CN114317782B - 基于荧光raa技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物探针组合、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物探针组合、试剂盒和方法。本发明首先公开了基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物探针组合，包括用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和/或用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B。本发明进一步基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法。本发明基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法检出率高、检测时间短、灵敏度高、特异性强、灵活方便，为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的临床快速高效检测提供了一种新的选择。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域。更具体地，涉及基于荧光重组酶介导等温扩增(RAA)技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的引物探针组合、试剂盒和方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是常见条件致病菌，广泛分布于自然界。近40％的成年人携带金黄色葡萄球菌，该菌通常定植在宿主的体表或者粘膜，当宿主免疫力下降，就容易感染金黄色葡萄球菌，可以造成皮肤、呼吸道、伤口等感染，甚至会导致脓毒血症和心脏内膜炎等严重疾病。在抗生素出现之前，金黄色葡萄球菌的严重感染引起的死亡率极高。自上世纪40年代发现青霉素后，死亡率有所下降。然而，随着青霉素的广泛应用，金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药性逐渐增强。1959年甲氧西林问世后，由耐青霉素的金黄色葡萄球菌引起的相关感染性疾病的发病率和死亡率均显著降低。但随着甲氧西林的广泛使用，1961年，世界首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistantStaphylococcus aureus,MRSA)被分离出。MRSA每年引起大约18000多人死亡,并在世界范围内广泛分布，且呈现出逐年上升的趋势。由于其严重的耐药性和分布的广泛性，MRSA已经成为一种严重威胁人类和动物健康的人兽共患病原菌。
MRSA具有β-内酰胺酶活性，能够耐受青霉素和大多数头孢菌素类抗生素。MRSA耐药的主要机制是其携带的mecA基因编码了一种新的青霉素结合蛋白(penicillin-bindingproteins，PBPs)，即PBP2a。PBP2a对β-内酰胺类抗生素亲和力低，可代替PBPs继续合成细菌细胞壁从而表现出耐药。另外，MRSA还可以通过改变抗生素作用靶位、产生修饰酶和降低膜通透性等方式产生对氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类等抗生素的耐药性。
随着临床感染MRSA病例增多，选取快速、高效和经济的检测方法对于临床实验室具有重要意义。目前，MRSA的检测手段多种多样，大概可以分成两类，一类是基于耐药表型的传统检测方法，包括头孢西丁纸片扩散法、微量肉汤稀释法和琼脂稀释法、产色培养基法、E-test法、乳胶凝集试验以及全(半)自动微生物分析仪等，也是目前临床实验室经常采用的方法，但由于涉及细菌分离培养，因此上述方法普遍存在耗时较长的缺陷，不能满足MRSA的快速诊断要求；另一类是基于耐药基因或产物的分子生物学检测技术，包括核酸杂交技术、质谱技术、免疫层析和PCR技术等，但是核酸杂交技术、质谱技术和免疫层析存在方法不够成熟、设备昂贵和检测成本偏高等问题，目前应用有限。以mecA作为靶基因的PCR技术，由于具有高特异性和灵敏度，是目前检测MRSA的“金标准”。
2007年，英国和丹麦发现了一种新型的MRSA(LGA251)，该MRSA对苯唑西林和头孢西丁耐药，但mecA基因检测和PBP2a抗体凝集实验为阴性。该菌株携带有一种新的mecA同源基因mecALGA251，即mecC。mecC与mecA在DNA水平上只存在有68.7％的同源性，所编码的PBP2a在蛋白水平上也只有63％的同源性。回顾性研究发现mecC MRSA已经感染人类与动物超过40年之上，已在13个欧洲国家发现并报道，至少有14种宿主。监测数据显示英国、丹麦等国2011-2015年的mecC MRSA占比约为0.1％-6.3％。由于mecC与mecA序列同源性较低，以往利用PCR检测mecA基因和凝集试验检测PBP2a蛋白来判定mecC MRSA则会出现假阴性结果。有数据显示，近40％的mecC MRSA分离株无法通过实验室临床试验获得鉴别。另外，由于mecC MRSA出现较晚，中国尚未有mecC MRSA阳性菌株分离的报道，在mecC MRSA检测方法、流行病学等方面的研究还非常欠缺。
因此，开发可同时检测mecC与mecA的MRSA快速检测技术可以有效提高各型MRSA的检出效率，对维护公共卫生安全和动物性食品安全也具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种检出率高、特异性强和灵敏度高的基于荧光重组酶介导等温扩增(RAA)技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的引物探针组合和试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供一种能快速有效的基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供了一种基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物探针组合，所述引物探针组合包括用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和/或用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B；其中，所述引物探针组合A由序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物mecAF1和SEQ IDNO.6所示的下游引物mecAR3组成的引物对和序列如SEQ ID NO.13所示的mecA-探针组成，所述引物探针组合B由序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物mecCF1和SEQ ID NO.11所示的下游引物mecCR2组成的引物对和序列如SEQ ID NO.14所示的mecC-探针组成。
进一步，所述mecA-探针的5′端第31位T碱基上修饰荧光报告基团，5′端第33位T碱基上修饰荧光淬灭基团，荧光报告基团与荧光淬灭基团之间间隔1个碱基C，由四氢呋喃残基替换，3′端进行C3 spacer阻断修饰；
所述mecC-探针的5′端第31位T碱基上修饰荧光报告基团，5′端第35位T碱基上修饰荧光淬灭基团，荧光报告基团与荧光淬灭基团之间间隔3个碱基ACA，C由四氢呋喃残基替换，3′端进行C3 spacer阻断修饰。
进一步，所述mecA-探针或mecC-探针的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、VIC、ROX、CY3或CY5；所述mecA-探针或mecC-探针的荧光淬灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
本发明上述引物探针组合可实现mecA与mecC两种耐药基因的同步检测，有效避免了mecC的漏检，提高了MRSA检出率；也可以根据不同需求单独检测mecA或mecC基因，灵活方便。当对mecA与mecC两种耐药基因的同步检测且需要进行区分时，所述mecA-探针和mecC-探针采用的荧光报告基团和荧光淬灭基团互不相同。
在本发明具体的实施方式中，所述mecA-探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；所述mecC-探针的荧光报告基团为CY5，荧光淬灭基团为BHQ3。
在本发明具体的实施方式中，所述mecA-探针的序列为TAGCACTTGTAAGCACACCTTCATATGACG[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]ATCCATTTATGTATG-C3spacer；所述mecC-探针的序列为AGAGCCTTTGCTCAACAAATTTCAAATCAC[CY5-dT]A[THF]A[BHQ3-dT]CACCAGGTTCAAC-C3 spacer。
进一步，所述引物探针组合中上游引物mecAF1、下游引物mecAR3、上游引物mecCF1、下游引物mecCR2的浓度均为5μM；所述mecA-探针的浓度为5μM，mecC-探针的浓度为6μM。
重组酶介导等温扩增技术(Recombinase Aided Amplification，RAA)是一种多酶恒温核酸快速扩增技术，基本原理是：在常温恒下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描，待找到与引物互补的目标区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物3’末端开始链的延伸，这个过程迅速高效地循环，从而完成目的片段超快速扩增。荧光检测则依赖核酸外切酶的作用，加入根据模板设计的特异分子探针，使用荧光监测设备实现对目标片段扩增过程的实时监控。该方法灵敏性度和特异性较高，操作简便，具有较高的临床应用价值。
本发明进一步提供了基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物探针组合。
进一步，所述试剂盒还包括现有技术中常用的用于荧光RAA扩增的其他试剂，如包括重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、dNTP等成分，可以通过商品化购买得到。
