KR20120027894A

KR20120027894A - 식물플랑크톤 유래 도모익산 검출용 바이오센서 및 도모익산 검출 방법

Info

Publication number: KR20120027894A
Application number: KR1020100089736A
Authority: KR
Inventors: 장만; 이택견
Original assignee: 한국해양연구원
Priority date: 2010-09-14
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2012-03-22

Abstract

본 발명은 유독 식물 플랑크톤에 의해 합성 분비되는 독성물질인 도모익산(domoic acid; DA)을 검출할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 독성물질 검출 방법에 관한 것으로, 도모익산과 단백질의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리한 항-DA 항혈청(anti-DA antiserum)을 포함하는 것을 특징으로 하는 도모익산 검출용 바이오센서 및 도모익산과 단백질의 결합체를 제조하는 단계; 상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항-DA 항혈청을 제조하는 단계; 그리고, 상기 항혈청과 도모익산의 항원 항체 반응에 의한 발색도를 측정하는 단계를 포함하는 본 발명의 독성물질 검출 방법은, 아직까지 식물플랑크톤 유래 biotoxin인 도모익산에 대하여는 개발되지 않은 기술로써 정밀 분석기기를 이용하여 현장에서 독소의 조기 정밀 검정 기술 확립과 함께 이의 활용 가능성은 매우 높은 것이다.

Description

식물플랑크톤 유래 도모익산 검출용 바이오센서 및 도모익산 검출 방법 {Antibody production and detecting method for detection of domoic acid from phytoplankton}

본 발명은 유독 식물플랑크톤에 의해 합성 분비되는 독성물질인 도모익산(domoic acid)을 검출할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 독성물질 검출 방법에 관한 것으로, 상세하게는 도모익산과 같은 독성물질을 쥐에 주사하여 혈청으로부터 항체를 생산하고, 생산된 항체와 독성물질의 반응에 의해 발색되는 정도를 측정함으로써 도모익산을 비롯한 독성물질을 검출하는 방법과 관련된다.

적조현상(redtide; Harmful Algal Blooms)은 전세계적으로 발생 빈도가 증가하고 있을 뿐 아니라, 유독화, 조밀화되고 있어 수산자원, 해양환경, 및 공중보건에도 심각한 위협이 되므로 이에 대한 대책이 요구되고 있다. 최근 들어 우리나라 근해, 특히 남해안에서 주로 발생하는 유해조류의 이상증식현상(적조)은 대체로 유독성 편모조류에 의한 것으로, 우리나라 총 어업생산의 30%를 차지하는 양식산업에 막대한 피해를 주고 있는 실정이다. 이에 따라 국내 연구소뿐만 아니라 대학 등에서도 적조방제를 위한 다각적인 노력을 기울이고 있다.

적조에 의한 어패류의 피해로는, 식물 플랑크톤의 대발생으로 인해 해수 내의 용존산소가 감소되는 경우와, 식물 플랑크톤이 아가미 등에 모이면서 어패류의 사멸을 유도하는 경우가 일반적으로 알려져 있으나, 더욱 커다란 문제는 일부 유해 적조생물들에 의해 합성되어 분비 또는 세포내 함유되는 독성물질로 인한 피해라 할수있다. 이와 같이 유독 식물 플랑크톤에 의해 합성, 분비되는 독성물질은 크게 PSP(Paralytic Shellfish Poison), DSP(Diarrhetic Shellfish Poison), ASP(Amnestic Shellfish poison) 등으로 분류되는데, 도모익산은 ASP 계열의 독성물질이다. 도모익산은 규조류인 Nitzschia pungens에 의해 합성 및 분비되는 것으로 알려져 있는 대표적인 망각성 패독이다.

