KR20170003748A

KR20170003748A - 토마토 근부위조병 저항성 유전자 선발용 분자마커

Info

Publication number: KR20170003748A
Application number: KR1020150092628A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 김빛샘
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2017-01-10
Also published as: KR101755231B1

Abstract

본 발명은 토마토 근부위조병(Fusarium crown root rot, FCRR) 저항성 유전자 선발용 분자 마커에 관한 것으로서, 상세하게는 토마토 근부위조병 저항성 판별용 프라이머 세트, 토마토 근부위조병 저항성 판별용 키트 및 토마토 근부위조병 저항성 판별 방법을 제공한다. 이러한 DNA 마커를 이용하여 근부위조병 저항성 품종을 매우 신속하고 정확하게 육성함으로써 종자회사의 육종프로그램에 크게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

토마토 근부위조병 저항성 유전자 선발용 분자마커{Molecular marker for selecting fusarium crown root rot resistance gene in tomato}

본 발명은 토마토 근부위조병 저항성 유전자 선발용 분자마커에 대한 것이다.

토마토 근부위조병(Fusarium crown root rot, FCRR)은 Fusarium oxysporum f. sp . radicis - lycopersici (FORL)에 의해 발병하는 토양성 전염병으로, 감염된 식물은 과실을 맺기 전에 고사하거나 과실의 품질을 저하시킨다. 한국을 비롯하여 세계적으로 발병하고 있으며, FORL에 저항성을 가지는 유전자 Frl은 9번 염색체의 long arm 부근에 위치한다고 알려져 있다. Fazio et al.(1999)에서는 RAPD 마커를 이용한 유전자 지도작성을 통해 Frl과 가까이 위치하는 마커를 찾고, 이들 마커들이 UBC655-UBC116-UBC194-Frl 순으로 위치하는 것을 밝혔으나, 토마토 근부위조병 저항성 식물의 마커이용선발(Marker-assisted selection, MAS) 및 저항성 유전자의 클로닝을 위해서는 마커-표현형 연관 분석에 대한 추가적인 연구가 필요하다.

한국공개특허 10-2012-0121639(2012.11.06 공개)

본 발명의 목적은 토마토 근부위조병 저항성 판별용 DNA 마커 조성물, 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 근부위조병 저항성 판별 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 토마토 근부위조병(Fusarium crown root rot, FCRR) 저항성 판별용 DNA 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 토마토 근부위조병(Fusarium crown root rot, FCRR) 저항성 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토 근부위조병 저항성 판별 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 토마토 근부위조병 저항성 판별 방법을 제공한다.

본 발명은 토마토 근부위조병 저항성 유전자 선발용 분자마커에 관한 것으로서, 토마토의 신품종 육성에 요구되는 근부위조병 형질을 선발해 낼 수 있는 DNA 마커를 유전자 지도 방법으로 개발하였다. 이러한 DNA 마커를 이용하여 근부위조병 저항성 품종을 매우 신속하고 정확하게 육성함으로써 종자회사의 육종프로그램에 크게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

도 1은 PNU-D4 프라이머를 통해 AV107-4 및 L3708로부터 증폭된 PCR 단편의 서열을 나타낸다. 단일 염기 다형성(Single nucleotide polymorphisms; SNP)은 파란색으로 표시하였고, RFLP 분석에 사용된 SNP는 녹색 직사각형으로 표시하였다.
도 2는 토마토 근부위조병(Fusarium crown root rot, FCRR)에 대한 저항성 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 Fusarium oxysporum f. sp . radicis - lycopersici (FORL)의 연관 분석에 사용된 14개 마커의 유전적 및 물리적 위치를 나타낸다.
도 4(A)는 토마토 상업품종(F1 hybrid)에 대한 FORL-저항성 시험 결과를 나타낸다. 도 4(B)는 PNU-D4이 상기 품종을 대상으로 한 검정에서 근부위조병 저항성과 매우 높은 연관성이 있다는 것을 나타낸다.

이에, 본 발명자들은 Frl과 가까이 위치하는 RAPD 마커의 증폭 염기서열을 파악하여 토마토 참조 유전체(tomato reference genome)에서 위치를 파악한 후, Tomato EXPEN-2000 map상에서 유전적으로 가까이 위치하는 마커들을 선발하여 이용함으로써 Frl의 유전자좌(locus)를 보다 정밀하게 관찰하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 토마토 근부위조병(Fusarium crown root rot, FCRR) 저항성 판별용 DNA 마커 조성물을 제공한다.

