CN108165658A - 陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记及其筛选方法。本发明通过设计Indel引物对503份陆地棉自然品种进行基因型分析，结合两年四个环境的油份表型数据检测到一个与棉仁含油量相关的基因为雷蒙德氏棉中预测的GrKAS1；将GrKAS1基因在陆地棉基因组中搜索到6个拷贝，以其为模板分别设计引物，分别对503份陆地棉品种用聚丙烯凝胶电泳分析及关联分析；对陆地棉品种中的10份极端材料中的GhKAS1基因进行测序，找出突变位点，自设计引物对503份陆地棉资源群体进行分析，利用聚丙烯凝胶电泳分析及关联分析。本发明发掘了与棉籽油含量相关的分子标记，为棉籽油的分子标记辅助选择育种提供参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及棉花分子育种技术领域，尤其涉及陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记及其筛选方法与应用。
背景技术
棉花的两大产物是纤维和棉籽，其中棉籽油的产量仅次于大豆油和菜籽油(Shang,et al.,2017)。中国、美国、巴基斯坦是世界最大的棉花生产国。在发达国家棉籽油在植物油市场占重要的地位。棉仁中油份占很大的比例，在陆地棉棉仁中含油量为25％-40％。棉籽油中含有70％的不饱和脂肪酸，其中，50％是亚油酸。食用精炼棉籽油可以降低胆固醇和软化血管，调节人体的新陈代谢(Alfred et al.,2012)。美国国家棉花委员会发布大约有90亿加仑的棉籽油用于人类食品的生产(Shang,et al.,2017)。在巴基斯坦，大部分的食用油来源于棉籽(Khan,2003)。棉籽油不仅可以作为食用油，在工业上的应用也是十分重要的。棉籽油可以用来制造生物柴油(Keskin,et al.,2008)。用毛棉油来制造肥皂、甘油和油墨，可以少量添加在机械润滑油中，也可以做皮革加脂剂。然而，棉籽油的遗传基础研究很少受到关注，关于棉籽油的遗传信息缺乏，因此开发陆地棉棉仁含油量有关的分子标记迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记及其筛选方法与应用，本发明发掘了与棉籽油含量相关的分子标记，为棉籽油的分子标记辅助选择育种提供参考依据。
本发明的目的之一在于提供一种陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记，其由下述引物对经PCR扩增并测序获得：
(1)标记引物RM3705，
正向引物序列：TTTGTGGATGTGTGAGGCTGC
反向引物序列：GACCAACCCAGTTCACATGATA；
(2)标记引物RMQ11，
正向引物序列：AACAAAAAACTACGAAGGACTTG
反向引物序列：TTGAGAGGGGCTATACCTAATT；
其中，所述标记引物(1)-(2)的扩增长度分别为222bp以及154bp。
本发明的目的之二在于提供一种陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记的筛选方法，其具体步骤包括：
步骤1、确定陆地棉棉仁含油量基因：以雷蒙德氏棉基因组中与脂肪酸合成相关的基因为参考序列设计了多对Indel引物，利用这些引物对多份陆地棉品种进行基因型分析，结合油份表型数据检测到一个与棉仁含油量相关的基因为雷蒙德式棉中预测的GrKAS1；
步骤2、候选基因功能标记的关联分析：将基因GrKAS1在陆地棉基因组中搜索到6个拷贝，随后针对这6个候选基因为模板分别设计引物，以多份陆地棉品种为模板进行PCR扩增，再用聚丙烯凝胶电泳分析及候选基因的关联分析，检测到引物RM3705与棉花棉仁含油量目标性状显著相关，表明引物RM3705所对应的A05/D05染色体上的分子标记GhKAS1-3705与棉花棉仁含油量相关，该标记对应的基因命名为GhKAS1；
步骤3、突变位点的关联分析：从多份陆地棉品种中选取棉仁含油量极端材料提取DNA，其中包括低油材料和高油材料，然后对陆地棉品种中的极端材料中的GhKAS1基因进行基因重测序，确定突变位点，再针对突变位点设计多对引物，以多份陆地棉品种为模板进行PCR扩增，进行突变位点的关联分析，利用聚丙烯凝胶电泳分析及关联分析，检测到引物RMQ11与棉花棉仁含油量目标性状显著相关，引物RMQ11所对应的分子标记为GhKAS1-Q11，即获得了一个可以鉴定棉仁含油量的分子标记为GhKAS1-Q11。
本发明的有益效果：
1、通过本发明首次开发了陆地棉棉仁含油量相关的基因GhKAS1，通过功能关联分析获得与棉花棉仁含油量基因GhKAS1相关的分子标记GhKAS1-3705，并进行突变位点的关联分析，获得一个可以鉴定棉仁含油量的分子标记为GhKAS1-Q11。
2、通过本发明分子标记定位的主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与该陆地棉棉仁含油量相关的基因GhKAS1的分子标记，即可预测陆地棉棉仁的含油量，加快高含油量陆地棉棉仁的选育进度，其检测方便快速，不受环境影响。本发明发掘了与棉籽油含量相关的分子标记，为棉籽油的分子标记辅助选择育种提供参考依据。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记的筛选方法中的候选基因聚丙烯酰氨凝胶电泳结果；