해양 미세조류 유래의 독성물질을 이해하고 이용하기 위한 연구에서 가장 중요한 문제점으로는 독성물질을 손쉽고 빠르게 검출할 수 있는 기술의 부재를 들 수 있다. 기존의 해양 미세조류 독성물질의 연구에는 HPLC나 GC 등을 이용한 독성물질의 분석 방법이나 핵자기 공명, 질량분석 등의 방법이 이용되어 왔으며 [Yasumoto, T. 등, 1990, Norwegian 연안 해수로부터 Chrysochroumlina polyepis와 Gyrodiinium aureolum의 hemolytic과 ichthyotoxic 성분의 탐색, In Toxic Marine Phytoplankton (E. Graneli, B. Sundstrom, L. Edler and D. M. Anderosn 저), pp. 436-440. Elsevier Science 출판사, 뉴욕], 일부 독성물질에 대해서는 방사능으로 표지된 물질을 먹이고 이를 추적함으로써 연구하는 생화학적 방법이 적용되어 왔다. (Shimizu, Y. 등, 1984, saxitoxin analogues의 생합성: 예상되지 않은 과정. J. Am. Chem. Soc. 106: 6433-6434; Douglas, D. J. 등, 1992, [13C]로 표지된 전구체와 핵자기 공명법으로 결정한 해양 규조류 Nitzschia pungens에 의한 신경마비독성 domoic acid의 생합성. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1992: 714-716).

그러나 이와 같은 기존의 방법으로는 복잡한 구조를 가진 해양미세조류 유래독성물질의 생합성 과정을 이해하기 어려울 뿐 아니라, 많은 인력과 장비, 시간이 요구된다. 따라서 독성물질을 손쉽고 빠르게 검출할 수 있는 바이오센서의 개발은 시급하면서도 필수적인 것으로 받아들여지고 있다.

국내에서 환경오염물질을 검출할 수 있는 바이오센서의 개발은 수질 모니터링, 토양독성 모니터링, 가스독성 모니터링 등을 위해 연구되고 있다. 특히 생물학적인 바이오센서로는 물벼룩, 해조류, 어류 등을 이용하는 방법과, 대장균, 바실러스, 슈도모나스, 살모넬라 등의 미생물에서 비롯된 유전자 재조합 미생물을 이용하는 방법 등이 주를 이류고 있다. 이중에서 물벼룩, 해조류, 어류 등을 이용하는 방법은 생물체의 유지, 보관 등의 문제로 인하여 일회용 탐지기능만을 제공할 수밖에 없다는 단점이 있다. 한편, 유전자 재조합 미생물을 이용하는 방법에 있으서는 현재까지 생물학적 빛 (bioluminescence)와 녹색형광(green fluoresscence)을 표지유전자로 사용하는 연구가 활발히 진행 중에 있다. 그리고, 최근에는 DNA 칩을 이용한 마이크로어레이(microarray) 기법도 적용되고 있다.

그러나 이상에서 언급된 바이오센서 관련 연구들은 환경호르몬, 내분비계 장애물질 등과 같은 유해 화학물질과 중금속 등에 국한되어 있을 뿐, 유독 식물 플랑크톤에 의해 합성, 분비되어 어패류 뿐만 아니라 인간에게까지 치명적인 영향을 미치는 독성물질에 대해서는 전혀 연구 개발이 이루어지지 않고 있는 실정이다.

해수 중의 유독 플랑크톤 수가 1㎖당 200개 이상일 경우에는 독소에 의한 피해가 예상되므로, 패독(貝毒) 발생을 대비한 광범위한 실태조사와 함께 채취 시기의 지도 및 조기 수확 등 적절한 사전관리가 필요하게 된다. 그러나, 단순히 유독 플랑크톤의 수를 기준으로 하여 독소 발생을 예측하는 것은 매우 어려운 일이 될 수 밖에 없다. 식품의약품안전청에서는 해수에 기준치 이상(80 ㎕/g 이상)의 독소성분이 검출될 경우 발생지역에서 생산되는 조개류에 대한 판매 금지 및 가공식품 원료 사용 금지를 취하고 있다. 그러나 이처럼 독소 발생 지역을 발표하는 것은 정확한 검정법이 될 수 없으므로, 생체를 이용한 바이오 모니터링의 개발이 필요하고, 고가의 분석장비를 활용하는 동시에 현장에서 신속하게 실시할 수 있는 독소 검정법이 필요하게 된다.

현재 신속한 독소의 검출 방법으로 가장 많이 사용하고 있는 것이 항원-항체 이용법이지만, 독소의 경우 항체를 생산하기가 쉽지 않아 아직까지 초기단계의 연구만 이루어져 있는 실정이다.

