ES2673276T3 - Métodos para el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal - Google Patents

Métodos para el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal Download PDF

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Abstract

Un método para diagnosticar la enfermedad inflamatoria intestinal, la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa en un sujeto humano que comprende las etapas de: - medir un nivel de uno o más bacterias productoras de H2S en una muestra de microbiota intestinal del sujeto humano, en donde las una o más bacterias productoras de H2S se seleccionan entre Fusobacterium nucleatum, Veillonella parvula, y Atopobium parvulum, y - comparar el nivel de las uno o más bacterias productoras de H2S con un nivel de referencia de las una o más bacterias productoras de H2S de muestras de microbiota intestinal de sujetos humanos sanos, en donde un nivel de una o más bacterias productoras de H2S más alto que el nivel de referencia es indicativo de enfermedad.

Description

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DESCRIPCION
Métodos para el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal Campo técnico
Esta invención se refiere en general a métodos para el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII).
Antecedentes
Una asociación intricada y esencial se establece temprano en la vida entre el anfitrión y el microbioma intestinal, asegurando el mantenimiento de la homeostasis de la microbiota. La alteración de esta asociación a menudo se asocia con diversas afecciones patológicas, incluyendo las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) (Cho, I. & Blaser, M. J. The human microbiome: at the interface of health and disease. Nature reviews. Genetics 13, 260-270, doi:10.1038/nrg3182 (2012)). La microbiota de pacientes con EII se caracteriza por una disminución de la prevalencia de microorganismos protectores (es decir, grupos Clostridium IXa y IV) y una expansión de bacterias perjudiciales (es decir, Enterobacteriaceae/Escherichia coli) (Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F. y Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology 9, 599-608,
doi:10.1038/nrgastro.2012.152 (2012).
La enfermedad inflamatoria intestinal abarca dos afecciones principales: colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC). Algunos pacientes tienen características de ambos subtipos y se clasifican como EII indefinida (EII-I) (Gastroenterology, 2007. 133(5): pág. 1670-89). La CU se define por la inflamación continua de la mucosa que comienza en el recto y se restringe al colon, mientras que la inflamación por EC puede ocurrir en cualquier parte del tracto gastrointestinal, afecta al espesor total de la pared intestinal y a menudo con lesiones salteadas (Gastroenterol Clin North Am, 2009. 38(4): pág. 611-28; Gastroenterology, 2007. 133(5): pág. 1670-89). Los intentos recientes para encontrar nuevos marcadores para los subtipos de EII, tales como anticuerpos convencionales, han tenido un desempeño muy pobre en la diferenciación de la EC colónica frente a la CU. Puesto que los tratamientos y las respuestas a las terapias médicas difieren entre EC y CU (J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2010, S1-S13. The American journal of gastroenterology, 2011. 106 Supl 1: pág. S2-25; cuestionario S26. Gastroenterol Clin North Am, 2009. 38(4): p. 611-28) existe una necesidad urgente de biomarcadores para diferenciar entre EC y CU.
La herramienta principal utilizada tanto para el diagnóstico como para el tratamiento de la EII es la endoscopia (World J Gastrointest Endosc, 2012. 4(6): pág. 201-11). La endoscopia permite tanto la visualización de la mucosa como el acceso a las biopsias de la mucosa para diagnosticar la enfermedad, definir la extensión y la actividad de la enfermedad, y controlar la progresión de la enfermedad. La precisión diagnóstica de la colonoscopia oscila entre 60 y 74% (J Clin Pathol, 2002. 55: pág. 955-60). El diagnóstico preciso y precoz es esencial para el manejo adecuado de la enfermedad. El objetivo del tratamiento de la EII es llevar la enfermedad activa a la remisión y prevenir la recaída de seguimiento (brotes). La elección del tratamiento depende del tipo de enfermedad (EC versus CU), la ubicación de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad, las complicaciones de la enfermedad y factores individuales del anfitrión (p.ej., el estado nutricional y de crecimiento, el estado puberal, la edad y el tamaño del niño, alergias medicamentosas) (J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2010, S1-S13. The American journal of gastroenterology, 2011. 106 Supl 1: pág. S2-25; cuestionario S26. Gastroenterol Clin North Am, 2009. 38(4): pág. 611-28). Las terapias farmacológicas actuales consisten en aminosalicilatos, inmunomoduladores, corticosteroides, antibióticos y terapias biológicas (es decir, anticuerpos monoclonales anti-TNF [alfa]). El régimen terapéutico óptimo para mantener un estado libre de enfermedad aún no se ha determinado y la eficacia de estos fármacos difiere significativamente entre EC y CU (J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2010, S1-S13. The American journal of gastroenterology, 2011. 106 Suppl 1: pág. S2-25; cuestionario S26. Gastroenterol Clin North Am, 2009. 38(4): pág. 611-28). Por ejemplo, los medicamentos del ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) son moderadamente eficaces para inducir la remisión y prevenir la recaída en la CU de leve a moderadamente activa, mientras que no se recomiendan en el manejo de la EC activa (The American journal of gastroenterology, 2011. 106 Supl 1: pág. S2-25; cuestionario S26). El metotrexato es una prueba evidente para el uso como terapia de mantenimiento para prevenir la recaída en la EC, sin embargo, no hay evidencia de su uso en la CU (The American journal of gastroenterology, 2011. 106 Supl 1: pág. S2-25; cuestionario S26). Cada vez se reconoce que se requieren mayores dosis de terapias anti-TNFa a intervalos más frecuentes para el tratamiento satisfactorio de la CU grave en comparación con los protocolos de tratamiento convencionales en uso para la EC. Un tercio del coste asociado con la EII se debe a terapias médicas (CCFC. 2008, informe. pag. 1-101) enfatizando la importancia económica de un tratamiento eficaz y por lo tanto un diagnóstico preciso.
Si bien se desconoce la etiología de la EII, la microbiota intestinal está emergiendo como un actor clave en el desarrollo y/o cronicidad de la enfermedad. Los estudios genómicos de asociación amplia en pacientes adultos y pediátricos han identificado nuevos genes asociados a la EII, pero solo definen 25% del riesgo genético de desarrollar EII y, salvo para lactantes muy pequeños (es decir, <2 años de edad), no se han descubierto genes únicos que definan la EII pediátrica a partir de la EII de inicio en el adulto. La EII es una enfermedad poligénica compleja que implica múltiples loci de genes de riesgo (Nature genetics, 2008. 40(8): p. 955-62. Nature genetics, 2009. 41(12): pág. 1335-40. Nature genetics, 2010. 42(4): pág. 332-7). Estos loci codifican genes implicados en la
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inmunidad innata y adaptativa, la autofagia y el mantenimiento de la integridad de la barrera epitelial para aquellos genes que tienen una función conocida. Si bien estos estudios han demostrado a los autores de la presente invención que múltiples vías están involucradas en la patogénesis de la EII, éstos siguen ignorando sorprendentemente las causas raíz y la patogénesis de la EII. Una hipótesis predominante es que el desarrollo de la EII es una consecuencia de anomalías funcionales en la interacción entre la microbiota intestinal y el anfitrión (World journal of gastroenterology: WJG, 2011. 17(5): pág. 557-66). Algunas de las mejores pruebas de que la microbiota intestinal desempeña un papel clave en la EII proviene de estudios con modelos animales (World journal of gastroenterology : WJG, 2011. 17(5): p. 557-66. Cell, 2007. 131(1): pág. 33-45. Inflamm Bowel Dis, 2007. 13(12): pág. 1457-66). Aunque los modelos animales experimentales de EII no imitan exactamente a la EII humana, estos estudios han demostrado que el desarrollo de la enfermedad depende de la presencia de bacterias residentes (Cell, 2007. 131(1): pág. 33-45. Inflamm Bowel Dis, 2007. 13(12): pág. 1457-66). Se demostró que la pérdida del factor transcripcional T-bet en ratones, que regula la diferenciación y la función de las células del sistema inmunitario, promueve que la microbiota se vuelva colitogénica. Además, la colitis inducida podría transmitirse a otros anfitriones genéticamente intactos mediante transferencia vertical de la microbiota colitogénica (Cell, 2007. 131(1): pág. 33-45). Numerosos estudios han revelado alteraciones en la composición de la microbiota intestinal de pacientes con EII (Proc Natl Acad Sci USA, 2007. 104(34): pág. 13780-5. (9) Nature, 2010. 464(7285): pág. 59-65. (10) Cell, 2012. 148(6): pág. 1258-70; World journal of gastroenterology : WJg, 2011. 17(5): p. 557-66). Sin embargo, los autores de la presente invención desconocen qué desencadena la EII y la disbiosis de la microbiota intestinal resultante y solo tienen una comprensión rudimentaria de la interacción entre la microbiota intestinal y el anfitrión. Claramente, los estudios que siguen longitudinalmente la disbiosis de la microbiota intestinal en seres humanos durante los brotes y las remisiones podrían contribuir a una comprensión importante de la trascendencia clínica de la composición de la microbiota intestinal.
Los síntomas de la EII pueden incluir diarrea con sangre, dolor abdominal, calambres, fatiga, diversas deficiencias nutricionales incluyendo anemia por deficiencia de hierro, problemas de salud ósea y pérdida de peso (Archives of disease in childhood, 2006). En los niños, el crecimiento lineal deficiente también es común. La aparición de los síntomas es lenta, indolente y no específica, por lo que la enfermedad puede estar presente en ciertas regiones del intestino durante períodos de tiempo muy largos antes del diagnóstico. Después del diagnóstico, esta enfermedad crónica de por vida se caracteriza por episodios de brote y remisión (estado quiescente, sin síntomas) (Gastroenterol Clin North Am, 2009. 38(4): pág. 611-28; Archives of disease in chilhood, 2006). Los tratamientos terapéuticos actuales pretenden detener la inflamación de la mucosa a fin de mantener el período de quiescencia y reducir los brotes para reducir el daño intestinal permanente y aliviar las complicaciones de la enfermedad. Los corticosteroides (prednisona) siguen siendo el pilar del tratamiento de la EII, a pesar de los conocidos efectos secundarios de este medicamento (Journal of Crohn's & colitis, 2012. 6(4): pág. 492-502). Alternativamente, la nutrición enteral (NE) se utiliza con mayor frecuencia como terapia primaria en lugar de prednisona para inducir la remisión de le EC (Current opinion in clinical nutrition and metabolic care, 2011. 14(5): pág. 491-6). Sin embargo, es más difícil para la mayoría de los pacientes adherirse a estos protocolos que implican fórmulas enterales solas sin ingerir alimentos durante muchas semanas a la vez. Es evidente que la composición de la microbiota se correlaciona con la enfermedad y que una microbiota "anormal" contribuye a (si no desencadena) alteraciones de la mucosa y disfunciones del sistema inmunitario (World journal of gastroenterology: WJG, 2011. 17(5): pág. 557-66). De ello se desprende que las intervenciones destinadas a restablecer el equilibrio de la microbiota podrían promover la salud y/o prevenir los brotes. Además, dado que cada paciente tiene una composición única de microbiota intestinal, se deduce que cualquier intervención destinada a manipular la microbiota intestinal debería ser preferiblemente específica de la enfermedad y del paciente.
En vista de lo anterior, existe la necesidad de mejores ensayos de diagnóstico y tratamientos para el manejo de la EII.
Compendio
Se proporcionan ensayos y métodos para diagnosticar y tratar la EII así como para clasificar las muestras intestinales en muestras de EII, CU o EC. También se proporciona un dispositivo para clasificar las muestras intestinales en muestras de EII, CU o EC.
En una realización, se proporciona un ensayo que comprende las etapas de medir un nivel de proteobacterias o bacterias productoras de H2S o ambas en una muestra de microbioata intestinal de un ser humano para identificar la probabilidad de que el sujeto humano tenga enfermedad inflamatoria intestinal (EII), y comparar el nivel de proteobacterias o bacterias productoras de H2S o ambas con un nivel de referencia de proteobacteria o bacterias productoras de H2S o ambas a partir de muestras de microbiota intestinal de sujetos humanos sanos, en donde un nivel de proteobacterias o bacterias productoras de H2S o ambas por encima del nivel de referencia es indicativo de enfermedad.
En otra realización, se proporciona un ensayo que comprende las etapas de medir un nivel de A. parvulum en una muestra de microbiota intestinal de un sujeto humano para identificar la probabilidad de que el sujeto humano tenga EII, y comparar el nivel de A. parvulum con un nivel de referencia de A. parvulum de muestras de microbiota intestinal de sujetos humanos sanos, en donde un nivel de A. parvulum más alto que el nivel de referencia es indicativo de enfermedad.
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En una realización adicional, se proporciona un ensayo que comprende las etapas de medir un nivel de bacterias productoras de butirato en una muestra de microbiota intestinal de un sujeto humano para identificar la probabilidad de que el sujeto humano tenga EII, y comparar el nivel de bacterias productoras de butirato con un nivel de referencia de bacterias productoras de butirato a partir de muestras de microbiota intestinal de sujetos humanos sanos, en donde un nivel de bacterias productoras de butirato inferior al nivel de referencia es indicativo de enfermedad.
Ventajosamente, la invención proporciona un método para distinguir entre pacientes con CU o EC.
En otra realización adicional, se proporciona un ensayo para determinar la gravedad de la enfermedad EC que comprende medir un nivel de uno o más taxones bacterianos seleccionados entre Carnobacteriaceae, Granulicatella, Mogibacterium, Proprionibacterium, Bacillaceae y Atopobium en una muestra de microbiota del intestino del sujeto humano en donde un nivel superior a un nivel predeterminado es indicativo de una inflamación moderada o grave.
Se proporciona adicionalmente un ensayo que comprende las etapasl de medir un nivel de sulfodioxigenasa (ETHE1), tiosulfato sulfotransferasa (TST), subunidad IV de citocromo c oxidasa, sulfuro deshidrogenasa (SQR) y complejos III y IV de la cadena respiratoria mitocondrial en una muestra de moco intestinal de un sujeto humano para identificar la probabilidad de que el sujeto humano tenga EII, y en donde un nivel inferior con respecto a un nivel de referencia de un sujeto sano es indicativo de enfermedad.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar la EII en un paciente, comprendiendo el método: realizar un ensayo para determinar la presencia de enfermedad (EII o CU o EC) y administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto seleccionado entre aminosalicilatos, inmunomoduladores, anti- integrinas, anti-citocinas, programas de alimentación enteral, esteroides, corticosteroides, antibióticos, anti-TNFa, bismuto o una combinación de los mismos.
Estas y otras realizaciones de la descripción se describen adicionalmente a continuación con referencia a los Dibujos y la Descripción Detallada.
Breve descripción de los dibujos
La invención se comprende mejor por medio de la siguiente descripción detallada de realizaciones de la invención con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 A es un PLS-DA de pacientes con EC con inflamación severa (n = 23) contra pacientes con EC con inflamación leve (n = 9), para confirmar la validación de los modelos PLS-DA, se realizaron pruebas de permutación (n = 1000) y se calculó el valor p correspondiente para la precisión de la predicción.
La Figura 1 B es un análisis biplot de los dos primeros componentes del modelo PLS-DA en el panel A que muestra los taxones significativos en relación con la actividad de la enfermedad (flechas).
La Figura 1 C es un gráfico que muestra la Abundancia de A. parvulum con respecto a las bacterias totales determinada mediante PCR cuantitativa en función de la severidad de EC (n = 13 para controles y EC severa, n = 6 para EC leve y moderada, comparación estadística mediante prueba de Kruskal-Wallis, los rombos indican mínimo o máximo; las cruces indican la media; las barras horizontales indican la mediana).
La Figura 2 A es una fotomicrografía que muestra el ciego y el colon de ratones M10_/“ gnotobióticos que estaban asociados o no con A. parvulum.
La Figura 2 B es una fotomicrografía que muestra la inflamación controlada macroscópicamente con un endoscopio murino.
La Figura 2 C es una fotomicrografía que muestra secciones histológicas representativas del colon y el ciego distales.
La Figura 2 D es un gráfico que muestra una puntuación histológica ciega de inflamación (n = 6 a 7 por grupo, las líneas horizontales indican la media y las cruces indican la mediana; comparación mediante la prueba de dos colas de Mann-Whitney).
La Figura 3 A es un análisis funcional de anotación ("componente celular") de las proteínas expresadas diferencialmente; se muestran los 10 grupos funcionales más significativamente enriquecidos (términos GO) (P < 10' 13); los asteriscos denotan clasificaciones que fueron significativamente enriquecidas en comparación con el conjunto completo de datos proteómicos, *P < 0,05 y ***P < 0,001 (prueba exacta de Fisher).
La Figura 3 B es un análisis PLS-DA de pacientes con EC en función de la actividad de la enfermedad y los controles (se realizó la validación externa de 10 veces del modelo en conjuntos de validación retenidos separados de 5 muestras seleccionadas al azar que muestran una precisión de predicción de 75%).
La Figura 3 C es un análisis qRT-PCR de TST normalizado para el control, n = 5 para CU, 13 a 15 para EC y 10 a 15
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para controles Ns, la significación estadística no significativa se evaluó utilizando una prueba de Mann-Whitney de dos colas.
La Figura 3 D es un análisis qRT-PCR de la subunidad citocromo c oxidasa IV (hCOX41) normalizado para el control, n = 5 para CU, 13 a 15 para EC y 10 a 15 para controles Ns, la significación estadística no significativa se evaluó utilizando una Prueba de Mann-Whitney de dos colas.
La Figura 3 E es un análisis de qRT-PCR de sulfuro deshidrogenasa (SQR) normalizado para el control, n = 5 para CU, 13 a 15 para EC y 10 a 15 para controles Ns, la significación estadística no significativa se evaluó utilizando una prueba de Mann-Whitney de dos colas.
La Figura 4 A son endoscopias murinas representativas de ratones M10_/" asociados o no con A. parvulum, tratados o no con bismuto y mantenidos bajo condiciones SPF durante 6 semanas.
La Figura 4 B son puntuaciones de inflamación ciegas (n = 7 a 8 por grupo) para ratones M10_/" bajo condiciones de SPF, las líneas horizontales indican las medias y las cruces indican la mediana. La significación estadística se evaluó utilizando una prueba de Kruskal-Wallis con una prueba post hoc de Dunn utilizando el procedimiento Conover-Iman.
La Figura 4 C es un gráfico del número de focos GALT de ratones N10'/' asociados o no con A. Parvulum y tratados o no con bismuto, y mantenidos bajo condiciones gnotobióticas o SPF (n = 6 a 11 por grupo), las líneas horizontales indican que las medias y las cruces indican la mediana. La significación estadística se evaluó utilizando una prueba de Kruskal-Wallis con una prueba post hoc de Dunn.
La Figura 4 D son secciones representativas histológicas del colon sometidas a la técnica "Swiss-roll" que muestran los focos GALT en ratones gnotobióticos, las flechas indican los focos GALT.
La Figura 4 E es un análisis PCA de la microbiota de ratones M10'/' mantenidos bajo condiciones SPF (azul claro), tratados con bismuto (azul), asociados con A. Parvulum (rojo), y asociados con A. parvulum y tratados con bismuto (verde).
La Figura 5 A es un gráfico del tamaño del núcleo de la microbiota de sujetos de control y pacientes con EC y CU; (UTO: unidad taxonómica operativa).
La Figura 5 B es un árbol filogenético de los taxones microbianos detectados en al menos el 75% de las muestras dentro de cada grupo en donde se detectaron un total de 241 UTO núcleo, que representan 90,2% ± 8,3% de la población microbiana, la cifra fue generada utilizando el programa de la red ítOl (Interactive Tree of Life) en el que los taxones marcados con círculo interno se identificaron como miembros del núcleo de la microbiota de los sujetos de control, los taxones marcados con círculos medios y externos se identificaron como miembros del núcleo microbiota de los pacientes con CU o EC respectivamente. Las comunidades microbianas de EC y CU se caracterizan por un núcleo de la microbiota más pequeño en comparación con el control con 179, 172 y 214 núcleos UTO para EC, CU y sujetos control, respectivamente.
La Figura 6 A representa la abundancia relativa promedio de phyla bacterianos identificados en pacientes con enfermedad de Crohn (EC, n = 9) y colitis ulcerosa (CU, n = 8) y sujetos de control (n = 9); se obtuvieron perfiles similares con las lecturas generadas utilizando secuenciación Hiseq2500.
La Figura 6 B representa el cambio en la abundancia relativa de Proteobacterias (media ± ETM) en controles, pacientes con EC y CU; se aplicó la prueba de dos colas de Mann-Whitney para la comparación estadística por pares.
La Figura 7 A representa las abundancias relativas de los taxones bacterianos obtenidos del análisis de las lecturas de pirosecuenciación 454 que se analizaron mediante análisis de discriminación lineal (LDA) seguido de una prueba de Mann-Whitney-Wilcoxon para evaluar el tamaño del efecto utilizando LEfSe; histograma de la puntuación del tamaño del efecto LDA para taxones diferencialmente abundantes específicos de EC (n = 9 para EC y controles).
La Figura 7 B es un histograma de la puntuación del tamaño del efecto LDA para taxones diferencialmente abundantes específicos de CU (n = 9 para control y n = 8 para CU), como se muestra en el panel A, Atopobium fue identificado como un biomarcador de EC; se recuperaron lecturas de pirosecuenciación 454 asignadas como Atopobium por el análisis QIIME y se encontró que coincidían con A. Parvulum siguiendo el alineamiento de las lecturas con las bases de datos RDB y NCBI (la región alineada cubría la longitud completa de la secuencia 454 con >99% de identidad de secuencia para A. Parvulum y no se alineó con ninguna otra especie bacteriana conocida).
La Figura 8 A es un análisis de anotación funcional de las proteínas expresadas diferencialmente para PB: procesos biológicos en los que se muestran los 10 grupos funcionales más significativamente enriquecidos (términos GO) (p <10'1~); todas las clasificaciones se enriquecieron significativamente en comparación con el conjunto completo de datos proteómicos con P < 0,05 (prueba exacta de Fisher).
La Figura 8 B es un análisis de anotación funcional de las proteínas expresadas diferencialmente para FM: funciones
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moleculares en las que se muestran los 10 grupos funcionales más enriquecidos (términos GO) (p <10-13); todas las clasificaciones se enriquecieron significativamente en comparación con el conjunto completo de datos proteómicos con P < 0,05 (prueba exacta de Fisher).
La Figura 8C es un análisis de anotación funcional de las proteínas expresadas diferencialmente para las vías KEGG en las que se muestran los 10 grupos funcionales más significativamente enriquecidos (términos GO)
(p < 10-13); todas las clasificaciones se enriquecieron significativamente en comparación con el conjunto completo de datos proteómicos con P < 0,05 (prueba exacta de Fisher).
La Figura 9 A es un análisis PLS-DA de los perfiles de proteínas mitocondriales clasificados como pacientes con EC (negro) y sujetos control (gris), el modelo se calculó en base a las 95 proteínas mitocondriales expresadas diferencialmente como se determina mediante una prueba ANOVA y seleccionando las proteínas con el término GO correspondiente (utilizando el programa de anotación GO funcional DAVID), se obtuvo un modelo PLS-DA aceptable con 2 componentes (parámetro de capacidad predictiva [Q2 cum] = 0,77, parámetro de bondad de ajuste [R2Y cum] = 0,92).
La Figura 9 B es un análisis PLS-DA de las 96 proteínas mitocondriales expresadas diferencialmente de pacientes con EC clasificados como una función de la actividad de la enfermedad (leve, moderada y grave), se generó un modelo robusto con buen poder predictivo con cuatro componentes (parámetro de capacidad predictiva [Q2 cum] = 0,44, parámetro de bondad de ajuste [R2Y cum] = 0,94).
La Figura 10 es un modelo de catabolismo de H2S mitocondrial donde la sulfuro deshidrogenasa (SQR) unida a la membrana oxida el sulfuro (H2S) a persulfuro (formado en una de las cisteínas de SQR; SQR-SSH), los electrones se transfieren a la cadena respiratoria mitocondrial (complejo citocromo c oxidasa III y IV) a través del conjunto quinona (Qox/Qred), la sulfodioxigenasa, ETHE1, oxida persulfuros a sulfitos (H2SO3) en la matriz mitocondrial, la rodanasa (azufre trans) cataliza la reacción final, que produce tiosulfito (H2S2O3) transfiriendo un segundo persulfuro del SQR al sulfito, se requiere la subunidad IV de la citocromo c oxidasa (COX-IV) para el ensamblaje de la citocromo c oxidasa, la rodanasa comprende dos isoenzimas: tiosulfato sulfotransferasa (TST) y mercaptopiruvato sulfotransferasa (MST).
La Figura 11 A es un gráfico de la expresión de citocina Cxcl1 en el ratones II10"/" convencionalizado (ratones
129/SvEv II10"/", medida mediante qRT-PCR, que se asociaron o no con A. Parvulum y se mantuvieron bajo
condiciones SPF (n = 7 a 8 por grupo), se extrajo ARN total de los tejidos intestinales del colon 6 semanas después de la asociación y se realizó una prueba U de Mann-Whitney para evaluar la significación estadística, las líneas horizontales indican la media y las barras de error la DT, ns, no significativo.
La Figura 11 B es un gráfico de la expresión de la citocina II-17 en ratones II10 "/' convencionalizados (ratones
129/SvEv II10'-'), medida mediante qRT-PCR, que se asociaron o no con A. Parvulum y se mantuvieron bajo
condiciones SPF (n = 7 a 8 por grupo), se extrajo ARN total de los tejidos intestinales del colon 6 semanas después de la asociación y se realizó una prueba U de Mann-Whitney para evaluar la significación estadística, las líneas horizontales indican la media y las barras de error la DT, ns, no significativo.
La Figura 11 C es un gráfico de la expresión de la citocina II-12 en ratones II10'-' convencionalizados (ratones 129/SvEv II10'-'), medida mediante qRT-PCR, que se asociaron o no con A. Parvulum y se mantuvieron bajo condiciones SPF (n = 7 a 8 por grupo), se extrajo ARN total de los tejidos intestinales del colon 6 semanas después de la asociación y se realizó una prueba U de Mann-Whitney para evaluar la significación estadística, las líneas horizontales indican la media y las barras de error la DT, ns, no significativo.
La Figura 11 D es un gráfico de la expresión de la citocina II1p en ratones M10'/' convencionalizados (ratones 129/SvEv N10'/'), medida mediante qRT-PCR, que se asociaron o no con A. parvulum y se mantuvieron bajo condiciones SPF (n = 7 a 8 por grupo), se extrajo el ARN total de los tejidos intestinales del colon 6 semanas después de la asociación y se realizó una prueba U de Mann-Whitney para evaluar la significación estadística, las líneas horizontales indican la media y las barras de error la DT, ns, no significativo.
La Figura 12 A es una puntuación de hiperplasia de ratones 129/SvEv M10'/' mono-asociados o no con A. Parvulum y tratados o no con bismuto mantenido bajo condiciones gnotobióticas (n = 6 a 11 por grupo), las barras de error indican DT.
La Figura 12 B representa los niveles de ADN cromosómico extraído de los sedimentos de heces obtenidos 6 semanas después de la mono-asociación o no de ratones 129/SvEv N10'/' con A. parvulum, el nivel de colonización se estimó utilizando qPCR en tiempo real y fue referido como el número de copias del gen de ADNr 16S por mg de heces, las barras de error indican ETM, para los paneles A y B, las líneas horizontales indican las medias. La significación estadística se evaluó utilizando una prueba U de Mann-Whitney.
La Figura 13 muestra la cuantificación relativa del gen de butiril-CoA:CoA transferasa (BCoAT) utilizando qPCR. BCoAT se cuantificó a partir de muestras de control y de EII. Las muestras de EC y CU se subclasificaron como normales e inflamadas en función del aspecto del colon durante la toma de las muestras. El resultado se expresa
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10
15
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25
30
35
40
45
50
como el número de genes BCoAT por el gen de ARNr 16S. Las barras de error representan el error típico de la media.
La Figura 14 A muestra la diversidad de bacterias productoras de butirato. Número de unidades taxonómicas operacionales observadas (UTO) de la secuenciación de BCoAT al 95% de similitud de secuencia.
La Figura 14 B muestra la diversidad alfa representada por las UTO estimadas de Chao1 (panel izquierdo) y el índice de diversidad de Shannon (panel derecho). El número de lecturas se igualó entre muestras a 4.600 lecturas. Control (barra azul), EC (barra roja) y CU (barra naranja).
La Figura 14 C muestra la diversidad Beta presentada por el gráfico de análisis de coordenadas principales (PCoA) bidimensional de la distancia UniFrac ponderada. El gráfico de la izquierda representa la diversidad beta de los pacientes del grupo de control y del EC, y el gráfico de la derecha muestra el grupo control y la diversidad beta de los pacientes con CU. El porcentaje de varianza explicado por cada componente se presenta debajo de cada eje. Muestras de control (cuadrados verdes), muestras de EC (triángulos rojos) y muestras de CU (círculos azules).
La Figura 15 A-D muestra las bacterias productoras de butirato identificadas a nivel de especie utilizando la secuenciación BCoAT. (A-C) Gráficos circulares de abundancia relativa de productores de butirato en cada grupo combinado. (A) Grupo de control, (B) pacientes con EC y (C) pacientes con CU. (D) Abundancia relativa de productores de butirato en muestras individuales. Cada barra apilada representa un sujeto.
La Figura 16 A-F muestra las especies de productores de butirato con abundancia diferencial en la EII. (A-F) abundancia relativa de Eubacterium rectale, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia inulinivorans, UTO totales sin clasificar, OUT_34 sin clasificar y OUT_43 sin clasificar; respectivamente. Cada barra representa la abundancia relativa promedio en un grupo. Las barras de error representan el error típico de la media. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P< 0,001.
La Figura 17 A - D muestra los géneros de productores de butirato identificados por la región hipervariable V6 de la secuenciación del ARNr 16S. (A-C) Gráficos circulares de abundancia relativa de productores de butirato en cada grupo combinado. (A) Grupo de control, (B) pacientes con EC y (C) pacientes con CU. (D) Abundancia relativa de productores de butirato en muestras individuales. Cada barra apilada representa un sujeto.
La Figura 18 A-F muestra el análisis cuantitativo de PCR de productores clave de butirato. Eubacterium rectale y Faecalibacterium prausnitzii fueron cuantificados utilizando BCoAT y cebadores de ARNr 16S. Roseburia se cuantificó utilizando cebadores de ARNr 16S. (A-E) representan el ACt de productores de butirato dirigidos con respecto a ARNr 16S bacteriano total. (F) Ct para ARNr 16S bacteriano total es similar entre grupos. Las barras de error representan el error típico de la media. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; ****, P < 0,0001.
La Figura 19 A muestra el análisis de PCR cuantitativa de Faecalibacterium prausnitzii de muestras de heces. Faecalibacterium prausnitzii se cuantificó utilizando cebadores de ARNr 16S, abd representa ACt de F. prausnitzii con respecto al ARNr 16S bacteriano total.
La Figura 19 B muestra que Ct para ARNr 16S bacteriano total es similar entre grupos. Las barras de error representan el error típico de la media.
Descripción detallada
En la presente descripción por microbiota se quiere significar un conjunto de microorganismos que reside en un entorno y, en particular, por microbiota intestinal, se quieren significar microorganismos que se encuentran en cualquier parte del tubo digestivo desde los labios hasta el ano.
Por pacientes que tienen enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se quieren significar pacientes con colitis ulcerosa (CU) o pacientes con enfermedad de Crohn (EC) o EII indefinida (EII-I).
Por nivel o abundancia de bacterias o taxones bacterianos se quieren significar un nivel o abundancia obtenidos por un medio para cuantificar bacterias tales como métodos basados en cultivos, citometría de flujo, microscopía, análisis cuantitativo de ADN y cualquier otro medio que sería obvio para un experto en la técnica.
Por severidad de la enfermedad se quiere significar un nivel de síntomas como se describe en el índice de actividad de la enfermedad, índice de actividad de la enfermedad de Crohn (IAEC), índice de actividad de la enfermedad de Crohn pediátrica (IAECP), índice de Harvey-Bradshaw, índice de actividad de colitis ulcerosa (IACU), índice de actividad de la colitis ulcerosa pediátrica (IACUP), clasificación de París de la enfermedad de Crohn pediátrica y similares. Por ejemplo, una EC severa corresponde a una puntuación de 450 en el índice IAEC.
Por "núcleo" se quieren significar los taxones bacterianos que se conservan entre individuos (que están presentes en dos o más individuos).
En un aspecto de la invención, se proporciona un método en el que se puede detectar la EII midiendo los niveles (o la abundancia relativa) de ciertos taxones bacterianos en muestras del intestino de pacientes. Las muestras de
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30
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55
60
En una realización, la recogida puede realizarse durante la endoscopia enjuagando con una solución fisiológica, tal como solución salina estéril o agua estéril, sobre la mucosa para eliminar la capa de moco fuertemente adherente que recubre las células epiteliales de la mucosa intestinal y la comunidad microbiana incrustada dentro de la capa de moco. Los productos aspirados se recolectan a continuación directamente a través de un colonoscopio en un lugar específico en el intestino, como por ejemplo, desde el íleon terminal, colon derecho y colon izquierdo, y las muestras se colocan inmediatamente preferiblemente en hielo en la sala de endoscopia. Por ejemplo, se pueden realizar las siguientes etapas: 1) primero se aplica al paciente un protocolo regular de limpieza intestinal en preparación para la colonoscopia, 2) a continuación se avanza el colonoscopio ("endoscopio") hacia el colon ascendente o hacia una región del colon distal a la de interés, 3) se succiona el fluido y material partículado, utilizando el sistema de lavado del endoscopio o con una jeringa a través del puerto de biopsia, 4) se enjuaga con agua estéril sobre la mucosa hasta que se desprendan los fragmentos de moco, 5) se aspira el líquido que contiene moco en una trampa estéril a través del sistema de aspiración del endoscopio, 6) se retira la trampa de la succión del endoscopio y se cubre e inmediatamente se coloca sobre hielo, 7) se hace avanzar el endoscopio a la región de interés más proximal y se repiten las etapas 3-6, 8) se transportan las trampas con moco al laboratorio en el plazo de 15 minutos de la recogida. La muestra puede analizarse a continuación en el punto de atención o transferirse a un laboratorio. Las muestras también se pueden procesar adicionalmente y a continuación almacenar a -80°C.
La recogida de la microbiota intestinal también se puede realizar en las heces. La recogida de bacterias de las heces se conoce en la técnica. En el caso de la recogida/análisis de microbiota fecal, las heces frescas pueden recogerse e inmediatamente procesarse y almacenarse a -80°C para la extracción del ADN y la secuencia/cuantificación como parte de un análisis bacteriano como se describe más adelante.
Las muestras que contienen microbiota intestinal recogidas como se describió anteriormente se pueden analizar para determinar su composición microbiana. La identificación de las bacterias presentes en las muestras se puede realizar utilizando técnicas de secuenciación de ADN como se describe en los ejemplos a continuación. En una realización, el ADN total se puede extraer de productos aspirados intestinales o muestras de heces. El protocolo puede comprender la extracción de ADN total utilizando una etapa de extracción con rotura mecánica. El ADN extraído puede someterse a continuación a secuenciación para identificar bacterias comparando las secuencias con las secuencias contenidas en las bases de datos. En una realización preferida, el ADN metagenómico puede someterse a secuenciación paralela masivamente multiplexada en la región V6 hipervariable del gen de ARNr 16S. Se aprecia que la secuenciación de regiones distintas de la región V6 hipervariable del gen de ARNr 16S puede utilizarse siempre que tales regiones proporcionen potencia discriminante (resolución taxonómica) para al menos algunos taxones bacterianos o unidades taxonómicas operativas (UTO) y en particular para taxones bacterianos que están preferentemente asociados con la EII como se describe más adelante.
También se apreciará que se pueden utilizar otros métodos para identificar bacterias de las muestras intestinales, incluyendo, entre otros, microscopía, identificación de metabolitos, tinción de Gram, citometría de flujo, técnicas inmunológicas (anticuerpos), métodos basados en cultivo, tales como el recuento de unidades formadoras de colonias y similares como conocerá un experto en la técnica.
En un aspecto de la descripción, la abundancia relativa de ciertos taxones bacterianos, a saber, filo, clase, orden, familia, género o especie o combinación de los mismos en el intestino (perfil de microbiota intestinal) de los pacientes se utiliza para evaluar la presencia o ausencia de enfermedad EII. Se ha encontrado que la microbiota de EII se caracteriza por un núcleo más pequeño en comparación con los controles (Fig. 5A-B y Tabla 1), lo que indica una pérdida de la homeostasis de la microbiota. Además, la microbiota de EII se caracteriza por un agotamiento de microbios productores de butirato junto con una mayor abundancia de bacterias generadoras de H2S. Por ejemplo, el aumento de los niveles de productores H2S tales como Fusobacterium nucleatum, Veillonella parvula, y Atopobium parvulum es indicativo de enfermedad
La evaluación de la presencia de enfermedad EC y CU en un sujeto humano se puede lograr midiendo la abundancia relativa de taxones como se ilustra en la tabla 1. En este ejemplo concreto, se enumeran las unidades taxonómicas operativas (UTO) microbianas que se detectaron en todas las muestras dentro de cada grupo y cuya abundancia varía significativamente entre EC, CU y/o controles. El número de lecturas de ADNr 16S en cada muestra se normalizó mediante submuestreo aleatorio a 500.000. Mínimo y máximo corresponden al número mínimo y máximo de lecturas obtenidas; la media corresponde a la media del número de lecturas obtenidas. Los valores P se generaron utilizando una prueba de Kruskal-Wallis con una prueba post hoc de Dunn. "p|Control" indica los valores P obtenidos en comparación con los controles; "p|CU" y "p|EC" indican los valores P obtenidos en comparación con los pacientes con CU y EC, respectivamente. Los valores en negrita indican significación (P<0,05). A partir de la tabla se puede observar que ciertos taxones son más o menos abundantes en pacientes con enfermedad que en controles sanos. Además, también es posible distinguir entre EC y CU en función de la abundancia relativa.
Tabla 1
UTO de núcleos cuya abundancia varía significativamente en al menos una de las tres comparaciones por pares realizadas (controles vs. EC; controles vs. CU; y EC vs. CU).
UTO|Variable Taxonomía|Variable Min Max Media Desviación p|Control p|CU p|EC
típica
177005| Control
177005 CU
177005|EC
5413011 Control
541301 |CU
541301 |EC
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_Blautia; s_|Control
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_Blautia; s_|CU
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_Blautia; s_|EC
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales;
f_Porphyromonadacea
e; g_Parabacteroides; sJControl
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales;
f_Porphyromonadacea
e; g_Parabacteroides;
s_|CU
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales;
f_Porphyromonadacea
e; g_Parabacteroides;
s_|EC
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
0,000 12876,000 1590,857 3303,847
1,000 8538,000 829,071 2266,987
0,000 24758,000 870,135 4086,298
0,000 34876,000 2923,571 7856,412
2,000 4594,000 400,357 1221,873
10433,000 1166,622 2439,874
1
0,304
0,022
1
0,265
0,332
0,304 0,022
1 0,388
0,388 1
0,265 0,332
1 0,038
0,038 1
c_Bacteroidia;
2586911 Control o_Bacteroidales;
f_Bacteroidaceae;
g_Bacteroides;
s_Bacteroidesovatus|
Control
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales;
f_Bacteroidaceae;
g_Bacteroides;
258691 |CU s_Bacteroidesovatus|CU
k_Bacteria; p_Bacteroidetes; c_Bacteroidia; o_Bacteroidales; f_Bacteroidaceae; g_Bacteroides;
258691 |EC s_Bacteroidesovatus|EC
k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae; g_; 182122| Control s_|Control
k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales; f_Lachnospiraceae; 182122|CU g_; s_|CU
k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales; f_Lachnospiraceae; 182122|EC g_; s_| EC
k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales; f_Lachnospiraceae;
0,000 40719,000 2275,238
1,000 86361,000 6325,500
1,000 37102,000 3148,459
3,000 13653,000 1649,619
0,000 5379,000 518,643
1,000 7805,000 691,216
8846,849 1 0,812 0,038
23037,262 0,812 1 0,122
7654,185 0,038 0,122 1
3463,599 1 0,034 0,077
1417,505 0,034 1 0,427
1475,854 0,077 0,427 1
g_Dorea;
s_Doreaformicigenerans|
261912| Control Control 12,000
k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales; f_Lachnospiraceae; g_Dorea;
s_Doreaformicigenera ns|
566952|CU CU 24,000
566952|EC
585419| Control
585419|CU
585419|EC
566952| Control
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_Dorea; 4,000
s_Doreaformicigenerans| EC
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_VeilloneNaceae;
g_Veillonella; s_|Control 2,000
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
LVeillonellaceae;
g_Veillonella; s_| CU 17,000
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_VeilloneNaceae;
g_Veillonella; s_| EC 5,000
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_Clostridium; s_|Control 1,000
k_Bacteria;
23969,000
7473,000
92806,000
860,000
29801,000
14260,000
559,000
7682,238 8341,342 1
1846,143 2506,511 0,043
10038,811 17773,654 0,540
111,000 201,434 1
4900,714 9206,483 0,003
1293,811 3473,360 0,114
152,381 171,608 1
0,043 0,540
1 0,091
0,091 1
0,003 0,114
1 0,059
0,059 1
0,011 0,137
566952|CU
566952|EC
303772| Control
303772|CU
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_Clostridium; s_|CU
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_Clostridium; s_|EC
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae; g_; s_| Control
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_; s_| CU
k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales; f_Lachnospiraceae; 303772|EC g_; s_| EC
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_VeilloneNaceae;
145149| Control g_Veillonella; s_|Control k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales; f_VeilloneNaceae;
1451491 |CU g_Veillonella; s_| CU k_Bacteria; p_Firmicutes;
0,000
0,000
0,000
1,000
0,000
1,000
2,000
378,000
720,000
149466,000
16984,000
2852,000
350,000
15569,000
41,429
106,108
8653,333
1460,286
193,811
75,524
4072,786
101,442
165,187
32546,409
4486,377
613,649
107,340
6042,303
0,011
0,137
1
0,163
0,177
1
0,012
1 0,137
0,137 1
0,163 0,177
1 0,007
0,007 1
0,012 0,170
1 0,119
145149|EC
362168| Control
362168|CU
362168|EC
470973| Control
4709731 |CU
470973|EC
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
LVeillonellaceae;
g_Veillonella; s_| EC 1,000
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales;
f_Bacteroidaceae;
g_Bacteroides; s_|Control 1,000
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales;
f_Bacteroidaceae;
g_Bacteroides; s_|CU 2,000
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales;
f_Bacteroidaceae;
g_Bacteroides; s_|EC 2,000
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_Ruminococcus;
s_Ruminococcustorqu es|Control 3,000
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_Ruminococcus;
s_Ruminococcustorqu
es|CU 3,000
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia; o_Clostridiales; 0,000
f_Lachnospiraceae;
g_Ruminococcus;
9591,000
10035,000
17437,000
35846,000
73975,000
55265,000
109867,000
811,892
709,286
1507,500
1950,054
5461,905
4591,643
8736,757
1841,236
2194,846
4604,990
6025,223
16369,874
14678,969
20949,142
0,170
1
0,540
0,039
1
0,106
0,637
0,119 1
0,540 0,039
1 0,261
0,261 1
0,106 0,637
1 0,029
0,029 1
s_Ruminococcustorqu
es|EC
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales;
f_Rikenellaceae;
138006| Control g_Alistipes; s_|Control k_Bacteria; p_Bacteroidetes; c_Bacteroidia; o_Bacteroidales; f_Rikenellaceae;
138006|CU g_Alistipes; s_|CU
k_Bacteria; p_Bacteroidetes; c_Bacteroidia; o_Bacteroidales; f_Rikenellaceae;
138006|EC 9_Alistipes; s_| EC
k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales; f_Ruminococcaceae;
g_Faecalibacterium; s_
188900| Control Control
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Ruminococcaceae;
g_Faecalibacterium;
188900|CU s_| CU
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Ruminococcaceae;
g_Faecalibacterium;
188900|EC s_| EC
k_Bacteria;
p_Fusobacteria;
0,000 2913,000 464,476 900,379 1
0,117 0,229
0,000 1393,000 193,286 411,329 0,117 1 0,006
1,000 7020,000 795,243 1586,474 0,229 0,006 1
11,000 9087,000 1275,952 2844,824 1 0,266 0,042
3,000 87401,000 7661,214 23050,226 0,266 1 0,585
2,000 98077,000 8299,324 20200,719 0,042 0,585 1
UTO|Variable
Taxonomía|Variable Min Max Media Desviación típica p|Control p|CU p|EC
64396| Control
c_Fusobacteria; o_Fusobacteriales; f_Fusobacteriaceae; g_Fusobacterium; s_|Control 0,000 674,000 86,952 185,286 1 0,050 0,013
64396|CU
k_Bacteria; p_Fusobacteria; c_Fusobacteria; o_Fusobacteriales; f_Fusobacteriaceae; g_Fusobacterium; s_|CU 0,000 41529,000 3892,429 11049,181 0,050 1 0,993
64396|EC
k_Bacteria; p_Fusobacteria; 1,000 164748,000 6092,135 27224,424 0,013 0,993 1
c_Fusobacteria;
o_Fusobacteriales;
f_Fusobacteriaceae;
g_Fusobacterium; s_|EC
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales; <
f_Lachnospiraceae; g_; s_|
1967311 Control
Control 1,000 787,000 174,333 238,985 1 0,000 1 0,346
k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales; <
f_Lachnospiraceae; 0,000 <
196731 |CU
9_; s_| CU k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; 0,000 0,000 0,000 0,000 1 1 0,0001
o_Clostridiales; <
f_Lachnospiraceae; 0,000
196731 |EC
g_; s_| EC 0,000 8748,000 666,892 1933,413 0,346 1 1
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales;
f_Bacteroidaceae;
g_Bacteroides;
469709| Control s_Bacteroidesdorei|Control 4,000 113796,000 12561,190 32939,260 1 0,274 0,035
k_Bacteria; p_Bacteroidetes; c_Bacteroidia;
469709|CU
469709|EC
183879| Control
183879|CU
o_Bacteroidales;
f_Bacteroidaceae;
g_Bacteroides;
s_Bacteroidesdorei|CU
k_Bacteria;
p_Bacteroidetes;
c_Bacteroidia;
o_Bacteroidales;
f_Bacteroidaceae;
g_Bacteroides;
s_Bacteroidesdorei|EC
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae; g_; s_| Control
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Lachnospiraceae;
g_; s_| CU
k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales; f_Lachnospiraceae; 183879|EC 9_; s_| EC
k_Bacteria;
p_Firmicutes;
c_Clostridia;
o_Clostridiales;
f_Clostridiaceae;
5146111 Control g_Clostridium; s_|Control k_Bacteria; p_Firmicutes; c_Clostridia; o_Clostridiales; f_Clostridiaceae;
514611 |CU g_Clostridium; s_|CU k_Bacteria; p_Firmicutes;
11,000
2,000
0,000
1,000
0,000
3,000
0,000
123061,000
221413,000
25451,000
26097,000
2104,000
44090,000
3656,000
14096,286 34346,257
22583,189 42793,771
2080,381 5620,095
2375,786 6987,836
220,324 486,771
2806,333 9573,507
599,643 1154,057
0,274
0,035
1
0,097
0,005
1
0,154
1 0,529
0,529 1
0,097 0,005
1 0,533
0,533 1
0,154 0,019
1 0,633
UTO|Variable
Taxonomía|Variable Min Max Media Desviación típica p|Control P|CU P|EC
c_Clostridia; o_Clostridiales; f_Clostridiaceae;
514611|EC
g_Clostridium; s_|EC k_Bacteria; p_Fusobacteria; c_Fusobacteria; o_Fusobacteriales; f_Fusobacteriaceae; 0,000 173925,000 6113,162 29294,960 0,019 0,633 1
288565| Control
g_Fusobacterium; s_|Control 1,000 204469,000 18673,762 57773,500 1 0,343 < 0,0001
k_Bacteria; p_Fusobacteria; c_Fusobacteria; o_Fusobacteriales; f_Fusobacteriaceae;
288565|CU
g_Fusobacterium; s_|CU k_Bacteria; p_Fusobacteria; c_Fusobacteria; o_Fusobacteriales; 0,000 21535,000 2582,714 6677,428 0,343 1 < 0,0001
f_Fusobacteriaceae; < <
288565|EC
g_Fusobacterium; s_|EC k_Bacteria; p_Bacteroidetes; c_Bacteroidia; o_Bacteroidales; 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,000 1 1
f_Bacteroidaceae; <
171559| Control
g_Bacteroides; s_|Control 1,000 697,000 109,762 201,308 1 0,000 1 < 0,0001
k_Bacteria; p_Bacteroidetes; c_Bacteroidia; <
o_Bacteroidales; 0,000
175559|CU
f_Bacteroidaceae; g_Bacteroides; s_|CU k_Bacteria; p_Bacteroidetes; c_Bacteroidia; o_Bacteroidales; 0,000 0,000 0,000 0,000 1 1 1,000
f_Bacteroidaceae; <
171559|EC
g_Bacteroides; s_|EC 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1
En la tabla 2 se presentan los resultados para la abundancia relativa de taxones. Se muestran taxones cuya abundancia varía significativamente en al menos una de las tres comparaciones por pares realizadas (controles frente EC; controles frente a CU; y EC frente a CU). En la tabla 2, se enumeran las UTO microbianas que se detectaron en al menos 75% de las muestras dentro de cada grupo y cuya abundancia varía significativamente entre 5 EC, CU y/o controles. El número de lecturas de ADNr 16S en cada muestra se normalizó mediante submuestreo aleatorio a 500.000. Mínimo y máximo corresponden al número mínimo y máximo de lecturas obtenidas; la media corresponde a la media del número de lecturas obtenidas. Los valores P se generaron utilizando una prueba de Kruskal-Wallis con una prueba post hoc de Dunn. "p|Control" indica los valores P obtenidos en comparación con los controles; "p|CU" y "p|EC" indican los valores P obtenidos en comparación con los pacientes con CU y EC, 10 respectivamente. Los valores en negrita indican significación (P <0,05).