在本发明具体的实施方式中，所述用于荧光RAA扩增的其他试剂购自潍坊安普未来生物科技有限公司的DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)，包括bufferA和bufferB等。
上述引物探针组合或试剂盒在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内：
1)在检测待测样本是否为或含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用；
2)在制备检测待测样本是否为或含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的产品中的应用；
3)在检测待测样本是否为或含有mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用；
4)在制备检测待测样本是否为或含有mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的产品中的应用；
5)在检测待测样本是否为或含有mecA阳性或mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用；
6)在制备检测待测样本是否为或含有mecA阳性或mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的产品中的应用；
7)在区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性中应用；
8)在制备区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的产品中应用；
9)在区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性还是mecA阴性或mecC阳性还是mecC阴性中的应用；
10)在制备区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性还是mecA阴性或mecC阳性还是mecC阴性的产品中的应用。
在本发明具体的实施方式中，所述待测样本为待测金黄色葡萄球菌。
本发明进一步还提供了一种基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
以待测样本的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用上述引物探针组合或试剂盒中用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行双重荧光RAA扩增或分别进行单一荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线分析待测样本是否为或含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，若待测样本出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测样本阳性(待测样本为或含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)；若待测样本未出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测样本阴性(待测样本不为或不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)。
本发明进一步还提供了一种基于RAA技术检测待测样本是否为或含有mecA阳性mecC阴性(即携带mecA基因未携带mecC基因)、mecC阳性mecA阴性(即携带mecC基因未携带mecA基因)还是mecA与mecC双阳性(即同时携带mecA与mecC基因)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
以待测样本的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用上述引物探针组合或上述试剂盒中用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行双重荧光RAA扩增或分别进行单一荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线的荧光信号分析待测样本是否为或含有mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：当出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测样本为或含有mecA阳性mecC阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，即mecA+mecC—型MRSA；当出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测样本为或含有mecC阳性mecA阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，即mecA—mecC+型MRSA；当同时出现荧光信号为mecA-探针和mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测样本为或含有mecA和mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，即mecA+mecC+型MRSA。
本发明进一步还提供了一种基于荧光RAA技术检测待测样本是否为或含有mecA阳性(即携带mecA基因)或mecC阳性(即携带mecC基因)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
以待测样本的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用上述引物探针组合或上述试剂盒中用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A或用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行单一荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线所利用的引物探针组合分析待测样本是否为或含有mecA阳性的或mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：
如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本为或含有mecA阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本不为或不含有mecA阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本为或含有mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本不为或不含有mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
在本发明的具体的实施方式中，上述方法中所述待测样本为待测金黄色葡萄球菌。
本发明进一步还提供了一种基于荧光RAA技术区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性(即携带mecA基因未携带mecC基因)、mecC阳性mecA阴性(即携带mecC基因未携带mecA基因)还是mecA与mecC双阳性(即同时携带mecA与mecC基因)的方法，包括如下步骤：
以待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用上述引物探针组合或上述试剂盒中用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行双重荧光RAA扩增或分别进行单一荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线的荧光信号区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，当出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性；当出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecC阳性mecA阴性；当同时出现荧光信号为mecA-探针和mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA和mecC双阳性。
本发明进一步还提供了一种基于荧光RAA技术区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性(即携带mecA基因)还是mecA阴性(即未携带mecA基因)或mecC阳性(即携带mecC基因)还是mecC阴性(即未携带mecC基因)的方法，包括如下步骤：
以待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用上述引物探针组合或上述试剂盒中用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A或用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行单一荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线所利用的引物探针组合区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性还是mecA阴性或mecC阳性还是mecC阴性：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阴性；如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecC阳性，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecC阴性。
