KR100483908B1 - 항원 항체 반응을 이용한 삭시톡신 검출용 바이오센서 - Google Patents

항원 항체 반응을 이용한 삭시톡신 검출용 바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유독 식물 플랑크톤에 의해 합성 분비되는 독성물질인 삭시톡신 (saxitoxin)을 검출할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 독성물질 검출 방법에 관한 것으로, 삭시톡신과 단백질과의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리한 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)인 것을 특징으로 하는 삭시톡신(saxitoxin; STX) 검출용 바이오센서, 및 독성물질과 단백질의 결합체를 제조하고; 상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항혈청(antiserum)을 제조하고; 그리고 상기 항혈청과 독성물질의 항원 항체 반응에 의한 발색도를 측정하는 단계를 포함하는 본 발명의 독성물질 검출 방법은, 아직까지 전세계에서 체계적으로 시도되거나 개발되지 않은 새로운 기술로서, 고가의 정밀분석기기의 이용과 함께 현장에서 독소의 조기 정밀 검정 기술이 확립된다면 이의 활용 가능성은 매우 높게 된다.

Description

항원 항체 반응을 이용한 삭시톡신 검출용 바이오센서{BIOSENSOR FOR SAXITOXIN DETECTION USING ANTIGEN-ANTIBODY INTERACTION}
본 발명은 유독 식물 플랑크톤에 의해 합성 분비되는 독성물질인 삭시톡신 (saxitoxin)을 검출할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 독성물질 검출 방법에 관한 것으로, 상세하게는 삭시톡신과 같은 독성물질을 쥐에 주사하여 혈청으로부터 항체를 생산하고, 생산된 항체와 독성물질의 반응에 의해 발색되는 정도를 측정함으로써 삭시톡신을 비롯한 독성물질을 검출하는 방법과 관련된다.
적조현상(redtide; Harmful Algal Blooms (HABs))은 전세계적으로 발생 빈도가 증가하고 있을 뿐 아니라, 유독화, 조밀화되고 있어 수산자원, 해양환경, 및 공중보건에도 심각한 위협이 되므로 이에 대한 대책이 요구되고 있다. 최근 들어 우리나라 근해, 특히 남해안에서 주로 발생하는 유해조류의 이상증식현상(적조)은 대체로 유독성 편모조류에 의한 것으로, 우리나라 총 어업생산의 30 %를 차지하는 양식산업에 막대한 피해를 주고 있는 실정이다. 이에 따라 국내 연구소 뿐만 아니라 대학 등에서도 적조방제를 위한 다각적인 노력을 기울이고 있다.
적조에 의한 어패류의 피해로는, 식물 플랑크톤의 대발생으로 인해 해수 내의 용존산소가 감소되는 경우와, 식물 플랑크톤이 아가미 등에 모이면서 어패류의 사멸을 유도하는 경우가 일반적으로 알려져 있으나, 더욱 커다란 문제는 일부 유해 적조생물들에 의해 합성되어 분비 또는 세포내 함유되는 독성물질로 인한 피해라 할 수 있다. 이와 같이 유독 식물 플랑크톤에 의해 합성, 분비되는 독성물질은 크게 PSP(Paralytic Shellfish Poison), DSP(Diarrhetic Shellfish Poison), ASP(Amnestic Shellfish Poison) 등으로 분류되는데, 최근에 국내외적으로 중요하게 다루어지고 있는 독성물질로는 PSP 중 삭시톡신(saxitoxin) 계열을 들 수 있다.
해양 미세조류 유래의 독성물질을 이해하고 이용하기 위한 연구에서 가장 중요한 문제점으로는 독성물질을 손쉽고 빠르게 검출할 수 있는 기술의 부재를 들 수 있다. 기존의 해양 미세조류 독성물질의 연구에는 HPLC나 GC 등을 이용한 독성물질의 분석 방법이나 핵자기 공명, 질량분석 등의 방법이 이용되어 왔으며(Yasumoto, T. 등, 1990, Norwegian 연안 해수로부터 Chrysochromulina polyepis와 Gyrodinium aureolum의 hemolytic과 ichthyotoxic 성분의 탐색. In Toxic Marine Phytoplankton (E. Graneli, B. Sundstrom, L. Edler and D. M. Anderson 저), pp. 436-440. Elsevier Science 출판사, 뉴욕), 일부 독성물질에 대해서는 방사능으로 표지된 물질을 먹이고 이를 추적함으로써 연구하는 생화학적 방법이 적용되어 왔다 (Shimizu, Y. 등, 1984, saxitoxin analogues의 생합성: 예상되지 않은 과정. J. Am. Chem. Soc. 106: 6433-6434; Douglas, D.J. 등, 1992, [13C]로 표지된 전구체와 핵자기 공명법으로 결정한 해양 규조류 Nitzschia pungens에 의한 신경마비독성 domoic acid의 생합성. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1992: 714-716).