Tabla 2
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p| Control p|CU p|EC
PHYLUM
Firmicutes|Control
177570,000 4^ -vi en o o o 00 co oT "3- o o o co 95087,202 1 0,011 0,246
Firmicutes|CU
39474,000 eo en co en en en o o o o o o O) co "3- o CM 82968,346 0,011 1 0,075
Firmicutes|EC
66149,000 4^ 4^ -v| o O) -v| o o o 259197,486 102279,924 0,246 0,075 1
CLASE
Negativicutes|Control
23,000 16688,000 1555,333 3588,392 1 0,020 0,008
Negativicutes|CU
95,000 39966,000 10613,357 14349,888 0,020 1 0,799
Negativicutes|EC
27,000 74088,000 8759,081 15370,608 0,008 0,799 1
Clostridia|Control
172358,000 4^ O) O) CO O) -v| O O O 290267,667 92133,532 1 0,006 0,054
Clostridia|CU
37917,000 eo en O) 4^ -v| o o o 00 O) en O) o eo en -v| 00 4^ 00 00 -vi b> 00 O) 0,006 1 0,173
Clostridia|EC
9293,000 413730,000 227236,162 o co o en -v| co 0,054 0,173 1
Verrucomicrobiae|Control
0,000 1098,000 85,381 251,309 1 0,014 0,296
Verrucomicrobiae|CU
0,000 13,000 1,071 3,452 0,014 1 0,075
Verrucomicrobiae|EC
0,000 2103,000 95,811 357,421 0,296 0,075 1
Betaproteobacteria|Control
14,000 44407,000 4215,810 10576,956 1 0,120 0,002
Betaproteobacteria|CU
27,000 74113,000 12641,071 23053,369 0,120 1 0,306
Betaproteobacteria|EC
26,000 129123,000 14407,270 26352,478 0,002 0,306 1
ORDEN
Pasteurellales|Control
0,000 446,000 24,238 96,821 1 0,003 0,002
Pasteurellales|CU
0,000 6141,000 661,857 1682,557 0,003 1 0,544
Pasteurellales|EC Chromatiales |
0,000 998,000 75,135 190,092 0,002 0,544 1
Control
0,000 1,000 0,048 0,218 1 0,003 0,009
Chromatiales|CU
0,000 12,000 2,071 3,407 0,003 1 0,331
Chromatiales|EC
0,000 30,000 2,054 5,637 0,009 0,331 1
Burkholderiales|Control
9,000 44407,000 4150,000 10590,948 1 0,764 0,015
Burkholderiales|CU
5,000 52910,000 6830,000 14990,496 0,764 1 0,073
Burkholderiales|EC
9,000 O O o co LO 00 CM 13994,270 26364,706 0,015 0,073 1
Selenomonadales|Control
23,000 16688,000 1555,333 3588,392 1 0,020 0,008
Selenomonadales|CU
95,000 39966,000 10613,357 14349,888 0,020 1 0,799
Selenomonadales|EC
27,000 74088,000 8759,081 15370,608 0,008 0,799 1
Clostridiales|Control
172357,000 4^ O) O) CO O) -v| O O O 290267,619 92133,596 1 0,006 0,054
Clostridiales|CU
37917,000 eo en O) 4^ -v| o o o 00 O) en en 00 00 en -v| 00 4^ 00 00 J-sl en -v| K) 0,006 1 0,173
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p| Control p|CU p|EC
Clostridiales|EC
9292,000 413730,000 227233,919 O co o en K) o O) 0,054 0,173 1
Hydrogenophilales|Control
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,008 0,660
Hydrogenophilales|CU
0,000 2,000 0,286 0,611 0,008 1 0,011
Hydrogenophilales|EC
0,000 2,000 0,054 0,329 0,660 0,011 1
OceanospiriNales|Control
0,000 4777,000 381,000 1090,456 1 0,007 0,127
Oceanospirillales|CU
1,000 8453,000 1310,500 2596,743 0,007 1 0,100
Oceanospirillales|EC
0,000 2349,000 180,459 413,881 0,127 0,100 1
Rhizobiales|Control
0,000 2,000 0,238 0,539 1 0,001 0,537
Rhizobiales|CU
0,000 170,000 23,786 55,134 0,001 1 0,002
Rhizobiales|EC
0,000 67,000 4,243 14,245 0,537 0,002 1
Verrucomicrobiales|Control
0,000 1098,000 85,381 251,309 1 0,014 0,296
Verrucomicrobiales|CU
0,000 13,000 1,071 3,452 0,014 1 0,075
Verrucomicrobiales|EC
0,000 2103,000 95,811 357,421 0,296 0,075 1
FAMILIA
Verrucomicrobiaceae|control
O O o o 1098,000 85,381 251,309 1 0,014 0,296
Verrucomicrobiaceae|CU
0,000 13,000 1,071 3,452 0,014 1 0,075
Verrucomicrobiaceae|EC
0,000 2103,000 95,811 357,421 0,296 0,075 1
Staphylococcaceae|Control
0,000 4079,000 355,333 910,119 1 0,345 0,009
Staphylococcaceae|CU
0,000 229,000 59,000 80,285 0,345 1 0,216
Staphylococcaceae|EC
0,000 5529,000 222,270 934,404 0,009 0,216 1
Lachnospiraceae|Control
1485,000 K) 4^ 4^ O 00 en o o o 73731,762 57312,252 1 0,006 0,058
Lachnospiraceae|CU
1094,000 83206,000 26960,929 25720,429 0,006 1 0,178
Lachnospiraceae|EC
388,000 O) o O) eo en o o o 47128,243 45439,902 0,058 0,178 1
Halomonadaceae|Control
0,000 55,000 2,667 11,993 1 0,014 0,263
Halomonadaceae|CU
0,000 711,000 52,857 189,465 0,014 1 0,083
Halomonadaceae|EC
0,000 12,000 0,811 2,246 0,263 0,083 1
Pasteurellaceae|Control
0,000 446,000 24,238 96,821 1 0,003 0,002
Pasteurellaceae|CU
0,000 6141,000 661,857 1682,557 0,003 1 0,544
Pasteurellaceae|EC
0,000 998,000 75,135 190,092 0,002 0,544 1
Paenibacillaceae|Control
0,000 181,000 32,000 44,159 1 0,014 0,009
Paenibacillaceae|CU
0,000 53,000 8,286 14,435 0,014 1 0,658
Paenibacillaceae|EC
0,000 617,000 23,730 100,869 0,009 0,658 1
Listeriaceae|Control
0,000 11,000 1,381 3,008 1 0,310 0,011
Listeriaceae|CU
0,000 3,000 0,286 0,825 0,310 1 0,272
Listeriaceae|EC
0,000 2,000 0,054 0,329 0,011 0,272 1
Bradyrhizobiaceae|Control
0,000 2,000 0,190 0,512 1 0,006 0,604
Bradyrhizobiaceae|CU
0,000 32,000 3,714 8,914 0,006 1 0,010
Bradyrhizobiaceae|EC
0,000 57,000 3,216 11,814 0,604 0,010 1
Methylococcaceae|Control
0,000 2,000 0,190 0,512 1 0,004 0,243
Methylococcaceae|CU
0,000 351,000 30,929 94,613 0,004 1 0,032
Methylococcaceae|EC
0,000 4,000 0,243 0,830 0,243 0,032 1
Hydrogenophilaceae|control
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,008 0,660
Hydrogenophilaceae|CU
0,000 2,000 0,286 0,611 0,008 1 0,011
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8I-02-90-S0
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Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p| Control p|CU p|EC
Catonella|Control
0,000 8,000 0,524 1,750 1 0,133 0,231
Catonella|CU
0,000 13,000 2,071 3,990 0,133 1 0,007
Catonella|EC
0,000 19,000 0,595 3,149 0,231 0,007 1
Mobiluncus|Control
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,007 0,677
Mobiluncus|CU
0,000 3,000 0,500 1,092 0,007 1 0,009
Mobiluncus|EC
0,000 1,000 0,027 0,164 0,677 0,009 1
Pantoea|Control
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,058 0,002
Pantoea|CU
0,000 8,000 1,071 2,401 0,058 1 0,523
Pantoea|EC
0,000 99,000 3,432 16,194 0,002 0,523 1
Enterobacter|Control
0,000 17,000 1,810 3,829 1 0,003 0,109
Enterobacter|CU
0,000 10592,000 778,786 2824,745 0,003 1 0,057
Enterobacter|EC
0,000 3590,000 105,892 588,904 0,109 0,057 1
Paenibacillus|Control
0,000 181,000 31,952 44,147 1 0,013 0,007
Paenibacillus|CU
0,000 53,000 8,214 14,412 0,013 1 0,699
Paenibacillus|EC
0,000 617,000 23,595 100,894 0,007 0,699 1
Staphylococcus|Control
0,000 4079,000 353,762 910,667 1 0,224 0,010
Staphylococcus|CU
0,000 229,000 58,357 80,759 0,224 1 0,370
Staphylococcus|EC
0,000 5529,000 214,649 925,461 0,010 0,370 1
VitreosciNa|Control
0,000 37,000 2,286 8,057 1 0,009 0,319
VitreosciNa|CU
0,000 1667,000 128,357 443,285 0,009 1 0,044
VitreosciNa|EC
0,000 15,000 1,622 3,192 0,319 0,044 1
Alcanivorax|Control
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,012 1,000
Alcanivorax|CU
0,000 5,000 0,643 1,646 0,012 1 0,006
Alcanivorax|EC
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,006 1
Veillonella|Control
6,000 1213,000 187,571 292,401 1 0,003 0,106
Veillonella|CU
23,000 38298,000 8985,571 13795,955 0,003 1 0,063
Veillonella|EC
7,000 17002,000 2107,243 4464,809 0,106 0,063 1
Tatumella|Control
0,000 61,000 3,381 13,347 1 0,014 0,090
Tatumella|CU
0,000 1836,000 175,643 501,883 0,014 1 0,224
Tatumella|EC
0,000 71,000 5,054 13,894 0,090 0,224 1
Afipia|Control
0,000 1,000 0,095 0,301 1 0,027 0,913
Afipia|CU
0,000 30,000 2,429 7,949 0,027 1 0,012
Afipia|EC
0,000 3,000 0,135 0,536 0,913 0,012 1
5
10
15
20
25
30
35
Ciertos taxones bacterianos exhiben niveles más altos (abundancia) en pacientes con CU o EC o EII y algunos taxones exhiben niveles más bajos en pacientes con CU o EC o EII. Por lo tanto, se puede realizar un ensayo en una muestra intestinal de un paciente para medir una abundancia (o nivel) de un taxón bacteriano y comparar esta abundancia con una abundancia predeterminada o una abundancia promedio (como en las tablas 1 o 2) de los taxones derivados de la muestra de pacientes con CU o EC o EII. El resultado permite determinar si un paciente tiene CU o EC o EII.
La abundancia o el nivel de taxones bacterianos se pueden determinar, por ejemplo, mediante análisis de ADN cuantitativo tal como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Como se describió anteriormente, los datos se pueden normalizar (ejemplo, normalización por submuestreo) como se conocería en la técnica. Por lo tanto, los resultados comentados en la presente solicitud pueden representar abundancia relativa. Se apreciará que un experto en la técnica sabrá interpretar estos valores para determinar los niveles relativos de bacterias.
También se proporciona un método en el que se logra un diagnóstico de CU o EC o EII recogiendo una muestra intestinal de un paciente y a partir de la cual se eliminarán los niveles de taxones bacterianos utilizando un ensayo como se describió anteriormente. La muestra del intestino puede proceder del enjuague de la pared del colon como se describió anteriormente y aún más detalladamente a continuación o de deposiciones.
Ciertos taxones exhiben una diferencia estadísticamente significativa en su abundancia entre pacientes con CU y pacientes con EC. Por lo tanto, al comparar la abundancia relativa de uno o más de estos taxones entre pacientes con CU y EC, es posible determinar si el paciente tiene enfermedad EC o CU. Por ejemplo, Hydrogenophilus es más abundante en pacientes tanto con EC como con CU en comparación con individuos sanos y, además, es más abundante en pacientes con CU que en pacientes con EC.
En otro aspecto de la invención, la gravedad de la enfermedad también puede evaluarse a partir del perfil bacteriano de la microbiota intestinal. Por lo tanto, la gravedad de la EC se puede establecer midiendo la abundancia relativa de ciertos taxones bacterianos en una muestra de microbiota intestinal. A este respecto, la abundancia relativa de uno o más taxones microbianos del intestino se puede comparar/correlacionar con un índice de actividad de enfermedad convencional. La clasificación resultante permite el uso de la abundancia relativa de taxones bacterianos como un indicador de la gravedad de la enfermedad (Tabla 3). Se apreciará que se pueden utilizar para ese fin las mediciones de abundancia de uno o más taxones bacterianos.
Tabla 6 Complementaria: Los Taxones cuya abundancia varía significativamente en pacientes con EC en al menos una de las tres comparaciones por pares realizadas (leve frente a moderada, leve frente a grave y moderada frente a grave). En la tabla 3, el número de lecturas de ADNr 16S en cada muestra se normalizó mediante submuestreo aleatorio a 500.000. Mínimo y máximo corresponden al número mínimo y máximo de lecturas obtenidas; la media corresponde a la media del número de lecturas obtenidas. Los valores P se generaron utilizando una prueba de Kruskal-Wallis con una prueba post hoc de Dunn y una corrección de Bonferroni para múltiples hipótesis. "p|leve" indica los valores P obtenidos por comparación con los pacientes con EC con una inflamación leve; "p|moderada" y "p|grave" indican los valores P obtenidos por comparación con pacientes con EC con inflamación moderada y grave respectivamente. Los valores en negrita indican significación (P<0,05).
Tabla 3
Variable
Mínimo Máximo Media Desviación típica p| Leve p| Grave p| Moderada
PHYLUM Ninguno
CLASE
Clostridia|Leve
174469,0 00 413730,0 00 312892,0 00 87462,076 1 0,012 0,105
Clostridia|Grave
9293,000 407027,0 00 198223,4 35 105908,496 0,012 1 0,860
Clostridia|Moderada
59849,000 289226,0 00 206514,2 00 90299,691 0,105 0,860 1
Betaproteobacteria|Leve
26,000 29550,000 4640,333 9490,562 1 0,170 0,013
Betaproteobacteria|Grave
60,000 54643,000 10878,69 6 15121,993 0,170 1 0,084
Betaproteobacteria|Moderada
2685,000 129123,0 00 48219,20 0 55650,162 0,013 0,084 1
ORDEN
Clostridiales|Leve
174469,0 00 413730,0 00 312892,0 00 87462,076 1 0,012 0,105
Clostridiales Grave
9292,000 407027,0 00 198219,8 70 105908,987 0,012 1 0,860
Clostridiales Moderada
59849,000 289225,0 00 206514,0 00 90299,462 0,105 0,860 1
FAMILIA
Staphylococcaceae|Leve
4,000 1507,000 255,222 507,068 1 0,025 0,002
Staphylococcaceae|Grave
0,000 5529,000 257,522 1149,930 0,025 1 0,089
Staphylococcaceae |Moderada
0,000 2,000 0,800 0,837 0,002 0,089 1
Propionibacteriaceae|Leve
0,000 1,000 0,556 0,527 1 0,016 0,484
Propionibacteriaceae|Grave
0,000 363,000 33,652 88,327 0,016 1 0,007
Propionibacteriaceae|Moderada
0,000 1,000 0,200 0,447 0,484 0,007 1
Acidaminococcaceae|Leve
0,000 4,000 1,111 1,691 1 0,003 0,030
Acidaminococcaceae|Grave
0,000 36271,000 2476,261 7722,681 0,003 1 0,965
Acidaminococcaceae|Moderada
0,000 8395,000 1712,000 3736,459 0,030 0,965 1
Bacillaceae|Leve
0,000 136,000 16,000 45,008 1 0,137 0,281
Bacillaceae|Grave
0,000 6167,000 427,174 1339,746 0,137 1 0,016
Bacillaceae|Moderada
0,000 3,000 0,600 1,342 0,281 0,016 1
Carnobacteriaceae|Leve
13,000 643,000 155,222 229,710 1 0,206 0,148
Carnobacteriaceae|Grave
5,000 76920,000 3723,870 15973,648 0,206 1 0,008
Carnobacteriaceae|Moderada
4,000 78,000 26,200 30,136 0,148 0,008 1
Sutterellaceae|Leve
2,000 1157,000 136,889 382,665 1 0,004 0,004
Sutterellaceae|Grave
1,000 54546,000 7005,435 15182,702 0,004 1 0,342
Sutterellaceae|Moderada
9,000 128471,0 00 42805,000 59466,785 0,004 0,342 1
GÉNERO
Atopobium|Leve
1,000 257,000 60,778 81,208 1 0,704 0,056
Atopobium|Grave
0,000 1273,000 118,652 263,676 0,704 1 0,014
Atopobium|Moderada
0,000 7,000 4,800 2,775 0,056 0,014 1
Propionibacterium|Leve
0,000 1,000 0,556 0,527 1 0,016 0,484
Propionibacterium|Grave
0,000 363,000 33,652 88,327 0,016 1 0,007
Propionibacterium|Moderada
0,000 1,000 0,200 0,447 0,484 0,007 1
Trichococcus|Leve
0,000 3,000 0,556 1,014 1 0,002 0,031
Trichococcus|Grave
0,000 0,000 0,000 0,000 0,002 1 1,000
Trichococcus|Moderada
0,000 0,000 0,000 0,000 0,031 1,000 1
Pectobacterium|Leve
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 0,029
Pectobacterium|Grave
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 0,014
Pectobacterium|Moderada
0,000 80,000 16,000 35,777 0,029 0,014 1
Granulicatella|Leve
13,000 581,000 145,444 215,009 1 0,229 0,167
Granulicatella|Grave
5,000 74250,000 3494,130 15434,318 0,229 1 0,012
Granulicatella|Moderada
3,000 78,000 25,000 30,406 0,167 0,012 1
Jonquetella|Leve
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 0,029
Jonquetella|Grave
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 0,014
Variable
Mínimo Máximo Media Desviación típica p| Leve p| Grave p| Moderada
Jonquetella|Moderada
0,000 83,000 16,600 37,119 0,029 0,014 1
Riemerella|Leve
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 0,002
Riemerella|Grave
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 0,000
Riemerella|Moderada
0,000 3,000 0,800 1,304 0,002 0,000 1
Mogibacterium|Leve
0,000 45,000 7,556 14,934 1 0,187 0,207
Mogibacterium|Grave
0,000 376,000 34,478 82,168 0,187 1 0,013
Mogibacterium|Moderada
0,000 1,000 0,200 0,447 0,207 0,013 1
Staphylococcus|Leve
4,000 1247,000 226,333 428,093 1 0,024 0,002
Staphylococcus Grave
0,000 5529,000 256,565 1150,035 0,024 1 0,090
Staphylococcus Moderada
0,000 2,000 0,800 0,837 0,002 0,090 1
Sutterella|Leve
2,000 1157,000 136,889 382,665 1 0,004 0,004
Sutterella|Grave
1,000 54546,000 7005,435 15182,702 0,004 1 0,342
Sutterella|Moderada
9,000 128471,0 00 42805,000 59466,785 0,004 0,342 1
Phascolarctobacterium|Leve
0,000 4,000 1,111 1,691 1 0,003 0,030
Phascolarctobacterium|Grave
0,000 36271,000 2476,261 7722,681 0,003 1 0,965
Phascolarctobacterium|Moderada
0,000 8395,000 1712,000 3736,459 0,030 0,965 1
Comamonas|Leve
0,000 3,000 0,667 1,118 1 0,016 0,054
Comamonas|Grave
0,000 1,000 0,043 0,209 0,016 1 0,792
Comamonas|Moderada
0,000 0,000 0,000 0,000 0,054 0,792 1
Hylemonella|Leve
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 0,029
Hylemonella|Grave
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 0,014
Hylemonella|Moderada
0,000 1,000 0,200 0,447 0,029 0,014 1
Xenorhabdus|Leve
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 0,029
Xenorhabdus|Grave
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 0,014
Xenorhabdus|Moderada
0,000 1,000 0,200 0,447 0,029 0,014 1
Averyella|Leve
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 0,029
Averyella|Grave
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 0,014
Averyella|Moderada
0,000 11,000 2,200 4,919 0,029 0,014 1
Se apreciará que es posible refinar la evaluación de la etapa o la gravedad de la enfermedad combinando la medición o mediciones de la abundancia de taxones bacterianos con la observación de una elección de síntomas subyacentes a los índices de enfermedad clásicos para llegar al establecimiento de un diagnóstico. Por ejemplo, 5 puede ser deseable o algunas veces solo posible medir solo un conjunto limitado de síntomas convencionales asociados con índices de enfermedades. Este conjunto limitado de síntomas puede no ser suficiente para plantear un diagnóstico. En tales casos, puede ser posible combinar un ensayo que implique la medición de taxones bacterianos para proporcionar información adicional sobre la naturaleza o fase de la enfermedad.
En un aspecto de la invención A. parvulum, un productor de H2S, es un buen marcador de EC que exhibe una mayor 10 abundancia relativa en pacientes con EC que en los controles. Además, la abundancia relativa de A. parvulum en comparación con la abundancia de taxones bacterianos núcleo también es una medida de la presencia y gravedad de la enfermedad. Por ejemplo, una abundancia de A. parvulum con relación al núcleo mayor que 0.005% es indicativa de etapa moderada o severa de la enfermedad (Fig. 1C). Además, la gravedad de la EC también se puede caracterizar por una abundancia significativamente mayor de microbios de Proteobacterias. La EC y la CU graves 15 también se pueden caracterizar por un aumento en la abundancia relativa de productores H2S en comparación con los controles. Se apreciará que se pueden utilizar taxones específicos para evaluar la gravedad de la enfermedad como se describe en la Tabla 3.
En otro aspecto más de la descripción, una disminución de la abundancia relativa de productores de butirato tales como Firmicutes, Clostridia, Clostridiales y Lachnopiraceae Eubacterium y Faecalibacterium es indicativa de la 20 presencia de enfermedad (EC o CU). Las mediciones de la abundancia de taxones bacterianos utilizando cuantificación de ADN generalmente se pueden realizar por medio de métodos que son conocidos en la técnica. Sin
embargo, en un aspecto de la invención se proporciona un método para determinar la abundancia de A. parvulum mediante medición cuantitativa de ADN absoluta realizando PCR en el ADN metagenómico extraído. Se desarrollaron los siguientes cebadores para las mediciones cuantitativas de A. parvulum: Aparv-711 F 5'- GGGGAGTATTTCTTCCGTGCCG-3' (SEQ ID NO. 1) y Aparv-881R 5'-CTTCACCTAAATGTCAA GCCCTGG-3' 5 (SEQ ID NO. 2). El desarrollo de estos cebadores permite el uso de un ensayo para medir la abundancia de A. parvulum que es altamente específico, rápido y confiable. Por lo tanto, en otro aspecto de la descripción también se proporcionan kits que comprenderían estos cebadores y otros reactivos como se conocería en la técnica para detectar A. parvulum u otros taxones útiles para el diagnóstico, la evaluación o la estadificación de CU, EC o EII como se describe en la presente memoria.
10 En una realización adicional de la descripción, la presencia de enfermedad CU y EC puede evaluarse por la presencia, ausencia y/o abundancia relativa de ciertas proteínas del anfitrión. Las proteínas se pueden identificar y medir mediante mecanismos conocidos en la técnica, tales como espectrometría de masas de perdigonada junto con fraccionamiento de proteínas. También se pueden utilizar otros métodos para detectar proteínas específicas tales como, métodos basados en inmunología (anticuerpos), transferencias Western, espectrofotometría, ensayos
15 enzimáticos, ELISA y cualquier otro método como será conocido por un experto en la técnica. La Tabla 4 proporciona una lista de todas las proteínas expresadas diferencialmente y su importancia variable en las puntuaciones de proyección (VIP) derivadas del PLS-DA calculado. (Control frente a EC con aumento de la gravedad de la inflamación)
Tabla 4
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Subunidad 1 del factor IIA de transcripción general; subunidad p19 de TFIIA; subunidad p35 de TFIIA; TFIIAL; cadena alfa del factor IIA de inicio de la transcripción; cadena beta del factor IIA de inicio de la transcripción; subunidad 1 del factor IIA de inicio de la transcripción; subunidad de 42 kDa del factor TFIIA de inicio de la transcripción
2,513 1,975 1,814
Proteína de unión a angiotensina; Endopeptidasa microsomal; Oligopeptidasa M mitocondrial; Neurolisina, mitocondrial; Endopeptidasa para neurotensina
2,296 1,901 1,745
Defensina, alfa 5; Defensina-5
2,013 1,575 1,399
Proteína del gen inducido por polvo mineral; Antígeno nuclear inducido por MYC; Proteína nucleolar 52
1,942 1,793 1,585
Isoforma renal de glutaminasa, mitocondrial; Glutaminasa K; L-glutamina amidohidrolasa
1,880 1,538 1,358
Etanolaminafosfotransferasa 1; Selenoproteína I; Proteína no caracterizada putativa ENSP00000385426; Proteína no caracterizada putativa ENSP00000391804
1,853 1,918 1,702
ARNr 18S dimetilasa; de tipo DIM1 dimetiladenosina transferasa; Probable dimetiladenosina transferasa; S-adenosilmetionina-6-N,N-adenosil(ARNr) dimetiltransferasa
1,790 1,524 1,435
Isozima de tipo 6PF-2-K/Fru-2,6-P2asa cardíaca; 6-fosfofructo-2-quinasa; 6-fosfofructo-2- quinasa/fructosa-2,6-bifosfatasa 2; Fructosa-2,6-bisfosfatasa
1,717 1,442 1,275
proteína 8 que contiene repeticiones armadillo; ADNc FLJ56387, muy similar a 8 que contiene repeticiones armadillo de Mus musculus (Armc8), mRNA; Proteína no caracterizada putativa ARMC8; 8 que contiene repeticiones armadillo, isoforma CRA_g; ADNc FLJ53383, muy similar a 8 que contiene repeticiones armadillo de Homo sapiens (ARMC8), variante 2 del transcrito, ARNm
1,692 1,548 1,376
Aconitasa 2, mitocondrial; Aconitato hidratasa, mitocondrial; Citrato hidro-lisasa; ADNc FLJ60429, muy similar a Aconitato hidratasa, mitocondrial (EC 4.2.1.3); ADNc FLJ50886, muy similar a Aconitato hidratasa, mitocondrial(EC 4.2.1.3)
1,645 1,338 1,191
2C4D; Clase II mMOB1; homólogo 3 de Mob1; 3 de tipo activador de quinasa de unión 1 de Mps; Proteína 3 de preimplantación; ADNc FLJ52887, muy similar a Proteína 3 de preimplantación
1,634 1,359 1,203
Subunidad del complejo II hierro-azufre; Succinato deshidrogenasa [ubiquinona] subunidad hierro azufre, mitocondrial
1,612 1,266 1,216
Reticulocalbina-1; ADNc FLJ55835, muy similar a Reticulocalbina-1
1,593 1,238 1,093
Subunidad de 14 kDa del factor inductor de sensibilidad DRB; subunidad pequeña del
1,592 1,247 1,102
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
factor inductor de sensibilidad DRB; Factor de elongación de la transcripción SPT4
Rodanasa; Tiosulfato sulfotransferasa
1,590 1,257 1,112
proteína de 22 kDa; CP-22; Sarcina; V19; Proteína no caracterizada putativa SRI; ADNc FLJ60640, muy similar a Sarcina; ADNc FLJ54267, Moderadamente similar a Sarcina
1,589 1,282 1,144
Subunidad del complejo II de flavoproteína; Subunidad de Succinato deshidrogenasa [ubiquinona] flavoproteína, mitocondrial
1,576 1,225 1,169
Acetilneuraminil hidrolasa; G9 sialidasa; Sialidasa lisosomal; N-acetil-alfa-neuraminidasa 1; Sialidasa-1
1,562 1,955 1,773
Beta-IV espectrina; Cadena beta de espectrina, cerebro 3; Espectrina, 3 cadena beta no eritroide; Proteína no caracterizada putativa SPTBN4
1,557 1,291 1,194
Homólogo SEC63 de la proteína de translocación
1,542 1,555 1,373
Proteína de unión a ácido graso de tipo epidérmico; Proteína 5 de unión a ácido graso; Proteína de unión a ácido graso, epidérmica; Homólogo de proteína de unión a ácido graso asociada a Psoriasis
1,540 1,206 1,071
Complejo I-51kD; NADH deshidrogenasa [ubiquinona] flavoproteína 1, mitocondrial; NADH deshidrogenasa flavoproteína 1; NADH-ubiquinona oxidorreductasa subunidad de 51 kDa; ADNc FLJ57949, muy similar a NADH-ubiquinona oxidorreductasa subunidad de 51 kDa, mitocondrial (EC 1.6.5.3); ADNc, FLJ79021, muy similar a NADH-ubiquinona oxidorreductasa subunidad de 51 kDa, mitocondrial (EC 1.6.5.3)
1,530 1,205 1,205
Calregulina; Calreticulina; CRP55; Proteína 60 residente en el retículo endoplásmico; grp60; HACPB; ADNc FLJ58668, muy similar a Calreticulina
1,528 1,220 1,077
UDP-glucosa 6-deshidrogenasa; ADNc FLJ60093, muy similar a UDP-glucosa 6- deshidrogenasa (EC 1.1.1.22)
1,522 1,183 1,052
4-alfa-glucanotransferasa; Amilo-alfa-1,6-glucosidasa; Dextrina 6-alfa-D-glucosidasa; Desramificadora de glicógeno; Enzima desramificadora de glicógeno; Oligo-1,4-1,4- glucanotransferasa
1,516 1,200 1,072
Enzima málica 2; Enzima málica dependiente de NAD, mitocondrial
1,514 1,225 1,081
Delta(3),delta(2)-enoil-CoA isomerasa; Proteína 1 relacionada con el inhibidor de la unión a diazepam; Dodecenoil-CoA isomerasa; DRS-1; Antígeno 88 asociado a carcinoma hepatocelular; 3,2-Trans-enoil-CoA isomerasa peroxisomal; Antígeno de carcinoma renal NY-REN-1; Proteína no caracterizada putativa PECI
1,513 1,178 1,046
Complejo I-75kD; NADH-ubiquinona oxidorreductasa subunidad de 75 kDa, mitocondrial; ADNc FLJ60586, muy similar a NADH-ubiquinona oxidorreductasa subunidad de 75 kDa, mitocondrial (EC 1.6.5.3)
1,510 1,324 1,181
ADNc FLJ53665, muy similar a proteína 1 de cuatro dominios y medio LIM; 1 de cuatro dominios y medio LIM; proteína 1 de cuatro dominios y medio LIM; LIM-proteína 1 de músculo esquelético
1,500 1,168 1,031
Adenosilhomocisteinasa 3 putativa; Proteína de tipo 2S-adenosilhomocisteína hidrolasa; S-adenosil-L-homocisteína hidrolasa 3
1,499 1,165 1,031
Proteína ribosomal S9 28S, mitocondrial
1,489 1,198 1,121
Proteína regulada por oxígeno de 150 kDa; Proteína regulada por glucosa de 170 kDa; Proteína 1 regulada al alza por hipoxia; ADNc FLJ54708, muy similar a Proteína regulada por oxígeno de 150 kDa (Orp150)
1,480 1,179 1,041
Complejo I-39kD; NADH deshidrogenasa [ubiquinona] subcomplejo 1 alfa subunidad 9, mitocondrial; subunidad de 39 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
1,466 1,152 1,083
DDAHI; Dimetilargininasa-1; N(G),N(G)-dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 1; ADNc FLJ54083, muy similar a NG,NG-dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 1 (EC 3.5.3.18); ADNc FLJ54119, muy similar a NG,NG-dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 1 (EC 3.5.3.18)
1,465 1,177 1,072
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Cadena beta de fenilalanina--ARNt ligasa; Cadena beta de fenilalanil-ARNt sintetasa
1,462 1,154 1,080
APB-278; Homólogo APB-280; de tipo proteína de unión a actina; Beta-filamina; Homólogo 1 de filamina; Filamina-3; Filamina-B; Autoantígeno de tiroides; Proteína de unión a actina truncada
1,462 1,166 1,032
Subunidad beta de succinil-CoA sintetasa específica de GTP; Subunidad beta de succinil-CoA ligasa [formadora de GDP], mitocondrial; Cadena beta-G de succinil-CoA sintetasa
1,459 1,151 1,018
TPPP/p20; Miembro 3 de la familia de proteína promotora de la polimerización de tubulina
1,455 1,376 1,275
F8W031; F8VXJ7; F8VP03
1,450 1,187 1,058
Homólogo 1 de la proteína NipSnap
1,438 1,119 0,993
proteína de unión a grastrina de 78 kDa; 3-Hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga; Enoil-CoA hidratasa de cadena larga; TP-alfa; Subunidad alfa de enzima trifuncional, mitocondrial
1,434 1,118 1,032
Enzima AOE372 antioxidante; Peroxirredoxina IV; Peroxirredoxina-4; Tiorredoxina peroxidasa AO372; Peroxido reductasa A0372 dependiente de tiorredoxina
1,421 1,144 1,011
Calumenina; Crocalbina; IEF SSP 9302
1,418 1,286 1,136
Miembro 4 de la FAMILIA IMAP de GTPasa; Proteína 1 de nucleótido asociada a inmunidad; Proteína 4 asociada a inmunidad; ADNc FLJ51351, muy similar a GTPasa, Miembro 4 de la FAMILIA IMAP
1,418 1,105 0,975
Placofilina-2; Placofilina-2 truncada
1,417 1,103 1,000
Subunidad mu-2 del complejo adaptador de proteínas AP-1; Subunidad mu-2 del complejo 1 de proteína relacionado con el adaptador; Subunidad mu-2 del complejo AP- 1; Miembro mu1 B de la FAMILIA de la cadena AP-mu; Cadena 2 media del complejo 1 de proteína de ensamblaje a Clatrina; Subunidad mu-2 de adaptina del adaptador HA1/AP1 de Golgi; Mu1 B-adaptina; Mu-adaptina 2
1,417 1,262 1,117
Subunidad 1 del complejo III; Proteína core I; subunidad 1 del complejo citocromo b-c1, mitocondrial; Proteína 1 core del complejo ubiquinol-citocromo-c reductasa
1,413 1,209 1,071
proteína quinasa S6 3 ribosomal de 90 kDa; Proteína quinasa 1 estimulada por insulina; proteína quinasa 1b activada por MAP quinasa; pp90RSK2; Proteína quinasa S6 alfa-3 ribosomal; quinasa S6 ribosomal 2; ADNc, FLJ79381, muy similar a Proteína quinasa S6 alfa-3 ribosomal (EC 2.7.11.1); ADNc FLJ56618, muy similar a Proteína quinasa S6 alfa-3 ribosomal (EC 2.7.11.1)
1,410 1,200 1,080
3-5 RNA exonucleasa OLD35; PNPasa old-35; Polinucleótido fosforilasa 1; Proteína de tipo polinucleótido fosforilasa; Polirribonucleótido nucleotidiltransferasa 1, mitocondrial
1,407 1,255 1,155
Complejo I-B15; NADH deshidrogenasa [ubiquinona] subcomplejo 1 beta subunidad 4; NADH-ubiquinona oxidorreductasa subunidad B15; Proteína no caracterizada putativa NDUFB4
1,397 1,113 1,010
Carnitina O-palmitoiltransferasa 2, mitocondrial; Carnitina palmitoiltransferasa II
1,396 1,089 0,976
Aldehído deshidrogenasa 5; Miembro B1 de la FAMILIA 1 de aldehído deshidrogenasa; Aldehído deshidrogenasa X, mitocondrial; ADNc FLJ51238, muy similar a Aldehído deshidrogenasa, X, mitocondrial (EC 1.2.1.3)
1,393 1,120 0,988
Subunidad 1 de coatómero; Proteína épsilon de la envoltura; Complejo proteico del coatómero, subunidad épsilon, isoforma CRA e; Proteína no caracterizada putativa COPE
1,388 1,080 0,959
Proteína 1 de la encefalopatía etilmalónica; Proteína 1 del clon sustraido del hepatoma; Proteína ETHE1, mitocondrial
1,383 1,090 0,974
Proteína de unión a ARN que interactúa con el tallo-bucle SRA, mitocondrial
1,382 1,075 0,960
15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa [NADP+]; Carbonil reductasa [NADPH] 1;
1,379 1,085 1,043
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Carbonil reductasa dependiente de 1NADPH; Prostaglandina 9-cetoreductasa; Prostaglandin-E(2) 9-reductasa; Proteína no caracterizada putativa CBR1; Carbonil reductasa 1, isoterma CRA c; ADNc FLJ60474, muy similar a Carbonil reductasa
Proteína de 53 kDa del compartimento intermedio RE-Golgi; Gp58; Lectina MR60 específica de manosa intracelular; Lectina de unión a manosa 1; Proteína ERGIC-53
1,374 1,129 1,046
Factor trefoil intestinal; Polipéptido P1.B; Factor trefoil 3
1,369 1,093 0,971
Proteína regulada por glucosa de 78 kDa; proteína grp78 de unión a Ca(2+) luminal del retículo endoplásmico; Proteína 5 de 70 kDa de choque térmico; Proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina
1,366 1,104 1,046
Complejo I-13kD-A; proteína 6 con hierro-azufre NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial; subunidad A de 13 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
1,365 1,090 0,968
3-cetoacil-CoAtiolasa, mitocondrial; Acetil-CoA aciltransferasa; Beta-cetotiolasa; 3- Oxoacil-CoA tiolasa mitocondrial; T1
1,365 1,097 1,028
Proteína 46 residente en el retículo endoplásmico; Proteína 5 que contiene dominio tiorredoxina; Proteína tiorredoxina de tipo p46; Proteína TXNDC5; ADNc, FLJ96678, 5 que contiene el dominio tiorredoxina de Homo sapiens (TXNDC5), ARNm; HCG1811539, isoforma CRA b
1,363 1,103 0,994
Factor de elongación Tu, mitocondrial; P43
1,361 1,065 0,985
Proteína porina 2 de la membrana mitocondrial externa; Proteína 2 del canal selectivo de aniones dependiente del voltaje; Canal 2 aniónico dependiente del voltaje; ADNc FLJ60120, muy similar a proteína 2 del canal selectivo de aniones dependiente del voltaje; ADNc, FLJ78818, muy similar a proteína 2 del canal selectivo de aniones dependiente del voltaje
1,361 1,060 0,938
Proteína de membrana de 63 kDa; Proteína 4 asociada al citoesqueleto
1,361 1,102 0,975
Citovillina; Ezrina; p81; Villina-2
1,360 1,057 0,937
Miosina I beta; Miosina-Ic
1,359 1,071 0,948
Antígeno de pénfigo paraneoplásico de 250/210 kDa; Desmoplaquina
1,356 1,126 1,002
Acil-CoA deshidrogenasa específica de cadena muy larga, mitocondrial
1,355 1,089 0,983
15-oxoprostaglandina 13-reductasa; Prostaglandin reductasa 2; Alcohol deshidrogenasa de unión a cinc, Proteína 1 que contiene dominio
1,353 1,160 1,057
Subunidad 2 del complejo III; Proteína II core; subunidad 2 del complejo citocromo b-c1, mitocondrial; Proteína 2 core del complejo ubiquinol-citocromo-c reductasa
1,345 1,200 1,182
Aspartato aminotransferasa, mitocondrial; Proteína de unión a ácido graso; Glutamato oxaloacetato transaminasa 2; Proteína de unión a ácido graso asociada a la membrana plasmática; Transaminasa A
1,339 1,041 0,919
CML33; Cadena alfa de fenilalanina--ARNt ligasa; Cadena alfa de fenilalanina--ARNt ligasa sintetasa; ADNc FLJ50378, muy similar a cadena alfa de fenilalanil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.20)
1,337 1,179 1,051
Subunidad alfa-1 de la bomba de sodio; Subunidad alfa-1 de ATPasa de transporte de sodio/potasio; ATPasa, transporte de Na+/K+, polipéptido alfa 1, isoforma CRA_a; ADNc FLJ52430, muy similar a cadena alfa-1 de la ATPasa de transporte de sodio/potasio (EC 3.6.3.9)
1,335 1,042 0,927
Proteína no caracterizada putativa MLLT4; Afadina; Gen fusionado a ALL-1 de la proteína del cromosoma 6; Leucemia mieloide/linfoide o de linage mixto (Homólogo Trithorax, Drosophila); translocado a, 4
1,334 1,277 1,207
polipéptido Vb de citocromo c oxidasa; subunidad 5B de citocromo c oxidasa, mitocondrial
1,332 1,229 1,092
Lectina de 35 kDa; Proteína 35 de unión a carbohidrato; Lectina 3 específica de galactosa; Proteína de unión a galactósido; Galectina-3; Proteína de unión a IgE; L-31;
1,328 1,057 0,972
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Proteína de unión a laminina; Lectina L-29; Antígeno Mac-2
Complejo I-B22; Proteína 3 que contiene el motivo LYR; Subcomplejo 1 beta subunidad 9 de NADH deshidrogenasa [ubiquinona]; Subunidad B22 de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
1,327 1,179 1,045
3-Cetoacil-CoAtiolasa; Acetil-CoA aciltransferasa; Beta-cetotiolasa; TP-beta; Subunidad beta de enzima trifuncional, mitocondrial; ADNc FLJ56214, muy similar a subunidad beta de enzima trifuncional, mitocondrial; Proteína no caracterizada putativa HADHB
1,325 1,030 0,972
Proteína 28 residente en el retículo endoplásmico; Proteína 29 residente en el retículo endoplásmico; Proteína 31 residente en el retículo endoplásmico
1,322 1,061 0,938
Correpresor 1 de Alu; Enzima antioxidante B166; Mancha 71BV en 2D-page de tejido hepático; Peroxirredoxina V; Peroxirredoxina-5, mitocondrial; Enzima antioxidante peroxisomal; PLP; Tiorredoxina peroxidasa PMP20; Tiorredoxina reductasa; TPxtipo VI; Proteína no caracterizada putativa PRDX5
1,316 1,071 0,947
SNARE de RE-Golgi de 24 kDa; Homólogo B de proteína implicada en el tráfico de vesículas SEC22; 1 de tipo proteína implicada en el tráfico de vesículas SEC22; Proteína implicada en el tráfico de vesículas SEC22b
