CN105695564A - 一种基于荧光pcr的快速核酸测序法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于荧光PCR的快速核酸测序法，在细菌基因测序中成功应用，可用于病原菌鉴定。采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段，上机进行双脱氧测序。研制的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂：1）FTA卡1片。2）PCR反应液1管，内装SYBR GREEN荧光PCR反应液。3）上下游引物各1管，内装目标序列扩增及测序引物。4）双脱氧测序试剂一套。5）测序产物纯化试剂一套，包括XTerminator solution、SAM solution各1管。6）去离子水1管，内装无DNA酶的灭菌去离子水。由于采用FTA卡保存核酸，该卡自然晾干后，能在室温下长期保存，不仅方便保存，PCR扩增时无需进行核酸提取，而且避免了普通细菌基因测序时处理菌悬液操作过程的生物安全风险。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于荧光PCR的快速核酸测序法，在细菌基因测序中成功应用，可用于病原菌鉴定。
背景技术
1977年Sanger发明了双脱氧DNA测序方法，到目前为止使用最多的仍是双脱氧链终止法测序和化学降解法测序两类经典传统测序方法，其中前者应用最为广泛，是使人类基因组计划得以顺利完成的核心技术。在该方法中用得最多的是美国应用生物系统公司的BigDye终止子法。其主要步骤包括DNA提取、PCR扩增、PCR产物定性检测、PCR产物纯化、测序反应、测序产物纯化、毛细管电泳、数据分析、序列拼接（对于长片段）等。近年来，由于测序技术的提高和普及，国际DNA序列数据库及比对程序的完善，使得测序逐渐地开始应用于病原菌的检测。测序法与其它分子生物学方法相比，其最大的优点在于无需借助与标准菌株的比对，便可直接得出结果，也无需使用其它方法进行确证，是细菌鉴定的金标准。第2代、第3代测序技术虽已有商业化产品，但费用仍居高不下，不太适用于基层检测机构的日常检测。另外，对细菌测序鉴定方法而言，相关遗传标记的基础研究缺乏系统性，是阻碍该方法大规模推广应用的一大原因。
发明内容
本发明的目的在于公开一种基于荧光PCR的快速核酸测序法。
方法原理：将FTA卡核酸保存技术、实时荧光PCR技术与传统双脱氧测序法创新性相结合，使双脱氧基因测序操作步骤有明显简化，减少工作量，但细菌测序质量基本不变。具体步骤包括：FTA卡保存细菌核酸，实时荧光PCR直接扩增后上机进行双脱氧测序。由于采用FTA卡保存，该卡自然晾干后，能在室温下长期保存，不仅方便保存，而且避免了普通细菌基因测序时的生物安全风险；由于采用实时荧光PCR代替普通PCR，可以免去凝胶电泳的操作，不仅降低操作过程中样品或PCR反应体系的交叉污染，也可以实时监控PCR扩增的效果，同时还缩短了实验时间。
基于上述目的，本发明采用以下具体实施方案：
采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段，上机进行双脱氧测序。
基于本发明研制的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂：
1）FTA卡1片。
2）PCR反应液1管，内装SYBRGREEN荧光PCR反应液，包括Taq酶、dNTP、含Mg2+的Buffer、SYBRGREEN溶液。
3）上下游引物各1管，内装目标序列扩增及测序引物。
4）双脱氧测序试剂一套，包括BigDyeTerminatorv3.1SequencingBuffer(5×),BigDyeMix。
5）测序产物纯化试剂一套，包括XTerminatorsolution、SAMsolution各1管。
6）去离子水1管，内装无DNA酶的灭菌去离子水。
基于本发明建立的基于荧光PCR的快速测序方法，按下列步骤进行：
1）FTA样品卡的制备
细菌悬液经适当稀释后（大约6×104至6×107CFU/mL），吸取100ul滴于FTA卡上，室温晾干备用。
2）SYBRGreen实时荧光PCR直接扩增目标片段
