CN101485283B - 一种提高杂交水稻育种选择效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高杂交水稻育种选择效率的方法，其特征在于包括以下步骤：以恢复系科恢675为对照，在田间选择优良株系：选用恢复力强的恢复系科恢675为母本，以含有稻瘟病抗性基因Pi-1，来自利比亚的LAC23为父本进行杂交获得F1杂交种子；F1杂交种子自交获得F2代种子；以科恢675为对照，利用F2代种子建立趋亲选择群体；收获被选趋亲单株及科恢675种子；利用科恢675和LAC23之间的差异分子标记，以LAC23的标记为对照，选择含有稻瘟病抗性基因Pi-1的株系；通过与双亲对比的交叉选择，再进行系谱选育，到F6代，选择恢复力和抗稻瘟病能力强的公共株系。本发明的有益效果是，提高选择效率，聚合多个有利基因，创造新的优异资源。
Description
技术领域
本发明涉及一种杂交水稻育种选择方法，特别涉及一种提高杂交水稻育种选择效率的方法。
背景技术
由于不少传统农业技术的潜力已发挥至极，不能满足可持续经济发展的需要，水稻育种理论方法创新的优势和重要性日渐显露。九十年代以来，水稻育种理论方法创新进入了一个飞速发展的时期，无论在基础研究还是在应用开发方面，都已经取得了令人瞩目的巨大成就。水稻育种理论方法创新作为21世纪的关键技术在世界各国均受到高度重视和支持，竞相制定发展计划，政府和企业界纷纷投入巨资，国家实行非常优厚的产业政策，以促进其发展，增强本国的竞争能力。水稻育种理论方法创新在全世界范围的迅速兴起，极大地推动了农业科学的产业革命与结构重组。国际水稻基因组测序计划圆满完成，将使人们可以利用遗传途径改良水稻品种。世界各国都在为加快技术创新，发展高科技，实现产业化竭尽全力。
我国自80年代中期以来，杂交水稻育种理论和技术方法得到蓬勃发展，已初步形成了农业领域生物技术的研究与开发体系；一些高附加值产品开始进入市场，显示出强大的生命力和竞争能力。在我国，杂交水稻育种理论和技术一直受到党和政府的高度重视，国家采取了多种促进农业高技术研究与产业化的政策与措施，增加了对农业高新技术的投入。建立起一批设备条件优良的实验室与开发基地，经过科技人员的艰辛努力，我国水稻育种理论和技术已经取得一些重大进展，走在了世界的前列，获得不少水平高、效益显著的成果，其中一些已达到国际先进水平；初步形成一批农业高新技术产业，显示出巨大的经济效益和发展前景。
杂交水稻种育种方法很多，传统的杂交后代选择技术(如系谱选择等)仍在各种育种方法中占主导地位，近年来，随着分子生物技术的发展，分子标记辅助选择技术已在水稻育种中成功运用，其选择作用仅仅是辅助，传统的田间选择结果仍是选择的主要依据。然而，传统选择技术，要求丰富的经验和长达数年甚至十几年的时间，并且受环境条件的限制，很难创造出突破性的新材料和新品种。如何提高选择效率、减小育种进程中的盲目性，聚合多个有利基因，创造新的优异资源是杂交水稻育种方法创新的关键。采用杂交分离群体与亲本的田间比对趋亲选择和实验室分子标记的比对趋亲选择相结合的方法，实现了传统选择技术与现代生物技术有机结合，提高了选择效率。目前为止，该项技术未见报道。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种在杂交水稻育种中，F2分离群体、回交选择群体以及诱变群体等很难选择取舍株系，利用此方法可以快速准确地从杂交后代中选择目标株系，创造新材料提高杂交水稻育种选择效率的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高杂交水稻育种选择效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以恢复系科恢675为对照，根据育种目标在田间选择优良株系
选用恢复力强的恢复系科恢675为母本，以含有稻瘟病抗性基因Pi-1，来自利比亚的LAC23为父本进行杂交，获得F1杂交种子300粒；
F1杂交种子自交获得F2代种子13000粒；
以母本科恢675为对照，利用F2代种子建立趋亲选择群体：
将F2代按5×8寸种植，每行种植12窝，每窝种植1粒谷秧，共种植10000 窝以上，走道2尺，与走道平行种植2行对照，种植规格5×8寸；
以株高、分蘖力、叶色、叶脉、剑叶长短及剑叶夹角、穗长、穗粒数、有效穗、千粒重、粒形、结实率为选择指标，在F2代中选择与母本科恢675相近的趋亲单株1000株以上；收获被选趋亲单株及母本科恢675种子；
(2)、利用母本科恢675和父本LAC23之间的差异分子标记，以父本LAC23的标记为对照，选择含有稻瘟病抗性基因Pi-1的株系
