CN113322337A - 一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物及其试剂盒 - Google Patents

一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物及其试剂盒。该试剂盒是以金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌基因组中的保守序列，及耐甲氧西林基因的保守序列为基础，设计的反应体系在革兰氏阳性菌的尺度上，实现快速、同步、判定、检测多种葡萄球菌，包括金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌以及耐甲氧西林基因。适用环境便捷，可用于快速检测拭子或痰液样本中的多种葡萄球菌，并且判定其是否携带耐甲氧西林基因。检测结果可用于辅助诊断由葡萄球菌造成的感染，并且对临床用药提供指导。成本低、准确度高、靶基因保守度高、检测覆盖度高。

Description

一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物及其试 剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物及其试剂盒。
背景技术
葡萄球菌属(genius)包含超过四十种(species)革兰氏阳性菌，其中有若干种具有致病性。其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是最常见的导致人类化脓性感染的病原菌。
金黄色葡萄球菌可引起局部化脓性感染，如疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)是引起医院获得性和社区相关性感染的重要病原菌。
自1961年首次发现MRSA以来，其在金黄色葡萄球菌中分离率不断上升，据2009年中国CHINET细菌耐药性监测报告，我国10省市14所教学医院临床分离出的4114株金黄色葡萄球菌中MRSA比率高达52.7％(2010年的情况类似，4452株金黄色葡萄球菌中MRSA的比率为51.7％)。多数医院获得性金黄色葡萄球菌肺炎(HA-MRSA)对甲氧西林和所有β-内酰胺类耐药，且常为多重耐药，可选择药物十分有限。而社区获得性金黄色葡萄球菌肺炎(CA-MRSA)通常仅对β-内酰胺类耐药，对非β-内酰胺类抗生素敏感。试验鉴别甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(Methicillin-Sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)与MRSA，这一点非常重要，因为抗生素的选择可以决定临床治疗是否有效。
目前国内对于金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸检测方法有实时荧光PCR法、乳胶凝集法、细菌培养法、胶体金法。其中胶体金法是对病毒的蛋白质进行检测；热裂解将MRSA中的PBP-2a提取出来，加入PBP-2a特异性单克隆抗体致敏的乳胶颗粒溶液，出现肉眼可见的特异性凝集现象，然而其后期细菌培养法检测周期较长。相比较而言，荧光PCR是针对遗传物质DNA/RNA进行检测的手段，从准确度上来说，荧光PCR探针法准确度更高。目前国内大多数耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸检测试剂盒，仅针对抗性Mec基因进行检测，缺乏对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌本身的核酸序列检测。
除金黄色葡萄球菌以外，葡萄球菌属中仍然有其他潜在的致病菌，如：表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)。以上两种细菌都属于人体正常的共生菌落，一般情况下不会致病。但是在手术后，或者患者接受外科植入物之后，这些细菌可能侵入机体造成感染，并引起发炎症状。同时，它们也有可能获得抗生素抗性，从而使常规的临床诊疗手段变得低效。
现有的文件中公开了一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA核酸的试剂盒，该技术方案是为了解决在利用双重检测技术的基础上，实现对金黄色葡萄球菌SA基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA的检测的目的，该公开文件仅实现了对单一的金黄色葡萄球菌的某一具体基因进行检测，缺乏关于葡萄球菌的其他菌属的检测；以及对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA进行检测，缺乏对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌本身的核酸序列检测。
现有文件也公开了一种检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒，该试剂盒是为了解决在金黄色葡萄球菌耐药基因的尺度上进行了设计。
上述的检测试剂盒均并未有关于对革兰氏阳性菌菌属的判定，以及革兰氏阳性菌菌属尺度上的对于葡萄球菌系列的菌属的判定。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物及其试剂盒。
本发明所采用的技术方案为：一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物，包括针对葡萄球菌属Tuf基因的第一引物组和第一探针、第二引物组和第二探针，以及针对耐药基因的第三引物组和第三探针；
