CN109112222B - 肠道菌群的荧光检测试剂盒 - Google Patents

肠道菌群的荧光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明是一种利用纳米磁珠提纯粪便样品结合荧光流式细胞术检测肠道菌群的方法。在本发明中，提供了针对艰难梭菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠杆菌、肠炎弧菌和鼠疫杆菌的特异性DNA探针序列，利用偶联于探针序列上的荧光物质，通过微流控技术检测肠道菌群。本发明的检测方法具有快速，准确，灵敏度高等优点。

Description

肠道菌群的荧光检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物诊断和检测领域，涉及一种肠道菌群的分子生物学检测方法，特别是涉及一种利用DNA荧光探针的检测技术、检测菌群DNA的试剂盒及应用。
背景技术
在人体肠道中定居有大量细菌，即"肠道菌群"，这些肠道菌群被认为在人体中具有重要的作用，能极大的影响人体身体健康，是许多慢性疾病，如肥胖症、糖尿病等的重要诱因。最新的研究表明，肠道菌群的变化与帕金森等神经退行性疾病，甚至抑郁症等都有密切的关系，调整肠道菌群可能是一个新的治疗此类疾病的方向。因此，建立准确，快速的肠道菌群的检测系统和方法具有重要意义。
现有的肠道菌群检测中，标本的采集基本为新鲜粪便样品。肠道菌群的研究方法主要有传统法和分子生物学的方法。传统法的培养法和镜鉴法是早期的肠道菌群研究方法。其中细菌的实验室培养，耗时长，并且肠道菌群的种类繁多，在实验室中难于快速高效地培养，为检测增加了难度。分子生物学技术检测粪便中细菌基因组DNA，是当前研究人体肠道菌群的重要方法。对DNA的检测方法，目前常采用的是对目标基因进行PCR扩增，对扩增产物进行定性，检测肠道菌群中目标DNA的存在与否，来判断被检测的细菌是否存在。对扩增产物定性的检测方法包括：凝胶电泳、核酸分子杂交、测序等。所述这些方法，需要多个步骤，包括DNA提取、PCR、电泳或杂交、成像检测等，通常需要6‐7个小时；并且这些方法需要较多的专用性仪器，例如PCR仪、电泳仪、基因芯片、荧光成像装置等。
目前，仍然需要开发肠道菌群的快速检测方法及检测产品。
发明内容
本发明通过实验研究，针对肠道菌群中具有临床重要意义的菌群，开发了特异性高的DNA探针，进一步在所述探针上连接荧光基团，通过所述DNA荧光探针与目标菌群的目的DNA杂交，利用荧光流式细胞技术，通过检测荧光的有无，实现直接检测细菌DNA的目的，高效、快速、简便。
本发明的一个目的是提供用于肠道菌群检测的DNA探针。本发明的另一个目的是提供含有所述DNA探针的DNA荧光探针。本发明的再一个目的是提供利用所述DNA探针或DNA荧光探针检测肠道菌群的方法。
本发明的技术方案如下：
DNA探针，其为分离的核酸。
所述分离的核酸，包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、或SEQ ID No.10。
分离的核酸，包括SEQ ID No.1、或SEQ ID No.2。即使存在肠道菌群中的其他细菌，所述核酸也可以选择性地与艰难梭菌的DNA杂交。
分离的核酸，包括SEQ ID No.3。即使存在肠道菌群中的其他细菌，所述核酸也可以选择性地与沙门氏菌的DNA杂交。
分离的核酸，包括SEQ ID No.4。即使存在肠道菌群中的其他细菌，所述核酸也可以选择性地与志贺氏菌(Shigella)的DNA杂交。
分离的核酸，包括SEQ ID No.5、或SEQ ID No.6。即使存在肠道菌群中的其他细菌，所述核酸也可以选择性地与空肠弯曲菌(Campylobacter)的DNA杂交。
分离的核酸，包括SEQ ID No.7、或SEQ ID No.8。即使存在肠道菌群中的其他细菌，所述核酸也可以选择性地与肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic E.coli,，EHEC)的DNA杂交。
分离的核酸，包括SEQ ID No.9。即使存在肠道菌群中的其他细菌，所述核酸也可以选择性地与肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA杂交。
分离的核酸，包括SEQ ID No.10。即使存在肠道菌群中的其他细菌，所述核酸也可以选择性地与鼠疫杆菌(Yersinia pestis)的DNA杂交。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、或SEQ ID No.10。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID No.1。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID No.2。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID No.3。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID No.4。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID No.5。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID No.6。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID No.7。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID No.8。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID No.9。
