CN105255884B - 贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时荧光定量pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物领域，尤其涉及贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时荧光定量PCR方法。该引物组包括如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物。采用本发明提供的引物组进行实时荧光定量PCR方法扩增效率高，误差小，结果客观准确，具有良好的特异性、重复性、敏感性。

Description

贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时荧光定量PCR 方法

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时荧光定量PCR方法。

背景技术

Q热(Q Fever)是一种能使人和多种动物感染而产生发热的一种疾病，病程可分为急性期和慢性期。急性感染的症状包括：高热、颤抖、肌肉疼痛和头疼等，更严重的会导致肺炎或肝炎。怀孕期间被感染时，有可能导致胎儿流产或新生儿早产。大约有1％的感染最终转变成慢性疾病。1950年，我国首例发现Q热病例，随后在屠宰场、农牧场等地多次暴发流行，病原体分别从五十多种野生动物中分离出。目前此病已遍及全世界，中国已有十多个省份存在此病。

Q热于1937年初在澳大利亚的布里斯班大规模爆发后，Dr.Herald Rae Cox等成功地分离了除了病原菌，并用他们的名字命名为贝纳特氏立克次体(Rickettsia burneti)，又名贝氏立克次体(Coxiella burnetii)，属立克次体。近几年研究将其从斑点热立克次体中分离出来，属于非斑点热群立克次体，该菌为革兰阴性菌。其致病性、免疫原性与其脂多糖、质粒、表面蛋白等方面密切相关。对理化因子有特殊的抵抗力，在外界环境中可长期存活，可通过气溶胶广泛传播，通过飞沫方式使人和动物发生感染。贝氏立克次体是立克次体族中目前已知唯一含有质粒的病原菌，现已发现4种质粒型(QpHI、QpRS、QpDV、QpDG)和无质粒(plasmidless)。每种质粒各有其特异序列，并且质粒的类型与Q热的临床类型无关。大多病症是亚临床症状或不被确诊。

检测贝氏立克次体最可靠依据是从样本中分离到贝氏立克次体，可用动物分离、鸡胚分离、细胞分离等手段，但是贝氏立克次体的分离耗时、繁琐、敏感性差，在一般实验室难以进行。目前，最常用的贝氏立克次体检测方法是血清特异性抗体检测，由于高水平的特异性抗体出现较晚，所以特异性抗体的检测结果难以用作Q热的早期诊断，也无法用于检测样品是否携带该病菌。因此，急需提供一种能够准确、快速检测贝氏立克次体的试剂盒及其方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时荧光定量PCR方法。采用该引物组及其检测试剂对贝氏立克次体进行检测，能够具有良好的特异性、重复性和灵敏性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种贝氏立克次体的检测引物组，包括如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物。

本发明还提供了一种贝氏立克次体的实时荧光定量PCR检测试剂，包括如SEQ IDNO：1所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ IDNO：3所示核苷酸序列的探针。

本发明以贝氏立克次体的保守序列作为检测靶目标，提供用于贝氏立克次体的荧光定量检测的探针和引物，以该引物和探针对贝氏立克次体进行检测，能够具有良好的特异性、重复性和灵敏性。

在本发明中，如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的探针的3’端连接有FAM荧光标记基团。

作为优选，本发明提供的检测试剂中还包括dNTP、Taq酶和/或PCR反应缓冲液。

作为优选，本发明提供的检测试剂中还包括ddH₂O、96孔板和/或光学反应盖膜。

本发明还提供了一种非诊断目的检测贝氏立克次体的实时荧光定量PCR方法，包括：以如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物扩增待测样品DNA，以如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针检测，经实时荧光定量PCR获得荧光信号。

作为优选，实时荧光定量PCR的反应体系为：

采用本发明提供的实时荧光定量PCR反应体系进行扩增能够获得良好的扩增曲线，提高实验的准确性。

作为优选，实时荧光定量PCR的程序为：

熔解温度(Tm)是引物的一个重要参数。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。本发明提供的荧光定量PCR引物退火温度为57℃，以此温度检测，能够提高实验的特异性。

