図４
Description
本発明は、イチゴ炭疽病に対する抵抗性を示すイチゴ属植物系統を選抜することができる炭疽病抵抗性関連マーカー及びその利用方法に関する。
DNAマーカー（遺伝マーカーや遺伝子マーカーとも称される）の開発により、植物の品種改良において、有用形質や不良形質の有無を迅速に且つ効率的に判別することが可能となっている。DNAマーカーの開発は、シロイヌナズナやイネといったモデル植物のみならず、様々な実用植物においても進捗しており、品種改良において大いに役立っている。
非特許文献１には、栽培イチゴにおいて統合型高密度連鎖地図を開発したとの報告がある。非特許文献１によれば、以前より約300個のamplified fragment length polymorphism (AFLP)マーカーからなる連鎖地図の報告があるものの、８倍体と複雑なゲノムを有するため、栽培イチゴについてはより高密度な連鎖地図の開発が望まれているとある。また、非特許文献１では、F. vessca及びF.×ananassaについて単純反復配列（simple sequence repeat）マーカーを開発し、統合型高密度連鎖地図を構築している。具体的には、02-19、Sachinoka、Kaorino、Akihime及び0212921の5品種・系統を用いて連鎖地図を作製し、これを統合して１つの統合型高密度連鎖地図を作成している。非特許文献１では、02-19については575個のマーカー、Sachinokaについては556個のマーカー、Kaorinoについては294個のマーカー、Akihimeについては318個のマーカー及び0212921については822個のマーカーを開発している。しかし、非特許文献１に開示された統合型高密度連鎖地図では、座上するマーカー数が無い連鎖群が存在しており、特にマーカー数が少ないKaorinoやAkihimeではその傾向は顕著である。さらに、非特許文献１に開示された統合型高密度連鎖地図は、すべての連鎖地図がカバーされていないと考察している。
また、非特許文献２には、イチゴ炭疽病抵抗性品種の開発を効率的に進めるため、イチゴ炭疽耐病性と連鎖するDNAマーカーを開発したと記載されている。非特許文献２には、Random Amplified Polymorphic DNA法（RAPD法）、AFLP法及びSSR法によりマーカーを用いて連鎖地図を作製し、耐病性連鎖マーカーを解析したとある。その結果、非特許文献２によれば、いちご中間母本農２号を交配した集団に利用することで、育種集団を１／８に減らすことができ、約７０％の確率で耐病性系統を判別できるマーカーを開発できたとある。
なお、イチゴ炭疽病については、非特許文献３に記載されるように、Glomerella cingulate及びColletotrichum acutatumがその原因菌として知られている。
一方、例えば、特許文献１にはテンサイ黒根病抵抗性品種選抜マーカーを開発したことが開示され、特許文献２にはトウモロコシについて目的の形質に連鎖したマーカーを利用する選抜技術が開示されている。
DNA Research 20, 79-92, (2013)
栃木県農業試験場 研究成果集第２９号、第５１〜５２頁
Microbiol. Cult. Coll., 25(1): 27-32, 2009
ところが、上述したテンサイやトウモロコシで開発されてきたDNAマーカー技術は、イチゴ属植物において殆ど進んでいないのが現状であった。非特許文献１にはSSRマーカーを開発し、統合型高密度連鎖地図を構築したことが記載されるものの、多倍数性で複雑なゲノム構造のイチゴ属植物において目的とする形質に連鎖するDNAマーカーを選抜するには十分とは言えなかった。また、非特許文献２には、イチゴ炭疽病耐病性と連鎖するDNAマーカーを開発したと記載されるものの、QTL解析の結果としてはLOD（logarithym of odds）値や寄与率が高いとは言えず、優れたマーカーとは評価できなかった。
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、多倍数性で複雑なゲノム構造のイチゴ属植物について多数のDNAマーカーを開発し、これら多数のDNAマーカーを用いることで炭疽病抵抗性を高精度に判定することができる炭疽病抵抗性関連マーカー及びその利用方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、イチゴ属植物における多数のマーカーを準備し、交雑後代系統における量的形質とマーカーとの連鎖解析によって、炭疽病抵抗性といった量的形質に連鎖するマーカーを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
本発明は以下を包含する。
（１）イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
（２）上記核酸領域は、配列番号１〜１０からなる群から選ばれるいずれか１の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする（１）記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
（３）上記核酸領域は、イチゴ属植物の染色体における配列番号４に示す塩基配列と配列番号８に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に位置することを特徴とする（１）記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
（４）少なくとも一方の親がイチゴ属植物である後代植物の染色体及び/又は当該親のイチゴ属植物の染色体を抽出する工程と、
上記で得られた染色体における上記（１）乃至（３）いずれか１に記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、炭疽病抵抗性が向上したイチゴ属植物系統の製造方法。
上記で得られた染色体における上記（１）乃至（３）いずれか１に記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、炭疽病抵抗性が向上したイチゴ属植物系統の製造方法。
（５）上記測定する工程では、上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅反応により当該イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定することを特徴とする（４）記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
（６）上記測定する工程では、上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする（４）記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
（７）上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする（４）記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
本発明によれば、イチゴ属植物における量的形質の中でも炭疽病抵抗性に連鎖する新規なイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを提供することができる。本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用することによって、イチゴ属植物の交配系統における炭疽病抵抗性を検定することができる。これにより、炭疽病抵抗性が向上した特性を有するイチゴ属植物系統を非常に低コストに識別することができる。
以下、本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー及びその利用方法、特にイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを用いたイチゴ属植物系統の製造方法について説明する。
＜イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー＞
本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとは、イチゴ属植物の染色体上に存在する特定の領域であり、イチゴ属植物炭疽病抵抗性という形質を判別できる機能を有する。すなわち、既知のイチゴ属植物を用いて得られた後代系統において、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認することで炭疽病抵抗性の向上という形質を有する系統であると判断することができる。なお、本発明において、イチゴ炭疽病とは、Microbiol. Cult. Coll., 25(1): 27-32, 2009に記載されるように、Glomerella cingulate及び/又はColletotrichum acutatumが感染することに起因して病班が形成される病気を意味している。特に、本発明において、イチゴ炭疽病とは、Glomerella cingulataの感染を原因とする病気としても良い。