그러나 이와 같은 기존의 방법으로는 복잡한 구조를 가진 해양미세조류 유래 독성물질의 생합성 과정을 이해하기 어려울 뿐 아니라, 많은 인력과 장비, 시간이 요구된다. 따라서, 독성물질을 손쉽고 빠르게 검출할 수 있는 바이오센서의 개발은 시급하면서도 필수적인 것으로 받아들여지고 있다.
국내에서 환경오염물질을 검출할 수 있는 바이오센서의 개발은 수질 모니터링, 토양독성 모니터링, 가스독성 모니터링 등을 위해 연구되고 있다. 특히 생물학적인 바이오센서로는 물벼룩, 해조류, 어류 등을 이용하는 방법과, 대장균, 바실러스, 슈도모나스, 살모넬라 등의 미생물에서 비롯된 유전자 재조합 미생물을 이용하는 방법 등이 주를 이루고 있다. 이중에서 물벼룩, 해조류, 어류 등을 이용하는 방법은 생물체의 유지, 보관 등의 문제로 인하여 일회용 탐지기능만을 제공할 수밖에 없다는 단점이 있다. 한편, 유전자 재조합 미생물을 이용하는 방법에 있어서는 현재까지 생물학적 빛(bioluminescence)와 녹색형광(green fluorescence)을 표지유전자로 사용하는 연구가 활발히 진행 중에 있다. 그리고, 최근에는 DNA 칩을 이용한 마이크로어레이(microarray) 기법도 적용되고 있다.
그러나, 이상에서 언급된 바이오센서 관련 연구들은 환경호르몬, 내분비계 장애물질 등과 같은 유해 화학물질과 중금속 등에 국한되어 있을 뿐, 유독 식물 플랑크톤에 의해 합성, 분비되어 어패류 뿐만 아니라 인간에게까지 치명적인 영향을 미치는 독성물질에 대해서는 전혀 연구 개발이 이루어지지 않고 있는 실정이다.
한편, 우리나라에서 발생될 수 있는 조개류의 식중독 중에서는 진주담체(홍합)에 의한 식중독이 가장 중요하다. 진주담체의 삭시톡신은 과편모조류의 일종인 유독식물 플랑크톤이 진주담체 등에 섭취되어 축적되는 것에서 비롯되는 것으로, 이들 독소성분이 함유된 진주담체를 인간이 섭취하였을 경우 식중독을 일으키게 된다. 우리나라에서는 늦은 봄부터 초여름까지 해수 중의 유독식물 플랑크톤에서 비롯된 이 독소로 인해 남해안 지역 해안에서 피해가 자주 발생한다.
해수 중의 유독 프랑크톤 수가 1 ㎖ 당 200 개 이상일 경우에는 독소에 의한 피해가 예상되므로, 패독(貝毒) 발생을 대비한 광범위한 실태 조사와 함께 채취 시기의 지도 및 조기 수확 등 적절한 사전관리가 필요하게 된다. 그러나, 단순히 유독 프랑크톤의 수를 기준으로 하여 독소 발생을 예측하는 것은 매우 어려운 일이 될 수밖에 없다. 식품의약품안전청에서는 해수에 기준치 이상(80 ㎍/g 이상)의 독소성분이 검출될 경우 발생지역에서 생산되는 조개류에 대한 판매 금지 및 가공식품 원료 사용 금지를 취하고 있다. 그러나, 이처럼 독소 발생 지역을 발표하는 것은 정확한 검정법이 될 수 없으므로, 생체를 이용한 바이오 모니터링의 개발이 필요하고, 고가의 분석장비를 활용하는 동시에 현장에서 신속하게 실시할 수 있는 독소 검정법이 필요하게 된다.
