CN113621529B - 一种重组载体、表达载体、基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种重组载体、表达载体、基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及钾离子通道调控蛋白技术领域，具体涉及一种重组载体、表达载体、基因工程菌及其应用。该重组载体是将SEQ ID NO.1所示DNA序列插入pPrey‑PartnerSUS‑2in1‑Dest载体的NruI和NdeI位点之间获得的，命名为pKY2in1‑Dest，该表达载体是将钾通道基因以及其它调控蛋白基因通过Gateway克隆反应一步转入pKY2in1‑Dest获得的。该基因工程菌是将所述的表达载体转入受体菌获得的。本发明的基因工程菌可应用于大规模筛选影响钾离子通道钾吸收功能的调控蛋白，通过观察低钾条件下酵母生长，直接展示对钾通道功能影响，具有条件简单、成本低和实验周期短的特点。

Description

一种重组载体、表达载体、基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及钾离子通道调控蛋白技术领域，具体涉及一种重组载体、表达载体、基因工程菌及其应用。
背景技术
钾离子通道在植物钾吸收及渗透压平衡过程中发挥关键作用。对钾离子通道的调控，是植物吸收钾元素维持生长，响应外界胁迫的基础。钾离子通道发挥功能，主要依靠膜电位变化下通道蛋白结构变化，允许钾离子通过实现。这一通道蛋白受膜电位变化影响允许钾通过称为通道门控特性。
钾离子通道调控，包括从有效蛋白数目多少出发的调控(如蛋白转录表达水平调控，蛋白亚细胞定位调控)，以及从对蛋白通道门控活性出发的调控(如通过蛋白相互作用直接影响通道功能实现调控)。近年来一系列研究表明，一些植物膜转运蛋白与钾离子通道共表达后通过相互作用影响通道门控特性，进一步影响钾吸收活性。
目前用于分析钾通道跨膜转运钾离子功能，特别是分析共表达调控蛋白如何影响通道功能，主要依靠在非洲爪蟾卵母细胞中开展电压钳电生理实验完成。非洲爪蟾未受精卵母细胞是一个理想的研究通道蛋白功能的平台。通过显微注射离子通道RNA，DNA在卵内表达对应蛋白，或直接显微注射通道蛋白，可以使该蛋白在爪蟾卵母细胞膜上表达。将卵母细胞置于一定的钾溶液中，利用电压钳设备给卵母细胞施加一定的电压，可以模拟膜电位变化，促使通道开放。此时，探究共表达调控蛋白是否影响通道功能，可以通过测定不同电压下跨膜钾电流变化情况实现。该技术的缺点在于特殊实验设备及技术要求高，成本高。如需要非洲爪蟾饲养条件，需要手术能力从爪蟾中取卵，需要显微操作设备及技术完成RNA或DNA或蛋白质注射，同时需要电压钳设备及技术实现电生理实验。同时，由于同一个爪蟾卵中只能一对一表达通道蛋白及调控蛋白，由于实验设备及技术要求高，难以用于大规模筛选潜在影响通道蛋白活性的调控蛋白。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术的缺陷，提供一种重组载体、表达载体、基因工程菌及其应用。
第一方面，本发明提供了一种重组载体，是将SEQ ID NO.1所示DNA序列插入pPrey-PartnerSUS-2in1-Dest载体的NruI和NdeI位点之间获得的，命名为pKY2in1-Dest。
第二方面，本发明提供了一种含有钾通道基因以及其它调控蛋白基因的表达载体，是将钾通道基因以及其它调控蛋白基因通过Gateway克隆反应一步转入前述的pKY2in1-Dest获得的。
第三方面，本发明提供了一种基因工程菌，是将前述的表达载体转入钾吸收缺陷酵母R5421获得的。
第四方面，本发明提供了前述基因工程菌在筛选影响钾离子通道钾吸收功能的调控蛋白中的应用。
进一步的，前述的应用包括以下步骤：
S1、将待测蛋白基因和钾离子通道基因通过BP反应分别重组到gateway载体，获得待测蛋白-入门克隆和钾离子通道-入门克隆；
S2、将待测蛋白-入门克隆、钾离子通道-入门克隆和pKY2in1-Dest载体通过LR反应重组，转化至钾吸收缺陷酵母R5421，获得基因工程菌；将钾离子通道-入门克隆和pKY2in1-Dest载体通过LR反应重组，转化至钾吸收缺陷酵母R5421，获得对照菌；
S3、将基因工程菌和对照菌于含不同钾浓度的培养基中培养，检查并对比二者生长情况。
进一步的，所述钾离子通道基因为KAT1基因。
进一步的，所述gateway载体为pDONR221载体。
进一步的，所述培养基为CSM-L氨基酸缺陷培养基。
进一步的，S3的结果判定是：与对照菌相比，基因工程菌能在更低钾浓度下生长，则表明待测蛋白能够促进钾离子通道活性，提高钾离子通道钾吸收功能；反之，基因工程菌在更高钾浓度下才能生长，则表明待测蛋白能够抑制钾离子通道活性，降低钾离子通道钾吸收功能。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明在钾吸收缺陷酵母R5421中同时表达钾离子通道及潜在调控蛋白，通过观察低钾条件下酵母生长，直接展示对钾通道功能影响。