本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとは、イチゴ属植物の染色体上に存在する特定の領域であり、イチゴ属植物炭疽病抵抗性という形質を判別できる機能を有する。すなわち、既知のイチゴ属植物を用いて得られた後代系統において、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認することで炭疽病抵抗性の向上という形質を有する系統であると判断することができる。なお、本発明において、イチゴ炭疽病とは、Microbiol. Cult. Coll., 25(1): 27-32, 2009に記載されるように、Glomerella cingulate及び/又はColletotrichum acutatumが感染することに起因して病班が形成される病気を意味している。特に、本発明において、イチゴ炭疽病とは、Glomerella cingulataの感染を原因とする病気としても良い。
また、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとは、炭疽病抵抗性が向上する形質に連鎖するマーカーと、炭疽病抵抗性が低下する形質に連鎖するマーカーの両者を含む意味である。例えば、特定のイチゴ属植物において、前者のマーカーが存在していれば炭疽病抵抗性が向上した品種と判断できる。さらに、特定のイチゴ属植物において、前者のマーカーが存在し、且つ、後者のマーカーが非存在である場合には炭疽病抵抗性が向上した品種であるとより高精度に判断できる。なお、特定のイチゴ属植物において、後者のマーカーが非存在であることのみをもって、炭疽病抵抗性が向上した品種であると判断しても良い。
特に、前者のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーは、イチゴ属植物の炭疽病抵抗性といった形質の原因遺伝子（群）に連鎖した領域と考えられる。
ここで、イチゴ属植物とは、バラ科イチゴ属(Fragaria L.)に属する植物の全てを含む意味である。すなわち、イチゴ属植物としては、一般的な栽培イチゴであるオランダイチゴ(Fragaria × ananassa)等の交雑種を挙げることができる。また、イチゴ属植物としては、栽培イチゴの祖先種となるF. virginiana並びにF. chiloensis、シロバナノヘビイチゴ（F. vesca）、ノウゴウイチゴ（F. iinumae）、モリイチゴ（F. nipponica）、F. nubicola、F. bucharica、F. daltoniana、F. orientalis、F. corimbosa、F. moschata及びF. iturupensis等の野生種を挙げることができる。さらに、イチゴ属植物としては、栽培イチゴ（F. × ananassa）における既知の品種・系統も含む意味である。栽培イチゴにおける既知の品種・系統としては、特に限定されず、日本国内にて使用可能なあらゆる品種・系統、日本国外において使用されている品種・系統等を含む意味である。例えば、栽培イチゴの日本国内育成品種としては、特に限定されないが、とよのか、サンチーゴ、純ベリー、女峰、ピーストロ、リンダモール、とちおとめ、アイストロ、栃の峰、章姫、紅ほっぺ、とちひめ、さちのか、けいきわせ、さがほのか、アイベリー、カレンベリー、レッドパール、さつまおとめ、福岡S6（あまおう）、濃姫、ひのみね及び宝交早生等を挙げることができる。また、栽培イチゴの品種としては、所定の特性の獲得を目的とした品種改良に利用する育種素材である中間母本である、いちご中間母本農１号及びいちご中間母本農２号を挙げることができる。いちご中間母本農２号は炭疽病抵抗性の育成系統である83118-41と抵抗性品種Doverの交配から育成された育種素材である。なお、いちご中間母本農２号の炭疽病抵抗性は、抵抗性品種宝交早生やDoverと同程度以上であり、また罹病性品種との交配実生集団において高度抵抗性個体の出現率が高く、イチゴ炭疽病抵抗性を有する新品種育成へ利用されている。
イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認する対象の植物としては、上述したイチゴ属植物、上述したイチゴ属植物を利用した後代系統とすることができる。後代系統は、母本及び父本のいずれか一方が上述したイチゴ属植物であればよく、いわゆる同種交配による系統であっても良いし、交雑系統であっても良い。また、後代系統は、いわゆる戻し交配によって得られたものでも良い。
特に、栽培イチゴ（F. × ananassa）を対象として、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認することが好ましい。さらに、栽培イチゴの中でも上述した各種の品種・系統を用いた品種改良において、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認することが好ましい。すなわち、この場合、作出した新品種についてイチゴ炭疽病抵抗性を判別することができる。よって、新品種としては、イチゴ炭疽病抵抗性を有する品種を少なくとも一方の親として得た品種であることが好ましい。より詳細には、例えば、いちご中間母本農２号を一方の親として作出した新品種について、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認し、イチゴ炭疽病抵抗性を評価することができる。
本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーは、栽培いちご：さちのかから取得した1,502個のマーカー及びいちご中間母本農２号から取得した2,162個のマーカーを含む遺伝子連鎖地図と、イチゴ炭疽病抵抗性データとを用いたQTL（Quantitative Trait Loci）解析によって新たに同定されたものである。なお、イチゴ炭疽病抵抗性は、多数の遺伝子が関与していると考えられ、連続分布をとる量的形質である。すなわち、イチゴ炭疽病抵抗性は、連続分布をとるイチゴ炭疽病への罹患率に基づいて評価される。QTL解析には、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法を適用している。
具体的に、上述したQTL解析により、ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値（例えば2.5）以上となる領域を上記遺伝子連鎖地図に見いだした。この領域は約29.0cM（センチモルガン）であり、いちご中間母本農２号の第２３連鎖群に含まれる領域であった。ここで、「モルガン（Ｍ）」は、染色体上の遺伝子間の距離を相対的に示した単位であり、交叉価をパーセントにした値である。イチゴ属植物の染色体において、1cMは、約400kbに相当する。なお、この領域には、ロッドスコアが約18.3のピークが存在しており、当該ピーク位置又はその近傍にイチゴ属植物炭疽病抵抗性を向上させる形質の原因遺伝子（群）が存在することが示唆される。
この29.0cMの領域には、表１に示す１０種類のマーカーがこの順で含まれている。なお、表１において、マーカー名とは、本発明で独自に取得したマーカーに付された名称である。
すなわち、本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーは、イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域である。ここで、上記29.0cMの領域に含まれるピークは、配列番号４に示す塩基配列からなるマーカー（IA200064）及び配列番号８に示す塩基配列からなるマーカー（IA202631）により挟み込まれる領域に存在している。
また、この29.0cMの領域には、炭疽病抵抗性が向上する形質に連鎖するマーカーと、炭疽病抵抗性が低下する形質に連鎖するマーカーの両者を含んでいる。表１に示す１０種類のマーカーのうち、配列番号９に示す塩基配列からなるマーカー（IA202517R）は、炭疽病抵抗性が低下する形質に連鎖するマーカー（相反メーカー）であり、その他は全て炭疽病抵抗性が向上する形質に連鎖するマーカーである。
表１に示した29.0cMの領域に含まれる連続した核酸領域を、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。ここで、核酸領域とは、イチゴ属植物の染色体に存在する他の領域との同一性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下となるような塩基配列からなる領域を意味する。イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域と他の領域との同一性が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。ここで、同一性の値は、例えばＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出することができる。
また、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長は、少なくとも８塩基長以上、好ましくは１５塩基長以上、より好ましくは２０塩基長以上、最も好ましくは３０塩基長とすることができる。イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。
特に、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとしては、上記29.0cMの領域に含まれる１０種類のマーカーのうち、配列番号４に示す塩基配列と配列番号８に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域から選ばれることが好ましい。上記ピークが配列番号４に示す塩基配列と配列番号８に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に存在するためである。