현재 신속한 독소의 검출 방법으로 가장 많이 사용하고 있는 것이 항원-항체 이용법이지만, 독소의 경우 항체를 생산하기가 쉽지 않아 아직까지 개발된 예가 없는 실정이다.
본 발명에서는 이상과 같은 문제점을 고려하여 분자면역학을 이용한 방법으로 현장에서 사용 가능한 독소 검정 기술을 개발하고자 한 것으로, 유독 식물 플랑크톤에 의해 합성 분비되는 독성물질인 삭시톡신(saxitoxin)을 검출할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 독성물질 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 삭시톡신(saxitoxin; STX) 검출용 바이오센서는,
삭시톡신과 단백질과의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리한 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)인 것을 특징으로 한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 독성물질 검출 방법은,
독성물질과 단백질의 결합체를 제조하고;
상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항혈청(antiserum)을 제조하고; 그리고
상기 항혈청과 독성물질의 항원 항체 반응에 의한 발색도를 측정하는 단계를 포함한다.
이와 같은 독성물질 검출 방법의 예로서 본 발명의 삭시톡신(saxitoxin; STX) 검출 방법은,
삭시톡신과 단백질의 결합체를 제조하고;
상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)을 제조하고; 그리고
상기 항혈청과 삭시톡신의 항원 항체 반응에 의한 발색도를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 유독식물 플랑크톤에 의해 합성 분비되는 독성물질인 삭시톡신 (saxitoxin)을 검출할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 독성물질 검출 방법을 제공하기 위한 것으로, 삭시톡신과 같은 독성물질을 마우스에 주사하여 혈청으로부터 항체를 생산하고, 생산된 항체와 독성물질의 반응에 의해 발색되는 정도를 측정함으로써 독성물질을 검출하도록 하고 있다.
본 발명에 따른 삭시톡신 검출용 바이오센서는 다음 과정을 거쳐 제작된다:
먼저, 삭시톡신(STX)과 전달 단백질(carrier protein)과의 결합체 (conjugate)를 제조한다. 전달 단백질로는 헤모시아닌(Mariculture Keyhole Limpet Hemocyanin; mcKLH)이나 오브알부민(ovalbumin; OVA) 등을 사용할 수 있다.
제조된 mcKLH-STX 결합체를 마우스에 복강내 주사하여 면역반응시킨 후 혈액을 채취하여 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)을 분리한다.
이와 같이 mcKLH-STX로 면역반응시킨 쥐로부터 획득한 항혈청의 역가를 알아보기 위해, 유리 STX 또는 OVA-STX를 코팅시킨 마이크로역가 플레이트를 이용하여 간접 ELISA를 실시한 결과, 본 발명에 따른 항혈청은 OVA-STX 및 유리 STX와 특이적으로 반응을 하는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명에 따른 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)의 STX에 대한 감도 역시 매우 높은 것으로 나타나, 이 항혈청을 현장에서 적용하였을 때 약 1.56 ng의 STX까지 효과적으로 감지할 수 있을 것으로 보여진다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단,이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
(1) 삭시톡신(STX)-단백질 결합체(conjugate)의 제조
정제된 삭시톡신(STX)은 NRC-CNRC에서 구입하였으며, 단백질과의 결합은 결합 키트(Imject? Immunogen EDC conjugation kit, Pierce)를 사용하였다.
즉, 전달 단백질(carrier protein)로 사용될 헤모시아닌(Mariculture Keyhole Limpet Hemocyanin; mcKLH) 및 오브알부민(ovalbumin; OVA)을 10 ㎎/㎖의 농도가 되도록 증류수에 녹이고, STX는 결합 완충액(conjugation buffer; 0.1 M MES, 0.9 M NaCl, 0.02 % Nan3, pH 4.7)에 4 ㎎/㎖의 농도가 되도록 준비하였다.
결합(conjugation)을 위하여 500 ㎕의 STX와 200 ㎕의 전달 단백질 용액을 혼합한 후, 50 ㎕의 EDC(10 ㎎/㎖) 용액을 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 결합 반응을 수행하였다. 반응이 끝난 후 결합이 되지 않은 STX와 전달 단백질 용액에 남아 있는 EDTA는 탈염 컬럼(D-SaltTM desalting column)을 사용하여 제거하였다.