根据与水稻抗稻瘟病基因连锁的分子标记，筛选了7个标记，即RM254、RM144、RM224、RM139、RM456、RM536和MRG4766，并在它们所在的物理图谱区段中查找已经定位于该物理图谱上的SSR标记，以科恢675和LAC23的DNA为模板，通过SSR扩增反应，用凝胶成像系统扫描记录电泳结果，筛选双亲之间差异标记，结果发现RM224和RM144是双亲中最大的差异标记；
利用差异分子标记RM224和RM144，在步骤(1)选择出来的趋亲单株中选择与父本LAC23标记一致的株系；
(3)、通过与双亲对比的交叉选择，即步骤(1)和(2)选择出来的公共株系，再进行系谱选育，到F6代就可以与不育系进行测配，测定其恢复力，同时鉴定抗稻瘟病能力，选择恢复力和抗稻瘟病能力强的公共株系。
本发明用于分子选择的引物序列组成如下表所示：
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 染色体上位置 |
| RM254 | AGCCCCGAATAAATCCACCT(F) CTGGAGGAGCATTTGGTAGC(R) | 11 |
| RM536 | TCTCTCCTCTTGTTTGGCTC(F) ACACACCAACACGACCACAC(R) | 11 |
| RM224 | ATCGATCGATCTTCACGAGG(F) TGCTATAAAAGGCATTCGGG(R) | 11 |
| RM144 | TGCCCTGGCGCAAATTTGATCC(F) GCTAGAGGAGATCAGATGGTAGTGCATG(R) | 11 |
| RM139 | GAGAGGGAGGAAGGGAGGCGGC(F) CTGCCATGGCAGAGAAGGGGCC(R) | 11 |
| RM456 | TTGTAGTCCGGGTCGTAACC(F) GATAGAATAGGGAGGGGGGG(R) | 11 |
| MRG4766 | ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC(F) AAGTGGAGGCAGTTCACCAC(R) | 11 |
本发明方法中，所述的趋亲选择群体是指以LAC23为父本，以科恢675为母本杂交的F2群体。形态选择是指以株高、穗长和千粒重等多个农艺性状为指标，以科恢675为对照，在F2群体中选择目标株系。分子选择是指利用与抗稻瘟病基因紧密链锁的分子标记，在双亲之间进行差异标记筛选，利用差异标记在趋亲单株中选择与LAC23标记一致的单株。交叉选择是指将形态选择与分子选择结果进行综合比较，选择两种结果交叉的株系号。
本发明一种提高杂交水稻育种选择效率方法的有益效果是，采用杂交分离群体与亲本的田间比对趋亲选择，和实验室分子标记的比对趋亲选择相结合的方法，实现了传统选择技术与现代生物技术有机结合，减小育种进程中的盲目性，提高了选择效率，聚合多个有利基因，创造新的优异资源。具体实施方式下面对本发明作进一步的说明：
选用恢复系科恢675为母本，以来自利比亚，携有广谱、显性抗稻瘟病基因Pi-1的水稻材料LAC23为父本进行杂交获得F1代种子，F1代种子自交获得F2代种子；种植F2代种子建立趋亲选择群体，共栽植了11500个株系，以科恢675为对照，以株高、穗长和叶色等多个农艺性状为选择指标进行趋亲选择(形态 选择)，获得选择株系1309个，提取被选株系DNA，利用与广谱抗稻瘟基因Pi-1紧密链锁的分子标记RM254、RM144，RM224、RM139、RM456、RM536和MRG4766，在双亲科恢675和LAC23之间进行差异选择，在分子电泳图谱中得到了差异较大的分子标记RM224和RM144，利用这两个标记，以LAC23为对照，对形态选择株系进行分子选择，获得目标株系，利用其中2个株系(KH715和KH36)与不育系进行恢复力测定，KH715和KH36的恢复度与科恢675大致相当，KH715略高，而KH36略低，结果见表1。同时，对目标株系进行接种鉴定，结果表明，利用RM144和RM244对抗稻瘟株系选择的准确率均在80％以上，同时用这两个标记进行选择，选择的准确率达到了96.9％，具体结果见表2。
详细技术说明如下：
1、亲本科恢675(糯稻89-1/泰引1号//糯稻89-1)
是用腋芽耐冷性、茎秆抗倒力和叶片抗退绿力强的重庆市地方品种糯稻89-1与泰引1号杂交，F2代开始定向选择综合性状优良、生育期适中的中间材料，利用F6代优良株系与糯稻89-1复交，复交F1代混种混收，F3代以后进行优良株系选择，通过F5代优良株系与多个不育系测配鉴定杂种优势选育出KH715和KH36。抗稻瘟病供体亲本LAC23来自利比亚，携有Pi-1基因。