所述葡萄球菌属Tuf基因的第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物、第一下游引物和第一探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示；
所述葡萄球菌属Tuf基因的第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物、第二下游引物和第二探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示；
所述耐药基因的第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，第三上游引物、第三下游引物和第三探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
所述第一探针的5′端、所述第二探针的5′端以及第三探针的5′端均标记有荧光基团，所述第一探针的3′端、所述第二探针的3′端以及第三探针的3′端均标记有淬灭基团。
作为优选地，所述耐药基因为耐甲氧西林mecA基因。
作为优选地，所述荧光基团包括但不限于FAM、Cy5、ROX、VIC和NED中的任意一种。
作为优选地，所述淬灭基团包括但不限于QSY、MGB和BHQ1中的任意一种。
作为优选地，所述葡萄球菌属包括金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌和屎肠球菌。
一种用于检测葡萄球菌属耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括检测液、DNA聚合酶、dNTPs、qPCR缓冲液、ROX参比荧光染料、空白对照品和阳性对照品。
作为优选地，所述检测液包括权利要求1中的第一引物组和第一探针、第二引物组和第二探针、第三引物组和第三探针。
作为优选地，所述空白对照品为ddH2O。
作为优选地，所述阳性对照品为细菌基因组DNA样本序列。
作为优选地，所述试剂盒在辅助检测区分革兰氏阳性菌属、种及其耐药性中的非诊断目的的应用。
本发明的有益效果为：
(一)本发明提供了一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物及其试剂盒，该试剂盒是以金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌基因组中的保守序列，及耐甲氧西林基因的保守序列为基础，技术方案设计的反应体系瞄准于在革兰氏阳性菌的尺度上，实现快速、同步、判定、检测多种葡萄球菌，包括金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌以及耐甲氧西林基因的荧光定量PCR试剂盒。
(二)该试剂盒适用于辅助判定检测样本中是否含有金黄色葡萄球菌属种、是否为耐药金黄色葡萄球菌属种、是否为球菌属及是否为耐药球菌，非球菌但属于革兰氏阳性菌属种及其是否为耐药革兰氏阳性菌。
(三)适用环境便捷，可用于快速检测拭子或痰液样本中的多种葡萄球菌，并且判定其是否携带耐甲氧西林基因。检测结果可用于辅助诊断由葡萄球菌造成的感染，并且对临床用药提供指导。相比其他单一检测体系，本申请的方案给出的反应体系节约了时间和试剂成本，且实验结果判读简单、方便，无需对操作人员进行额外的培训。
(四)可以一次性完成多种葡萄球菌的鉴定，并且给出明确的耐甲氧西林基因检测结果。具有成本低、准确度高的特点。所选取的靶基因保守度高，能够覆盖金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌的保守序列。
附图说明
图1是当使用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA为模板，log对数曲线实验结果示意图；
图2是当使用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA为模板，Linear线性扩增曲线实验结果示意图；
图3是当使用普通金黄色葡萄球菌DNA为模板，log对数曲线实验结果示意图；
图4是当使用普通金黄色葡萄球菌DNA为模板，Linear线性扩增曲线实验结果示意图；
图5是当使用表皮葡萄球菌DNA为模板，log对数曲线实验结果示意图；
图6是当使用表皮葡萄球菌DNA为模板，Linear线性扩增曲线实验结果示意图；
图7是当使用木糖葡萄球菌DNA为模板，log对数曲线实验结果示意图；
图8是当使用木糖葡萄球菌DNA为模板，Linear线性扩增曲线实验结果示意图；
图9是当使用屎肠球菌DNA为模板，log对数曲线实验结果示意图；
图10是当使用屎肠球菌DNA为模板，Linear线性扩增曲线实验结果示意图。
图中：F-FAM探针信号通道；V-VIC探针信号通道；N-NED探针信号通道。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例：
该试剂盒包含针对多种葡萄球菌Tuf基因的探针/引物组、适用于高GC序列的DNA聚合酶、特定比例的dNTPs、适用于定量分析的qPCR缓冲液、ROX参比荧光染料、空白对照和阳性对照品。
检测位点及其序列陈列表1：
Figure BDA0003146391980000061
PCR体系：
荧光PCR反应体系配制，其中PCR反应缓冲液来自南京诺唯赞，引物由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成，探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。如表2所示：
表2荧光PCR反应体系配制
Figure BDA0003146391980000071
荧光定量PCR反应程序(适应于ABI 7500和StepOne系列)，如图3所示：
