CN114107548B - 一种用于检测杨梅果实颜色的kasp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种用于检测杨梅果实颜色的KASP分子标记及应用，其SNP位点位于杨梅6号染色体第4,691,249位碱基，利用该单碱基差异设计了KASP引物组合，可用于快速精准地鉴定杨梅该位点的基因分型，从而预测杨梅果实颜色，挑选出需要的果实颜色的种质材料，大大加快杨梅种质材料的选择进度，简便高效，成本低，在鉴定杨梅果实颜色和辅助育种方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及作物形态构成性状分子标记开发和分子辅助育种技术领域，具体涉及一种用于检测杨梅果实颜色的KASP分子标记及其应用。
背景技术
杨梅是我国特有的栽培经济果树，树形优美、四季常绿、口感鲜美，果实富含花青素等功能性物质，营养价值极高；按照果实颜色可分为白梅类、红梅类、乌梅类等类型(图1)。
目前，杨梅育种仍以常规的芽变育种为主，然而芽变育种性状变异存在不定向，优良性状不能聚合，杂交育种可以达到双亲优良性状聚合的目的，但是杂交后代童期长达10年，果实颜色、品质等性状童期内无法检测，严重阻碍了杨梅育种进程。因此，基于开发表型相关的特异分子标记显得尤为重要。KASP(kompetitive allele specific PCR)是一种一步法的基因型鉴定技术，通过荧光信号判断目标位点的基因型。由于KASP标记具有省时省力，费用低廉等特点，逐步成为了分子标记辅助育种中常用的标记类型。
CN113293227A公开了鉴定杨梅果实颜色性状的标记引物，但其并未准确找到决定杨梅果实颜色的SNP位点，仅通过一条正向引物和一条反向引物扩增杨梅基因，认为能扩增即为白梅，不能扩增则为其他颜色。该方法仅能用于检测白梅，无法区分出红梅和乌梅，而且一旦扩增失败，容易误将白梅判定为其他颜色的杨梅，准确度难以保证。
因此急需充分挖掘杨梅果实颜色性状形成相关的调控基因，为杨梅果实颜色的筛选和分子辅助育种提供有力技术支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测杨梅果实颜色的KASP分子标记及应用，其SNP位点位于杨梅6号染色体第4,691,249位碱基，利用该单碱基差异设计了KASP引物组合，可用于快速精准地鉴定杨梅该位点的基因分型，选出所期望的杨梅果实颜色的基因型，从而找到所需要的杨梅种质材料。
本发明提供了一种用于检测杨梅果实颜色的KASP标记，所述KASP标记的SNP位点位于杨梅6号染色体第4,691,249位碱基，分子标记多态性为A/G。
本发明基于前期种质资源的调查的基础，对全国杨梅产区的种质资源进行整理，共收集到173份种质资源，进行了基因组重测序，并测定了其中136份种质资源的果实颜色的重要性状明度(L)，将基因组数据与明度进行全基因组关联分析，在6号染色体的4,691,249 bp位置检测到SNP，根据SNP位置查找到基因为MrChr6G813，CDS序列如Seq ID NO.4 所示。
本发明提供的检测杨梅果实颜色的SNP位于MrChr6G813基因，将MrChr6G813的CDS序列在NCBI进行Blast比对，发现与MrMYB1基因序列一致(图3)，应为同一基因。杨梅果实颜色与花青苷含量成正向相关性，MrMYB1转录因子能够调控花青苷生物合成途径中结构基因的表达，从而影响花青苷合成。花青苷，即矢车菊素-3-葡萄糖苷，属于类黄酮化合物，是普遍存在于自然界的水溶性的天然食用色素，有助于花和果实色素沉着。花青苷是植物体内一类重要的次级代谢产物，广泛分布在不同的组织器官，形成不同的颜色。而果实颜色是果实品质构成的一个重要指标，同时也是果实成熟的标志。花青苷不仅具有提高植物抗逆性作用，还较强的抗氧化活性，能够清除自由基、增强人体抵抗力，具有保健作用。
本发明所获得的KASP标记为杨梅果实颜色性状的基因标记，能用于分子辅助选育所期望的杨梅果实颜色品种。
另一方面，本发明提供了一种用于检测上述的KASP标记的引物组合，该引物组合包括：
Ⅰ)两条正向引物为正向引物1和正向引物2，其中正向引物1序列如序列表中SeqID NO.1所示，正向引物2序列如序列表中Seq ID NO.2所示；
Ⅱ)一条共用反向引物，其序列如序列表中Seq ID NO.3所示。
进一步地，所述正向引物1的5’端带有FAM荧光信号标签；正向引物2的5’端带有HEX 荧光信号标签。
再一方面，本发明提供了含有如上所述的引物组合的试剂或试剂盒。
再一方面，本发明提供了采用如上所述的引物组合检测杨梅果实颜色的方法，该方法主要包括以下步骤：
1)提取待测杨梅品种基因组DNA；
2)以待测杨梅品种基因组DNA为模板，利用如上所述的引物组合进行KASP反应检测；
3)根据KASP产物荧光信号的差异，鉴别出待测杨梅的基因型。
进一步地，步骤2)中KASP反应体系为：5～10ng/μl杨梅基因组DNA 0.8μl，KASPMaster Mix(KASP主混合物，购自LGC，Biosearch Technologie)0.8μl，KASP Assay Mix(如上所述的引物组合，其中包括正向引物1 0.05μl，正向引物2 0.05μl，反向引物0.05 μl)0.05μl。