作为优选，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物的浓度为10pmol/L；SEQ IDNO:2所示核苷酸序列的上游引物的浓度为10pmol/L。

作为优选，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的浓度为10pmol/L。

根据荧光信号值及扩增曲线获得样品中是否含有贝氏立克次体，具体为：

荧光信号Ct值＜28.0，并出现典型的扩增曲线，试验有效；

无荧光信号Ct值或无扩增曲线，待测样品为阴性，不含贝氏立克次体；

荧光信号Ct值≤30.0，并出现典型的扩增曲线，待测样品为阳性，含有贝氏立克次体。

本发明提供了贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时荧光定量PCR方法。该引物组包括如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物。本发明至少具有如下优势之一：

1、采用本发明提供的引物组进行实时荧光定量PCR方法扩增效率为101％，相关系数为0.999，说明误差小，结果客观准确；

2、采用本发明引物组进行实时荧光定量PCR方法对贝氏立克次体进行检测，具有良好的特异性，通过扩增只有贝氏立克次体出现扩增曲线，其它未有S型曲线扩增；

3、本发明重复性检测的荧光PCR的Ct变异系数最小可达0.16％，梯度重复性良好，表明本发明检测方法重复性良好且稳定，所检测到的Ct值近似或根据稀释倍数呈现梯度曲线；

4、本发明实时荧光定量PCR方法能检出的最低拷贝数为1.55×10⁵copies/μL，荧光PCR的敏感度均较高。

附图说明

图1示按照实施例1的反应体系及条件分别对不同菌进行检测的结果；线1示贝氏立克次体扩增曲线，其余菌未扩增出扩增曲线。

具体实施方式

本发明公开了贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时荧光定量PCR方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的贝氏立克次体的检测引物组及其检测试剂、实时荧光定量PCR方法中采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

贝氏立克次体标准品的制备方法为：

首先，根据NCBI公布的贝氏立克次体IS111a基因序列合成目的基因(序列见SEQID NO:4，上海生物工程有限公司合成)与PMD18T载体(TAKARA公司)连接后转入大肠杆菌里，直接提取质粒DNA；

质粒作为贝氏立克次体标准品进行实验。质粒的260nm/280nm比值为2.0，浓度为56.00ng/μL。

提取待测样品DNA所用缓冲液ATL、缓冲液AL、缓冲液AW1、缓冲液AW2、缓冲液AE、QIAampMini spin column收集管来自DNA提取试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1贝氏立克次体的检测方法

以SEQ ID NO:1所示核苷酸序列为上游引物；以SEQ ID NO:2所示核苷酸序列为下游引物；以SEQ ID NO:3所示核苷酸序列为探针，检测贝氏立克次体。

根据矩阵法正交验证，确定引物和探针的最佳浓度和用量。以含贝氏立克次体基因的质粒作为模版，建立荧光PCR反应体系，总反应体系为25μL。在确定模板浓度相同的情况下，对引物和探针分别用5，10，15，20pM的引物浓度和5，10，20的探针浓度，用矩阵法筛选引物和探针的最佳浓度。结果最佳引物浓度为10pM，探针浓度为10pM。最佳体系结果为：

通过对贝氏立克次体Taq-man荧光PCR和反应体系及条件的优化，结果在57℃时为最佳退火温度。

Taq-man荧光PCR具体反应条件为：

利用贝氏立克次体验证后的阳性单克隆质粒为模板，重组质粒DNA经酶标仪测定，质粒浓度为56ng/μL进行10倍梯度稀释，根据已优化好的反应条件和体系进行3组平行重复荧光PCR扩增实验。以拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，建立标准曲线。

贝氏立克次体的标准曲线相关系数R²＝0.999，扩增效率E＝101％，所获得标准曲线的斜率为-3.285，截距为44.346，得到回归方程：Ct＝-3.285lgN+44.346。