DNA荧光探针，其特征在于，为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID No.10。
所述荧光物质可以是罗丹明类化合物、荧光素类化合物、BODIPY类化合物、EDANS类化合物、香豆素类化合物、对甲氨基酚类化合物、花菁类化合物、吖啶类化合物、异吲哚类化合物、丹酰类化合物、氨基邻苯二甲酸酰肼类化合物、邻氨基苯甲酸类化合物、氨基邻苯二甲酰亚胺类化合物、氨基萘二甲酰亚胺类化合物、氨基苯并呋喃类化合物、氨基喹啉类化合物、Alexa Fluor类荧光染料或二氰基氢醌类化合物。优选为异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、罗丹明、罗丹明B异硫氰酸盐(RITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)、4,4’‐二异氰硫基二苯乙烯‐2,2’二磺酸(DIDS)或Alexa488。
在本发明的一个具体实施方式中，所述荧光物质为Alexa488。在本发明的一个优选实施方式中，所述Alexa488偶联在分离核酸的5’端。
肠道菌群的检测试剂盒，其特征在于，含有一种或多种DNA荧光探针，所述DNA荧光探针为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸选自SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、或SEQ ID No.10。
根据本发明，所述检测试剂盒，进一步含阳性对照探针。优选所述阳性对照探针是能结合肠道细菌共有序列的DNA探针，其3’端或5’端结合有荧光物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述阳性对照探针的序列为GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA。优选，在所述核酸序列5’端连接Alexa488荧光染料。
根据本发明，所述检测试剂盒，进一步含有用于悬浮结合了DNA荧光探针后的细菌DNA的PBS溶液。
根据本发明，所述检测试剂盒，进一步含有用于悬浮提取获得的细菌DNA的重悬液。在本发明的一个实施方式中，所述重悬液的组成为：10mM Tris‐HCl，pH 8。
根据本发明，所述检测试剂盒，进一步含有用于提取细菌DNA的试剂。
在本发明的一个优选实施方式中，用于提取细菌DNA的试剂为纳米磁珠悬浮提取核酸的试剂。在本发明的一个具体实施方式中，所述检测试剂盒进一步包含纳米磁珠悬浮提取核酸的试剂：裂解液、清洗液和磁珠；所述裂解液的组成为：500mM Tris，16mM EDTA，10mM NaCl，pH 9.0；所述清洗液的组成为：100mM Tris‐HCl，pH 7.5，1.5M LiCl，1mM EDTA；所述磁珠为表面包覆硅质膜的磁珠，优选为
Figure BDA0001703213820000041
的磁珠。
肠道菌群的检测方法，其特征在于，将细菌DNA与所述的DNA荧光探针杂交。
根据本发明，在杂交之后利用荧光流式细胞技术进行检测。
根据本发明，所述检测方法还进一步包括细菌DNA的提取操作。
在本发明的一个具体实施方式中，将提取的细菌DNA用重悬液制成混悬物，分为8等分，其中的7份分别加入针对7种细菌的DNA荧光探针，另一份加入阳性对照探针，所述DNA荧光探针和阳性对照探针的使用浓度为2‐4ug/ml，优选3ug/ml，孵育20～40分钟，优选为30分钟，PBS清洗1‐4次，优选3次，重新悬浮于PBS中。
所述阳性对照探针是能结合肠道细菌共有序列的DNA探针，其3’端或5’端结合有荧光物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述阳性对照探针的序列为GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA。优选，在所述核酸序列5’端连接Alexa488荧光染料。
在本发明的一个具体实施方式中，采用纳米磁珠颗粒悬浮提取核酸的方法提取细菌DNA。该方法中，磁珠颗粒上预先链接了核酸结合物，能在微体积(例如20ul)溶液中，快速准确地抓取细菌核酸，实现细菌DNA无损提取，避免了例如乙醇提取法等常规提取方法中细菌DNA的损失。
在本发明的一个具体实施方式中，取粪便样品，按照500ul裂解液/50‐150mg粪便样品的量，优选500ul裂解液/100mg粪便样品的量，加入裂解液混匀；将裂解产物在95～100℃下，优选97℃下，放置3～10分钟，优选5分钟后，置于冰水浴；15,000g离心3‐8min，优选5min；抽取上层溶液加入磁珠，室温下静置后，置于磁性分离架进行分离后，取出上清，加入清洗液，重新置于分离架进行分离；如此重复清洗操作1‐2次；最后磁珠重新悬浮于重悬液。