STX-전달 단백질 결합체는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였으며, 브래드포드 분석(Bradford assay) 용액을 이용한 단백질 정량 후 적정량을 분주하여 20 ℃에 보관하였다.
(2) 면역반응(Immunization)
4 주령의 BALB/c 마우스를 사용하여 폴리클로날 항혈청(polyclonal antiserum)을 제조하였다.
첫번째 면역반응에는 완전 프로인트 보조제(complete Freunds adjuvant)를 사용하였으며, 두번째 면역반응부터는 불완전 프로인트 보조제(incomplete Freunds adjuvant)를 사용하였다.
각 면역반응에는 쥐 한 마리당 50 ㎍의 mcKLH-STX 결합체가 되도록 멸균된 PBS에 희석하여 사용하였으며, 복강내(intraperitoneal; i.p.) 경로로 주사하였다. 면역반응은 10 일에 한 번씩 실시하였다.
총 4 회의 면역반응 후 항체 역가(titer)를 측정하기 위해 채혈한 후, 혈액을 원심분리하여 상층의 혈청만을 사용하였다.
(3) ELISA
① 유리(free) STX의 고정화
유리 STX의 면역반응을 위하여, 먼저 96-웰 마이크로역가 플레이트(96-well microtiter plate)를 BSA(5 ㎍/㎖ in 0.2 M 탄산염 완충액, pH 9.4, with 0.15 M NaCl, 200 ㎕/웰)로 코팅하였다. 실온에서 하룻밤 반응시킨 플레이트는 PBST(PBS with 0.05 %(v/v) 트윈(Tween) 20)로 3 회 세척 후, 추가적으로 PBS로 3 회 세척하였다. 유리 STX는 동일한 완충용액에 25 μM 용액으로 만들어 100 ㎕ 씩 각 웰에 분주하여 실온에서 하룻밤 반응시켰다.
항혈청 민감도의 측정을 위하여, 0∼50 μM 범위에서 일련의 희석을 하여 동일한 방법으로 마이크로역가 플레이트(microtitier plate)에 분주하였다. 반응 후, 남은 유리 STX는 PBST로 3 회 세척하여 제거하였으며, 2 %(w/v) BSA (in PBS)를 각 웰에 200 ㎕씩 분주하여 실온에서 3 시간 동안 반응시켜 블로킹(blocking)하였다. 블로킹 후 마이크로역가 플레이트는 PBST로 3 회 세척하였다.
② OVA-STX 결합체의 고정화
OVA-STX의 고정화는, 코팅 완충용액(0.2 M 탄산염 완충액, pH 9.4)으로 1 ㎍/㎖이 되도록 희석한 OVA-STX 결합체를 96-웰 마이트로역가 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후 4 ℃에서 하룻밤 반응시켜 실시하였다.
반응 후, 블로킹(blocking)을 위하여 PBST에 2 %(w/v)의 BSA 용액을 만들고, 각 웰에 100 ㎕ 씩 분주하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 블로킹 후 마이크로 플레이트는 PBST로 3 회 세척하였다.
③ OVA-STX 결합체를 이용한 간접 ELISA
항혈청 역가측정: 유리 STX가 코팅된 마이크로역가 플레이트의 경우는 BSA (0.5 ㎍/웰)만 코팅되어 있는 웰을, OVA-STX가 코팅된 경우는 OVA(1 ㎍/웰)을 코팅시킨 웰을 대조구로 사용하였다.
일차 항체 결합을 위하여 mcKLH-STX로 면역반응시킨 쥐에서 채취한 항혈청을, 0.2 %(w/v) BSA/PBST를 이용해서 1/1000부터 1/64000까지 1/2씩 희석하여 100 ㎕씩 분주한 후 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 각 항원에 대하여 2 회씩 실시하였으며, 항혈청을 넣지 않는 웰을 반대 대조구로 사용하였다. 반응이 끝난 후, PBST로 3 회 세척하였다.