서열번호 1은 'FORL 저항성 계통인 AV107-4(S. lycopersicum)'에서 증폭되는 PNU-D4 마커의 염기서열이며, 서열번호 2는 '감수성 계통인 L3708(S. pimpinellifolium)'에서 증폭되는 PNU-D4 마커의 염기서열이다.

본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 토마토 근부위조병(Fusarium crown root rot, FCRR) 저항성 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

바람직하게는, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트는 제한효소 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism; RFLP) 마커를 증폭하기 위한 것이다. 본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트는 "PNU-T1212" 마커를 증폭하기 위한 것이고, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트는 "PNU-D4" 마커를 증폭하기 위한 것이다.

바람직하게는, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트는 제한 증폭 다형성 서열(Cleaved amplified polymorphic sequence; CAPS) 마커를 증폭하기 위한 것이다. 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트는 "PNU-100431" 마커를 증폭하기 위한 것이고, 서열번호 9 및 서열번호 10로 표시되는 프라이머 세트는 "PNU-53169" 마커를 증폭하기 위한 것이다.

본 발명에 있어서, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.

본 발명에 있어서, "분자 마커" 또는 "DNA 마커"는 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 품종을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 분자 마커 또는 DNA 마커는 유전현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 개체간 다형성(polymorphism)을 나타내는 방법으로, 주로 반복 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새털라이트(microsatellite)나 유전자 염기 서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브나 SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커가 이용되고 있다.

본 발명에 있어서, "제한효소 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism; RFLP) 마커"는 제한효소에 의해 잘라진 PCR 증폭 DNA나 gemomic DNA를 아가로스 젤로 전기영동하거나 Southern blot하여 방사선 동위 원소로 표지된 탐침(probe)을 이용하여 DNA의 다형성을 찾아내는 기술이다. RFLP를 이용하여 서로 다른 DNA의 프로파일을 분석할 수 있는데, 이 프로파일의 차이는 단일 염기 서열의 변화로 인한 염기치환 돌연변이나 유전자의 삽입, 결실, 역위 등에 인한 DNA 재배열에 의해 발생하였음을 의미한다. RFLP 마커는 상대적으로 높은 다형성과 공우성을 보이며 높은 재현성을 보이는 신빙성 있는 기법이나 Southern blot이 필요한 경우 많은 양의 DNA가 필요하고, 긴 시간이 소요된다.

본 발명에 있어서, "제한 증폭 다형성 서열(Cleaved amplified polymorphic sequence; CAPS) 마커"는 SNP처럼 한 개의 염기서열이 변하거나 InDel에 의해 발생하는 제한효소에 의해 잘리는 부위의 변화를 해석할 수 있는 마커이다. CAPS 마커는 유전자좌에 특이적인 프라이머로 PCR 증폭을 한 후 제한효소로 잘라준 뒤 나타나는 다형성을 분석하는 방법이다.

본 발명에 있어서, "단순반복염기서열(simple sequence repeat; SSR) 마커"는 STR(Short Tandem Repeats)이라고도 하며, DNA 상에서 1 내지 6개의 염기가 반복되어 나타나는 서열을 말한다. 일반적으로 SSR 서열은 유전자 내에서 다양한 마커로 사용 가능하며, 특정 유전자의 복제 또는 결실에 관한 연구에 사용되기도 한다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토 근부위조병 저항성 판별 키트를 제공한다.

상기의 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2+와 같은 조인자 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.

한편, 프라이머 세트가 RFLP 마커 또는 CAPS 마커를 포함하는 경우에는 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 외에 제한효소를 필요로 한다. 즉, RFLP 마커 또는 CAPS 마커는 증폭 반응을 수행한 후에, 해당하는 제한효소로 절단해야 증폭 산물을 구별할 수 있기 때문이다.

본 발명은 (1) 토마토에서 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 PCR 증폭 산물을 제한효소로 절단하여 분석하는 단계를 포함하는 토마토 근부위조병 저항성 판별 방법을 제공한다.

