CN109182572B

CN109182572B - 一种与菠菜果实形态相关的kasp分子标记及检测引物与应用

Info

Publication number: CN109182572B
Application number: CN201811005853.9A
Authority: CN
Inventors: 钱伟; 徐兆生; 刘志远; 张合龙; 王晓武; 武剑
Original assignee: China Vegetable Seed Technology Co ltd Beijing; Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: China Vegetable Seed Technology Co ltd Beijing
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2018-08-30
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2038-08-30
Also published as: CN109182572A

Abstract

本发明属于分子遗传育种技术领域，具体公开了一种与菠菜果实形态相关的KASP分子标记及检测引物与应用。所述分子标记位于菠菜全基因组的Chr3：54314034，其位点存在等位基因C/T，与菠菜果实表面是否有刺相关。本发明基于KASP技术，根据关键突变位点[C/T]设计引物，用于鉴定菠菜果实形态。该技术可以高通量检测多个样本，大大提高检测效率，减少时间和成本，缩短菠菜雌性系的选育时间，提高育种效率。

Description

一种与菠菜果实形态相关的KASP分子标记及检测引物与应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种技术领域，具体地说，涉及一种与菠菜果实形态相关的KASP分子标记及检测引物与应用。

背景技术

菠菜(Spinacia oleracea L.)，别名波斯草、赤根菜，黎科菠菜属，二倍体(2n＝12)雌雄异株植物，栽培历史悠久，是我国重要的蔬菜作物之一。菠菜营养丰富，抗寒性强，适应性广，生产周期短，复种指数高，产量产值高，深受生产者和消费者欢迎。

菠菜生产中播种用的“种子”实为果实，果实形态是其重要的农艺性状之一,可分为有刺型和无刺型两种。有刺型菠菜的花萼发育成角状突起，俗称“刺”，一般为2～3个刺，少数为1个或4～6个刺，而无刺型菠菜的花萼不发育成角状突起(图1)。菠菜果实表面的刺由花萼发育而来，这也就决定了果实刺的有无由母本的基因型决定(即F₁“种子”形态是由母本的基因型决定)。Sneep(1958)通过大量的菠菜杂交组合发现，果实形态受单基因调控，其中有刺型对无刺型表现为显性性状。

目前，菠菜杂交种的生产主要采用以无刺型雌性系菠菜为母本，以有刺型自交系菠菜为父本进行杂交种的生产，这种生产方式不仅能够发挥菠菜杂种优势的特点，而且有利于且便于种子贮存、包装、运输、生产播种等操作(Sneep,1958)。菠菜为雌雄异株作物，果实形态受母本基因型控制，雄株携带的果实形态基因型只有在下一代采种时才能表现，因此在菠菜优良种质创新过程中，果实形态不易稳定纯化，给优良种质的纯化及品种选育造成了很大影响。

近年来，国内外对菠菜标记研究主要集中在菠菜性型及菠菜抗霜霉病研究上，开发了大量与其相关的分子标记。然而，至今为止未见果实形态相关分子标记的报道，严重影响了菠菜自交系的纯化速度和品种选育的进程。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供与菠菜果实形态相关的KASP分子标记及检测引物与应用

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种与菠菜果实形态相关的分子标记，该分子标记为与菠菜果实形态紧密连锁的KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)标记KM1112035，可用于检测菠菜果实表面是否有刺。

该分子标记信息如表1所示。

表1

标记	染色体	SNP物理位置	等位基因
				KM1112035	Chr3	54314034	[C/T]

表1中的SNP位置是根据Xu等(2017)发表的菠菜全基因组序列而确定的。(http://www.spinachbase.org/cgi-bin/spinach/index.cgi)

进一步地，本发明针对该分子标记，提供了检测所述分子标记的检测引物。

所述检测引物包括两条正向引物，和一条通用的反向引物。

具体序列如下：

正向引物1：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAAAACCGCCATTATGAAAAAGAAGAAAG-3’；

其中GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为通用标签A；

正向引物2：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAAAACCGCCATTATGAAAAAGAAGAAAA-3’；

其中GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为通用标签B；

反向引物：5’-GCTTTAAGGCTGGGCAAAGTAGGAT-3’。

进一步地，本发明针对该分子标记(KASP标记KM1112035)，提供了其在检测菠菜果实形态方面的应用。

可选的，所述应用体现为一种检测菠菜果实形态的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测菠菜样品的全基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用前述检测引物进行PCR扩增；