进一步地，步骤2)中KASP反应程序为：95℃预变性，15min；95℃变性20s；65℃退火延伸25s，每个循环退火温度降低1℃，共10个循环；95℃变性10s，57℃退火延伸60s，共30个循环。
进一步地，步骤3)为根据KASP产物荧光信号的差异，利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析，鉴别出待测杨梅的基因型。
进一步地，步骤3)鉴别出的杨梅基因型包括AA、GG和AG，其中AA为乌梅，AG为红梅，GG为白梅或红梅。
主要根据荧光颜色分类，得到基因分型效果图，从而进行杨梅基因型的鉴别。共检测到三种基因型，分别是杂合型AG与纯合型AA、GG，其中杂合型AG为紫色(红色与蓝色荧光混合颜色)，纯合型GG为红色，AA为蓝色。
由于正向引物1的5’端带有FAM荧光信号标签；正向引物2的5’端带有HEX荧光信号标签，如果检测到的材料是纯合基因型，扩增的时候只会选其中对应的一个正向引物扩增与共用反向引物结合(例如，纯合GG型能与F-FAM和共用反向引物结合，产生红色荧光)，根据荧光的差异，分辨出所测材料是GG型还是AA型，如果检测的材料是杂合 AG型的，扩增时2个引物都会结合，产生的红、蓝两种荧光信号(合成紫色)，不同于纯合基因型的材料，从而实现区分杂合基因型。
在一些方式中，步骤3)若在SNP位点检测到碱基A，为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，荧光信号显示为蓝色，则判定待测杨梅构型为纯合基因型AA；若检测到碱基G，为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，荧光信号显示为红色，则判定待测杨梅构型为纯合基因型GG；若同时检测到碱基A和G，为同时连接FAM荧光标签序列和HEX 荧光标签序列的中间型，荧光信号显示为紫色，则判定待测杨梅构型为杂合基因型AG。
将KASP获得的SNPs与相应的果实颜色进行比对，以确定检测准确率。该SNP位点检测基因型为AA时，100％为乌梅类的杨梅；当基因型为AG时，100％为红梅类杨梅；当基因型为GG时，50％为白梅类，50％为红梅类。
再一方面，本发明提供了一种如上所述的KASP标记或如上所述引物组合或如上所述的试剂或试剂盒在鉴定杨梅果实颜色或杨梅辅助育种方面的用途。
本发明提供的KASP分子标记能用于选出所期望的杨梅果实颜色的基因型的分子辅助选择，该标记具有可靠性和可用性。大量实验证明，本发明所获得的KASP分子标记能用于快速精准地鉴定杨梅该位点的基因分型，帮助选取所期望的果实颜色基因型，从而找到所需要的种质材料。
本发明的有益效果：
1、提供了一种用于检测杨梅果实颜色的KASP分子标记，其SNP位点位于6号染色体第4,691,249bp碱基，通过该分子标记中的单碱基差异设计了KASP检测的引物组合，可用于快速精准地鉴定杨梅构型的基因分型，从而预测杨梅果实颜色；
2、帮助快速准确地筛选所需要杨梅颜色的种质材料，大大加快杨梅种质材料的选择进度；
3、减少时间和人工成本的同时又可以高通量检测多个样品，大大提高检测效率，将在优质杨梅品种选育中发挥重要作用。
附图说明
图1为杨梅果实颜色示意图，从左到右依次为白梅、红梅、乌梅；
图2为实施例1中SNP位点在MrChr6G813基因中的位置的示意图，其中a为通过利用TASSEL软件计算制得的GWAS图，c为通过EMMAX软件计算制得的GWAS图，a 和c显示都在同一位置关联到SNP；
图3为实施例1中MrChr6G813与MrMYB1的序列比对结果示意图；
图4为实施例3中KASP分型结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。实施例中未注明具体条件者按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市售购买获得的常规产品。
实施例1用于检测杨梅果实颜色的KASP分子标记的开发
1、杨梅果实颜色基因的挖掘
基于前期种质资源的调查的基础，全国杨梅产区的种质资源进行整理，共收集到173 份种质资源，进行了基因组重测序，并测定了其中136份种质资源的果实颜色的重要性状明度(L)，将基因组数据与明度进行全基因组关联分析，在6号染色体的4,691,249bp位置检测到SNP，根据SNP位置查找到所在的基因为MrChr6G813(图2a和c)，其中a为通过利用TASSEL软件计算方法制得的GWAS图，c为通过EMMAX软件计算方法制得的 GWAS图，a和c显示都在同一位置关联到SNP，可见本发明提供的SNP位点非常准确可靠。MrChr6G813的CDS序列如Seq ID NO.4所示。
2、基因MrChr6G813功能预测
将MrChr6G813的CDS序列在NCBI进行Blast比对，发现与前人报道序列号为GQ340767的MrMYB1基因一致(图3)，应为同一基因，该基因具有调控花青苷生物合成途径中结构基因的表达，影响花青素苷合成的作用。