1,315 1,023 0,937
Proteína Aralar2 transportadora mitocondrial de unión a calcio; Citrina; 2 transportadora de aspartato glutamato mitocondrial; Miembro 13 de la FAMILIA 25 de portadores de soluto
1,314 1,021 0,944
proteína de tipo RRP12
1,311 1,083 0,961
Proteína 70 residente en el retículo endoplásmico; Proteína 72 residente en el retículo endoplásmico; Proteína disulfuro-isomerasa A4
1,311 1,110 0,980
Miosina-Id
1,308 1,070 0,944
Factor despolimerizante de actina; Destrina
1,306 1,027 0,918
Complejo I-B14.5a; subunidad 7 del subcomplejo 1 alfa de NADH deshidrogenasa [ubiquinona]; subunidad B14.5a de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
1,305 1,115 1,169
Beta-G1; Beta-glucuronidasa
1,297 1,019 0,921
Miembro 3A FAMILIA de elastasa tipo quimotripsina; Elastasa IIIA; Elastasa-3A; Proteasa E
1,297 1,020 0,910
17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa 11; 17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa XI; Antígeno HD-CL-03 asociado a linfoma de células T cutáneo; Deshidrogenasa/reductasa
1,294 1,013 0,895
Miembro de la FAMILIA 8SDR; Estradiol 17-beta-deshidrogenasa 11; Deshidrogenasa/reductasa 2 de cadena corta retiniana
Interleuquina-25; Factor de crecimiento SF20 derivado de células estromáticas; UPF0556 proteína C19orf10
1,292 1,121 0,990
Subunidad 3 del complejo 3; Subunidad III del complejo 3; citocromo b; Subunidad 3 del complejo citocromo b-c1; subunidad del complejo citocromo b de ubiquinol-citocromo-c reductasa
1,287 1,237 1,209
Proteína de unión a la hormona tiroidea celular; p55; Subunidad beta de prolil 4- hidroxilasa; Proteína disulfuro-isomerasa; ADNc FLJ59430, muy similar a Proteína disulfuro-isomerasa (EC 5.3.4.1)
1,285 1,018 0,995
Importina-4; Importina-4b; Proteína 4 de unión a Ran
1,280 1,268 1,137
Proteína regulada por glucosa de 94 kDa; Endoplasmina; Homólogo gp96; Miembro beta 1 de la proteína de choque térmico de 90 kDa; Antígeno 1 de rechazo de tumores
1,277 1,040 1,005
Amino oxidasa [que contiene flavina] A; Monoamino oxidasa tipo A; ADNc FLJ61220, muy similar a Amino oxidasa (que contiene flavina) A (EC 1.4.3.4)
1,276 1,023 0,903
Modificador 1 de pliegue de Ubiquitina
1,269 1,042 1,089
Antígeno NY-CO-4; Factor de elongación 1 -delta
1,267 1,160 1,025
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
3-fosfoadenosina-5-fosfosulfato sintasa; Adenosina-5-fosfosulfato 3-fosfotransferasa; AdenMiisulfato 3-fosfotransferasa; Adenilil-sulfato quinasa; APS quinasa; ATP-sulfurilasa; 3-Fosfoadenosina 5-fosfosulfato sintasa 2 bifuncional; Sulfato adenilato transferasa; Sulfato adenililtransferasa; Sulfurilasa quinasa 2
1,263 0,990 0,874
Alfa-aducina; Subunidad alfa de aducina eritrocítica; Aducina 1 (Alfa); Aducina 1 (Alfa), isoforma CRA_e; Proteína ADD1
1,259 1,110 0,981
Subunidad de 25 kDa de la peptidasa señal microsomal; Subunidad 2 del complejo de peptidasa señal
1,257 0,978 0,863
Quiescina Q6; Sulfhidril oxidasa 1
1,257 1,111 1,053
Acetoacetil-CoAtiolasa; Acetil-CoA acetiltransferasa, mitocondrial; T2
1,255 0,994 0,887
Componente E1 del complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa; 2-oxoglutarato deshidrogenasa, mitocondrial; Alfa-cetoglutarato deshidrogenasa
1,254 0,996 0,933
Complejo III subunidad 7; Complejo III subunidad VII; subunidad 7 del complejo citocromo b-c1; QP-C; Proteína de 14 kDa del complejo ubiquinol-citocromo c reductasa; ADNc FLJ52271, Moderadamente similar a la proteína de 14 kDa del complejo ubiquinol- citocromo c reductasa (EC 1.10.2.2)
1,251 1,078 0,966
Miembro 1 de la FAMILIA del canal de cloruro activado por calcio; Proteína 1 del canal de cloruro activado por calcio; Regulador 1 del canal de cloruro activado por calcio
1,250 0,983 0,905
Componente 4A del complemento (grupo sanguíneo de Rodgers); Proteína no caracterizada putativa c4A; Componente 4B del complemento (grupo sanguíneo de Childo); Componente 4B del complemento (grupo sanguíneo de Childo) 2; C4B1; Componente 4B del complemento (grupo sanguíneo de Childo)
1,249 0,982 0,981
Proteína 1 de interacción con actina; NORI-1; Proteína 1 que contiene la repetición WD; ADNc FLJ58303, muy similar a Proteína 1 de repetición de WD
1,249 1,050 1,050
Catalasa
1,245 0,986 0,951
Subunidad alfa tipo-7 del proteasoma; Subunidad RC6-1 del proteasoma; Subunidad XAPC7 de proteasoma; Subunidad tipo alfa del proteasoma
1,244 0,988 1,122
Proteína 2 de 70 kDa relacionada con el choque térmico; ADNc FLJ40505 fis, clon TESTI2045562, muy similar a PROTEÍNA 2 de 70 kDa RELACIONADA CON EL CHOQUE TÉRMICO
1,244 1,032 0,922
Endopeptidasa SP18; Subunidad de 18 kDa de la peptidasa señal microsomal; Homólogo A de SEC11; Proteína 1 de tipo SEC11; Subunidad SEC11A del complejo catalítico de peptidasa señal; SPC18; ADNc FLJ51313, muy similar a Subunidad de 18 kDa de la peptidasa señal microsomal (EC 3.4.-.-); 1 de tipo SEC11 (S. cerevisiae), isoforma CRA d
1,240 1,009 1,057
Pirofosfatasa inorgánica; Pirofosfato fosfo-hidrolasa; Pirofosfatasa (Inorgánica) 1
1,238 0,962 0,998
Cadena pesada 11 de miosina; Cadena pesada de miosina, isoforma de músculo liso; Miosina-11; SMMHC; Cadena pesada de miosina 11 isoforma de músculo liso
1,234 0,963 0,862
Cadena pesada 1 de clatrina; Cadena pesada de clatrina en cromosoma 17
1,232 0,982 0,869
ViMina-1; ADNc FLJ57609, muy similar a ViNina-1
1,228 0,979 0,871
Proteína V centromérica; Proteína p30 nuclear; Proteína 6 rica en prolina
1,227 1,172 1,067
Catepsina C; Catepsina J; Dipeptidil peptidasa 1; Cadena del domino de exclusión de dipeptidil peptidasa 1; Cadena pesada 1 de dipeptidil peptidasa; Cadena ligera 1 de dipeptidil peptidasa; Dipeptidil peptidasa I; Cadena del domino de exclusión de dipeptidil peptidasa I; Cadena pesada I de dipeptidil peptidasa; Cadena ligera I de dipeptidil peptidasa; Dipeptidil transferasa
1,224 0,962 0,855
Hidroxiacil-coenzima A deshidrogenasa, mitocondrial; L-3-hidroxiacil-coenzima A deshidrogenasa de cadena media y corta; 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena corta
1,224 1,009 0,903
Miembro B1 de la FAMILIA 10 de aldo-ceto reductasa; de tipo aldosa reductasa; proteína
1,223 0,954 0,851
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
relacionada con aldosa reductasa; ARL-1; Reductasa del intestino delgado
Carbonato deshidratasa II; Anhidrasa carbónica 2; Anhidrasa carbónica C; Anhidrasa carbónica II
1,223 1,031 0,910
Proteína no caracterizada putativa PRRC1; Proteína PRRC1
1,223 0,951 0,938
Malato deshidrogenasa citosólica; Malato deshidrogenasa, citoplásmica; Malato deshidrogenasa; Proteína no caracterizada putativa MDH1
1,222 0,988 0,875
Sustrato Src asociado a cadherina; Catenina delta-1; Catenina p120; p120(cas); Proteína no caracterizada putativa CTNND1
1,222 1,013 0,894
Metavinculina; Vinculina
1,221 0,977 0,955
Proteína asociada con anfirregulina; Proteína de la etapa media de la gestación y renal; Midquina; Factor 2 promotor del desarrollo de neuritas; Proteína promotora del desarrollo de neuritas
1,220 1,206 1,070
Proteína no caracterizada putativa APEH; Enzima liberadora de acilaminoácidos; Acilaminoacil-peptidasa; Acil-péptido hidrolasa; Proteína hidrolasa oxidada
1,219 0,973 0,871
Inhibidor de calicreína; calistatina; Inhibidor 4 de peptidasa; Serpina A4
1,218 1,258 1,166
Dihidrolipoamida deshidrogenasa; Dihidrolipoil deshidrogenasa, mitocondrial; Proteína L del sistema de escisión de glicina; ADNc FLJ50515, muy similar a Dihidrolipoil deshidrogenasa, mitocondrial (EC 1.8.1.4); Dihidrolipoil deshidrogenasa
1,213 0,980 0,911
5-aminoimidazol-4-carboxamido ribonucleotido formiltransferasa; AICAR transformilasa; ATIC; Proteína PURH de biosíntesis de purina bifuncional; IMP ciclohidrolasa; IMP sintasa; Inosinicasa; Fosforibosilaminoimidazolcarboxamido formiltransferasa
1,212 0,943 0,864
Proteína 2 relacionada con la patogénesis del glioma; Proteína 1 relacionada con la patogénesis vegetal asociada a Golgi; 2 relacionada con la patogénesis de GLI
1,210 1,027 0,947
Transductor de señales y activador de la transcripción 1-alfa/beta; Componentes p91/p84 de factor de transcripción ISGF-3
1,209 1,167 1,046
PDHE1-Atipo I; Subunidad alfa del componente E1 de la piruvato deshidrogenasa, forma somática, mitocondrial
1,205 0,948 0,932
Glucosa fosfomutasa 1; Fosfoglucomutasa-1; ADNc FLJ50606, muy similar a Fosfoglucomutasa-1 (EC 5.4.2.2)
1,202 0,935 0,998
Proteína de unión a ARN de Alu de 18 kDa; Proteína de 14 kDa de la partícula de reconocimiento de la señal
1,200 1,015 0,912
Isovaleril-CoA deshidrogenasa, mitocondrial; ADNc FLJ16602 fis, clon TESTI4007816, muy similar a Isovaleril-CoA deshidrogenasa, mitocondrial (EC 1.3.99.10); Isovaleril Coenzima A deshidrogenasa, isoforma CRA_b
1,198 1,177 1,045
Proteína 1 asociada a culina y de nedilación disociada; Proteína 1 adociada a culina disociada de NEDD8; p120 CAND1; Proteína de 120 kDa A que interactúa con TPB
1,197 1,039 0,994
Polipéptido Vlc de citocromo c oxidasa; subunidad 6C de citocromo c oxidasa
1,196 1,056 0,935
Subunidad alfa de beta-hexosaminidasa; Subunidad alfa de beta-N- acetilhexosaminidasa; Subunidad alfa N-acetil-beta-glucosaminidasa
1,194 1,105 1,110
HCNPpp; Péptido neuroestimulador colinérgiuco del hipocampo; Neuropolipéptido h3; Proteína 1 de unión a fosfatidilEtanolamina; Proteína de unión prostática; Inhibidor de la proteína Raf quinasa; ADNc FLJ51535, muy similar a proteína 1 de unión a FosfatidilEtanolamina
1,193 0,958 0,996
Serina/treonina proteína quinasa de 59 kDa; ILK-1; ILK-2; Proteína quinasa unida a integrina; p59ILK; ADNc FLJ50979, Moderadamente similar a Proteína quinasa unida a integrina (EC 2.7.11.1); ADNc FLJ53825, muy similar a Proteína quinasa unida a integrina 1 (EC 2.7.11.1)
1,192 1,090 0,965
Cadena alfa-1(XV) de colágeno; Endostatina; Endostatina-XV; Relacionada con
1,188 0,994 0,894
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
endostatina; Restina
Desmoyoquina; Proteína AHNAK asociada a la diferenciación de neuroblastos
1,187 0,968 0,893
Proteína A de unión a proteína 2 de unión a HBeAg; Proteína 1 con defecto en la utilización de Manosa-P-dolicol; Supresordel homólogo con mutación en la glicosilación de Lec15 and Lec35; Proteína My008; ADNc FLJ57793, Moderadamente similar a la proteína 1 con defecto en la utilización de Manosa-P-dolicol; ADNc FLJ14836 fis, clon OVARC1001702
1,183 0,933 0,904
Proteína porina 1 de la membrana mitocondrial externa; Porina del plasmalema; Porina 31HL; Porina 31HM; Proteína 1 del canal selectivo de aniones dependiente del voltaje
1,182 0,920 0,858
Alfa E-catenina; Proteína asociada a cadherina; Catenina alfa-1; Antígeno de carcinoma renal NY-REN-13; ADNc FLJ54047, muy similar a Alfa-1 catenina (Proteína asociada a cadherina); Catenina (Proteína asociada a cadherina), alfa 1, 102 kDa, isoforma CRA c; Proteína CTNNA1
1,180 0,933 0,847
Antígeno KI-67
1,180 1,623 1,483
Glutamato deshidrogenasa 1, mitocondrial; ADNc FLJ55203, muy similar a Glutamato deshidrogenasa 1, mitocondrial (EC 1.4.1.3); ADNc FLJ16138 fis, clon BRALZ2017531, muy similar a Glutamato deshidrogenasa 1, mitocondrial (EC 1.4.1.3); Glutamato deshidrogenasa 1, isoforma CRA_a; Glutamato deshidrogenasa 2, mitocondrial
1,179 0,981 0,896
Complejo I-PDSW; subunidad 10 del subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa [ubiquinona] ; subunidad PDSW de NADH-ubiquinona oxidorreductasa; subcomplejo 1 beta de NADh deshidrogenasa (Ubiquinona), 10, 22kDa, isoforma CRA a; Proteína NDUFB10
1,176 1,263 1,126
Proteína de tipo 2 Hidroxiesteroide deshidrogenasa; ADNc FLJ61200, muy similar a proteína de tipo 2 Hidroxiesteroide deshidrogenasa de Homo sapiens (HSDL2), ARNm
1,175 0,941 0,868
Factor de elongación Ts, mitocondrial; Factor de elongación Ts
1,169 1,294 1,165
Antígeno 5H9; Antígeno CD9; Proteína 2 del gen inhibidor del crecimiento celular; Antígeno MIC3 leucocitario; Proteína relacionada con la motilidad; p24; Tetraspanina-29; Proteína no caracterizada putativa EC9; ADNc FLJ51032, muy similar al antígeno EC9
1,169 0,916 0,826
Homólogo receptor ribosómico de 180 kDa; Proteína relacionada con ES/130; Proteína del receptor ribosómico; Proteína 1 de unión al ribosoma
1,168 0,928 1,046
Sustrato de LYN específico de células hematopoyéticas; Proteína específica del linaje de células hematopoyéticas; LckPB1; p75
1,167 1,083 1,017
DDAHII; Dimetilargininasa-2; N(G),N(G)-dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2; Proteína G6a; Proteína de la fase S; Dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2
1,166 0,968 0,901
Glutatión S-transferasa omega-1; Glutatión S-transferasa omega 1, isoforma CRA a; Glutatión S-transferasa omega 1
1,162 0,906 0,890
Inductor de la condensación de cromatina apoptótica en el núcleo
1,160 1,040 0,920
Miembro A1 de la FAMILIA 6 de aldehído deshidrogenasa; Metilmalonato-semialdehído deshidrogenasa [acilante], mitocondrial
1,158 0,938 0,845
Proteína disulfuro isomerasa P5; Proteína disulfuro-isomerasa A6; Proteína 7 que contiene el dominio tiorredoxina; ADNc FLJ58502, muy similar a proteína disulfuro- isomerasa A6 (EC 5.3.4.1)
1,158 0,924 0,953
Factor 2 de transporte nuclear; Proteína 15 de la placenta
1,157 1,016 0,914
Complejo I-23kD; proteína 8 con hierro-azufre de NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial; 23 kDa subunidad de NADH-ubiquinona oxidorreductasa; subunidad TYKY
1,151 1,148 1,025
Subunidad 5 de complejo III; Subunidad IX del complejo III; subunidad 1 del complejo citocromo b-c11; Subunidad 5 del complejo citocromo b-c1; Subunidad de Rieske del complejo citocromo b-c1, mitocondrial; Proteína azufre-hierro de Rieske; proteína de 8 kDa de ubiquinol-citocromo c reductasa; subunidad hierro-azufre de ubiquinol-citocromo c
1,150 1,059 0,936
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
reductasa; proteína de tipo 1 del complejo citocromo b-c1 de la subunidad de Rieske putativo
Nicotinamida fosforribosiltransferasa; Factor potenciador de colonias de células 1Pre-B; Visfatina; Proteína novedosa similar al factor potenciador de células 1Pre-B (PBEF)
1,148 0,893 0,823
Cremallera de leucina básica y Proteína 2 que contiene el dominio W2; Proteína no caracterizada putativa BZW2; Cremallera de leucina básica y dominios 2 de W2, isoforma CRA b
1,147 0,987 0,974
Subunidad beta de succinil-CoA sintetasa específica de ATP; Antígeno de carcinoma renal NY-REN-39; Subunidad beta de succinil-CoA ligasa [formadora de ADP], mitocondrial; Cadena beta-A de succinil-CoA sintetasa; Succinato-CoA ligasa, Subunidad beta formadora de ADP
1,147 0,928 0,922
3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, mitocondrial; 3-hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolasa
1,145 1,152 1,058
E3 UFM1-proteína ligasa 1
1,143 1,066 1,053
UPF0197 proteína transmembrana C11orf10
1,140 0,886 0,782
Proteína p53 inducida por interferón; T1-TrpRS; T2-TrpRS; Triptófano--ARNt ligasa; Triptofanil-ARNt sintetasa, citoplásmica
1,139 1,201 1,084
2 de tipo proteína D52 tumoral; 2 de tipo proteína D52 tumoral, isoforma CRA_e; Proteína D54 tumoral
1,136 1,002 0,885
Glicógeno fosforilasa, forma cerebral
1,131 0,884 0,787
Proteína de unión a la hormona tiroidea citosólica; Proteína 3 de interacción con Opa; p58; Piruvato quinasa 2/3; isozimas M1/M2 de piruvato quinasa; Isozima muscular de piruvato quinasa; Proteína 1 de unión a la hormona tiroidea; M2-PK tumoral
1,131 1,043 0,931
Proteína regulada por glucosa de 58 kDa; Proteína microsomal de 58 kDa; Disulfuro isomerasa ER-60; Proteína 57 residente en el retículo endoplásmico; Proteína 60 residente en el retículo endoplásmico; Proteína disulfuro-isomerasa A3; ADNc PSEC0175 fis, clon OVARC1000169, muy similar a Proteína disulfuro-isomerasa A3 (EC 5.3.4.1)
1,129 0,910 1,022
Glutatión S-transferasa kappa 1; Subunidad 13 de glutatión S-transferasa; GST 13-13; Kappa de clase GST; GSTK1-1
1,128 0,978 0,995
Enoil-CoA hidratasa 1; Enoil-CoA hidratasa, mitocondrial; Eenoil-CoA hidratasa de cadena corta
1,125 0,890 0,787
Proteína relacionada con la región del cúmulo del punto de rotura activo; ADNc FLJ54747, muy similar a la proteína relacionada con la región del cúmulo del punto de rotura activo
1,124 0,918 0,913
Proteína II asociada a HLA-DR; ADNasa activada por el inhibidor de granzima A; PHAPII; Inhibidor de fosfatasa 2A I2PP2A; Proteína SET; Factor I de activación del molde; Oncogen nuclear SET; Proteína no caracterizada putativa SET
1,118 1,145 1,099
Cadena beta-2 de tubulina; Cadena beta-2C de tubulina
1,117 0,900 0,805
Espectrina beta-II; Cadena beta de fodrina; Cadena beta de espectrina, 1 de cerebro; Espectrina, cadena beta 1 no eritroide
1,117 0,905 0,800
Ciclofilina B; CYP-S1; Peptidil-prolil cis-trans isomerasa B; Rotamasa B; S-ciclofilina
1,115 0,920 0,903
Subunidad a de ATP sintasa; Proteína de 6F-ATPasa
1,112 0,888 0,826
Proteína no caracterizada putativa ARPC4; Subunidad 4 del complejo de proteína 2/3 relacionado con actina; Subunidad de 20 kDa del complejo Arp2/3
1,106 0,931 0,919
Homólogo de carboximetilenbutenolidasa
1,106 0,927 0,820
Fosfoproteína estimulada por vasodilatores
1,106 1,087 0,995
Proteína de unión al receptor de manosa 6-fosfato de 47 kDa; Proteína de selección de carga TIP47; Proteína 1 de unión al receptor de manosa-6-fosfato; Perilipina-3; Proteína 17 placentaria
1,102 0,978 0,917
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Todo-trans-13,14-dihidroretinol saturasa; Todo-trans-retinol 13,14-reductasa
1,099 1,249 1,121
Proteína Beta de envoltura; Subunidad beta del coatómero; p102; ADNc FLJ56271, muy similar a subunidad beta del coatómero; Complejo proteico del coatómero, subunidad beta 2 (Beta principal), isoforma CRA_b
1,097 0,880 0,905
PGAM 1 dependiente de PBG; Fosfoglicerato mutasa 1; Isozima B de fosfoglicerato mutasa
1,096 1,042 0,940
Miembro 5 de la FAMILIA de cadherina; Desmogleína-2; HDGC
1,096 1,083 1,010
Superóxido dismutasa [Mn], mitocondrial; Superóxido dismutasa
1,095 0,871 0,872
Proteína de 15 kDa inducida por interferón; Proteína de 17 kDa inducida por interferón; Proteína que reacciona de forma cruzada con ubiquitina
1,093 0,918 0,810
Proteína 1 que contiene dominio transmembrana y de bobina en espiral; Proteína 4 condominios transmembrana y de bobina en espiral; Proteína con inmunidad cruzada xenogénica PCIA3; Proteína no caracterizada putativa TMCO1
1,092 0,849 0,786
Proteína 280 de unión a actina; Alfa-filamina; Proteína de unión a actina endotelial; Filamina-1; Filamina-A; Filamina no muscular; Filamina A, alfa (Proteína 280 de unión a actina)
1,091 0,939 0,851
Proteína de tipo APB-280; APB-L; de tipo proteína de unión a actina; Filamina-2; Filamina-C; Gamma-filamina
1,089 0,855 0,761
1-acilglicerofosfocolina O-aciltransferasa; 1-acilglicerofosfoserina O-aciltransferasa; Lisofosfatidilcolina aciltransferasa; Lisofosfatidilcolina aciltransferasa 3; Lisofosfatidilserina aciltransferasa; Lisofosfolipido aciltransferasa 5; Proteina 5 que contiene el dominio O-aciltransferasa de unión a membrana; ADNc FLJ55747, muy similar a proteina 5 que contiene el dominio O-aciltransferasa de unión a membrana (EC 2.3.-.-)
1,088 1,242 1,118
Alcohol deshidrogenasa 1C; Subunidad gamma de alcohol deshidrogenasa
1,086 0,976 0,875
Subunidad beta de beta-hexosaminidasa; Cadena A de la subunidad beta de beta- hexosaminidasa; Cadena B de la subunidad beta de beta-hexosaminidasa; Subunidad beta de beta-N-acetilhexosaminidasa; Proteína 7 del protooncogen de cáncer de cérvix; Subunidad beta de N-acetil-beta-glucosaminidasa; ENC-1AS
1,081 0,841 0,811
E3 ubiquitina/ISG15 ligasa TRIM25; Proteína de dedo sensible a estrógeno; Proteína 147 de dedo RING; Proteína 25 que contiene el motivo tripartito; Enzima TRIM25 de conjugación a ubiquitina/ISG15; Proteína 147 de dedo de cinc
1,079 0,982 0,925
p195; Proteína de tipo IQGAP1 activadora de GTPasa Ras
1,078 0,877 0,859
Polipéptido IV de citocromo c oxidasa; isoforma 1 de la subunidad 4 de citocromo c oxidasa, mitocondrial; isoforma 1 de la subunidad IV de citocromo c oxidasa; Proteína COX4I1
1,074 1,097 0,969
Proteasa 1 intramembrana; Antígeno H13 menor de histocompatibilidad; Presenilina proteína de tipo 3; Péptido de peptidasa señal
1,074 0,847 0,768
Complejo I-ASHI; Subunidad 8 del subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial; Subunidad ASHI de NADH-ubiquinona oxidorreductasa; subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa (Ubiquinona), 8, 19kDa; subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa (Ubiquinona), 8, 19kDa, isoforma CRA_a; ADNc FLJ52503, muy similar a la subunidad 8 del subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial (EC 1.6.5.3) (EC 1.6.99.3) (Subunidad ASHI de NADH-ubiquinona oxidorreductasa) (Complejo I-ASHI) (Cl-ASHI)
1,073 0,986 1,194
Catepsina D; Cadena pesada de catepsina D; Cadena ligera de catepsina D
1,070 0,864 0,790
homólogo B de transporte 1 de Golgi; hGOT1a; Proteína 470 de activación de NF-kappa- B putativa; Proteína GOT1 B de transporte de vesículas
1,069 0,834 0,763
Factor 4 de ribosilación de ADP; Proteína no caracterizada putativa ARF4
1,069 0,890 0,832
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Calnexina; IP90; Proteína p88 de unión a antígeno de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad; p90; ADNc FLJ54242, muy similar a Calnexina
1,068 0,857 0,983
Subunidad C8 de macropaína; Subunidad C8 del complejo de endopeptidasa multicatalítico; Componente C8 el proteasoma; Subunidad 3 tipo alfa del proteasoma
1,066 0,845 0,953
Proteína de tipo oxidorreductina-1 endoplásmica; proteína alfa de tipo ERO1; Oxidorreductina-1-L-alfa
1,066 0,875 0,912
Proteína 1 localizada en la interfase de microfibrillas de elastina; EMILINA-1
1,064 0,846 0,788
Proteína p24A de la membrana; Proteína 2 que contiene el dominio emp24 transmembrana ; ADNc FLJ52153, muy similar a Proteína 2 que contiene el dominio emp24 transmembrana
1,059 0,828 0,826
Ribonucleoproteina SS-A/Ro de 60 kDa; Autoantígeno Ro de 60 kDa; Antígeno A2 de síndrome de Sjoegren; Antígeno tipo A del síndrome de Sjoegren; Miembro 2 de la FAMILIA del dominio TROVE; FAMILIA del dominio TROVE, miembro 2; FAMILIA del dominio TROVE, miembro 2, isoforma CRA_c; FAMILIA del dominio TROVE, miembro 2, isoforma CRA_e; FAMILIA del dominio TROVE, miembro 2, isoforma CRA_d
1,057 1,024 0,928
Subunidad catalítica beta de serina/treonina-proteína fosfatasa PP1
1,049 0,850 0,916
Complejo I-49kD; Proteína 2 hierro-azufre de NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial; Subunidad de 49 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa; ADNc, FLJ78876, muy similar a la subunidad de 49 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa, mitocondrial (EC 1.6.5.3)
1,048 0,883 0,931
Glicoproteína GP36b; 2 de lectina de unión a manosa; proteína VIP36 integrante de la membrana vesicular; ADNc FLJ52285, muy similar a proteína VIP36 integrante de la membrana vesicular
1,039 0,809 0,779
Azoreductasa; DT-diaforasa; Menadiona reductasa; NAD(P)H deshidrogenasa [quinona] 1; NAD(P)H:quinona oxidorreductasa 1; Filoquinona reductasa; Quinona reductasa 1; ADNc FLJ50573, muy similar a NAD(P)H deshidrogenasa quinona 1 de Homo sapiens (NQO1), variante 3 del transcrito, ARNm
1,039 0,880 0,848
Fortilina; Factor de liberación de Histamina; p23; Proteína tumoral controlada traduccionalmente; Proteína TPT1; Proteína tumoral, 1 controlada traduccionalmente; Proteína tumoral, 1 controlada traduccionalmente, isoforma CRA a
1,037 0,854 0,770
Proteína del adaptador CMS; Ligando Cas con dominios SH3 múltiples; Proteína asociada a CD2
1,033 1,063 0,962
Proteína 1 de unión a oxisterol
1,032 1,125 1,001
B5; Doliquil-difosfooligosacárido--subunidad STT3A de la proteína glicosiltransferasa; Proteína 1 integrante de membrana; Proteína TMC transmembrana
1,029 0,966 0,888
Subunidad alfa del complejo regulador 11S; Activador de la subunidad 1 de proteasa multicatalítica; Proteína I-5111 regulada al alza por interferón gamma; Subunidad alfa del activador 28 del proteasoma; Subunidad 1 del complejo activador del proteasoma; Proteína no caracterizada putativa PSME1
1,028 1,069 0,953
CFR-1; Receptor del factor de crecimiento de fibroblastos rico en cisteína; ligando 1 de selectina E; Proteína 1 del aparato de Golgi; Sialoglicoproteína MG-160 de Golgi
1,028 0,879 0,890
Proteína D3 transportadora de ubiquitina; Enzima E2 D3 de conjugación a ubiquitina; Enzima E2(17)KB 3 de conjugación a ubiquitina; Enzima E2-17 kDa 3 de conjugación a Ubiquitina; Ubiquitina-proteína ligasa D3; Proteína D2 transportadora de ubiquitina; Enzima E2 D2 de conjugación a ubiquitina; Enzima E2(17)Kb 2 de conjugación a ubiquitina; Enzima E2-17 kDa 2; Ubiquitina-proteína ligasa D2; Proteína transportadora de ubiquitina
1,028 0,940 0,831
Coactivador p15 transcripcional de ARN polimerasa II activado; p14; Cofactor4 positivo; Homólogo SUB1
1,024 0,913 0,818
Transcrito 3 asociado a HLA-B; Proteína BAT3 rica en prolina grande; Proteína G3;
1,024 0,942 0,836
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Transcrito 3 asociado a HLA-B; Transcrito 3 asociado a HLA-B, isoterma CRA_a
Polipéptido II de la citocromo c oxidasa; Subunidad 2 de la citocromo c oxidasa
1,024 1,008 1,048
Histona H1; Histona H1(0); Histona H1.0
1,022 0,846 0,748
4 de tipo proteína asociada a microtúbulos de equinodermo; Proteína asociada a la proliferación expresada en exceso restrictivamente; Ropp 120; Proteína no caracterizada putativa EML4
1,021 0,899 0,822
Fructosa-bisfosfato aldolasa A; Antígeno NY-LU-1 de cáncer de pulmón; Aldolasa de tipo muscular
1,019 0,828 0,750
Proteína de unión a lipoproteínas de alta densidad; Vigilina
1,018 0,791 0,705
Proteína accesoria de 32 kDa; Subunidad d 1 de la bomba de protones vacuolar; Proteína accesoria de 40 kDa V-ATPasa; Subunidad AC39 de V-ATPasa; Subunidad 1 de ATPasa de protones tipo 1V
1,015 0,810 0,900
NADH deshidrogenasa [ubiquinona] flavoproteína 2, mitocondrial; Subunidad de 24 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
1,015 0,833 0,956
3 Embrionaria maternal; Proteína 35 asociada a la clasificación de proteínas vacuolares; 35 de clasificación de proteínas de vesículas
1,013 0,795 0,951
Histona H3
1,013 0,825 0,729
17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2; 20 alfa-hidroxiesteroide deshidrogenasa; E2DH; Estradiol 17-beta-deshidrogenasa 2; 17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa microsomal; Testosterona 17-beta-deshidrogenasa
1,013 1,457 1,303
Proteína de 56 kDa de unión a selenio; Proteína 1 de unión a selenio; ADNc FLJ61035, muy similar a la proteína 1 de unión a selenio; Proteína 1 de unión a selenio
1,013 0,789 0,706
Proteína 19 del gen inductor de la proliferación celular; Subunidad muscular de LDH; Cadena A de L-lactato deshidrogenasa; Antígeno de carcinoma renal NY-REN-59
1,006 0,936 1,001
Proteína 1 de unión estrecha; Proteína ZO-1 de unión estrecha; Proteína 1 de la zona occludens; Proteína 1 de la zónula occludens
1,002 1,323 1,170
Proteína Rab-18 relacionada con Ras; RAB18, miembro de la FAMILIA de oncogenes RAS
1,000 0,849 1,001
Proteína epitelial perdida en el neoplasma; Proteína 1 de unión al dominio LIM y a actina; ADNc FLJ55990, muy similar a la Proteína 1 de unión al dominio LIM y a actina
1,000 0,980 0,875
Proteína 2 reguladora de hierro; Proteína 2 de unión al elemento sensible a hierro
0,999 0,786 0,761
Subunidad beta-2 de proteína G; Subunidad beta-2 de la proteína G(I)/G(S)/G(T) de unión al nucleótido de guanina; Cadena beta 2 de transducina; Proteína no caracterizada putativa GNB2
0,995 0,799 0,785
Proteína S13 ribosomal 40S
0,991 0,857 0,891
Proteína 1/2 de 70 kDa de choque térmico; Proteína 1A/1B de 70 kDa de choque térmico; Proteína 1A de 70kDa de choque térmico
0,989 1,199 1,082
Proteína 1 del dominio LIM y SH3; Proteina del gen 50 metastásico de nódulo linfático; Proteína no caracterizada putativa LASP1; ADNc FLJ51834, muy similar a la proteína 1 del dominio LIM and SH3; ADNc FLJ52195, muy similar a la proteína 1 del dominio LIM y SH3
0,981 0,977 0,872
Proteína L26 ribosomal 60S
0,981 0,765 0,972
Cadena ligera de miosina de 20 kDa; MLC-2C; Cadena ligera 2 reguladora de miosina, isoforma de músculo liso; Cadena ligera 9 reguladora de miosina; Cadena ligera MRLC1 reguladora de miosina; Polipéptido 9 ligero regulador de miosina; Miosina RLC
0,981 1,027 0,924
Subunidad alfa de la proteína G(y) de unión a nucleótido de guanina; Subunidad alfa-11 de la proteína de unión a nucleótido de guanina
0,978 0,764 0,780
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Meg-3; Proteína niban de tipo 1; Proteína FAM129B
0,972 0,829 0,789
Proteína 5 que interactúa con la proteína 6 del factor de ribosilación de ADP; Proteína sensible a vitamina A relacionada con el citoesqueleto; Proteína 11 derivada DE papilas dérmicas; Proteína de interacción con el transportador de glutamato EAAC1; GTRAP3- 18; JM5; Proteína 3 de la FAMILIA PRA1; Proteína 2 del aceptor de Rab prenilado; Proteína JWa; Proteína PM27 de activación de MAPK putativa
0,969 1,128 1,069
Proteína L27 ribosomal 60S
0,968 0,799 0,741
Beta-globina; Cadena beta de hemoglobina; Subunidad beta de hemoglobina; LVV- hemorfina-7
0,967 0,996 1,014
GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa; GDP-L-fucosa sintasa; Proteína FX; Proteína de unión a NADP(H) de eritrocitos; Miembro 1 de la FAMILIA 4E de deshidrogenasa/reductasa de cadena corta
0,964 0,927 0,848
Subunidad 6A reguladora de proteasa 26S; Subunidad RPT526S AAA-ATPasa del proteasoma; ATPasa 3 de la subunidad 26S del proteasoma; Subunidad P50 del proteasoma; Proteína 1 de unión a Tat
0,963 1,125 1,059
Proteína de un ión a apolipoproteína A-I; Proteína 1 que contiene el dominio N-terminal de YjeF
0,958 1,024 0,970
Nucleasa APEX; Endonucleasa 1 apurínica-apirimidínica; DNA-(sitio apurínico o apirimidínico) lisasa; Proteína REF-1
0,954 1,016 0,900
Proteína de 54 kDa de partícula de reconocimiento de la señal
0,953 0,743 0,667
5F7; Basigina; Factor estimulador de colagenasa; Inductor de la metaloproteinasa de la matriz extracelular; Antígeno M6 de activación de leucocitos; antígeno del grupo sanguíneo OK; Factor estimulador de colagenasa derivado de células tumorales
0,952 0,794 0,849
Carboxilasa AIR; Proteína ADE2 multifuncional; Fosforibosilaminoimidazol carboxilasa; Fosforibosilaminoimidazol-succinocarboxamido sintasa; Sintetasa SAICAR
0,952 0,740 0,673
Proteína de 70 kDa de la membrana del peroxisoma; Miembro 3 de la sub-FAMILIA D del casete de unión a ATP
0,951 0,926 0,853
Actina, músculo liso aórtico; Alfa-actina-2; Proteína 46 del gen inhibidor del crecimiento celular; Actina, alfa 1, músculo esquelético
0,951 0,935 0,971
3-Hidroxibutirato deshidrogenasa tipo 2; Miembro 6 de la FAMILIA SDR de deshidrogenasa/reductasa; Oxidorreductasa CUPA; R-beta-hidroxibutirato deshidrogenasa
0,946 0,753 0,896
Cadena ligera 4 de cinesina; Proteína 8 de tipo cinesina; ADNc FLJ58264, muy similar a cadena ligera 4 de cinesina
0,945 1,267 1,218
Enzima 15 de desubiquitinación; Ubiquitina carboxi-terminal hidrolasa 15; Ubiquitina tioesterasa 15; Proteasa 15 de procesamiento específico de ubiquitina; Unph-2; Unph4
0,944 1,145 1,049
Proteína no caracterizada putativa KIAA0664; Proteína KIAA0664
0,933 0,738 0,830
Homólogo de proteína SCO2, mitocondrial
0,928 0,744 0,657
35-alfa calcimedina; Anexina A3; Anexina III; Anexina-3; Inositol 1,2-fosfato cíclico 2- fosfohidrolasa; Lipocortina III; Proteína III anticoagulante placentaria
0,926 1,006 0,966
Inosina fosforilasa; Purina nucleosido fosforilasa
0,919 0,803 0,816
Complejo I-B8; Subunidad 2 del subcomplejo 1 alfa de NADH deshidrogenasa [ubiquinona]; Subunidad B8 de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
0,916 0,719 0,780
Lamina-B2
0,914 0,712 0,910
Molécula 1 del adaptador del transductor de señales; Proteína no caracterizada putativa STAM
0,906 0,965 0,883
Isoforma 1 de calcio ATPasa de la membrana plasmática; Isoforma 1 de la bomba; ATPasa 1 de transporte de calcio de la membrana plasmática
0,896 0,797 0,826
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Carbonil reductasa [NADPH] 3; Carbonil reductasa 3 dependiente NADPH
0,896 1,061 1,298
Subunidad H de ARN polimerasa II ADN-dirigida; Polipéptido de 17,1 kDa de ARN polimerasas I, II, y III ADN-dirigidas; Subunidad RPABC3 de ARN polimerasas I, II, y III ADN-dirigidas; rPb17; Homólogo de RPB8; Proteína no caracterizada putativa PoLr2H
0,892 1,439 1,271
Lamina de 70 kDa; Lamina-A/C; Antígeno de carcinoma renal NY-REN-32; Lamina A/C; Progerina; Antígeno MU-RMS-40.12 de rabdomiosarcoma
0,888 0,914 0,853
Proteína ácida de 22 kDa de enriquecimiento de tejido neuronal; Proteína 1 soluble ácida de cerebro; Proteína NAP-22 de la membrana axónica neuronal
0,888 0,915 0,984
Proteína de tipo 3ADP-factor de ribosilation
0,884 1,055 1,005
Acetilglucosamina fosfomutasa; N-acetilglucosamina-fosfato mutasa; Fosfoacetilglucosamina mutasa; Fosfoglucomutasa-3
0,884 0,712 0,632
Polipéptido VIIc de citocromo c oxidasa; Subunidad 7C de citocromo c oxidasa, mitocondrial
0,879 0,913 0,839
Subunidad de 67 kDa de doliquil-difosfooligosacárido--proteína glicosiltransferasa; Subunidad 1 de doliquil-difosfooligosacárido--proteína glicosiltransferasa; Riboforina I; Riboforina-1; ADNc FLJ50809, muy similar a la subunidad de 67 kDa de doliquil- difosfooligosacárido--proteína glicosiltransferasa (EC 2.4.1.119); ADNc FLJ51908, muy similar a la subunidad de 67 kDa de doliquil-difosfooligosacárido--proteína glicosiltransferasa (EC 2.4.1.119)
0,878 0,715 0,974
Subunidad 7A2 de citocromo c oxidasa, mitocondrial; subunidad VIIa-hígado/corazón de citocromo c oxidasa
0,875 0,705 0,933
Proteína de tráfico transmembrana de 21 kDa; p24delta; S31III125; Tmp-21-I; Proteína 10 que contiene dominio emp24 transmembrana; Proteína Tmp21 transmembrana
0,875 0,690 0,754
Proteína 50A de control del cíclo celular; Proteína 30A transmembrana; ADNc FLJ55687, muy similar a proteína 50A de control del cíclo celular
0,868 2,133 1,883
Proteína 1 sensible al estrés oxidativo; Serina/treonina-proteína quinasa OSR1; Proteína no caracterizada putativa OXSR1
0,864 1,203 1,066
Proteína 3 que contiene el dominio de unión a Acil-CoA; Proteína 1 asociada al complejo de Golgi; Fosfoproteína 1 de Golgi; Proteína GCP60 residente en el aparato de Golgi; Proteína 7 asociada a PBR y PKA; Proteína PAP7 asociada al receptor de benzodiazepina periférico
0,861 1,201 1,111
Piruvato carboxilasa, mitocondrial; Carboxilasa pirúvica; ADNc FLJ60715, muy similar a Piruvato carboxilasa, mitocondrial (EC 6.4.1.1)
0,857 1,001 0,885
Homólogo 1 de la proteína de Staufen de unión a ARN de doble hebra; Staufen, proteína de unión a ARN, homólogo 1 (Drosophila)
0,855 1,316 1,229
Q15149-6
0,851 0,704 1,087
Proteína S19 ribosomal 40S
0,848 0,732 0,944
Plastina específica de intestino; Plastina-1
0,845 1,185 1,053
Nidógeno-2; Osteonidógeno
0,836 1,244 1,104
Antígeno Ga19 de cáncer gástrico; N-alfa-acetiltransferasa 15, subunidad auxiliar NatA; Proteína 1 regulada por el receptor de NMDA; Acetiltransferasa N-terminal; Proteína Tubedown-1; Tbdn100