图2为本发明实施例3提供的陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记的筛选方法中的突变位点聚丙烯酰氨凝胶电泳结果。
具体实施方式
实施例1雷蒙德氏棉中GrKAS1基因的发现
以雷蒙德氏棉基因组与脂肪酸合成相关的基因为参考序列设计的162对的Indel引物进行基因型分析，利用503份陆地棉品种在两年四个环境中的棉仁含油量在TASSEL2.1中基于线性模型检测到一个与棉籽油含量相关的基因为雷蒙德式棉中预测的KAS1基因，命名为GrKAS1，具体地是用162对Indel引物，以503份陆地棉品种为模板进行PCR扩增及电泳，聚丙烯凝胶电泳结果的整理及关联分析，发现其中一对Indel引物PCR扩增出来的基因与含油量有关，标记名为GrKAS1。而这对Indel引物对应的是雷蒙德式棉中预测的GrKAS1基因，关联分析结果如表1。
表1
表1中关联分析结果中，P值越小显著性越高，解释率代表数据关联的可靠性，一般解释率在0.02-0.15可认为数据可靠性高。说明：实施例1的电泳结果即关联分析结果跟实施例2中的结果是一样的)
实施例2陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记
1、利用CottongenBlast将基因比对到陆地棉的基因组数据库上，找出同源性较高的片段、确定其在染色体上的位置，可以确定GrKAS1在陆地棉基因组有6个拷贝，为6个候选基因。
⑴利用http://www.cottongen.org/网站找出GrKAS1在陆地棉基因组中的拷贝数目以及其物理位置。
⑵预测6个候选基因基因结构和蛋白质结构，所用网站是http://meme.ebi.edu.au/meme/cgibin/meme.cgi。
2、针对6个候选基因设计特异性引物
⑴找到A基因组、D基因组以及海岛棉及陆地棉TM-1中的GhKAS1基因预测的序列(在NCBI中比对预测的是否是KAS1基因)，设计引物扩增全长。
⑵将扩增的序列进行比对，找出其特异区域设计引物，用于候选基因关联分析。
3、以503份陆地棉品种为模板进行PCR扩增及电泳。
PCR体系是10μL体系。DNA模板30ng,10X缓冲液1mmol L-1，MgCl20.8mmol L-1，dNTPs 0.25μmol L-1，primer 0.16μmol L-1，Taq酶0.16U，不足部分用无菌的双蒸水补齐。PCR的程序是95℃预变性5min，95℃变性50s，56℃复性45s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。聚丙烯酰氨凝胶电泳，银染。
4、聚丙烯凝胶电泳结果的整理及关联分析。关联分析利用TASSEL2.1软件的线性模型进行分析。检测到引物RM3705与棉花棉仁含油量目标性状显著相关，表明引物RM3705所对应的A05/D05染色体上的分子标记GhKAS1-3705与棉花棉仁含油量相关，该标记对应的基因命名为GhKAS1基因(GhKAS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)，。其中聚丙烯凝胶电泳结果如附图1所示，关联分析结果如表2所示。
表2
其中，图1中聚丙烯凝胶电泳结果中的不同带型代表不同基因型；表2中关联分析结果中，P值越小显著性越高，解释率代表数据关联的可靠性，一般解释率在0.02-0.15可认为数据可靠性高。
在黄冈2012年环境中，在高油基因型中高油表型占的比率是80.15％，低油基因型中低油表型占的比率是45.04％；在黄冈2013年环境中，在高油基因型中高油表型占的比率是70％，低油基因型中低油表型占的比率是48.86％；在河南郑州2012年环境中，在高油基因型中高油表型占的比率是78.83％，低油基因型中低油表型占的比率是48.79％；在河南郑州2013年环境中，在高油基因型中高油表型占的比率是66.91％，低油基因型中低油表型占的比率是53.17％；石河子2012高油表型占的比率70.77％，低油表型占的比率53.96％；石河子2013高油表型占的比率70.15％，低油表型占的比率49.12％；库尔勒2012高油表型占的比率67.23％，低油表型占的比率55.95％；库尔勒2013高油表型占的比率70.37％，低油表型占的比率53.19％。
关联分析结果表明检测到的引物RM3705(核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示)与棉花棉仁含油量目标性状显著相关，表明引物RM3705对应的棉籽油含量相关的分子标记GhKAS1-3705(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)与棉花棉仁含油量相关。
实施例3陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记突变位点的关联分析
1、极端材料重测序，确定突变位点