表3荧光PCR反应程序
Figure BDA0003146391980000072
Figure BDA0003146391980000081
实验结果总结：
实验材料准备：为了验证本发明的有效性，特购买各类细菌培养，其信息如表4所示：
表4各类细菌培养信息表
菌种中文名称 菌种拉丁文名称 编号
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC 26003
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA ATCC 43300
木糖葡萄球菌 Staphylococcus xylosus ATCC 29971
表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermidis ATCC 29887
头状葡萄球菌 Staphylococcus capitis ATCC 35661
屎肠球菌 Enterococcus faecium ATCC 19434
DNA提取：
建议可通过使用Qiagen的QIAamp DNA Mini kit核酸提取试剂盒，搭配天根的溶菌酶裂解革兰氏阳性菌获得所需样本。提取后将DNA稀释至5ng/uL备用。
1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光PCR实验结果：
按照表2中的PCR体系配制反应体系，并且按照表3中的反应程序进行反应，当使用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA为模板，且阈值线设置为0.1时，阈值线0.02以下为背景信号，不具备参考意义。
结果数据如下表5所示：
PCR孔 样本信息 靶标基因 荧光基团 Ct值
A1 ATCC 43300 Tuf FAM 29.80
A1 ATCC 43300 MecA NED 37.82
A1 ATCC 43300 Tuf VIC 31.50
A2 ATCC 43300 Tuf FAM 30.18
A2 ATCC 43300 MecA NED 36.21
A2 ATCC 43300 Tuf VIC 31.95
实验数据、结合如图1所示的log对数曲线实验结果、如图2所示的Linear线性扩增曲线实验结果表明，A1和A2两孔中，FAM，VIC，NED三个探针信号通道均有信号，且Ct值较为均一。
2、普通金黄色葡萄球菌荧光PCR实验结果
按照表2中的体系配制反应体系，并且按照表3中的反应程序进行反应，当使用普通金黄色葡萄球菌DNA为模板(25ng/uL)，且阈值线设置为0.1时，且阈值线设置为0.1时，阈值线0.02以下为背景信号，不具备参考意义。
结果数据如下表6所示：
Figure BDA0003146391980000091
Figure BDA0003146391980000101
实验数据、结合如图3所示的log对数曲线实验结果、如图4所示的Linear线性扩增曲线实验结果表明，A3和A4两孔中，FAM和VIC两个探针信号通道均有信号，且Ct值较为均一。NED通道无信号。
3、其他葡萄球菌荧光PCR实验结果：
按照表2中的体系配制反应体系，并且按照表3中的反应程序进行反应，①当使用表皮葡萄球菌DNA为模板(5ng/uL)，且阈值线设置为0.1时，阈值线0.1以下为背景信号，不具备参考意义。
结果数据如表下7所示：
Figure BDA0003146391980000102
实验数据、结合如图5所示的log对数曲线实验结果、如图6所示的Linear线性扩增曲线实验结果表明，B1和B2两孔中，仅有VIC探针信号通道有信号，且Ct值较为均一。FAM和NED探针信号通道无信号。
②当使用木糖葡萄球菌DNA为模板(25ng/uL)，且阈值线设置为0.1时，阈值线0.1以下为背景信号，不具备参考意义。
结果数据如下表8所示：
Figure BDA0003146391980000111
实验数据、结合如图7所示的log对数曲线实验结果、如图8所示的Linear线性扩增曲线实验结果表明，B3和B4两孔中，仅有VIC探针信号通道有信号，因为模板浓度较高，所以Ct值较低。FAM和NED探针信号通道无信号。
4、非葡萄球菌的革兰氏阳性菌荧光PCR实验结果：
当使用屎肠球菌DNA为模板(25ng/uL)，且阈值线设置为0.1时，阈值线0.1以下为背景信号，不具备参考意义。
结果如图9所示的log对数曲线实验结果、如图10所示的Linear线性扩增曲线实验结果表明：FAM，NED和VIC三个探针信号通道均无信号。
以上所有实验中，阈值线均为0.1，因此部分附图中未标记的线条均在阈值线之下，不具有参考意义。
综上所述，本发明可以在一管PCR体系内实现耐药性金黄色葡萄球菌的鉴定，并且检测出其他可感染人体的葡萄球菌，如木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌等葡萄球菌。并且可以给对耐甲氧西林的抗性给出明确的提示。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京华诺奥美医学检验实验室有限公司
<120> 一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物及其试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Tuf基因 第一上游引物核苷酸序列
<400> 1
caatgccaca aactcg 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Tuf基因 第一下游引物核苷酸序列
<400> 2
gcttcagcgt agtcta 16