进一步，所述双重荧光RAA扩增的RAA反应体系中上游引物mecAF1、下游引物mecAR3、上游引物mecCF1、下游引物mecCR2的终浓度均为0.2μM；所述mecA-探针的终浓度为0.06μM，mecC-探针的终浓度为0.072μM。
在本发明具体的实施方式中，所述双重荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A14.7μL、上游引物mecAF1 1μL、下游引物mecAR3 1μL、上游引物mecCF1 1μL、下游引物mecCR2 1μL、mecA-探针0.3μL、mecC-探针0.3μL、ddH2O 3.45μL、buffer B 1.25μL和模板1μL；所述上游引物mecAF1、下游引物mecAR3、上游引物mecCF1、下游引物mecCR2的浓度均为5μM；所述mecA-探针的浓度为5μM，mecC-探针的浓度为6μM。
进一步，所述单一荧光RAA扩增的RAA反应体系中上游引物mecAF1、下游引物mecAR3的终浓度均为0.2μM、mecA-探针的终浓度为0.06μM，或所述上游引物mecCF1、下游引物mecCR2均为0.2μM、mecC-探针的终浓度为0.072μM。
在本发明具体的实施方式中，所述单一荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A14.7μL、上游引物mecAF1 1μL、下游引物mecAR3 1μL、mecA-探针0.3μL、ddH2O5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL，或buffer A 14.7μL、上游引物mecCF1 1μL、下游引物mecCR21μL、mecC-探针0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL；所述上游引物mecAF1、下游引物mecAR3、上游引物mecCF1、下游引物mecCR2的浓度均为5μM，mecA-探针的浓度为5μM，mecC-探针的浓度为6μM。
在本发明具体的实施方式中，所述双重荧光RAA扩增和单一荧光RAA扩增的反应程序均为39℃，30s，40个循环。
本发明的有益效果如下：
本发明基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法为MRSA的临床快速高效检测的提供了一种新的选择，具有如下优点：
1、检出率高且灵活方便。将MRSA新型耐药基因mecC纳入检测范围，一方面可以进行双重荧光RAA扩增实现mecA与mecC两种耐药基因的同步检测，有效避免了mecC型MRSA的漏检，与单一针对mecA基因的荧光定量PCR或者PBP2a蛋白的血清凝集实验相比，该方法提高了MRSA检出率；另一方面也可以根据不同需求进行单一荧光RAA扩增实现mecA或mecC基因的单独检测，灵活方便。
2、检测时间短。无需进行药敏实验，以待测样本的基因组DNA作为模板，通过荧光RAA扩增可在1小时内完成MRSA的检测，与传统药敏试验和PCR相比，显著缩短了检测时间。
3、灵敏度高。不管是对mecA和mecC基因进行单一荧光RAA检测还是双重荧光RAA检测，mecA和mecC的最低检测限度均可达到20copies/μL，与荧光定量PCR灵敏度相当。
4、特异性强。当对mecA基因进行单一荧光RAA检测时能够准确检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mecA阳性)和阳性重组质粒puc57-mecA，与表皮葡萄球菌、无乳链球菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌无交叉反应；当对mecC基因进行单一荧光RAA检测时能够准确检测出阳性重组质粒puc57-mecC，与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mecA阳性)、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌无交叉反应。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因(a)和mecC基因(b)的不同引物对的荧光RAA扩增曲线。
图2为用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因(a)和mecC基因(b)的不同引物浓度的荧光RAA扩增曲线。
图3为用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因(a)和mecC基因(b)的不同探针浓度的荧光RAA扩增曲线。
图4为单一荧光RAA检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因(a)或mecC基因(b)的灵敏性试验结果。
图5为单一荧光RAA检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因(a)或mecC基因(b)的特异性试验结果。
图6为双重荧光RAA检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因和mecC基因的灵敏性试验结果。
图7为部分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的单一荧光RAA检测mecA基因结果。
图8为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的双重荧光RAA检测结果。
图9为部分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的taqman-探针法qPCR检测mecA基因结果。
图10为taqman-探针法qPCR与单一荧光RAA检测mecA基因的相关性比较。
图11为部分金黄色葡萄球菌临床分离株的双重荧光RAA检测结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明下述实施例用到的菌株及样品如下：
甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mecA阳性)(ATCC43300)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、大肠杆菌(ATCC25922)、无乳链球菌(ATCC13813)、肠炎沙门氏菌(临床分离株)。
46份耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离株以及12份金黄色葡萄球菌临床分离株样品来自中国兽医药品监察所安全评价室。
阳性对照为阳性重组质粒puc57-mecA和阳性重组质粒puc57-mecC，mecA和mecC全长基因由华大基因公司合成并克隆至puc57质粒中。
本发明下述实施例用到主要耗材与仪器来源：
细菌基因组DNA提取试剂盒、2×TaqPCRMix购于天根生化科技公司；
DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)购自潍坊安普未来生物科技有限公司；
2×SuperFast Probe Mixture、ddH2O购自康为世纪公司；
10×Loading Buffer购自Takara公司；
实时荧光PCR仪购自赛默飞公司；
电泳仪购自北京市六一仪器厂；
凝胶成像系统购自BIO-RAD公司。
实施例1基于荧光RAA技术用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物探针组合的筛选
1、引物与探针的设计与合成
根据荧光重组酶恒温扩增引物探针设计要求，分别在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA与mecC耐药基因的保守区选择序列并设计引物和探针(表1)，由华大基因公司合成。
表1引物和探针序列
所述mecA-探针在5′端第31位T碱基修饰荧光报告基团FAM，在5′端第33位T碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1，荧光报告基团与荧光淬灭基团之间间隔1个碱基C，由四氢呋喃残基替换，3′端进行C3 spacer阻断修饰，即所述mecA-探针为：
TAGCACTTGTAAGCACACCTTCATATGACG[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]ATCCATTTATGTATG-C3 spacer；
所述mecC-探针在5′端第31位T碱基修饰荧光报告基团CY5，在5′端第35位T碱基修饰荧光淬灭基团BHQ3，荧光报告基团与荧光淬灭基团之间间隔3个碱基ACA，C由四氢呋喃残基替换，3′端进行C3 spacer阻断修饰，即所述mecC-探针为：
AGAGCCTTTGCTCAACAAATTTCAAATCAC[CY5-dT]A[THF]A[BHQ3-dT]CACCAGGTTCAAC-C3 spacer。
2、RAA反应体系的优化
2.1引物对的筛选
将用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因的上游引物mecA-F1、mecA-F2、mecA-F3与下游引物mecA-R1、mecA-R2、mecA-R3两两组合后与探针(mecA-探针)进行组合，以阳性重组质粒puc57-mecA为模板(以ddH2O为阴性对照，即negative)进行荧光RAA扩增比较mecAF1/R1、mecAF1/R2、mecAF1/R3、mecAF2/R1、mecAF2/R2、mecAF2/R3、mecAF3/R1、mecAF3/R2和mecAF3/R3共9对引物对的扩增效果；将用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecC基因的上游引物mecC-F1、mecC-F2、mecC-F3与下游引物mecC-R1、mecC-R2、mecC-R3两两组合后与探针(mecC-探针)进行组合，以阳性重组质粒puc57-mecC为模板(以ddH2O为阴性对照，即negative)进行荧光RAA扩增比较mecCF1/R1、mecCF1/R2、mecCF1/R3、mecCF2/R1、mecCF2/R2、mecCF2/R3、mecCF3/R1、mecCF3/R2和mecCF3/R3共9对引物对的扩增效果。