0,833 0,751 0,704
Proteína S14 ribosomal 40S
0,832 0,654 0,615
Ribonucleoproteína L nuclear heterogénea; ADNc FLJ75895, muy similar a ribonucleoproteína L nuclear heterogénea de Homo sapiens (HNRPL), variante 2 del transcrito, ARNm; Proteína no caracterizada putativa HNRNPL
0,829 0,747 0,663
ADNc FLJ56102, muy similar a calpastatina (CAST) de Homo sapiens, variante 8 del transcrito, ARNm; Inhibidor de calpaína; Calpastatina; Componente BS-17 de esperma;
0,826 0,782 0,694
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
ADNc FLJ56123, muy similar a Calpastatina
Tropomiosina 3; Tropomiosina 3, isoforma CRA b; ADNc FLJ35393 fis, clon SKNSH2000971, muy similar a TROPOMIOSINA, TIPO CITOESQUELÉTICO
0,826 0,829 0,732
Cadena Z de macropaína; Cadena Z del complejo de endopeptidasa multicatalítico; Subunidad tipo beta 7 del proteasoma; Subunidad Z del proteasoma; Subunidad del proteasoma (Prosoma, macropaína), tipo beta, 7; ADNc FLJ60039, muy similar a subunidad tipo beta 7 del proteasoma (EC 3.4.25.1); Subunidad del proteasoma (Prosoma, macropaína), beta tipo, 7, isoforma CRA_b
0,825 0,745 0,685
Polipéptido de 140 kDa de la ARN polimerase II ADN-dirigida; Subunidad B de la ARN polimerasa II ADN-dirigida; Subunidad RPB2 de la ARN polimerase II ADN-dirigida; Subunidad 2 de la ARN polimerasa II; Subunidad B2 de la ARN polimerasa II; Proteína no caracterizada putativa POLR2B
0,824 1,499 1,425
Proteína S7 ribosomal 40S; Proteína no caracterizada putativa RPS7
0,824 0,813 0,982
Proteína 3 asociada al receptor de la hormona tiroidea; Componente de 150 kDa del complejo asociado al receptor de la hormona tiroidea
0,823 1,280 1,131
Homólogo 1 del supresortumoral grande; Serina/treonina-proteína quinasa LATS1; Proteína quinasa WaRTS; Proteína LATS1
0,822 0,768 0,718
Subunidad beta del complejo regulador 11S; Activador de la subunidad 2 de proteasa multicatalítica; Subunidad beta 28 del activador del proteasoma; Subunidad 2 del complejo activador del proteasoma
0,819 1,303 1,157
Antígeno común leucocitario; Tirosina-proteína fosfatasa C de tipo receptor; T200
0,819 0,976 0,975
Proteína 2 de unión estrecha; Proteína ZO-2 de unión estrecha; Proteína 2 de la zona occludens; Proteína 2 de la zónula occludens
0,811 0,919 0,836
Proteína de activación de GTPasa CDC42; Proteína de activación de GTPasa rhoOGAP; p50-RhoGAP; Proteína 1 de activación de GTPasa Rho; Activador de proteína GTPasa pequeña relacionada con Rho; Proteína de activación de GTPasa de tipo 1Rho
0,805 0,963 1,011
Proteinasa 2 neutra activada por calcio; Polipéptido L2 grande de calpaína; Tipo calpaína M; Subunidad catalítica de calpaína-2; Subunidad grande de calpaína-2; Calpaína milimolar
0,804 1,056 1,017
APB125; APB130; Proteína de transporte Sec31A; proteína 1 de tipoSEC31; Proteína A relacionada con SEC31; Proteína de tipoWeb1; Proteína SEC31A
0,798 0,622 0,895
Subunidad beta de flavoproteína de transferencia de electrones
0,797 0,696 0,886
Proteína 2 mediadora de respuestas a colapsina; Proteína 2 relacionada dihidropirimidinasa; N2A3; Fosfoproteína 2 similar a Unc-33
0,796 0,874 1,048
Proteína 27 de la caja DEAD; Probable ARN helicasa DDX27 dependiente de ATP
0,781 1,299 1,171
Cobre amino oxidasa; HPAO; Amino oxidasa primaria de membrana; Amino oxidasa sensible a semicarbazida; Proteína 1 de adherencia vascular
0,778 0,845 0,888
Subunidad de 63 kDa de doliquil-difosfooligosacárido--proteína glicosiltransferasa; Subunidad 2 de doliquil-difosfooligosacárido--proteína glicosiltransferasa; RIBIIR; Riboforina II; Riboforina-2
0,777 0,766 1,033
Argininosuccinato sintasa; Citrulina--aspartato ligasa
0,776 0,987 0,880
Glicoproteína 25L2; Proteína 9 que contiene el dominio emp24 transmembrana
0,772 1,404 1,242
Proteína relacionada con NAP-1; 1 de tipo proteína 1 de ensamblaje del nucleosomas; ADNc FLJ30458 fis, clon BRACE2009421, muy similar a 1 DE TIPO PROTEÍNA 1 DE ENSAMBLAJE DE NUCLEOSOMAS; DNA FLJ58569, muy similar a 1 de tipo proteína 1 de ensamblaje del nucleosomas; ADNc FLJ16112 fis, clon 3NB692001853, muy similar a 1 DE TIPO PROTEÍNA 1 DE ENSAMBLAJE DE NUCLEOSOMAS; 1 de tipo proteína 1 de ensamblaje del nucleosomas, isoforma CRA_c
0,763 1,080 0,954
TESS; Testina
0,761 1,013 0,896
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Fosfohistidina fosfatasa de 14 kDa; Fosfohistidina fosfatasa 1; Homólogo de proteína janus-A
0,761 0,888 0,888
Subunidad beta-1 de proteína G(I)/G(S)/G(T) de unión a nucleótido de guanina; Cadena beta 1 de transducina; proteína (proteína G) de unión a nucleótido de guanina, polipéptido 1 beta
0,758 1,071 1,024
Proteína rica en leucina de 130 kDa; GP130; Proteína que contiene el motivo PPR rico en leucina, mitocondrial
0,756 0,741 0,954
Celugirina; Sinaptogirina-2
0,754 0,685 0,839
c-Ki-ras; c-K-ras; GTPasa KRas; GTPasa KRas, procesadas N-terminalmente; Ki-Ras; K- Ras 2
0,750 1,185 1,075
Proteína 80K-H; Subunidad beta de glucosidasa 2; Subunidad beta de glucosidasa II; Cadena pesada de proteína de 60,1 kDa de sustrato de proteína quinasa C
0,749 0,874 1,036
Haptoglobina; Cadena alfa de haptoglobina; Cadena haptoglobina; Proteína HP
0,746 0,838 1,044
Proteína de 49 kDa que interactúa con la proteína de unión a la caja TATA; Proteína citosólica de eritrocitos de 54 kDa; Subunidad H del complejo INO80; Proteína 238 de la matriz nuclear; Pontina 52; 1 de tipo RuvB; TIP49a; Proteína 54-alfa asociada a TIP60
0,742 0,585 0,524
1 que interactúa con Peptidil-prolil cis-trans isomerasa NIMA; Peptidil-prolil cis-trans isomerasa Pin1; Rotamasa Pin1
0,741 0,769 0,689
Ceramidasa ácida; Subunidad alfa de ceramidasa ácida; Subunidad beta de ceramidasa ácida; Acilesfingosina desacilasa; N-acilesfingosina amidohidrolasa; Proteína cardíaca de 32 kDa putativa
0,740 1,345 1,559
Anexina A2; Anexina II; Anexina-2; Cadena pesada I de calpactina; Cadena pesada 1 de calpactina; Cromobindina B; Lipocortina II; p36; Proteína IV anticoagulante placentaria; Proteína I; Pseudogen 2 de anexina A2; Pseudogen de lipocortina II; Proteína de tipo A2 de anexina putativa; ADNc FLJ34687 fis, clon MESAN2000620, muy similar a Anexina A2
0,740 0,626 0,871
Proteína 1 de translocación; Proteína SEC62 de translocación
0,735 1,515 1,341
Supresor Smu-1 de homólogo de proteína mec-8 y unc-52; Proteína SMU1 que contiene la repetición WD40; ADNc FLJ54259, muy similar a supresor Smu-1 de homólogo de proteína mec-8 y unc-52
0,723 1,363 1,272
UPF0568 proteína C14orf166
0,722 0,730 0,998
NADPH--citocromo P450 reductasa
0,721 1,142 1,009
proteína L3 ribosomal 60S; Proteína B de unión a ARN de TAR de VIH-1; Proteína no caracterizada putativa RPL3
0,715 0,561 0,512
Subunidad 5 del complejo de proteína 2/3 relacionada con actina; Subunidad de 16 kDa del complejo Arp2/3
0,709 0,599 0,724
Citrato sintasa, mitocondrial; Citrato sintasa
0,706 0,689 0,932
ARN helicasa nucleolar de 61 kDa dependiente de ATP; Proteína 21 de la caja DEAD; Proteína 56 de la caja DEAD; Probable ARN helicasa DDX56ATP dependiente de ATP; Proteína no caracterizada putativa DDX56
0,705 0,549 0,971
Proteína SBDS de maduración de ribosomas; Proteína del síndrome de Shwachman- Bodian-Diamond
0,705 0,681 0,704
Selenuro, agua diquinasa 1; Proteína 1 donadora de selenio; Selenofosfato sintasa 1; ADNc FLJ60186, muy similar a Selenuro, agua diquinasa 1 (EC 2.7.9.3); Selenofosfato sintetasa 1; Selenofosfato sintetasa 1, isoforma CRA_a
0,699 1,296 1,294
Subunidad épsilon del factor de intercambio GDP-GTP eIF-2B; Subunidad épsilon del factor eIF-2B de inicio de la traducción
0,691 1,419 1,313
Proteína 1 del dominio LIM C-terminal; Elfina; proteína CLP-36 del dominio LIM; Proteína 1 del dominio PDZ y LIM
0,673 0,568 0,950
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Calciclina; Proteína 2A9 inducible por el factor de crecimiento; MLN 4; Proteína asociada al receptor de prolactina; Proteína S100-A6; Proteína de unión a calcio A6S100
0,672 0,522 0,519
Subunidad de 48 kDa de doliquil-difosfooligosacárido--proteína glicosiltransferasa
0,670 0,522 0,898
ICD-M; IDP; Isocitrato deshidrogenasa [NADP], mitocondrial; ICDH específica de NADP(+); Oxalosuccinato descarboxilasa
0,669 1,139 1,036
Coactivador de 100 kDa; Coactivador p100 de EBNA2; co-activador p100; Proteína 1 que contiene dominio nucleasa estafilocócico; Proteína 11 que contiene el dominio Tudor
0,665 0,600 0,914
Glutarredoxina-1; Tioltransferasa-1
0,656 1,176 1,038
Subunidad grande de la proteína de transferencia de glicéridos microsomal
0,639 1,044 1,044
Proteína beta de la envoltura; Subunidad beta del coatómero
0,638 0,631 0,946
Proteína L23a ribosomal 60S; Proteína no caracterizada putativa RPL23A; Proteína L23a Ribosomal, isoforma CRA_a
0,634 0,711 0,945
eta de proteína 14-3-3; Proteína AS1; Proteína de activación de tirosina 3- monooxigenasa/triptófano 5-monooxigenasa, polipéptido eta
0,626 1,253 1,129
Proteína no caracterizada putativa SUMO1; Proteína 1 modificadora de GAP; Sentrina; Modificador 1 relacionado con ubiquitina pequeño; Homólogo 3 de SMT3; Proteína PIC1 del dominio de homología con ubiquitina; Proteína SMT3C de tipo ubiquitina; Proteína UBL1 de tipo Ubiquitina; Supresor SMT3 del Homólogo 1 de mif dos 3 (Levadura), isoforma CRA c; Supresor SMT3 del homólogo 1 de mif dos 3 (Levadura), isoforma CRA b
0,623 0,485 0,694
Complejo I-15 kDa; Proteína 5 hierro-azufre de NADH deshidrogenasa [ubiquinona]; Subunidad de 15 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
0,622 0,602 0,912
Importina-7; Proteína 7 de unión a Ran
0,621 0,754 0,722
Proteína de tipo Dnm1p/Vps1p; menos dominio carboxilo terminal rico en prolina del miembro de la FAMILIA de dinamina; Proteína de tipo dinamina-1; Proteína de tipo dinamina; Proteína 4 de tipo dinamina; Proteína IV de tipo dinamina; Proteína 1 relacionada con dinamina; ADNc FLJ59504, muy similar a proteína de tipo dinamina-1 (EC 3.6.5.5)
0,614 1,328 1,172
Proteína 1 activada por plaquetas; proteína de unión a poli(A) inducible; Proteína 4 de unión a poliadenilato; Proteína de unión a poli(A), 4 citoplásmica (Forma inducible); Proteína de unión a poli(A), 4 citoplásmica (Forma inducible), isoforma CRA_e
0,611 0,710 0,994
Subunidad alfa de succinil-CoA ligasa [formadora de GDP], mitocondrial; Subunidad alfa de succinil-CoA sintetasa
0,604 0,498 0,906
Proteína del prosoma de 27 kDa; Cadena iota Macropaína; Cadena iota del complejo endopeptidasa multicatalítico; Cadena iota del proteasoma; Subunidad alfa tipo-6 del proteasoma; ADNc FLJ51729, muy similar a subunidad alfa tipo 6 del proteasoma (EC 3.4.25.1) ; Subunidad del proteasoma (Prosoma, Macropaína), alfa tipo, 6, isoforma CRA_a; ADNc FLJ52022, muy similar a subunidad alfa tipo 6 del proteasoma (EC 3.4.25.1) ; ADNc, FLJ79122, muy similar a subunidad alfa tipo 6 del proteasoma (EC 3.4.25.1)
0,603 1,148 1,138
Citosol aminopeptidasa; Aminopeptidasa 3 de leucina; Leucil aminopeptidasa; Peptidasa S; Prolina aminopeptidasa; Prolil aminopeptidasa
0,599 0,963 0,857
Proteína L14 ribosomal 60S; CAG-ISL 7; ADNc FLJ51325, muy similar a proteína L14 ribosomal 60S
0,589 0,522 0,744
ADN topoisomerasa 1; ADN topoisomerasa I
0,575 0,715 0,997
proteína S26 ribosomal 40S; 1 de tipo proteína S26 ribosomal 40S putativa
0,571 0,777 0,753
Inhibidor 1 de disociacion de GDP Rho; Rho-GDI alfa; ADNc FLJ50748, muy similar al Inhibidor 1 de disociación de GDP Rho; Proteína no caracterizada putativa ARHGDIA
0,562 0,438 1,074
Proteína de organización de Hsc70/Hsp90; Antígeno de carcinoma renal NY-REN-11;
0,550 0,715 1,000
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Fosfoproteína 1 inducida por estrés; Proteína IEF SSP 3521 sensible a la transformación
Subunidad delta del receptor de secuencias señal; Subunidad delta de la proteína asociada al translocón; Proteína no caracterizada putativa SSR4
0,548 0,602 0,556
Proteína no caracterizada putativa MUTED
0,547 0,734 0,906
Proteína 3A que contiene el dominio de la FAMILIA AAA de ATPasa
0,544 0,612 0,978
Homólogo C de la proteína de distribución nuclear; Proteína nudC de migración nuclear
0,540 0,429 0,779
Homólogo de la proteína LSM12
0,530 0,932 1,102
Subunidad beta de la proteína Sec61 de transporte de proteínas
0,528 0,579 0,791
Subunidad C5 Macropaína; Subunidad C5 del complejo endopeptidasa multicatalítico; Componente C5 del proteasoma; Cadena gamma del proteasoma; Subunidad beta tipo-1 del proteasoma
0,509 1,172 1,039
Alcohol deshidrogenasa 5; Cadena chi de la clase alcohol deshidrogenasa; Alcohol deshidrogenasa clase-3; Alcohol deshidrogenasa clase-III; Formaldehído deshidrogenasa dependiente de glutatión; S-(hidroximetil)glutationa deshidrogenasa
0,508 0,456 0,936
Proteína 47 de la caja DEAD; Probable ANA helicasa DDX47 dependiente de ATP
0,502 0,638 0,755
Cadena delta Macropaína; Cadena delta del complejo endopeptidasa multicatalítico; Cadena delta del proteasoma; Subunidad beta tipo 6 del proteasoma; Subunidad Y del proteasoma
0,499 1,013 1,008
Cadena 13 del proteasoma; Componente C10-II del proteasoma; Subunidad beta tipo-3 del proteasoma; Cadena theta del proteasoma
0,499 1,147 1,422
Subunidad gamma-5 de la proteína G(I)/G(S)/G(O) de unión a nucleótidos
0,493 0,673 1,014
proteína L35 ribosomal 0S
0,480 0,523 0,899
Proteína no caracterizada putativa DBN1; Proteína de cerebro regulada evolutivamente; Drebrina
0,468 0,770 0,774
ARNt pseudouridina sintasa A; ARNt pseudouridilato sintasa I; ARNt-uridina isomerasa I
0,467 0,877 0,963
Proteína NDRG2; Proteína SyId709613; ADNc FLJ55190, muy similar a Proteína NDRG2
0,467 1,647 1,485
Proteína de tipo AKAP 120; Proteína de 350 kDa ancla de quinasa A; Proteína de 450 kDa ancla de quinasa A; Proteína 9 ancla de quinasa A; Proteína asociada a PKN localizada en el Centrosoma y Golgi; Proteína hiperión; Proteína 9 de anclaje a proteína quinasa A; Proteína yotiao
0,465 0,785 0,703
Anandamida amidohidrolasa 1; Acido grado amida hidrolasa 1; Oleamida hidrolasa 1
0,462 0,612 1,046
Acil-coenzima Atioesterasa 13; Miembro 2 de la superFAMILIA de tioesterasas
0,461 1,134 1,032
Proteína S21 ribosomal 40S; Proteína RPS21; Proteína S21 ribosomal; Proteína S21 ribosomal, isoforma CRA_e
0,456 0,594 0,980
Cofactor p47 de NSFL1; cofactor p47 de p97; Proteína 2C que contiene el dominio UBX
0,448 0,600 1,023
Glutarredoxina-3; Primo de tiorredoxina que interactúa con PKC; Proteína que interactúa con PKC-theta; Proteína de tipo 2 de tiorredoxina
0,445 0,808 0,971
Proteína en cristales de Charcot-Leyden; CLC; Lisofosfolipasa de eosinófilos; Galectina- 10; Lisolecitina acilhidrolasa
0,445 1,579 1,477
Proteína 2 de tipo LanC; Proteína con sensibilidad a adriamicina específica de testículos
0,441 1,599 1,423
Dimetilaliltranstransferasa; Farnesil difosfato sintasa; Farnesil pirofosfato sintasa; Geraniltranstransferasa
0,441 0,469 0,821
Subunidad 7 reguladora de proteasa 26S; subunidad RPT1 26S de AAA-ATPasa del proteasoma; ATPasa 2 de la subunidad 26S del proteasoma; Proteína MSS1; ADNc FLJ52353, muy similar a la subunidad 7 reguladora de proteasa 26S
0,436 0,409 0,774
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
CCT-épsilon; Subunidad épsilon de la proteína 1 del complejo T
0,432 0,768 0,859
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
0,428 0,605 0,994
Proteína Rab-6A relacionada con Ras
0,427 0,874 1,046
4b de tipo proteína 1 de ensamblaje de nucleosomas; Proteína no caracterizada putativa NAP1 L4; 4 de tipo proteína 1 de ensamblaje de nucleosomas; Proteína 2 de ensamblaje de nucleosomas
0,426 0,331 0,996
Miosina-VI; Miosina-6 no convencional
0,422 0,789 0,865
Subunidad 3 reguladora no ATPásica del proteasoma 26S; subunidad RPN3 reguladora del proteasoma 26S; subunidad S3 reguladora del proteasoma 26S; Subunidad p58 del proteasoma; ADNc FLJ54148, muy similar a la Subunidad 3 reguladora no ATPásica del proteasoma 26S
0,420 0,562 0,992
Inhibidor de ribonucleasa placentaria; Inhibidor de Ribonucleasa; Inhibidor 1 de ribonucleasa/angiogenina
0,419 0,470 0,883
Proteína de 30 kDa del prosoma; Subunidad C2 Macropaína; Subunidad C2 del complejo endopeptidasa multicatalítico; Componente C2 del proteasoma; Cadena nu del proteasoma; 1 de tipo subunidad alfa del proteasoma; Tipo subunidad alfa del proteasoma
0,402 0,563 0,994
IMPDH-II; Inosina-5-monofosfato deshidrogenasa 2
0,401 0,356 0,652
Antagonista de Bax seleccionado en Saccharomyces 1; Proteína de unión al elemento regulador negativo; Proteína DPB-5; Proteína SON; SON3
0,401 0,560 0,906
AGX-1; AGX-2; Antígeno X; Antígeno 2 asociado a esperma; UDP-N-acetilgalactosamina pirofosforilasa; UDP-N-acetilglucosamina pirofosforilasa; UDP-N-acetilhexosamina pirofosforilasa; UDP-N-acetilglucosamina pirofosforilasa 1
0,400 1,176 1,039
Proteína 4 de choque térmico de 70 kDa; Proteína APG-2 relacionada con choque térmico 70; HSP70RY
0,390 1,029 1,069
Factor de motilidad autocrino; Glucosa-6-fosfato isomerasa; Neuroleuquina; Fosfoglucosa isomerasa; Fosfohexosa isomerasa; Antígeno 36 de esperma
0,383 0,317 0,849
Helicasa SMARCA2 dependiente de ATP; Factor 190B asociado a BRG1; Probable activador de la transcripción global SNF2L2; Homólogo de proteína brahma; SNF2-alfa; Miembro 2 de la subFAMILIA A del regulador de cromatina dependiente de actina asociado a la matriz relacionado con SWI/SNF
0,379 0,669 1,095
Homólogo PEP11; Proteína 29 asociada con la clasificación de proteínas vacuolares; 29 de clasificación de proteínas de las vesículas
0,366 1,199 1,100
Enzima 7 de desubiquitinación; Proteasa específica de ubiquitina asociada a Herpesvirus; Hidrolasa 7 carboxi terminal de ubiquitina; tioesterasa 7 de ubiquitina; Proteasa 7 de procesamiento específico de ubiquitina; Hidrolasa carboxi terminal de ubiquitina
0,365 0,730 0,991
Proteína 1 inducida por butirato; Proteína PTPLAD1 de tipo proteína tirosina fosfatasa; Proteína 1 que contiene dominio A de tipo proteína tirosina fosfatasa; ADNc FLJ54138, muy similar a transcrito 1 inducido por butirato de Homo sapiens (HSPC121), ARNm
0,365 0,301 0,736
Aminooxidasa [que contiene flavina] B; Monoaminooxidasa tipo B; ADNc FLJ51821, muy similar a Aminooxidasa (que contiene flavina) B (EC 1.4.3.4); ADNc FLJ52418, muy similar a Aminooxidasa (que contiene flavina) B (EC 1.4.3.4)
0,364 1,217 1,126
Proteína 21 del gen inductor de la proliferación celular; 1 de tipo subunidad beta-2 de la proteína de unión a nucleótido de guanina; Proteína 12.3 de tipo subunidad beta de proteína de unión a nucleótido de guanina; Proteína 7 del oncogen de cáncer de pulmón humano; Receptor para quinasa C activada; Receptor de proteína quinasa C 1 activada
0,361 0,644 0,979
Subunidad alfa CAAX farnesiltransferasa; FTasa-alfa; Subunidad alfa tipo 1 de proteína farnesiltransferasa/geranilgeraniltransferasa; Subunidad alfa de preniltransferasa de proteínas Ras; subunidad alfa proteína geranil-geraniltransferasa tipo 1
0,356 1,417 1,499
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Antígeno 1F5; Factor de restricción homólogo de 20 kDa; Glicoproteína CD59; Proteína inhibidora de MAC; antígeno MEM43; Factor de inhibición del complejo de ataque a la membrana; Inhibidor de membrana de la lisis reactiva; Protectina
0,354 1,131 1,368
Miembro A1 de la FAMILIA 1 de aldehído deshidrogenasa; Aldehído deshidrogenasa, citosólica; ALDH-E1; ALHDII; Retinal deshidrogenasa 1
0,348 0,678 1,002
Glicina hidroximetiltransferasa; Serina hidroximetiltransferasa, mitocondrial; Serina metilasa; ADNc FLJ58585, muy similar a Serina hidroximetiltransferasa, mitocondrial (EC 2.1.2.1); Serina hidroximetiltransferasa 2 (Mitocondrial), isoforma CRA_h
0,345 0,677 0,978
Cadena Z Macropaína; Cadena zeta del complejo endopeptidasa multicatalítico; subunidad alfa de tipo 5 del proteasoma; Cadena zeta del proteasoma; ADNc FLJ52182, muy similar a subunidad alfa de tipo 5 del proteasoma (EC 3.4.25.1); Subunidad del proteasoma (Prosoma, macropaína), tipo alfa, 5, isoforma CRA_c
0,339 0,954 0,900
Metionina--ARNt ligasa; Metionil-ARNt sintetasa, citoplasmica; Proteína MARS no caracterizada putativa; ADNc FLJ16674 fis, clon THYMU3008136, muy similar a Metionil- ARNt sintetasa (EC 6.1.1.10)
0,325 0,537 0,977
Importina-9; Proteína 9 de unión a Ran
0,320 0,530 0,801
Factor de empalme SRP75Pre-ARNm; Factor de empalme, 4 rico en arginina/serina; SRP001 LB
0,310 1,096 1,336
Homólogo 2 de proteína de gradiente anterior; HPC8; Homólogo XAG-2 de la proteína de la glándula de cemento secretada; Proteína AGR2 no caracterizada putativa
0,310 1,524 1,365
Cadena A del factor XIII de coagulación; Cadena A de la proteína glutamina gamma- glutamiltransferasa; Cadena A de transglutaminasa
0,306 1,379 1,397
Factor MCM2 que autoriza la replicación de ADN; Homólogo 2 de la proteína de mantenimiento del minicromosoma; Proteína nuclear BM28
0,303 0,555 0,981
Proteína transportadora de fosfato, mitocondrial; proteína transportadora de fosfato; Miembro 3 de la FAMILIA 25 de transportadores de soluto
0,299 0,569 0,911
CCT-beta; Subunidad beta de la proteína 1 del complejo T
0,291 0,540 0,980
+++Homólogo 3 de la proteína ftsJ; ARNr metiltransferasa 3 putativa; ARNr (uridina-2-O- )-metiltransferasa 3
0,286 0,995 1,042
Homólogo 2 de la proteína nuclear de tipo alta movilidad; Proteína 1 de tipo NHP2; OTK27; Homólogo de SNU13; Proteína de 15,5 kDa U4/U6.U5 tri-snRNP; 1 Tipo proteína 2 no histónica del cromosoma NHP2 (S. cerevisiae)
0,280 0,676 0,992
CCT-gamma; hTRiC5; Subunidad gamma de la proteína 1 del complejo T
0,278 0,521 0,867
Proteína 200 de la matriz nuclear; Factor 19 de procesamiento Pre-ARNm; Homólogo de PRP19/PSO4; Factor de evasión de senescencia
0,276 0,291 0,352
Homólogo de la proteína mago nashi; ADNc FLJ55283, moderadamente similar al homólogo de la proteína mago nashi; Homólogo de mago-nashi, asociado a la proliferación (Drosophila); Homólogo de mago-nashi, asociado a la proliferación (Drosophila), isoforma CRA a
0,272 1,125 1,047
Manosa-6-fosfato isomerasa; Fosfohexomutasa; Fosfomanosa isomerasa; Isoforma de manosa fosfato isomerasa
0,261 0,847 0,931
Translocasa carnitina/acilcarnitina; Proteína transportadora carnitina/acilcarnitina mitocondrial; Miembro 20 de la familia 25 de transportadores de soluto; ADNc FLJ53016, muy similar a la proteína transportadora de carnitina/acilcarnitina mitocondrial
0,254 1,064 1,024
Caspasa-1; Subunidad p10 de caspasa-1; Subunidad p20 de caspasa-1; Convertasa beta de interleuquina-1; Enzima conversora beta de interleuquina-1; p45; ADNc FLJ59442, muy similar a Caspasa-1 (EC 3.4.22.36)
0,252 1,158 1,068
Proteína S4 ribosomal 40S, isoforma X; SCR10; Proteína de ARNm abundante de una sola copia
0,252 0,522 0,958
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Dipeptidil aminopeptidasa II; Dipeptidil peptidasa 2; Dipeptidil peptidasa 7; Dipeptidil peptidasa II; Prolina dipeptidasa de células quiescentes
0,248 1,042 0,922
Homólogo 2 de proteína mago nashi; Proteína MAGOHB no caracterizada putativa
0,240 1,337 1,259
Aldolasa de tipo cerebral; Fructosa-bisfosfato aldolasa C; Fructosa-bisfosfato aldolasa; Proteína ALDOC no caracterizada putativa
0,236 0,954 0,892
Proteína Rab-1A relacionada con Ras; Proteína relacionada con YPT1; ADNc FLJ57768, muy similar a la proteína Rab 1b relacionada con Ras
0,230 0,572 0,900
Miosina I de borde en cepillo; Cadena pesada de miosina I; Miosina-la
0,222 1,238 1,241
Homólogo de CDC21; Factor MCM4 que autoriza la replicación de ADN; P1-CDC21
0,220 0,172 0,646
Proteína de choque térmico de 28 kDa; Proteína de 24 kDa regulada por estrógenos; Proteína de choque térmico de 27 kDa; Proteína beta-1 de choque térmico; Proteína 27 sensible al estrés; ADNc FLJ52243, muy similar a la proteína beta-1 de choque térmico
0,208 0,621 0,941
ARN helicasa DDX19A dependiente de ATP; Proteína de tipo DDX19; Proteína 19A de la caja DEAD; ARN helicasa DDX19B dependiente de ATP; Proteína 19B de la caja DEAD; aRn helicasa DEAD5 de la caja DEAD; ADNc FLJ52463, muy similar a la ARN helicasa DDX19A dependiente de ATP (EC 3.6.1.-)
0,207 0,443 0,447
Proteína 76 de unión a ARN de doble hebra; Factor 3 de unión al potenciador de interleuquina; Fosfoproteína 4 de la fase M; Factor nuclear asociado con ARNdh; Factor nuclear de células T activadas de 90 kDa; Proteína 80 de control traduccional; Proteína ILF3 no caracterizada putativa; ADNc FLJ58801, muy similar al factor 3 de unión al potenciador de interleuquina
0,202 0,696 0,934
Proteína 6 de dedo PHD; Proteína de dedo de cinc de tipo PHD; ADNc FLJ60207, muy similar a la proteína 6 de dedo PHD; Proteína 6 de dedo PHD, isoforma CRA_d
0,201 1,197 1,485
Miembro 1 de la familia 25 de glicosiltransferasa; Hidroxilisina galactosiltransferasa 1; Procolágeno galactosiltransferasa 1
0,197 0,183 1,063
D-fructosa-6-fosfato amidotransferasa 2; Glucosamina--fructosa-6-fosfato aminotransferasa [isomerizante] 2; Glutamina:fructosa 6 fosfato amidotransferasa 2; Hexosafosfato aminotransferasa 2
0,197 1,720 1,634
CCT-delta; Estimulator de la unión de ARN a TAR; Subunidad delta de la proteína 1 del complejo T
0,189 0,562 0,972
5-3 Exorribonucleasa 2; Proteína de tipo DHM1; ADNc FLJ55645, muy similar a 5-3 exorribonucleasa 2 (EC 3.1.11.-)
0,187 0,495 0,838
Proteína 2a del grupo de alta movilidad; Proteína 4 del grupo de alta movilidad; Proteína B3 del grupo de alta movilidad
0,182 0,609 1,217
CCT-theta; Antígeno de carcinoma renal NY-REN-15; Subunidad theta de la proteína 1 del complejo T; ADNc FLJ53379, muy similar a la subunidad theta de la proteína 1 del complejo T; ADNc FLJ59382, muy similar a la subunidad theta de la proteína 1 del complejo T
0,181 0,581 0,962
Antígeno CD63; Granulofisina; Proteína 3 de membrana asociada al lisosoma; Antígeno ME491 asociado al melanoma; Antígeno asociado al melanoma ocular; OMA81H; Tetraspanina-30; Proteína EC63 no caracterizada putativa; Variante de la proteína 3 de la membrana asociada al lisosoma
0,180 0,953 0,884
Sideroflexina-1; Proteína transportadora de tricarboxilato
0,178 0,600 0,965
Fosfopantotenato--cisteína ligasa; Fosfopantotenoilcisteína sintetasa
0,178 0,853 1,016
CCT-alfa; Subunidad alfa de la proteína 1 asociada al complejo T
0,175 0,864 0,990
Miembro A1 de la familia 18 de la aldehído deshidrogenasa; Delta-1-pirrolino-5- carboxilato sintasa; Gamma-glutamil quinasa; Gamma-glutamil fosfato reductasa; Glutamato 5-quinasa; Glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa; Glutamil-gamma- semialdehído deshidrogenasa
0,174 0,757 0,868
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Alfa-II espectrina; Cadena alfa de fodrina; Cadena alfa de espectrina, cerebro; Espectrina, cadena alfa no eritroide; Proteína SPTAN1 no caracterizada putativa; ADNc FLJ59116, muy similar a la cadena alfa de espectrina, cerebro
0,173 0,562 0,960
Delta(3,5)-Delta(2,4)-dienoil-CoA isomerasa, mitocondrial
0,167 0,512 0,972
Farnesil-difosfato farnesiltransferasa; FPP:FPP farnesiltransferasa; Escualeno sintasa; ADNc FLJ50548, muy similar a Escualeno sintetasa (EC 2.5.1.21); ADNc FLJ50447, muy similar a Escualeno sintetasa (EC 2.5.1.21); ADNc, FLJ78892, muy similar a Escualeno sintetasa (EC 2.5.1.21); ADNc, FLJ79250, muy similar a Escualeno sintetasa (EC 2.5.1.21); ADNc, FLJ79430, muy similar a Escualeno sintetasa (EC 2.5.1.21); ADNc FLJ50660, muy similar a Escualeno sintetasa (EC 2.5.1.21); ADNc, FLJ79433, muy similar a Escualeno sintetasa (EC 2.5.1.21); ADNc FLJ33164 fis, clon UTERU2000542, muy similar a Escualeno sintetasa (EC 2.5.1.21)
0,167 0,280 0,600
Proteína 30 de caja DEAH; ARN helicasa DHX30 dependiente de ATP
0,162 0,794 1,002
Coenzima A sintasa bifuncional; Desfosfo-CoA quinasa; Desfosfo-CoA pirofosforilasa; Desfosfocoenzima A quinasa; NPB; Panteteína-fosfato adenililtransferasa; Fosfopanteteína adenililtransferasa; POV-2
0,162 1,139 1,115
Subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN; DNPK1; p460
0,161 0,579 0,967
Homólogo de CDC46; Factor MCM5 que autoriza la replicación del ADN; P1-CDC46; deficiente mantenimiento del minicromosoma 5 MCM5, ciclo 46 del ciclo celular (S. cerevisiae), isoforma CRA_c; Componente 5 del complejo de mantenimiento del minicromosoma
0,159 0,349 0,925
Proteína A1S9; Enzima E1 activadora de ubiquitina; Enzima 1 activadora de modificador de tipo ubiquitina; ADNc FLJ54582, muy similar a la enzima E1 activadora de ubiquitina
0,156 0,683 0,940
CNDP dipeptidasa 2; Dipeptidasa no específica citosólica; Proteína 1 de tipo glutamato carboxipeptidasa; Peptidasa A
0,155 1,122 0,999
Proteína Rab-5B relacionada con Ras; ADNc FLJ60627, muy similar a la proteína Rab- 5B relacionada con Ras; RAB5B, miembro de la familia del oncogén RAS, isoforma CRA_b
0,152 0,305 0,369
Nucleoporina de 358 kDa; E3 SUMO-proteína ligasa RanPB2; Proteína Nup358 del complejo de poro nuclear; Nucleoporina Nup358; p270; Proteína 2 de unión a Ran
0,152 0,806 0,988
Proteína 2 de los paraspeckles; Proteína 14 del motivo de unión a ARN; Proteína 14 de unión a ARN; RRM que contiene coactivador activador/modulador; Proteína que interacciona con sinaptotagmina
0,142 0,762 0,779
Proteína de dedo de cinc 11; Factor de unión a CCCTC; Parálogo de CTCFL; CTCF represor transcripcional; Proteína CTCF no caracterizada putativa
0,131 0,524 1,286
6-Fosfofructoquinasa, tipo muscular; Isozima A de fosfofructo-1-quinasa; Fosfofructoquinasa 1; Fosfohexoquinasa
0,124 0,812 1,019
Proteína p19 asociada a ciclina-A/CDK2; Proteína 2 del órgano de Corti; Proteína II del órgano de Corti; p19A; p19skp1; Proteína de tipo factor de elongación de ARN polimerasa II; SIII; Proteína 1 asociada a quinasa en fase S; Factor B de elongación de la transcripción
0,123 0,644 0,779
Proteína 1 reguladora de la familia DRG; Probablemente ortólogo de la eritropoyetina 4 de respuesta temprana inmediata de ratón; Proteína 15 que contiene el dominio CCCH de dedo de cinc
0,121 0,869 0,890
Proteína L53 ribosomal 39S, mitocondrial
0,119 0,960 0,919
Proteína mitocondrial inducida por Met; Homólogo 2 de transportador mitocondrial
0,116 0,476 0,951
Proteína H105e3; Esterol-4-alfa-carboxilato 3-deshidrogenasa, descarboxilante; Proteína NSDHL no caracterizada putativa
0,105 1,222 1,087
Bw-45; Antígeno de histocompatibilidad de clase I de HLA, cadena alfa B-45; Antígeno B*45 de clase I de MHC
0,095 0,796 0,733
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Proteína de interacción con Hsc70; Proteína p48 asociada con el receptor de progesterona; Proteína FAM10A1; Supresor tumoral ST13 putativo; Antígeno de carcinoma renal NY-REN-33; Proteína 13 de supresión de la tumorigenicidad; Proteína ST13; Proteína FAM10A5 putativa; Proteína FAM10A4 putativa
0,095 0,714 0,961
Subunidad MERIT40 del complejo BRCA1-A; Mediador de interacciones RAP80 y subunidad de direccionamiento de 40 kDa; Nuevo componente del complejo BRCA1-A
0,091 0,275 0,504
Fosfoproteína 50 de unión a ezrina-radixina-moesina; cofactor regulador del intercambio de Na(+)/H(+) NHE-RF1; Cofactor regulador del intercambiador Na(+)/H(+); Factor 1 regulador del intercambiador de sodio-hidrógeno; Factor 1 regulador de la isoforma A3 de la familia 9 de transportadores de soluto
0,088 0,557 0,968
Valil-ARNt sintetasa; Proteína G7a; Valina--ARNt ligasa
0,084 0,710 0,910
Proteína 2 transactivada HCV F; Proteína 5 regulada al alza durante el crecimiento de músculo esquelético
0,083 0,468 0,994
Proteína G alfa estimuladora de adenilato ciclasa; Proteína alfa extra grande; Isoformas XLa de la subunidad alfa de proteínas G de unión al nucleótido guanina; Proteína GNAS no caracterizada putativa; Isoformas cortas de la subunidad alfa de proteínas G de unión al nucleótido guanina
0,073 1,209 1,091
CCT-eta; Proteína de interacción con Nef de VIH-1; Subunidad eta de la proteína 1 del complejo T; Proteína CCT7 no caracterizada putativa; ADNc FLJ59454, muy similar a la subunidad eta de la proteína 1 del complejo T; Chaperonina que contiene TCP1, subunidad 7 (Eta), isoforma CRA_a
0,071 0,574 0,934
Cadena alfa 1 del colágeno (VI); ADNc FLJ61362, muy similar a la cadena alfa-1 de colágeno (VI)
0,068 1,608 1,496
Proteína 1 de unión a ARF; E3 ubiquitina-proteína ligasa HUWE1; Proteína 1 que contiene los dominios HECT, UBA y WWE; Homóloga a la proteína 9 homóloga al extremo carboxilo de E6AP; Estructura grande de UREB1; Mcl-1 ubiquitina ligasa E3; Proteína 1 de unión al elemento regulador aguas arriba
0,066 0,661 0,963
Alfa-1-glicoproteína ácida 2; Orosomucoide-2
0,060 1,836 1,804
Homólogo 3A de la proteína NipSnap; Homólogo 4 de la proteína NipSnap; Diana para la proteína C secretada por Salmonella
0,060 0,931 1,090
Proteína 1 antioxidante; HBC189; Peroxirredoxina III; Peroxirredoxina-3; Homólogo de la proteína MER5; Peróxido reductasa dependiente de tiorredoxina, mitocondrial
0,058 0,578 0,972
Aspartato carbamoiltransferasa; Proteína CAD; Dihidroorotasa; Carbamoil-fosfato sintasa dependiente de glutamina
0,049 0,820 0,923
Proteína 1 del aparato mitótico nuclear; Antígeno SP-H
0,045 0,486 0,961
Nucleoporina de 50 kDa; Proteína Nup50 del complejo de poro nuclear; de tipo proteína de 60 kDa asociada al poro nuclear; Nucleoporina Nup50
0,043 0,036 0,745
[Proteína transtransportadora de acilo] S-acetiltransferasa; [Proteína transtransportadora de acilo] S-maloniltransferasa; 3-hidroxipalmitoil-[proteína transtransportadora de acilo] deshidratasa; 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] reductasa; 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] sintasa; Enoil-[proteína transportadora de acilo] reductasa; Ácido graso sintasa; Oleoil-[proteína transtransportadora de acilo] hidrolasa
0,035 0,582 0,581
Proteína Msh6 de reparación de emparejamientos erróneos del ADN; Proteína de unión al emparejamiento erróneo G/T; Subunidad de 160 kDa de MutS-alfa; ADNc FLJ55677, muy similar a la proteína MSH6 de reparación de emparejamientos erróneos en el ADN
0,029 0,674 0,714
Ribonucleoproteína nuclear heterogénea H; Ribonucleoproteína nuclear heterogénea H, procesada N-terminalmente
0,025 0,583 0,972
Proteína-tirosina fosfatasa 1D; Proteína-tirosina fosfatasa 2C; SH-PTP2; SH-PTP3; Tirosina-proteína fosfatasa no receptora tipo 11
0,018 0,430 0,913
ARN helicasa A dependiente de ATP; Proteína 9 de caja DEAH; ADN helicasa II nuclear
0,006 0,562 0,967
Comp 1 Comp 2 Comp 3
Variable
VIP VIP VIP
Cisteína dioxigenasa tipo 1; Cisteína dioxigenasa tipo I
0,005 1,364 1,209
Se ha observado que ciertas proteínas mitocondriales se expresan diferencialmente y sus niveles pueden asociarse con la presencia o ausencia de enfermedad CU o EC. Por ejemplo, los genes de sulfodioxigenasa (ETHE1), tiosulfato sulfotransferasa (TST), subunidad IV de citocromo c oxidasa, sulfuro deshidrogenasa (SQR) y los 5 complejos III y IV de la cadena respiratoria mitocondrial obtenidos a partir de una muestra de moco intestinal de un sujeto humano pueden ser indicativos de la presencia de CU o EC o EII en el sujeto. Sin embargo, se apreciará que también se puede utilizar cualquier otra proteína enumerada en la tabla 4 o 5, sola o en una combinación que es o son expresadas diferencialmente, para evaluar la presencia/ausencia/gravedad de la enfermedad CU o EC.