2、本发明的pKY2in1-Dest重组载体中，钾离子通道在组成型启动子调控下表达，待测调控蛋白基因在甲硫氨酸负向调控启动子控制下表达，有助于利用甲硫氨酸浓度进一步调整待测调控蛋白基因表达水平，更清楚观察对钾离子通道功能影响。
3、相较于电压钳电生理技术，本发明所需设备及实验条件简单，成本低，本发明利用酵母实验，试验周期短，适用于大规模筛选。本发明中可以简单通过改变甲硫氨酸浓度调节待测调控蛋白基因表达水平，可以更清楚看到影响，电压钳电生理技术中需要通过在爪蟾卵母细胞中注射不同比例与浓度RNA、DNA、蛋白实现。
附图说明
图1为pKY2in1-Dest重组载体结构及2in1 LR反应。
图2为VAMP721，SYP121及VAMP727对KAT1钾离子通道钾吸收能力的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的R5421酵母菌株公众可从上海唯地生物有限公司获得。该酿酒酵母菌株为K+/钾离子缺陷型菌株，在文献中也称为CY162，MATα型，多用于钾离子转运蛋白的鉴定试验中，也可用于K+/钾离子通道或钠钾离子泵的鉴定试验。Transformation marker为：ura3，leu2，该菌株可以在含有100mM KCl的培养基中正常生长，在含有5-10mM KCl的培养基中生长缓慢，当培养基中KCl浓度低于0.5mM，R5421(CY162)细胞停止生长。将具有钾跨膜转运活性的离子通道蛋白表达在该酵母中后，可以使该酵母在低钾条件下生长。这一方法已成为分析某蛋白是否具有钾吸收能力的经典方案。
含VAMP721，SYP121，VAMP727及KAT1的Gateway入门克隆可从山西大学生命科学学院张犇课题组获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
pPrey-PartnerSUS-2in1-Dest载体记载于《Tri-SUS:a yeast split-ubiquitinassay to examine protein interactions governed by a third binding partner》，Plant Physiology,Volume 185,Issue 2,February 2021,Pages 285–289。申请人保证从申请日起20年内向公众发放生物材料。
实施例1：pKY2in1-Dest重组载体制备
pPrey-PartnerSUS-2in1-Dest载体用于在酵母中测定三蛋白互作，与本发明功能无关，该载体仅为本发明pKY2in1-Dest载体提供带Amp抗性及Leu合成能力的载体筛选背景骨架。人工合成DNA序列SEQ ID NO.1(上海生工)，包含pmet25-attR1-CmR-ccdb-attR4-Myc-ptdh3-HA-attR3-LacZ-attR2组件，序列两端保留NruI与NdeI酶切位点。启动子是酵母表达调控的重要元件，其活性的强弱可以显著影响异源基因转录的起始、持续时间和表达的水平。本发明中选用的pTDH3为酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶3启动子，为组成型启动子；pmet25为ATP硫酸化酶/O-乙酰高丝氨酸硫酸化酶启动子，为外源甲硫氨酸浓度负向调控启动子。利用限制性内切酶NruI和NdeI(NEB)对pPrey-PartnerSUS-2in1-Dest载体及SEQ IDNo.1所示序列进行双酶切，37℃酶切反应2h，回收SEQ ID No.1片段和pPrey-PartnerSUS-2in1-Dest载体骨架，利用T4 DNA连接酶(NEB)将SEQ ID NO.1所示序列片段和pPrey-PartnerSUS-2in1-Dest载体骨架进行连接，连接产物转化大肠杆菌TransDB3.1感受态细胞(全式金)，挑取单克隆，利用酶切检测及测序鉴定阳性克隆，获得pKY2in1-Dest载体。
实施例2：利用pKY2in1-Dest载体构建VAMP721-KAT1,SYP121-KAT1与VAMP727-KAT1克隆并转化酵母
1、构建表达载体
SYP121，VAMP721与VAMP727为拟南SNARE家族膜转运蛋白，KAT1为拟南芥钾离子通道，已通过BP反应分别获得pDONR221-L3L2-KAT1，pDONR221-L1L4-SYP121，pDONR221-L1L4-VAMP721,及pDONR221-L1L4-VAMP727 Gateway入门克隆。将pKY2in1-Dest重组载体与以上入门克隆DNA，利用PureLinkTMPCR纯化试剂盒(Thermo)纯化后，稀释至浓度为150ng/ul。取1ul pKY2in1-Dest重组载体，按照DNA分子数为载体：KAT1入门克隆：SNARE入门克隆＝1：3：3配置2in1 LR反应体系，加入LR酶1ul，混匀后室温过夜，转化Trans10(全式金)感受态细胞，涂布含Amp的LB平板上37℃过夜，挑取单克隆培养，提取克隆质粒后酶切验证，获得pKY2in1-(SYP121/KAT1)，pKY2in1-(VAMP721/KAT1)与pKY2in1-(VAMP727/KAT1)克隆。另外按照载体：KAT1入门克隆＝1：3进行LR反应，获得仅转入KAT1的pKY2in1-control KAT1作为对照克隆。图1所示为pKY2in1-Dest载体结构图及2in1 LR反应示例。
