JP2000093181A - オリゴヌクレオチド及びこれをプライマーとして用いたサルモネラ属細菌の検出方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチド及びこれをプライマーとして用いたサルモネラ属細菌の検出方法Info
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Abstract
に、雑菌としてシトロバクターが存在してもサルモネラ
属細菌を良好に検出できるようにする。 【解決手段】 サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコード
するヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配
列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオ
チドであって、配列番号1又は2に示される塩基配列 (5´)TTGTGTATAAGTACC(3´) (配列番号1) (5´)ATAAGTACCCGTTT(3´) (配列番号2) を含むオリゴヌクレオチドを、PCR法を用いてサルモ
ネラ属細菌を検出するときのプライマーとして使用す
る。
Description
の検出方法に関する。さらに詳しくは、特定の塩基配列
を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてポ
リメラーゼ連鎖反応法(Polymerase Chain Reaction、
以下PCR法と省略する)を行い、増幅されたプライマ
ーの伸長物を検出することによりサルモネラ属細菌を検
出する方法に関する。
一つであり、中でも、腸炎菌(Salmonella enteritidi
s)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)等の血清
型のものは食中毒を引き起こす細菌として知られてい
る。
めには、検査材料が患者の吐瀉物、糞便、又は食品等の
抜き取り材料ある場合、一般に、増菌培養、分離培養を
経て各種確認試験が行なわれている。この方法でサルモ
ネラ属細菌による汚染を確認するまでには通常4日が必
要であり、次いで当該汚染が、サルモネラ属細菌のどの
血清型によるものであるかを特定するには、さらに時間
が必要となっている。また、分離培養や確認試験におい
ては、培地の微妙な色調変化を調べる必要もある。この
ため、サルモネラ属細菌による汚染の確認試験の操作
は、煩雑で熟練を要するものとなっている。
ルモネラ属細菌の検出方法として、オリゴヌクレオチド
を用いたDNAプローブ法あるいはハイブリダイゼーシ
ョン法が試みられている。しかしながら、これらの方法
では充分な検出感度と再現性を得ることが困難である。
プライマーとして、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコ
ードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチ
ド配列と相補的となるように化学合成した2種のオリゴ
ヌクレオチドを使用することにより、サルモネラ属細菌
の特定領域のオリゴヌクレオチドを増幅し、これを検出
することを試みている(Rapid Detection of Salmonella
e in Poultry with the Magnetic Immuno-Polymerase C
hain Reaction Assay., Appl. Env. Microb.,59, No.5,
1342(1993))。
らのサルモネラ属細菌の検出方法によると、雑菌として
シトロバクター(Citrobacter freundii)が存在する場
合、サルモネラ属細菌の検出感度が落ちるという問題が
ある。なお、このシトロバクターは腸内細菌叢として存
在し、サルモネラ症は引き起こさないが、サルモネラ属
細菌に極めて類縁であり、サルモネラ属細菌との識別が
困難な菌である。
し、PCR法でサルモネラ属細菌を検出するための新規
のプライマーを開発し、雑菌としてシトロバクターが存
在してもサルモネラ属細菌を良好に検出できるようにす
ることを目的とする。
め、本発明は、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコード
するヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配
列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオ
チドであって、配列番号1又は2に示される塩基配列 (5´)TTGTGTATAAGTACC(3´) (配列番号1) (5´)ATAAGTACCCGTTT(3´) (配列番号2) を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供し、
特に、配列番号3、4又は5に示される塩基配列 (5´)TTGAGTTGTGTATAAGTACC(3´) (配列番号3) (5´)TTGTGTATAAGTACCCGTTT(3´) (配列番号4) (5´)ATAAGTACCCGTTTTGATCC(3´) (配列番号5) を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
ードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチ
ド配列と相補的となるように化学合成された2種のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマーであって、その一方
が上述のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする
プライマーを提供する。
え、PCR法によりプライマーの伸長反応と標的とする
ヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列
の検出を行うことを特徴とするサルモネラ属細菌の検出
方法を提供する。
は、PCR法におけるプライマーとして、サルモネラ属
細菌のoriC遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的
とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学
合成された特定の塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用
する。
属細菌の検出のためにPCR法で使用するプライマー
と、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするヌクレ
オチド配列を標的とする点では共通であるが、その相補
鎖側の配列が異なる。即ち、Fluitらのプライマーがシ
トロバクターの配列とほぼ一致する領域を有するのに対
し、本発明のプライマーはシトロバクターの配列とは全
く一致しないものとなっている。したがって、本発明の
プライマーを使用すると、サルモネラ属細菌とシトロバ