また、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとしては、上記表１に示した１０種類のマーカーから選ばれる１種類のマーカーを含む核酸領域とすることもできる。例えば、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとしては、ピークの位置に最も近い配列番号８に示す塩基配列からなるマーカー（IA202631）を含む核酸領域を使用することが好ましい。このとき、マーカーを含む核酸領域の塩基配列は、当該マーカーの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたインバースPCR等の隣接配列取得法によって特定することができる。
さらに、イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる核酸領域から、複数の領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとすることもできる。
さらにまた、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとしては、上記１０種類のマーカーそのものを使用することができる。すなわち、配列番号１〜１０の塩基配列からなる１０個の領域から選ばれる１又は複数の領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとすることができる。例えば、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとしては、ピークの位置に最も近い配列番号８に示す塩基配列からなるマーカー（IA202631）を使用することが好ましい。或いは、例えば、配列番号７の塩基配列からなるマーカー（IA200826）と配列番号８の塩基配列からなるマーカー（IA202631）とで挟み込まれる領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとすることもできる。
＜イチゴ属植物におけるマーカーの同定＞
本発明では、上述したように、さちのかから取得した1,502個のマーカー及びいちご中間母本農２号から取得した2,162個のマーカーからイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを特定した。ここでは、これら1,502個と2,162個のマーカーについて説明する。このマーカーを同定する際には、特開2011-120558号公報や国際公開公報2011/074510に開示された方法を適用したDNAマイクロアレイを使用することができる。
本発明では、上述したように、さちのかから取得した1,502個のマーカー及びいちご中間母本農２号から取得した2,162個のマーカーからイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを特定した。ここでは、これら1,502個と2,162個のマーカーについて説明する。このマーカーを同定する際には、特開2011-120558号公報や国際公開公報2011/074510に開示された方法を適用したDNAマイクロアレイを使用することができる。
具体的に、当該DNAマイクロアレイに使用するプローブの設計方法は、図１に示すように、先ず、さちのか或いはいちご中間母本農２号からゲノムDNAを抽出する（工程1a）。次に、抽出したゲノムDNAを１又は複数の制限酵素により消化する（工程1b）。なお、図１に示した例では、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂの２種類の制限酵素をこの順で用いてゲノムDNAを消化している。ここで、制限酵素としては、特に限定されないが、例えば、PstI、EcoRI、HindIII、BstNI、HpaII、HaeIII等を使用することができる。特に制限酵素としては、ゲノムDNAを完全に消化した際に20〜10000塩基長のゲノムDNA断片となるよう、認識配列の出現頻度等を考慮して適宜選択することができる。また、複数の制限酵素を使用する場合、全ての制限酵素を使用した後のゲノムDNA断片が200〜6000塩基長となっていることが好ましい。さらに、複数の制限酵素を使用する場合、処理に供する制限酵素の順序は特に限定されず、また、処理条件（溶液組成や温度等）が共通する場合には複数の制限酵素を同一の反応系で使用しても良い。すなわち、図１に示した例においては、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂをこの順で使用してゲノムDNAを消化しているが、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂを同じ反応系で同時に使用してゲノムDNAを消化しても良いし、制限酵素Ｂ及び制限酵素Ａをこの順で使用してゲノムDNAを消化してもよい。さらに、使用する制限酵素の数は３以上であってもよい。
次に、制限酵素処理後のゲノムDNA断片に対してアダプターを結合する（工程1c）。ここで、アダプターとは、上述した制限酵素処理によって得られたゲノムDNA断片の両端に結合できるものであれば特に限定されない。アダプターとしては、例えば、制限酵素処理によってゲノムDNAの両末端に形成される突出末端（粘着末端）に対して相補的な一本鎖を有し、詳細を後述する増幅処理の際に使用するプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合配列を有するものを使用することができる。また、アダプターとしては、上記突出末端（粘着末端）に対して相補的な一本鎖を有し、クローニングする際のベクターに組み入れるための制限酵素認識部位を有するものを使用することもできる。
また、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化した場合には、各制限酵素に対応する複数のアダプターを準備して使用することができる。すなわち、複数の制限酵素でゲノムDNAを消化した場合に生ずる複数種類の突出末端のそれぞれに対して、相補的な一本鎖を有する複数のアダプターを使用することができる。このとき、複数の制限酵素に対応する複数のアダプターは、共通するプライマーがハイブリダイズできるように共通するプライマー結合配列を有しているものであっても良いし、それぞれ異なるプライマーがハイブリダイズできるように異なるプライマー結合配列を有するものであっても良い。
さらに、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化した場合、アダプターとしては、使用した複数の制限酵素のなかから選ばれる１つの制限酵素若しくは、使用した制限酵素のうち一部の制限酵素に対応するアダプターを準備して使用することもできる。
次に、両末端にアダプターが付加されたゲノムDNA断片を増幅する（工程1d）。プライマー結合配列を有するアダプターを使用した場合には、当該プライマー結合配列にハイブリダイズできるプライマーを使用することで上記ゲノムDNA断片を増幅することができる。或いは、アダプターを付加したゲノムDNA断片を、アダプター配列を利用してベクターにクローニングし、当該ベクターにおける所定の領域にハイブリダイズできるプライマーを用いてゲノムDNA断片を増幅することができる。なお、プライマーを用いたゲノムDNA断片の増幅反応としては、一例としてPCRを使用することができる。
また、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化するとともに、各制限酵素に対応する複数のアダプターをゲノムDNA断片に連結した場合、複数の制限酵素を用いた処理によって得られたゲノムDNA断片の全てにアダプターが連結されることとなる。この場合、アダプターに含まれるプライマー結合配列を用いて核酸増幅反応を行うことで、得られた全てのゲノムDNA断片を増幅することができる。
或いは、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化するとともに、使用した複数の制限酵素のなかから選ばれる１つの制限酵素若しくは、使用した制限酵素のうち一部の制限酵素に対応するアダプターをゲノムDNA断片に連結した場合、得られたゲノムDNA断片のうち、選ばれた制限酵素の認識配列を両末端に有するゲノムDNA断片のみを増幅することができる。
次に、増幅されたゲノムDNA断片の塩基配列を決定し（工程1e）、当該ゲノムDNA断片より短い塩基長を有し、ゲノムDNA断片内の少なくとも一部をカバーする１又は複数の領域を特定し、特定した１又は複数の領域を、栽培いちごにおけるプローブとして設計する（工程1f）。ゲノムDNA断片の塩基配列を決定する方法は、特に限定されず、サンガー法等を適用したDNAシークエンサーを利用した従来公知の方法を使用することができる。ここで、設計する領域としては、上述したように、例えば20〜100塩基長、好ましくは30〜90塩基長、より好ましくは50〜75塩基長とする。
以上のように、栽培いちごから抽出したゲノムDNAを使用して多数のプローブを設計し、設計したプローブの塩基配列に基づいて、担体上にて目的の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することでDNAマイクロアレイを作製することができる。このように作製したDNAマイクロアレイを使用することで、上述した配列番号１〜１０に示した１０種類のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを含む1,502個と2,162個のマーカーを同定することができる。