본 발명에서는 이상과 같은 문제점을 고려하여 분자면역학을 이용한 방법으로 현장에서 사용 가능한 독소 검정 기술을 개발하고자 한 것으로, 유독 식물플랑크톤에 의해 합성 분비되는 독성물질인 도모익산(domoic acid)을 검출할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 독성물질 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 도모익산(domoic acid ;DA)과 단백질의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리된 항-DA 항혈청(anti-DA antiserum)이 포함된 식물플랑크톤 유래 도모익산 검출용 바이오센서를 제공하고자 한다.

또한, 상기 단백질은 오브알부민(ovalbumin; OVA)또는 보바인 혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)인 것을 특징으로 하는 식물플랑크톤 유래 도모익산 검출용 바이오센서를 제공하고자 한다.

또한, 도모익산과 단백질의 결합체를 제조하는 단계; 상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항-DA 항혈청을 제조하는 단계; 상기 항혈청과 도모익산의 항원 항체 반응에 의한 발색도를 측정하는 단계를 포함하는 도모익산 검출 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 도모익산 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 도모익산 검정법은 아직까지 전세계에서 체계적으로 시도되거나 개발되지 않은 새로운 기술로써, 고가의 정밀분석기기의 이용과 함께 현장에서 독소의 조기 정밀 검정 기술이 확립된다면 이의 활용 가능성은 매우 높게 된다. 또한, 본 발명에 따른 항원 항체 반응을 이용한 독성 물질 검출 방법은 다른 유해독소의 조기 정밀 진단에도 적용 가능하므로 발전 가능성은 매우 높은 것이다.

도 1은 해조류 유래 항동맥경화 및 항당뇨 활성이 있는 열수추출물 및 분획물을 얻을 수 있는 제조공정도를 나타내는 그림을 도시한 도,
도 2은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 DA-단백질 conjugate를 SDS-PAGE에 의해 분리 확인한 그림을 도시한 도,
도 3는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 ELISA(Enzyme-Linked immuno Sorbent Assay)를 이용하여 항-DA 항혈청(anti-DA antiserum)의 역가 변화를 측정한 그래프를 도시한 도.

본 발명을 첨부된 실시 예의 도면을 참조하여 상세하게 설명하면 다음과 같다. 도 1은 해조류 유래 항동맥경화 및 항당뇨 활성이 있는 열수추출물 및 분획물을 얻을 수 있는 제조공정도를 나타내는 그림을 도시한 도이고, 도 2은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 DA-단백질 conjugate를 SDS-PAGE에 의해 분리 확인한 그림을 도시한 도이며, 도 3는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 ELISA(Enzyme-Linked immuno Sorbent Assay)를 이용하여 항-DA 항혈청(anti-DA antiserum)의 역가 변화를 측정한 그래프를 도시한 도이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 도모익산(domoic acid; DA) 검출용 바이오센서는, 도모익산과 단백질과의 결합체로 면역반응 시킨 마우스로부터 분리된 항-DA 항혈청(anti-DA antiserum)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 특히 상기 단백질은 오브알부민(ovalbumin;OVA) 또는 보바인 혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)인 것이 바람직하다.

상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 독성물질 검출 방법은, 독성물질과 단백질의 결합체를 제조하고; 상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항혈청을 제조하고; 그리고 상기 항혈청과 독성물질의 항원 항체 반응에 의한 발색도를 측정하는 단계를 포함한다. 이와 같은 독성물질 검출 방법의 예로서 본 발명의 도모익산 검출 방법은, 도모익산과 단백질의 결합체를 제조하는 단계; 상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항-DA 항혈청을 제조하는 단계; 그리고, 상기 항혈청과 도모익산의 항원 항체 반응에 의한 발색도를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명은 유독 식물플랑크톤에 의해 합성 분비되는 독성물질인 도모익산(domoic acid)을 검출할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 독성물질 검출 방법을 제공하기 위한 것으로, 도모익산과 같은 독성물질을 마우스에 주사하여 혈청으로부터 항체를 생산하고, 생산된 항체와 독성물질의 반응에 의해 발생되는 정도를 측정함으로써 독성물질을 검출하도록 하고 있다.