2、转化酵母
将pKY2in1-(SYP121/KAT1)、pKY2in1-(VAMP721/KAT1)、pKY2in1-(VAMP727/KAT1)克隆、对照克隆以及pKY2in1-Dest重组载体分别转化R5421酵母，方法如下：
(1)取100ul冰上融化的R5421感受态细胞，加入预冷克隆2ug，预先加热变性的10mg/ml鳜鱼精DNA(sigma)10ul，加入350ul 50％PEG3350溶液，50ul 1M的LiAc溶液，轻轻吸打几次混匀。
(2)30℃水浴30min(每10min时翻转3-5次混匀)后，将管放入42℃水浴20min。
(3)5000rpm室温离心40s弃上清，加入ddH2O 400ul重悬，离心30s弃上清。
(4)ddH2O 50ul重悬，涂板(CSM-L氨基酸缺陷培养基，含钾离子100mM)，28℃培养48-96h。
实施例3：利用实施例2的基因工程菌探索SYP121，VAMP721与VAMP727对KAT1钾吸收功能的影响
1.挑取实例2获得的酵母菌落，在含钾离子100mM的CSM-L氨基酸缺陷培养基(CSM-L，100mM K)中，28℃，150rpm培养过夜。
2.保留750ul酵母过夜培养产物，与250ul 60％甘油混合，液氮速冻后，至于-80℃保存。
3.室温下3000rpm离心1min收获酵母细胞并重悬于CSM-L 100mM K中，ddH2O中稀释至OD600 1.0和0.1。
4.在含不同浓度钾离子(1，5，10，100mM)及不同浓度甲硫氨酸(0.5与500mM)的CSM-L固体平板上滴加4ul上一步获得菌液，28℃下培养24-72小时。检查酵母生长情况，并通过扫描仪或照相机拍照记录。
图2为SYP121、VAMP721与VAMP727对KAT1钾吸收功能的影响的酵母生长结果示例图。
KAT1为拟南芥钾离子通道，前期工作中已通过非洲爪蟾卵母细胞中电生理实验发现SNARE膜转运蛋白VAMP721抑制KAT1钾离子通道钾转运功能，SNARE膜转运蛋白SYP121促进KAT1钾离子通道钾转运功能，在本实例中作为系统对照验证。SNARE膜转运蛋白VAMP727与KAT1同样具有相互作用，但是否影响钾离子通道钾转运功能未知。将SYP121/KAT1，VAMP721/KAT1与VAMP727/KAT1分别转入pKY2in1-Dest载体并转化R5421酵母后，调整酵母浓度至OD600为1.0和0.1，点于含不同浓度钾离子及甲硫氨酸(Met)的CSM-L培养基。经28℃，72小时生长后，结果如2图所示。
转入空载体(pKY2in1-Dest重组载体)酵母可以在钾浓度大于10mM的培养基上生长。载体仅转入KAT1后，转化酵母可以在5-10mM钾浓度下生长，显示KAT1存在促进了酵母的钾吸收。加入甲硫氨酸，对于仅表达KAT1酵母生长无影响。
SYP121/KAT1通过pKY2in1-Dest载体转入酵母后，在低甲硫氨酸浓度下,SYP121大量表达，促进KAT1钾通道钾转运功能，酵母可以在1mM钾浓度培养基上生长。在高甲硫氨酸培养基上，SYP121表达抑制，酵母生长情况与仅表达KAT1类似。对于VAMP721/KAT1，在低甲硫氨酸浓度下，VAMP721大量表达，抑制钾通道活性，酵母仅在大于10mM钾浓度培养基生长。在高甲硫氨酸浓度培养基上，由于VAMP721表达受抑制，酵母可以在5mM浓度钾培养基生长，与仅表达KAT1相似。对于VAMP727/KAT1，转化酵母在培养基上显示出类似于转化VAMP721/KAT1酵母生长趋势，显示VAMP727与KAT1共表达后抑制后者通道活性。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 山西大学
<120> 一种重组载体、表达载体、基因工程菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3601
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tcgcgagctc ggatgcaagg gttcgaatcc cttagctctc attatttttt gctttttctc 60
ttgaggtcac atgatcgcaa aatggcaaat ggcacgtgaa gctgtcgata ttggggaact 120
gtggtggttg gcaaatgact aattaagtta gtcaaggcgc catcctcatg aaaactgtgt 180
aacataataa ccgaagtgtc gaaaaggtgg caccttgtcc aattgaacac gctcgatgaa 240
aaaaataaga tatatataag gttaagtaaa gcgtctgtta gaaaggaagt ttttcctttt 300
tcttgctctc ttgtcttttc atctactatt tccttcgtgt aatacagggt cgtcagatac 360