より具体的に、本発明者らは、既知の栽培いちご品種さちのか、いちご中間母本農２号及びこれらの交配後代系統（133系統）について、上述したDNAマイクロアレイを用いてシグナルデータを取得した。そして、得られたシグナルデータから遺伝子型データを取得し、この遺伝子型データを元にして、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap（Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-378）を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出した。さらに、取得したマーカーの位置情報をもとに、Mapmaker/EXP ver.3.0（A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Third Edition, January, 1993）により遺伝地図データシートを作成した。その結果、上述した配列番号１〜１０に示した１０種類のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを含む1,502個と2,162個のマーカーを同定している。
＜イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの利用＞
イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用することで、炭疽病抵抗性が未知であるイチゴ属植物（例えば、後代系統）について炭疽病抵抗性を示す系統であるか判断することができる。ここで、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用するとは、当該マーカーを含む核酸断片を特異的に増幅する方法を利用する形態、当該マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態を含む意味である。
イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用することで、炭疽病抵抗性が未知であるイチゴ属植物（例えば、後代系統）について炭疽病抵抗性を示す系統であるか判断することができる。ここで、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用するとは、当該マーカーを含む核酸断片を特異的に増幅する方法を利用する形態、当該マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態を含む意味である。
イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを含む核酸断片を特異的に増幅する方法とは、いわゆる核酸増幅法を利用することを意味する。核酸増幅法としては、目的とする核酸断片を特異的に増幅するように設計したプライマーを使用する方法、プライマーを使用することなく目的とする核酸断片を特異的に増幅する方法が挙げられる。
目的とする核酸断片を特異的に増幅するプライマーとは、核酸増幅法によって、上述のように定義されたイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを含む核酸断片を増幅できるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーを使用する核酸増幅法としては、特に限定されず、PCR(Polymerase Chain Reaction)法に代表される核酸断片を増幅させるものであればどのようなものでもかまわない。例えば、PCR法以外に、RCA(Rolling Circle Amplification)法、CPT(Cycling Probe Technology)法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids)法、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method)法、及びTMA(Transcription mediated amplification method)法等の公知の方法が例示できるが、これらに限定されるものではない。
これら核酸増幅反応のうち例えばPCR法を利用する場合、イチゴ属植物の染色体におけるイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを挟み込むように一対のプライマーを設計する。また、LAMP法を利用する場合、イチゴ属植物の染色体におけるイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを挟み込むように４種類のプライマーを設計する。
プライマーを使用しない核酸増幅法としては、特に限定されないが、LCR(Ligase Chain Reaction)法を挙げることができる。ただし、LCR法においても、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを含む核酸断片にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを設計する。
以上のように、核酸増幅法によれば、検査対象のイチゴ属植物に上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーが存在している場合、当該マーカーを含む核酸断片を増幅産物として得ることができる。言い換えると、検査対象のイチゴ属植物から抽出した染色体を鋳型とした核酸増幅法によって所期の核酸断片を増幅した場合には、当該検査対象のイチゴ属植物が炭疽病抵抗性を有すると判断することができる。
増幅した核酸断片を検出するには、特に限定されないが、増幅反応後の溶液をアガロース電気泳動にかけ、Ethidium BromideやSYBR Greenなどの蛍光性インターカレーターを結合させ特異的な蛍光を観察する方法、核酸増幅反応の溶液に蛍光性インターカレーターを添加し、増幅反応後の蛍光検出を行う方法、蛍光標識されたプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、増幅反応後の蛍光検出を行う方法等を挙げることができる。
なお、核酸増幅法を利用してイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出する場合、当該マーカーを含む増幅断片の塩基長は、核酸増幅方法の原理等によっても異なるが、例えば30〜10000塩基長とすることができ、50〜5000塩基長とすることが好ましく、70〜2000塩基長とすることがより好ましい。
また、イチゴ属植物における炭疽病抵抗性を判定する際、複数のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出しても良い。すなわち、イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる核酸領域から選ばれる複数の領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとし、これら複数のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出しても良い。例えば、配列番号１〜１０の塩基配列からなる１０個の領域から選ばれる複数の領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとし、これら複数の領域を検出しても良い。
一例としては、配列番号７の塩基配列からなる領域（IA200826）と配列番号８の塩基配列からなる領域（IA202631）とをそれぞれイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとし、これら各領域を核酸増幅法により増幅してイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存否を確認することができる。或いは、一例として、配列番号７の塩基配列からなる領域（IA200826）と配列番号８の塩基配列からなる領域（IA202631）とで挟み込まれる領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとし、この領域を核酸増幅法により増幅してイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存否を確認することができる。
一方、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態において、当該プローブとは、上述のように定義されたイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーに対して、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、上述のように定義されたイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの塩基配列又はその相補鎖の少なくとも連続する１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、５０塩基又はそれ以上の塩基長の部分領域若しくは全領域として設計することができる。なお、このプローブを有するDNAマイクロアレイとしては、ガラスやシリコーン等の平面基板を担体とするマイクロアレイや、マイクロビーズを担体とするビーズアレイ、或いは中空繊維の内壁にプローブを固定する３次元マイクロアレイ等の如何なるタイプのマイクロアレイであってもよい。