荧光定量PCR的反应体系、模板、探针、引物的浓度和用量都会影响到实验结果，特别会影响到PCR扩增效率。本发明实验结果表明，采用本发明提供的反应体系扩增效率为101％，结果较为良好。相关系数为0.999，说明误差小，结果较为客观准确。

实施例2特异性检测

按照实施例1的反应体系及条件分别检测贝氏立克次体、西伯利亚立克次体、鼠疫菌、土拉菌、布氏杆菌、大肠杆菌、李斯特杆菌，结果如图1。通过扩增只有贝氏立克次体出现扩增曲线，其它未有S型曲线扩增，阴性对照成立，表明具有良好的特异性。研究结果显示，所建立的检测方法特异性强，可对贝氏立克次体进行特异性鉴定。

实施例3重复性及灵敏度检测

按照实施例1的反应体系及条件，将质粒样品(贝氏立克次体标准品)进行10倍梯度稀释，共稀释7个梯度，将稀释倍数依次为：10⁸、10⁶、10⁴进行平行验证，应用优化好的方法对每个梯度样品做重复性检测。结果如表1：

表1贝氏立克次体不同稀释度重复性试验

结果显示，重复性检测的荧光PCR的Ct变异系数最小可达0.16％，梯度重复性良好，以此证明所建立的方法重复性良好且稳定，所检测到的Ct值近似或根据稀释倍数呈现梯度曲线。经计算，贝氏立克次体标准品的荧光PCR能检出的最低拷贝数为1.55×10⁵copies/μL，荧光PCR的敏感性均较高。

实施例4检测实例

从4个不同省份，10个市区共收集蜱4797只，10只分为一组，共475组。其中吉林省2105只，辽宁省1195只，黑龙江省905只，内蒙古592只；7个蜱种包括：森林革蜱，全沟硬蜱，微小牛蜱，嗜群血蜱，草原血蜱，亚东璃眼蜱，日本血蜱。应用本研究所建立的检测方法对4个省份4797只蜱进行鼠疫耶尔森氏菌进行检测：

首先：将蜱种鉴定、标号后，用75％酒精将其浸泡消毒20min后，用吸水纸吸干，再用PBS液，漂洗3次，用吸水纸吸干婢表面水份，放置研磨钵中，倒入液氮进行研磨，取粉末放入离心管中，以备用。

将动物组织在液氮中粉碎后，粉末组织放于1.5rnl离心管中；

加入180μL缓冲液ATL，然后加入20μL蛋白酶K，于56℃温育1～3小时，每隔20min取出轻轻旋祸，观察直到组织完全溶解；

取出离心管短暂离心，然后加入200μL的缓冲液AL，短暂祸旋15s，37℃温育l0min；

短暂离心后加入200μL无水乙醇，轻轻祸旋15s，短暂离心；

将上述样品加入到QIAampMini spin column收集管中，8000rpm离心Imin，弃滤液；

加入500μL缓冲液AW1，8000rmp离心1min，弃滤液；

加入500μL缓冲液AW2，全速离心2min,弃滤液；

更换柱子的收集管，全速离心1min；

将柱子放置到新的1.5ml离心管上，加入100μl缓冲液AE，室温下放置1min，8000rmp，离心1min。

应用实施例1所述的引物及条件体系对蜱虫样品进行实时定量荧光PCR检测。结果见表2。

表2对蜱虫样品进行实时定量荧光PCR检测结果

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种贝氏立克次体的检测引物组，其特征在于，包括如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物。

2.一种贝氏立克次体的实时荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，包括如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的探针。

3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述探针的3’端连接有FAM荧光标记基团。

4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，还包括dNTP、Taq酶和/或PCR反应缓冲液。

5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，还包括ddH₂O、96孔板和/或光学反应盖膜。

6.一种非诊断目的检测贝氏立克次体的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括：以如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物扩增待测样品DNA，以如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针检测，经实时荧光定量PCR获得荧光信号。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系为：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的程序为：

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物的浓度为10pmol/L；所述SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的上游引物的浓度为10pmol/L。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的浓度为10pmol/L。