具体如下：
根据DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)使用说明书，配置25μL由如下各组分组成的RAA反应体系：buffer A 14.7μL、上下游引物(10μM)各1μL、探针(10μM)0.3μL、ddH2O5.75μL、buffer B 1.25μL、模板1μL，各组分混合后上下颠倒混匀后立即放入实时荧光PCR仪，反应程序为39℃，30s，40个循环，进行荧光RAA扩增。
结果如图1所示，结果显示：利用mecAF1/R3引物对和mecA-探针组合以阳性重组质粒puc57-mecA为模板进行荧光RAA扩增时得到的荧光RAA扩增曲线的Ct值最低和ΔR值最高(图1中a)；利用mecCF1/R2引物对和mecC-探针组合以阳性重组质粒puc57-mecC为模板进行荧光RAA扩增时得到的荧光RAA扩增曲线的Ct值最低和ΔR值最高(图1中b)。
因此，用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因和mecC基因的RAA最佳引物对的分别为mecAF1/R3与mecCF1/R2。
2.2引物和探针浓度的筛选
将2.1筛选到的最佳引物对(mecAF1/R3与mecCF1/R2)的上下游引物分别进行稀释，得到上下游引物的浓度分别均为3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM，其余步骤同2.1进行荧光RAA扩增，扩增结束后结合荧光RAA扩增曲线的Ct值和ΔR值，筛选出最经济的引物浓度。结果如图2所示，结果显示：用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因和mecC基因的上下游引物的浓度均为5μM，以阳性重组质粒puc57-mecA(图2中a)和puc57-mecC(图2中b)为模板的荧光RAA扩增曲线的Ct值最低和ΔR值最高，扩增效率最高。因此，用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因的引物对mecAF1/R3和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecC基因的引物对mecCF1/R2的上下游引物的最佳浓度均为5μM。
将用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA与mecC基因的探针(mecA-探针和mecC-探针)分别进行稀释，得到探针的浓度分别均为1μM、3μM、5μM、7μM、9μM，以筛选到的最佳引物对(mecAF1/R3与mecCF1/R2)和最佳浓度(5μM)，其他步骤同2.1进行荧光RAA扩增，扩增结束后结合荧光RAA扩增曲线的Ct值和ΔR值，筛选出最经济的探针浓度。结果如图3所示，根据最低的Ct值和最高ΔR值，mecA-探针的最佳浓度为5μM(图3中a)，mecC-探针的最佳浓度为6μM(图3中b)。
综上，通过RAA反应体系的优化，用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因的引物探针组合由引物对mecAF1/R3和mecA-探针组成，所述引物对mecAF1/R3由上游引物mecAF1(其序列如SEQ ID NO.1所示)和下游引物mecAR3(其序列如SEQ ID NO.6所示)组成，上下游引物的最佳浓度均为5μM(经换算在RAA反应体系中的终浓度为0.2μM)，所述mecA-探针的序列如SEQ ID NO.13所示，最佳浓度为5μM(经换算在RAA反应体系中的终浓度为0.06μM)；用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecC基因的引物探针组合由引物对mecCF1/R2和mecC-探针组成，所述引物对mecCF1/R2由上游引物mecCF1(其序列如SEQ ID NO.7所示)和下游引物mecCR2(其序列如SEQ ID NO.11所示)组成，上下游引物的最佳浓度均为5μM(经换算在RAA反应体系中的终浓度为0.2μM)，所述mecC-探针的序列如SEQ ID NO.14所示，最佳浓度为6μM(经换算在RAA反应体系中的终浓度为0.072μM)。
实施例2基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒及方法的建立
1、基于荧光RAA技术用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒
根据实施例1的筛选结果提供一种基于荧光RAA技术用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，所述试剂盒包括：上游引物mecAF1、下游引物mecAR3和mecA-探针组成的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和/或上游引物mecCF1、下游引物mecCR2和mecC-探针组成的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B、ddH2O、buffer A、buffer B；其中，上游引物mecAF1、下游引物mecAR3、上游引物mecCF1、下游引物mecCR2的浓度均为5μM；所述mecA-探针的浓度为5μM，mecC-探针的浓度为6μM；ddH2O、buffer A、buffer B来源于购自潍坊安普未来生物科技有限公司的DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)。
2、基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
以待测样本的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行双重荧光RAA扩增或分别进行单一荧光RAA扩增，双重荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A 14.7μL、上游引物mecAF1(5μM)1μL、下游引物mecAR3(5μM)1μL、上游引物mecCF1(5μM)1μL、下游引物mecCR2(5μM)1μL、mecA-探针(5μM)0.3μL、mecC-探针(6μM)0.3μL、ddH2O 3.45μL、buffer B 1.25μL和模板1μL；单一荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A 14.7μL、上游引物mecAF1(5μM)1μL、下游引物mecAR3(5μM)1μL、mecA-探针(5μM)0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL，或buffer A 14.7μL、上游引物mecCF1(5μM)1μL、下游引物mecCR2(5μM)1μL、mecC-探针(6μM)0.3μL、ddH2O5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL；反应程序均为39℃，30s，40个循环。
根据荧光RAA扩增曲线分析待测样本是否为或含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，若待测样本出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测样本阳性(待测样本为或含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)；若待测样本未出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测样本阴性(待测样本不为或不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)。
3、基于RAA技术检测待测样本是否为或含有mecA阳性mecC阴性(即携带mecA基因未携带mecC基因)、mecC阳性mecA阴性(即携带mecC基因未携带mecA基因)还是mecA与mecC双阳性(即同时携带mecA与mecC基因)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
以待测样本的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行双重荧光RAA扩增或分别进行单一荧光RAA扩增，双重荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A 14.7μL、上游引物mecAF1(5μM)1μL、下游引物mecAR3(5μM)1μL、上游引物mecCF1(5μM)1μL、下游引物mecCR2(5μM)1μL、mecA-探针(5μM)0.3μL、mecC-探针(6μM)0.3μL、ddH2O 3.45μL、buffer B 1.25μL和模板1μL；单一荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A 14.7μL、上游引物mecAF1(5μM)1μL、下游引物mecAR3(5μM)1μL、mecA-探针(5μM)0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL，或buffer A 14.7μL、上游引物mecCF1(5μM)1μL、下游引物mecCR2(5μM)1μL、mecC-探针(6μM)0.3μL、ddH2O5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL；反应程序均为39℃，30s，40个循环。