以上のように作製されたDNAマイクロアレイを使用することで、後代系統等に代表される炭疽病抵抗性の表現型が未知のイチゴ属植物について、炭疽病抵抗性に優れるという表現型を示す系統であるか判断することができる。なお、上述したDNAマイクロアレイを使用する方法以外であっても、従来公知の手法を用いて上述したイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出して、供試イチゴ属植物について炭疽病抵抗性に優れるという形質を有する系統であるか判断してもよい。DNAマイクロアレイを使用する方法以外の方法としては、例えば、上述したプローブを用いた、いわゆるFISH（fluorescence in situ hybridization）法を適用することができる。
DNAマイクロアレイを使用する方法をより詳細に説明する。図２に示すように、先ず供試イチゴ属植物からゲノムDNAを抽出する。この供試イチゴ属植物とは、後代系統等の炭疽病抵抗性の表現型が未知のイチゴ属植物及び/又は後代系統を作製する際に使用した親のイチゴ属植物のことであり、炭疽病抵抗性に優れるといった形質を有するか判定する対象となるイチゴ属植物である。
次に、抽出したゲノムDNAを、上記＜イチゴ属植物におけるマーカーの同定＞の欄で説明したDNAマイクロアレイを作製する際に使用した制限酵素で消化して複数のゲノムDNA断片を調整する。次に、得られたゲノムDNA断片と、DNAマイクロアレイを作製する際に使用したアダプターとを連結する。次に、両末端にアダプターが付加されたゲノムDNA断片を、DNAマイクロアレイを作製する際に使用したプライマーを用いて増幅する。これにより、DNAマイクロアレイを作製する際の工程1dで増幅したゲノムDNA断片に対応する、供試イチゴ属植物由来のゲノムDNA断片を増幅することができる。
この工程においては、アダプターが付加されたゲノムDNA断片のうち、所定のゲノムDNA断片を選択的に増幅してもよい。例えば、複数の制限酵素に対応する複数のアダプターを使用した場合には、特定のアダプターが付加されたゲノムDNA断片を選択的に増幅することができる。また、複数の制限酵素でゲノムDNAを消化した場合、得られたゲノムDNA断片のうち、所定の制限酵素に対応する突出末端を有するゲノムDNA断片のみにアダプターを付加することで、アダプターが付加されたゲノムDNA断片を選択的に増幅することができる。このように、所定のゲノムDNA断片を選択的に増幅することで濃縮することができる。
次に、増幅したゲノムDNA断片に標識を付加する。標識としては、従来公知の如何なる物質を使用しても良い。標識としては、例えば蛍光分子、色素分子、放射性分子等を使用することができる。なお、本工程は、ゲノムDNA断片を増幅する工程において標識を有するヌクレオチドを用いることで省略することができる。上記工程において標識を有するヌクレオチドを用いてゲノムDNA断片を増幅することで、増幅されたDNA断片が標識化されるためである。
次に、標識を有するゲノムDNA断片を所定の条件下でDNAマイクロアレイに接触させ、DNAマイクロアレイに固定されたプローブと標識を有するゲノムDNA断片とをハイブリダイズさせる。このとき、ハイブリダイズさせる際には高いストリンジェンシー条件とすることが好ましい。このような高いストリンジェンシー条件とすることによって、供試イチゴ属植物にイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーが存在しているか否かを、より高精度に判定することができる。なお、ストリンジェンシー条件は、反応温度及び塩濃度で調節することができる。すなわち、より高温とすることでより高いストリンジェンシー条件となり、またより低い塩濃度でより高いストリンジェンシー条件となる。例えば、50〜75塩基長のプローブを使用する場合、ハイブリダイゼーション条件としては、40〜44℃、0.2%SDS、6×SSCの条件とすることでより高いストリンジェンシー条件とすることができる。
また、プローブと標識を有するゲノムDNA断片とのハイブリダイズは、標識に基づいて検出することができる。すなわち、上述した標識を有するゲノムDNA断片とプローブのハイブリダイズ反応の後、未反応のゲノムDNA断片等を洗浄し、その後、プローブに対して特異的にハイブリダイズしたゲノムDNA断片の標識を観察する。例えば、標識が蛍光物質である場合にはその蛍光波長を検出し、標識が色素分子であればその色素波長を検出する。より具体的には、通常のDNAマイクロアレイ解析に使用している、蛍光検出装置やイメージアナライザー等の装置を使用することができる。
以上のように、核酸増幅法を利用する方法或いはDNAマイクロアレイを使用する方法により、供試イチゴ属植物が上述したイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを有するか否か判断することができる。ここで、上述したように、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーのうち、炭疽病抵抗性に優れるという形質に連鎖するイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーが存在していれば、炭疽病抵抗性に優れる系統・品種と判断できる。また、上述したように、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーのうち、炭疽病抵抗性が低下する形質に連鎖するイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーが非存在であれば、炭疽病抵抗性に優れる系統・品種と判断できる。
特に、上述した方法では、供試イチゴ属植物を実際の炭疽病抵抗性試験を実施可能な程度まで成長させる必要はなく、例えば後代系統の種子や当該種子を発芽させた幼苗を使用することができる。したがって、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用することによって、供試イチゴ属植物を生育させるための圃場やその他、生育のためのコストを大幅に削減することができる。また、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用することによって、実際に炭疽菌の原因微生物（Glomerella cingulate及び/又はColletotrichum acutatum）を感染させる必要がなく、大規模専用温室や専用圃場、外部との隔離施設など設備等にかかるコストを削減できる。
特に、イチゴ属植物の新品種作出に際して、先ず、交配により数万種類の交配種を作製した後、実生選抜に先立って若しくは実生選抜に代えて、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用した判断を行うことが好ましい。これにより、実際の圃場において、優良な系統を栽培する数を大幅に削減することができ、イチゴ属植物の新品種作出に係る手間やコストを大幅に抑制することができる。
或いは、イチゴ属植物の新品種作出に際して、先ず、交配に使用する親品種におけるイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在の有無を判定し、炭疽病抵抗性に優れた親品種を選抜することもできる。炭疽病抵抗性に優れた親品種を優先的に使用して後代系統を作出することで、炭疽病抵抗性に優れた後代系統が高頻度に出現すると期待できる。これにより、優良な系統を栽培する数を大幅に削減することができ、イチゴ属植物の新品種作出に係る手間やコストを大幅に抑制することができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
１．DNAマイクロアレイ用プローブの作成
(1)材料
栽培いちご品種：さちのか及びいちご中間母本農２号を用いた。
(1)材料
栽培いちご品種：さちのか及びいちご中間母本農２号を用いた。
(2)制限酵素処理
これら栽培いちご品種からそれぞれゲノムDNAをCTAB法（Cetyl trimethyl ammonium bromide法）により抽出した。抽出したゲノムDNA(180ng)を制限酵素PstI(NEB社、6unit)で37℃、1時間処理した。その後、PstI処理後のゲノムDNA(150ng)を制限酵素BstNI(NEB社、5unit)を添加、60℃で1時間処理した。
これら栽培いちご品種からそれぞれゲノムDNAをCTAB法（Cetyl trimethyl ammonium bromide法）により抽出した。抽出したゲノムDNA(180ng)を制限酵素PstI(NEB社、6unit)で37℃、1時間処理した。その後、PstI処理後のゲノムDNA(150ng)を制限酵素BstNI(NEB社、5unit)を添加、60℃で1時間処理した。
(3)アダプターライゲーション
(2)で処理したゲノムDNA断片(120ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’（配列番号１１）、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ （配列番号１２）)とT4 DNA Ligase(NEB社、800 unit)を加え、16℃で4時間以上の条件でライゲーション反応を行った。これにより、(2)で処理したゲノムDNA断片のうち、両末端にPstI認識配列を有するゲノムDNA断片に対して選択的にアダプターを付加した。