从503份陆地棉品种中选取10份棉仁含油量极端材料提取DNA，其中取10份棉仁含油量极端材料包括5份低油材料和5份高油材料，然后对陆地棉品种中的10份极端材料中的GhKAS1基因进行基因重测序，重测序数据用DNAMANV6软件处理。比较序列差异，找出突变位点，确定突变位点；
具体为：提取10份极端材料种子的DNA，以此为模板扩增GhKAS1基因。因为GhKAS1基因太长，设计引物分段扩增，然后进行TA克隆。TA克隆的体系是5微升体系：2.5微升2XRapid Ligation Buffer；0.5微升T4DNA Ligase；1微升pGEM-TEasy；1微升PCR纯化产物。4℃过夜连接，连接产物转移到感受态TOP10，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴5min，转移到2ml灭菌离心管，加300微升SOC，37℃摇菌1h，涂Amp+LB固体皿，倒扣37℃培养箱14-18h。挑单克隆，M13引物检验阳性，送测序。至少测序2个菌。全部测序完利用DNAMAN软件成进行拼接。利用DNAMAN软件将10份极性材料的测序结果进行多序列比对，找出突变位点。
2、针对突变位点设计引物，用于关联分析
针对突变位点设计多对引物，以503份陆地棉品种为模板进行PCR扩增GhKAS1基因。PCR体系是10μL体系，聚丙烯酰氨凝胶电泳，银染；
PCR体系：模板30ng；ddH2O 4.97μL；Buffer 1mmol L-1；Mg2+0.8mmol L-1；dNTP0.25mmol L-1；primer 0.16μmol L-1；Taq酶0.16U。
PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性50s；56℃复性45s；72℃延伸30s；30个循环；72℃延伸8min；4℃保存。
3、聚丙烯凝胶电泳结果的整理及关联分析。关联分析利用TASSEL2.1软件的线性模型进行分析。其中聚丙烯凝胶电泳结果如附图2所示；关联分析结果如下表3所示。
表3
在黄冈2012年环境中，在高油基因型中高油表型占的比率是71.32％，低油基因型中低油表型占的比率是44.17％；在黄冈2013年环境中，在高油基因型中高油表型占的比率是60.90％，低油基因型中低油表型占的比率是47.68％；在河南郑州2012年环境中，在高油基因型中高油表型占的比率是71.77％，低油基因型中低油表型占的比率是48.31％；在河南郑州2013年环境中，在高油基因型中高油表型占的比率是60.98％，低油基因型中低油表型占的比率是52.97％；石河子2012高油表型占的比率63.56％，低油表型占的比率54.14％；石河子2013高油表型占的比率60.87％，低油表型占的比率49％；库尔勒2012高油表型占的比率61.47％，低油表型占的比率59.93％；库尔勒2013高油表型占的比率66.95％，低油表型占的比率56.5％。
其中附图2聚丙烯凝胶电泳结果中的不同带型代表不同基因型；关联分析结果表3中P值越小显著性越高，解释率代表数据关联的可靠性，一般解释率在0.02-0.15认为数据可靠性高。
关联分析表明检测到的引物RMQ11(核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示)与棉花棉仁含油量目标性状显著相关，表明引物RMQ11对应的分子标记GhKAS1-Q11(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)与棉花棉仁含油量相关。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 陆地棉棉仁含油量基因KAS1的分子标记及其筛选方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttgtggatg tgtgaggctg c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaccaaccca gttcacatga ta 22
<210> 3
<211> 222
<212> DNA
<213> 棉仁分子标记GhKAS1-3705(cotton)
<400> 3
tttgtggatg tggaggctgc ttcaatcctt gtgtaacttt tcgtgagagc caatttgtga 60
ttttgtcatt gttggaatga ttttgagttg aattctagct ttagcctagg aattggtgaa 120
ctcgtatatt ttcaacacca acacgactat atttgatgag gcaattaatg aaggagagat 180
tttgttctgt tttaaatacg tatcatgtga actgggttgg tc 222
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacaaaaaac tacgaaggac ttg 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgagagggg ctatacctaa tt 22
<210> 6
<211> 154
<212> DNA
