CN102599044B

CN102599044B - 一种广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的选育方法

Info

Publication number: CN102599044B
Application number: CN 201210066974
Authority: CN
Inventors: 杨剑波; 倪金龙; 陆徐忠; 倪大虎; 王德正; 李莉; 汪秀峰; 马琳; 张小娟
Original assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-03-14
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2032-03-14
Also published as: CN102599044A

Abstract

本发明提供了一种利用分子标记辅助选择手段将水稻广亲和基因S5n、光敏核不育基因pms1、pms3及温敏核不育基因tms5进行聚合，以培育出广亲和性光、温敏不育聚合系的方法。本发明综合运用杂交、回交、穿梭育种、测交等传统育种技术，并结合DNA标记选择的技术手段，将水稻广亲和基因S5n、光敏核不育基因pms1、pms3及温敏核不育基因tms5聚合到同一遗传背景中，培育出综合农艺性状优良、配合力高、恢复谱宽、制种安全性好的水稻两系不育系。

Description

一种广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的选育方法

技术领域

本发明涉及一种水稻广亲和性光、温敏不育聚合系的选育方法，确切地说，就是运用分子标记技术辅助聚合水稻光敏核不育基因、温敏核不育基因和广亲和基因，以培育出适用范围广且制种安全的水稻两系不育系。

背景技术

水稻光、温敏核不育资源的发现及其在杂交水稻上的成功应用，为保障我国粮食安全问题发挥了重要作用。与三系不育系相比，两系不育系具有自我繁殖、恢复谱广等优点，因此，近年两系法杂交水稻在我国发展较快，种植面积和推广范围迅速扩大。据农业部统计，2009年全国种植面积超过400万亩的杂交水稻品种全部为两系水稻(2009年全国农作物主要品种推广情况统计表，2010)。

我国生产上应用的两系核不育系主要分为光敏与温敏两种类型。光敏不育系主要由农垦58S衍生而来，其光敏不育特性由两个基因共同控制，为pms1和pms3，分别定位在第7和12染色体上(Liu et al.，2001，Mol.Genet.Genomics，266：271-275；Lu et al.，2005，Mol.Genet.Genomics，273：507-511)；温敏不育系则由安农S或其同型系衍生而来，其温敏不育特性主要由tms5基因控制，该基因位于第2染色体上(Yang et al.，2007，Planta，225：321-330)。光敏型雄性不育系的育性主要受光照时间调节，长日照条件下表现为雄性不育，短日条件下育性恢复；温敏型不育系的育性主要受温度调节，表现为高温不育、低温可育。因而，光敏雄性不育与温敏雄性不育是两种截然不同的育性调节机制。研究发现，无论是光敏还是温敏不育系其育性波动受光照时长与温度影响较大。由于自然界中的温度和光照时常的变化具有不确定性，因而光敏或温敏不育系制种安全性问题是制约两系杂交水稻应用的重要因素。利用分子标记辅助选择的方法，将光敏核不育基因pms1、pms3和温敏核不育基因tms5聚合在同一基因组中，将光、温敏两套雄性不育机制聚合到同一水稻品系中，培育出光敏、温敏不育聚合系，将有望大大提高两系杂交水稻的制种安全性。

为了进一步拓宽两系不育系的应用范围及更加高效利用籼粳亚种间杂种优势，培育具有广亲和特性的水稻雄性不育系是一个重要途径。水稻广亲和基因的应用是培育广亲和育种材料的重要基础。Chen等(2008，PNAS，105：11436-11441)已成功克隆了位于水稻第6染色体上的广亲和基因S5n，这为加速S5n基因的应用和广亲和材料的培育奠定了基础。

利用分子标记辅助育种技术，将光敏核不育基因pms1和pms3、温敏核不育基因tms5及广亲和基因S5n聚合在同一遗传背景中，培育具有广亲和特性的水稻光敏、温敏聚合不育系，不仅可以提高两系不育系的应用安全性，还将有助于高效利用籼粳亚种间的杂种优势，以便于培育出超高产杂交水稻新品种。

发明内容

本发明是一种方法上的创新，是将现代分子生物学的分子标记技术与传统的作物遗传育种中的杂交、回交、测交等多种选择技术有机结合，为作物新品种选育、新材料创制提供快捷、准确、可预见的实用方法。