La expresión de ciertas citocinas por encima de los niveles normales también se puede utilizar para detectar la 10 presencia de A. parvulum. Por ejemplo, la presencia de A. parvulum se correlaciona con la expresión (o expresión anormalmente alta) de CxcI1, II17a, II12 y II1p. Por lo tanto, se proporciona un ensayo para identificar la probabilidad de que un individuo tenga CU o EC o EII midiendo una abundancia relativa de A. parvulum midiendo la expresión de CxcI1, II17a, II12 o II1p. Esta correlación también se puede utilizar para proporcionar un método de diagnóstico que comprende recoger muestras para medir una o más citocinas, determinar la presencia de A. parvulum basándose en 15 la medición de las citocinas y establecer un diagnóstico.
Tabla 5 Lista de todas las proteínas mitocondriales expresadas diferencialmente y su importancia variable en las puntuaciones de proyección (VIP) derivadas del modelo de PLS-DA calculado.
Tabla 5
Variable
Comp. 1 Comp. 2 Comp .3
VIP
VIP
VIP
Complejo I-PDSW; subunidad 10 del subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa [ubiquinona]; subunidad PDSW de NADH-ubiquinona oxidorreductasa; subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa (Ubiquinona), 10, 22kDa, isoforma CRA_a; Proteína NdUfB10
1,834 1,448 1,178
Complejo I-75kD; subunidad de 75 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa, mitocondrial; ADNc FLJ60586, muy similar a la subunidad de 75 kDa NADH-ubiquinona oxidorreductasa, mitocondrial (EC 1.6.5.3)
1,788 1,323 1,100
Isovaleril-CoA deshidrogenasa, mitocondrial; ADNc FLJ16602 fis, clon TESTI4007816, muy similar a Isovaleril-CoA deshidrogenasa, mitocondrial (EC 1.3.99.10); Isovaleril Coenzima A deshidrogenasa, isoforma CRA_b
1,748 1,559 1,324
Complejo I-39kD; subunidad 9 de subcomplejo 1 alfa de NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial; subunidad de 39 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
1,706 1,331 1,100
Polipéptido Vb de citocromo c oxidasa; subunidad 5B de citocromo c oxidasa, mitocondrial
1,666 1,237 1,006
Subunidad 5 del complejo III; Subunidad IX del complejo III; subunidad 11 del complejo citocromo b-c1; Subunidad 5 del complejo citocromo b-c1; Subunidad de Rieske del complejo citocromo b-c1, mitocondrial; Proteína azufre-hierro de Rieske; Proteína de 8 kDa de ubiquinol-citocromo c reductasa; Subunidad hierro-azufre de ubiquinol-citocromo c reductasa; proteína 1 de tipo subunidad de Riesjke del complejo citocromo b-c1 putativa
1,658 1,249 1,038
Subunidad 7 del complejo III; Subunidad VII del complejo III; subunidad 7 del complejo citocromo b-c1; QP-C; Proteína de 14 kDa del complejo ubiquinol-citocromo c reductasa; ADNc FLJ52271, moderadamente similar a la proteína de 14 kDa del complejo ubiquinol- citocromo c reductasa (EC 1.10.2.2)
1,625 1,220 1,007
Variable
Comp. 1 Comp. 2 Comp .3
VIP
VIP
VIP
Subunidad 2 del complejo III; Proteína II core; subunidad 2 del complejo citocromo b-c1, mitocondrial; Proteína 2 core del complejo ubiquinol-citocromo-c reductasa
1,551 1,167 1,207
Proteína de unión a angiotensina; Endopeptidasa microsomal; Oligopeptidasa M mitocondrial; Neurolisina, mitocondrial; Endopeptidasa para neurotensina
1,547 1,997 1,627
Rodanasa; Tiosulfato sulfotransferasa
1,504 1,169 0,954
Complejo I-ASHI; subunidad 8 del subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial; subunidad ASHI de NADH-ubiquinona oxidorreductasa; subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa (Ubiquinona), 8, 19kDa; subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa (Ubiquinona), 8, 19kDa, isoforma CRA_a; ADNc FLJ52503, muy similar a la subunidad 8 del subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa (ubiquinona), mitocondrial (EC 1.6.5.3) (EC 1.6.99.3) (subunidad ASHI de NADH-ubiquinona oxidorreductasa) (Complejo I-ASHI) (CI-ASHI)
1,489 1,117 1,207
Subunidad hierro-azufre del complejo II; subunidad hierro-azufre de Succinato deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial
1,486 1,167 1,040
Subunidad 1 del complejo III; proteína 1 Core; subunidad 1 del complejo citocromo b-c1, mitocondrial; Proteína 1 core del complejo ubiquinol-citocromo-c reductasa
1,474 1,124 0,922
Complejo I-B14.5a; subunidad 7 del subcomplejo 1 alfa de NADH deshidrogenasa [ubiquinona]; subunidad B14.5a de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
1,470 1,088 1,194
Complejo I-23kD; proteína 8 hierro-azufre de NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial; subunidad de 23 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa; subunidad TYKY
1,443 1,178 0,982
Polipéptido IV citocromo c oxidasa; Subunidad 4 de la isoforma 1 de citocromo c oxidasa, mitocondrial; isoforma 1 de la subunidad IV de citocromo c oxidasa; proteína COX4I1
1,432 1,063 0,934
Polipéptido VIc de citocromo c oxidasa; subunidad 6C de citocromo c oxidasa
1,416 1,074 0,929
Glutatión S-transferasa kappa 1; Subunidad 13 de Glutatión S-transferasa; GST 13-13; GST clase-kappa; GSTK1-1
1,404 1,172 0,975
Polipéptido II de citocromo c oxidasa; subunidad 2 de citocromo c oxidasa
1,375 1,120 0,943
Subunidad beta de succinil-CoA sintetasa específica de GTP; Subunidad beta de succinil- CoA ligasa [formadora de GDP], mitocondrial; Cadena beta-G de succinil-CoA sintetasa
1,363 1,127 0,961
Antígeno paraneoplásico de 250/210 kDa; Desmoplaquina
1,354 1,040 0,867
Complejo I-51kD; flavoproteína 1 de NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial; Flavoproteína 1 de NADH deshidrogenasa; subunidad de 51 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa; ADNc FLJ57949, muy similar a la subunidad de 51 kDa de NADH- ubiquinona oxidorreductasa, mitocondrial (EC 1.6.5.3); ADNc, FLJ79021, muy similar a la subunidad de 51 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa, mitocondrial (EC 1.6.5.3)
1,353 1,034 1,066
Correpresor 1 Alu; Enzima antioxidante B166; Mancha 71B de 2D-page de tejido hepático; Peroxirredoxina V; Peroxirredoxina-5, mitocondrial; Enzima antioxidante del peroxisoma; PLP; Tiorredoxina peroxidasa PMP20; Tiorredoxina reductasa; TPx tipo VI; Proteína no caracterizada putativa PRDX5
1,336 0,994 0,821
Variable
Comp. 1 Comp. 2 Comp .3
VIP
VIP
VIP
ICD-M; IDP; Isocitrato deshidrogenasa [NADP], mitocondrial; ICDH específico de NADP(+); Oxalosuccinato decarboxilasa
1,320 1,210 1,078
Subunidad flavoproteína del complejo II; Subunidad flavoproteína de succinato deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial
1,292 1,057 1,032
Aldolasa de tipo cerebral; Fructosa-bisfosfato aldolasa C; Fructosa-bisfosfato aldolasa; Proteína no caracterizada putativa ALDOC
1,289 1,115 0,906
Complejo I-13kD-A; Proteína 6 hierro-azufre de NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial; subunidad A de 13 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
1,261 0,935 0,781
Proteína 1 de la encefalopatía etilmalónica; Proteína 1 del clon sustraido del hepatoma; Proteína ETHE1, mitocondrial
1,252 0,951 0,851
Complejo I-B15; subunidad 4 del subcomplejo 1 beta de NADH deshidrogenasa [ubiquinona]; Subunidad B15 de NADH-ubiquinona oxidorreductasa; Proteína no caracterizada putativa NDUFB4
1,241 0,922 0,749
Proteína 30 de caja DEAH; Putativa ARN helicasa DHX30 dependiente de ATP
1,213 1,450 1,220
Polipéptido VIIc de citocromo c oxidasa; Subunidad 7C de citocromo c oxidasa, mitocondrial
1,211 0,897 0,751
Amina oxidasa [que contiene flavina] A; Monoamina oxidasa tipo A; ADNc FLJ61220, muy similar a Amina oxidasa (que contiene flavina) A (EC 1.4.3.4)
1,204 0,970 0,866
Carnitina O-palmitoiltransferasa 2, mitocondrial; Carnitina palmitoiltransferasa II
1,141 0,869 0,871
Amina oxidasa [que contiene flavina] B; Monoamina oxidasa tipo B; ADNc FLJ51821, muy similar a Amina oxidasa (que contiene flavina) B (EC 1.4.3.4); ADNc FLJ52418, muy similar a Amina oxidasa (que contiene flavina) B (EC 1.4.3.4)
1,066 1,289 1,107
Isoforma renal de glutaminasa, mitocondrial; K-glutaminasa; L-glutamina amidohidrolasa
1,033 1,317 1,087
Acil-coenzima A tioesterasa 13; Miembro 2 de la superfamilia de la tioesterasa
1,006 1,393 1,190
Catepsina D; Cadena pesada de catepsina D; Cadena ligera de catepsina D
1,004 0,784 0,652
Proteína de unión a grastrina de 78 kDa; 3-Hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga; Enoil-CoA hidratasa de cadena larga; TP-alfa; Subunidad alfa de enzima trifuncional, mitocondrial
0,999 0,742 0,836
Factor de elongación Tu, mitocondrial; P43
0,991 0,754 0,929
Enoil-CoA hidratasa 1; Enoil-CoA hidratasa, mitocondrial; Enoil-CoA hidratasa de cadena corta
0,968 0,842 0,714
Dihidrolipoamida deshidrogenasa; Dihidrolipoil deshidrogenasa, mitocondrial; Proteína L del sistema de escisión de glicina; ADNc FLJ50515, muy similar a Dihidrolipoil deshidrogenasa, mitocondrial (EC 1.8.1.4); Dihidrolipoil deshidrogenasa
0,956 0,716 0,728
Variable
Comp. 1 Comp. 2 Comp .3
VIP
VIP
VIP
Delta(3),delta(2)-enoil-CoA isomerasa; Proteína 1 relacionada con el inhibidor de la unión a diazepam; Dodecenoil-CoA isomerasa; DRS-1; Antígeno 88 asociado a carcinoma hepatocelular; 3,2-Trans-enoil-CoA isomerasa de peroxisoma; Antígeno de carcinoma renal NY-REN-1; Proteína no caracterizada putativa PECi
0,945 0,706 0,578
Catalasa
0,924 0,881 0,801
3-Cetoacil-CoA tiolasa; Acetil-CoA aciltransferasa; Beta-cetotiolasa; TP-beta; Subunidad beta de enzima trifuncional, mitocondrial; ADNc FLJ56214, muy similar a la subunidad beta de enzima trifuncional, mitocondrial; Proteína no caracterizada putativa HADHB
0,892 0,696 0,981
Miembro A1 de la familia 6 de la aldehído deshidrogenasa; Metilmalonato-semialdehído deshidrogenasa [acilante], mitocondrial
0,882 0,756 0,616
Enzima málica 2; Enzima málica dependiente de NAD, mitocondrial
0,872 1,419 1,325
Proteína porina 2 de la membrana mitocondrial externa; Proteína 2 del canal selectivo de aniones dependiente de voltaje; Canal 2 de aniones dependiente del voltaje; ADNc FLJ60120, muy similar a la proteína 2 del canal selectivo de aniones dependiente del voltaje; ADNc, FLJ78818, muy similar a la proteína 2 del canal selectivo de aniones dependiente del voltaje
0,871 0,649 0,538
Aspartato aminotransferasa, mitocondrial; Proteína de unión a ácido graso; Glutamato oxaloacetato transaminasa 2; Proteína de unión a ácido graso asociada a la membrana plasmática; Transaminasa A
0,869 0,668 0,605
Aldehído deshidrogenasa 5; Miembro B1 de la familia 1 de aldehído deshidrogenasa; Aldehído deshidrogenasa X, mitocondrial; ADNc FLJ51238, muy similar a Aldehído
0,861 0,893 0,729
Deshidrogenasa X, mitocondrial (EC 1.2.1.3)
Homólogo 1 de la proteína NipSnap
0,849 0,635 0,541
Proteína Aralar 2 transportadora mitocondrial de unión a calcio; Citrina; Portadora 2 de aspartato glutamato mitocondrial; Miembro 13 de la familia 25 de transportadores de soluto
0,840 0,650 0,691
Factor de elongación Ts, mitocondrial; Factor de elongación Ts
0,822 0,893 0,726
Citosol aminopeptidasa; Leucina aminopeptidasa 3; Leucil aminopeptidasa; Peptidasa S; Prolina aminopeptidasa; Prolil aminopeptidasa
0,797 0,590 0,848
Proteína porina 1 de la membrana mitocondrial externa; Porina del plasmalema; Porina 31HL; Porina 31 HM: Proteína 1 del canal selectivo de aniones dependiente del voltaje
0,766 0,602 0,533
Superóxido dismutasa [Mn], mitocondrial; Superóxido dismutasa
0,723 0,581 0,916
Sideroflexina-1; Proteína transportadora de tricarboxilato
0,721 0,705 1,238
Miembro A1 de la familia 18 de aldehído deshidrogenasa; Delta-1-pirrolino-5-carboxilato sintasa; Gamma-glutamil quinasa; Gamma-glutamil fosfato reductasa; Glutamato 5-quinasa; Glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa; Glutamil-gamma-semialdehído deshidrogenasa
0,716 0,559 1,164
Variable
Comp. 1 Comp. 2 Comp .3
VIP
VIP
VIP
Proteína L53 ribosomal de 39S, mitocondrial
0,705 0,812 0,703
Glicina hidroximetiltransferasa; Serina hidroximetiltransferasa, mitocondrial; Serina metilasa; ADNc FLJ58585, muy similar a serina hidroximetiltransferasa, mitocondrial (EC 2.1.2.1); Serina hidroximetiltransferasa 2 (Mitocondrial), isoforma CRA_h
0,687 0,690 1,139
Enzima antioxidante AOE372; Peroxirredoxina IV; Peroxirredoxina-4; Tiorredoxina peroxidasa AO372; Peroxido reductasa A0372 dependiente de tiorredoxina
0,651 1,017 1,015
Sustrato 1 de LYN específico de células hematopoyéticas; Proteína específica de células de linaje hematopoyético; LckPB1; p75
0,635 0,872 0,708
Acetoacetil-CoAtiolasa; Acetil-CoA acetiltransferasa, mitocondrial; T2
0,592 0,646 0,573
Complejo I-B8; Subunidad 2 del subcomplejo 1 alfa de NADH deshidrogenasa [ubiquinona]; subunidad B8 de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
0,570 1,106 0,937
Proteína 2 de 70 kDa relacionada con el choque térmico; ADNc FLJ40505 fis, clon TESTI2045562, muy similar a PROTEÍNA 2 de 70 kDa RELACIONADA CON EL CHOQUE TÉRMICO
0,551 1,027 0,850
Piruvato carboxilasa, mitocondrial; Piruvato carboxilasa; ADNc FLJ60715, muy similar a la piruvato carboxilasa, mitocondrial (EC 6.4.1.1)
0,542 0,477 0,394
Proteína 2 de tipo hidroxiesteroide deshidrogenasa; ADNc FLJ61200, muy similar a 2 de tipo hidroxiesteroide deshidrogenasa de Homo sapiens (HSDL2), ARNm
0,509 0,403 0,419
Tipo I de PDHE1-A; Subunidad alfa del componente E1 de piruvato deshidrogenasa, forma somática, mitocondrial
0,498 0,372 0,801
Proteína antioxidante 1; HBC189; Peroxirredoxina III; Peroxirredoxina-3; Homólogo de la proteína MER5; Peróxido reductasa dependiente de tiorredoxina, mitocondrial
0,490 0,707 1,120
Tipo 2 de 3-hidroxibutirato deshidrogenasa; Miembro 6 de la familia SDR de deshidrogenase/reductasa; Oxidorreductasa UCPA; R-beta-hidroxibutirato deshidrogenasa
0,476 0,807 0,883
3-5 ARN exonucleasa OLD35; PNPasa old-35; Polinucleótido fosforilasa 1; Proteína de tipo polinucleótido fosforilasa; Polirribonucleótido nucleotidiltransferasa 1, mitocondrial
0,470 1,236 1,035
3-cetoacil-CoA tiolasa, mitocondrial; Acetil-CoA aciltransferasa; Beta-cetotiolasa; 3-Oxoacil- CoA tiolasa mitocondrial; T1
0,461 0,677 1,061
Delta(3,5)-Delta(2,4)-dienoil-CoA isomerasa, mitocondrial
0,458 0,638 1,143
Carnitina/acilcarnitina translocasa; Proteína transportadora de carnitina/acilcarnitina mitocondrial; Miembro 20 de la familia 25 de transportadores de soluto; ADNc FLJ53016, muy similar a la proteína transportadora de carnitina/acilcarnitina mitocondrial
0,453 2,048 1,697
Homólogo de la proteína SCO2, mitocondrial
0,439 1,323 1,107
HCNPpp; Péptido neuroestimulador colinérgico del hipocampo; Neuropolipéptido h3; Proteína 1 de unión a fosfatidiletanolamina; Proteína inhibidora de quinasa Raf; ADNc
0,411 0,517 0,981
Variable
Comp. 1 Comp. 2 Comp .3
VIP
VIP
VIP
FLJ51535, muy similar a la proteína 1 de unión a fosfatidiletanolamina
Proteína 2 mediadora de respuesta a colapsina; Proteína 2 relacionada con dihidropirimidonasa; N2A3; Fosfoproteína 2 de tipo Unc-33
0,403 0,309 1,150
Proteína S9 ribosomal 28S, mitocondrial
0,356 2,072 1,692
Proteína mitocondrial inducida por Met; Homólogo 2 de transportador mitocondrial
0,353 0,461 1,075
Proteína transportadora de fosfato, mitocondrial; Proteína transtransportadora de fosfato; Miembro 3 de la familia 25 de transportadores de soluto
0,353 0,514 1,140
Proteína 3 que contiene el dominio de unión a acil-CoA; Proteína 1 asociada a complejo de Golgi; Fosfoproteína 1 de Golgi;
0,351 1,694 1,801
Proteína GCP60 residente en Golgi; Proteína 7 asociada con PBR y PKA; Proteína PAP7 asociada a receptor de benzodiazepina periférico
Proteína 2 transactivada de HCV F; Proteína 5 regulada al alza durante el crecimiento del músculo esquelético
0,344 0,707 1,117
Proteína tirosina fosfatasa 1D; Proteína tirosina fosfatasa 2C; SH-PTP2; SH-PTP3; Tirosina- proteína fosfatasa no receptora de tipo 11
0,303 0,699 1,024
Subunidad a de ATP sintasa; Proteína 6 de F-ATPasa
0,260 0,193 0,279
Subunidad 3 del complejo III; Subunidad III del complejo III; Subunidad 3 del complejo de citocromo b-c1; Subunidad b del citocromo complejo ubiquinol-citocromo-c reductasa
0,235 0,489 0,692
Cadena pesada 1 de clatrina; Cadena pesada de clatrina en el cromosoma 17
0,226 0,477 0,730
Glutamato deshidrogenasa 1, mitocondrial; ADNc FLJ55203, muy similar a Glutamato deshidrogenasa 1, mitocondrial (EC 1.4.1.3); ADNc FLJ16138 fis, clon BRALZ2017531, muy similar a glutamato deshidrogenasa 1, mitocondrial (EC 1.4.1.3); Glutamato deshidrogenasa 1, isoforma CRA_a; Glutamato deshidrogenasa 2, mitocondrial
0,216 0,315 0,598
Subunidad alfa de succinil-CoA ligasa [formadora de GDP], mitocondrial; Subunidad alfa de succinil-CoA sintetasa
0,189 0,452 1,125
Complejo I-15 kDa; Proteína 5 hierro-azufre de NADH deshidrogenasa [ubiquinona]; Subunidad de 15 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa
0,163 1,344 1,142
Complejo I-49kD; Proteína 2 hierro-azufre de NADH deshidrogenasa [ubiquinona], mitocondrial; Subunidad de 49 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa; ADNc, FLJ78876, muy similar a la subunidad de 49 kDa de NADH-ubiquinona oxidorreductasa, mitocondrial (EC 1.6.5.3)
0,137 0,301 1,161
3-Hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, mitocondrial; 3-Hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolasa
0,106 1,378 1,513
Alcohol deshidrogenasa 5; Cadena chi de la clase alcohol deshidrogenasa; Clase 3 de alcohol deshidrogenasa; Clase III de alcohol deshidrogenasa; Formaldehído deshidrogenasa dependiente de glutatión; S-(hidroximetil)glutation deshidrogenasa
0,093 0,471 1,107
5
10
15
20
25
30
35
Variable
Comp. 1 Comp. 2 Comp .3
VIP
VIP
VIP
Subunidad beta de flavoproteína de transferencia de electrones
0,091 0,479 1,047
Proteína rica en leucina de 130 kDa; GP130; Proteína que contiene el motivo PPR rico en leucina, mitocondrial
0,057 0,480 1,135
Subunidad beta de succinil-CoA sintetasa específica de ATP; Antígeno de carcinoma renal NY-REN-39; Subunidad beta de succinil-CoA ligasa [formadora de ADP], mitocondrial; Cadena beta-A de succinil-CoA sintetasa; Succinato-CoA ligasa, formadora de ADP, subunidad beta
0,024 0,865 0,725
Citrato sintasa, mitocondrial; Citrato sintasa
0,014 0,627 1,020
En otro aspecto más de la descripción, se proporciona un ensayo que permite la medición de la composición de la microbiota intestinal y el metaproteoma de una misma muestra. Más específicamente, el ensayo comprende la recogida de moco en la interfase luminal del intestino durante la endoscopia al enjuagar con una solución fisiológica, tal como solución salina estéril, sobre la mucosa para eliminar la capa de moco fuertemente adherente que recubre las células epiteliales de la mucosa intestinal tomando muestras de ese modo de la comunidad microbiana y de las proteínas del anfitrión y bacterianas embebidas dentro de la capa de moco. Los productos aspirados se recogen directamente a través del colonoscopio y las muestras se colocan inmediatamente sobre hielo directamente en la sala de endoscopia. La muestra se puede analizar a continuación en el punto de atención o transferir a un laboratorio. Las bacterias y las proteínas se pueden identificar y/o medir a continuación como se describió anteriormente. Este método permite ventajosamente el establecimiento de un perfil proteico y bacteriano en el mismo paciente en un punto temporal predeterminado.
El establecimiento de la presencia de enfermedad utilizando taxones bacterianos se puede utilizar para determinar un curso de tratamiento en un paciente. El tratamiento normalmente se basa en índices aceptados de enfermedades. Los métodos y ensayos proporcionados por la invención pueden complementar o reemplazar dichos índices de enfermedad para proporcionar un diagnóstico más preciso y, por lo tanto, permitir tratamientos más eficaces.
Se apreciará que los ensayos descritos anteriormente para identificar y medir proteínas y bacterias intestinales se pueden realizar en función del tiempo, permitiendo de ese modo una evaluación del progreso de la enfermedad así como de la eficacia de un tratamiento. La estadificación de la EII (y EC y CU) es particularmente útil para elegir el tratamiento apropiado que se administrará. Por ejemplo, el régimen de tratamiento puede ajustarse ventajosamente teniendo en cuenta los niveles de bacterias productoras de H2S, que como se describió anteriormente, son más elevados a medida que aumenta la gravedad de la enfermedad. Por lo tanto, los regímenes que son más agresivos para mitigar los efectos de las bacterias productoras de H2S se pueden administrar oportunamente para optimizar la dosis terapéutica. La optimización del tratamiento utilizando la información sobre la presencia/fase de EII, CU y EC proporcionada por medio de la medición de bacterias y proteínas como se describió anteriormente, se puede aplicar a agentes terapéuticos conocidos tales como, pero no limitados a, aminosalicilatos, inmunomoduladores, antiintegrinas, anti-citocinas, programas de alimentación enteral, esteroides, corticosteroides, antibióticos, anti-TNFa, bismuto y similares. En particular, como se describe más adelante, el bismuto se puede utilizar de manera eficaz como tratamiento cuando A. parvulum se detecta en un paciente y/o se determina que está por encima de ciertos niveles críticos de abundancia.
En la tabla 6 se enumeran taxones cuya abundancia varía significativamente en ratones I110-/- en respuesta a la colonización de A. parvulum y/o la administración de bismuto. Como se puede observar en la tabla, el tratamiento con bismuto puede estar indicado o ser beneficioso cuando la abundancia relativa de taxones distintos de A. parvulum se encuentra dentro de los niveles indicativos de enfermedad.
Tabla 6
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo Bis p|bis p|SPF
PHYLUM
Basidiomycota|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,000
Basidiomycota|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,000
Basidiomycota|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,000
Basidiomycota|SPF
0,000 80,000 25,429 32,103 0,000 0,000 0,000 1
Firmicutes|Atopo
57699,000 101958,0 00 79769,875 13542,546 1 0,869 0,002 0,194
Firmicutes|AtopoBis
49410,000 184098,0 00 104984,625 60115,166 0,869 1 0,003 0,255
Firmicutes Bis
105913,000 199488,0 00 175443,625 40788,918 0,002 0,003 1 0,084
Firmicutes|SPF
64133,000 198934,0 00 121645,143 57520,397 0,194 0,255 0,084 1
Cyanobacteria|Atopo
1,000 136,000 56,125 53,731 1 0,023 0,007 0,006
Cyanobacteria|AtopoBis
63,000 553,000 216,125 157,070 0,023 1 0,680 0,563
Cyanobacteria Bis
52,000 669,000 261,000 194,269 0,007 0,680 1 0,857
Cyanobacteria|SPF
30,000 872,000 370,000 326,109 0,006 0,563 0,857 1
Fusobacteria|Atopo
0,000 20,000 3,500 6,845 1 0,008 0,089 0,007
Fusobacteria|AtopoBis
1,000 34434,00 0 6670,125 12103,8 68 0,008 1 0,341 0,889
Fusobacteria Bis
0,000 3175,000 445,125 1109,01 2 0,089 0,341 1 0,289
Fusobacteria|SPF
5,000 96,000 38,571 31,921 0,007 0,889 0,289 1
Bacteroidetes|Atopo
86976,000 133781,0 00 108741,375 14150,0 40 1 0,216 < 0,0001 0,011
Bacteroidetes|AtopoBis
232,000 117882,0 00 64729,37 5 53917,8 01 0,216 1 0,004 0,175
Bacteroidetes|Bis
98,000 519,000 209,500 134,340 < 0,0001 0,004 1 0,151
Bacteroidetes|SPF
71,000 107705,0 00 28633,85 7 48179,2 54 0,011 0,175 0,151 1
CLASE
Fusobacteria (clase)|Atopo
0,000 20,000 3,500 6,845 1 0,008 0,089 0,007
Fusobacteria (clase)|AtopoBis
1,000 34434,00 0 6670,125 12103,8 68 0,008 1 0,341 0,889
Fusobacteria (clase) Bis
0,000 3175,000 445,125 1109,01 2 0,089 0,341 1 0,289
Fusobacteria (clase)|SPF
5,000 96,000 38,571 31,921 0,007 0,889 0,289 1
Erisipelotrichi|Atopo
998,000 7663,000 4385,500 2215,36 7 1 0,409 0,011 0,004
Erisipelotrichi|AtopoBis
928,000 8147,000 3320,375 2780,45 7 0,409 1 0,088 0,037
Erisipelotrichi|Bis
2,000 10136,00 0 1779,000 3443,70 0 0,011 0,088 1 0,660
Erisipelotrichi|SPF
6,000 3618,000 861,857 1483,60 9 0,004 0,037 0,660 1
Negativicutes|Atopo
1,000 2446,000 783,625 939,756 1 0,741 0,078 0,198
Negativicutes|AtopoBis
5,000 32,000 16,375 8,568 0,741 1 0,036 0,333
Negativicutes|Bis
0,000 10,000 3,625 3,335 2915,26 0,078 0,036 1 0,003
Negativicutes|SPF
1,000 7076,000 2222,286 3 0,198 0,333 0,003 1
Clostridia|Atopo
49447,000 95800,00 0 72002,75 0 15417,2 45 1 0,826 0,002 0,111
Clostridia|AtopoBis
41041,000 155491,0 00 88416,125 47521,5 87 0,826 1 0,005 0,167
Clostridia|Bis
95673,000 193932,0 00 161745,625 37810,1 73 0,002 0,005 1 0,184
Clostridia|SPF
54427,000 194395,0 00 116338,286 57644,5 57 0,111 0,167 0,184 1
Agaricomycetes|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,000
Agaricomycetes|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,000
Agaricomycetes|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,000
Agaricomycetes|SPF
0,000 80,000 25,429 32,103 0,000 0,000 0,000 1
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo Bis p|bis p|SPF
Bacteroidia|Atopo
86976,000 133781,0 00 108741,375 14150,0 40 1 0,216 < 0,0001 0,011
Bacteroidia|AtopoBis
232,000 117882,0 00 64729,37 5 53917,8 01 0,216 1 0,004 0,175
Bacteroidia|Bis
96,000 519,000 209,250 134,578 < 0,0001 0,004 1 0,151
Bacteroidia|SPF
71,000 107705,0 00 28633,85 7 48179,2 54 0,011 0,175 0,151 1
Betaproteobacteria|Atopo
0,000 295,000 44,375 101,677 1 0,067 0,837 0,001
Betaproteobacteria|AtopoBis
11,000 61,000 30,375 15,638 0,067 1 0,105 0,102
Betaproteobacteria|Bis
5,000 27,000 13,625 8,297 0,837 0,105 1 0,001
Betaproteobacteria|SPF
38,000 133,000 62,143 33,810 0,001 0,102 0,001 1
ORDEN
Clostridiales|Atopo
49447,000 95800,00 0 72002,75 0 15417,2 45 1 0,826 0,002 0,111
Clostridiales|AtopoBis
41041,000 155488,0 00 88397,875 47505,7 59 0,826 1 0,005 0,167
Clostridiales|Bis
95673,000 193932,0 00 161745,500 37810,3 79 0,002 0,005 1 0,184
Clostridiales SPF
54427,000 194394,0 00 116338,000 57644,3 23 0,111 0,167 0,184 1
Alteromonadales|Atopo
0,000 1,000 0,125 0,354 1 0,724 0,282 0,000
Alteromonadales|AtopoBis
0,000 1,000 0,250 0,463 0,724 1 0,470 0,001
Alteromonadales|Bis
0,000 126,000 24,875 47,975 0,282 0,470 1 0,007
Alteromonadales|SPF
1,000 915,000 264,143 345,489 0,000 0,001 0,007 1
Bacteroidales|Atopo
86976,000 133781,0 00 108741,375 14150,0 40 1 0,216 < 0,0001 0,011
Bacteroidales|AtopoBis
232,000 117882,0 00 64729,375 53917,8 01 0,216 1 0,004 0,175
Bacteroidales|Bis
96,000 519,000 209,250 134,578 < 0,0001 0,004 1 0,151
Bacteroidales|SPF
71,000 107705,0 00 28633,85 7 48179,2 54 0,011 0,175 0,151 1
Oceanospirillales|Atopo
0,000 5,000 2,000 1,852 1 0,393 0,576 0,004
Oceanospirillales|AtopoBis
0,000 74,000 23,125 27,910 0,393 1 0,158 0,037
Oceanospirillales|Bis
0,000 56,000 11,250 21,645 0,576 0,158 1 0,001
Oceanospirillales|SPF
3,000 4829,000 1391,571 1770,37 8 0,004 0,037 0,001 1
Agaricales|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,000
Agaricales|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,000
Agaricales|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,000
Agaricales|SPF
0,000 80,000 25,429 32,103 0,000 0,000 0,000 1
Actinomycetales|Atopo
0,000 1,000 0,500 0,535 1 0,446 0,796 0,002
Actinomycetales|AtopoBis
0,000 4,000 1,250 1,488 0,446 1 0,615 0,020
Actinomycetales|Bis
0,000 11,000 1,875 3,834 0,796 0,615 1 0,005
Actinomycetales|SPF
1,000 61,000 12,286 21,593 0,002 0,020 0,005 1
Erisipelotrichales|Atopo
998,000 7663,000 4385,500 2215,36 7 1 0,409 0,011 0,004
Erisipelotrichales|AtopoBis
928,000 8147,000 3320,375 2780,45 7 0,409 1 0,088 0,037
Erisipelotrichales|Bis
2,000 10136,00 0 1779,000 3443,70 0 0,011 0,088 1 0,660
Erisipelotrichales|SPF
6,000 3618,000 861,857 1483,60 9 0,004 0,037 0,660 1
Neisseriales|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,004 0,585 0,441
Neisseriales|AtopoBis
0,000 2,000 0,750 0,707 0,004 1 0,022 0,048
Neisseriales|Bis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,585 0,022 1 0,809
Neisseriales|SPF
0,000 8,000 1,143 3,024 0,441 0,048 0,809 1
Pasteurellales|Atopo
0,000 1,000 0,125 0,354 1 0,594 0,530 0,000
Pasteurellales|AtopoBis
0,000 4,000 0,750 1,488 0,594 1 0,925 0,001
Variable Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo p|bis p|SPF
imagen1
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3
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LU
LU
LU
LU
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Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo Bis p|bis p|SPF 1 0,000
Ferrimonadaceae|AtopoBis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,625 1 0,625
Ferrimonadaceae|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,625 1 < 0,000 1
Ferrimonadaceae|SPF
0,000 623,000 140,714 227,571 < 0,0001 0,000 < 0,0001 1
Alcanivoracaceae|Atopo
0,000 4,000 1,500 1,773 1 0,477 0,314 0,064
Alcanivoracaceae|AtopoBis
0,000 73,000 22,125 28,119 0,477 1 0,086 0,245
Alcanivoracaceae|Bis
0,000 4,000 0,500 1,414 0,314 0,086 1 0,005
Alcanivoracaceae|SPF
0,000 554,000 143,286 208,723 0,064 0,245 0,005 1
Bacteroidaceae|Atopo
86967,000 133771,0 00 108707,2 50 14136,2 18 1 0,226 < 0,0001 0,007
Bacteroidaceae|AtopoBis
211,000 117745,0 00 64625,87 5 53942,1 57 0,226 1 0,005 0,125
Bacteroidaceae|Bis
74,000 515,000 171,750 143,702 < 0,0001 0,005 1 0,239
Bacteroidaceae|SPF
57,000 107600,0 00 28388,71 4 48274,6 13 0,007 0,125 0,239 1
Oceanospirillaceae|Atopo
0,000 1,000 0,250 0,463 1 0,424 0,722 0,000
Oceanospirillaceae|AtopoBis
0,000 4,000 1,000 1,414 0,424 1 0,657 0,003
Oceanospirillaceae|Bis
0,000 16,000 3,250 6,228 0,722 0,657 1 0,001
Oceanospirillaceae|SPF
3,000 3579,000 1056,714 1313,00 5 0,000 0,003 0,001 1
Halomonadaceae|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,000
Halomonadaceae|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,000
Halomonadaceae|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,000
Halomonadaceae|SPF
0,000 18,000 5,857 7,010 0,000 0,000 0,000 1
Lactobacillaceae|Atopo
263,000 7137,000 2406,750 2385,72 0 1 0,004 0,000 0,001
Lactobacillaceae|AtopoBis
3,000 27,000 12,375 9,226 0,004 1 0,440 0,586
Lactobacillaceae|Bis
0,000 1026,000 133,000 360,889 0,000 0,440 1 0,840
Lactobacillaceae|SPF
0,000 81,000 19,571 30,127 0,001 0,586 0,840 1
Neisseriaceae|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,004 0,585 0,441
Neisseriaceae|AtopoBis
0,000 2,000 0,750 0,707 0,004 1 0,022 0,048
Neisseriaceae|Bis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,585 0,022 1 0,809
Neisseriaceae|SPF
0,000 8,000 1,143 3,024 0,441 0,048 0,809 1
Halothiobacillaceae|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 < 0,000 1
Halothiobacillaceae|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 < 0,000 1
Halothiobacillaceae|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 < 0,000 1
Halothiobacillaceae|SPF
0,000 14,000 4,571 5,255 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 1
Pasteurellaceae|Atopo
0,000 1,000 0,125 0,354 1 0,594 0,530 0,000
Pasteurellaceae|AtopoBis
0,000 4,000 0,750 1,488 0,594 1 0,925 0,001
Pasteurellaceae|Bis
0,000 14,000 2,000 4,899 0,530 0,925 1 0,001
Pasteurellaceae|SPF
2,000 56,000 20,143 21,836 0,000 0,001 0,001 1
Erisipelotrichaceae|Atopo
998,000 7663,000 4385,500 2215,36 7 1 0,409 0,011 0,004
Erisipelotrichaceae|AtopoBis
928,000 8147,000 3320,375 2780,45 7 0,409 1 0,088 0,037
Erisipelotrichaceae|Bis
2,000 10136,00 0 1779,000 3443,70 0 0,011 0,088 1 0,660
Erisipelotrichaceae|SPF
6,000 3618,000 861,857 1483,60 9 0,004 0,037 0,660 1
Fusobacteriaceae|Atopo
0,000 20,000 3,500 6,845 1 0,008 0,089 0,007
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo Bis p|bis p|SPF
Fusobacteriaceae|AtopoBis
1,000 34434,00 0 6670,125 12103,8 68 0,008 1 0,341 0,889
Fusobacteriaceae|Bis
0,000 3175,000 445,125 1109,01 2 0,089 0,341 1 0,289
Fusobacteriaceae|SPF
5,000 96,000 38,571 31,921 0,007 0,889 0,289 1
Bacillaceae|Atopo
71,000 336,000 147,875 94,253 1 0,001 0,024 0,311
Bacillaceae|AtopoBis
1182,000 28393,00 0 8495,875 9032,95 6 0,001 1 0,284 0,028
Bacillaceae|Bis
6,000 13296,00 0 5596,125 4907,61 9 0,024 0,284 1 0,244
Bacillaceae|SPF
65,000 7836,000 1401,571 2847,09 7 0,311 0,028 0,244 1
Listeriaceae|Atopo
0,000 1,000 0,375 0,518 1 0,006 0,029 0,477
Listeriaceae|AtopoBis
0,000 17,000 7,250 6,497 0,006 1 0,590 0,055
Listeriaceae|Bis
0,000 14,000 5,000 4,751 0,029 0,590 1 0,161
Listeriaceae|SPF
0,000 29,000 4,571 10,799 0,477 0,055 0,161 1
Streptococcaceae|Atopo
0,000 21,000 7,500 7,521 1 0,182 0,001 0,056
Streptococcaceae|AtopoBis
0,000 17141,00 0 3433,000 6026,70 9 0,182 1 0,046 0,532
Streptococcaceae Bis
9,000 22660,00 0 5396,500 7790,15 6 0,001 0,046 1 0,193
Streptococcaceae|SPF
8,000 237,000 84,714 100,521 0,056 0,532 0,193 1
Vibrionaceae|Atopo
0,000 13,000 2,375 4,534 1 0,191 0,374 < 0,000 1
Vibrionaceae|AtopoBis
1,000 14,000 5,000 5,155 0,191 1 0,677 0,006
Vibrionaceae|Bis
0,000 23,000 6,125 8,097 0,374 0,677 1 0,002
Vibrionaceae|SPF
20,000 48532,00 0 15351,14 3 18959,8 65 < 0,0001 0,006 0,002 1
Metilococcaceae|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,027
Metilococcaceae|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,027
Metilococcaceae Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,027
Metilococcaceae|SPF
0,000 2,000 0,429 0,787 0,027 0,027 0,027 1
Sutterellaceae|Atopo
0,000 14,000 3,125 5,592 1 0,020 0,708 0,007
Sutterellaceae|AtopoBis
1,000 37,000 12,125 12,253 0,020 1 0,050 0,645
Sutterellaceae|Bis
0,000 10,000 2,500 3,381 0,708 0,050 1 0,019
Sutterellaceae|SPF
1,000 125,000 33,571 44,071 0,007 0,645 0,019 1
Veillonellaceae|Atopo
1,000 2444,000 780,750 938,048 1 0,815 0,085 0,197
Veillonellaceae|AtopoBis
5,000 26,000 12,625 7,689 0,815 1 0,050 0,287
Veillonellaceae|Bis
0,000 10,000 3,375 3,378 2915,64 0,085 0,050 1 0,003
Veillonellaceae|SPF
1,000 7076,000 2221,857 0 0,197 0,287 0,003 1
Catabacteriaceae|Atopo
0,000 2,000 0,250 0,707 1 0,643 0,220 0,004
Catabacteriaceae|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 0,643 1 0,091 0,001
Catabacteriaceae|Bis
0,000 1472,000 314,000 592,517 0,220 0,091 1 0,097
Catabacteriaceae|SPF
0,000 525,000 113,857 201,222 0,004 0,001 0,097 1
Shewanellaceae|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 0,352 0,000
Shewanellaceae|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 0,352 0,000
Shewanellaceae|Bis
0,000 1,000 0,250 0,463 0,352 0,352 1 0,003
Shewanellaceae|SPF
0,000 118,000 24,429 42,637 0,000 0,000 0,003 1
Hahellaceae|Atopo
0,000 1,000 0,250 0,463 1 0,427 0,947 0,002
Hahellaceae|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 0,427 1 0,389 0,000
Hahellaceae|Bis
0,000 4,000 0,625 1,408 0,947 0,389 1 0,003
Hahellaceae|SPF
0,000 200,000 56,143 70,099 0,002 0,000 0,003 1
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo Bis p|bis p|SPF
Actinomycetaceae|Atopo
0,000 1,000 0,125 0,354 1 0,190 0,325 0,000
Actinomycetaceae|AtopoBis
0,000 3,000 0,875 1,126 0,190 1 0,743 0,017
Actinomycetaceae|Bis
0,000 9,000 1,375 3,114 0,325 0,743 1 0,007
Actinomycetaceae|SPF
1,000 60,000 11,571 21,454 0,000 0,017 0,007 1
Alteromonadaceae|Atopo
0,000 1,000 0,125 0,354 1 1,000 0,274 0,001
Alteromonadaceae|AtopoBis
0,000 1,000 0,125 0,354 1,000 1 0,274 0,001
Alteromonadaceae|Bis
0,000 125,000 24,625 47,533 0,274 0,274 1 0,027
Alteromonadaceae|SPF
0,000 280,000 99,000 107,201 0,001 0,001 0,027 1
Lycoperdaceae|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,000
Lycoperdaceae|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,000
Lycoperdaceae|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,000
Lycoperdaceae|SPF
0,000 80,000 25,429 32,103 0,000 0,000 0,000 1
Peptostreptococcaceae|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,308 0,352 0,006
Peptostreptococcaceae|AtopoBis
0,000 3,000 0,625 1,188 0,308 1 0,929 0,078
Peptostreptococcaceae|Bis
0,000 2,000 0,500 0,926 0,352 0,929 1 0,065
Peptostreptococcaceae|SPF
0,000 11,000 3,714 4,348 0,006 0,078 0,065 1
GÉNERO
Morganella|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,000
Morganella|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,000
Morganella|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,000
Morganella|SPF
0,000 80,000 25,429 32,103 0,000 0,000 0,000 1
Erwinia|Atopo
0,000 24,000 12,750 8,714 1 0,826 0,710 0,003
Erwinia|AtopoBis
0,000 145,000 49,625 60,985 0,826 1 0,880 0,006
Erwinia|Bis
0,000 50896,00 0 10198,37 5 19632,3 94 0,710 0,880 1 0,010
Erwinia|SPF
146,000 2984,000 919,857 992,120 0,003 0,006 0,010 1
Peptostreptococcus|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,308 0,352 0,006
Peptostreptococcus|AtopoBis
0,000 3,000 0,625 1,188 0,308 1 0,929 0,078
Peptostreptococcus Bis
0,000 2,000 0,500 0,926 0,352 0,929 1 0,065
Peptostreptococcus|SPF
0,000 11,000 3,714 4,348 0,006 0,078 0,065 1
Dorea|Atopo
0,000 9,000 2,625 2,973 1 0,757 0,527 0,041
Dorea|AtopoBis
0,000 20,000 5,750 7,888 0,757 1 0,346 0,081
Dorea|Bis
0,000 10,000 2,375 3,926 0,527 0,346 1 0,008
Dorea|SPF
0,000 30,000 13,429 10,114 0,041 0,081 0,008 1
Ruminococcus|Atopo
13,000 281,000 62,375 89,427 1 0,030 0,021 0,002
Ruminococcus|AtopoBis
29,000 1586,000 441,500 610,453 0,030 1 0,891 0,341
Ruminococcus|Bis
33,000 1006,000 398,250 401,712 0,021 0,891 1 0,412
Ruminococcus|SPF
69,000 20346,00 0 4684,143 8151,122 0,002 0,341 0,412 1
Kangiella|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 0,548 0,003
Kangiella|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 0,548 0,003
Kangiella|Bis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,548 0,548 1 0,015
Kangiella|SPF
0,000 23,000 4,429 8,344 0,003 0,003 0,015 1
Enterovibrio |Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 < 0,000 1
Enterovibrio |AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 < 0,000 1
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo Bis p|bis p|SPF
Enterovibrio|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 < 0,000 1
Enterovibrio|SPF
0,000 239,000 88,000 92,454 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 1
Coprobacillus|Atopo
331,000 2302,000 1152,125 678,666 1 0,003 0,008 0,004
Coprobacillus|AtopoBis
0,000 1735,000 257,375 605,539 0,003 1 0,772 0,970
Coprobacillus|Bis
0,000 1309,000 200,625 452,797 0,008 0,772 1 0,750
Coprobacillus|SPF
0,000 924,000 177,571 348,761 0,004 0,970 0,750 1
Actinomyces|Atopo
0,000 1,000 0,125 0,354 1 0,190 0,325 0,000
Actinomyces|AtopoBis
0,000 3,000 0,875 1,126 0,190 1 0,743 0,017
Actinomyces|Bis
0,000 9,000 1,375 3,114 0,325 0,743 1 0,007
Actinomyces|SPF
1,000 60,000 11,571 21,454 0,000 0,017 0,007 1
Marinomonas|Atopo
0,000 1,000 0,250 0,463 1 0,694 0,694 0,002
Marinomonas|AtopoBis
0,000 1,000 0,375 0,518 0,694 1 0,431 0,007
Marinomonas|Bis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,694 0,431 1 0,001
Marinomonas|SPF
0,000 494,000 144,857 185,634 0,002 0,007 0,001 1
Vibrio|Atopo
0,000 13,000 2,375 4,534 1 0,216 0,381 < 0,000 1
Vibrio|AtopoBis
1,000 12,000 4,750 4,683 0,216 1 0,718 0,006
Vibrio|Bis
0,000 23,000 6,125 8,097 0,381 0,718 1 0,002
Vibrio|SPF
19,000 48256,00 0 15217,85 7 18829,1 26 < 0,0001 0,006 0,002 1
Dialister|Atopo
0,000 9,000 1,375 3,114 1 0,020 0,534 0,129
Dialister|AtopoBis
0,000 18,000 6,625 6,675 0,020 1 0,003 0,465
Dialister|Bis
0,000 1,000 0,250 0,463 0,534 0,003 1 0,034
Dialister|SPF
0,000 7,000 3,571 3,101 0,129 0,465 0,034 1
Halothiobacillus|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 < 0,000 1
HalothiobaciNus|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 < 0,000 1