토마토에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 젤 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 젤 전기영동 또는 아크릴아미드 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 식물 재료

분자 마커와 FORL-저항성 간 유전적 연관(genetic linkage or association)을 조사하기 위해, FORL 저항성 계통인 AV107-4(S. lycopersicum)과 감수성 계통인 L3708(S. pimpinellifolium)을 이용하여 F₂집단을 생성하였다. F₁ 세대를 만들기 위해 AV107-4를 모본으로, L3708을 부본으로 인공수분하고 이어서 F₁ 개체를 자가 수정시켜 F₂ 세대를 진전하였으며 이러한 F₂ 집단을 이용하여 FORL 저항성 유전자좌(locus)인 Frl의 위치를 알아내기 위한 근부위조병 검정 및 마커 유전자형 검정를 수행하였다.

또한 토마토 상업품종(F1 hybrid)에서도 마커와 FORL-저항성 간 연관을 분석하기 위해 17개의 F1 hybrid 품종을 종자회사에서 확보하여 F2 집단에서와 동일한 방법으로 병리검정 및 분자마커의 유전자형 검정을 수행하였다. 추가로 42개의 품종에 대해서는 종자회사에서 공시한 근부위조병 정보 (저항성 29 품종, 감수성 13 품종)를 이용하여 분자마커 검정 및 연관분석을 실시하였다.

2. 근부위조병 병리검정

AV107-4와 L3708을 이용하여 생성한 345개의 F₂ 개체와 17개 상업품종 (품종당 10 개체)의 근부위조병 저항성을 파악하기 위해, 병원 접종 및 발병도 측정을 비롯한 병리검정을 강릉원주대학교의 온실에서 수행하였다.

병원균 접종을 위해 FORL 균주 KACC 40031을 한국 미생물 은행(Korean Agriculture culture collection, KACC)에서 제공받아 PDA 배지에서 25℃에서 5일동안 배양한 후, 그 하생 균사를 potato dextrose broth에 옮겨 25℃에서 7일 동안 회전식 진동기에서 150rpm으로 유지하였다. 균사체들은 3겹의 소독된 거즈를 이용해 걸러지고, 포자 현탁액은 증류수로 희석되어 최종 농도를 1 x 10⁷ conidia/mL로 맞추었다. 토마토 종자는 원예용 상토가 채워진 96 hole plug tray에 심겨져 온실에서 25±5℃에서 3주간 재배되었다. 이후 각 유묘는 뿌리의 흙을 제거하기 위해 수세된 후, 뿌리 끝을 잘라 FORL 1 x 10⁷ conidia/mL 포자 현탁액에 15분 동안 침지하여 접종되었다. 접종된 식물체는 온실의 15cm 직경의 화분에 옮겨서 4주 동안 약 90%의 습도, 25±5℃로 유지하였다. 4주 후 각 식물체의 뿌리는 날카로운 칼로 잘라져 단면의 도관 갈변 정도에 따라 아래와 같이 FORL 발병도(Disease severity index, DSI)를 0에서 3까지 수치로 평가하였다.

0= 원뿌리 및 줄기 내부 갈변 없음, 1= 원뿌리 내부 갈변 약하게 발생, 2= 전체 원뿌리에서 다소 심각한 내부 갈변 발생, 3= 원뿌리에서 토양에 접한 낮은 줄기 부위에 걸쳐 심각한 내부 갈변 발생. 각 F₂ 개체의 FORL 저항성 여부는 DSI 값을 이용하였으며, 0의 값은 저항성, 1~3의 값은 감수성으로 간주하였다.

3. Frl 연관 RAPD 마커 분석

FORL 저항성 유전자인 Frl과의 연관이 보고된 random amplified polymorphic DNA (RAPD) 마커들을 PCR을 이용해 보유한 식물재료에 평가하였다. UBC#194, UBC#116, UBC#655 RAPD primer 염기서열을 Fazio의 논문에서 이용하여 PCR mixture는 40ng의 genomic DNA, 1.25uM의 primer, 1X PCR buffer, 0.2mM dNTPs 와 0.6 U 의 Taq polymerase(Solgent, Daejeon, Korea)를 사용하여 총 20ul로, PCR 조건은 94℃에서 30초 1회, 92℃에서 20초, 36℃에서 50초, 72℃에서 2분을 45회, 72℃에서 7분, 1회 후 4℃에서 10분 수행하였다. 전기영동은 1.5% Tris-acetate EDTA (TAE) agarose gel에서 160V 1시간 수행한 후 Ethidium bromide(Et-br)로 염색하여 UV로 밴드를 확인하였다.