实施例2用于KASP检测分子标记的引物组合的设计
本实施例根据实施例1获得的SNP位点，查找6号染色体4,691,249bp位置SNP的上游50bp序列(Seq ID NO.5)、下游50bp序列(Seq ID NO.6)，利用Cereals DB website 网站，设计了编号为KASP-Primer-813的KASP引物，用于检测不同杨梅果实颜色的杨梅基因型。引物序列如表1所示，其中正向引物1的5’端带有FAM荧光信号标签，正向引物2的5’端带有HEX荧光信号标签。该引物组合序列可与该SNP位点上下游相应序列特异性结合。
表1KASP-Primer-813引物序列
实施例3 KASP分子标记的验证
利用80份不同果实颜色的杨梅种质进行检测率准确率的验证，其中40份种质为乌梅类，32份为红梅类，8份为白梅类(表3)。利用CTAB法提取80份杨梅种质材料的DNA，利用实施例2提供的KASP-Primer-813引物进行KASP引物基因型检测。
使用1.6μl PCR反应系统，包含0.8μl KASP主混合物(LGC，BiosearchTechnologie)， 0.05μl每个引物(Primer_AlleleFAM、Primer_AlleleHEX、Primer_Common)和0.8μl DNA (5-10ng/μl)，根据IntelliQube仪器(LGC，Biosearch Technologies)使用说明，进行PCR 分析，PCR反应程序为：95℃预变性，15min；95℃变性20s；65℃退火延伸25s，每个循环退火温度降低1℃，共10个循环；95℃变性10s，57℃退火延伸60s，共30个循环。
KASP基因分型结果如图4所示，共检测到三种基因型，分别是AA、GG和AG。由图4可见，该基因型是通过检测KASP产物中两种荧光强度判断的，图中每个圆点代表一份待测材料，检测结果原图为彩色图，考虑到专利申请时只能提交黑白图，因此申请人对图中的各小圆圈所代表的基因型进行了标注。所有材料被分成了红色区、蓝色区和紫色区，其中红色圆点表示是纯合基因型GG，蓝色圆点表示是纯合基因型AA，紫色圆点表示是杂合基因型AG；其中AA基因型有40株，AG基因型为23株，GG基因型为17株。并对基因型与杨梅果实颜色进行统计分析(表2)。
表2检测果实颜色的材料编号、基因型与果实颜色
将KASP获得的SNPs与相应的果实颜色进行比对，以确定检测准确率。由表2可见，该SNP位点检测基因型为AA时，100％为乌梅类；当基因型为AG时，100％为红梅类；当基因型为GG时，50％为白梅类。
因此，通过KASP-Primer-813引物进行KASP分子标记分型，可以准确的预测红梅类与乌梅类杨梅，为童期杨梅种苗的选择提供可靠依据，为杨梅分子辅助育种技术的发展奠定基础。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
Seq ID NO.1
正向引物1：
TGCTGAAATGAGGCTCAGTGG
Seq ID NO.2
正向引物2：
TGCTGAAATGAGGCTCAGTGA
Seq ID NO.3
反向引物：
AATGATCAGGCTTCATAAGCTC
Seq ID NO.4
MrChr6G813：
ATGGAAGGCTCTTTAGGTGTACGAAAAGGCGCATGGACTGTAGAGGAAGATACCCTTCTGA AGCTGTACATTGAGAAGTACGGAGAAGGGAAGTGGCACCAAGTTCCTCCCAGAGCAGGCTT AAATAGATGCCGGAAAAGCTGTAGACTGAGGTGGCTGAATTATCTAAAGCCCAACATCAAGAGAGGAGAGTTTAAAGCGGACGAAGTGGATCTAATGATCAGGCTTCATAAGCTCCTAGGTA ACAGATGGTCAATGATAGCTGGTAGGCTTCCAGGAAGAACAGCGAACGATGTGAAGAACTA CTGGAATACACACCTGCGCAAGAATGCAATTTCTCGCATCAAAGACGGTGGTGAAAAAGCTCAACAAACGTCGAAAGTGAACATAATAAAACCTCGACCCCGGACCTTCGCCAAAAATTTAA CTTGGTTCGGTGGGAAACCAACGATAATGGCAGCGAGCTTTCAACCAAAGGACAATGTTATT AGCGACCTACCTCCAGCACCGTTGCCATCCGAGAATAGTGTAAAATGGGGGGAAAACCTGTTCGATGACAAGGAAGCTGGTGACGAAATAGGCACATACGATGTAGGTGGGTTAAATGAAGA GCCCATCGCAACTTTTCGGTGGGCCGAAGCAGCACCGGCTGAGACAGTGGGAACCCCTCTTGATGAGTTCGGCCCGAGCTTTTGGGCTGAGTTCCCTTCTAATTTGGACGTTTGGGATTTTCTCG ATCCATAA
Seq ID NO.5
SNP位点前50bp的序列：