一种采用荧光流式细胞技术检测肠道菌群的方法，其特征在于，将细菌DNA与所述的DNA荧光探针杂交。
根据本发明，所述检测方法还进一步包括细菌DNA的提取操作。
在本发明的一个具体实施方式中，将提取的细菌DNA用重悬液制成混悬物，分为8等分，其中的7份分别加入针对7种细菌的DNA荧光探针，另一份加入阳性对照探针，所述DNA荧光探针和阳性对照探针的使用浓度为2‐4ug/ml，优选3ug/ml，孵育20～40分钟，优选为30分钟，PBS清洗1‐4次，优选3次，重新悬浮于PBS中。
所述阳性对照探针是能结合肠道细菌共有序列的DNA探针，其3’端或5’端结合有荧光物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述阳性对照探针的序列为GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA。优选，在所述核酸序列5’端连接Alexa488荧光染料。
在本发明的一个具体实施方式中，采用纳米磁珠颗粒悬浮提取核酸的方法提取细菌DNA。
在本发明的一个具体实施方式中，取粪便样品，按照500ul裂解液/50‐150mg粪便样品的量，优选500ul裂解液/100mg粪便样品的量，加入裂解液混匀；将裂解产物在95～100℃下，优选97℃下，放置3～10分钟，优选5分钟后，置于冰水浴；15,000g离心3‐8min，优选5min；抽取上层溶液加入磁珠，室温下静置后，置于磁性分离架进行分离后，取出上清，加入清洗液，重新置于分离架进行分离；如此重复清洗操作1‐2次；最后磁珠重新悬浮于重悬液。
本发明所选的肠道菌群均为临床常见的、致病性强、易感染的菌群，在国外均被列为医院住院必查的菌群。
艰难梭菌：是一种肠道寄生菌，在国内外医院已经爆发过多次感染疫情，抗生素不合理使用是引发艰难梭菌感染的主要诱因。艰难梭菌的主要毒性在于所产生的毒素A/毒素B。目前检测的方法为两种：产毒培养和细胞毒性试验。这两种方法均耗时长，需要的设备也比较复杂。
本发明中的SEQ ID No.1的序列如下：
tcaggagttgttaaatcgtggaaatttagctgcagcatctgacatagtaagattattagccctaaaaaattttggcggagtatatttagatgttgatatgcttccaggtattcactctg；是针对艰难梭菌毒素A的编码基因tcdA。
SEQ ID No.2的序列如下：
gataatatttacggacaagcagttgactatagcggtttagttagagtggtgaagatatatattattttggagaaacctatacaattgagact；是针对艰难梭菌毒素B的编码基因tcdB。
利用本发明的探针可特异性的标记艰难梭菌的产毒基因tcdA和/或tcdB，结合探针上的荧光物质，可准确快速的对艰难梭菌进行检测。
沙门氏菌：可以引起急性肠炎，是常见的肠道致病菌群之一，具有传染性。目前广泛使用real‐time PCR的方法进行检查，但缺乏稳定的测序序列。
本发明中的SEQ ID No.3的序列如下：
CACCGACGGCGAGACCGACTTT，是针对沙门氏菌的ttr基因。SEQ ID No.3的探针所用序列与其他序列相比，检测敏感度及准确率均有大幅度提高。
志贺氏菌：是引起痢疾的主要病菌，产生的致病原为志贺氏菌毒素。此外，志贺氏菌还产生一种特异的ipaH蛋白，对人体的免疫系统有很重要的影响。
本发明中的SEQ ID No.4的序列如下：TCGATAATGATACCGGCGCTC，是针对ipaH蛋白的DNA片段，可有效识别志贺氏菌一类的产ipaH蛋白的痢疾杆菌。
空肠弯曲菌：是人类腹泻的主要致病菌之一。空肠弯曲菌肠炎的发病率在发达国家超过细菌性痢疾，在发展中国家的发病率和细菌性痢疾相同。
本发明中的SEQ ID No.5的序列如下：tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga，是针对空肠弯曲菌的fla片段。
本发明中的SEQ ID No.6的序列如下：caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc，是针对空肠弯曲菌的hipO片段。
采用SEQ ID No.5和/或SEQ ID No.6的探针可快速、稳定地识别此类细菌，并且可以与其他的大肠杆菌属细菌区分开。
肠出血性大肠杆菌：是一种人类致病性大肠杆菌属细菌，可引起严重的食源性疾病，产生的毒素为hemolysin，主要由hly基因编码。
本发明中的SEQ ID No.7的序列为：ACGATGTGGTTTATTCTGGA，是针对肠出血性大肠杆菌的hly基因。
本发明中的SEQ ID No.8的序列为：ACACTGGATGATCTCAGTGG，是针对肠出血性大肠杆菌的stx1基因。
本发明的SEQ ID No.9的序列为：CATTCGCGATTGACCTACCATCCA，是针对肠炎弧菌的trh基因。
本发明的SEQ ID No.10的序列为：ATGCCATATATTGGACTTGCAGGCCAGT，是针对鼠疫杆菌的pla基因。