국내 저항성 품종인 간바루네의 DNA를 이용한 PCR 결과 Frl과 가까운 UBC#194에서 보고된 저항성 DNA 절편이 관측되지 않은데 반해, UBC#116에서 저항성 밴드가 확인되었다. UBC#116의 증폭된 DNA 절편을 아가로스 젤에서 채취하여 Expin^TM Gel SV (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 정제한 후 dye-termination method를 이용해 제노텍에서 시퀀싱 수행하였다. 파악한 염기서열은 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 Tomato reference genome (http://solgenomics.net/, ITAG2.3 release) 상에서 UBC116의 물리적 위치를 파악하였다.

4. 마커 -표현형 연관 분석을 위한 마커 개발

UBC#116의 Tomato reference genome상 물리적 위치를 기반으로 Tomato EXPEN-2000 map (http://solgenomics.net/) 에서 이를 포함하는 40 cM ~55 cM 영역에서 마커를 선발하였다. 유전적, 물리적으로 UBC116과 연관된 이 마커들 중에서, AV107-4와 L3708에 PCR 증폭 후 다형성을 보이는 두개의 SSR 마커와 PCR 증폭 후 제한효소를 처리하여 다형성을 보이는 세 개의 RFLP 마커를 확인하였으며(표 1), 두 개의 SSR 마커는 SSR70 및 SSR237로 각각 map 상에서 42 cM, 50.37 cM에 위치하며, 세 개의 RFLP 마커는 T1212, Clet-2-D4, and CD3 로 각각 map 상에서 48cM, 50cM, 52.1cM에 위치하였다.

선발된 마커들의 AV107-4과 L3708 간 다형성을 검정하기 위하여 두 개의 SSR 마커는 Tomato EXPEN-2000 map에 공시된 프라이머 정보를 그대로 사용하였으나, 세 개의 RFLP 마커에 대해서는 map에 공시된 probe의 염기서열을 참조 유전체 서열에 blast하여 동일 서열을 찾아내고 이를 포함한 보다 긴 염기서열이 증폭되도록 프라이머를 제작하였다.

PCR은 genomic DNA 20ng, 각 forward 와 reverse primer 0.3M, 1X PCR buffer, 0.2mM dNTPs와 Taq polymerase 0.6 U (Solgent, Daejeon, Korea)를 총 20ul로 혼합하여, 다음과 같은 PCR 조건으로 수행하였다: 95℃에서 5분 1회, 94℃에서 30초, 결합 온도(annealing temperature; AT, 표 1)에서 30초, 72℃에서 1분을 35회, 72℃에서 7분, 1회 후 4℃에서 10분. PCR 후 SSR 마커의 경우 PCR 증폭산물을 1.5% Tris-acetate EDTA (TAE) agarose gel에서 160 V로 1시간 수행한 후 Ethidium bromide(Et-br)로 염색하여 UV light 하에서 확인하였으며, RFLP 마커들의 경우, PCR 증폭산물을 다양한 제한효소(NEB, Ipswich, Suffolk, England)를 이용하여 처리한 후 2.5% Tris-acetate EDTA (TAE) agarose gel로 전기영동하여 AV107-4과 L3708 간 다형성을 보이는 제한효소를 확인하였다.

이들 마커에 추가적인 분자마커를 개발하여 더 정밀한 Frl의 locus를 예측하기 위해서 AV107-4와 L3708의 genomic DNA를 SNP Genetics Inc. (Seoul, Korea)에 SolCAP Tomato SNP array의 Infinium platform(Illumina Inc., San Diego, CA, USA) 분석을 의뢰하여 개체간 SNP를 분석하였으며 각 SolCAP SNP들의 annotation 정보는 SGN database에서 다운로드하여 이용하였다. 9번 염색체의 5Mb~72Mb에 있는 총 8개의 SNP를 CAPS designer software (http://solgenomics.net/)를 이용하여 제한 증폭 다형성 서열(Cleaved amplified polymorphic sequence; CAPS) 마커로 전환하였다(표 1). 물리적 위치상 2개의 SNP (solcap_snp_sl_100431, 53169)는 PNU-D4와 SSR237 사이에, 2개의 SNP (solcap_snp_sl_100181, 100461)는 SSR237과 PNU-CD3 사이에, 4개의 SNP(solcap_snp_sl_43011, 46840, 58307, 63662)는 PNU-CD3와 9번 염색체의 말단 사이에 위치하였다. PCR 증폭, 제한효소, 전기영동은, 위 RFLP 마커에서 사용한 방법과 동일하게 수행하였다.