(3)利用荧光检测仪分析PCR产物，判断菠菜果实形态基因型。

作为优选，提取待测菠菜样品的全基因组DNA后，将其浓度稀释为20ng/μL；向稀释后的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KSAP Master mix，进行PCR扩增；在小于40℃条件下，采用荧光检测仪分析PCR产物。若分型结果不理想，分析后可再进行一次PCR扩增，PCR反应结束后再次进行荧光检测分析。

本发明提供的检测方法通量大且操作简单，只需将特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix加入到含有DNA样本的PCR微孔反应板中，进行PCR扩增。最终结果采用荧光检测仪进行分析即可。

所述KASP Primer mix含有3条特异引物：分别带有通用标签A和B的正向引物1和2，以及一条反向引物，即前文所述检测引物。

所述KASP Master mix包含通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂等组分，已预置于优化的缓冲液中。其中荧光报告集团A为FAM，荧光报告集团B为HEX，所述KASP Master mix是英国LGC公司产品。产品目录号为KBS-1016-002。

其中，检测方法中涉及的PCR反应体系为：

组分	96孔板(μL)	384孔板(μL)
			模板DNA	5	2.5
KASP Master mix	5	2.5
			KASP Primer mix	0.14	0.07
总体积	10.14	5.07

涉及的PCR反应条件为：

如需要再次进行PCR扩增，再次PCR的反应条件为：

本发明是基于KASP技术，根据关键突变位点[C/T]设计引物，用于鉴定菠菜果实形态。该技术可以高通量检测多个样本，大大提高检测效率，减少时间和成本，缩短菠菜雌性系的选育时间，提高育种效率。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

附图说明

图1为菠菜果实外形(A)及解剖面(B)。

图2为SLAF-BSA法对控制菠菜果实形态基因的快速定位。

图3为分子标记KM1112035扩增两亲本及20份BC1子代的结果。

图4为分子标记KM1112035检测20份菠菜高代自交系材料的结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所用引物在上海捷瑞生物工程有限公司合成。

本发明所用菠菜品种均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所菠菜课题组提供。

实施例1利用SLAF_BSA方法确定与菠菜果实形态相关基因的候选区域及连锁标记的开发

1、菠菜遗传群体的构建

利用高代自交系无刺型菠菜12S3和有刺型菠菜12S4进行杂交得到了F₁代，将F₁代的雌株与回交亲本12S3的雄株进行回交获得BC₁群体。

2、基因组DNA的提取以及SLAF文库的构建

采用CTAB法提取亲本和BC₁群体的基因组DNA。

SLAF文库的构建流程如下：

1)参考基因组的确定

选用菠菜基因组，实际基因组大小为989Mb，组装出的基因组大小为493.771Mb，GC含量为38.00％，下载地址：

ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA_000510995.2_Spinach-1.0.3。

2)酶切方案的确定

利用软件对参考基因组进行酶切预测，选择最适酶切方案，最终选用的酶为RsaI+HaeIII酶。

3)建库测序

经酶切后，对得到的酶切片段进行3’端加A处理，连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiseqTM 2500进行测序。

3、SLAF-seq数据分析、构建混池及关联分析

基于BC₁群体果实形态的调查结果，分别调取20个有刺型菠菜及20个无刺型菠菜的SLAF测序数据，以SLAF标签中SNP数据作为混池测序的SNP，进行数据混池分析，利用欧氏距离(Euclidean distance,ED)算法进行关联分析，ED的的公式如下：

其中Aaa，Gaa，Caa，Taa分别代表有刺型混池中碱基A，G，C，T的深度，Aab，Gab，Cab，Tab分别代表无刺型混池中碱基A，G，C，T的深度。

4、果实形态基因的初定位

基于关联分析的结果并以此评估与菠菜果实形态相关联的区域。根据计算得到关联阈值为0.168，结合菠菜高密度遗传图谱，将控制果实形态基因定位在连锁群LG1的两个区域内，这两个区间的遗传距离大小为3.77cM和4.32cM，对应于菠菜染色体上为chr3的40697932-94115929区间(图2)。

5、果实形态基因的精细定位及连锁标记的开发

为了缩小初定位区域大小，结合菠菜基因组的数据，在初定位区域内设计40个KASP，并利用这些标记在BC₁群体筛选重组交换单株，以期缩小候选区域，最终将果实形态基因定位到KM1112035和KM2897873之间。其中KM1112035标记分型效果更好，因此选择该标记进行分子标记辅助选择育种。