이차 항체로는 염소 항-마우스 IgG-포스파타제 결합체(goat anti-mouse IgG-phosphatase conjugate, Sigma)를 0.2 %(w/v) BSA/PBST로 1000 배 희석하여 사용하였다. 각 웰에 100 ㎕씩 분주하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후 PBST로 세척하고, 이어서 pNpp를 사용하여 발색반응을 실시하였다. 마이크로플레이트 판독기 (Microplate reader)를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
항혈청 민감도 측정: 순차적으로 희석된 유리 STX를 고정화시킨 마이크로역가 플레이트에 항-mcKLH-STX 항혈청(anti-mcKLH-STX antiserum)을 0.2 %(w/v) BSA/PBST로 5000 배 희석하여 100 ㎕씩 분주하고 동일한 조건에서 실험을 진행하였다.
위에서 실시한 실험을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)의 역가 측정
mcKLH-STX로 면역반응시킨 쥐로부터 획득한 항혈청의 역가를 알아보기 위해, OVA-STX 및 OVA를 코팅시킨 마이크로역가 플레이트를 이용하여 간접 ELISA를 실시하였다.
도 1 은 ELISA를 이용하여 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)의 역가 변화를 측정한 도면이다.
여기에서 보면, 이 항혈청은 OVA-STX와 특이적으로 반응을 하며, OVA에는 반응하지 않는 것을 확인할 수 있으며, 1/10000 희석 조건에서도 상당히 높은 흡광도 값(OD405 > 1)을 보이는 것으로 보아 감도 역시 높다는 것을 알 수 있다.
유리 STX에 대한 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)의 역가 측정
위 실험으로 확인한 항혈청의 유리 STX에 대한 역가를 알아보기 위해, 유리-STX를 코팅시킨 마이크로역가 플레이트를 이용하여 간접 ELISA를 실시하였다.
도 2 는 ELISA를 이용하여 유리 STX(free STX)에 대한 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)의 역가 변화를 측정한 도면이다.
여기에서 보면 이 항혈청은 유리 STX와 특이적으로 반응하고, PBS에는 반응하지 않는 것을 확인할 수 있으며, 1/16000 희석 조건에서도 상당히 높은 흡광도 값(OD405 > 1)을 보이는 것으로 보아 감도 역시 높다는 것을 알 수 있다.
현장 적용을 위한 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)의 감도 측정
상기 실험 결과에서, 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)이 1/16000 희석 조건에서도 상당히 높은 흡광도 값(OD405 > 1)을 보이는 것으로 보아, 이 혈청은 STX에 대해 높은 감도를 갖는다는 것을 알 수 있다.
다음 표 1은 희석비율에 따른 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)의 감도 변화를 측정한 표이다.
희석률 유리-STX PBS
1,0002,0004,0008,00016,00032,00064,000 1.8231.9821.7321.4030.9830.7320.306 0.0430.0270.0840.0210.0300.0030.002
이에 따라, 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)을 현장에서 적용하였을 때 약 1.56 ng의 STX까지 효과적으로 감지할 수 있을 것으로 보여진다.
이상의 결과로부터, 본 발명에 따라 제작된 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum) 및 이를 이용한 검정법은 STX를 비롯한 독성물질의 조기 정밀 검정에 효과적임을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 삭시톡신 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 삭시톡신 검정법은 아직까지 전세계에서 체계적으로 시도되거나 개발되지 않은 새로운 기술로서, 고가의 정밀분석기기의 이용과 함께 현장에서 독소의 조기 정밀 검정 기술이 확립된다면 이의 활용 가능성은 매우 높게 된다. 또한, 본 발명에 따른 항원 항체 반응을 이용한 독성 물질 검출 방법은 다른 유해독소의 조기 정밀 진단에도 적용 가능하므로 발전 가능성은 매우 높다.
도 1 은 ELISA를 이용하여 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)의 역가 변화를 측정한 도면,
도 2 는 ELISA를 이용하여 유리 STX(free STX)에 대한 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)의 역가 변화를 측정한 도면.

Claims (3)

  1. 삭시톡신(saxitoxin; STX)과 단백질과의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리한 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)인 것을 특징으로 하는, 삭시톡신 검출용 바이오센서.
  2. 삭제
  3. 삭시톡신(saxitoxin; STX)과 단백질의 결합체를 제조하고;
    상기 결합체를 마우스에 주사하여 면역반응시켜 항-STX 항혈청(anti-STX antiserum)을 제조하고; 그리고
    상기 항혈청과 삭시톡신의 항원 항체 반응에 의한 발색도를 측정하는 단계를 포함하는 삭시톡신 검출 방법.
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