표 1은 다음과 같다. ^aSSR, 단순반복염기서열(simple sequence repeat); RFLP, 제한효소 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism); CAPS, 제한 증폭 다형성 서열(Cleaved amplified polymorphic sequence).

^b대조 유전체 서열 ITAG2.4 (http://solgenomics.net/) 상 프라이머 서열의 물리적 위치.

^CTomato EXPEN-2000 map (http://solgenomics.net/) 상 위치; -, 알려지지 않음.

^dTm, PCR 결합 온도(annealing temperatures); TD, 터치다운(touchdown) PCR

^eL3708 및 A107-4에 특이적인 PCR 단편 크기는 괄호 안에 "/"로 표시하였다.

< 실시예 1> 마커 -저항성 연관분석을 위한 마커 개발

Fazio et al.(1999)의 보고에 따르면, Frl 유전자는 9번 염색체의 long arm에 맵핑되어 RAPD 마커들과 UBC655-UBC116-UBC194-Frl 순으로 위치하며 UBC194는 Frl과 5.1 cM으로 가깝게 연관되어 있다. 본 발명에서는 AV107-4와 L3708 사이에 이들 마커들의 다형성을 관찰한 결과, UBC116과 UBC655 프라이머에서만 다형성 PCR 밴드가 관찰되어 Frl과 보다 근접한 UBC116의 PCR 밴드를 클로닝하여 염기서열을 파악하였다. 확보한 염기서열을 blast하여 reference genome(ITAG 2.4) 상의 위치를 확인한 결과, 이 400 bp 정도의 염기서열은 물리적으로 9번 염색체의 약 45 Mb, 유전적으로는 Tomato EXPEN-2000 map 상에서 50cM에 위치하였다(도 1). UBC116 마커의 염기서열이 위치하는 것으로 예측되는 염색체 지도 영역인 40 cM~ 55 cM에서 AV107-4와 L3708 간 다형성인 두 개의 SSR 마커(SSR70, SSR237)와 세 개의 RFLP 마커(PNU-T1212, -D4, -CD3)를 개발하여 F₂ 집단의 마커 유전자형을 검정하였다(표 1). 또한, 보다 상세한 Frl의 위치를 예측하기 위해 3.6Mb~72Mb에 걸친 8개 SolCAP SNP(solcap_snp_sl_100431, 53169, 100181, 100461, 43011, 46840, 58307, 63662)를 이용하여 CAPS 마커(PNU-100431, -53169, -100181, -100461, -43011, -46840, -58307, -63662)를 제작하여 F₂ 집단에 추가 검정하였다(표 1).

< 실시예 2> F ₂ 집단에서 마커 -저항성 연관분석

AV107-4와 L3708을 교배하여 생성된 총 345개의 F₂ 개체들의 FORL 균주(KACC 40031)에 대한 저항성 여부를 파악하고, 9번 염색체에 존재하는 13개 마커에 대한 유전자형을 비교해 Frl의 유전적 위치를 추정하였다. FORL 생물학적 검정 결과, AV107-4는 평균 DSI가 0.2로 높은 저항성 수준을 보인 반면 L3708은 2.38로 높은 감수성을 나타냈다(도 2). 이를 부모본으로 한 F₂집단에서는 255개의 개체가 저항성(DSI<1), 90개의 개체가 감수성(DSI<=1)으로 저항성 개체와 감수성 개체의 분리비가 3:1(χ²=0.29, P <0.05)을 따라 FORL 저항성 유전자가 단일 우성 유전하는 것을 확인하였다.