<213> 棉仁分子标记GhKAS1-Q11(cotton)
<400> 6
aacaaaaaac tacgaaggac ttgtaaataa agttcaaggt tttagtattt atttataatt 60
aattattatt taattatatt taaataaaat tattaacatt tatttataag tttcccacta 120
cacaatgcct ataattaggt atagcccctc tcaa 154
<210> 7
<211> 3621
<212> DNA
<213> 棉仁KAS1基因(cotton)
<400> 7
atggaagctc ttcaagcctc atctcttcga gcttcccctc taaaacctct ccaaaaaccc 60
aagttcaata tccatttccc caatgcatcg agactcgttc ccagggcaac caagaaattc 120
tcttccatca ccgcttcatc ccccaccgta tctgctccca agcgcgagaa ggaccccaaa 180
aaacgggtcg ttattacggg tatgggattg gtttccgttt ttgggaatga tgtcgatgct 240
tattacgata agttgctggc tggggaaagc gggatcggac tcatcgaccg gttcgatgct 300
tccaagtttc ctacccggtt cgccggtcag atccggggtt tctcttctca gggttacatt 360
gacggaaaga acgataggcg acttgacgat tgcttgaggt actgcattgt tgcaggaaag 420
aaggctttgg aagatgctga tctcgggggc gataagttat ccaaggtggg ttttttcagt 480
ggttcttgct tgttgagttt tgttaattgg gctgttttgc tagtgatttg catttttgta 540
tgttttcttc ctgaactaga gacccaaagt ttattccttt attggcttgg cttgccttga 600
tgtgcgattt tcacaagaaa gagttgcttc tttatttgca tgactttcga acctcagcaa 660
gatttaattt aactttacaa accctgatgc tttttgtgct tgttacccga ttgttctttt 720
agcattattg attttatttg atttctattt tttgtgagca tatttactgg agttttatgt 780
tttatagcat ccgtatagtc gcctgcatca atcctaccct acagaatgaa aaagatatgt 840
tgagagtgaa acctgttctt agaattacat gagtgcttat aggactgtgg attcattatt 900
tctctcgtct ggtgtttaga ttatcaactc actttttatt ttgtgattta gcttcggctc 960
ttgttagcgg tgcttcgtta aacaatgttc ctttactacc ttttctccct gtaatgctta 1020
cagaattttg aatacgttgc agatcgacaa ggagcgagct ggagtgctag ttggaactgg 1080
catgggtggt ctaacggtat tctctgacgg cgtccaaaat ctgatagaga aaggctatag 1140
aaaaataaca ccattcttca ttccctatgc tataacaaac atgtcatctg ccttgctagc 1200
cattgatctt ggtctcatgg gtccaaatta ttcaatttca actgcttgtg ctacctccaa 1260
ttattgcttc tatgctgctg ccaaccacat ccgtcgaggt gaggctgaaa tgatgattgc 1320
tggtggaact gaggctgcaa ttattcctat tgggctgggg ggctttgttg cctgcagggc 1380
attgtctcaa agaaatgatg atcctcaaac tgcttcaaga ccatgggaca aagaccgaga 1440
tggctttgtt atgggtgagg gtgctggagt attggtaagt ttacatacta atcctttata 1500
tgcatcatta gatttctttt ttagttgtta tgttgtttat gtctgtttag caccttgttt 1560
tggctccatt ggtgatcctt gatactattg ttaagagatg ctttgtggcc tgatggggat 1620
cctgtctatg tgggggtgaa gggagggggg tgaacacttc ctttacaata tcaaaatctt 1680