具体地说，用携带广亲和基因S5n的材料(如02428、轮回422、培矮64等)、携带pms1和pms3的光敏不育系(如培矮64S、7001S等)分别与携带tms5的综合农艺性状优良的温敏不育系(如广占63S、Y58S等)杂交、回交、自交，并结合分子标记辅助选择技术，选育出含有广亲和基因S5n的温敏不育系和含有不育基因pms1和pms3的光敏、温敏聚合不育株系。再将两种类型的不育系杂交、回交或自交，并结合分子标记筛选，选育出同时携带pms1、pms3、tms5和S5n基因的两系不育系。

本发明解决技术问题采用如下方案：

广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的快速选育方法，包括如下步骤：

(1)利用携带pms1、pms3基因的光敏不育系品种与综合农艺性状优良的温敏不育系品种通过杂交、回交，结合分子标记筛选，在分离世代中选育出选育出pms1和pms3基因位点纯合的光、温敏不育聚合株系；

(2)综合农艺性状优良的温敏不育系品种与含有S5n广亲和基因品种通过杂交、回交，结合分子标记筛选，在分离世代中选育出广亲和基因S5n位点纯合的水稻温敏不育株系；

(3)利用步骤(1)中选育出的含有pms1和pms3基因的光、温敏聚合不育株系和步骤(2)中的广亲和性温敏不育株系进行杂交、自交并结合分子标记筛选，以选育出综合农艺性状优异的广亲和性光、温敏不育聚合株系；

所述光、温敏不育聚合株系、广亲和基因S5n位点纯合的水稻温敏不育株系以及广亲和性光、温敏不育聚合株系采用分子标记辅助选择进行快速选育，所述分子标记辅助选择就是以分离世代优良单株的基因组DNA为模版，用一定的核苷酸序列(5’-3’)的双引物进行PCR分析，以跟踪选择目标基因的聚合体，所述引物对如下：

本发明广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的快速选育方法，还包括如下步骤：

选用生产上广泛应用的籼、粳型恢复系分别与选育出的广亲和性光、温敏不育聚合株系进行杂交配组，杂交种进行小区种植，以适宜当地种植的高产杂交组合设为对照，考察每个杂交组合的结实率和稻谷产量，以进一步筛选出高配合力的广亲和性水稻两系不育系。

3.根据权利要求1所述的一种广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的快速选育方法，其特征在于，所述的水稻温敏核不育系包括广占63S、Y58S或其同型系及衍生温敏核不育系。

所述的水稻温敏核不育系包括但不限于广占63S、Y58S或其同型系及衍生温敏核不育系。所述的水稻光敏核不育系包括但不限于培矮64S、7001S或其同型系及衍生光敏核不育系。所述的水稻广亲和材料包括但不限于02428、轮回422、培矮64等或携带广亲和基因S5n的材料。所述的水稻籼型恢复系包括但不限于明恢63、明恢86、9311、蜀恢527、绿稻24、9308、绵恢725、特青、R288、浙恢7954等材料。所述的水稻粳型恢复系包括但不限于C57、C418、R18、皖恢9号、C堡、金恢58、R190、C4115、宁粳1号、武运粳14号等材料。

本发明具体实施步骤如下：

1、广亲和性温敏不育系的创制

鉴于广占63S、Y58S等温敏不育系的综合农艺性状表现突出，且在农业生产上应用地域范围较广泛，因而选用广占63S、Y58S等温敏不育系作为轮回亲本，分别与携带广亲和基因S5n的材料如02428、轮回422、培矮64等进行杂交、回交，结合分子标记筛选，在分离世代中选育出广亲和基因S5n位点纯合的水稻温敏不育株系。

2、光、温敏不育聚合系的创制

选用广占63S、Y58S等综合农艺性状优异的温敏不育系作为轮回亲本，与携带pms1、pms3基因的不育系如培矮64S、7001S等进行杂交、回交，结合分子标记筛选，在分离世代中选育出pms1和pms3基因位点纯合的光、温敏不育聚合株系。

3、广亲和性光、温敏不育聚合株系的选育

将上述选育出的广亲和性温敏不育株系与含有pms1和pms3基因的光、温敏聚合不育株系在海南进行杂交，正季自交，结合分子标记技术，在正季种植的分离群体中选择综合农艺性状优异的携带目标基因的不育单株。将选择的不育单株割蔸后带往海南种植并套袋自交。收获的种子正季种植，结合分子标记技术，筛选出所有目标基因位点纯合且综合农艺性状优异的不育单株。再将选出的不育单株在海南和正季进行穿梭繁殖育种，以选育出综合农艺性状优异的广亲和性光、温敏不育聚合株系。