F₂ 개체들의 유전형 분석은 13개의 마커(Tomato EXPEN-2000 map 기반으로 2개의 SSR 마커와 3개의 RFLP 마커, AV107-4와 L3708 간 SNP를 기반으로 8개의 CAPS 마커)를 이용하여 수행되었다. 토마토 참조 유전체(Tomato reference genome)의 9번 염색체 3.62Mb(Tomato EXPEN-2000의 42cM)에 위치하는 SSR70 마커는 상대적으로 낮은 89.5%의 마커-저항성 일치율을 보였다. 다음 5.09Mb와 6.09Mb(48.0cM과50.0cM)에 위치하는 PNU-T1212와 PNU-D4는 각각 93.2%, 93.0%의 높은 마커-저항성 일치율을 보였다. 다음 25.17Mb에 위치하는 PNU-100431은 92.7%로 일치율이 감소했는데, 흥미롭게도 같은 수준의 일치율(92.7%)이 각각 28.02Mb, 46.42Mb, 48.78Mb, 56.94Mb (3.62Mb~56.94Mb)에 위치하는 PNU-53169, SSR237(50.37cM), PNU-100181, PNU-100461에서 관찰되었다. 이러한 넓은 영역에서 마커-저항성 일치율이 유지되는 경향은 이 영역이 유전적 재조합(genetic recombination or crossing-over)이 극도로 억제되어 염색체상 물리적 거리가 멀어짐에도 유전적 거리가 유지되는 pericentromeric region에 포함된다는 것을 암시한다. 하지만 이들 마커들의 하위영역인 63.10Mb, 64.52Mb, 67.13Mb, 68.87Mb, 72.02Mb(63.10Mb~72.02Mb)에 위치하는 PNU-CD3, PNU-43011, PNU-46840, PNU-58307, PNU-63662 마커들은 표현형과의 일치율이 90.8%에서 60.8%로 순차적으로 낮아지는 것을 알 수 있으며, 이는 마커가 염색체 long arm의 텔로미어(telomere)에 가까이 위치할수록 마커와 저항성 유전자좌 사이에서 교차의 빈도가 점차적으로 늘어나는 것을 암시한다(도 3).

< 실시예 3> 상업 품종에서 마커 -표현형 연관분석

FORL 저항성 유전자인 Frl은 염색체 교차 빈도가 제한되는 연관그룹(Linkage block) 내부에 위치하고 있기 때문에 양친으로 얻은 F₂집단에서 해당 영역에 마커를 포화시켜 더 정밀한 locus 를 찾는 것은 어려우며, 따라서 다양한 토마토 상업품종 집단에서 Frl과 마커들의 연관성을 검정해 보고자 하였다. 본 발명에서는 17개의 상업품종에 대하여 근부위조병 병리검정을 수행하였으며. 17개의 접종된 식물체 중 14개는 저항성(DSI=0), 3개는 이병성(DSI>=1)으로 나타나 종자회사에서 공시한 표현형 정보와 일치하였으며, F₂ 집단에서 저항성과 높은 일치율을 보인 5개의 마커(PNU-T1212, PNU-D4, PNU-100431, PNU-53169, SSR237)로 이들 품종들의 유전자형을 조사하여 비교하였다. 추가로, 종자회사에서 공시한 기타 29개의 저항성, 13개의 감수성 품종에서도 위 5개의 마커로 검정하였다.