配制反应体系：按常规配制SYBRGreen实时荧光PCR反应体系，加入上下游引物的终浓度均为100ng/uL，用打孔器在FTA卡打出直径0.5mm的纸片加入体系，终体积为20uL。荧光PCR直接扩增：使用荧光定量PCR仪进行扩增，扩增反应条件为，95℃2min，[95℃10s，60℃20S，72℃40S(荧光采集)]35次循环，72℃10min。PCR扩增效果评价：Cp（或Ct）值小于30且熔解曲线显示有一个明显主峰，否则即为扩增产物不合格。
3）测序PCR反应
如果荧光PCR扩增产物合格，将PCR产物依据Cp值大小稀释5-10倍，取已稀释的产物1ul置于PCR管中，再加4ulBigDyeTerminatorv3.1SequencingBuffer(5×),测序引物（上游或下游引物）的终浓度为100ng/uL，终体积为10uL，使用梯度PCR仪进行扩增。扩增条件为：98℃2min，（96℃10S，50℃5s，60℃4min）25次循环。
4）产物纯化、毛细管电泳、序列读取和分析
在96孔板中加入产物1uL，SAMsolution9uL，BigDyeXTerminatorsolution2uL。震荡5min，2000g离心2min，盖上测序用硅胶封盖，用基因分析仪进行毛细管电泳，电泳完毕机器自动根据测序谱图并进行序列读取，可获得目标片段基因序列。
本发明的优点包括:
1.由于采用FTA卡保存核酸，该卡自然晾干后，能在室温下长期保存，不仅方便保存，PCR扩增时无需进行核酸提取，而且避免了普通细菌基因测序时处理菌悬液操作过程的生物安全风险。
2.由于采用实时荧光PCR代替普通PCR，可以免去凝胶电泳的操作，不仅降低操作过程中样品或PCR反应体系的交叉污染，也可以实时监控PCR扩增的效果，同时还缩短了实验时间。
3.基于上述两个明显的简化操作、节省时间的优点，使得在基层实验室推广基因测序法鉴定致病菌成为可能。
附图说明
图1是利用本发明涉及的基于荧光PCR的快速核酸测序法的病原菌FTA卡-SYBRGreen实时荧光PCR直接扩增效果图。
图2是利用本发明涉及的基于荧光PCR的快速核酸测序法的病原菌测序谱图。
具体实施方式
待测序鉴定病原菌1株：来自临床标本分离菌株，为斜面生长菌苔。
检测步骤：应用上述试剂和方法进行检测。
1）样品的处理与DNA模板的提取
上述分离菌株细菌悬液经适当稀释后（大约6×104至6×107CFU/mL），吸取100ul滴于FTA卡上，室温晾干备用。
2）SYBRGreen实时荧光PCR反应体系配制；
将SYBRGreen实时荧光PCR从冰箱取出后，置室温融化，2000rpm离心10sec。按下表计算试剂用量；
| 试剂名称 | PCR反应液. | 上下游引物 | 灭菌去离子水 |
| 用量μL | 10×4.5 | 各1×4.5 | 8×4.5 |
n=1（阴性对照）+1（阳性对照）+2（样品数）+0.5（损耗）
将45μLPCR反应液、4.5μL上游引物、4.5μL下游引物、36μL灭菌去离子水、分别加入1.5mL离心管中，混匀后，2000rpm离心10sec，分别向设定的阳性反应孔、阴性反应孔和样品反应孔中加入20μL/孔。
3）加样
用打孔器在FTA卡打出直径0.5mm的纸片1片加入体系，用反应膜封住反应孔，置于荧光PCR仪上检测。
4）反应参数及PCR扩增效果评价
荧光PCR仪选择FAM通道，扩增反应条件为，95℃2min，[95℃10s，60℃20S，72℃40S(荧光采集)]35次循环，72℃10min。PCR扩增效果评价：Cp（或Ct）值小于30且熔解曲线显示有一个明显主峰，否则即为扩增产物不合格。
5）测序PCR反应
如果荧光PCR扩增产物合格，将PCR产物依据Cp值大小稀释5-10倍，取已稀释的产物1ul置于PCR管中，再加4ulBigDyeTerminatorv3.1SequencingBuffer(5×),测序引物（上游或下游引物）的终浓度为100ng/uL，终体积为10uL，使用梯度PCR仪进行扩增。扩增条件为：98℃2min，（96℃10S，50℃5s，60℃4min）25次循环。
6）产物纯化、毛细管电泳、序列读取和分析
在96孔板中加入产物1uL，SAMsolution9uL，BigDyeXTerminatorsolution2uL。震荡5min，2000g离心2min，盖上测序用硅胶封盖，用基因分析仪进行毛细管电泳，电泳完毕机器自动根据测序谱图并进行序列读取，可获得目标片段基因序列。
Claims (1)
1.一种基于荧光PCR的快速核酸测序法，采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段，上机进行双脱氧测序；基于本发明研制的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂：