クターとの共存下でサルモネラ属細菌が微量に存在する
場合でも、サルモネラ属細菌を検出することが可能とな
る。
行うPCR法は、Saikiが開発したPolymerase Chain Re
action法(Science,230,1350(1985))に基づくものであ
る。
細菌を検出するに際して使用するプライマーとして、特
定の塩基配列を有する本発明のオリゴヌクレオチド、即
ち、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするヌクレ
オチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的
となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、配列番号1又は2に示される塩基配列 (5´)TTGTGTATAAGTACC(3´) (配列番号1) (5´)ATAAGTACCCGTTT(3´) (配列番号2) を含むオリゴヌクレオチドを使用する。
ゴヌクレオチドの配列は、サルモネラ属細菌のoriC遺伝
子の塩基配列とシトロバクターのoriC遺伝子の塩基配列
とを詳細に解析した結果、シトロバクターのoriC遺伝子
の塩基配列と完全に識別される領域を見出すことにより
決定されたものである。これら配列番号1又は2に示さ
れる配列は、サルモネラ属細菌を検出するための公知の
PCR法(Fluitら、Appl. Env. Microb., 59, No.5, 1
342(1993))で使用される、oriC遺伝子を標的とした1
組のプライマー(正規鎖側プライマー及び相補鎖側プラ
イマー)のうち、相補鎖側プライマーの配列が、シトロ
バクターのoriC遺伝子の塩基配列とほぼ一致する領域を
有しているのと明確に区別される。したがって、これら
の配列を有するオリゴヌクレオチドをPCR法のプライ
マーとして使用することにより、シトロバクターの共存
下でも、シトロバクターの非共存下と同様にサルモネラ
属細菌を検出することが可能となる。特に、腸炎菌(Sal
monella enteritidis)、ネズミチフス菌(Salmonella ty
phimurium)等の血清型の菌を高感度で検出することが可
能となる。
列番号1又は2で示される塩基配列を含む限り、その5
´末端側又は3´末端側が延長されていてもよく、連鎖
する塩基数が14〜40のものが好ましい。例えば、好
ましいオリゴヌクレオチドとして、配列番号3、4又は
5に示される塩基配列 (5´)TTGAGTTGTGTATAAGTACC(3´) (配列番号3) (5´)TTGTGTATAAGTACCCGTTT(3´) (配列番号4) (5´)ATAAGTACCCGTTTTGATCC(3´) (配列番号5) を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
とサルモネラ属細菌のoriC遺伝子以外の遺伝子と反応
し、サルモネラ属細菌の検出の選択性が低下するので好
ましくない。また、連鎖する塩基数が多すぎるとサルモ
ネラ属細菌のoriC遺伝子との結合が不安定となりやすい
ので好ましくない。
列番号1又は2で示される塩基配列を含む限り、オリゴ
ヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基につい
て、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の
分子で置換されるなどにより修飾されているものも含ま
れる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドには、サル
モネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするオリゴヌクレオ
チドをPCR法で増幅した後、そのオリゴヌクレオチド
の検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌク
レオチドの3´末端を蛍光色素であるフルオレセインイ
ソチオシアネート(FITC)で標識したものが含まれ
る。この他、3´末端にビオチンを結合し、アビジンと
共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るもの
や、デオキシリボース骨格間を結合しているリン酸の中
の酸素をイオウ原子に置き換えることによりアンチセン
ス化したもの等が含まれる。
でサルモネラ属細菌を検出する場合の1組のプライマー
の一方として使用する場合に、これと組み合わせて使用
するもう一方のプライマーとしては、正規鎖側プライマ
ーとして公知のものを使用することができる。例えば、
FluitらがPCR法でサルモネラ属細菌を検出する場合
に使用した、配列番号6 (5´)TTATTAGGATCGCGCCAGGC(3´) (配列番号6) で示されるオリゴヌクレオチドからなる正規鎖側プライ
マー(Appl. Env. Microb., 59, No.5, 1342(1993))等
を使用することができる。
マーを使用し、サルモネラ属細菌に特異的なオリゴヌク
レオチドを増幅するPCR法自体は公知の方法に従うこ
とができる。即ち、まず、検体を熱処理することにより
検体中の二本鎖DNAを一本鎖に分離し、これに1組の
プライマーを作用させて、相補的な検体のオリゴヌクレ
オチド配列と特異的にハイブリダイズさせ、次に、DN
Aポリメラーゼと4種のデオキシリボヌクレオチド三リ
ン酸(dNTP)との存在下でプライマーの下流の領域
を選択的に合成する。そしてこの操作を20〜40サイ
クル程度繰り返すことにより、検体中の特異的なオリゴ
ヌクレオチドをプライマーの伸長物として増幅すること
ができる。また、この増幅は、電気泳動、クロマトグラ
フィー等により確認することができ、これにより検体中
のサルモネラ属細菌を容易にかつ確実に検出することが
可能となる。
は、患者の吐瀉物、糞便、又は食品等の抜き取り材料等
をあげることができる。
明する。
縦の見出し欄に示したものを用い、それぞれ増菌用の平
板培地に接種し、35℃で一晩培養した。菌体を掻き取
り、0.85%食塩水に懸濁し、沸騰水中で10分間加
熱することによりDNAを抽出し、遠心分離した上澄液
を検体とした。なお、この懸濁液中の菌濃度は107C
FU/ml程度であった。
ド配列を標的とする、相補鎖側プライマーとして、配列
番号3、4又は5の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドをトリエステル法により合成した。また、正規鎖側プ
ライマーとして、配列番号6の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドをトリエステル法により合成した。
ー5μl(宝酒造株式会社製、TaKaRa Taqに
付属のBuffer)、4種類のデオキシリボヌクレオ
チド三リン酸(dNTP)混合液(宝酒造株式会社製、
TaKaRaTaqに付属のdNTP混合液)4μl、
表1に示すように、正規鎖側プライマーとして配列番号
6の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(Appl. Env.