본 발명에 따른 도모익산 검출용 바이오센서는 다음 과정을 거쳐 제작된다: 먼저 , 도모익산(DA)과 전달 단백질(carrier protein)과의 결합체 (conjugate)를 제조한다. 전달 단백질로는 오브알부민(ovalbumin: OVA)이나 보바인 혈청알부민(bovine serum albumin: BSA)등을 사용할 수 있다. 제조된 OVA-DA결합체를 마우스에 피하 및 근육에 주사하여 면역반응 시킨 후 혈액을 채취하여 항-DA 항혈청 (anti-DA antiserum)을 분리한다.

이와 같이 OVA-DA 로 면역반응 시킨 쥐로부터 획득한 항혈청의 역가를 알아보기 위해, BSA-DA를 코팅시킨 마이크로역가 플레이트를 이용하여 간접 ELISA를 실시한 결과, 본 발명에 따른 항혈청은 결합체로 사용한 OVA 단백질보다 OVA-DA와 특이적으로 반응을 하는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명에 따른 항-DA 항혈청(anti-DA antiserum)의 DA에 대한 감도 역시 매우 높은 것으로 나타나, 이 항혈청을 현장에서 적용하였을 때 약 0.625ng의 DA까지 효과적으로 감지할 수 있을 것으로 보여진다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참고로 하여 구체적으로 설명한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이고, 첨부된 특허 청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 도모익산(DA)-단백질 결합체(coniugate)의 제조

정제된 도모익산(DA)은 NRC-CNRC에서 구입하였으며, 단백질과의 결합은 결합 키드(ImjectR Immunogen EDC conjugation kit, Pierce)를 사용하였다. 즉, 전달 단백질(carrier protein)로 사용될 오브알부민(ovalbumin; OVA)과 보바인 혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)을 10mg/㎖ 의 농도가 되도록 증류수에 녹이고, DA는 결합 완충액(conjugation buffer; 0.1 M MES, 0.9 M Nacl, 0.02% Nan3, pH 4.7)에 1 mg/㎖의 농도가 되도록 준비하였다.

결합(conjugation)을 위하여 400㎕의 DA와 200㎕의 전달 단백질 용액을 혼합한 후, 50 ㎕의 EDC(10 mg/㎖) 용액을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행하였다. 반응이 끝난 후 결합이 되지 않은 DA와 전달 단백질 용액에 남아 있는 EDTA는 탈염 컬럼(D-Salt TM desalting column)을 사용하여 제거하였다.

DA-전달 단백질 결합체는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였으며, BCA 단백질정량 용액(BCA protein assay reagent, Pierce)을 이용한 단백질 정량 후 아세톤 침전법을 사용하여 그 농도가 1 ㎕/㎖이 되도록 맞추어 적정량을 분주하여 20℃에 보관하였다.

실시예 2: 면역반응(Immunization)

4주령의 BALB/c 마우스를 사용하여 다클론 항혈청(polyclonal antiserum)을 제조하였다. 면역반응에는 3차 면역까지 보조제로 임젝트 알럼 (ImjectR Alum, Pierce)를 사용하였으며 네 번째 면역에서는 보조제를 사용하지 않았다.

각 면역반응에서는 쥐 한 마리당 100 ㎕의 OVA-DA결합체가 되도록 멸균된 PBS에 희석하여 사용하였으며, 피하 및 근육 경로로 주사하였다. 면역반응은 10일에 한번씩 실시하였다. 총 4회의 면역반응 후 항체 역가(titer)를 측정하기 위해 채혈한 후, 혈액을 원심분리하여 상층의 혈청만을 사용하였다.

실시예 3: 효소면역 진단법(ELISA)

① BSA-DA 결합체의 고정화

BSA-DA 결합체의 고정화는 코팅 완충용액(0.2 M 탄산염 완충액, pH 9.4)으로 0.5 ㎕/㎖이 되도록 희석한 BSA-DA 결합체를 96-웰 마이트로역가 플레이트에 200㎕씩 분주한 후 37℃에서 2시간 반응시켜 실시하였다. 반응 후, 블로킹(blocking)을 위하여 PBST에 1 %(w/v)의 non fat dry skim milk 용액을 만들고, 각 웰에 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 블로킹 후 마이크로 플레이트는 PBST로 3 회 세척하였다.