(2)で処理したゲノムDNA断片(120ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’（配列番号１１）、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ （配列番号１２）)とT4 DNA Ligase(NEB社、800 unit)を加え、16℃で4時間以上の条件でライゲーション反応を行った。これにより、(2)で処理したゲノムDNA断片のうち、両末端にPstI認識配列を有するゲノムDNA断片に対して選択的にアダプターを付加した。
(4)PCR増幅
(3)で得られたアダプターを有するゲノムDNA断片(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’（配列番号１３）)とTaq polymerase(タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
(3)で得られたアダプターを有するゲノムDNA断片(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’（配列番号１３）)とTaq polymerase(タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
(5)ゲノムシークエンス取得
(4)においてPCR増幅したゲノムDNA断片についてGAII(Illumina社)を用いて塩基配列を決定した。
(4)においてPCR増幅したゲノムDNA断片についてGAII(Illumina社)を用いて塩基配列を決定した。
(6)プローブ設計及びDNAマイクロアレイの作成
(5)のゲノムシークエンス情報をもとに50〜75bpのプローブを設計した。設計したプローブの塩基配列情報をもとに、これらプローブを有するDNAマイクロアレイを作製した。
(5)のゲノムシークエンス情報をもとに50〜75bpのプローブを設計した。設計したプローブの塩基配列情報をもとに、これらプローブを有するDNAマイクロアレイを作製した。
２．DNAマイクロアレイを用いたシグナルデータの取得
(1)材料
栽培いちご品種：さちのか、いちご中間母本農２号及びこれらの交雑後代133系統を用いた。
(1)材料
栽培いちご品種：さちのか、いちご中間母本農２号及びこれらの交雑後代133系統を用いた。
(2)制限酵素処理
これら栽培いちご品種及び交雑後代からそれぞれゲノムDNAをCTAB法により抽出した。抽出したゲノムDNA(180ng)を制限酵素PstI(NEB社、6unit)で37℃、1時間処理した。その後、PstI処理後のゲノムDNA(150ng)を制限酵素BstNI(NEB社、5unit)を添加、60℃で1時間処理した。
これら栽培いちご品種及び交雑後代からそれぞれゲノムDNAをCTAB法により抽出した。抽出したゲノムDNA(180ng)を制限酵素PstI(NEB社、6unit)で37℃、1時間処理した。その後、PstI処理後のゲノムDNA(150ng)を制限酵素BstNI(NEB社、5unit)を添加、60℃で1時間処理した。
(3)アダプターライゲーション
(2)で処理したゲノムDNA断片(120ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’（配列番号１１）、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ （配列番号１２）)とT4 DNA Ligase(NEB社、800 unit)を加え、16℃で4時間以上の条件でライゲーション反応を行った。これにより、(2)で処理したゲノムDNA断片のうち、両末端にPstI認識配列を有するゲノムDNA断片に対して選択的にアダプターを付加した。
(2)で処理したゲノムDNA断片(120ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’（配列番号１１）、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ （配列番号１２）)とT4 DNA Ligase(NEB社、800 unit)を加え、16℃で4時間以上の条件でライゲーション反応を行った。これにより、(2)で処理したゲノムDNA断片のうち、両末端にPstI認識配列を有するゲノムDNA断片に対して選択的にアダプターを付加した。
(4)PCR増幅
(3)で得られたアダプターを有するゲノムDNA断片(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’（配列番号１３）)とTaq polymerase(タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
(3)で得られたアダプターを有するゲノムDNA断片(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’（配列番号１３）)とTaq polymerase(タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
(5)ラベル化
上述した(4)で得られたPCR増幅断片をカラム(Qiagen社)で精製後、NimbleGen Arrays User’s Guideに従ってNimbleGen One-Color DNA Labelingを用いてラベル化サンプルを調整した。
上述した(4)で得られたPCR増幅断片をカラム(Qiagen社)で精製後、NimbleGen Arrays User’s Guideに従ってNimbleGen One-Color DNA Labelingを用いてラベル化サンプルを調整した。
(6)ハイブリ・シグナル検出
(5)のラベル化サンプルを用い、NimbleGen Array User's Guideに従い、上記１．で作製したDNAマイクロアレイを用いてハイブリダイズを行い、ラベルに基づくシグナルを検出した。
(5)のラベル化サンプルを用い、NimbleGen Array User's Guideに従い、上記１．で作製したDNAマイクロアレイを用いてハイブリダイズを行い、ラベルに基づくシグナルを検出した。
３．イチゴ属植物炭疽病抵抗性のQTLの同定及びマーカーの開発
(1)遺伝地図データ作成
さちのか、いちご中間母本農２号、交雑後代133系統のシグナルデータから、さちのか型の1,502個のマーカー及びいちご中間母本農２号型の2,162個のマーカーとなりうる遺伝子型データを取得した。遺伝子型データをもとに、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap（Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-378）を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出してマーカーの遺伝地図データを取得した。
(1)遺伝地図データ作成
さちのか、いちご中間母本農２号、交雑後代133系統のシグナルデータから、さちのか型の1,502個のマーカー及びいちご中間母本農２号型の2,162個のマーカーとなりうる遺伝子型データを取得した。遺伝子型データをもとに、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap（Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-378）を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出してマーカーの遺伝地図データを取得した。
(2)イチゴ炭疽病検定試験データの取得
さちのか、いちご中間母本農２号、交雑後代103系統のランナー増殖したクローン株を検定株とした。各検定株について１区５株×３反復で栽培した。接種２日前までに展開葉が３〜４枚になるように下葉を除去して葉数をそろえた。
さちのか、いちご中間母本農２号、交雑後代103系統のランナー増殖したクローン株を検定株とした。各検定株について１区５株×３反復で栽培した。接種２日前までに展開葉が３〜４枚になるように下葉を除去して葉数をそろえた。
そして、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構の野菜茶業研究所が保有しているイチゴ炭疽病菌株（Glomerella cingulate）をPS液体培地(1000mlに対しマッシュポテト20g、しょ糖2％)中にて５日間振盪培養(120rpm)した。培養液をガーゼで濾過した後、分生胞子を105個/mlの濃度に調整したものを接種源(分生胞子懸濁液)とした。2012年9月19日、気温が低下し始める午後３時より、調整した接種源(分生胞子懸濁液)を電池式肩掛け動力噴霧器にて、展着剤などは添加せずに、植物体が全体的に濡れる程度まで噴霧した。
その後、寒冷紗で内張遮光をしたガラス室内で発病させた。接種当日から翌日の昼までガラス室を閉めきり、多湿に保った。その後、天窓・側窓を自動開閉(25℃)として、温度は成り行きで管理した。イチゴ炭疽病罹病株の調査は、10月19日に各品種・系統について萎凋もしくは枯死した株の割合として調査した。調査結果を図３に示した。
(3)量的形質（Quantitative trait loci: QTL）の解析