atagatacaa ttctattacc cccatccata caatcacaag tttgtacaaa aaagctgaac 420
gagaaacgta aaatgatata aatatcaata tattaaatta gattttgcat aaaaaacaga 480
ctacataata ctgtaaaaca caacatatcc agtcactatg gcggccgcat taggcacccc 540
aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta taatgtgtgg attttgagtt aggatccgtc 600
gagattttca ggagctaagg aagctaaaat ggagaaaaaa atcactggat ataccaccgt 660
tgatatatcc caatggcatc gtaaagaaca ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg 720
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caccatgggc aaatattata cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt 1200
tcatcatgcc gtttgtgatg gcttccatgt cggcagaatg cttaatgaat tacaacagta 1260
ctgcgatgag tggcagggcg gggcgtaaac gcgtggatcc ggcttactaa aagccagata 1320
acagtatgcg tatttgcgcg ctgatttttg cggtataaga atatatactg atatgtatac 1380
ccgaagtatg tcaaaaagag gtatgctatg aagcagcgta ttacagtgac agttgacagc 1440
gacagctatc agttgctcaa ggcatatatg atgtcaatat ctccggtctg gtaagcacaa 1500
ccatgcagaa tgaagcccgt cgtctgcgtg ccgaacgctg gaaagcggaa aatcaggaag 1560
ggatggctga ggtcgcccgg tttattgaaa tgaacggctc ttttgctgac gagaacaggg 1620
gctggtgaaa tgcagtttaa ggtttacacc tataaaagag agagccgtta tcgtctgttt 1680
gtggatgtac agagtgatat tattgacacg cccgggcgac ggatggtgat ccccctggcc 1740
agtgcacgtc tgctgtcaga taaagtctcc cgtgaacttt acccggtggt gcatatcggg 1800
gatgaaagct ggcgcatgat gaccaccgat atggccagtg tgccggtctc cgttatcggg 1860
gaagaagtgg ctgatctcag ccaccgcgaa aatgacatca aaaacgccat taacctgatg 1920
ttctggggaa tataaatgtc aggctccctt atacacagcc agtctgcagg tcgaccatag 1980
tgactggata tgttgtgttt tacagtatta tgtagtctgt tttttatgca aaatctaatt 2040
taatatattg atatttatat cattttacgt ttctcgttca acttttctat acaaagttgg 2100
aagctgatct cagaggagga cctgtaagag ctcgcatgcg agtttatcat tatcaatact 2160
gccatttcaa agaatacgta aataattaat agtagtgatt ttcctaactt tatttagtca 2220
aaaaattagc cttttaattc tgctgtaacc cgtacatgcc caaaataggg ggcgggttac 2280
acagaatata taacatcgta ggtgtctggg tgaacagttt attcctggca tccactaaat 2340
ataatggagc ccgcttttta agctggcatc cagaaaaaaa aagaatccca gcaccaaaat 2400
attgttttct tcaccaacca tcagttcata ggtccattct cttagcgcaa ctacagagaa 2460
caggggcaca aacaggcaaa aaacgggcac aacctcaatg gagtgatgca acctgcctgg 2520
agtaaatgat gacacaaggc aattgaccca cgcatgtatc tatctcattt tcttacacct 2580