2、分子选择技术。提取LAC23和科恢675以及形态选择株系的基因组总DNA，分别以与广谱抗稻瘟基因Pi-1紧密链锁的分子标记RM254、RM144，RM244、RM139、RM456、RM536和MRG4766为引物，以双亲DNA为模板进行PCR扩增，选择差异标记，再以选择出来的差异标记为引物，以LAC23(对照)和形态选择株系的DNA为模板进行比对选择，选择出与对照分子标记一致的株系。扩增反应混合液体积为20μl，其中10×PCR缓冲液(含Mg2+，Buffer：100mM Tris.Cl pH9.0；500mM KCl；18mM MgCl2；1％Triton X-100)2.0μl，2.5mmol.L-1dNTP 1.5μl，5U.μl-1TaqDNA聚合酶0.5μl，2μmol.L-1SSR引物2.0μl，20ng.μl-1模板DNA 2.0μl，ddH2O 12.0μl。PCR的反应参数为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环，然后72℃10min，待温度降至10℃后取出来放在4℃下备用。PCR扩增完毕后，加入2μl溴酚兰指示剂，混匀后，用加有溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶于0.5×TBE(0.5×TBE：1.045mol/Tris·硼酸；0.001mol/L EDTA)缓冲液中恒压120V-150V电泳2h-3h，用凝胶成像系统扫描记录电泳结果。
3、抗稻瘟病接种鉴定。通过形态选择和分子选择保留下来的株系，进行稻瘟病接种鉴定，验证选择的准确性。
4、恢复力测定。用KH715、KH36和科恢675与宜香A、中9A、岗46A、汕A、II-32A、K18A和D62A等7个不育系进行测配，以测试种为试材，采用正规区试设计，3次重复，收获5株考种，考察每穗总粒数、每穗实粒数和结实率等农艺性状，测小区实际产量。
表1三个恢复系与不同不育系测配的杂交后代的结实率及产量
表2科恢675/LAC23F2群体形态选择和分子选择结果
| 标记 | 形态选择株系数 | 分子选择株系数 | 全部感病株系数 | 选择准确率(％) |
| RM144 | 1309 | 48 | 6 | 87.5 |
| RM224 | 1309 | 41 | 8 | 80.5 |
| RM144 RM224 | 1309 | 32 | 1 | 96.9 |
Claims (1)
1.一种提高杂交水稻育种选择效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以恢复系科恢675为对照，根据育种目标在田间选择优良株系
选用恢复力强的恢复系科恢675为母本，以含有稻瘟病抗性基因Pi-1，来自利比亚的LAC23为父本进行杂交，获得F1杂交种子300粒；
F1杂交种子自交获得F2代种子13000粒；
以母本科恢675为对照，利用F2代种子建立趋亲选择群体：
将F2代按5×8寸种植，每行种植12窝，每窝种植1粒谷秧，共种植10000窝以上，走道2尺，与走道平行种植2行对照，种植规格5×8寸；
以株高、分蘖力、叶色、叶脉、剑叶长短及剑叶夹角、穗长、穗粒数、有效穗、千粒重、粒形、结实率为选择指标，在F2代中选择与母本科恢675相近的趋亲单株1000株以上；收获被选趋亲单株及母本科恢675种子；
(2)、利用母本科恢675和父本LAC23之间的差异分子标记，以父本LAC23的标记为对照，选择含有稻瘟病抗性基因Pi-1的株系；
根据与水稻抗稻瘟病基因连锁的分子标记，筛选了7个标记，即RM254、RM144、RM224、RM139、RM456、RM536和MRG4766，并在它们所在的物理图谱区段中查找已经定位于该物理图谱上的SSR标记，以科恢675和LAC23的DNA为模板，通过SSR扩增反应，用凝胶成像系统扫描记录电泳结果，筛选双亲之间差异标记，结果发现RM224和RM144是双亲中最大的差异标记；
利用差异分子标记RM224和RM144，在步骤(1)选择出来的趋亲单株中选择与父本LAC23标记一致的株系；
(3)、通过与双亲对比的交叉选择，即步骤(1)和(2)选择出来的公共株系，再进行系谱选育，到F6代与不育系进行测配，测定其恢复力，同时鉴定抗稻瘟病能力，选择恢复力和抗稻瘟病能力强的公共株系。
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