tgtcattgta ttgtgttgtt ttatactcat ggaacctaat tcaccatcta tgtaaacttt 1740
tatacgcatt attgtggtct tttgtaggaa tgaagtataa attttcactg acttgagaat 1800
tcatgaaaag ttttccagtt atacttgcat actttccccc tctttttatc actttgaact 1860
acttgattaa tgagacacag tcttgagtca gtggatgctg cttttccata tagattcttg 1920
gcttggttgt tacttgctta ctgaccttga gctgggggaa atgccatagc cttttataat 1980
gagttgttta ttttgctttc caggtaatgg aaagcttgga acatgccatg aaaagaggtg 2040
caccaattat tgctgagtac ttaggtggag ctgttaattg tgatgcttat catatgaccg 2100
atccaagatc tgatggtctt ggggtgtcct catgcattga gagaagcctt gaagatgctg 2160
gtgtgtctcc tgaagaggtg attctatgct ttttcaacca attctcataa tatatggtgc 2220
gaaaatccag ttaggttgtt ctggtttcta gatattcctc ttctcccatg ttatgttgtt 2280
tctttctatc taggtttgct gactcctgtg taggcattta gagttgtttt ttttttgggg 2340
gggggttcaa tcgataccac caacaagttc tatgttttat ggtgtattta atgtctgtct 2400
ttgacttgtc ttcacaaaat ctgtatcgag ataacttcta ttttatctat tagatccagg 2460
ttccaatttt aagtgagact gtagagaacc attctaatgg ttgcggttca taaatcatta 2520
tagtgactag ttaacacagt gttgttgact tcacatcaat aataggtttc agaatatacg 2580
tgttttctaa aatttatgca tggttccaaa ggtggaaaaa ttagcgaact aagtaagttc 2640
catatttcag gtaaactaca taaatgcaca tgcaacttct actcttgctg gtgatctggc 2700
tgagataaat gctattaaaa aggtattcaa gaatacatct ggcatcaaaa tcaatgcaac 2760
aaaggtacgt tttctttctc ttgcaaaatt tgagattacc atgctgtgat gttacgcttt 2820
tgctgttggt taaatgcttt gatttttgtt tcagtcgatg atagggcact gtctgggtgc 2880
agcgggcggt ttagaagcca ttgccagtgt gaaagccatt accacgggat ggctgcatcc 2940
ctccataaac caatttgtat gtgccagttt cctgtttaat gcaccttgtt tgttctgtaa 3000
agagtattat taaaactaac ttaagatagt atgtgcgagt cttggtcata tattggtttt 3060
cctttttctt taaaactttt atttacagta attccccatt acttattttt cttcaaattg 3120
tctaccaagt ctcgaatatt tgatttaatg gggaccaaac cccgcctgaa ctctgttttg 3180
ttttttcaaa tttttatgtt tatttatggt accccttttt ggtaactcaa tattttttta 3240
ctacaacttg gaaaagaaca ttttgggagt gtttaaaata tatttggttc tttcctctac 3300
ttcatgttta aatgctagat ctctttagat accttgaagt gctaaatttt ttgaatgcag 3360
aatccagagc catcagttga gtttgacact gttgccaaca aaaagcagca gcacgaggtt 3420
aatgttggta agactcttta tcctttcttg ggaagcacac catccctgtc tatatactta 3480
cattttgata gatccggatc atccagaacc tgtgtgttct gtaattctaa tcgacttgtt 3540
cttgtggatt cagcaatctc aaattcattt ggatttggag gacacaactc ggttgtggca 3600