GAAGTGGATCTAATGATCAGGCTTCATAAGCTCCTAGGTAACAGGCAAGT
Seq ID NO.6
SNP位点后50bp的序列：
CACTGAGCCTCATTTCAGCAGCTGACATACAATTAATCGTTAAGAACTATC。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种用于检测杨梅果实颜色的KASP分子标记及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgctgaaatg aggctcagtg g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgctgaaatg aggctcagtg a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatgatcagg cttcataagc tc 22
<210> 4
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggaaggct ctttaggtgt acgaaaaggc gcatggactg tagaggaaga tacccttctg 60
aagctgtaca ttgagaagta cggagaaggg aagtggcacc aagttcctcc cagagcaggc 120
ttaaatagat gccggaaaag ctgtagactg aggtggctga attatctaaa gcccaacatc 180
aagagaggag agtttaaagc ggacgaagtg gatctaatga tcaggcttca taagctccta 240
ggtaacagat ggtcaatgat agctggtagg cttccaggaa gaacagcgaa cgatgtgaag 300
aactactgga atacacacct gcgcaagaat gcaatttctc gcatcaaaga cggtggtgaa 360
aaagctcaac aaacgtcgaa agtgaacata ataaaacctc gaccccggac cttcgccaaa 420
aatttaactt ggttcggtgg gaaaccaacg ataatggcag cgagctttca accaaaggac 480
aatgttatta gcgacctacc tccagcaccg ttgccatccg agaatagtgt aaaatggggg 540
gaaaacctgt tcgatgacaa ggaagctggt gacgaaatag gcacatacga tgtaggtggg 600
ttaaatgaag agcccatcgc aacttttcgg tgggccgaag cagcaccggc tgagacagtg 660
ggaacccctc ttgatgagtt cggcccgagc ttttgggctg agttcccttc taatttggac 720
gtttgggatt ttctcgatcc ataa 744
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagtggatc taatgatcag gcttcataag ctcctaggta acaggcaagt 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cactgagcct catttcagca gctgacatac aattaatcgt taagaactat 50
Claims (1)
1.一种引物组合用于制备检测杨梅果实为乌梅、红梅还是白梅的制剂的用途，其特征在于，所述引物组合由两条正向引物和一条共用反向引物组成，所述两条正向引物为正向引物1和正向引物2，其中正向引物1序列如序列表中Seq IDNO.1所示，5’端带有FAM荧光信号标签；正向引物2序列如序列表中Seq ID NO.2所示，5’端带有HEX荧光信号标签；一条共用反向引物，其序列如序列表中Seq ID NO.3所示；
所述检测杨梅果实的方法由以下步骤组成：
1)提取待测杨梅品种基因组DNA；
2)以待测杨梅品种基因组DNA为模板，利用引物组合进行KASP反应检测；KASP反应体系为：5～10ng/μl杨梅基因组DNA 0.8μl，KASP Master Mix 0.8μl，KASP Assay Mix 0.05μl；KASP反应程序为：95℃预变性，15min；95℃变性20s；65℃退火延伸25s，每个循环退火温度降低1℃，共10个循环；95℃变性10s，57℃退火延伸60s，共30个循环；
3)根据KASP产物荧光信号的差异，利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析，鉴别出待测杨梅的基因型；鉴别出的杨梅基因型为AA、GG和AG，其中AA为乌梅，AG为红梅，GG为白梅或红梅。
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