根据荧光RAA扩增曲线的荧光信号分析待测样本是否为或含有mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：当出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测样本为或含有mecA阳性mecC阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，即mecA+mecC—型MRSA；当出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测样本为或含有mecC阳性mecA阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，即mecA—mecC+型MRSA；当同时出现荧光信号为mecA-探针和mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测样本为或含有mecA和mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，即mecA+mecC+型MRSA。
4、基于荧光RAA技术检测待测样本是否为或含有mecA阳性(即携带mecA基因)或mecC阳性(即携带mecC基因)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
以待测样本的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A或用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行单一荧光RAA扩增，单一荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A 14.7μL、上游引物mecAF1(5μM)1μL、下游引物mecAR3(5μM)1μL、mecA-探针(5μM)0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL，或buffer A 14.7μL、上游引物mecCF1(5μM)1μL、下游引物mecCR2(5μM)1μL、mecC-探针(6μM)0.3μL、ddH2O5.75μL、bufferB 1.25μL和模板1μL；反应程序为39℃，30s，40个循环。
根据荧光RAA扩增曲线所利用的引物探针组合分析待测样本是否为或含有mecA阳性的或mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：
如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本为或含有mecA阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本不为或不含有mecA阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本为或含有mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌且是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本不为或不含有mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
5、基于荧光RAA技术区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性(即携带mecA基因未携带mecC基因)、mecC阳性mecA阴性(即携带mecC基因未携带mecA基因)还是mecA与mecC双阳性(即同时携带mecA与mecC基因)的方法，包括如下步骤：
以待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行双重荧光RAA扩增或分别进行单一荧光RAA扩增，双重荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A 14.7μL、上游引物mecAF1(5μM)1μL、下游引物mecAR3(5μM)1μL、上游引物mecCF1(5μM)1μL、下游引物mecCR2(5μM)1μL、mecA-探针(5μM)0.3μL、mecC-探针(6μM)0.3μL、ddH2O 3.45μL、buffer B 1.25μL和模板1μL；单一荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A 14.7μL、上游引物mecAF1(5μM)1μL、下游引物mecAR3(5μM)1μL、mecA-探针(5μM)0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL，或buffer A 14.7μL、上游引物mecCF1(5μM)1μL、下游引物mecCR2(5μM)1μL、mecC-探针(6μM)0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL；反应程序为39℃，30s，40个循环。
根据荧光RAA扩增曲线的荧光信号区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，当出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性；当出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecC阳性mecA阴性；当同时出现荧光信号为mecA-探针和mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA和mecC双阳性。
6、基于荧光RAA技术区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性(即携带mecA基因)还是mecA阴性(即未携带mecA基因)或mecC阳性(即携带mecC基因)还是mecC阴性(即未携带mecC基因)的方法，包括如下步骤：
以待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A或用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行单一荧光RAA扩增，单一荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A 14.7μL、上游引物mecAF1(5μM)1μL、下游引物mecAR3(5μM)1μL、mecA-探针(5μM)0.3μL、ddH2O5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL，或buffer A14.7μL、上游引物mecCF1(5μM)1μL、下游引物mecCR2(5μM)1μL、mecC-探针(6μM)0.3μL、ddH2O5.75μL、buffer B 1.25μL和模板1μL；反应程序为39℃，30s，40个循环。
根据荧光RAA扩增曲线所利用的引物探针组合区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性还是mecA阴性或mecC阳性还是mecC阴性：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阴性；如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecC阳性，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecC阴性。
实施例3基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法的灵敏度和特异性试验
1、单一荧光RAA检测mecA基因或mecC基因的灵敏度试验
将阳性重组质粒puc57-mecA与puc57-mecC为标准阳性质粒，根据文献(MankertzA,Hillenbrand B.Replication of porcine circovirus type 1 requires twoproteins encoded by the viral rep gene[J].Virology,2001,279(2):429-38.)介绍的质粒拷贝数公式，计算出每微升标准阳性质粒中所含的拷贝数，分别做10倍的倍比稀释(阳性重组质粒puc57-mecA稀释后的浓度为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10copies/μL，阳性重组质粒puc57-mecC稀释后的浓度为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、5×10、2×10、1×10copies/μL)。以ddH2O为阴性对照(即negative)。采用如下RAA反应体系：buffer A 14.7μL、上下游引物(浓度均为5μM的mecAF1和mecAR3)各1μL、mecA-探针(浓度为5μM)0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL、模板1μL，或buffer A 14.7μL、上下游引物(浓度均为5μM的mecCF1和mecCR2)各1μL、mecC-探针(浓度为6μM)0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL、模板1μL分别以阳性重组质粒puc57-mecA或puc57-mecC为模板按照反应程序：39℃，30s，40个循环进行荧光RAA扩增检测mecA基因或mecC基因，通过荧光RAA扩增曲线来确定能检测阳性重组质粒的最低拷贝数，以评估检测方法的灵敏性。
结果如图4所示，结果显示：不同拷贝数的阳性重组质粒进行荧光RAA扩增在20min内均可完成，荧光RAA扩增曲线的起峰的时间随着拷贝数的降低逐渐延长，峰值高度也随着拷贝数的降低而降低，阴性对照未见明显荧光RAA扩增曲线，该检测方法可检出的puc57-mecA最低浓度为10copies/μL(图4中a)，puc57-mecC最低浓度为20copies/μL(图4中b)。
2、单一荧光RAA检测mecA基因或mecC基因的特异性试验
将甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mecA阳性)(ATCC43300)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、无乳链球菌(ATCC13813)、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌(ATCC25922)复苏培养，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，分别采用如下RAA反应体系：buffer A 14.7μL、上下游引物(浓度均为5μM的mecAF1和mecAR3)各1μL、mecA-探针(浓度为5μM)0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL、模板1μL，或buffer A14.7μL、上下游引物(浓度均为5μM的mecCF1和mecCR2)各1μL、mecC-探针(浓度为6μM)0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL、模板1μL分别以上述DNA、阳性重组质粒puc57-mecA和阳性重组质粒puc57-mecC为模板(以ddH2O为阴性对照，即negative)按照如下反应程序：39℃，30s，40个循环，进行荧光RAA扩增检测mecA基因或mecC基因，以评估检测方法的特异性。
结果如图5所示，结果显示：当检测mecA基因时，只有阳性重组质粒puc57-mecA和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC43300)的DNA出现了荧光RAA扩增曲线，表现为阳性，其余均为阴性(图5中a)；当检测mecC基因时，只有阳性重组质粒puc57-mecC出现了荧光RAA扩增曲线，表现为阳性，甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC43300)和其他菌均为阴性(图5中b)，说明该检测方法中设计的引物对和探针都有良好的特异性。
3、双重荧光RAA检测mecA基因和mecC基因的灵敏度试验
双重荧光RAA扩增的RAA反应体系为25μL，由如下组分组成：buffer A 14.7μL、上下游引物(浓度均为5μM的mecAF1、mecAR3、mecCF1、mecCR2各1μL)共4μL、探针(浓度为5μM的mecA-探针和浓度为6μM的mecC-探针各0.3μL)共0.6μL、buffer B 1.25μL、模板(阳性重组质粒puc57-mecA与puc57-mecC；以ddH2O为阴性对照，即negative)各1μL，用ddH2O补齐。阳性重组质粒puc57-mecA与puc57-mecC分别稀释至1×105、1×104、1×103、1×102、2×10copies/μL。反应体系中各组分混合后上下颠倒混匀立即放入实时荧光PCR仪，反应程序为39℃，30s，40个循环进行双重荧光RAA扩增检测mecA基因和mecC基因，通过荧光RAA扩增曲线来确定能检测阳性重组质粒的最低拷贝数，以评估检测方法的灵敏性。
结果如图6所示，结果显示：和单一荧光RAA检测mecA基因或mecC基因的灵敏度试验相比，双重荧光RAA检测mecA和mecC基因的灵敏度基本不变，mecA和mecC基因的最低检测限度均可达到20copies/μL。
实施例4检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的不同方法的比较试验
将46株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离株样品划线复苏，挑取单菌落于灭菌的TSB肉汤中，置于恒温摇床，37℃摇菌过夜，取200μL菌液于离心管中，12000r/min离心2min后弃去上清，向离心管内加入1mlμL去离子水，混合均匀，煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清(即得到含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因组DNA的溶液)保存于-20℃作为模板备用。
1、荧光RAA检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因
分别以46株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因组DNA、阳性重组质粒puc57-mecA作为模板，以ddH2O为阴性对照(即negative)，利用用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因的引物探针组合采用实施例1优化的RAA反应体系(即bufferA14.7μL、上下游引物(浓度均为5μM的mecAF1和mecAR3)各1μL、mecA-探针(浓度为5μM)0.3μL、ddH2O 5.75μL、buffer B 1.25μL、模板1μL)分别按照实施例1的反应程序(即39℃，30s，40个循环)进行荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线分析待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性还是mecA阴性(即携带mecA还是未携带mecA基因)：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，若出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为mecA阳性(待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为携带mecA基因的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)；待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌未出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为mecA阴性(待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为未携带mecA基因的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)。
结果如图7所示，结果显示：有35株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为阳性，11株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为弱阳性。
2、双重荧光RAA检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
分别以46株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因组DNA、阳性重组质粒puc57-mecA和阳性重组质粒puc57-mecC作为模板，以ddH2O为阴性对照(即negative)，利用用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因的引物探针组合和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecC基因的引物探针组合采用RAA反应体系(即buffer A 14.7μL、上下游引物(浓度均为5μM的mecAF1、mecAR3、mecCF1、mecCR2各1μL)共4μL、探针(浓度为5μM的mecA-探针和浓度为6μM的mecC-探针各0.3μL)共0.6μL、bufferB1.25μL、模板1μL)分别按照反应程序(即39℃，30s，40个循环)进行荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线分析待测样本是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，若待测样本出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测样本阳性(待测样本为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)；待测样本未出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测样本阴性(待测样本不为耐氧西林金黄色葡萄球菌，即为甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌)；进一步根据荧光RAA扩增曲线的荧光信号分析待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，当出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团(FAM)的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团(CY5)的荧光RAA扩增曲线，说明耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性的；当出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团(CY5)的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团(FAM)的荧光RAA扩增曲线，说明耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecC阳性mecA阴性；当同时出现荧光信号为mecA-探针和mecC-探针的荧光报告基团(FAM和CY5)的荧光RAA扩增曲线，说明耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA和mecC双阳性。
结果如图8所示，结果显示：46株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均出现了荧光信号为FAM的荧光RAA扩增曲线，没有荧光信号为CY5的荧光RAA扩增曲线，因此，46株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均为mecA阳性mecC阴性，这与单一荧光RAA检测结果一致。该结果也与中国目前尚未有mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌报道的现状相符。