上記(1)で得られた遺伝地図データ及び上記(2)で得られたイチゴ炭疽病検定試験データ（萎凋・枯死株率）をもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法によりQTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。その結果、図４に示すように、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の区間内にLOD値18.3のイチゴの炭疽病抵抗性に関する遺伝子の存在を示唆するピークを確認することができた。得られたピークは表２に示すように特定することができ、当該ピークの位置に炭疽病抵抗性を向上させる機能を有する原因遺伝子（群）が存在することが示唆された。
上記(1)で得られた遺伝地図データ及び上記(2)で得られたイチゴ炭疽病検定試験データ（萎凋・枯死株率）をもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法によりQTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。その結果、図４に示すように、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の区間内にLOD値18.3のイチゴの炭疽病抵抗性に関する遺伝子の存在を示唆するピークを確認することができた。得られたピークは表２に示すように特定することができ、当該ピークの位置に炭疽病抵抗性を向上させる機能を有する原因遺伝子（群）が存在することが示唆された。
なお、表２において効果（％）の欄は、炭疽病萎凋・枯死株率を示している。よって、効果（％）の数値が負である場合、当該QTLは炭疽病抵抗性が向上する形質に連鎖することを意味している。
そして、図４に示すように、当該ピークの近傍に位置するマーカーは、炭疽病抵抗性を向上させる機能を有する原因遺伝子（群）と連鎖して遺伝するため、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとして使用できることが示された。すなわち、図４に示した１０種類のマーカーは、イチゴ属植物炭疽病抗性関連マーカーとして使用できることが明らかとなった。
また、本実施例で作成したプローブの塩基配列及びシグナル値の閾値を表３に示した。
また、本実施例で作成したプローブの塩基配列及びシグナル値の閾値を表３に示した。
表３に示したプローブを利用して、さちのか及びいちご中間母本農２号、並びに後代系統について、マーカーIA204069からIA201502のシグナルを検出した結果をそれぞれ図５乃至１４に示した（なお、図５乃至１４において中母２号＊はいちご中間母本農２号を意味している）。また、検出結果を表４に纏めて示した。
表４及び図５〜１４に示すように、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域は、イチゴ属植における炭疽病萎凋・枯死株率(%)と高い関連性を示すことが明らかとなった。
４．PCRベースマーカーの開発
また、本実施例では、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域のなかからマーカーIA202631及びIA200826をPCRによって増幅するプライマーを設計した。
また、本実施例では、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域のなかからマーカーIA202631及びIA200826をPCRによって増幅するプライマーを設計した。
(1)プライマー作製
シーケンスアセンブリソフトウェアATGC ver.6を使い、マーカーIA202631及びIA200826の配列情報から、それぞれの配列を識別するプライマーを作製した。すなわち、IA202631についてはCGGTTAACCCCTCCTAGAAAATC（IA202631F_2A：配列番号２４）とTGCAGCTGTGAGGTTGTCTTTAT（IA202631R_111A：配列番号２５）を設計し、IA200826についてはCTGCAGAAAAGGGAGAAGAAGTTC（IA200826F_1A：配列番号２６）とGCCAGATGAAATAGAAGATTAGCACC（IA200826R_259A：配列番号２７）を設計した。
シーケンスアセンブリソフトウェアATGC ver.6を使い、マーカーIA202631及びIA200826の配列情報から、それぞれの配列を識別するプライマーを作製した。すなわち、IA202631についてはCGGTTAACCCCTCCTAGAAAATC（IA202631F_2A：配列番号２４）とTGCAGCTGTGAGGTTGTCTTTAT（IA202631R_111A：配列番号２５）を設計し、IA200826についてはCTGCAGAAAAGGGAGAAGAAGTTC（IA200826F_1A：配列番号２６）とGCCAGATGAAATAGAAGATTAGCACC（IA200826R_259A：配列番号２７）を設計した。
また、同様に、シーケンスアセンブリソフトウェアATGC ver.6を使い、マーカーIA202531及びIA200064の配列情報から、それぞれの配列を識別するプライマーを作製した。すなわち、IA202531についてはGCTACTCATAGTAGGTCGATTGGAAG：配列番号２８とCTGCAGTTTACATGCAGCAGA：配列番号２９を設計し、IA200064についてはAAGTTCAACATTATCAAGGAAAATGAA：配列番号３０とAATTGATAACTATTAACAGCAGTCAGG：配列番号３１を設計した。
(2)PCR増幅
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代12系統のゲノムDNA（15ng）に、上記プライマーペアとTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit）を加え、PCR（98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。マーカーIA200826をPCR増幅した結果を図１５に示し、マーカーIA202631をPCR増幅した結果を図１６に示した。図１５及び図１６に示すように、表４に示したシグナルデータと一致して、いずれのプライマーペアも目的のバンドパターンを増幅できることが示された。
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代12系統のゲノムDNA（15ng）に、上記プライマーペアとTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit）を加え、PCR（98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。マーカーIA200826をPCR増幅した結果を図１５に示し、マーカーIA202631をPCR増幅した結果を図１６に示した。図１５及び図１６に示すように、表４に示したシグナルデータと一致して、いずれのプライマーペアも目的のバンドパターンを増幅できることが示された。
また、マーカーIA202531をPCR増幅した結果を図２０に示した。図２０に示すように、マーカーIA202531についても、表４に示したシグナルデータと一致して、上述のように設計したプライマーペアにより目的のバンドパターンを増幅できることが示された。
ところで、マーカーIA200064については、イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号のゲノムDNAを鋳型としたPCRの後、PCR増幅したDNA断片をサンガー法でシーケンスした。その結果、さちのかゲノムからは配列番号３２に示す配列情報が得られ、中間母本農２号ゲノムからは配列番号３２に示す配列情報と配列番号４に示す配列情報とが得られた。配列番号３２と配列番号４とにおける257番目は、SNP（配列番号３２ではA、配列番号４ではT）であることが判明した。配列番号３２において、257番目のAから６塩基（ATGCAT）は、制限酵素Nsi Iの認識配列（ATGCAT）と一致していた。
そして、マーカーIA200064を上記他のマーカーと同様にPCR増幅し、PCR増幅したDNA断片にNsi I（NEB社、2 unit）を加え、37℃で1時間処理した。制限酵素処理したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。マーカーIA200064をPCR増幅し、制限酵素処理した結果を図２１に示した。制限酵素認識部位を有するさちのかでは247塩基と261塩基近傍にバンドが現れたが、一方、中間母本農２号では、247塩基と261塩基近傍のバンドに加え500塩基近傍にバンドが現れた。図２１に示すように、500塩基近傍のバンドは、表４に示したシグナルデータと一致して、上述のように設計したプライマーペアにより目的のバンドパターンを増幅できることが示された。
５．炭疽病抵抗性系統の選抜
(1)遺伝子型データと炭疽病萎凋・枯死株率
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代133系統の選抜マーカーIA200826の遺伝子型データと炭疽病萎凋・枯死株率を比較した（図１７）。イチゴ炭疽病への抵抗性に優れる系統の多くは、選抜マーカーIA200826を持っていた（平均10.6%）。一方、イチゴ炭疽病への罹病性を示す系統の多くは、選抜マーカーIA200826を持っていなかった（平均49.8%）。T検定の結果、有意水準1%で両平均値に有意な差が認められた。