Microb., 59, No.5, 1342(1993)のプライマー1)20
pmol、相補鎖側プライマーとして、配列番号3、4
又は5の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド20pm
ol、DNAポリメラーゼ(宝酒造株式会社製、TaK
aRa Taq)0.25μlを加え、水で50μlと
した。
(50℃、1分)、重合反応(72℃、1分)からなる
過程を1サイクルとし、これを30サイクル繰り返し反
応させた。
か否かを見るために、アガロースゲル電気泳動及び臭化
エチジウムによる染色を行った。即ち、電気泳動は3%
のアガロースゲルを使用し、TBEバッファー中、10
0ボルトで30分行った。次いでゲルを取り出し、0.
5μg/mlの臭化エチジウム水溶液中に30分浸漬し
て染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロ
イドカメラで撮影した。この場合、電気泳動時に塩基対
数が既知のDNA断片を一緒に流すことにより、相対比
較によって、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを
算出した。
マーの組合せが、配列番号6のオリゴヌクレオチドと配
列番号3のオリゴヌクレオチドの場合140塩基対、配
列番号6のオリゴヌクレオチドと配列番号4のオリゴヌ
クレオチドの場合135塩基対、配列番号6のオリゴヌ
クレオチドと配列番号5のオリゴヌクレオチドの場合1
29塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されたこと
を示している。
も、サルモネラ属細菌を正しく検出できることがわか
る。
よるサルモネラ属細菌の検出結果が、サルモネラ属細菌
に対し選択的であることを確認するため、臨床検査、食
品衛生検査等において高頻度で現れる腸内細菌科のサル
モネラ属以外の属の菌を表2に示すように選び、実施例
1と同様にして各プライマーの組合せごとに特定の長さ
の塩基対が増幅された否かを調べた。
マーの組合せが、配列番号6のオリゴヌクレオチドと配
列番号3のオリゴヌクレオチドの場合140塩基対、配
列番号6のオリゴヌクレオチドと配列番号4のオリゴヌ
クレオチドの場合135塩基対、配列番号6のオリゴヌ
クレオチドと配列番号5のオリゴヌクレオチドの場合1
29塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されなかっ
たことを示している。
も、サルモネラ属以外の細菌は検出できないことがわか
る。
Salmonella Enteritidis 食品由来株を実施例1と同様
に培養し、菌の懸濁液とした。これの10倍希釈系列を
調製し、これを沸騰水中で10分間加熱することにより
DNAを抽出し、遠心分離し、その上澄液を検体とし
た。なお、加熱直前に希釈液の一部を取って菌数測定
し、それぞれの菌濃度を算出した。これらの菌濃度を表
3に示す。
反応用バッファー5μl(宝酒造株式会社製、TaKa
Ra Taqに付属のBuffer)、4種類のデオキ
シリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)混合液(宝酒
造株式会社製、TaKaRaTaqに付属のdNTP混
合液)4μl、表3に示すように、正規鎖側プライマー
として配列番号6の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド(Appl. Env. Microb., 59, No.5, 1342(1993)のプラ
イマー1)20pmol、相補鎖側プライマーとして、
配列番号3、4又は5の塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド、あるいは相補鎖側プライマーの比較例として、
FluitらがPCR法でサルモネラ属細菌を検出する場合
にプライマー2として使用した、配列番号7 (5´)AAAGAATAACCGTTGTTCAC(3´) (配列番号7) で示されるオリゴヌクレオチド(Appl. Env. Microb.,
59, No.5, 1342(1993))、20pmol、DNAポリメ
ラーゼ(宝酒造株式会社製、TaKaRa Taq)
0.25μlを加え、水で50μlとした。
ごとに、実施例1と同様にして特定の長さの塩基対が増
幅された否かを調べた。
述の表1、表2と同様に、配列番号6のオリゴヌクレオ
チドと配列番号3のオリゴヌクレオチドの場合140塩
基対、配列番号6のオリゴヌクレオチドと配列番号4の
オリゴヌクレオチドの場合135塩基対、配列番号6の
オリゴヌクレオチドと配列番号5のオリゴヌクレオチド
の場合129塩基対に相当する大きさの増幅物の観察の
有無を示している。
が存在しない場合のサルモネラ属細菌の検出限界は、相
補鎖側プライマーとして、本発明の配列番号3、4又は
5のオリゴヌクレオチドを使用した場合は、公知の配列
番号7のオリゴヌクレオチドを使用した場合と同様にサ
ルモネラ属細菌を103CFU/mlまで検出できるこ
とがわかる。
るので、雑菌の共存条件下でもサルモネラ属細菌を検出
できることが必要である。そこで、前述の実施例3の操
作において、各検体液中にサルモネラ属細菌と最も類縁
であるシトロバクター(Citrobacter freundii)を6.