HalothiobaciNus|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 < 0,000 1
Halothiobacillus|SPF
0,000 14,000 4,571 5,255 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 1
Trichococcus|Atopo
0,000 6,000 1,125 2,031 1 0,007 0,041 0,009
Trichococcus|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 0,007 1 0,519 1,000
Trichococcus|Bis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,041 0,519 1 0,533
Trichococcus|SPF
0,000 0,000 0,000 0,000 0,009 1,000 0,533 1
Nitrincola|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,577 1,000 0,001
Nitrincola|AtopoBis
0,000 3,000 0,375 1,061 0,577 1 0,577 0,003
Nitrincola|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,577 1 0,001
Nitrincola|SPF
0,000 226,000 55,143 83,762 0,001 0,003 0,001 1
Serratia|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,198 1,000 0,000
Serratia|AtopoBis
0,000 3,000 0,750 1,165 0,198 1 0,198 0,009
Serratia|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,198 1 0,000
Serratia|SPF
0,000 621,000 192,286 237,182 0,000 0,009 0,000 1
Ferrimonas|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,625 1,000 < 0,000 1
Ferrimonas|AtopoBis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,625 1 0,625 0,000
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo Bis p|bis p|SPF
Ferrimonas|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,625 1 < 0,000 1
Ferrimonas|SPF
0,000 623,000 140,714 227,571 < 0,0001 0,000 < 0,0001 1
Butyrivibrio |Atopo
0,000 1,000 0,125 0,354 1 1,000 0,534 0,032
Butyrivibrio |AtopoBis
0,000 1,000 0,125 0,354 1,000 1 0,534 0,032
Butyrivibrio|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 0,534 0,534 1 0,006
Butyrivibrio|SPF
0,000 1,000 0,571 0,535 0,032 0,032 0,006 1
Oscillospira|Atopo
0,000 3,000 0,750 1,165 1 0,055 0,144 0,000
OsciNospira|AtopoBis
1,000 7,000 3,125 2,167 0,055 1 0,646 0,083
OsciNospira|Bis
0,000 3538,000 715,625 1371,80 3 0,144 0,646 1 0,030
Oscillospira|SPF
2,000 3855,000 713,000 1439,67 8 0,000 0,083 0,030 1
Epulopiscium|Atopo
0,000 9,000 1,625 3,068 1 0,434 0,099 0,014
Epulopiscium|AtopoBis
0,000 2,000 0,375 0,744 0,434 1 0,015 0,001
Epulopiscium|Bis
0,000 8385,000 1199,875 2932,01 1 0,099 0,015 1 0,393
Epulopiscium|SPF
2,000 60,000 17,429 24,110 0,014 0,001 0,393 1
Escherichia|Atopo
0,000 7,000 2,000 2,507 1 0,029 0,557 0,351
Escherichia|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 0,029 1 0,110 0,002
Escherichia|Bis
0,000 52,000 10,375 19,799 0,557 0,110 1 0,133
Escherichia|SPF
0,000 5,000 2,714 1,799 0,351 0,002 0,133 1
Alkalimonas|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,006
Alkalimonas|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,006
Alkalimonas|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,006
Alkalimonas|SPF
0,000 30,000 7,714 11,339 0,006 0,006 0,006 1
Listeria|Atopo
0,000 1,000 0,375 0,518 1 0,006 0,029 0,477
Listeria|AtopoBis
0,000 17,000 7,250 6,497 0,006 1 0,590 0,055
Listeria|Bis
0,000 14,000 5,000 4,751 0,029 0,590 1 0,161
Listeria|SPF
0,000 29,000 4,571 10,799 0,477 0,055 0,161 1
Streptococcus|Atopo
0,000 21,000 7,500 7,521 1 0,182 0,001 0,056
Streptococcus|AtopoBis
0,000 17141,00 0 3433,000 6026,70 9 0,182 1 0,046 0,532
Streptococcus|Bis
9,000 22660,00 0 5396,500 7790,15 6 0,001 0,046 1 0,193
Streptococcus|SPF
8,000 237,000 84,714 100,521 0,056 0,532 0,193 1
Actinobacillus|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,681 0,328 0,000
Actinobacillus|AtopoBis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,681 1 0,571 0,001
Actinobacillus|Bis
0,000 8,000 1,125 2,800 0,328 0,571 1 0,005
Actinobacillus|SPF
0,000 39,000 12,000 15,011 0,000 0,001 0,005 1
Roseburia|Atopo
10,000 46,000 23,125 12,722 1 0,773 0,040 0,321
Roseburia|AtopoBis
1,000 56,000 22,875 17,836 0,773 1 0,078 0,203
Roseburia|Bis
1,000 22,000 7,875 7,453 0,040 0,078 1 0,003
Roseburia|SPF
8,000 192,000 65,429 64,714 0,321 0,203 0,003 1
Bacillus|Atopo
70,000 331,000 145,500 92,705 1 0,001 0,023 0,298
Bacillus|AtopoBis
1162,000 24417,00 0 7572,750 7652,21 3 0,001 1 0,284 0,029
Bacillus Bis
5,000 11338,00 0 4861,250 4100,80 1 0,023 0,284 1 0,250
Bacillus|SPF
57,000 7717,000 1376,429 2805,25 9 0,298 0,029 0,250 1
Parabacteroides|Atopo
0,000 40,000 8,875 13,559 1 0,195 0,562 0,036
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo Bis p|bis p|SPF
Parabacteroides|AtopoBis
1,000 35,000 12,750 10,820 0,195 1 0,061 0,397
Parabacteroidesps
0,000 9,000 3,750 3,284 0,562 0,061 1 0,008
Parabacteroides|SPF
0,000 43,000 23,571 16,662 0,036 0,397 0,008 1
Sarcina|Atopo
0,000 1,000 0,125 0,354 1 0,005 0,009 0,317
Sarcina|AtopoBis
0,000 1929,000 424,250 698,617 0,005 1 0,815 0,082
Sarcina|Bis
0,000 2282,000 700,125 966,646 0,009 0,815 1 0,131
Sarcina|SPF
0,000 8,000 2,286 3,147 0,317 0,082 0,131 1
Enterococcus|Atopo
11,000 38,000 20,750 9,588 1 0,000 0,016 0,040
Enterococcus|AtopoBis
121,000 1543,000 718,125 539,764 0,000 1 0,161 0,100
Enterococcus|Bis
0,000 1425,000 558,625 527,899 0,016 0,161 1 0,773
Enterococcus|SPF
39,000 1382,000 260,429 495,621 0,040 0,100 0,773 1
Carnobacterium|Atopo
0,000 1,000 0,125 0,354 1 0,006 0,045 0,543
Camobacterium|AtopoBis
0,000 42,000 17,500 18,769 0,006 1 0,451 0,040
Camobacterium|Bis
0,000 29,000 6,500 10,100 0,045 0,451 1 0,185
Carnobacterium|SPF
0,000 4,000 1,000 1,732 0,543 0,040 0,185 1
Coprococcus|Atopo
244,000 35300,00 0 7793,625 11731,1 18 1 0,001 0,012 0,220
Coprococcus|AtopoBis
10,000 79,000 40,625 22,671 0,001 1 0,433 0,050
Coprococcus Bis
6,000 5234,000 893,750 1803,12 5 0,012 0,433 1 0,228
Coprococcus|SPF
20,000 31009,00 0 6867,571 12275,6 31 0,220 0,050 0,228 1
Enterobacter|Atopo
0,000 3,000 0,500 1,069 1 0,849 0,333 0,000
Enterobacter|AtopoBis
0,000 1,000 0,375 0,518 0,849 1 0,437 0,001
Enterobacter Bis
0,000 12,000 2,875 4,794 0,333 0,437 1 0,007
Enterobacter|SPF
3,000 2140,000 682,571 877,138 0,000 0,001 0,007 1
Neisseria|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,003 0,538 0,387
Neisseria|AtopoBis
0,000 2,000 0,750 0,707 0,003 1 0,014 0,032
Neisseria|Bis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,538 0,014 1 0,785
Neisseria|SPF
0,000 5,000 0,714 1,890 0,387 0,032 0,785 1
Photobacterium|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,222 1,000 < 0,000 1
Photobacterium|AtopoBis
0,000 2,000 0,250 0,707 0,222 1 0,222 < 0,000 1
Photobacterium|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,222 1 < 0,000 1
Photobacterium|SPF
1,000 121,000 42,286 49,671 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 1
Brenneria|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,000
Brenneria|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,000
Brenneria|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,000
Brenneria|SPF
0,000 595,000 156,429 226,566 0,000 0,000 0,000 1
Oceanobacillus|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,465 0,005 1,000
Oceanobacillus|AtopoBis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,465 1 0,026 0,480
Oceanobacillus|Bis
0,000 2,000 0,625 0,744 0,005 0,026 1 0,006
Oceanobacillus|SPF
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,480 0,006 1
Lactobacillus|Atopo
263,000 7137,000 2406,750 2385,72 0 1 0,000 < 0,0001 < 0,000 1
Lactobacillus|AtopoBis
3,000 27,000 12,375 9,226 0,000 1 0,277 0,441
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo Bis p|bis p|SPF
Lactobacillus Bis
0,000 1026,000 133,000 360,889 < 0,277 1 0,774
0,0001
Lactobacillus|SPF
0,000 81,000 19,571 30,127 < 0,0001 0,441 0,774 1
Xanthomonas|Atopo
0,000 1,000 0,125 0,354 1 0,620 0,138 0,007
Xanthomonas|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 0,620 1 0,052 0,002
Xanthomonas Bis
0,000 1005,000 207,500 395,202 0,138 0,052 1 0,163
Xanthomonas|SPF
0,000 29,000 6,000 10,360 0,007 0,002 0,163 1
Sutterella|Atopo
0,000 14,000 3,125 5,592 1 0,009 0,657 0,003
Sutterella|AtopoBis
1,000 37,000 12,125 12,253 0,009 1 0,026 0,586
Sutterella|Bis
0,000 10,000 2,500 3,381 0,657 0,026 1 0,009
Sutterella|SPF
1,000 125,000 33,571 44,071 0,003 0,586 0,009 1
Staphilococcus|Atopo
0,000 8,000 1,250 2,765 1 0,000 0,001 0,003
Staphilococcus|AtopoBis
6,000 82,000 32,625 28,213 0,000 1 0,744 0,558
Staphilococcus Bis
0,000 132,000 40,000 45,854 0,001 0,744 1 0,785
Staphilococcus|SPF
2,000 838,000 191,000 333,003 0,003 0,558 0,785 1
Lachnobacterium|Atopo
0,000 22,000 4,125 7,605 1 0,072 0,275 0,068
Lachnobacterium|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 0,072 1 0,006 0,001
Lachnobacterium|Bis
0,000 11871,00 0 2128,000 4324,49 4 0,275 0,006 1 0,418
Lachnobacterium|SPF
0,000 809,000 230,857 372,166 0,068 0,001 0,418 1
Vagococcus|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,001 0,004 0,129
Vagococcus|AtopoBis
0,000 37,000 7,000 12,387 0,001 1 0,570 0,049
Vagococcus|Bis
0,000 34,000 8,500 12,166 0,004 0,570 1 0,144
Vagococcus|SPF
0,000 3,000 0,857 1,215 0,129 0,049 0,144 1
Leclercia|Atopo
0,000 2,000 0,500 0,756 1 0,298 0,501 < 0,000 1
Leclercia|AtopoBis
0,000 4,000 0,500 1,414 0,298 1 0,707 < 0,000 1
Leclercia|Bis
0,000 1,000 0,250 0,463 0,501 0,707 1 < 0,000 1
Leclercia|SPF
12,000 4650,000 1419,143 1875,85 5 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 1
Fusobacterium|Atopo
0,000 20,000 3,500 6,845 1 0,006 0,065 0,005
Fusobacterium|AtopoBis
1,000 34434,00 0 6670,000 12103,9 46 0,006 1 0,307 0,865
Fusobacterium|Bis
0,000 3175,000 445,125 1109,01 2 0,065 0,307 1 0,249
Fusobacterium|SPF
4,000 94,000 38,000 31,559 0,005 0,865 0,249 1
Citrobacter|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,000
Citrobacter|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,000
Citrobacter|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,000
Citrobacter|SPF
0,000 41,000 11,857 16,477 0,000 0,000 0,000 1
Hahella|Atopo
0,000 1,000 0,250 0,463 1 0,265 0,925 0,000
Hahella|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 0,265 1 0,229 < 0,000 1
Hahella|Bis
0,000 4,000 0,625 1,408 0,925 0,229 1 0,000
Hahella|SPF
0,000 200,000 56,143 70,099 0,000 < 0,0001 0,000 1
Alcanivorax|Atopo
0,000 4,000 1,500 1,773 1 0,481 0,085 0,045
Alcanivorax|AtopoBis
0,000 73,000 22,125 28,119 0,481 1 0,019 0,170
Variable
Mínimo Máximo Media Desv. típica p|Atopo p|Atopo Bis p|bis p|SPF
Alcanivoraxps
0,000 0,000 0,000 0,000 0,085 0,019 1 0,001
Alcanivorax|SPF
0,000 531,000 138,857 200,897 0,045 0,170 0,001 1
Facklamia|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 1,000 0,003
Facklamia|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 1,000 0,003
Facklamia|Bis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 1 0,003
Facklamia|SPF
0,000 56,000 11,571 21,509 0,003 0,003 0,003 1
Faecalibacterium|Atopo
0,000 252,000 39,625 86,169 1 0,010 0,687 0,007
Faecalibacterium|AtopoBis
8,000 120,000 57,000 37,413 0,010 1 0,004 0,811
Faecalibacterium|Bis
1,000 31,000 13,375 11,476 0,687 0,004 1 0,003
Faecalibacterium|SPF
8,000 212,000 88,571 76,868 0,007 0,811 0,003 1
Eubacterium|Atopo
3,000 43,000 8,875 13,861 1 0,024 0,417 0,000
Eubacterium|AtopoBis
10,000 32,000 18,500 8,783 0,024 1 0,130 0,052
Eubacterium|Bis
1,000 2387,000 313,625 838,348 0,417 0,130 1 0,001
Eubacterium|SPF
13,000 1107,000 485,143 399,257 0,000 0,052 0,001 1
Shewanella|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 1,000 0,144 < 0,000 1
Shewanella|AtopoBis
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1 0,144 < 0,000 1
Shewanella|Bis
0,000 1,000 0,250 0,463 0,144 0,144 1 < 0,000 1
Shewanella|SPF
0,000 118,000 24,429 42,637 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 1
Tatumella|Atopo
0,000 0,000 0,000 0,000 1 0,454 1,000 < 0,000 1
Tatumella|AtopoBis
0,000 1,000 0,125 0,354 0,454 1 0,454 0,000
Tatumellaps
0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,454 1 < 0,000 1
Tatumella|SPF
0,000 76,000 26,714 33,674 < 0,0001 0,000 < 0,0001 1
Bacteroides|Atopo
86967,000 133771,0 00 108707,2 50 14136,2 18 1 0,075 < 0,0001 0,000
Bacteroides|AtopoBis
211,000 117745,0 00 64625,87 5 53942,1 57 0,075 1 0,000 0,027
Bacteroides Bis
74,000 515,000 171,750 143,702 < 0,0001 0,000 1 0,083
Bacteroides|SPF
57,000 107600,0 00 28388,71 4 48274,6 13 0,000 0,027 0,083 1
También se ha encontrado que A. parvulum se correlaciona con la presencia/abundancia de focos GALT. Por lo tanto, se proporciona un ensayo para identificar la probabilidad de que un individuo tenga CU o EC o EII midiendo una abundancia relativa de A. parvulum midiendo la abundancia de focos GALT. Esta correlación también se puede 5 utilizar para proporcionar un método de diagnóstico que comprende la recogida de muestras para medir la abundancia de focos GAT, determinar la presencia de A. parvulum basándose en la medición de las citocinas y establecer un diagnóstico.
En otro aspecto de la invención, se ha demostrado que ciertas UTO y/o taxones son indicativos de una mejora de la respuesta terapéutica. La Tabla 7 ilustra UTO y/o taxones que exhiben una diferencia significativa entre los niveles 10 de bacterias entre los pacientes que respondieron al tratamiento. Los pacientes en los dos grupos (respondieron al tratamiento/no respondieron al tratamiento) recibieron una medicación sistémica con corticosteroides (prednisona) como su terapia antiinflamatoria aguda. Dos pacientes (en el grupo que respondió) recibieron en su lugar la medicación con corticosteroides activa en la mucosa Entocort. Se inició una medicación inmunomoduladora con azatioprina (n = 11) o metotrexato (n = 4) en los pacientes para terapia de mantenimiento. El fracaso clínico de la 15 respuesta se determinó mediante las determinaciones de puntuación del Phisician Global Assessment y del Pediatric Crohn's Disease Activity Index.
Claramente, a partir de los datos de la tabla 7, existe un vínculo entre el nivel de bacterias y la eficacia del tratamiento. Por lo tanto, cuando un paciente presenta niveles bacterianos en uno o más taxones o UTO de la tabla 7 que son más elevados que un nivel predeterminado o promedio correspondiente al nivel del respondedor, es
probable que el participante no responda al tratamiento. Alternativamente, los pacientes que presentan niveles de bacterias más bajos que un nivel predeterminado o promedio correspondiente a los no respondedores, sacarán el máximo provecho del tratamiento. El paciente que no respondió tenía un estado fisiológico o patológico diferente de acuerdo con lo evaluado por las pruebas de diagnóstico convencionales. Por ejemplo, es probable que pacientes 5 con niveles de Erwinia mayores que aproximadamente 3431 o preferiblemente mayor que aproximadamente 13482 (una desv. típica) no respondan y pacientes con niveles más bajos que estos puedan beneficiarse más.
Tabla 7
Análisis a nivel de variable UTO
Observa- Minimo Máximo Media Desviación p|res- p|Falló
ciones típica pondió
Eubacterium (UTO589746)|respondió
9 0,000 4,000 1,333 1,732 1 0,011
Eubacterium (UTO589746)|Falló
6 2,000 20,000 9,667 7,174 0,011 1
Oribacteriumsinus (UTO470747)|respondió
9 0,000 11,000 2,778 3,598 1 0,005
Oribacteriumsinus (UTO470747)|Falló
6 2,000 77,000 28,000 25,954 0,005 1
Veillonellaceae (UTO535825)|respondió
9 0,000 40,000 9,000 14,186 1 0,024
Veillonellaceae (UTO535825)|Falló
6 2,000 93,000 49,500 38,667 0,024 1
Enterobacteriaceae (UTO323418)|respondió
9 0,000 180,000 23,889 59,675 1 0,035
Enterobacteriaceae (UTO323418)|Falló
6 1,000 140,000 34,000 55,714 0,035 1
Lachnospiraceae (UTO71387)|respondió
9 0,000 137,000 16,000 45,418 1 0,015
Lachnospiraceae (UTO71387)|Falló
6 2,000 259,000 73,500 95,663 0,015 1
Atopobium (UTO529659)|respondió
9 0,000 101,000 17,889 32,259 1 0,018
Atopobium (UTO529659)|Falló
6 19,000 187,000 78,667 62,516 0,018 1
Mogibacterium (UTO46159)|respondió
9 0,000 163,000 21,556 53,346 1 0,043
Mogibacterium (UTO46159)|Falló
6 3,000 376,000 79,167 146,389 0,043 1
Propionibacteriumacnes (UTO368907)|respondió
9 0,000 192,000 32,667 68,431 1 0,044
Propionibacteriumacnes (UTO368907)|Falló
6 1,000 363,000 63,500 146,761 0,044 1
Alteromonadaceae; BD2-13 (UTO110075)|respondió
9 0,000 44,000 8,444 15,001 1 0,022
Alteromonadaceae; BD2-13 (UTO110075)|Falló
6 1,000 715,000 142,000 281,637 0,022 1
Coprococcus (UTO182512)|respondió
9 0,000 133,000 23,778 43,249 1 0,045
Coprococcus (UTO182512)|Falló
6 3,000 282,000 129,167 128,205 0,045 1
Lachnospiraceae (UTO303772)|respondió
9 1,000 78,000 14,778 25,806 1 0,043
Lachnospiraceae (UTO303772)|Falló
6 2,000 509,000 167,667 205,745 0,043 1
Clostridiales (UTO204932)|respondió
9 0,000 2054,000 237,222 681,670 1 0,024
Clostridiales (UTO204932)|Falló
6 11,000 5639,000 1037,833 2257,516 0,024 1
Bacteroidales (UTO183618)|respondió
9 0,000 2059,000 246,667 681,482 1 0,023
Bacteroidales (UTO183618)|Falló
6 9,000 6706,000 1295,167 2666,325 0,023 1
Ruminococcaceae (UTO195252)|respondió
9 0,000 120,000 21,889 40,946 1 0,044
Ruminococcaceae (UTO195252)|Falló
6 2,000 9494,000 1716,333 3814,455 0,044 1
Sutterella (UTO295422)|respondió
9 2,000 1132,000 145,556 371,004 1 0,018
Sutterella (UTO295422)|Falló
6 17,000 20759,000 6729,833 8755,580 0,018 1
Enterobacteriaceae (UTO307080)|respondió
9 6,000 13849,000 1846,333 4559,821 1 0,025
Enterobacteriaceae (UTO307080)|Falló
6 165,00 15872,000 4616,833 5840,027 0,025 1
5
10
15
20
25
30
35
Análisis a nivel de variable UTO
Observa ciones Minimo 0 0,000 Máximo Media Desviación típica p|res- pondió p|Falló
Ruminococcus (UTO174136)|respondió
9 24,000 6,667 9,000 1 0,033
Ruminococcus (UTO174136)|Falló
6 1,000 48877,000 8170,833 19941,884 0,033 1
Clostridiumramosum (UTO470139)|respondió
9 5,000 10411,0 00 1186,4 44 3459,360 1 0,045
Clostridiumramosum (UTO470139)|Falló
6 10,000 139273, 000 36964, 333 53876,950 0,045 1
Erwinia (UTO289103)|respondió
9 3,000 30231,000 3425,667 10052,419 1 0,010
Erwinia (UTO289103)|Falló
6 78,000 164661, 42988, 62253,78 0,010 1
000 167 6
Erwinia|respondió
9 3,000 30231,000 3430,778 10050,512 1 0,013
Erwinia|Falló
6 O o o co O o o co co "3- co 42989,333 62253,169 0,013 1
Atopobium|respondió
9 0,000 307,000 51,556 101,187 1 0,045
Atopobium|Falló
6 23,000 231,000 90,167 76,434 0,045 1
Propionibacterium|respondió
9 0,000 196,000 40,444 79,783 1 0,042
Propionibacterium|Falló
6 2,000 363,000 63,833 146,593 0,042 1
Se apreciará que más de un taxón y/o UTO pueden combinarse para identificar a los pacientes que tienen más probabilidades de responder al tratamiento. Por ejemplo, se podría combinar la medición de UTO295422 y del taxón Erwinia en un paciente y si los niveles están por debajo de aproximadamente 145 y aproximadamente 3430 respectivamente, se considera probable que el paciente responda. Cabe señalar que las UtO están relacionadas la mayor parte del tiempo con un taxón, por lo que el enfoque descrito anteriormente también sería aplicable utilizando taxones asociados con una UTO.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para someter a ensayo o analizar o medir los niveles de bacterias intestinales obtenidas directamente del intestino o de las heces y en el que se realiza la medición real de los niveles bacterianos. in vitro. Los niveles medidos se pueden utilizar para evaluar la naturaleza, gravedad o fase de la enfermedad EII, EC o CU y determinar el curso del tratamiento, tal como la administración de ciertos medicamentos.
Además, también se proporciona un método en el que se solicita una prueba para medir los niveles de bacterias como se describe anteriormente para proporcionar los resultados de un análisis para determinar si un paciente tiene EII, EC o CU o para determinar la gravedad o fase de tal enfermedad evaluando los niveles bacterianos como se describió anteriormente y administrando un tratamiento si el paciente exhibe el tipo y los niveles de bacterias asociados con la enfermedad o la gravedad o fase de la enfermedad.
Por lo tanto, la presente invención proporciona la identificación de estados patológicos o características de pacientes identificando las bacterias asociadas con enfermedad y de estados fisiológicos proporcionando niveles de bacterias presentes en la enfermedad o en diferentes fases o gravedad de la enfermedad.
Los taxones y proteínas bacterianos descritos anteriormente se pueden denominar marcadores de diagnóstico. Estos marcadores de diagnóstico se pueden utilizar en un método para clasificar una muestra como asociada a EII, CU o EC. El método comprende las etapas de determinar la presencia o el nivel de uno o más de los marcadores de diagnóstico y comparar la presencia o el nivel con muestras de pacientes con EII, CU o EC y/o pacientes normales. Una combinación de marcadores de diagnóstico se puede combinar entre sí y también se puede combinar con un resultado de diagnóstico convencional derivado de un índice de actividad de la enfermedad.
El algoritmo puede ser un algoritmo estadístico que puede comprender un sistema clasificador estadístico de aprendizaje (o combinación de tales sistemas) tal como una red neuronal, un bosque aleatorio, un árbol interactivo y similares, tal como conocería un experto en la técnica. El valor predictivo del sistema clasificador se puede predeterminar y puede ser, por ejemplo, al menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. El resultado de la clasificación se puede proporcionar a un médico, tal como un gastroenterólogo o un médico general.
En otro aspecto más de la descripción, se proporciona un método para clasificar una muestra intestinal para determinar una asociación con EII, CU o EC que comprende determinar un perfil de marcador de diagnóstico detectando una presencia o nivel de al menos un marcador de diagnóstico de intestino y clasificando la muestra como EII, CU o Ec comparando el perfil del marcador de diagnóstico con muestras de pacientes con EII, CU o EC o sujetos normales o una combinación de los mismos. El perfil se puede combinar con un diagnóstico basado en un
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índice de actividad de la enfermedad específico para EII, CU o EC.
El marcador de diagnóstico se puede seleccionar entre bacterias productoras de H2S, Proteobacterias, bacterias productoras de butirato, Fusobacterium nucleatum, Veillonella parvula, Atopobium parvulum, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnopiraceae, Eubacterium, Roseburia, Coprococcus, Clostridium, Eubacterium rectale, Clostridium coccoides, Roseburia inulivorans, Verrucomicrobiae, Clostridiales, Verrucomicrobiales, Verrucomicrobiaceae, Lachnospiraceae, Paenibacillaceae, Akkermansia, Turicibacter, Paenibacillus, Pasteurellales, Chromatialles, Hydrogenophilales, Oceanospirillales, Rhizobiales, Halomonadaceae, Pasteurellaceae, Bradyrhizobiaceae,
Metilococcaceae, Hydrogenophilaceae, Porphyromonas, Lautropia, Metilobacterium, Haemophilus, Finegoldia, Nitrincola, Hydrogenophilu, Actinobacillus, Anaerococcus, Mobiluncus, Enterobacter, Vitreoscilla, Alcanivorax, Veillonella, Tatumella, Staphilococcaceae, Paenibacillaceae, Listeriaceae, Listeria, Paenibacillus, Staphilococcus, Negativicutes, Betaproteobacteria, Pasteurellales, Chromatialles, Burkholderiales, Selenomonadales,
Pasteurellaceae, Haemophilus, Pantoea, Carnobacteriaceae, Granulicatella, Mogibacterium, Proprionibacterium, Bacillaceae, Atopobium, Hydrogenophilales, Rhizobiales, Bradyrhyzobiaceae, Hydrogenophilaceae, Porphyromonas, Lautropia, Tannarella, Finegoldia, Hydrogenophilus, Catonella, Mobilumcus, Alcanivorax, Afipia, sulfodioxigenasa (ETHE1), tiosulfato sulfotransferasa (TST), subunidad IV de citocromo c oxidasa, sulfuro deshidrogenasa (SQR), complejos III y IV de la cadena respiratoria mitocondrial, Cxcll, IL17a, II12, II1p y combinación de los mismos.
El perfil puede consistir en niveles de un marcador o la combinación de niveles de diferentes marcadores o los niveles relativos (proporciones) de marcadores combinados o no con un diagnóstico basado en un índice de actividad de la enfermedad. El perfil también puede comprender niveles de marcadores a lo largo del tiempo o fases de la enfermedad o enfermedades o gravedad de la enfermedad o enfermedades. El perfil también puede ser ponderado con respecto a los marcadores o el diagnóstico.
También se proporciona un aparato que comprende un detector de marcador de diagnóstico capaz de detectar uno o más de los marcadores descritos anteriormente por ejemplo mediante métodos descritos en esta solicitud, un procesador configurado para clasificar la muestra como una muestra de EII, CU o EC comparando el perfil del marcador de diagnóstico para las muestras de sujetos con EII, EC, CU o normales o una combinación de los mismos y una unidad de visualización de resultados para mostrar a un usuario una clasificación obtenida del procesador. El procesador también puede recibir de una entrada un resultado de diagnóstico basado en un índice de actividad de enfermedad específico para EII, CU o EC y combinar este resultado de diagnóstico con el perfil del marcador de diagnóstico para generar la clasificación. Por lo tanto, el procesador puede utilizar datos de entrenamiento o una cohorte de entrenamiento para identificar las características del marcador de diagnóstico que proporciona una clasificación fiable. Los datos proporcionados aquí (niveles de bacterias y proteínas por ejemplo) con su correlación con la presencia de enfermedad o gravedad o progresión de la enfermedad se pueden utilizar como una cohorte de entrenamiento. Sin embargo, se apreciará que se podrían generar datos adicionales para mejorar los datos de entrenamiento basados en la orientación de los resultados presentados en esta solicitud.
Se entenderá que el procesador puede utilizar algoritmos como se describió anteriormente.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se reclutó una cohorte de inicio de 157 pacientes (84 enfermedad de Crohn (EC), 20 colitis ulcerosa (CU) y 53 controles, tabla 8).
Tabla 8
Núm. ID Muestra
Descrip ción M/ F edad Sitio Muestreado Apariencia Visual Clasificación Paris IAECP/IACUP Experimento
HMC002RC
UC F 16 RC normal E1,S0 20 (Leve) Illumina
HMC003RC
Control F 9 RC normal n/a n/a Illumina
HMC004RC
Control M 12 RC normal n/a n/a Piro454
HMC005RC
Control F 10 RC normal n/a n/a Illumina
HMC006RC
Control M 15 RC normal n/a n/a Illumina
HMC012RC
CD M 13 RC normal A1b,L1,B1,G0 12,5 (Leve) Illumina
HMC013RC
UC M 12 RC inflamado E4,S1 65 (Grave) Illumina
HMC014RC
CD F 14 RC normal A1b,L3,L4a,B1, G1 37,5 (Moderada piro454
HMC015RC
CD F 14 RC normal A1b,L1,B2,G0 10 (Leve) Illumina
HMC016RC
CD M 13 RC normal A1b,L3,B1,G0 20 (Leve) Illumina
Núm. ID Muestra
Descrip ción M/ F edad Sitio Muestreado Apariencia Visual Clasificación Paris IAECP/IACUP Experimento
HMC017RC
CD M 13 RC inflamado A1b,L2,L4a,B1, G1 57,5 (Grave) Illumina
HMC018RC
Control M 13 RC normal n/a n/a Illumina
HMC019RC
UC M 14 RC inflamado E4,S1 80 (Grave) Illumina/piro454
HMC020RC
Control F 12 RC normal n/a n/a Piro454
HMC022RC
CD M 14 RC normal A1b,L1,B1,G1 37,5 (Moderada Illumina
HMC023RC
UC M 14 RC normal E4,S1 50 (Moderada Illumina/piro454
HMC024RC
UC M 16 RC normal E3,S1 40 (Moderada piro454
HMC025RC
CD F 15 RC normal A1b,L4b,B1,G0 20 (Leve) Illumina
HMC026RC
Control F 16 RC normal n/a n/a Piro454
HMC027RC
Control F 16 RC normal n/a n/a Illumina
HMC028RC
Control M 13 RC normal n/a n/a Illumina/piro454
HMC029RC
CD M 14 RC inflamado A1b,L3,L4a,B1, G0 32,5 (Moderada Illumina
HMC030RC
CD F 17 RC inflamado A1b,L3,L4a,B1, G0 45 (Grave) Illumina
HMC038RC
CD F 16 RC inflamado A1b,L2,B1p,G0 20 (Leve) Illumina
HMC039RC
CD F 13 RC normal A1b,L1,L4a,B1, G1 60 (Grave) Illumina
HMC041 RC
CD F 15 RC normal A1b,L3,B1,G0 57,5 (Grave) Illumina
HMC042RC
Control M 17 RC normal n/a n/a Illumina
HMC043RC
Control F 16 RC normal n/a n/a Illumina
HMC044RC
CD F 15 RC normal A1b,L1,B3,G1 52,5 (Grave) Illumina
HMC045RC
UC M 17 RC normal E3 45 (Moderada Illumina
HMC046RC
UC F 4 RC inflamado E4,S1 65 (Grave) Illumina/piro454
HMC047RC
CD M 16 RC inflamado A1b,L3,L4a,B1, G1 65 (Grave) Illumina
HMC049RC
CD M 12 RC normal A1b,L1,B1,G1 40 (Grave) Illumina/piro454
HMC050RC
CD F 16 RC normal A1b,L1,B1,G0 12,5 (Leve) Illumina
HMC051 RC
CD F 16 RC inflamado A1b,L3,L4a,B1, G0 65 (Grave) Illumina
HMC052RC
Control F 8 RC normal n/a n/a Piro454
HMC055RC
Control M 6 RC normal n/a n/a Illumina/piro454
HMC056RC
Control F 8 RC normal n/a n/a Illumina
HMC059RC
Control M 14 RC normal n/a n/a Illumina
HMC061 RC
CD M 9 RC inflamado A1a,L2,B1,G0 32,5 (Moderada Illumina/piro454
HMC062RC
CD F 15 RC inflamado A1b,L3,L4a,B3, G0 57,5 (Grave) Illumina
HMC063RC
CD M 13 RC normal A1b,L1,L4a,B1, G1 65 (Grave) Illumina/piro454
HMC064RC
UC M 18 RC inflamado E4,S1 0 (Inactiva) Illumina
HMC065RC
CD M 16 RC normal A1b,L1,B2,B3,G 0 50 (Grave) Illumina
HMC066RC
UC F 18 RC inflamado E4,S0 35 (Moderada Illumina/piro454
HMC067RC
Control F 17 RC normal n/a n/a Illumina
Núm. ID Muestra
Descrip ción M/ F edad Sitio Muestreado Apariencia Visual Clasificación Paris IAECP/IACUP Experimento
HMC068RC
CD M 17 RC inflamado A1b, L2, B1, G0 32,5 (Moderada Piro454
HMC069RC
Control F 17 RC normal n/a n/a Illumina
HMC070RC
Control F 8 RC normal n/a n/a Piro454
HMC071 RC
Control M 11 RC normal n/a n/a Illumina
HMC072RC
CD M 12 RC inflamado A1b,L3,L4a,B1, G1 55 (Grave) Illumina
HMC073RC
Control F 16 RC normal n/a n/a Illumina
HMC074RC
Control F 16 RC normal n/a n/a Piro454
HMC075RC
CD M 14 RC inflamado A1b,L2,B1,G1 50 (Grave) Illumina
HMC076RC
UC F 17 RC inflamado E4,S0 55 (Moderada Illumina/piro454
HMC077RC
UC M 17 RC normal E3,S0 50 (Moderada Illumina/piro454
HMC078RC
CD F 15 RC normal A1b,L1,B1,G0 45 (Grave) Illumina
HMC079RC
CD M 16 RC inflamado A1b,L3,B1,G0 45 (Grave) Illumina
HMC081 RC
CD M 11 RC normal A1b,L1,B1,G1 67,5 (Grave) Illumina
HMC082RC
CD F 15 RC inflamado A1a,L3,B1,G0 27,5 (Leve) Illumina
HMC085RC
CD M 16 RC normal A1b,L2,B1,G1 62,5 (Grave) Illumina/piro454
HMC086RC
CD M 8 RC normal A1a,L1,L4a,L4b, B1,G0 22,5 (Leve) Illumina
HMC087RC
Control F 18 RC normal n/a n/a Illumina/piro454
HMC088RC
UC M 16 RC inflamado E1,S0 20 (Leve) Illumina
HMC090RC
CD M 16 RC inflamado A1b,L3,L4,B1,G 0 52,5 (Grave) Illumina/piro454
HMC091 RC
Control M 12 RC normal n/a n/a Illumina
HMC092RC
UC M 12 RC normal E3,S1 80 (Grave) Illumina/piro454
HMC093RC
CD M 12 RC normal A1b,L1,B1p,G0 27,5 (Leve) Illumina/piro454
HMC094RC
CD M 11 RC normal A1b,L1,B1p,G0 45 (Grave) Illumina
HMC095RC
CD M 11 RC normal A1b,L3,B1p,G1 65 (Grave) Illumina
HMC097RC
CD M 12 RC inflamado A1b, L3, L4a, B1, G0 40 (Grave) Piro454
HMC098RC
Control F 16 RC normal n/a n/a Illumina
HMC100RC
Control M 15 RC normal n/a n/a Illumina
HMC102RC
Control F 17 RC normal n/a n/a Illumina
HMC103RC
UC F 17 RC inflamado E4,S0 50 (Moderada Illumina
HMC106DC
Control F 16 DC normal n/a n/a qPCR/qRTPCR
HMC109DC
Control F 3 DC normal n/a n/a qPCR/qRTPCR
HMC112DC
Control M 9 DC normal n/a n/a qPCR/qRTPCR
HMC113DC
UC M 15 DC inflamado E2, S1 0 ((Inactiva)) qRTPCR
HMC117DC
Control F 15 DC normal n/a n/a qRTPCR
HMC201 RC
CD F 11 RC inflamado A1b,L2,B1,G1 37,5 (Moderada Illumina/Masssp ec/qPCR/qRTP
HMC202RC
CD M 17 RC inflamado A1b,L3,B1,G0 37,5 (Moderada Illumina/Masssp ec/qPCR/qRTP
HMC203RC
CD M 11 RC inflamado A1b,L3,B1,G0 45 (Grave) Illumina/Masssp ec/qPCR/qRTP
Núm. ID Muestra
Descrip ción M/ F edad Sitio Muestreado Apariencia Visual Clasificación Paris IAECP/IACUP Experimento
HMC204RC
CD M 13 RC normal A1b,L1,l G1 _4b,B1, 45 (Grave) Illumina/qRTPC R
HMC205RC
CD M 13 RC normal A1b,L1,l P,G1 _4a,B1, 45 (Grave) Illumina/qPCR/q RTPCR
HMC206RC
CD M 14 RC inflamado A1b, L3, B1, G1 45 (Grave) qRTPCR
HMC207RC
UC F 13 RC inflamado E4,S1 70 (Grave) Illumina
HMC208RC
Control F 16 RC normal n/a n/a Illumina/qPCR/q RTPCR
HMC210RC
CD F 17 RC normal A1b, L1, B1, G0 37,5 (Moderada qRTPCR
HMC211 RC
control M 13 RC normal n/a n/a qRTPCR
HMC212RC
control F 15 RC normal n/a n/a qRTPCR
HMC213RC
CD M 10 RC inflamado A1b, L3, B1, G1 60 (Grave) qPCR/EspecMas as
HMC214RC
UC M 17 RC inflamado E3, S0 35 (Moderada qRTPCR
HMC215RC
UC F 12 RC inflamado E4, S1 65 (Grave) qRTPCR
HMC217RC
CD F 14 RC normal A1b, L1, G0 L4a, B1, 55 (Grave) qPCR/qRTPCR
HMC219RC
CD M 14 RC inflamado A1b, L3, B1, G1 37,5 (Moderada EspecMasas/qRT P CR
HMC220RC
CD M 13 RC inflamado A1b, L3, B1, G0 60 (Grave) EspecMasas/qRT P CR
HMC221 RC
control F 9 RC normal n/a n/a qPCR/qRTPCR
HMC222RC
control M 10 RC normal n/a n/a qPCR/qRTPCR
HMC223RC
CD F 9 RC inflamado A1a, L2, B1, G1 45 (Grave) EspecMasas/qRT P CR
HMC224RC
control M 15 RC normal n/a n/a qPCR/qRTPCR/ EspecMasas
HMC225RC
control F 15 RC normal n/a n/a qRTPCR
HMC227RC
CD F 13 RC inflamado A1b, L3, B1, G0 32,5 (Moderada qPCR/qRTPCR/ EspecMasas
HMC228RC
CD M 13 RC inflamado A1b, L3, G0 B1, P, 62,5 (Grave) EspecMasas/qRT P CR
HMC229RC
CD M 10 RC inflamado A1b, L2, G0 L4a, B1, 57,5 (Grave) qPCR/qRTPCR
HMC230RC
CD M 14 RC inflamado A1b, L3, P, G0 L4a, B1, 52,5 (Grave) qPCR/qRTPCR
HMC231RC
CD F 15 RC normal A1b, L1, B1, G0 37,5 (Moderada qPCR/qRTPCR
HMC232RC
control F 15 RC normal n/a n/a qPCR/qRTPCR/ EspecMasas
HMC234RC
CD F 13 RC inflamado A1b, L3, B1, G0 52,5 (Grave) qRTPCR
HMC235RC
control M 11 RC normal n/a n/a qRTPCR
HMC237RC
control M 14 RC normal n/a n/a EspecMasas/qRT P CR
HMC238RC
Control M 14 RC normal n/a n/a qPCR/qRTPCR
HMC239RC
CD M 3 RC infamed A1a, L3, B1p, G0 22,5 (Leve) EspecMasas/qRT P CR
HMC240RC
CD M 10 RC normal A1b, L1, B1, G0 55 (Grave) qRTPCR
Núm. ID Muestra
Descrip ción M/ F edad Sitio Muestreado Apariencia Visual Clasificación Paris IAECP/IACUP Experimento
HMC241RC
Control F 12 RC normal n/a n/a qRTPCR
HMC243RC
UC M 8 RC inflamado E1, S0 45 (Moderada qRTPCR
HMC245RC
Control M 16 RC normal n/a n/a qRTPCR
HMC246RC
Control M 13 RC normal n/a n/a qRTPCR
HMC247RC
UC F 13 RC inflamado E4, S1 80 (Grave) qRTPCR
HMC249RC
UC M 14 RC inflamado E4, S0 45 (Moderada qRTPCR
HMC252RC
CD M 9 RC inflamado A1a, L3, B1, G0 37,5 (Moderada EspecMasas
HMC253RC
CD F 11 RC inflamado A1b, L2, L4a, B1 40 (Grave) qPCR
HMC254RC
CD M 12 RC normal A1a, L1, L4a, B2B3 27,5 (Leve) EspecMasas
HMC256RC
CD F 10 RC inflamado A1b, L2, B1 30 (Moderada EspecMasas
HMC258RC
Control M 15 RC normal n/a n/a EspecMasas
HMC260RC
CD M 13 RC inflamado A1b,L2,B1p 47,5 (Grave) qPCR
HMC261RC
CD F 13 RC normal A1b, L3, L4, B1p 32,5 (Moderada qPCR
HMC264RC
CD F 15 RC normal A1bL3L4aB1G0 30 (Moderada qPCR
HMC266RC
CD F 10 RC inflamado A1a, L2, B1 27,5 (Leve) qPCR
HMC269RC
CD M 8 RC normal A1a, L3, L4a, B1 2,5 (Inactiva) qPCR
HMC270RC
Control F 17 RC normal n/a n/a qPCR
HMC271RC
CD M 15 RC inflamado A1a, L3, B1p, GO 62,5 (Grave) qPCR/EspecMas as
HMC272RC
CD M 12 RC inflamado A1a, L3, B1p, G1 50 (Grave) EspecMasas
HMC280RC
CD M 15 RC inflamado A1b, L3, B1 35 (Moderada EspecMasas
HMC281RC
Control F 15 RC normal n/a n/a EspecMasas
HMC285RC
CD F 9 RC inflamado A1a, L3, B1, G0 17,5 (Leve) qPCR
HMC286RC
CD M 15 RC inflamado A1b, L3, L4a, B1 5 (Inactiva) qPCR
HMC288RC
CD M 14 RC inflamado A1b, L3, B1p 62,5 (Grave) qPCR/EspecMas as
HMC289RC
CD M 12 RC inflamado A1b, L3, B1p 67,5 (Grave) qPCR
HMC293RC
CD F 12 RC inflamado A1b, L2, B1, G1 22,5 (Leve) qPCR
HMC295RC
CD F 14 RC inflamado L2, B1, G0 20 (Leve) qPCR
HMC297RC
Control F 17 RC normal n/a n/a qPCR
HMC298RC
CD M 12 RC normal A1b, L1, B1 52,5 (Grave) qPCR
HMC300RC
CD M 10 RC inflamado A1a, L3, L4a, B1, G1 27,5 (Leve) EspecMasas
HMC301RC
CD F 14 RC inflamado A1b, L3, L4a, B1, G0 60 (Grave) EspecMasas
HMC305RC
CD M 4 RC normal A1a, L3, L4a, B2p, G0 12,5 (Leve) qPCR
HMC307RC
Control F 16 RC normal n/a n/a qPCR/EspecMas as
HMC309RC
Control M 10 RC normal n/a n/a qPCR/EspecMas as
HMC313RC
Control M 16 RC normal n/a n/a qPCR
HMC315RC
Control M 16 RC normal n/a n/a EspecMasas
HMC316RC
CD M 14 RC inflamado A1b, L3, L4a, B1 17,5 (Leve) qPCR/EspecMas as
HMC317RC
CD M 15 RC normal A1b, L1, L4a, 0 (Inactiva) qPCR
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Núm. ID Muestra
Descrip ción M/ F edad Sitio Muestreado Apariencia Visual Clasificación Paris IAECP/IACUP Experimento
B1p
HMC319RC
O D M 12 RC normal L1, B1, G1 40 (Grave) qPCR
HMC321RC
Control F 16 RC normal n/a n/a qPCR
HMC322RC
O D M 12 RC inflamado A1bL3B1P 27,5 (Leve) qPCR
HMC323RC
O D F 16 RC inflamado A1bL3B1G0 35 (Moderada qPCR
HMC327RC
CD F 10 RC inflamado A1aL2B1 25 (Leve) EspecMasas
Se recogió la microbiota en la interfase de la mucosa intestinal embebida dentro de la capa de moco y en contacto directo con el sitio de la enfermedad, y se caracterizó la composición microbiana. La microbiota de EII se caracterizó por un núcleo más pequeño en comparación con los controles (Fig. 5A, 5B y Tabla 1), lo que indica una pérdida de la homeostasis de la microbiota. Además, se encontró que dos taxones de la microbiota núcleo que son potentes productores de H2S, Fusobacterium nucleatum y Veillonella parvula eran más abundantes en pacientes con EC y CU, respectivamente, en comparación con los controles (P<0,013; Tabla 1). Notablemente, F. nucleatum ha sido previamente asociado con EII de adultos y se ha demostrado que promueve la tumorigénesis en ratones Apcmin/+ 4-6 Para identificar los microbios asociados con la EII, se comparó la composición de taxones microbianos de las comunidades de EC, CU y control mediante una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, que indicó factores discriminantes significativos en 48 taxones (P<0,015; Tabla Complementaria 5). Las abundancias relativas de Firmicutes, Clostridia, Clostridiales y Lachnospiraceae, que son los principales productores de butirato, disminuyeron en EC y CU en comparación con la microbiota de control, mientras que las abundancias relativas de Negativicutes, Selenomonadales, Veillonella y Betaproteobacterias aumentaron (Tabla 2) . Los taxones asociados con la actividad de la enfermedad se identificaron para identificar los microbios que modulan la gravedad de la EII. Una prueba de Kruskal-Wallis identificó 11 taxones únicos que muestran una abundancia diferencial entre pacientes con EC con inflamación leve, moderada o grave (Tabla 3). El análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) agrupó pacientes con EC con inflamación severa por separado de aquellos con inflamación leve (Fig. 1a; p = 0,001). El análisis biplot de los taxones indicó que ciertos taxones, a saber, Carnobacteriaceae, Granulicatella, Mogibacterium, Proprionibacterium, Bacillaceae y Atopobium fueron más abundantes en pacientes con inflamación severa en comparación con leve (Fig. 1b). Por el contrario, Clostridia, que son productores principales de butirato, fueron conductores de inflamación leve y exhibieron una disminución significativa de la abundancia relativa con una mayor gravedad de la enfermedad. Atopobium fue clasificado adicionalmente como Atopobium parvulum (UTO Núm. 529659), un potente productor de H2S implicado en la halitosis7,8. H2S es ahora reconocido como un mediador importante de muchos procesos fisiológicos y patológicos y se ha asociado con la EII y el cáncer colorrectal9,10. El sulfuro inhibe el metabolismo del butirato, la principal fuente de energía para los colonocitos, y la actividad oxidasa del citocromo c, el sitio de la producción de ATP9. Por lo tanto, una mayor concentración de H2S podría dañar gravemente la bioenergética celular. Esto induciría la inanición y muerte de los colonocitos, alteraría la barrera epitelial y potencialmente conduciría a inflamación.