이와 같이 60개 품종(17개의 감수성, 43개의 저항성)에 대하여 9번 염색체의 약 41Mb(5.09Mb~ 46.42Mb)에 걸쳐 분포하는 PNU-T1212, PNU-D4, PNU-100431, PNU-53169, SSR237 마커의 유전자형을 분석한 결과, F₂집단에서의 결과와 다르게 표현형과 가장 높은 일치율을 보였던 PNU-T1212가 감수성 품종에서 100%, 저항성 품종에서 46.51%의 낮은 일치율을 나타냈다(표 2 및 도 4). 반면에 PNU-D4 마커의 경우, 감수성 품종에서 88%, 저항성 품종에서 95%의 가장 높은 일치율을 관찰할 수 있었으며, 이 결과는 특히 종자회사의 FORL 저항성 품종 육종과정 중, PNU-T1212와 PNU-D4 사이 영역의 유전적 재조합이 빈번하게 일어났다는 것을 암시한다. PNU-D4 마커 하부의 PNU-100431, PNU-53169, SSR237 마커들에서는 일치율이 더욱 감소되는 양상을 보였다(표 2). 따라서 다양한 상업품종을 분석한 경우 F₂ 집단에서보다 마커-Frl 간 보다 높은 교차빈도가 확인되어 상세한 Frl의 locus를 추측하는 것이 가능하였다. 본 발명의 결과는 Frl 유전자가 기존에 보고된 염색체 9번의 long arm에 존재하기보다는 염색체 교차가 크게 억제되는 short arm의 pericentromeric region에 존재함을 보여준다. 본 발명에서 개발된 PNU-D4는 F2 집단과 상업 품종군을 대상으로 한 검정에서 근부위조병 저항성과 매우 높은 연관성을 보여줌으로써 향후 근부위조병 저항성 품종 육성을 위한 마커 이용 선발(marker-assisted selection, MAS)에 매우 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Cultivar	Seed Provider	Phenotype	Marker Genotype
Cultivar	Seed Provider	Phenotype	T1212	D4	100431	53169	SSR237
Alexander Deluxe	PPS	R	S	H	H	H	H
All Round	Nongwoobio	R	R	R	R	R	R
AS6*	Daeyoun	R	S	R	R	R	R
AS7*	Daeyoun	R	S	R	R	R	R
ASD-152*	Daeyoun	R	S	H	R	R	R
ASD-312*	Daeyoun	R	S	H	H	H	H
B Blocking*	Koregon	R	H	H	R	R	R
Barkus		R	S	H	H	H	H
BetaAlexander	PPS	R	S	H	H	H	H
Block*	Daeyoun	R	S	H	R	R	R
Doctor Q	Nongwoobio	R	R	R	R	R	R
DOTAERANG DIA	Koregon	R	S	H	H	H	H
Dotaerang Gourmet	Takii	R	S	H	H	H	H
Dotaerang Master	Koregon	R	S	H	H	H	H
Dotaerang Season	Koregon	R	S	H	H	H	H
Fighting	Takii	R	S	H	R	R	R
Ganbarune 11*	Daeyoun	R	S	H	H	H	H
Greenguard*	Daeyoun	R	R	R	R	R	R
Greensaver*	Daeyoun	R	R	R	R	R	R
Harmony		R	R	R	R	R	R
High Power*	Daeyoun	R	R	H	R	R	R
Kyupirang	Nongwoobio	R	S	H	H	H	H
Magnet	Sakata Korea	R	H	R	R	R	R
MB*		R	H	H	R	R	H
Prime Alexander	PPS	R	S	H	H	H	H
Rafito		R	H	H	R	R	R
Rex AD*		R	S	R	R	R	R
Shincheonggang		R	S	H	H	H	H
SPECIAL	Koregon	R	H	H	R	R	R
Spider		R	R	R	R	R	R
Spike 23*	Daeyoun	R	H	R	R	R	R
Suhosin	PPS	R	R	R	R	R	H
Super 334		R	H	H	H	H	H
Super sun road	Sakata Korea	R	H	H	H	H	S
Superprime	PPS	R	S	H	H	H	H
SUPPORT	Sakata Korea	R	H	R	R	R	R
Tosama*		R	H	H	H	H	S
TY Altorang	Nongwoobio	R	S	H	H	H	H
Ultra	PPS	R	R	R	R	R	R
Zuiken	Sakata Korea	R	S	H	H	H	H
Ace Ggul		S	S	S	S	S	S
Biolight		S	S	S	S	S	R
Charming		S	S	H	S	S	S
Dream 900*	Daeyoun	S	S	S	H	H	H
Galuxy		S	S	S	S	S	S
House Doterang		S	S	S	H	H	H
Kary		S	S	S	H	H	R
Koko		S	S	S	H	H	S
Marune TY*	Daeyoun	S	H	S	H	H	H
Maskara		S	S	S	H	H	R
Olkeepper*		S	S	H	-	R	R
Sinhunggwang		S	S	S	H	H	H
Super Ace		S	S	S	S	S	S
Super Doterang		S	S	R	H	H	R
Tenten		S	S	S	H	H	S
Tiara	PPS	S	S	S	H	H	H
Umgi		S	S	S	H	H	H