1×107CFU/ml共存させ、実施例3と同様にし
て特定の長さの塩基対が増幅されたか否かを調べた。結
果を表4に示す。
て公知の配列番号7のオリゴヌクレオチドを使用した場
合には、検体中にサルモネラ属細菌とシトロバクターが
共存すると、前述の実施例3のシトロバクターが共存し
ない場合に比してサルモネラ属細菌の検出限界が劣る
が、本発明の配列番号3、4又は5のオリゴヌクレオチ
ドを使用した場合は、シトロバクターの共存下において
も前述の実施例3の共存しない場合と同様にサルモネラ
属細菌を103CFU/mlまで検出できることがわか
る。
属細菌を検出するにあたり、新規なプライマーを使用す
るので、雑菌としてシトロバクターが存在してもサルモ
ネラ属細菌を良好に検出することが可能となる。
for detection of Salmonella spp. usi ng the oligonucleotides as primers o
n the PCR method <130> PS98−0071 <160> 7 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the oligonucleotides are selec
ted in a gene sequence of oriC as th e target sequence to be amplified <400> 1 ttg tgt ata agt acc <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the oligonucleotides are selec
ted in a gene sequence of oriC as th e target sequence to be amplified <400> 2 ata agt acc cgt tt <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the oligonucleotides are selec
ted in a gene sequence of oriC as th e target sequence to be amplified <400> 3 ttg agt tgt gta taa gta cc <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the oligonucleotides are selec
ted in a gene sequence of oriC as th e target sequence to be amplified <400> 4 ttg tgt ata agt acc cgt tt <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the oligonucleotides are sele
cted in a gene sequence of oriC as t he target sequence to be amplified <400> 5 ata agt acc cgt ttt gat cc <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the oligonucleotides are sele
cted in a gene sequence of oriC as t he target sequence to be amplified <400> 6 tta tta gga tcg cgc cag gc <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the oligonucleotides are sele
cted in a gene sequence of oriC as t he target sequence to be amplified <400> 7 aaa gaa taa ccg ttg ttc ac
Claims (5)
- 【請求項1】 サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコード
するヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配
列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオ
チドであって、配列番号1又は2に示される塩基配列 (5´)TTGTGTATAAGTACC(3´) (配列番号1) (5´)ATAAGTACCCGTTT(3´) (配列番号2) を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項2】 配列番号3、4又は5に示される塩基配
列 (5´)TTGAGTTGTGTATAAGTACC(3´) (配列番号3) (5´)TTGTGTATAAGTACCCGTTT(3´) (配列番号4) (5´)ATAAGTACCCGTTTTGATCC(3´) (配列番号5) を有する請求項1記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項3】 サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコード
するヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配
列と相補的となるように化学合成された2種のオリゴヌ
クレオチドからなるプライマーであって、その一方が請
求項1又は2記載のオリゴヌクレオチドからなることを
特徴とするプライマー。 - 【請求項4】 2種のオリゴヌクレオチドのもう一方を
なすオリゴヌクレオチドが、配列番号6に示される塩基
配列 (5´)TTATTAGGATCGCGCCAGGC(3´) (配列番号6) を有する請求項3記載のプライマー。 - 【請求項5】 検体に、請求項3又は4記載のプライマ
ーを加え、PCR(Polymerase Chain Reaction)法に
よりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配
列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うこ
とを特徴とするサルモネラ属細菌の検出方法。
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