(1)遺伝子型データと炭疽病萎凋・枯死株率
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代133系統の選抜マーカーIA200826の遺伝子型データと炭疽病萎凋・枯死株率を比較した（図１７）。イチゴ炭疽病への抵抗性に優れる系統の多くは、選抜マーカーIA200826を持っていた（平均10.6%）。一方、イチゴ炭疽病への罹病性を示す系統の多くは、選抜マーカーIA200826を持っていなかった（平均49.8%）。T検定の結果、有意水準1%で両平均値に有意な差が認められた。
(2)未知系統の選抜
I.ゲノムDNAの抽出
新たに、イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号の交雑後代2系統(A及びB)について、CTAB法によりゲノムDNAを抽出した。
I.ゲノムDNAの抽出
新たに、イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号の交雑後代2系統(A及びB)について、CTAB法によりゲノムDNAを抽出した。
II.選抜マーカーによる検定
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代2系統(A及びB)のゲノムDNA（15ng）に、上記４．で設計したIA202631プライマーペア（IA202631F_2A及びIA202631R_111A）或いはIA200826プライマーペア（IA200826F_1A及びIA200826R_259A）とTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit）を加え、PCR（98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。その結果を図１８に示した。図１８に示すように、交雑後代A系統は、IA202631及びIA200826のいずれのマーカーも保有していなかった。一方、交雑後代B系統は、IA202631及びIA200826の両方のマーカーを保有していた。
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代2系統(A及びB)のゲノムDNA（15ng）に、上記４．で設計したIA202631プライマーペア（IA202631F_2A及びIA202631R_111A）或いはIA200826プライマーペア（IA200826F_1A及びIA200826R_259A）とTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit）を加え、PCR（98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。その結果を図１８に示した。図１８に示すように、交雑後代A系統は、IA202631及びIA200826のいずれのマーカーも保有していなかった。一方、交雑後代B系統は、IA202631及びIA200826の両方のマーカーを保有していた。
III.炭疽病検定試験データとの比較
炭疽病検定試験の結果、交雑後代A系統及び交雑後代B系統の炭疽病萎凋・枯死株率は、それぞれ80.0%と13.3%であった。T検定の結果、有意水準1%で系統Aおよび系統Bの炭疽病萎凋・枯死株率に有意な差が認められた。IA202631及びIA200826マーカーを保有していた交雑後代B系統は、炭疽病萎凋・枯死株率が低く、イチゴ炭疽病の抵抗性に優れていた。一方、IA202631及びIA200826のマーカーをいずれも保有していなかった交雑後代A系統は、炭疽病萎凋・枯死株率が高く、イチゴ炭疽病の抵抗性が劣っていた。以上の結果から、これらのマーカーを利用することで、炭疽病抵抗性に優れる系統、炭疽病抵抗性に劣る系統を判別できることが明らかとなった。
炭疽病検定試験の結果、交雑後代A系統及び交雑後代B系統の炭疽病萎凋・枯死株率は、それぞれ80.0%と13.3%であった。T検定の結果、有意水準1%で系統Aおよび系統Bの炭疽病萎凋・枯死株率に有意な差が認められた。IA202631及びIA200826マーカーを保有していた交雑後代B系統は、炭疽病萎凋・枯死株率が低く、イチゴ炭疽病の抵抗性に優れていた。一方、IA202631及びIA200826のマーカーをいずれも保有していなかった交雑後代A系統は、炭疽病萎凋・枯死株率が高く、イチゴ炭疽病の抵抗性が劣っていた。以上の結果から、これらのマーカーを利用することで、炭疽病抵抗性に優れる系統、炭疽病抵抗性に劣る系統を判別できることが明らかとなった。
IV.マーカー間領域でのPCR増幅
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号のゲノムDNA（15ng）に、プライマーペア（IA200826F_1AおよびIA202631R_111A）とTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit）を加え、PCR（98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を2分間、25サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。その結果を図１９に示した。図１９に示すように、いちご中間母本農２号では、1.4kbpのPCR増幅したDNA断片が確認された。すなわち、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域のなかからマーカーIA202631及びIA200826を含む領域をPCRによって増幅することができた。
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号のゲノムDNA（15ng）に、プライマーペア（IA200826F_1AおよびIA202631R_111A）とTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit）を加え、PCR（98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を2分間、25サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。その結果を図１９に示した。図１９に示すように、いちご中間母本農２号では、1.4kbpのPCR増幅したDNA断片が確認された。すなわち、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域のなかからマーカーIA202631及びIA200826を含む領域をPCRによって増幅することができた。
この結果から、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域のなかから複数のマーカーを一対のプライマーペアで増幅して、イチゴ属植物炭疽病を判別できることが明らかとなった。
Claims (7)
- イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
- 上記核酸領域は、配列番号１〜１０からなる群から選ばれるいずれか１の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする請求項１記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
- 上記核酸領域は、イチゴ属植物の染色体における配列番号４に示す塩基配列と配列番号８に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に位置することを特徴とする請求項１記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
- 少なくとも一方の親がイチゴ属植物である後代植物の染色体及び/又は当該親のイチゴ属植物の染色体を抽出する工程と、
上記で得られた染色体における上記請求項１乃至３いずれか１に記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、炭疽病抵抗性が向上したイチゴ属植物系統の製造方法。 - 上記測定する工程では、上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅反応により当該イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定することを特徴とする請求項４記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
- 上記測定する工程では、上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする請求項４記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
- 上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする請求項４記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102053753B1 (ko) * | 2019-01-14 | 2019-12-09 | 한국생명공학연구원 | 탄저병 저항성 딸기 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도 |
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