② BSA-DA결합체를 이용한 간접 ELISA

항혈청 역가측정은 BSA-DA결합체가 코팅된 웰의 대조구로 OVA(1 ㎕/웰)와 BSA(1 ㎕/웰)을 사용하였다. 일차 항체 결합을 위하여 OVA-DA로 면역반응 시킨 쥐에서 채취한 항혈청을, 0.1%(w/v) skim milk/PBST를 이용해서 1/500부터 1/500000까지 serial 희석하여 100 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 각 항원에 대하여 2회씩 실시하였으며, 항혈청을 넣지 않는 웰을 반대 대조구로 사용하였다. 반응이 끝난 후, PBST로 3회 세척하였다.

이차 항체로는 염소 항-마우스 lgG-HRP 결합체(goat anti-mouse HRP conjugate, Simga)를 0.1%(w/v) skim milk/PBST로 1000배 희석하여 사용하였다. 각 웰에 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBST로 세척하고, 이어서 50 ㎕의 기질(4 mg OPD and 5 ㎕ hydrogen peroxide in citrate-phosphate buffer)를 각 웰에 넣고 10분후에 발색반응을 관찰한 후, 100 ㎕의 반응중지 용액 (1NH2SO4)을 사용하여 발색반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

위에서 실시한 실험을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

결과예 1: 항-DA항혈청(anti-DA antiserum)의 역가 측정

OVA-DA로 면역반응시킨 쥐로부터 획득한 항혈청의 역가를 알아보기 위해, BSA-DA, OVA 및 BSA를 코팅시킨 마이크로역가 플레이트를 이용하여 간접 ELISA를 실시하였다. 도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 DA-단백질 conjugate를 SDS-PAGE에 의해 분리 확인한 그림이고, 도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)를 이용하여 항-DA항혈청(anti-DA antiserum)의 역가 변화를 측정한 그래프이다.

여기에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 항혈청은 BSA-DA와 특이적으로 반응하고, 상기 BSA-DA는 OVA와 BSA에 비해 현저히 강하게 반응하는 것을 확인할 수 있으며(도 3 참조), 1/50,000 희석 조건에서도 상당히 높은 흡광도 값(OD490≒0.1)을 보이는 것으로 보아 감도 역시 매우 높다는 것을 알 수 있다.(도 3 참조)

결과예 2: 현장 적용을 위한 항-DA 항혈청(anti-DA antiserum)의 감도 측정

상기 실험결과에서, 항-DA 항혈청이 1/50,000 희석 조건에서도 상당히 높은 흡광도 값(OD490≒0.1)을 보이는 것으로 보아, 이 혈청은 DA에 대해 높은 감도를 갖는다는 것을 알 수 있다. 다음 표 1은 희석비율에 따른 항-DA 항혈청의 감도 변화를 측정한 표이다.

희석비율에 따른 항-DA 항혈청의 감도 변화

Dilution Factor	Blank	BSA-DA2	BSA	OVA
100	0.034	0.247	0.029	0.233
500	0.039	0.248	0.032	0.216
1000	0.036	0.237	0.033	0.189
5000	0.036	0.204	0.033	0.126
10000	0.036	0.174	0.032	0.091
50000	0.038	0.095	0.035	0.048
100000	0.040	0.088	0.029	0.046
500000	0.037	0.077	0.031	0.042
0	0.036	0.046	0.031	0.040

이에 따라, 항-DA 항혈청을 현장에서 적용하였을 때 약 0.74 ng의 농도까지 효과적으로 감지할 수 있을 것으로 보여진다. 이상의 결과로부터, 본 발명에 따라 제작된 항-DA 항혈청 및 이를 이용한 검정법은 DA를 비롯한 독성물질의 조기 정밀 검정에 효과적임을 확인할 수 있다.

Claims

도모익산(domoic acid ;DA)과 단백질의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리된 항-DA 항혈청(anti-DA antiserum)이 포함된 식물플랑크톤 유래 도모익산 검출용 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 단백질은 오브알부민(ovalbumin; OVA)또는 보바인 혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)인 것을 특징으로 하는 식물플랑크톤 유래 도모익산 검출용 바이오센서.
도모익산과 단백질의 결합체를 제조하는 단계;
상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항-DA 항혈청을 제조하는 단계;
상기 항혈청과 도모익산의 항원 항체 반응에 의한 발색도를 측정하는 단계를 포함하는 도모익산 검출 방법.