3、taqman探针法qPCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因
使用taqman探针法qPCR方法分别对46株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的DNA、阳性重组质粒puc57-mecA(以ddH2O为阴性对照，即negative)进行real-time qPCR检测，引物和探针序列如表2所示，反应体系为20μL(表3)，反应程序为(95℃，30s)+{(95℃，10s)+(58℃，20s)}×40。
表2 taqman探针法qPCR的引物和探针序列
表3 taqman探针法qPCR的反应体系
结果如图9所示，结果显示：经taqman-探针法qPCR检测，35株为阳性，11株为弱阳性(30＝<Ct＝<35)，结果与荧光RAA检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因结果一致。
通过Graphpad Prism7.0软件对taqman-探针法qPCR的扩增循环数(CycleThreshold，Ct)和荧光RAA的阈值时间(ThresholdTime，TT)进行线性分析，显示二者存在显著关系，R2＝0.8682,P<0.0001(图10)，说明荧光RAA与taqman-探针法qPCR在检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性和灵敏度基本一致。
4、双重荧光RAA检测待测金黄色葡萄球菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，并区分待测金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
将甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mecA阳性)(ATCC43300)、12株金黄色葡萄球菌临床分离株(sample1-12，经taqman-探针法qPCR验证sample1、3、4、6为mecA阳性mecC阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，sample2、5、7、8、9、10、11、12为甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌)复苏培养，用水煮法获取细菌基因组DNA，分别以上述DNA、阳性重组质粒puc57-mecA和阳性重组质粒puc57-mecC为模板，以ddH2O为阴性对照(即negative)，利用用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行双重荧光RAA扩增，双重荧光RAA扩增的RAA反应体系为：buffer A14.7μL、上游引物mecAF1(5μM)1μL、下游引物mecAR3(5μM)1μL、上游引物mecCF1(5μM)1μL、下游引物mecCR2(5μM)1μL、mecA-探针(5μM)0.3μL、mecC-探针(6μM)0.3μL、ddH2O3.45μL、bufferB1.25μL和模板1μL；反应体系中各组分混合后上下颠倒混匀立即放入实时荧光PCR仪，反应程序为39℃，30s，40个循环进行双重荧光RAA扩增。
根据荧光RAA扩增曲线检测待测金黄色葡萄球菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，若待测金黄色葡萄球菌出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；若待测金黄色葡萄球菌未出现荧光RAA扩增曲线，则说明不为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
进一步，根据荧光RAA扩增曲线的荧光信号分析待测金黄色葡萄球菌为mecA阳性mecC阴性(即携带mecA基因未携带mecC基因)、mecC阳性mecA阴性(即携带mecC基因未携带mecA基因)还是mecA与mecC双阳性(即同时携带mecA与mecC基因)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：当出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测金黄色葡萄球菌为mecA阳性mecC阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；当出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测金黄色葡萄球菌为mecC阳性mecA阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；当同时出现荧光信号为mecA-探针和mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测金黄色葡萄球菌为mecA和mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
结果显示：阳性重组质粒puc57-mecA和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC43300)以及sample1、3、4、6的DNA出现了荧光信号为FAM的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为CY5的荧光RAA扩增曲线，说明sample1、3、4、6为mecA阳性mecC阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；阳性重组质粒puc57-mecC出现了荧光信号为CY5的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为FAM的荧光RAA扩增曲线，而甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌(ATCC29213)以及sample2、5、7、8、9、10、11、12既未出现荧光信号为FAM的荧光RAA扩增曲线也未出现荧光信号为CY5的荧光RAA扩增曲线，说明sample2、5、7、8、9、10、11、12不为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(即为甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌)，与实际情况相符合。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国兽医药品监察所
<120> 基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物探针组合、试剂盒
和方法
<130> JLP21I1559
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccctcaaaca ggtgaattat tagcacttgt aagca 35
Claims (10)
1.一种基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和/或用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B；
其中，所述引物探针组合A由序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物mecAF1和SEQ IDNO.6所示的下游引物mecAR3组成的引物对和序列如SEQ ID NO.13所示的mecA-探针组成，所述引物探针组合B由序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物mecCF1和SEQ ID NO.11所示的下游引物mecCR2组成的引物对和序列如SEQ ID NO.14所示的mecC-探针组成；
所述mecA-探针的5′端第31位T碱基上修饰荧光报告基团，5′端第33位T碱基上修饰荧光淬灭基团，荧光报告基团与荧光淬灭基团之间间隔1个碱基C，由四氢呋喃残基替换，3′端进行C3 spacer阻断修饰；
所述mecC-探针的5′端第31位T碱基上修饰荧光报告基团，5′端第35位T碱基上修饰荧光淬灭基团，荧光报告基团与荧光淬灭基团之间间隔3个碱基ACA，C由四氢呋喃残基替换，3′端进行C3 spacer阻断修饰；
所述mecA-探针或mecC-探针的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、VIC、ROX、CY3或CY5，所述mecA-探针或mecC-探针的荧光淬灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述mecA-探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1，所述mecC-探针的荧光报告基团为CY5，荧光淬灭基团为BHQ3。
3.一种基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组合。
4.权利要求1或2所述的引物探针组合或权利要求3所述的试剂盒在如下任一种中的应用：
1)在非诊断目的检测待测样本是否为或含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用；
2)在制备检测待测样本是否为或含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的产品中的应用；
3)在非诊断目的检测待测样本是否为或含有mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用；
