CN109517839A - 一种渗透液与一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法 - Google Patents

一种渗透液与一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法 Download PDF

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CN109517839A CN201811480483.4A CN201811480483A CN109517839A CN 109517839 A CN109517839 A CN 109517839A CN 201811480483 A CN201811480483 A CN 201811480483A CN 109517839 A CN109517839 A CN 109517839A
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Abstract

本发明提供一种渗透液与一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法，属于植物生物学技术领域，包括Triton X‑100和Silwet L‑77等。将渗透液与单克隆菌体混合调混合液的OD600值为0.6～1.2，对草莓未开的花蕾侵染，从开花到T1代阳性植株，仅6个月，对比例从取叶片到开花结果得T1代阳性植株至少14个月，本发明缩短8个月。本发明的转化方法中包括浸花后的草莓种子的荧光检测、幼苗抗生素筛选及幼苗荧光检测阳性植株，对T1代植株催芽，长出胚芽的种子检测荧光初步判断阳性种子，再置于抗生素溶液浸湿的滤纸上生长，具有叶柄的小三叶植株时，再通过叶片颜色判断阳性植株，后通过荧光验证阳性植株。

Description

一种渗透液与一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传 转化方法
技术领域
本发明涉及植物生物学技术领域，具体涉及一种渗透液与一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法。
背景技术
与果树植物相比，草莓具有植株矮小、生产周期短、占地面积小、结果量多、结果时间长、遗传转化体系成熟，且与果树尤其是蔷薇科果树亲缘关系近的优点。草莓现已成为果树学科研究功能基因组的模式植物。
目前常用的稳定草莓转基因方法为农杆菌介导叶盘法，根癌农杆菌介导叶盘法是草莓遗传转化的主要方法，该方法是将草莓植株离体叶片等用根癌农杆菌侵染，产生愈伤组织，经多次愈伤筛选培养，生芽、生根、移栽、检测，最后获得转基因T0代植株，从开始转化到植株移栽，至少需要8个月的时间；待T0代植株开花结果后才能获得T0代种子即T1代植株，经检测为阳性的才是真正转基因T1代植株，至少需要6个月；采用农杆菌介导叶盘法从开始转化到获得转基因T1代草莓植株前后至少共需14个月。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种渗透液，能够缩短获得转基因T1代草莓阳性植株的时间。
本发明提供了一种渗透液，以水为溶剂，包括以下的组分：MS培养基1.5～2.5g/L，蔗糖40～60g/L，Triton X-100 300～500μL/L,Silwet L-77 300～500μL/L，6-苄氨基腺嘌呤15～100μg/L，吲哚丁酸2～10μg/L和乙酰丁香酮200～400mg/L；所述渗透液的pH值为5.0～6.5。
本发明还提供了一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法，包括以下步骤：
1)通过匍匐茎繁殖的草莓子苗种植于营养土中，培养至现蕾；
2)将转化载体与农杆菌感受态细胞混合后依次进行第一冰浴、液氮处理、水浴和第二冰浴，再与复苏培养基混合，混合后进行涂皿培养，得到单克隆菌落；
3)将所述步骤2)得到的单克隆菌落接种于LB液体培养基中培养，得到培养液；
4)将所述步骤3)得到的培养液与LB液体培养基混合、培养调整至OD600值为0.8～1.2，离心收集单克隆菌体；
5)将所述步骤4)得到的单克隆菌体与渗透液混合，调节得到的菌体悬浮液的OD600值为1.0～1.5，得到浸花液；
6)将所述步骤1)得到的花蕾浸入步骤5)得到的浸花液中，得到浸花后的草莓植株；
7)将浸花后的草莓植株的种子在3～5℃下贮藏2周，得到贮藏种子；将所述贮藏种子进行催芽处理，得到发芽种子；
8)将步骤7)所述发芽种子在荧光下进行观察，将在荧光下发绿色荧光的发芽种子初步确定为阳性结果；
9)将所述初步确定为阳性结果的发芽种子置于滤纸上进行生长，待长出3小叶具有叶柄植株时，植株叶片绿，再次确定为阳性结果；植株叶片黄，为阴性结果；
10)将再次确定为阳性结果的植株的根、茎和叶在荧光下均显示绿色荧光，浸花后的草莓植株转化成功；
所述滤纸被浓度为5～10μg/mL的卡那霉素溶液浸透；
所述步骤1)与步骤2)-6)没有时间顺序限制。
优选的，所述步骤6)中的花蕾浸入浸花液的时间为0.5～5min。
优选的，所述浸花液的OD600值为0.6～1.2。
优选的，所述步骤2)中的转化载体包括pK7WG2D，所述pK7WG2D包含有新霉素磷酸转移酶基因和绿色荧光蛋白基因。
优选的，所述步骤2)中的转化载体pK7WG2D的质量与农杆菌感受态细胞的体积比为(0.5～1.5)μg:(150～250)μL。
优选的，所述步骤2的复苏培养基以水为溶剂，包括以下组分：胰蛋白胨5～15g/L，酵母提取物3～8g/L，NaCl 5～15g/L，所述复苏培养基的pH值为6.5～7.5。
优选的，所述步骤3)和4)中的LB液体培养基以水为溶剂，独立的包括以下组分：胰蛋白胨5～15g/L，酵母提取物3～8g/L，NaCl 5～15g/L，壮观霉素40～60mg/L，所述LB液体培养基的pH值为6.5～7.5。