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> Tuf基因第一探针核苷酸序列， 5'端标记荧光基团FAM，3'标记淬灭基团MGB
<400> 3
aattaatgga agctgtagat ac 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> Tuf基因 第二上游引物核苷酸序列
<400> 4
ctttagaagg cgatgctcaa tacg 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Tuf基因 第二下游引物核苷酸序列
<400> 5
acacggcctg tagcaacagt acc 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> Tuf基因 第二探针核苷酸序列， 5'端标记荧光基团VIC，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 6
cagtgattga gaatacgtcc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> mec A 第三上游引物核苷酸序列
<400> 7
cattgatcgc aacgttcaat tt 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> mec A 第三下游引物核苷酸序列
<400> 8
tggtctttct gcattcctgg a 21
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> mec A 第三探针核苷酸序列，5'端标记荧光基团NED，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 9
tggaagttag attgggatca tagcgtcat 29

Claims (10)

1.一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物，其特征在于，包括针对葡萄球菌属Tuf基因的第一引物组和第一探针、第二引物组和第二探针，以及针对耐药基因的第三引物组和第三探针；
所述葡萄球菌属Tuf基因的第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物、第一下游引物和第一探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示；
所述葡萄球菌属Tuf基因的第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物、第二下游引物和第二探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示；
所述耐药基因的第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，第三上游引物、第三下游引物和第三探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
所述第一探针的5′端、所述第二探针的5′端以及第三探针的5′端均标记有荧光基团，所述第一探针的3′端、所述第二探针的3′端以及第三探针的3′端均标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物，其特征在于，所述耐药基因为耐甲氧西林mecA基因。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、Cy5、ROX、VIC和NED中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物，其特征在于，所述淬灭基团包括QSY、MGB和BHQ1中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物，其特征在于，所述葡萄球菌属包括金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌和屎肠球菌。
6.一种用于检测葡萄球菌属耐药性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测液、DNA聚合酶、dNTPs、qPCR缓冲液、ROX参比荧光染料、空白对照品和阳性对照品。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测葡萄球菌属耐药性的试剂盒，其特征在于，所述检测液包括权利要求1中的第一引物组和第一探针、第二引物组和第二探针、第三引物组和第三探针。
8.根据权利要求6所述的一种用于检测葡萄球菌属耐药性的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为RNase-free ddH2O。
9.根据权利要求6所述的一种用于检测葡萄球菌属耐药性的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为细菌基因组DNA样本。
10.根据权利要求6所述的一种用于检测葡萄球菌属耐药性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在辅助检测区分革兰氏阳性菌属、种及其耐药性中的非诊断目的的应用。
CN202110751367.7A 2021-07-02 2021-07-02 一种用于检测葡萄球菌属耐药性的引物和探针组合物及其试剂盒 Pending CN113322337A (zh)

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