4)在制备检测待测样本是否为或含有mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的产品中的应用；
5)在非诊断目的检测待测样本是否为或含有mecA阳性或mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用；
6)在制备检测待测样本是否为或含有mecA阳性或mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的产品中的应用；
7)在非诊断目的区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性中应用；
8)在制备区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的产品中应用；
9)在非诊断目的区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性还是mecA阴性或mecC阳性还是mecC阴性中的应用；
10)在制备区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性还是mecA阴性或mecC阳性还是mecC阴性的产品中的应用；
所述待测样本为待测金黄色葡萄球菌。
5.一种非诊断目的基于荧光RAA技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测样本的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用权利要求1或2所述的引物探针组合或权利要求3所述的试剂盒中用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行双重荧光RAA扩增或分别进行单一荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线分析待测样本是否为或含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，若待测样本出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测样本为或含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；若待测样本未出现荧光RAA扩增曲线，则说明待测样本不为或不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
6.一种非诊断目的基于RAA技术检测待测样本是否为或含有mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测样本的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用权利要求1或2所述的引物探针组合或权利要求3所述的试剂盒中用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行双重荧光RAA扩增或分别进行单一荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线的荧光信号分析待测样本是否为或含有mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：当出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测样本为或含有mecA阳性mecC阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；当出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测样本为或含有mecC阳性mecA阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；当同时出现荧光信号为mecA-探针和mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测样本为或含有mecA和mecC双阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
7.一种非诊断目的基于荧光RAA技术检测待测样本是否为或含有mecA阳性或mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测样本的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用权利要求1或2所述引物探针组合或权利要求3所述的试剂盒中用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A或用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行单一荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线所利用的引物探针组合分析待测样本是否为或含有mecA阳性的或mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：
如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本为或含有mecA阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本不为或不含有mecA阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本为或含有mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测样本不为或不含有mecC阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
8.一种非诊断目的基于荧光RAA技术区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用权利要求1或2所述的引物探针组合或权利要求3所述的试剂盒中用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行双重荧光RAA扩增或分别进行单一荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线的荧光信号区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性、mecC阳性mecA阴性还是mecA与mecC双阳性：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，当出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性mecC阴性；当出现荧光信号为mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，而未出现荧光信号为mecA-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecC阳性mecA阴性；当同时出现荧光信号为mecA-探针和mecC-探针的荧光报告基团的荧光RAA扩增曲线，说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA和mecC双阳性。
9.一种非诊断目的基于荧光RAA技术区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性还是mecA阴性或mecC阳性还是mecC阴性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用权利要求1或2所述的引物探针组合或权利要求3所述的试剂盒中用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A或用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B进行单一荧光RAA扩增，根据荧光RAA扩增曲线所利用的引物探针组合区分待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性还是mecA阴性或mecC阳性还是mecC阴性：阴性对照未出现荧光RAA扩增曲线的前提下，如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA的引物探针组合A，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阳性，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecA阴性；如果利用的是用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因mecC的引物探针组合B，当出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecC阳性，未出现荧光RAA扩增曲线说明待测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是mecC阴性。
10.根据权利要求5-9任一所述的方法，其特征在于，所述双重荧光RAA扩增的RAA反应体系中上游引物mecAF1、下游引物mecAR3、上游引物mecCF1、下游引物mecCR2的终浓度均为0.2μM；所述mecA-探针的终浓度为0.06μM，mecC-探针的终浓度为0.072μM；
所述单一荧光RAA扩增的RAA反应体系中上游引物mecAF1、下游引物mecAR3的终浓度均为0.2μM、mecA-探针的终浓度为0.06μM，或上游引物mecCF1、下游引物mecCR2的终浓度均为0.2μM、mecC-探针的终浓度为0.072μM；
所述待测样本为待测金黄色葡萄球菌。
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| GR01 | Patent grant | ||
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