4、候选不育株系广亲和性与配合力测定

选用生产上广泛应用的籼、粳型恢复系分别与候选不育株系进行杂交配组，杂交种进行小区种植(以适宜当地种植的高产杂交组合设为对照)，考察每个杂交组合的结实率和稻谷产量，以进一步筛选出高配合力的广亲和性水稻两系不育系。

附图说明

图1广亲和性光、温敏不育聚合系的选育流程

图2广亲和基因S5n特异性标记的扩增结果

1-3：非广亲和材料，分别为9311、日本晴、明恢63；4：为广亲和材料02428；M：DNA ladderDL2000

图3光敏核不育基因pms1特异性标记的扩增结果。

1-5：非光敏核不育系，分别为9311、日本晴、明恢63、C418、广占63S；6-7：光敏核不育系，分别为培矮64S、7001S；M：DNA ladder DL2000.

图4光敏核不育基因pms3特异性标记的扩增结果。

1-2：非光敏核不育系，分别为9311、日本晴；3-7：光敏核不育系，分别为培矮64S、7001S、2310S、2312S、78S；M：DNA ladder DL2000.

图5温敏核不育基因tms5特异性标记的扩增结果。

M：DNA ladder Marker 100；1-2：温敏核不育系，分别为广占63S、Y58S；3-6：非温敏核不育系，分别为9311、日本晴、培矮64S、02428.

具体实施方式

以下叙述本发明的实施事例。应该说明，本发明的实施事例只对本发明起说明作用，而没有任何限制作用。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

本发明所用的水稻品种均为本领域公知的水稻育种材料。

1、基因组DNA的提取

取水稻幼嫩叶片100-200mg，置于2.0ml离心管中，加液氮研磨至粉末状，再加入700μL65℃预热的DNA提取液(81.7g NaCl和20g CTAB充分溶于适量水中，然后加入1mol/LTris-HCl 100mL，0.5mol/L EDTA40mL，定容至1000mL，4℃贮存)，65℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次；加入等体积氯仿/异戊醇，轻缓混匀，室温静置15min；12,000rpm离心15min，吸取上清移至另一支1.5mL离心管中，再加入等体积异丙醇混匀，置于-20℃30min，4℃、12,000rpm离心10min，弃上清，加入200μL 70％乙醇洗涤沉淀；12,000rpm离心10min后弃去乙醇，室温干燥后加入50μL灭菌水，充分溶解后备用。

2、目标基因的检测分析

2.1引物合成

用于检测目标基因的扩增引物序列

2.2PCR扩增与电泳

PCR扩增与电泳检测

在0.2mL薄壁管中依次加入，反应体系为：

扩增程序：94℃变性5min后，94℃40sec，57℃ 1min，72℃45sec，循环35次，72℃延伸10min，12℃保温。扩增产物分别取5μL经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

3、广亲和性温敏不育系的创制

选用02428、轮回422、培矮64等携带S5n基因的广亲和材料与综合农艺性状优异的温敏不育系广占63S、Y58S等(均携带tms5基因)杂交，并以不育系为轮回母本，回交4～5代后自交1～2代，结合分子标记技术筛选出携带S5n基因的温敏不育单株(图1)。

1)水稻基因组DNA提取

所用水稻材料：广亲和材料02428、轮回422、培矮64，温敏不育系广占63S、Y58S及以其为母本与广亲和材料杂交选育的回交和自交世代群体单株。剪取成株期水稻幼嫩叶片100-200mg，CTAB法提取基因组DNA；

2)S5n基因的PCR扩增与电泳检测

利用S5n基因的引物对每个回交世代和自交世代群体单株的基因组DNA进行扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

3)携带S5n基因的温敏不育单株选择

携带纯合S5n基因的不育单株仅扩增出一条167bp的谱带(见图2)；不携有S5n基因不育基因的单株仅扩增出一条303bp的谱带；携有S5n基因的杂合单株能扩增出大小分别为167bp和303bp的两条谱带。在回交后代中选择S5n基因位点上的杂合单株，在自交后代中选择S5n基因位点上的纯合单株。

4、光敏、温敏聚合不育系的创制

选用培矮64S、7001S等携带pms1和pms3基因的光敏不育系与综合农艺性状优异的温敏不育系广占63S、Y58S等(均携带tms5基因)杂交，并以温敏不育系为轮回母本，回交3～4代后自交2～3代，结合分子标记技术筛选出携带pms1和pms3基因的温敏不育单株(图1)。

1)水稻基因组DNA提取

所用水稻材料：光敏不育系培矮64S、7001S，温敏不育系广占63S、Y58S及以其为母本与光敏不育系杂交选育的回交和自交世代群体单株。剪取成株期水稻幼嫩叶片100-200mg，CTAB法提取基因组DNA；