La abundancia relativa de A. parvulum fue validada por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y se encontró que se correlacionaba positivamente con la gravedad de la enfermedad (Fig. 1c). La correlación entre A. parvulum y EC también se confirmó mediante pirosecuenciación 454 de un subconjunto de muestras seguido de un tamaño de efecto de análisis discriminante lineal11 (LEfSe; Fig. 2-3 Complementaria). Es importante destacar que no se observó mayor abundancia de A. parvulum en la CU y, por lo tanto, no es simplemente una consecuencia de la inflamación, lo que sugiere un efecto causal en la EC.
Para evaluar el potencial colitogénico de A. parvulum, los autores de la presente invención utilizaron ratones//10-/", susceptibles a colitis1213. Los ratones //10-"- libres de gérmenes se transfirieron a habitáculos libres de patógenos específicos (SPF) y se les administró A. parvulum (108 UFC/ratón/semana) mediante una sonda oral durante 6 semanas. En comparación con los ratones //10-"- no infectados de control, los ratones //10-"- colonizados con A. parvulum mostraron evidencia macroscópica de atrofia cecal y reducción de la longitud del colon (Fig. 2a). Las imágenes de colonoscopia revelaron eritema de la mucosa, friabilidad y ulceración de la mucosa en los ratones //10-"- colonizados con A. parvulum en comparación con la mucosa sana observada en ratones controlados (Fig. 2b). La evaluación histológica del tracto intestinal mostró evidencia de inflamación con hiperplasia de las criptas, úlceras, disminución de células caliciformes e infiltración de células inmunitarias observada en el ciego y la parte distal del colon de los ratones //10-"- colonizados con A. parvulum en comparación con los ratones //10'-' de control no infectados (Fig. 2c). En consecuencia, las puntuaciones de inflamación histológica fueron significativamente mayores en ratones //10-"- asociados con A. parvulum en comparación con los ratones no infectados (P<0,05; Fig. 2d). A nivel molecular, el colon de los ratones //10""" infectados por A. parvulum mostró un aumento de acumulación de ARNm de Cxcll y //17 en comparación con los ratones //10-"- no infectados (multiplicidades de aumento de 8 y 5, respectivamente; P<0,01). Estos resultados indican que la Bacteria productora de H2S A. parvulum induce pancolitis en un modelo de ratón de EII susceptible genéticamente.
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Para obtener ideas mecanicistas sobre el papel de los microbios productores de H2S en la gravedad de la EII, se realizó un análisis proteómico no sesgado, cuantitativo de biopsias de la mucosa de sujetos con EII de diversa gravedad de enfermedad (n = 21) y controles (n = 8). Se obtuvieron mediciones para 3880 proteínas de las cuales 490 se identificaron como expresadas diferencialmente comparando los 3 grupos principales, severo vs. moderado vs. control (ANOVA de una vía con P<0,05). Las proteínas mitocondriales se identificaron como una importante característica discriminante que representaba 21,7% de todas las proteínas expresadas diferencialmente (Fig. 3A y Fig. 8A, 8B y 8C). Las proteínas que controlan la actividad de la enfermedad se identificaron mediante PLS-DA y el análisis de sus puntuaciones de proyección de importancia variable (VIP) (Tablas 4 y 5 y Fig. 7B y 9A y 9B). En particular, se encontró que los componentes del complejo de desintoxicación de sulfuro de hidrógeno mitocondrial (9 y Fig. 10) eran las principales proteínas que impulsaban la separación basada en la gravedad de la enfermedad (Tabla 5). Estas proteínas, concretamente la sulfodioxigenasa (ETHE1), la tiosulfato sulfotransferasa (TST) y los componentes de los complejos III y IV de la cadena respiratoria mitocondrial, experimentaron una regulación a la baja en pacientes con EC en comparación con los controles (P<0,05).
La validación secundaria por qRT-PCR confirmó la represión del transcrito de TST (disminución de 5 veces, P=0,002) en pacientes con EC y CU (Figura 3C). Por otra parte, los niveles de expresión los genes de la subunidad IV de la citocromo c oxidasa y de la sulfuro deshidrogenasa (SQR), que también contribuyen a la desintoxicación de H2S, experimentaron una regulación a la baja significativamente en pacientes con EC y/o CU, medidos mediante qRT-PCR (Fig. 3D-E). Estos hallazgos indican que la regulación transcripcional contribuye al cambio observado en la abundancia de proteína y que la disminución de la abundancia de estas proteínas de desintoxicación de H2S es un sello distintivo de la actividad de la enfermedad EC y posiblemente de la CU. Es importante destacar que estos resultados explicarían el aumento previamente observado de los niveles de sulfuro fecal en pacientes con EII14.
Los hallazgos demuestran una alteración del equilibrio entre la producción de H2S derivado de bacterias y la desintoxicación de H2S mediada por el anfitrión en la interfase mucosa-luminal. Para someter a ensayo el papel causal de los microbios productores de H2S en la colitis, los autores de la presente invención evaluaron si un captador de H2S (bismuto) podría aliviar la colitis inducida por Atopobium en ratones II10~I~. De acuerdo con la primera cohorte, los ratones SPF asociados con Atopobium desarrollaron colitis grave (Fig. 4A-B) y exhibieron aumentos significativos de la expresión de citocinas proinflamatorias (Fig. 11A-D). El tratamiento con bismuto previno la colitis como se evidencia por la visualización colonoscópica (Fig. 4A) y por la disminución de la puntuación inflamatoria (P=0,007; Fig. 4B). Los ratones asociados con Atopobium también exhibieron un mayor número de focos GALT (tejido linfoide asociado al intestino) en comparación con los ratones no asociados (Fig. 4C; P=0,012). Sin embargo, el tratamiento con bismuto no evitó la formación GALT indicando que A. parvulum induce la neogénesis GALT en ratones II10~I~. Cabe señalar que los intestinos de los pacientes con EII también muestran un aumento similar del número de folículos linfoides15. Curiosamente, la eliminación de GALT con el tratamiento con LTpR-Ig protege a los ratones del desarrollo de colitis, lo que sugiere un papel para la formación de GALT en el desarrollo de la inflamación intestinal crónica16. El aumento de los focos GALT en los ratones asociados con Atopobium podría conducir a una expresión aberrante de las moléculas de adherencia linfoides y la activación deseada de células T no deseada hacia microbios comensales. Para evaluar el papel de estos microbios comensales en el desarrollo de la colitis, los ratones libres de gérmenes fueron mono-asociados con A. parvulum y mantenidos bajo condiciones gnotobióticas. Si bien estos ratones mostraron hiperplasia de criptas y aumento de focos GALT (Fig. 12A y Fig. 4C), no presentaban signos de ulceraciones, agotamiento de células caliciformes o infiltración de células inmunitarias (Fig. 4D). Este resultado indica que la microbiota intestinal es necesaria para el desarrollo de colitis inducida por Atopobium. Mientras que el tratamiento con bismuto previno la neogénesis de GALT en ratones mono-asociados con A. parvulum, el efecto observado podría no ser necesariamente debido a la captación de H2S, sino más bien debido a una posible actividad antimicrobiana del bismuto sobre A. parvulum, como se evidencia por la reducción del nivel de colonización (P=0,0001; Fig.12B). Debido a que tanto A. parvulum como la microbiota intestinal son necesarios para el desarrollo de colitis y debido a que el bismuto exhibe propiedades antimicrobianas17, los autores de la presente invención evaluaron el efecto del bismuto sobre la composición de la microbiota intestinal de sus ratones SPF y asociados con Atopobium. El análisis PCA de la composición de la microbiota intestinal reveló una alteración significativa del perfil microbiano de los ratones asociados con Atopobium en comparación con los ratones SPF (Fig. 4E). Concomitantemente a la prevención de la colitis, la administración de bismuto alteró la composición de la microbiota de estos 2 grupos de ratones (Tabla 6). En conjunto, estos resultados indican que (1) la colonización por A. parvulum alteró la composición de la microbiota intestinal (con una disminución significativa de la abundancia de los principales productores de butirato, incluido Eubacterium y Faecalibacterium (P<0,02)) de forma análoga a la composición de la microbiota de pacientes pediátricos con EII; (2) la composición aberrante de la microbiota intestinal en ratones asociados Atopobium es un inductor principal de colitis; y (3) el bismuto restaura la microbiota de estos ratones hacia una comunidad más saludable (con un aumento en la abundancia de productores de butirato).
En conjunto, los hallazgos arrojaron luz sobre los mecanismos patogénicos del comienzo temprano de la EII. La imagen emergente es que la microbiota pediátrica de EII se caracteriza por un agotamiento de los microbios productores de butirato junto con una mayor abundancia de bacterias generadoras de H2S, a saber A. parvulum, Fusobacterium y Veillonella, que producen H2S mediante fermentación proteica18. Debido a que los pacientes con EII exhiben aumento de niveles de H2S fecal14, se ha propuesto desde hace tiempo que las bacterias reductoras de sulfato (SRB) participen en la etiología de la EII, aunque los estudios no han demostrado un vínculo entre la SRB y
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la EII10. En cambio, el estudio de los autores de la presente invención demuestra un papel clave para los microbios que producen H2S a través de la fermentación proteica en la patogénesis de la EC. Se sabe que el butirato activa la expresión de los genes que codifican los componentes de desintoxicación H2S mitocondrial del anfitrión19 y los análisis proteómicos de los autores de la presente invención indican una disminución de la capacidad de desintoxicación de H2S por pacientes con EII. Por lo tanto, los autores de la presente invención postulan que el agotamiento de los microbios productores de butirato de la microbiota intestinal inhabilitaría los sistemas de defensa de H2S del anfitrión. Este anfitrión "desarmado" sería altamente susceptible a un mayor daño causado por el aumento de la producción de H2S, que da como resultado estrés metabólico y, posteriormente, aumento de la inflamación de la mucosa. Curiosamente, las variantes en el ADN mitocondrial, que dan como resultado un aumento de las actividades metabólicas, protegen a los ratones de la colitis . Esto está de acuerdo con el importante papel de las mitocondrias en la modulación de la barrera de la mucosa. Más recientemente, se ha demostrado que el exceso de H2S actúa como un activador autocrino de células T, lo que puede contribuir a respuestas de células T no deseadas contra las bacterias comensales21, de acuerdo con la observación de los autores de la presente invención de que se requiere la microbiota intestinal para la colitis experimental inducida por A. parvulum. Dado el papel esencial del butirato en la regulación de la homeostasis de las células T reguladoras (Treg) y el papel crítico de Treg en la limitación de la inflamación intestinal22, la producción de H2S también puede interferir con este proceso al alterar la oxidación del butirato y, por lo tanto, puede conducir a una mayor gravedad de la colitis. Este resultado enfatiza la importancia de la comunidad microbiana y su interacción con el anfitrión en la patogénesis de la EII. En conjunto, los hallazgos de los autores de la presente invención proporcionan nuevas vías para el diagnóstico, así como terapias para el tratamiento de la EII.
Métodos
Ejemplo 2
Se recogieron lavados de la mucosa colónica y/o biopsias de la mucosa de 157 sujetos pediátricos (84 enfermedad de Crohn, 20 colitis ulcerosa y 53 controles). Todos los casos de EII fueron diagnosticados recientemente de EII y cumplieron los criterios de diagnóstico convencionales para EC o CU. El ADN metagenómico de los lavados intestinales se extrajo utilizando el kit FastDNA SPIN. Se estudiaron las comunidades microbianas mediante la secuenciación profunda de la región hipervariable V6 del ARN 16S utilizando Illumina HiSeq2500 y Pirosecuenciación 454. Las lecturas se filtraron por calidad y se utilizó QIIME23 para asignar lecturas a unidades taxonómicas operativas (UTO) frente al conjunto de referencia de Greengenes. Se utilizaron varios enfoques estadísticos (pruebas de Kruskal-Wallis, LEF8e, PCA, PLS-DA) para determinar las UTO diferencialmente abundantes. La correlación entre la abundancia relativa de A. parvulum y la gravedad de EC se confirmó mediante qPCR. El análisis proteómico de las biopsias de la mucosa se realizó utilizando HPLC-ESI-MS/MS basada en super- SILAC. Los datos brutos generados se procesaron y analizados mediante MaxQuant frente a la base de datos Uniprot humana señuelo con el archivo de grupo de proteínas importado a Persus para el análisis estadístico. El análisis de la ruta se realizó utilizando los DAVID Bioinformatics Resources. Los niveles de transcripción de TST, SQRDL y COX4-1 fueron cuantificados mediante RT-qPCR. A los ratones II10_/" libres de patógeno gnotobióticos y específicos se les introdujo mediante sonda oral una vez a la semana A. parvulum (108 ufc) durante 6 semanas. Se añadió subsalicilato de bismuto (III) (7 g/kg) a la dieta de los grupos asignados una semana antes de la sonda oral. Se tomaron muestras de tejido del colon para el ARN y la histología como se describió previamente24. Se realizaron colonoscopias de ratón y se puntuó ciegamente la inflamación histológica como se describió previamente25. Las citocinas de la mucosa de ratones (Cxcll, II12p40, II1p y II17a) se cuantificaron mediante RT-qPCR.
Ejemplo 3
Cohorte de pacientes y diseño del estudio:
Este estudio incluyó la inscripción, la evaluación detallada y el muestreo biológico de 157 sujetos pediátricos (84 EC, 20 CU y 53 controles, Tabla 7). Todos los pacientes menores de 18 años programados para someterse a su primera colonoscopia diagnóstica en el Childrens Hospital of Eastern Ontario (CHEO) fueron potencialmente elegibles para el reclutamiento para este estudio, con las siguientes exclusiones que se sabe afectan a la composición de la microbiota intestinal: (1) índice de masa corporal (IMC) mayor que el percentil 95 por edad; (2) diagnóstico de diabetes mellitus; (3) diagnóstico de gastroenteritis infecciosa en los 2 meses anteriores; y (4) uso de antibióticos o probióticos en las últimas 4 semanas. Todos los casos fueron diagnosticados recientemente de EII (cohorte de inicio antes del comienzo del tratamiento) y cumplieron los criterios de diagnóstico convencionales para la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn tras una evaluación clínica, microbiológica, endoscópica, histológica y radiológica completa26; la mayoría tenía una enfermedad luminal inflamatoria activa que afectaba el íleon terminal y/o enfermedad del colon +/- perianal. La fenotipificación de la enfermedad se basó en la endoscopia y las puntuaciones de actividad clínica de la enfermedad. Se utilizó la puntuación endoscópica simplificada de la enfermedad de Crohn para registrar la actividad macroscópica en cada segmento del tracto intestinal en la enfermedad de Crohn27, el sitio de participación en la EC se registró utilizando la Clasificación de EII de París28 y la actividad de la enfermedad clínica de la EC se determinó mediante el índice de actividad de la enfermedad de Crohn pediátrica (IAECP)29. Para la CU, el sitio de la enfermedad se registró utilizando el sistema de Clasificación de París28, la actividad endoscópica se registró utilizando la Evaluación de la Puntuación de la Proctosigmoidoscopia Flexible de de la Clínica Mayo en la colitis ulcerosa y se determinó la actividad clínica de la CU mediante el Índice de Actividad de Colitis Ulcerosa
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Pediátrica (IACUP)30. Las puntuaciones de la actividad clínica se validan para su uso en la EII pediátrica. Todos los controles tenían un colon macroscópicamente y microscópicamente normal, y no tenían un diagnóstico de ningún trastorno intestinal inflamatorio conocido y no tenían una etiología infecciosa bien definida para la inflamación intestinal. Los datos recopilados de todos los participantes incluyeron: datos demográficos (edad, sexo, IMC, país de nacimiento, edad del diagnóstico), exposiciones ambientales (humo del cigarrillo, dieta, exposición previa a antibióticos) y todas las características clínicas. Este estudio se realizó de conformidad con el protocolo aprobado por el Consejo de Ética de Investigación del Childrens Hospital of Eastern Ontario.
Ejemplo 4
Biopsias y recogida de muestra mucosa-luminal:
Se recogieron muestras de la interfase mucosa-luminal del colon derecho en el momento de la endoscopia. La preparación de la colonoscopia se realizó el día antes del procedimiento según el protocolo convencional31. Durante la endoscopia, una vez que se alcanzó la posición correcta, se aspiró líquido y residuos desprendidos. Posteriormente, se enguagó con agua estéril la mucosa y se aspiró la acumulación de agua, moco y células intestinales de la mucosa colónica en un recipiente estéril a través del colonoscopio. Estas muestras se colocaron inmediatamente en hielo en la sala de endoscopia, se transfirieron rápidamente al laboratorio para minimizar el retraso en el procesamiento y a continuación se almacenaron a -80°C. Se recogieron hasta 2 biopsias de la zona macroscópicamente afectada del colon derecho. Las biopsias se congelaron rápidamente en hielo seco en la sala de endoscopia y se almacenaron inmediatamente a -80°C hasta su posterior procesamiento.
Ejemplo 5
Extracción de ADN de la microbiota y secuenciación de amplicones de ADNr 16S:
Se extrajo ADN metagenómico de las muestras de la mucosa luminal utilizando el kit Fast DNA SPIN (MP Biomedicals) y la máquina FastPrep (MP Biomedicals) con dos ciclos de lisis mecánica a una velocidad de 6.0 durante 40 segundos. El ADN extraído se utilizó a continuación para la construcción de las bibliotecas de secuenciación.
En este estudio se utilizaron dos plataformas de secuencia por síntesis: (1) pirosecuenciación (Roche 454 GS-FLX) y (2) Illumina Hiseq 2500. Las muestras para ambas técnicas de secuenciación se amplificaron mediante PCR para dirigirse a la misma región hipervariable V6. Las muestras para la secuenciación mediante Roche 454 se secuenciaron de forma independiente utilizando la química FLX en 12 calles de una placa 454 FLX PicoTiter subdividida de 16 calles (70x75 mm) y utilizando un total de 3 placas. Las bibliotecas de amplicones 454 se construyeron utilizando el par de cebadores V6 conservado 16S-v6_907-F (5'-AAACTCAAAKGAATTGACGG-3') y 16S-V6_1073-R (5'-ACGAGCTGACGACARCCATG-3')32. La región V6 hipervariable del gen de ADNr 16S se amplificó utilizando dos reacciones de PCR sucesivas para reducir el sesgo de PCR como se describió previamente33. La primera PCR utilizó cebadores específicos 16S-V6 y la segunda PCR implicó cebadores de cola fusionada 454. En la primera PCR, se generaron diez amplicones a partir de cada muestra de ADN extraída. Cada reacción de PCR contenía 2 pl de molde de ADN, 17,5 pl de agua de calidad biológica molecular, 2,5 pl de tampón de reacción 10X (Tris-HCl 200 mM, KCl 500 mM, pH 8,4), 0,5 pl de dNTP (10 mM), 1 pl de MgCh 50 mM, 1 pL de cebadores directos e inversos (10 mM cada uno) y 0,5 pL polimerasa Taq Platinum de Invitrogen (5 U/pL) en un volumen total de 25 pL. Las condiciones de PCR se iniciaron con la tapa calentada a 95°C durante 5 minutos, seguido de un total de 15 ciclos de 94°C durante 40 segundos, 48°C durante 1 minuto y 72°C durante 30 segundos, y una extensión final a 72°C durante 5 minutos, y mantenimiento a 4°C. Los amplicones generados a partir de cada muestra se agruparon y se purificaron para eliminar el exceso de cebadores no utilizados utilizando columnas de purificación de PCR MiniElute de Qiagen y se eluyeron en 30 pl de agua de calidad biológica molecular. Los amplicones purificados de la primera PCR se utilizaron como moldes en una segunda PCR con las mismas condiciones de amplificación utilizadas en la primera PCR con la excepción de la utilización de cebadores de colas fusionadas 454 en un régimen de amplificación de 30 ciclos. Se utilizó un termociclador Eppendorf Mastercycler ep gradient S en todas las PCR. Se incluyó una reacción de control negativo (sin molde de ADN) en todos los experimentos. El éxito de la PCR se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa. El amplicón 16S-V6 de cada muestra se cuantificó mediante un fluorómetro y se purificó con esferas magnéticas AMPure. Las bibliotecas de amplicones se secuenciaron en un sistema 454 Genome Sequencer FLX (Roche Diagnostics GmbH) siguiendo el protocolo de secuenciación de amplicones. Los amplicones de cada muestra se secuenciaron bidireccionalmente en 1/16a parte de la ronda de secuenciación completa (placa Picotiter 70 * 75).
Para que las muestras sean secuenciadas mediante Illumina Hiseq 2500, la región hipervariable V6 del gen de ADNr 16S se amplificó utilizando dos reacciones de PCR sucesivas como se describió previamente34. Los cebadores de ADNr 16S-V6 universales para la primera etapa de PCR se modificaron a partir de Sundquist et al32 para incluir los adaptadores de secuenciación de extremos emparejados de Illumina y una secuencia de códigos de barras de 4-6 nucleótidos (Tabla 10 complementaria). Cada reacción de PCR se realizó en un volumen total de 50 pL utilizando 50 ng del ADN extraído, 1X tampón de PCR Phusion HF, 0,5 pM de cada cebador, dNTP 0,2 mM y 1U de ADN polimerasa Phusion High-Fidelity (Thermo Scientific). Las condiciones de PCR incluyeron desnaturalización inicial a 94°C durante 30 s, 10 ciclos de 94°C durante 10 s, 61°C durante 10 s con una caída de 1°C en cada ciclo y 72°C
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durante 15 s, seguidos de ciclos 15 adicionales utilizando una temperatura de reasociación de 51°C durante 45 s, y una extensión final a 72°C durante 2 min. La segunda PCR se llevó a cabo utilizando 10 pL de los primeros productos de PCR en un volumen final de 50 pL utilizando los cebadores PCRFWD1/pCrRVS1 (Tabla 10 Complementaria). Las condiciones de la segunda PCR fueron de 30 segundos a 94°C, 15 ciclos de 10 segundos a 94°C, 10 segundos a 65°C y 15 segundos a 72°C, seguido de una etapa de extensión final a 72°C durante 2 minutos. Los amplicones de cada muestra se visualizaron en un gel de agarosa al 1,5% y se purificaron utilizando el Montage PCR96 Clean up Kit (Millipore). A continuación, se cuantificó la concentración de ADN en cada reacción utilizando el kit de ensayo Qubit® dsDNA BR (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se combinaron 100 ng de amplicones de cada muestra. Finalmente, la biblioteca que consistía en los amplicones agrupados se purificó en gel utilizando el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), se cuantificó y se sometió a la secuenciación Illumina HiSeq 2500 en The Center for Applied Genomics (TCAG, Toronto) generando lecturas de extremos emparejados de 2x 100 bases.
Ejemplo 6
Análisis de la microbiota:
Análisis de datos de pirosecuenciación 454:
Se generaron un total de 346.160 lecturas a partir de pirosecuenciación 454 de la región V6 de ADNr 16S de 26 muestras de colon derecho. Las lecturas generadas se enviaron a NCBI Sequence Read Archive con el número de acceso SRP034632. Las secuencias brutas se procesaron para eliminar las lecturas de baja calidad y cortas utilizando liberación Pipeline mediante Quantitative Insights Into Microbial Ecology 1.4.0 (QIIME 1.4.0)23 de acuerdo con los siguientes parámetros: (1) Longitud mínima de lectura de 100 pb, (2) Coincidencia exacta con los cebadores de secuenciación, (3) Sin nucleótidos ambiguos y (4) La puntuación de calidad promedio mínima de 20. Esto dio como resultado un total de 266.006 lecturas de alta calidad con un promedio de ~10.224 secuencias por muestra y una longitud media de 169,58 bases que incluyen los cebadores. A continuación, las secuencias se agruparon en unidades taxonómicas operativas (UTO) utilizando UCLUST en función del porcentaje medio de identidad de 97%. La lectura más abundante de cada UTO se seleccionó como una secuencia representativa para ese grupo, mientras que las observaciones únicas se descartaron. Se utilizó PyNAST para alinear las secuencias representativas con una longitud mínima de alineamiento de 100 y un porcentaje de identidad mínimo de 75%, seguido de la identificación de UTO quiméricas con el algoritmo Blast Fragments implementado en QIIME. Solo se identificaron como quimeras 6 secuencias representativas y, por lo tanto, se eliminaron del conjunto representativo alineado. Las asignaciones de taxonomía se realizaron con BLAST buscando las secuencias representativas en la base de datos Greengenes (versión 4 Feb, 2011) con un valor e de 1e-8 y una puntuación de confianza de > 0,5. La tabla de UTO resultante se utilizó para determinar la diversidad alfa y beta dentro y entre las muestras utilizando los criterios predeterminados de QIIME. Los taxones significativamente asociados con el estado de la enfermedad (EC, CU y control) o la gravedad de la enfermedad (leve, moderada y grave) se identificaron mediante el algoritmo de tamaño de efecto discriminante lineal (LEFSe) (
http://huttenhower.org/galaxy/)11. Para asignar la taxonomía a nivel de especie, las lecturas representativas de las UTO de interés se obtuvieron de QIIME y se alinearon con las bases de datos NCBI y RDB35,36.
Análisis de datos de secuenciación Illumina:
Las secuencias de extremo emparejado obtenidas mediante Illumina HiSeq 2500 (2 x 101 nucleótidos) se combinaron en lecturas más largas (con una longitud promedio por secuencia de 165 nucleótidos) utilizando el soporte lógico Fast Length Adjustment of Short Reads (FLASh) evitando cualquier emparejamiento erróneo en la región de solapamiento que oscile entre 20 y 80 nucleótidos37. Más de 95% de las lecturas se fusionaron con éxito, mientras que las secuencias que no se fusionaron se descartaron. Las lecturas combinadas se filtraron por calidad a continuación con una puntuación de calidad mínima de 20 utilizando el comando fastq_quality_filter del kit de herramientas Fastx (
http://hannonlab.cshl.edu/). Las lecturas de alta calidad se clasificaron de acuerdo con las secuencias de códigos de barras directas e inversas con recorte de códigos de barras utilizando el soporte lógico NovoBarCode (Novocraft.com). Las secuencias con cebadores emparejados erróneamente se excluyeron. Las lecturas ordenadas se enviaron a NCBI Sequence Read Archive con el número de acceso SRP034595. A continuación, las lecturas se introdujeron en Pipeline QIIME 1.5.023 y se agruparon en UTO utilizando un flujo de trabajo de selección de UTO de referencia cerrada con UCLUST contra el conjunto de referencia Greengenes (versión 4 Feb, 2011) basándose en un porcentaje de identidad promedio de 97%. A las UTO se les asignó la taxonomía asociada con la secuencia de referencia de Greengenes correspondiente. Las observaciones únicas y dobles se eliminaron y se generó una tabla de recuentos de UTO por muestra. A continuación, la tabla de UTO se sometió a submuestreo aleatorio a un número total de lecturas por muestra de 500.000. La tabla de UTO enrarecida resultante se utilizó para analizar la estructura y diversidad de la microbiota utilizando las herramientas de ecología microbiana disponibles en el paquete QIIME y para todos los demás análisis aguas abajo. Para la identificación de la microbiota núcleo, las UTO detectadas en al menos 75% de las muestras dentro de un grupo clínico (pacientes con EC, pacientes con CU o sujetos de control) se consideraron miembros de la microbiota núcleo para ese grupo en particular.
Análisis estadístico multivariante:
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Se utilizaron varios enfoques estadísticos para identificar taxones significativamente asociados con el estado y la gravedad de la enfermedad. Se realizó una prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de Dunn post hoc para comparar la abundancia relativa de los taxones en función del estado de enfermedad (EC vs. CU vs. control) y la gravedad de la enfermedad (leve vs. moderada vs grave). Se empleó una corrección de Bonferroni para explicar múltiples hipótesis considerando significativo P<0,05. Las abundancias relativas de los taxones identificados también se analizaron mediante análisis de componentes principales (PCA) y análisis discriminante parcial de mínimos cuadrados (PLS-DA). Para el cálculo de PLS-DA, los datos se transformaron logarítmicamente y se escalaron a la varianza de la unidad como describen Durbin. et al38 Los modelos de PLS-DA fueron validados por validación cruzada y pruebas de permutación. La importancia variable en el valor de proyección (VIP) se utilizó para identificar las características que contribuyen más a la agrupación (los taxones con VIP>1,0 se consideraron influyentes y con VIP>1,5 altamente influyentes). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de soporte lógico XLSTAT y/o R.
Ejemplo 7
Cuantificación mediante qPCR de Atopobium parvulum:
La abundancia relativa de A. parvulum se determinó mediante la realización de PCR cuantitativa absoluta en el ADN metagenómico extraído utilizando el analizador de ADN Applied Biosistems 7300 y cebadores de ARNr 16S específicos de A. parvulum desarrollados para el presente estudio; Aparv-711F 5'-
GGGGAGTATTTCTTCCGTGCCG-3' (SEQ ID NO. 1) y Aparv-881R 5'-CTTCACCTAAATGTCAA GCCCTGG-3' (SEQ ID NO. 2). Cada muestra se sometió a ensayo por duplicado en un volumen total de 25 pL por reacción. Se añadieron 100 ng de ADN molde a una mezcla de reacción que contenía 1 pM de cada cebador, y 1x mezcla maestra QuantiFast SYBR Green PCR (Qiagen). Las condiciones de amplificación fueron de 5 min a 95°C seguido de 40 ciclos de 95°C durante 10 segundos y 66°C durante 1 min con la recopilación de datos en la segunda etapa de cada ciclo. Para la normalización entre muestras, el ARNr 16S total de cada muestra se cuantificó simultáneamente utilizando los cebadores universales; 331F 5'-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3' y 797R 5'-
GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3'39. Los patrones positivos para la cuantificación de ARNr 16S de A. parvulum y total se prepararon mediante la realización de PCR en el ADN extraído de la cepa ATCC 33793 de A. parvulum y una muestra de producto aspirado de mucosa de un sujeto sano, respectivamente. Los amplicones se purificaron utilizando PureLink™ PCR Purification Kit (Invitrogen) y se cuantificaron mediante el kit de ensayo Qubit® dsDNA BR (Invitrogen). Después, se prepararon 106, 107, 108 y 109 copias de cada fragmento de gen, suponiendo que el peso molecular promedio del par de bases es 660, y los valores Ct se determinaron para cada concentración mediante qPCR siguiendo las mismas condiciones descritas anteriormente. Se establecieron las curvas patrón de los números de copias del gen de ARNr 16S tanto de A. parvulum como total contra los valores de Ct y se calculó la abundancia relativa de A. parvulum en cada muestra como ARNr 16S de A. parvulum dividido por el número de copias de ARNr 16S total. Para validar la especificidad de Apar-711F y Aparv-881R, se clonaron amplicones de PCR nuevos del ADN total extraído de dos productos aspirados de mucosa diferentes utilizando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y a continuación, el plásmido que contenía el fragmento del gen de ARNr 16S se extrajo de 6 clones diferentes mediante el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) utilizando su protocolo normalizado seguido de la secuenciación de Sanger utilizando los cebadores M13F y M13R.
Ejemplo 8
Mareaje isotópico estable por aminoácidos en cultivo celular (SILAC):
Se cultivaron individualmente células HuH7 hepáticas humanas (HuH-7), células 293 de riñón embrionario humano (HEK-293) y células 116 de cáncer colorrectal humano (HCT-116) a 37°C en una incubadora humidificada con CO2 al 5%. El medio SILAC se preparó de la siguiente manera: se preparó DMEM que carecía de lisina, arginina y metionina por encargo por AthenaES (Baltimore, MD, EE.UU.) y se le añadió un suplemento con 30 mg/L de metionina (Sigma Aldrich, Oakville, ON, CAN), FBS dializado al 10% (v/v) (GIBCO-Invitrogen; Burlington ON, CAN), piruvato sódico 1 mM (Gibco-Invitrogen), 28 pg/ml de gentamicina (Gibco-Invitrogen), y [13C6,15N2]-L-lisina, [13C6,15N4]-L-arginina (forma pesada de aminoácidos; Medios pesados) de Sigma Aldrich (Oakville, ON, CAN) a concentraciones finales de 42 mg/L y 146 mg/L para arginina y lisina, respectivamente. Para HCT-116, la concentración de arginina se aumentó a 84 mg/L. Las células se cultivaron durante al menos 10 duplicaciones en medio SILAC para permitir la incorporación completa de los aminoácidos marcados isotópicamente a las células.
Ejemplo 9
Determinación de la tasa de incorporación de aminoácidos SILAC a células HuH-7, HEK-293 y HCT-116:
Las células se cultivaron a 80% de confluencia en medio SILAC (se sembraron en placa 5 x 106 células en plecas de 10 cm). A continuación, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo y se lisaron mediante la adición de 1 ml de tampón RIPA 1X (Tris 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, NP-40 al 1% (v/v), desoxicolato al 0,5% (p/v), SDS al 0,1% (p/v) con cóctel inhibidor de proteasa (Complete Mini Roche; Mississauga, ON, CAN) e inhibidor de fosfatasa (comprimido PhosStop Roche). Los productos lisados se transfirieron a continuación a tubos cónicos de 15 ml y las proteínas se precipitaron mediante la adición de 5 ml de
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acetona enfriada con hielo seguido de incubación a -20°C durante la noche. Las proteínas se recogieron mediante centrifugación (3000xg, 10 min, 4°C), se lavaron con acetona enfriada con hielo dos veces, y los sedimentos de proteína se resolubilizaron en 300 pL de una solución NH4HCO3 50 mM que contenía urea 8 M. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el método de unión a colorante Bradford utilizando el kit de ensayo de proteína Bio-Rad (Mississauga, ON, CAN). Para la digestión general en solución, se reconstituyeron 200 pg de productos lisados de proteína en NH4HCO3 50 mM (200 pL) y las proteínas se redujeron mezclando con 5 pL de DTT 400 mM a 56°C durante 15 min. Las proteínas se sometieron después a alquilación mezclando con 20 pL de yodoacetamida 400 mM en la oscuridad (15 min a temperatura ambiente) seguido de la adición de 800 pL de NH4HCO3 50 mM para reducir la concentración de urea a ~ 0,8 M. A continuación, las proteínas se digirieron con solución de TPCK-tripsina (razón final de 1:20 (p/p, tripsina:proteína) a 37°C durante 18 h. Finalmente, los péptidos digeridos fueron desalados utilizando Cartuchos C-isSep-Pack (Waters), secados en un Speed-vac, y reconstituidos en ácido fórmico al 0,5% antes del análisis de espectrometría de masas (como se describe a continuación) y la determinación de la eficacia de marcaje. La eficacia de incorporación se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: (1-1/Razón (H/L)); donde H y L representan la intensidad de péptidos pesados y ligeros detectados por espectrometría de masas, respectivamente. El marcaje se consideró completo cuando los valores alcanzaron al menos 95% para cada tipo de célula.
Ejemplo 10
Análisis proteómico de biopsias utilizando espectrometría de masas cuantitativa basada en super-SILAC:
Las biopsias se lisaron en SDS (dodecilsulfato de sodio) al 4%, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) con un suplemento de cóctel de inhibidor de proteinasa (Roche) y se homogeneizaron con una mano de mortero Pellet. Los productos lisados se sometieron a sonicación 3 veces con pulsos de 10 s cada uno con al menos 30 s en hielo entre cada pulso. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el análisis de proteína Bio-Rad DC. Las proteínas se procesaron utilizando el Método de Preparación de Muestra Asistida por Filtro (FASP) como se describió previamente con algunas modificaciones40. Los productos lisados de tejido de colon (45 pg de proteínas) y los productos lisados celulares pesados marcados con SILAC (15 pg cada uno de células HuH-7, HEK-293 y HCT-116) se mezclaron a una razón en peso de 1:1 y se transfirieron al filtro.
Las muestras se centrifugaron (16.000xg, 10 min), seguido de dos lavados de 200 pL de urea 8 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. Después, las muestras se redujeron mediante incubación en 200 pL de urea 8 M, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) con un suplemento de ditiotreitol 20 mM. Después de la centrifugación, las muestras se sometieron a alquilación añadiendo 200 pl de urea 8 M, Tris-HCl 50 mM pH 8,0, que contenía yodoacetamida 20 mM (30 min a temperatura ambiente protegida de la luz). Las muestras se lavaron utilizando 200 pl de urea 8 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 (dos veces) para eliminar el exceso de SDS. Para diluir adicionalmente la urea, se realizaron dos lavados de 200 pl de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. Para la digestión con tripsina, las muestras se incubaron en 200 pl de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía 5 pg de tripsina (tratada con TPCK, Worthington) en un aparato de agitación oscilante (250 rpm) a 37°C durante la noche. Finalmente, se añadieron 200 pL de Tris-HCl 50 mM pH 8,0 para eluir los péptidos mediante centrifugación (dos veces). Los péptidos se fraccionaron, utilizando una columna SCX construida en la empresa con cinco fracciones de pH (pH 4,0, 6,0, 8,0, 10,0, 12,0). La composición del tampón era ácido bórico 20 mM, ácido fosfórico 20 mM y ácido acético 20 mM, con el pH ajustado utilizando NaOH 1M). Finalmente, las muestras fraccionadas se desalaron utilizando cartuchos de desalinización C18 de la empresa y se secaron en un Speed-vac antes del análisis LC-MS.