ttttcagcct tcaagccatg a 3621
Claims (8)
1.一种陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记，其特征在于，其由下述引物对经PCR扩增并测序获得：
(1)标记引物RM3705，
正向引物序列：TTTGTGGATGTGTGAGGCTGC
反向引物序列：GACCAACCCAGTTCACATGATA；
(2)标记引物RMQ11，
正向引物序列：AACAAAAAACTACGAAGGACTTG
反向引物序列：TTGAGAGGGGCTATACCTAATT；
其中，所述标记引物(1)-(2)的扩增长度分别为222bp以及154bp。
2.一种如权利要求1所述的陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记的筛选方法，其具体步骤包括：
步骤1、确定陆地棉棉仁含油量基因：以雷蒙德氏棉基因组中与脂肪酸合成相关的基因为参考序列设计了多对Indel引物，利用这些引物对多份陆地棉品种进行基因型分析，结合油份表型数据检测到一个与棉仁含油量相关的基因为雷蒙德氏棉中预测的GrKAS1；
步骤2、候选基因功能标记的关联分析：将基因GrKAS1在陆地棉基因组中搜索到6个拷贝，为6个候选基因，随后针对这6个候选基因为模板分别设计引物，以多份陆地棉品种为模板进行PCR扩增，再用聚丙烯凝胶电泳分析及候选基因的关联分析，检测到引物RM3705与棉花棉仁含油量目标性状显著相关，表明引物RM3705所对应的A05/D05染色体上的分子标记GhKAS1-3705与棉花棉仁含油量相关，该标记对应的基因命名为GhKAS1；
步骤3、突变位点的关联分析：从多份陆地棉品种中选取棉仁含油量极端材料提取DNA，其中包括低油材料和高油材料，然后对陆地棉品种中的极端材料中的GhKAS1基因进行基因重测序，确定突变位点，再针对突变位点设计多对引物，以多份陆地棉品种为模板进行PCR扩增，进行突变位点的关联分析，利用聚丙烯凝胶电泳分析及关联分析，检测到引物RMQ11与棉花棉仁含油量目标性状显著相关，引物RMQ11所对应的分子标记为GhKAS1-Q11，即获得了一个可以鉴定棉仁含油量的分子标记为GhKAS1-Q11。
3.如权利要求2所述用于鉴定陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤2中的PCR扩增体系是10μL体系，其中，DNA模板30ng，10X缓冲液1mmolL-1，MgCl2 0.8mmol L-1，dNTPs 0.25μmol L-1，primer 0.16μmol L-1，Taq酶0.16U，不足部分用无菌的双蒸水补齐。
4.如权利要求2所述用于鉴定陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤2中的PCR程序：95℃预变性5min，95℃变性50s，56℃复性45s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。
5.如权利要求2所述用于鉴定陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤3中的PCR扩增体系是10μL体系，其中，DNA模板30ng；ddH2O 4.97μL；Buffer 1mmol L-1；Mg2+0.8mmol L-1；dNTP 0.25mmol L-1；primer 0.16μmol L-1；Taq酶0.16U。
6.如权利要求2所述用于鉴定陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤3中的PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性50s；56℃复性45s；72℃延伸30s；30个循环；72℃延伸8min。
7.如权利要求2所述用于鉴定陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤3中的极端材料的重测序找出突变位点的具体步骤为：
提取10份极端材料种子的DNA，以此为模板扩增GhKAS1基因，设计引物分段扩增GhKAS1基因，然后进行TA克隆，接着4℃过夜连接，连接产物转移到感受态，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴5min，转移到2ml灭菌离心管，加300微升SOC，37℃摇菌1h，涂Amp+LB固体皿，倒扣37℃培养箱14-18h，挑单克隆，M13引物检验阳性，送测序，至少测序2个菌，全部测序完利用DNAMAN软件成进行拼接，利用DNAMAN软件将10份极性材料的测序结果进行多序列比对，找出突变位点。
8.如权利要求7所述用于鉴定陆地棉棉仁含油量基因GhKAS1的分子标记的筛选方法，其特征在于，TA克隆的体系是5微升体系：2.5μL 2X Rapid Ligation Buffer；0.5μL T4DNA Ligase；1μL pGEM-TEasy；1μL PCR纯化产物。
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