2)pms1和pms3基因的PCR扩增与电泳检测

利用pms1和pms3基因的引物对每个回交世代和自交世代群体单株的基因组DNA进行扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

pms3基因的扩增产物还需经Acc I内切酶处理。

酶切反应体系

3)携带pms1和pms3基因的光敏、温敏不育聚合单株选择

携带纯合pms1基因的不育单株仅扩增出一条237bp的谱带(见图3)；不携有pms1基因的单株仅扩增出一条274bp的谱带；携有pms1基因的杂合单株能扩增出大小分别为274bp和237bp的两条谱带。

携带纯合pms3基因的单株扩增产物不能被Acc I内切酶消化，产物大小为1392bp的谱带(见图4)；不携有pms3基因的单株扩增产物能被Acc I内切酶消化为461bp和931bp的2个片段；携有pms3基因的杂合单株扩增产物经Acc I内切酶消化，出现1392bp、931bp和461bp的3个片段。

在回交后代中选择pms1和pms3基因位点上的杂合单株，在自交后代中选择pms1和pms3基因位点上的纯合单株。

5、广亲和性光敏与温敏不育聚合系的选育

将选育出的携带S5n基因的广亲和温敏不育系与携带pms1和pms3基因的光敏与温敏不育聚合系杂交、自交，结合分子标记技术，在F_2～3代分离群体中筛选出S5n、pms1、pms3及tms5(tms5基因的扩增结果见图5)等目标基因位点纯合的不育株系30个，并进行繁育(图1)。

6、广亲和性与配合力测定

选用10个生产常用籼型恢复系或常规品系(明恢63、明恢86、9311、蜀恢527、绿稻24、9308、绵恢725、特青、R288、浙恢7954等)，和10个生产常用粳型恢复系或常规品系(C57、C418、R18、皖恢9号、C堡、金恢58、R190、C4115、宁粳1号、武运粳14号等)分别与选育出的广亲和性光敏与温敏不育聚合株系杂交配组。将所有杂交组合正季小区种植，收获后考察结实率和小区产量。进一步筛选出与籼粳恢复系杂交结实率均超过75％、高配合力的光、温敏不育聚合株系(图1)。

Claims

1.一种广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的快速选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）利用携带pms1、pms3基因的光敏不育系品种与温敏不育系品种通过杂交、回交，结合分子标记筛选，在分离世代中选育出pms1和pms3基因位点纯合的光、温敏不育聚合株系；

（2）利用温敏不育系品种与含有S5n广亲和基因品种通过杂交、回交，结合分子标记筛选，在分离世代中选育出广亲和基因S5n位点纯合的水稻温敏不育株系；

（3）利用步骤（1）中选育出的含有pms1和pms3基因的光、温敏聚合不育株系和步骤（2）中的广亲和性温敏不育株系进行杂交、自交并结合分子标记筛选，以选育出综合农艺性状优异的广亲和性光、温敏不育聚合株系；

所述光、温敏不育聚合株系、广亲和基因S5n位点纯合的水稻温敏不育株系以及广亲和性光、温敏不育聚合株系采用分子标记辅助选择进行快速选育，所述分子标记辅助选择就是以分离世代优良单株的基因组DNA为模板，用一定的核苷酸序列5’—3’的双引物进行PCR分析，以跟踪选择目标基因的聚合体，所述核苷酸序列5’—3’的双引物如下：

。

2.根据权利要求1所述的一种广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的快速选育方法，其特征在于，还包括如下步骤：

3.根据权利要求1所述的一种广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的快速选育方法，其特征在于，所述的水稻温敏不育系选自广占63S或Y58S。

4.根据权利要求1所述的一种广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的快速选育方法，其特征在于，所述的水稻光敏不育系为培矮64S或7001S。

5.根据权利要求1所述的一种广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的快速选育方法，其特征在于，所述步骤（2）中的广亲和基因品种为02428或轮回422、培矮64中的任意一种。

6.根据权利要求2所述的一种广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的快速选育方法，其特征在于，所述的水稻籼型恢复系为明恢63、明恢86、9311、蜀恢527、绿稻24、9308、绵恢725、特青、R288、浙恢7954中的任意一种。

7.根据权利要求2所述的一种广亲和性水稻光敏、温敏不育聚合系的快速选育方法，其特征在于，所述的水稻粳型恢复系为C57、C418、R18、皖恢9号、C堡、金恢58、R190、C4115、宁粳1号、武运粳14号中的任意一种。