1）FTA卡1片;
2）PCR反应液1管，内装SYBRGREEN荧光PCR反应液，包括Taq酶、dNTP、含Mg2+的Buffer、SYBRGREEN溶液;
上下游引物各1管，内装目标序列扩增及测序引物;
双脱氧测序试剂一套，包括BigDyeTerminatorv3.1SequencingBuffer(5×),BigDyeMix;
测序产物纯化试剂一套，包括XTerminatorsolution、SAMsolution各1管;
去离子水1管，内装无DNA酶的灭菌去离子水;
基于本发明建立的基于荧光PCR的快速测序方法，按下列步骤进行：
1）FTA样品卡的制备
细菌悬液经适当稀释后（大约6×104至6×107CFU/mL），吸取100ul滴于FTA卡上，室温晾干备用;
2）SYBRGreen实时荧光PCR直接扩增目标片段
配制反应体系：按常规配制SYBRGreen实时荧光PCR反应体系，加入上下游引物的终浓度均为100ng/uL，用打孔器在FTA卡打出直径0.5mm的纸片加入体系，终体积为20uL；
荧光PCR直接扩增：使用荧光定量PCR仪进行扩增，扩增反应条件为，95℃2min，[95℃10s，60℃20S，72℃40S(荧光采集)]35次循环，72℃10min；
PCR扩增效果评价：Cp（或Ct）值小于30且熔解曲线显示有一个明显主峰，否则即为扩增产物不合格;
3）测序PCR反应
如果荧光PCR扩增产物合格，将PCR产物依据Cp值大小稀释5-10倍，取已稀释的产物1ul置于PCR管中，再加4ulBigDyeTerminatorv3.1SequencingBuffer(5×),测序引物（上游或下游引物）的终浓度为100ng/uL，终体积为10uL，使用梯度PCR仪进行扩增；
扩增条件为：98℃2min，（96℃10S，50℃5s，60℃4min）25次循环;
4）产物纯化、毛细管电泳、序列读取和分析
在96孔板中加入产物1uL，SAMsolution9uL，BigDyeXTerminatorsolution2uL；
震荡5min，2000g离心2min，盖上测序用硅胶封盖，用基因分析仪进行毛细管电泳，电泳完毕机器自动根据测序谱图并进行序列读取，可获得目标片段基因序列;
方法原理：将FTA卡核酸保存技术、实时荧光PCR技术与传统双脱氧测序法创新性相结合，使双脱氧基因测序操作步骤有明显简化，减少工作量，但细菌测序质量基本不变；具体步骤包括：FTA卡保存细菌核酸，实时荧光PCR直接扩增后上机进行双脱氧测序；由于采用FTA卡保存核酸，该卡自然晾干后，能在室温下长期保存，不仅方便保存，PCR扩增时无需进行核酸提取，而且避免了普通细菌基因测序时处理菌悬液操作过程的生物安全风险；由于采用实时荧光PCR代替普通PCR，可以免去凝胶电泳的操作，不仅降低操作过程中样品或PCR反应体系的交叉污染，也可以实时监控PCR扩增的效果，同时还缩短了实验时间。
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| CN112301150A (zh) * | 2019-07-26 | 2021-02-02 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 一种直接荧光pcr检测呼吸道病毒的方法 |
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| CN101824470A (zh) * | 2009-12-31 | 2010-09-08 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 基于ce-sscp的血液病原菌快速检测方法 |
| CN102181580A (zh) * | 2011-04-18 | 2011-09-14 | 湖南农安生物技术有限公司 | 一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法 |
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- 2015-04-29 CN CN201510214642.6A patent/CN105695564A/zh active Pending
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