在本发明中，“荧光物质”、“荧光染料”、“荧光基团”或“荧光分子”的含义相同，可互换使用，是能够发出荧光的分子或化合物或基团，可以是本领域中已知的能够发出荧光的分子或化合物或基团，例如具有一个芳环或稠环的化合物，具有多个共轭双键的有机化合物，包括但不限于罗丹明类化合物、荧光素类化合物、BODIPY类化合物、EDANS类化合物、香豆素类化合物、对甲氨基酚类化合物、花菁类化合物、吖啶类化合物、异吲哚类化合物、丹酰类化合物、氨基邻苯二甲酸酰肼类化合物(例如鲁米诺及异鲁米诺衍生物)、邻氨基苯甲酸类化合物、氨基邻苯二甲酰亚胺类化合物、氨基萘二甲酰亚胺类化合物、氨基苯并呋喃类化合物、氨基喹啉类化合物、二氰基氢醌类化合物、Alexa Fluor类荧光染料。
在本发明中，可采用本领域已知的方法，将荧光物质偶联到核酸序列3’端或5’端的碱基上，例如：对核苷酸的5'或3'末端进行氨基修饰，巯基修饰或羧基修饰等，将能与所述氨基、巯基或羧基进行反应的荧光物质偶联到相应的修饰基团上。
在本发明中，可采用本领域中已知的各种提取细菌DNA的方法提取肠道细菌DNA，例如：CTAB法、SDS法、融法、煮沸法、碱解法、ROSE法等方法裂解菌体提取DNA，或者进一步采用酚、氯仿、异戊醇、乙醇等纯化DNA；或者采用各种商业化的基因组提取试剂盒；或者采用纳米磁珠颗粒悬浮提取核酸的方法。考虑到临床检验的大量样本检测的工作量，优选使用高质量、高产量和适用于高通量检测的纳米磁珠悬浮提取核酸的方法。所述纳米磁珠或配套的试剂盒均可商业购买获得，例如Promega、Roche、KingFisher、Dynal、Qiagen、海狸纳米、洛阳惠尔纳米、上海奥润微纳、长春博坤生物、上海百运纳米等厂家的产品。
在本发明中，如无特殊说明，核酸序列都是从5’端到3’端的顺序。
本发明的有益效果：
本发明通过设计独特且结合力高的DNA探针序列，实现了准确可靠的识别目标菌群的目的。
另外，通过荧光标记探针，直接使用荧光流式细胞技术检测，避免了PCR扩增、电泳或杂交检测等复杂的步骤，实现了快速检测的目的。
进一步，如果采用纳米磁珠提取细菌DNA，则可以采用本发明的方法，直接检测已经连接于磁珠上的细菌DNA，而无需洗脱磁珠，精简了操作步骤，更加省时高效。
附图说明
图1荧光流式细胞技术检测设门方式
图2被检品和阴性对照的荧光流式细胞技术检测结果柱状图
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。
实施例1、制备DNA荧光探针：
按照SEQ ID No.1～SEQ ID No.10的核酸序列，采用本领域已知的核酸序列合成方法，制备出SEQ ID No.1～SEQ ID No.10的分离的核酸。
按照本领域已知的偶联方法，将Alexa488荧光染料偶联到SEQ ID No.1～SEQ IDNo.10的每个分离核酸的5’端。
为便于描述，以下实施例中将本实施例合成的DNA荧光探针命名如下：
Figure BDA0001703213820000091
实施例2、检测粪便样品
为证实探针和检测方法的可行性，将适量的7种细菌混入临床采集的粪便中，制成实验样品。
1.用棉签挑取100mg粪便样品放入无菌试管中，加入裂解液500ul，充分震荡摇匀。将裂解产物97℃5分钟，然后置于冰水浴。15,000g离心5min。小心抽取上层棕色溶液，转移至无菌试管中。裂解液的组成为：500mM Tris，16mM EDTA，10mM NaCl，pH 9.0。
2.样品加入充分混合均匀的400ul dynabeads DNA direct(Invitrogen)，室温静置5分钟，置于磁性分离架2分钟，小心吸取上清。将样品取下分离架，加入清洗液400ul，重新置于分离架。重复清洗3次。最后磁珠重新悬浮于400ul重悬液。清洗液的组成为：100mMTris‐HCl，pH 7.5，1.5M LiCl，1mM EDTA。重悬液的组成为：10mM Tris‐HCl，pH 8。
3.将混悬物分为8等分，其中7份分别加入针对所述7种细菌的DNA荧光探针，一份加入阳性对照探针，探针使用浓度为3ug/ml，孵育30分钟，PBS清洗3次，重新悬浮于200ul的PBS中。
同时制备阴性对照，为空白磁珠，清洗液清洗，分为8等分，与样品同样方法对应加入DNA探针。
以下是检测样品的成分列表：
Figure BDA0001703213820000101
其中阳性对照探针为针对肠道菌群16s rDNA的探针，序列为GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA，在5’端连接Alexa488荧光染料。
4.利用台式单色荧光流式细胞仪(JIMBIO FIL)在绿光区检测上述样品，使用488nm的发射光。
结果：空白磁珠用FSC和SSC(A)设门，磁珠‐荧光探针复合物用面积(FITC‐A)和SSC散点(B)设门，如附图1所示。
检测结果用柱状图显示，如附图2所示，每一张图中深色的代表阴性对照，浅色的代表被检样品，A‐P的编号对应于上表的样品编号。
由结果可见，采用本发明的DNA荧光探针结合荧光流式细胞技术可以检测出粪便样品中含有的7种菌，证明本发明的探针和检测方法可行。
从本实施例可见，利用本发明的DNA荧光探针结合荧光流式细胞技术，只采样100mg粪便，即可检测出粪便中是否含有被检的7种细菌，样品使用量少，检测步骤少，灵敏而特异。
序列表
<110> 李莉
<120> 肠道菌群的荧光检测试剂盒
<130> CPCN18410540