Análisis de espectrometría de masas:
Todas las mezclas de péptidos resultantes se analizaron por cromatografía líquida de alto rendimiento/espectrometría de masas en tándem de ionización por electropulverización (HPLC-ESI-MS/MS). La HPLC-ESI-MS/MS consistió en un sistema Ekspert™ nanoLC 400 automático (Eksigent, Dublin, CA, EE.UU.) acoplado a un espectrómetro de masas LTQ Velos Pro Orbitrap Elite (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA) equipado con una interfase de nanoelectropulverización manejada en modo de iones positivos. Brevemente, cada mezcla de péptidos se reconstituyó en 20 pL de ácido fórmico al 0,5% (v/v) y se cargaron 12 pL en una precolumna de sílice fundida porosa de 200 pm x 50 mm cargada en la empresa con resinas Magic C-isAQ de fase inversa (5 pm, tamaño de poro de 200 A, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Alemania). La separación de los péptidos se realizó en una columna analítica (75 pm ^ 10 cm) cargada con esferas de fase inversa (3 pm, tamaño de poro de 120 A, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Alemania) utilizando un gradiente de 120 min de acetonitrilo al 5-30% (v/v) que contenía ácido fórmico al 0,1% (v/v) (JT Baker, Phillipsburg NJ, EE. UU.) a un caudal de eluyente de 300 nL/min. El voltaje de pulverización se ajustó a 2,2 kV y la temperatura del capilar calentado fue de 300°C. El método del aparato consistió en un barrido de Ms completo de 400 a 2000 m/z seguido de barrido de MS/MS dependiente de los datos de los 20 iones más intensos, un recuento de repetición de exclusión dinámica de 2 y una duración de repetición de 90 s. La masa completa se barrió en un analizador Orbitrap con R = 60.000 (definido en m/z 400), y los análisis subsiguientes de MS/MS se realizaron en un analizador LTQ. Para mejorar la precisión de la masa, todas las mediciones en el analizador de masas Orbitrap se realizaron con una recalibración interna sobre la marcha ("Lock Mass"). La función de rechazo de estado de carga se habilitó con estados de carga "no asignados" y estados de carga "únicos" rechazados. Todos los datos se registraron con el soporte lógico Xcalibur (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA).
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Búsqueda de bases de datos y análisis bioinformático:
Todos los archivos sin procesar fueron procesados y analizados por MaxQuant, Versión 1.2.2.5 contra la base de datos Uniprot humana señuelo (86.749 entradas), incluyendo los contaminantes comúnmente observados. Se utilizaron los siguientes parámetros: se seleccionó carbamidometilación de cisteína como una modificación fija, con oxidación de metionina, acetilación N-terminal de proteína y conjunto de prolina pesada como modificaciones variables. La especificidad de la enzima se estableció en tripsina. Se permitieron hasta dos escisiones erróneas de tripsina. El doble marcaje SILAC (ligero: K0R0; pesado: K8R10) se estableció como parámetro de búsqueda para evaluar la eficiencia de conversión. Las tolerancias de masa de iones precursores fueron de 7 ppm y la tolerancia de la masa de iones de fragmentos fue de 0,5 Da para los espectros MS/MS. La tasa de falso descubrimiento (FDR) para péptidos y proteínas se estableció en 1% y se utilizó una longitud mínima de seis aminoácidos para la identificación de péptidos. El archivo de péptidos se importó a Persus (versión 1.2.0.17) para extraer los péptidos que contenían lisina y arginina, respectivamente.
El archivo de grupos de proteínas se importó a Persus (versión 1.3.0.4) para el análisis estadístico de datos y se eligió una prueba ANOVA para el perfil de proteínas considerando significativos valores de p inferiores a 0,05. El análisis de la ruta de la Kyoto Enciclopedia of Genes and Genomes (KEGG) se logró utilizando DAVID Bioinformatics Resources (
http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Los análisis estadísticos DAVID se realizaron contra el genoma completo. La proteómica tiene una tendencia a sobremuestrear proteínas del citosol y el núcleo, mientras que submuestrea las proteínas asociadas a la membrana. Por lo tanto, los resultados de DAVID se volvieron a analizar contra el conjunto de proteínas que no cambiaban en conjunto de datos de los autores de la presente invención con el fin de eliminar cualquier sesgo de enriquecimiento de la ruta/GO.
Ejemplo 11
Extracción de ARN total y cuantificación de qRT-PCR de la expresión de genes mitocondriales:
La integridad del ARN se conservó añadiendo los productos aspirados de la mucosa a un volumen igual de RNAlater (Ambion) antes de congelar a -80°C. La alícuota congelada (2 ml) se descongeló en hielo y el ARN total se extrajo siguiendo un protocolo de fenol caliente como se describió previamente41. Brevemente, se sedimentaron 4 ml de cada muestra en RNAlater por centrifugación a 13.000xg durante 5 min a 4°C. Los sedimentos se lavaron una vez en tampón RNAlater/PBS al 50% y se resuspendieron con lisis en 2 ml de tampón desnaturalizante (tiocianato de guanidio 4 M, citrato de sodio 25 mM, N-laurilsarcosina al 0,5%, N-acetil cisteína al 1%, 2-mercaptoetanol 0,1 M). El producto lisado se dividió en alícuotas de 500 pL, a las cuales se añadieron 4 pL de acetato de sodio 1 M (pH 5,2). Cada alícuota se incubó a continuación con 500 pl de fenol saturado con tampón (pH 4,3) a 64°C durante 10 minutos, con mezcla intermitente. Se añadió 1 ml de cloroformo a la solución y se incubó durante 15 minutos en hielo, seguido de centrifugación a 18.000xg durante 30 minutos a 4°C. Posteriormente, se precipitó el ARN de la capa acuosa mediante la adición de 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M, EDTA tratado con DEPC 500 mM y 2 volúmenes de etanol frío seguido de incubación durante la noche a -80°C. El ARN se sedimentó a continuación mediante centrifugación a 4°C, se lavó con etanol frío al 80% y se resuspendió en 100 pL de ddH2O libre de ARNasa. El ARN extraído se trató dos veces con ADNasa I (Epicenter) seguido de amplificación por PCR utilizando los cebadores universales de ARNr 16S; Bact-8F y 1391-R; para confirmar la ausencia de ADN genómico. La calidad y la cantidad del ARN extraído se determinaron mediante el espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Termoscientific) y se confirmaron mediante el sistema de Experion StdSens rNa de BioRad de acuerdo con la descripción del fabricante y se almacenó a -80°C hasta su uso.
La cuantificación del nivel de expresión de los genes de TST (Tiosulfato Sulfotransferasa), SQRDL (de tipo Sulfuro Quinona Reductasa) y COX4-1 (isoforma 1 de la subunidad IV de Citocromo C oxidasa) con respecto a GAPDH (Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa) se determinó mediante el Analizador de ADN Applied Biosistems 7300 y el kit de RT-PCR Quantitect SYBR Green (Qiagen). Los cebadores utilizados fueron diseñados por la herramienta NCBI Primer-BLAST42 o extraídos de una fuente bibliográfica como se detalla en la Tabla 11 Complementaria. Cada reacción contenía 100 ng de molde de ARN, 0,5 pM de cada cebador, 1x mezcla maestra Quantitect SYBR Green RT-PCR y 0,25 pL de mezcla Quantitect RT en un volumen final de 25 pL. Las condiciones de RT-PCR de una etapa fueron de 50°C durante 30 min, 95°C durante 15 min, seguidas de 40 ciclos de 15 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C y 30 segundos a 72°C con la recopilación de datos en la tercera etapa de cada ciclo. La especificidad de la amplificación se verificó por el perfil de fusión del amplicón y la electroforesis en gel de agarosa al 2%. Los valores de Ct se extrajeron a continuación utilizando el soporte lógico de detección de secuencias Applied Biosistems 7300 versiones 1.3.1. Los valores de Ct de TST, SQRDL o COX4-1 se normalizaron a los valores de Ct de GAPDH generando ACt. A continuación, se calculó AACt restando ACt promedio del grupo de control de ACt de cada muestra La cuantificación relativa se calculó a continuación mediante 2-AACt Como se mencionó previamente34.
Ejemplo 12
Experimentos con ratones M10"í" y procesamiento de tejidos:
Los ratones SvEv129/C57BL6 N10'/';NF-kBegfp (8-12 semanas de edad, n = 12) libres de gérmenes se transfirieron a condiciones libres de patógenos específicos (SPF) y a los ratones de una cohorte (n = 6) se les introdujo mediante
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Para investigar la participación de la biota compleja y el H2S en el desarrollo de la colitis, los autores de la presente invención realizaron dos experimentos posteriores utilizando ratones 129/SvEv M-10-/". En el primer entorno experimental, los ratones M10-/" gnotobiotic (n = 37) se aleatorizaron en 4 grupos; 1: GF solo (n = 6), 2: GF + subsalicilato de bismuto (III) (n = 10); 3: A. parvulum (1x108 UFC) (n = 10) y 4: A. parvulum + subsalicilato de bismuto (III) (n = 11). Los ratones se sacrificaron después de 6 semanas de monoasociación. El subsalicilato de bismuto (III) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) se incorporó al alimento (Dieta para Roedores con 18% de Proteína Teklan Global) a una concentración de 7 g/kg (Harlan Laboratories, Madison, WI) y a continuación se irradió para los experimentos gnotobióticos. Los ratones se alimentaron con esta dieta comenzando 1 semana antes de la colonización con A. parvulum. En el segundo entorno experimental, los ratones M10_/" gnotobióticos (n = 31) se transfirieron a condiciones SPF y se aleatorizaron en 4 grupos; 1: SPF solo (n = 7), 2: SPF + subsalicilato de bismuto (III) (n = 8); 3: SPF más A. parvulum (1x108 UFC) (n = 8) y 4: A. parvulum + subsalicilato de bismuto (III) (n = 8). Los ratones se sacrificaron después de 6 semanas de infección semanal con A. parvulum. Se incorporó subsalicilato de bismuto (III) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) al alimento (Dieta para Roedores con 18% de Proteína Teklan Global) a una concentración de 7 g/kg (Harlan Laboratories, Madison, WI). Los ratones se alimentaron con esta dieta comenzando 1 semana antes de la colonización con A. parvulum.
Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Se tomaron muestras de tejido del colon para el ARN y la histología como se describió previamente24. Las imágenes histológicas se adquirieron utilizando una cámara DP71 y DP Controller 3.1.1.276 (Olympus), y la inflamación intestinal se puntuó como se describió previamente12. El tejido se dividió en 4 cuartos, se asignó una puntuación a cada cuarto por separado y a continuación se añadió para generar una puntuación final de inflamación en una escala de 0 -16.
Ejemplo 13
Endoscopia de ratón:
La colonoscopia se realizó utilizando un "Sistema Coloview" (Karl Storz Veterinary Endoscopy) como se describió anteriormente25. Los ratones se anestesiaron utilizando isoflurano de 1,5% a 2% y se visualizaron aproximadamente 4 cm del colon desde el borde anal desde la flexura esplénica. Los procedimientos fueron grabados digitalmente en un PC AIDA Compaq.
Ejemplo 14
RT-PCR en tiempo real en muestras intestinales de ratón:
El ARN total de los tejidos intestinales se extrajo utilizando TRIzol (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. El ADNc se transcribió de forma inversa utilizando M-MLV (Invitrogen) y los niveles de expresión de ARNm se midieron utilizando la mezcla SYBR Green PCR Master (Applied Biosistems) en un sistema de PCR rápida en tiempo real ABI 7900HT y se normalizaron a ¡5-actina. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: [3-actina (5'- TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3' y 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'), cxcll (5'- GCTGGGATTCACCTCAAGAA-3' y 5'-TCTCCGTTACTTGGGGACAC-3'), tnf (5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3' y 5'-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3'), il12p40 (5'-GGAAGCACGGCAGCAGCAGAATA-3' y 5'- AACTTGAGGGAGAAGTAGGAATGG-3'), il-1p_ (5'-GCCCATCCTCTGTGACTCAT -3' y 5'-
AGGCCACAGGTATTTTGTCG-3'), il-17a (5'-TCCAGAAGGCCCTCAGACTA-3' y 5'-ACACCCACCAGCATCTTCTC- 3'). Las reacciones de PCR se realizaron durante 40 ciclos de acuerdo con la recomendación del fabricante, y los cambios de ARN se calcularon utilizando el método AACt.
Análisis estadísticos de los resultados de los ratones M10-/":
A menos que se indique específicamente, los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 5.0a (GraphPad, La Jolla, CA). Las comparaciones de los estudios con ratones se hicieron con un análisis de varianza no paramétrico, y a continuación una prueba U de Mann-Whitney. Todos los gráficos representan la media ± ETM. Los experimentos se consideraron estadísticamente significativos si p < 0,05.
Ejemplo 15
Recogida de muestras. Se recogieron productos aspirados de mucosa (lavados) del colon derecho de 40 niños de control, 41 pacientes con enfermedad de Crohn (EC) y 20 con colitis ulcerosa (CU) con edades comprendidas entre 3 y 18 años en el momento del diagnóstico inicial, en el Children Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Ottawa, Canadá, utilizando un protocolo estandarizado28 El colon derecho fue seleccionado en particular porque se cree que es el sitio más activo para la síntesis de butirato29,30. Además, se recogieron muestras recientes de heces de un subgrupo de pacientes (5 controles y 10 con EC) al menos 24 horas antes del procedimiento de endoscopia (Tabla S1 para la información de los pacientes participantes). Inmediatamente después de la recogida, las muestras se transportaron en hielo al laboratorio donde se procesaron para la extracción de ADN o se almacenaron a -80°C
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hasta su uso posterior.
Extracción de ADN metagenómico. Se centrifugaron Alícuotas de 5 ml de los lavados de la mucosa a 20.000 x g durante 10 minutos a 4°C. A continuación, se extrajo el ADN de los sedimentos (o muestras de heces) utilizando el FastDNA® Spin Kit (MP Biomedicals) utilizando dos ciclos de lisis mecánica en un FastPrep® Instrument (MP Biomedicals) ajustado a una velocidad de 6,0 durante 40 segundos. El ADN extraído se almacenó a -20°C hasta su uso posterior.
Caracterización de la diversidad de bacterias productoras de butirato en niños sanos y con EII
Cuantificación relativa del gen BCoAT del ADN metagenómico de lavados de la mucosa utilizando qPCR. La
abundancia global de bacterias productoras de butirato se determinó cuantificando la cantidad de gen BCoAT utilizando los cebadores BCoATscrF/BCoATscrR como se describe en otra parte27. Se utilizaron 50 ng de ADN metagenómico de cada muestra en una reacción qPCR de 25 pl que contenía 1X QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN) y 0,5 pM de cebadores BCoATscrF/BCoATscrR. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 1 ciclo de 95°C durante 15 minutos; 40 ciclos de 94°C durante 15 segundos, 53°C y 72°C cada uno durante 30 segundos con adquisición de datos a 72°C. Para el análisis de la curva de fusión, se realizó un aumento escalonado de la temperatura de 55°C a 95°C. Los patrones de cuantificación se prepararon purificando y cuantificando el fragmento del gen BCoAT de sujetos sanos utilizando el kit de purificación PCR PureLink™ (Invitrogen) y el kit de ensayo Qubit® dsDNA BR (Invitrogen), respectivamente. A continuación, se prepararon 106, 107y 108 copias de genes suponiendo un peso molecular medio de 660 por nucleótido. Simultáneamente, se cuantificó el número de copias del gen de ARNr 16S en paralelo al gen BCoAT como se describió anteriormente 31, y los resultados se expresaron como el número de copias de los genes BCoAT por el gen de ARNr 16S.
Preparación del gen BCoAT y bibliotecas de ARNr 16S a partir del ADN metagenómico de lavados de la mucosa para la secuenciación profunda. La construcción de la biblioteca BCoAT se llevó a cabo utilizando una estrategia de PCR de dos etapas. En la 1a etapa, se utilizaron 50 ng de ADN metagenómico en una reacción de PCR de 50 pl que contenía MgCh 1,5 mM, 0,5 pM de cebadores BCoATscrF/BCoATscrR, dNTP 0,2 mM y ADN polimerasa HotStarTaq 2,5U (QIAGEN). La amplificación comenzó con una etapa de activación enzimática inicial a 95°C durante 15 minutos. A continuación, se llevó a cabo la amplificación utilizando 25 ciclos a 94°C, 53°C y 72°C (cada uno durante 30 segundos), y una extensión final de 10 min a 72°C. Para la segunda PCR, se diseñaron 13 cebadores de fusión (12 hacia directos y uno inverso, SEQ ID 3-15) siguiendo las pautas de diseño de cebadores Amplicon Fusion de Roche para la química de lib-L de la serie GS FLX Titanium. Brevemente, los cebadores directos contenían (de 5'-3') el cebador GS FLX Titanium A, una clave de biblioteca de cuatro bases, 12 Identificadores Múltiplex Diferentes (MID) y una secuencia de cebador BCoATscrF. El cebador inverso contenía (de 5'-3') el cebador GS FLX Titanium B, una clave de biblioteca de cuatro bases y una secuencia de cebador BCoATscrR (Tabla 9). Se utilizaron 10 pL de producto de la 1a PCR en 50 pl para la segunda reacción de PCR utilizando un único cebador de fusión MID para cada 12 muestras y la misma concentración de componente de PCR que en la 1a PCR. Se realizaron un total de 15 ciclos de amplificación utilizando las mismas condiciones de amplificación que la primera PCR. Para cada muestra, se prepararon un total de 5 tubos de reacción. Después de la amplificación, los productos de PCR de la misma muestra se combinaron, se inspeccionaron en gel de agarosa al 1,5% y se purificaron utilizando Montage PCR96 Cleanup Kit (Millipore). Finalmente, cantidades equimolares de muestras con MID únicos (un total de 4 bibliotecas) se combinaron y se secuenciaron en una plataforma Roche 454 utilizando una placa completa de química de GS FLX Titanium (cada biblioteca en % placa) en The McGill University and Genome Quebec Innovation Center, Montreal, QC, Canadá. Se construyó una biblioteca de ARNr 16S. La biblioteca 16S ARNr se secuenció en el Center of Applied Genomics (TCAG) en el Hospital for Sick Children en Toronto (Canadá) utilizando una plataforma HiSeq 2500 para generar lecturas de extremos emparejados de 2x100 bases.
Tabla 9
Nombre del Cebador Secuencia del Cebador
1a PCR
BCoATs crF 5'-GCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGGCAYATG-3'
BCoATs crR 5'-CCTGCCTTTGCAATRTCIACRAANGC-3'
2' PCR
BCoAT- F-1 5’- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACGAGTGCGTGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3' (SEQ ID NO. 3)
Nombre del Cebador Secuencia del Cebador
BCoAT- F-2 5’- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACGCTCGACAGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3’(SEQ ID NO. 4)
BCoAT- F-3 5’- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGACGCACTCGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3’(SEQ ID NO. 5)
BCoAT- F-4 5’- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGCACTGTAGGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3’(SEQ ID NO. 6)
BCoAT- F-5 5’- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCAGACACGGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3’(SEQ ID NO. 7)
BCoAT- F-6 5'- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATATCGCGAGGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3’(SEQ ID NO. 8)
BCoAT- F-7 5'- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGTGTCTCTAGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3'(SEQ ID NO. 9)
BCoAT- F-8 5- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTCGCGTGTCGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3’(SEQ ID NO. 10)
BCoAT- F-10 5'- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTCTATGCGGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3'(SEQ ID NO. 11)
BCoAT- F-11 5'- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGATACGTCTGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3'(SEQ ID NO. 12)
BCoAT- F-13 5'- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCATAGTAGTGGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3’(SEQ ID NO. 13)
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Nombre del Cebador Secuencia del Cebador
BCoAT- F-14 5’- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGAGAGATACGCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGG CAYATG-3’(SEQ ID NO. 14)
BCoAT-R 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCCTGCCTTTGCAATRTCIACRAANGC-3'(SEQ ID NO. 15)
Análisis de datos. Para la secuenciación de BCoAT, las lecturas desmultiplexadas de cada muestra se filtraron utilizando Pyrosequencing Pipeline de RDP32 basándose en una puntuación de calidad mínima de corte de longitud de la lectura de 20 y 200 nucleótidos. Las unidades taxonómicas operativas (UTO) agrupadas al 95% de similitud de secuencia se lograron utilizando un algoritmo de UCLUST de novo integrado en el paquete de soporte lógico V 1.7.0 de Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)33 después de lo cual, se eliminaron las UTO de observación única. También se utilizó QIIME para calcular la diversidad alfa y beta entre muestras utilizando un número fijo de lecturas/muestra de 4.600. La secuencia más larga de cada UTO se seleccionó a continuación y se utilizó para la asignación taxonómica como se describió anteriormente23. Las secuencias con identidad <75% con la base de datos de referencia de genes funcionales se consideraron UTO no clasificadas. Finalmente, se calculó la abundancia relativa (AR) de las especies asignadas y se analizaron las diferencias de AR de las bacterias productoras de butirato.
Las secuencias del extremo emparejado de ARNr 16S se fusionaron utilizando el soporte lógico Fast Length Adjustment of SHort reads (FLASH)34 Durante esta etapa, la mayoría de las lecturas se solaparon perfectamente en aproximadamente 10-80 nucleótidos, y menos del 5% de las lecturas no se combinaron. Las lecturas no combinadas se descartaron de un análisis adicional. Con posterioridad, se utilizó el comando Novobarcode de Novocraft Technologies para demultiplexar las lecturas fusionadas de acuerdo con las secuencias de códigos de barras 5' y 3' y recortar la secuencia del código de barras de la lectura correspondiente. Las lecturas con una puntuación mínima de calidad de 20 se seleccionaron para un análisis posterior utilizando la línea de comando fastq_quality_filter del Fastx-toolkit V 0.0.13. La asignación de taxonomía a nivel de género se realizó utilizando el alineamiento de QIIME V 1.5.0 con la base de datos Greengenes (versión 4feb2011) utilizando el método de selección de UTO basado en UCLUST Reference al 97% de identidad de secuencia. Los productores de butirato se seleccionaron de la micobiota general utilizando la lista de bacterias que producen butirato a través de la vía BCoAT encontrada en la referencia23. Dado que cada bacteria tiene un número de copia diferente del gen de ARNr 16S y solo una copia del gen BCoAT, el número de copias del ARNr 16S se normalizó a 1 dividiendo el número de lecturas de un género dado por su número de copias del ARNr 16S promedio obtenido de rrnDB35. A continuación se calculó la AR de los géneros de productores de butirato identificados. Finalmente, se analizó la correlación entre los conjuntos de datos de BCoAT y ARNr 16S.
Para el análisis filogenético, se obtuvieron secuencias de nucleótidos completas de los genes BCoAT para las especies productoras de butirato asignadas a partir de la Base de Datos de Secuencias de Referencia del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y MUSCLE alineados con las secuencias de UTO no clasificadas. A continuación, se construyó un árbol filogenético de secuencias alineadas utilizando un algoritmo de máxima verosimilitud con la herramienta FastTree integrada en QIIME. La presentación visual del árbol enraizado se logró utilizando la herramienta Interactive Tree Of Life (iTOL)36. Utilizando la misma estrategia, se construyó otro árbol filogenético a partir de secuencias de UTO no clasificadas alineadas con MUSCLE y secuencias de bases de datos de nucleótidos but (un conjunto de datos de todas las secuencias genéticas BCoAT pronosticadas (4.041 secuencias) obtenidas del Functional Gene Pipeline Repository26.
Confirmación de los resultados de la secuencia de BCoAT utilizando qPCR. Se utilizaron 35 muestras de producto aspirado de mucosa de control, 37 EC y 19 CU para validar el resultado de la secuenciación mediante qPCR. Se utilizaron los cebadores específicos del gen BCoAT de E. rectale y F. prausnitzii en la qPCR. Además, se utilizaron los cebadores dirigidos al gen de ARNr 16S la grupo (XIVa) de Eubacterium rectale/Clostridium coccoides (20-21), F. prausnitzii 22-23, y Roseburia 24-25. Para las muestras de heces, se utilizaron 5 sujetos de control y 10 con EC para determinar la cantidad relativa de F. prausnitzii utilizando cebadores específicos de ARNr 16S solamente (tabla 10). El gen de ARNr 16S completo se amplificó utilizando el cebador universal UniF/UniR (18-19) adaptado de la referencia37. Se utilizaron 50 ng de ADN metagenómico en una reacción de PCR de 25 jl utilizando QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN) como se describió en la sección anterior utilizando una
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Tabla 10
Diana
Nombre del Cebador Secuencia del Cebador Referencia
UniF 5'-GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA-3'
gen de ARNr 16S de todas las bacterias
UniR 5'-ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC-3' ISME J 2011; 5:220-230
Gen de ARNr 16S del grupo Eubacterium rectale/ Clostridium coccoides
UniF338 C.cocR491 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3' 5'-GCTTCTTAGTCAGGTACCGTCAT-3' Infect. Immun. 2008
Gen de ARNr 16S de Faecalibacterium
Fprau 07 5'-CCATGAATTGCCTTCAAAACTGTT-3' FEMS Microbiol. Ecol.
prausnitzii
Fprau 02 5'-GAGCCTCAGCGTCAGTTGGT-3' 2012; 79:685-696
Gen de ARNr 16S Roseburia spp.
Ros-F1 5'-GCGGTRCGGCAAGTCTGA-3' FEMS Microbiol. Ecol.
Ros-R1 5'-CCTCCGACACTCTAGTMCGAC-3' 2012; 79:685-6964
Gen BCoAT de todas las bacterias
BCoATscrF BCoATscrR 5'-GCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGGCAYATG-3' 5'-CCTGCCTTTGCAATRTCIACRAANGC-3' Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73:2009-2012.
RosEub_F 5'-TCAAATCMGGIGACTGGGTWGA-3'
Gen BCoAT de Eubacterium rectale
Eub_R 5'-TCATAACCGCCCATATGCCATGAG-3' Microbiome2013,1:8
Fprsn_F 5'-GACAAGGGCCGTCAGGTCTA-3'
Gen BCoAT de Faecalibacterium prausnitzii
Fprsn_R 5'-GGACAGGCAGATRAAGCTCTTGC-3' Microbiome2013,1:8.
Análisis estadístico. A menos que se especifique lo contrario, el resultado de la qPCR y la secuenciación se analizó utilizando la prueba de Mann-Whitney de dos colas que compara los subtipos de EII con el grupo de control. Un valor P menor que 0,05 se consideró significativo. La correlación entre la secuenciación de BCoAT y del ARNr 16S se realizó mediante el cálculo del coeficiente de correlación de rangos de Spearman (r) de la AR emparejada de taxones bacterianos identificados por los dos enfoques.
Los productores de butirato se reducen en pacientes con CU con inflamación colónica. Con el fin de
determinar la cantidad relativa de productores de butirato, se analizó el número de copias de genes BCoAT con respecto al ARNr 16S. La diferencia en el número relativo de genes BCoAT entre sujetos de control (2,15x10-4 ± 2.46x10-4) y subgrupos de EII (EC, 2,17x10'4 ± 1,97x10-4; CU, 1,74x10'4 ± 2,78x10'4) no fue estadísticamente significativa (P > 0,2) (figura 13). Sin embargo, el análisis de cada grupo de EII basado en la apariencia macroscópica durante la colonoscopia reveló que los pacientes con CU con colon inflamado tenían un menor número de productores de butirato (3,13x10)'5± 3,10x10"5) en comparación con los sujetos control (P = 0,029) (figura 13).
La diversidad de productores de butirato es diferente en pacientes con EII en comparación con sujetos sanos. Se generaron un total de 670.287 lecturas de alta calidad de 43 muestras (13 de control, 20 de EC y 10 de CU) con un promedio de 15.570 lecturas por muestra (rango, 44.158-2.938) y una longitud de lectura promedio de 465 nucleótidos (resumido en la Tabla s4). Las lecturas de agrupamientos a una distancia de 0,05 dieron como resultado en un total de 965 UTO de todas las muestras con un número total de UTO de 714 para los controles, 804 para EC y 744 para CU. La mayoría de las UTO observadas se compartieron entre los tres grupos (486 UTO), y solo unas pocas fueron exclusivas para cada grupo individual (figura 14A). La comparación de muestras de diversidad
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alfa, utilizando UTO estimadas de Chaol y el índice de diversidad de Shannon con conjuntos de datos igualados a 4.600 lecturas, reveló que las muestras de EC tenían UTO estimadas de Chao1 significativamente menores en comparación con los controles (P = 0,04) (figura 14B). Por el contrario, no se observaron diferencias en el índice de Shannon (figura 14B). Esto significa que los sujetos con EII tienen una uniformidad similar a los controles, pero los pacientes con EC muestran una menor riqueza.
Además, el análisis de escalamiento multidimensional de las métricas de UniFrac, presentado por el gráfico de análisis de coordenadas principales (PCoA), indica que el grupo de EII es diferente de los controles. Aunque no se observó separación con UniFrac no ponderado (datos no mostrados), PCoA mostró una buena separación de las muestras de EC y CU del control con UniFrac ponderado. Al agrupar muestras de EC con controles, la mayoría de los sujetos de control y EC se agruparon en dos grupos distintos con 52,6% de la varianza explicada por la coordenada 1 (PCoA1) y 12,7% adicional de la varianza atribuible a PCoA2 (figura 14C). Se observó una separación similar cuando se comparó la CU con el control, con 62,1% de varianza explicada por PCoA1 y 10,2% por PCoA2 (figura 14C).
Eubacterium rectale está agotado y Faecalibacterium prausnitzii prospera en pacientes con EII. Con el fin de
echar un vistazo más profundo a la diversidad de productores de butirato, los autores de la presente invención estudiaron los taxones bacterianos asignados. En general, las UTO de todas las muestras se asignaron a 12 especies bacterianas clasificadas que pertenecen al phylum Firmicutes además de 67 UTO no clasificadas (figura 15). En el grupo control, la mayoría de las bacterias productoras de butirato pertenecían al grupo XIVa de Clostridium. Estos incluían Eubacterium rectale (58,7%±29,7), Eubacterium hallii (8,5%±8,9), Roseburia inulinivorans (2,7%±7,2), Roseburia hominis (1%±2,9), Coprococcus catus (0,18%±0,65), Roseburia intestinalis (0,06%± 0,17), y Clostridium symbiosum (8,4x10-5% ± 2,8x10-4). También se encontró que Faecalibacterium prausnitzii, un miembro del grupo IV de Clostridium, era un contribuyente principal al consorcio de productores de butirato saludable con una abundancia de 14,3% ± 17,4. Otros miembros del núcleo saludable de productores de butirato son Clostridium sp. SS2/1 (11,2%± 22,1), bacteria productora de butirato SS3/4 (0,03% ± 0,08), Clostridium sp. M62/1 (0,019%±0,068), Ruminococcus bacteria D16 (2,7x10-6% ± 9,8x10-6), y 49 UTO no clasificadas diferentes (3,1% ± 4,4).
La comparación de la AR de las especies bacterianas identificadas del grupo de control con pacientes con EII (tanto EC como CU) reveló que el grupo de control se caracteriza por una mayor AR de E. rectale (P<0,05) (figura 16A). La subclasificación de pacientes con EII basada en la apariencia endoscópica mostró que E. rectale era reducido en pacientes con EC con colon inflamado o no inflamado (P<0,02). Por el contrario, solo los pacientes con CU con un colon inflamado tenían una AR reducida de E. rectale (P<0,05) (figura 16A). Otro productor de butirato con reducción de AR en EC es R. inulinivorans. La reducción en R. inulinivorans se limitó exclusivamente a pacientes de EC con un colon inflamado (P=0,04) (figura 16C). Inesperadamente, F. prausnitzii, que es uno de los productores de butirato más abundantes en el intestino humano sano, aumentó en la EC, particularmente en pacientes de EC con colon inflamado (P=0.04) (figura 16B). A pesar de que la AR de F. prausnitzii también fue alta en pacientes de CU en comparación con el control, la diferencia no alcanzó significación estadística (P=0,07). En conclusión, esto destaca la presencia de una firma única de productores de butirato que distingue la EII de los controles. La comparación de la AR bacteriana también se llevó a cabo para UTO no clasificadas. En total, se encontraron 61 UTO no clasificadas en muestras de EC que representan 7,2% ± 20,2 de todas las lecturas y 39 para CU que representan 0,7% ± 1 del total de lecturas. El número total de UTO no clasificadas fue significativamente menor en CU (P<0,05; figura 16D). La UTO_34 no clasificada, que comparte una identidad de 59% con E. rectale, se redujo en pacientes con EC con colones normales o inflamados (EC, P=0,006; EC_normal, P=0,01; EC_inflamado, P=0,05; figura 16E). Otra UTO no clasificada, UTO_43 que comparte una identidad de 61% con E. rectale, se redujo en todos los subconjuntos de EII (P<0,01). La UTO_43 se redujo tanto en subtipos de EC como en pacientes con CU con colon inflamado (figura 16F).
Con el fin de someter a ensayo la posibilidad de que las UTO no clasificadas pudieran representar nuevos productores de butirato, las secuencias completas del gen BCoAT para las especies bacterianas asignadas se alinearon mediante MUSCLE con las secuencias UTO no clasificadas. Las secuencias alineadas se utilizaron a continuación para construir un árbol filogenético utilizando un algoritmo de máxima verosimilitud. Veinticinco de las 67 UTO no clasificadas se agruparon con productores conocidos de butirato. Entre estos, las UTO no clasificadas 34 y 43, que se encontró que eran deficientes en EII, se agruparon con E. rectale. Curiosamente, 42 de las UTO no clasificadas no se agruparon con ninguno de los productores de butirato asignados. En una segunda etapa, las secuencias de las UTO no clasificadas se alinearon mediante MUSCLE con la base de datos de nucleótidos but descargada de Functional Gene Pipeline/Repository. La base de datos but contiene todas las secuencias de nucleótidos de los genes probables de BCoAT identificados por las búsquedas de modelos de Hidden Markov de la base de datos de proteínas bacterianas del NCBI. Posteriormente, las secuencias alineadas se sometieron a construcción de árbol filogenético. Esta vez, solo 4 de las 67 UTO no clasificadas se agruparon con bacterias clasificadas. Las UTO restantes se agruparon solo con secuencias codificantes de BCoAT parciales aisladas de muestras humanas que pertenecen a bacterias no cultivadas no clasificadas. Por lo tanto, esto sugiere que las 63 UTO no clasificadas podrían pertenecer a nuevos productores de butirato.
Diversidad de bacterias productoras de butirato revelada por la secuenciación del ARNr 16S: El análisis de la diversidad de bacterias productoras de butirato a nivel de género utilizando la secuenciación de ARNr 16S revela resultados similares a la secuenciación de BCoAT con diferencias mínimas. En total, se identificaron 10 géneros de
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productores de butirato con el enfoque de ARNr 16S en comparación con 6 géneros utilizando un enfoque genético funcional. La mayoría de las lecturas se asignaron a 4 géneros: Eubacterium, Faecalibacterium, Roseburia, y Coprococcus (figura 17). De acuerdo con los hallazgos de genes funcionales de los autores de la presente invención, Eubacterium fue mayor en el grupo de control (21,66% ± 22,95) en comparación con EII (EC, 6,89% ± 9,47; CU, 9,48 ± 18,72). Además, Faecalibacterium predominaba tanto en EC (55,6% ± 35,56) como en CU (60,12% ± 29,29) en comparación con los controles (18,09% ± 22,13). A diferencia de los datos de BCoAT, Roseburia fue la bacteria productora de butirato más abundante en el grupo de control (34,52% ± 28,55) y tuvo una mayor abundancia en comparación con EC (23,82% ± 24,76) y CU (16,99% ± 19,3). Esto respalda aún más una hipótesis previa de que la producción de butirato está restringida a ciertos miembros del mismo género26. De un modo similar, la abundancia de Coprococcus fue mayor en los datos del ARNr 16S en comparación con el enfoque de BCoAT (figura 17). Sin embargo, vale la pena señalar que Coprococcus puede producir butirato no solo a través de la vía BCoAT sino también a través de una ruta de butirato quinasa26. Esto podría explicar la reducción de la abundancia de Coprococcus en los datos de BCoAT. El enfoque de ARNr 16S identificó 6 productores de butirato de baja abundancia (abundancia total de los 6 géneros <1%) que se omitieron mediante la secuenciación de BCoAT. Éstos incluyen: Peptoniphilus, Anaerofustis, Anaerostipes, Butyrivibrio, Megasphaera, y Treponema. Esto podría atribuirse a la mayor profundidad de secuenciación de la plataforma HiSeq2500 Illumina utilizada para el ARNr 16S que puede generar hasta 50 veces más lecturas que la pirosecuenciación 454, que se utilizó para la secuenciación BCoAT. La falta de resolución a nivel de especie por los datos del ARNr 16S hizo imposible identificar algunos productores importantes de butirato que se identificaron por el enfoque del gen funcional. Éstos incluyen: Clostridium sp. M62/1, Clostridium sp. SS2/1, y Clostridium symbiosum. El cálculo del coeficiente de correlación de rango de Spearman pareado (r) para la abundancia relativa de productores de butirato identificados por secuenciación de ARNr 16S y BCoAT reveló una fuerte correlación entre los dos conjuntos de datos (r = 0,73).
Cuantificación relativa de productores clave de butirato revelada por qPCR: Los resultados de la secuenciación de BCoAT se validaron adicionalmente utilizando qPCR utilizando cebadores específicos de BCoAT y ARNr 16S. El grupo (XIVa) de Eubacterium rectale/Clostridium coccoides, que está dominado por E. rectale, se redujo en ambos subtipos de EC en comparación con los controles. Por otro lado, el grupo de CU tenía niveles similares de grupo XIVa en comparación con los controles (figura 18B). Este hallazgo en el grupo de CU no es inesperado ya que el grupo XIVa de Clostridium alberga otros productores de butirato principales y no productores de butirato, y un aumento en otros miembros del grupo XIVa podría oscurecer la reducción de E. rectale en pacientes con CU. La ausencia de cebadores específicos de especie, o incluso específicos de género, para ARNr 16S de E. rectale hizo imposible elegir como diana esta bacteria solo utilizando la qPCR para ARNr 16S. Cuando se elegía como diana el gen BCoAT de E. rectale, se observó una reducción clara en todos los subtipos de EII en comparación con los controles (P<0,02; figura 18A). No obstante, la secuenciación de BCoAT mostró una disminución en AR de E. rectale en pacientes con CU con un colon inflamado solamente, y la reducción de AR de E. rectale en pacientes con CU con colon normal no alcanzó significación estadística (figura 16A). A pesar de que F. prausnitzii fue alta en EC con colones inflamados por secuenciación, la qPCR (utilizando cebadores para BCoAT y ARNr 16S específicos para F. prausnitzii) reveló que éste aumentaba no solo en pacientes con EC, sino también en pacientes con CU con colon inflamado (figura 18C y 18D). Sin embargo, la ligera diferencia en la significación estadística de la qPCR en comparación con la secuenciación se debe al mayor número de muestras utilizado en la qPCR en comparación con la secuenciación. Finalmente, la reducción en R. inulinivorans, demostrada por la secuenciación, solo se validó a nivel de género utilizando cebadores específicos de ARNr 16S debido a la falta de cebadores específicos de especie. La qPCR muestra que Roseburia se reduce en la EC (con colon tanto normal como inflamado) (figura 8E), sin embargo, la significación estadística fue mayor en la EC con colon inflamado (EC-normal, P<0,017; EC- inflamado, P<0,009). Tomados en conjunto, los hallazgos de qPCR están en consonancia con los de la secuenciación de BCoAT.
Con el fin de investigar si el tipo de muestra (heces versus producto aspirado de la mucosa) podría afectar al nivel de bacterias detectadas, las heces recogidas de 5 pacientes de control y 10 con EC (6 con colon normal y 4 con colon inflamado, tabla S1) se sometieron a qPCR utilizando cebadores específicos ARNr 16S para F. prausnitzii. Al contrario del descubrimiento con el producto aspirado de la mucosa, F. prausnitzii mostró niveles similares a los controles en ambos subtipos de EC (figura 19).
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Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un método para diagnosticar la enfermedad inflamatoria intestinal, la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa en un sujeto humano que comprende las etapas de:
    - medir un nivel de uno o más bacterias productoras de H2S en una muestra de microbiota intestinal del sujeto humano, en donde las una o más bacterias productoras de H2S se seleccionan entre Fusobacterium nucleatum, Veillonella parvula, y Atopobium parvulum, y
    - comparar el nivel de las uno o más bacterias productoras de H2S con un nivel de referencia de las una o más bacterias productoras de H2S de muestras de microbiota intestinal de sujetos humanos sanos, en donde un nivel de una o más bacterias productoras de H2S más alto que el nivel de referencia es indicativo de enfermedad.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la uno o más bacterias productoras de H2S son A. parvulum y en donde la medición comprende la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y la utilización de un cebador directo e inverso para elegir como diana A. parvulum y en donde el cebador directo del par de cebadores tiene SEQ ID 1 y el cebador inverso tiene SEQ ID 2.
  3. 3. Un método para determinar la gravedad de la enfermedad de Crohn que comprende:
    - medir un nivel de Taxón bacteriano Atopobium en una muestra de microbioata intestinal del sujeto humano, en donde un nivel superior a un nivel predeterminado es indicativo de inflamación moderada o grave.
  4. 4. El método de la reivindicación 3, en donde Atopobium es Atopobium parvulum.
  5. 5. El método de la reivindicación 4, en donde el nivel predeterminado es una abundancia de A. parvulum mayor que aproximadamente 0,005 de abundancia relativa de bacterias totales de la muestra de microbioata intestinal.
  6. 6. El método de la reivindicación 5, en donde la medición del nivel de A. parvulum comprende la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y la utilización de un cebador directo e inverso para elegir como diana A. Parvulum y en donde el cebador directo del par de cebadores tiene SEQ ID 1 y el cebador inverso tiene SEQ ID 2.
  7. 7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha muestra de microbiota intestinal es una muestra de microbiota intestinal colónica, en donde las una o más bacterias productoras de H2S son A. parvulum y dicha etapa de medición se realiza midiendo en dicha muestra un nivel de un marcador seleccionado entre citocinas y focos GALT, en donde un nivel de citocina o focos GALT por encima del nivel normal es indicativo de la presencia de A. parvulum y de enfermedad, y en donde las citocinas se seleccionan entre CxCl1, IL17a, IL-12 e IL-1p o una combinación de las mismas.
  8. 8. El método de la reivindicación 7, en donde las citocinas se seleccionan entre IL-12 e IL-1 p o una combinación de las mismas.
  9. 9. Un método para determinar la eficacia de un tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal en un paciente que padece dicha enfermedad con un compuesto seleccionado entre aminosalicilatos, inmunomoduladores, anti- integrinas, anti-citocinas, programas de alimentación enteral, esteroides, corticosteroides, antibióticos, anti-TNFa, bismuto o una combinación de los mismos, comprendiendo dicho método:
    - realizar un análisis para determinar si el paciente tiene enfermedad inflamatoria intestinal, midiendo un nivel de una o más bacterias productoras de H2S en una muestra de microbiota intestinal del sujeto humano, en donde las una o más bacterias productoras de H2S se seleccionan entre Fusobacterium nucleatum, Veillonella parvula, y Atopobium parvulum, y uno de:
    - comparar el nivel de una o más bacterias productoras de H2S con un nivel predeterminado o promedio correspondiente al nivel de no respondióores de las una o más bacterias productoras de H2S de las muestras de microbiota intestinal, en donde un nivel de las una o más bacterias productoras de H2S que es inferior al nivel predeterminado de referencia o el promedio es indicativo de la eficacia del tratamiento, y
    - comparar el nivel de las una o más bacterias productoras de H2S con un nivel predeterminado o promedio correspondiente al nivel de los respondióores de las una o más bacterias productoras de H2S de las muestras de microbiota intestinal, en donde un nivel de las una o más bacterias productoras de H2S que es más elevado que el nivel predeterminado o el promedio es indicativo de la falta de eficacia del tratamiento.
  10. 10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el compuesto es bismuto.
  11. 11. El método de acuerdo con la reivindicación 9 en donde las una o más bacterias productoras de H2S son A. parvulum y en donde la medición comprende la utilización de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y la utilización de un cebador directo e inverso para elegir como diana A. parvulum y en donde el cebador directo del par de cebadores tiene SEQ ID 1 y el cebador inverso tiene SEQ ID 2
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