tctattacct tctgctctct ctgatttgga aaaagctgaa aaaaaaggtt gaaaccagtt 2640
ccctgaaatt attcccctac ttgactaata agtatataaa gacggtaggt attgattgta 2700
attctgtaaa tctatttctt aaacttctta aattctactt ttatagttag tctttttttt 2760
agttttaaaa caccaagaac ttagtttcga ataaacacac ataaacaaac aaactcgaga 2820
tgggtgggtc gtacccatac gatgttcctg actatgcggg ctatccctat gacgtcccgg 2880
actatgcagc aactttgtat aataaagttg aacgagaaac gtaaaatgat ataaatatca 2940
atatattaaa ttagattttg cataaaaaac agactacata atactgtaaa acacaacata 3000
tccagtcact atggcggccg cgggctagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 3060
tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 3120
cagctatgac catgattacg ccaagcttgc atgcctgccg gtcgactctc gaggatcccc 3180
gggtacctag ctcgaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 3240
gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 3300
aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag ctaacactat aaaaagctga 3360
tgcagacggg gcttttttct gcaggtcgac catagtgact ggatatgttg tgttttacag 3420
tattatgtag tctgtttttt atgcaaaatc taatttaata tattgatatt tatatcattt 3480
tacgtttctc gttcagcttt cttgtacaaa gtggttggtg gtggcggata cccatacgat 3540
gttcctgact atgcgggcta tccctatgac gtcccggact atgcaggatc ctatccatat 3600
g 3601

Claims (9)

1.一种重组载体，其特征在于，是将SEQ ID NO.1所示DNA序列插入pPrey-PartnerSUS-2in1-Dest载体的NruI和NdeI位点之间获得的，命名为pKY2in1-Dest。
2.一种含有钾通道基因以及其它调控蛋白基因的表达载体，其特征在于，是将钾通道基因以及其它调控蛋白基因通过Gateway克隆反应一步转入权利要求1所述的pKY2in1-Dest获得的。
3.一种基因工程菌，其特征在于，是将权利要求2所述的表达载体转入钾吸收缺陷酵母R5421获得的。
4.权利要求3所述基因工程菌在筛选影响钾离子通道钾吸收功能的调控蛋白中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将待测蛋白基因和钾离子通道基因通过BP反应分别重组到gateway载体，获得待测蛋白-入门克隆和钾离子通道-入门克隆；
S2、将待测蛋白-入门克隆、钾离子通道-入门克隆和pKY2in1-Dest载体通过LR反应重组，转化至钾吸收缺陷酵母R5421，获得基因工程菌；将钾离子通道-入门克隆和pKY2in1-Dest载体通过LR反应重组，转化至钾吸收缺陷酵母R5421，获得对照菌；
S3、将基因工程菌和对照菌于含不同钾浓度的培养基中培养，检查并对比二者生长情况。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述钾离子通道基因为KAT1基因。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述gateway载体为pDONR221载体。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述培养基为CSM-L氨基酸缺陷培养基。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，S3的结果判定是：与对照菌相比，基因工程菌能在更低钾浓度下生长，则表明待测蛋白能够促进钾离子通道活性，提高钾离子通道钾吸收功能；反之，基因工程菌在更高钾浓度下才能生长，则表明待测蛋白能够抑制钾离子通道活性，降低钾离子通道钾吸收功能。
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