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
tcaggagttg ttaaatcgtg gaaatttagc tgcagcatct gacatagtaa gattattagc 60
cctaaaaaat tttggcggag tatatttaga tgttgatatg cttccaggta ttcactctg 119
<210> 2
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
gataatattt acggacaagc agttgactat agcggtttag ttagagtggt gaagatatat 60
attattttgg agaaacctat acaattgaga ct 92
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
caccgacggc gagaccgact tt 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
tcgataatga taccggcgct c 21
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
tgtgaaagaa tttatcctaa agatgagcaa ggaga 35
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
caaagcatag tatctcgcaa tgttgatccc c 31
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
acgatgtggt ttattctgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
acactggatg atctcagtgg 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 9
cattcgcgat tgacctacca tcca 24
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 10
atgccatata ttggacttgc aggccagt 28

Claims (8)

1.10种DNA荧光探针在制备利用荧光流式细胞技术检测粪便中肠道菌群的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述DNA荧光探针为3’端或者5’端的碱基上偶联有荧光物质的分离的核酸，所述分离的核酸的序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10；所述检测试剂盒进一步含阳性对照探针，所述阳性对照探针3’端或5’端结合有荧光物质，所述阳性对照探针的序列为GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA；所述试剂盒进一步含有用于提取细菌DNA的试剂，所述试剂为纳米磁珠悬浮提取核酸的试剂；采用纳米磁珠颗粒悬浮提取核酸的方法提取粪便的细菌DNA，所述的DNA荧光探针与提取自粪便的细菌DNA杂交，在杂交之后利用荧光流式细胞技术检测，所述的肠道菌群是艰难梭菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠杆菌、肠炎弧菌和鼠疫杆菌。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的荧光物质为Alexa488。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的荧光物质偶联在分离核酸的5’端。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在所述阳性对照探针核酸序列5’端连接Alexa488荧光染料。
5.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒进一步含有用于悬浮结合了DNA荧光探针后的细菌DNA的PBS溶液。
6.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒进一步含有用于悬浮提取获得的细菌DNA的重悬液，所述重悬液的组成为：10 mM Tris-HCl，pH 8。
7.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒进一步包含的纳米磁珠悬浮提取核酸的试剂：裂解液、清洗液和磁珠；所述裂解液的组成为：500 mM Tris，16mM EDTA，10 mM NaCl，pH 9.0；所述清洗液的组成为：100 mM Tris-HCl，pH 7.5，1.5 MLiCl，1 mM EDTA；所述磁珠为表面包覆硅质膜的磁珠。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述磁珠为Dynabeads的磁珠。
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