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Molecular marker for selecting fusarium crown root rot resistance gene in tomato <130> ADP-2015-0286 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 851 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum L. <400> 1 gttatgaaaa tactcatata tctcaaattt ctgcatattc tcaccttttg gaatctttcc 60 acaaagtcta ttataactca cgttcaaaat ttgccacgga ttcttcgata ttattttcgg 120 tatactccca taaatcttat tatgactcaa atccaacctc cataacccct tcccaaacgt 180 caattttgac atatcgaatt caaatttatt ccgatccaat aacatttcaa acgtagtctt 240 atctttacca aacaaaaacg aaatatcccc ttcaagcatg ttccttgaca aatcaattgt 300 gtcaaaactc cacccagcaa atgaaattgg tacaatccct gtaagttggt tatgcccaag 360 gtaaagatac gttaaattgg gagctaattt gctaaacgac tccggtattg gtccagtcaa 420 tttgttccta tctaatcgta aaaattccaa atatggaagt tgcgatagcg aggctgggat 480 agttccaaca agcttattat acgacaaatt aatgtacgtt aagcttttca atttactaag 540 gacttcaggt actggtcctg aaatgtccga ttcactaatt ctgaagaaat tgagattcgt 600 gagcttaaca attgttgatg gaattggacc ggtgagatta cgtacattgt ggatactgaa 660 tttcgtaagg tatgtgagat ctccgatggc gggagagaga tatccagaga gattcatttt 720 ggagaaatcg atgagattaa tccggttcga tttttcatcg cattcgagag taggtccgta 780 ccagtcaatg cagcaatcag ttttgggatt ccaattaccc aaatcatcag gattacccag 840 agcttttttg a 851 <210> 2 <211> 851 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum L. <400> 2 gttatgaaaa tactcatata tctcaaattt ctgcatattc tcaccctttg gaatctttcc 60 acaaagtcta ttataactca cgttcaaaat ttgccacgga ttcttcgata tgattttcgg 120 tatactccca taaatcttgt tatgactcaa ttccaacctc cataacccct tcccaaacgt 180 caattttgac atatcgaatt caaatttatt ccgatccaat aacatttcat acgtcgtctt 240 atctttacca aacaaaaacg aaatatcccc ttcaagcatg ttccttgaca gatcaattgt 300 gtcaaaactc cacccagcaa atgaagttgg tacaatccct gtaagttggt tatgcccaag 360 gtaaagatac gttaaattgg gagctaattt gccaaatgac tccggtattg gtccagttaa 420 tttgttccta tctaatcgta aaaattccaa atatggaagt tgtgatagcg aggctgggat 480 agttccaaca agcttattat acgacagatt aatgtacgtt aagcttttca atcgactaag 540 gacttcaggt actggtcctg aaatgtccga ttcactaatt ctgaagaaaa tgagattcgt 600 gagcttaaca attgttgatg gaattggacc ggtgagatta cggacattgt ggaaactgaa 660 tttcgtaagg tatgtgagat ctccgatggc gggagagaga tatccagaga gattcatttt 720 ggagaagtcg atgagattaa tccgattcga tttttcatcg cattcgagag taggtccgta 780 ccagtcaatg cagcaatcag ttttgggatt ccaattactc aaatcatcag gattacctag 840 agcttttttg a 851 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggaggagtta agtgcatggc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgaccatcg gatcctttgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagctgaaag atgtcaccca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgatcattta caaggcggca 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gatcactagt cgtcctggtc aa 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ttcacgatgg tctttattcg t 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agagacggta catgctttga ca 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gttcatttgc atggcttcct 20

Claims

서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 토마토 근부위조병(Fusarium crown root rot, FCRR) 저항성 판별용 DNA 마커 조성물.
서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 토마토 근부위조병(Fusarium crown root rot, FCRR) 저항성 판별용 프라이머 세트.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트는 제한효소 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism; RFLP) 마커를 증폭하기 위한 토마토 근부위조병 저항성 판별용 프라이머 세트.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트는 제한 증폭 다형성 서열(Cleaved amplified polymorphic sequence; CAPS) 마커를 증폭하기 위한 토마토 근부위조병 저항성 판별용 프라이머 세트.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 토마토 근부위조병 저항성 판별 키트.
(1) 토마토에서 DNA를 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(3) 상기 PCR 증폭 산물을 제한효소로 절단하여 분석하는 단계를 포함하는 토마토 근부위조병 저항성 판별 방법.