6、KM1112035标记引物的合成

依据SNP突变信息特点，设计成套的竞争性等位基因特异性PCR引物，包括正向引物1、正向引物2和反向引物。两条正向引物末端为等位变异碱基C/T，反向引物的序列选择要保证扩增片段在60-120bp。正向引物的5’端连接有荧光标签序列，其中正向引物1的5’端连接为FAM荧光标签序列5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，正向引物2的5'端连接为HEX荧光标签序列5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

引物序列如下：

上述引物序列均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

实施例2 KM1112035分子标记检测BC₁群体以及两个亲本

检测方法如下：

1、提取植物基因组DNA

取待测菠菜叶片，采用CTAB法提取全基因组DNA。本次中BC₁群体中随机选取20株子代及两亲本进行检测。

2、稀释DNA浓度

本实验采用的DNA浓度为20ng/μL。

3、KASP Primer mix的制备

各取正向引物12μL(100μM),反向引物30μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL。

4、PCR扩增反应体系如下表：

实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

5、PCR反应条件如下：

6、PCR扩增产物的荧光扫描

利用Applied Biosystems公司生产的7900HT Fast Real-Time PCR System机器对PCR扩增产物进行扫描，两荧光(FAM荧光和HEX荧光)的激发波长和发射波长不同，利用软件SDS2.3进行分型。

7、等位基因的分型

采用SDS2.3软件对扫描数据进行分析，按照如下确定待测菠菜样品中果实形态基因的基因型，聚合在X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，即为CC；聚合在Y轴的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，即位TT；聚合在中间的显示绿色样本的基因型为两种等位基因，即位CT(图3)。

8、若第一次分型不理想，则分析后可再进行如下热循环。

热循环结束后可再进行步骤6与步骤7。

实施例3KM1112035分子标记检测高代自交系菠菜材料

检测方法如下：

在菠菜高代自交系中，随机挑选20份材料，利用按照实施例2中的方法提取DNA，使用KM1112035标记进行基因分型检测，其中每份材料进行一次重复，待材料产生果实后，鉴定其果实形态是否与KM1112035标记分型一致。KASP反应体系和程序均同实施例2中所描述。

结果分析：通过以上检测，KM1112035标记分型结果与田间调查结果完全一致(图4)，结果表明KM1112035标记可准确区分果实的有刺型和无刺型，且速度快，效率高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所中蔬种业科技（北京）有限公司

<120> 一种与菠菜果实形态相关的KASP分子标记及检测引物与应用

<141> 2018-07-19

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaaccgcc attatgaaaa agaagaaag 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaaaaccgc cattatgaaa aagaagaaaa 30

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctttaaggc tgggcaaagt aggat 25

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc taaaaaccgc cattatgaaa aagaagaaag 50

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tcaaaaaccg ccattatgaa aaagaagaaa a 51

Claims

1.一种与菠菜果实形态相关的KASP分子标记，其特征在于，所述分子标记位于菠菜全基因组的Chr3：54314034，其位点存在等位基因C/T，当等位基因为C时，菠菜果实表面无刺，当等位基因为T时，菠菜果实表面有刺。

2.用于检测权利要求1所述分子标记的检测引物，其特征在于，所述检测引物包括：

正向引物1：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAAAACCGCCATTATGAAAAAGAAGAAAG-3’；

正向引物2：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAAAACCGCCATTATGAAAAAGAAGAAAA-3’；

反向引物：

5’-GCTTTAAGGCTGGGCAAAGTAGGAT-3’。

3.权利要求1所述的分子标记在检测菠菜果实形态方面的应用；

所述应用为根据所述分子标记等位基因的基因型判断菠菜果实表面是否有刺，当等位基因为C时，菠菜果实表面无刺，当等位基因为T时，菠菜果实表面有刺。

4.一种检测菠菜果实形态的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测菠菜样品的全基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的检测引物进行PCR扩增；

(3)利用荧光检测仪分析PCR产物，判断菠菜果实形态基因型，当检测的分子标记的等位基因为C时，菠菜果实表面无刺，等位基因为T时，菠菜果实表面有刺。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的PCR反应条件为：

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，在小于40℃条件下，采用荧光检测仪分析PCR产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当分析PCR产物时的分型结果不理想，分析后可再进行一次PCR扩增，PCR反应结束后再次进行荧光检测分析；

再进行一次PCR扩增的PCR的反应条件为：