优选的，所述步骤4)中的培养液与LB液体培养基的体积比为(3～8):(450～550)。
本发明提供了一种渗透液，以水为溶剂，包括以下的组分：MS培养基1.5～2.5g/L，蔗糖40～60g/L，Triton X-100 300～500μL/L,Silwet L-77300～500μL/L，6-苄氨基腺嘌呤15～100μg/L，吲哚丁酸2～10μg/L和乙酰丁香酮200～400mg/L；所述渗透液的pH值为5.0～6.5。
本发明实施例的结果显示：采用本发明提供的渗透液与单克隆菌体混合，调节菌体悬浮液的OD600值后，处理草莓未开放的花蕾，共收获草莓种子1772颗，播种后发芽1418颗，发芽率达80％，在发芽的种子中检测GFP荧光发现呈现荧光种子有40粒，发芽后叶片为绿色且有GFP荧光幼苗17棵，转化率为1.19％；与对比例1相比，本发明对草莓未开放的花蕾进行侵染处理，能够缩短获得转化草莓的时间，本发明从定植、开花转化到获得T1代阳性植株，需要的时间仅为6个月，与对比例1(从选取叶片进行经愈伤组织培养阶段的遗传转化，到产生植株获得T0代阳性植株，至少需要8个月的时间，从T0代阳性植株获得T1代阳性植株，至少需要6个月)相比，需要的时间共缩短了至少8个月。
本发明将将初步鉴定阳性转化子的种子在4℃下贮藏2周后，在25℃下发芽，待发芽后，将其直接在荧光显微镜下检测，即可初步鉴定阳性转化子，但是由于种皮干扰，会有假阳性出现，为了更准确鉴定阳性转化子；将发芽的草莓种子放于培养皿内，培养皿下垫3层浸湿滤纸，盖上皿盖，滤纸被5～10μg/mL的卡那霉素溶液浸湿选择，待长出3小叶具有叶柄植株时，阳性植株叶片绿，非阳性植株叶片较黄，即可再次判断阳性转化子，为了防止抗生素分布不均和人为检测差异，最后通过荧光显微镜检测荧光颜色号，能更准备确定幼苗转化效率。
附图说明
图1为转化载体pK7WG2D的结构示意图；
图2为种子、幼苗荧光检测图。
具体实施方式
本发明提供了一种渗透液，以水为溶剂，包括以下的组分：MS培养基1.5～2.5g/L，蔗糖40～60g/L，TritonX-100 300～500μL/L，Silwet L-77 300～500μL/L，6-苄氨基腺嘌呤15～100μg/L，吲哚丁酸2～10μg/L和乙酰丁香酮200～400mg/L；所述渗透液的pH值为5.0～6.5。
本发明提供的渗透液以水为溶剂包括1.5～2.5g/L的MS培养基，优选为1.8～2.3g/L，更优选为2.15g/L。本发明对所述MS培养基的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。
本发明提供的渗透液以水为溶剂包括40～60g/L的蔗糖，优选为45～55g/L，更优选为50g/L。
本发明提供的渗透液以水为溶剂包括300～500μL/L的SilweetL-77，优选为350～450μL/L，更优选为400μL/L。本发明对所述SilweetL-77的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。
本发明提供的渗透液以水为溶剂包括300～500μL/L的Triton X-100，优选为350～450μL/L，更优选为400μL/L。本发明对所述Triton X-100的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明中，所述Silweet L-77和Triton X-100为表面活性剂，具有超级展扩能力，帮助溶液更有效更大范围地接触花药等转化受体。
本发明提供的渗透液以水为溶剂包括15～100μg/L的6-苄氨基腺嘌呤，优选为20～80μg/L，更优选为50μg/L。本发明对所述6-苄氨基腺嘌呤的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明中，所述6-苄氨基腺嘌呤的作用为：载体进入花粉受体的生长激素，通过提高花粉的萌发、开裂，促进花粉管生长，提高转化效率。
本发明提供的渗透液以水为溶剂包括2～10μg/L吲哚丁酸，优选为3～8μg/L，更优选为5μg/L。本发明对所述吲哚丁酸的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明中，所述吲哚丁酸的作用为：载体进入花粉受体的生长激素，通过提高花粉的萌发、开裂，促进花粉管生长，提高转化效率。
本发明提供的渗透液以水为溶剂包括200～400mg/L的乙酰丁香酮，优选为250～350mg/L，更优选为300mg/L。本发明对所述乙酰丁香酮的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明中，所述乙酰丁香酮作为诱导性的酚类化合物，通过诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进农杆菌T-DNA的加工与转移，使农杆菌T-DNA更易进入植株基因组并与其整合。
本发明还提供了一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法，包括以下步骤：1)将通过匍匐茎繁殖的草莓子苗种植于营养土中，培养至现蕾期；2)将转化载体与农杆菌感受态细胞混合后依次进行第一冰浴、液氮处理、水浴和第二冰浴，再与复苏培养基混合，混合后进行涂皿培养，得到单克隆菌落；3)将所述步骤2)得到的单克隆菌落接种于LB液体培养基中培养，得到培养液；4)将所述步骤3)得到的培养液与LB液体培养基混合、培养调整至OD600值为0.8～1.2，离心收集单克隆菌体；5)将所述步骤4)得到的单克隆菌体与上述技术方案提供的渗透液混合，调节得到的菌体悬浮液的OD600值为1.0～1.5，得到浸花液；6)将所述步骤1)得到的花蕾浸入步骤5)得到的浸花液中，得到浸花后的草莓植株；7)将浸花后的草莓植株的种子在3～5℃下贮藏2周，得到贮藏种子；将所述贮藏种子进行催芽处理，得到发芽种子；8)将步骤7)所述发芽种子在荧光下进行观察，将在荧光下发绿色荧光的发芽种子初步确定为阳性结果；9)将所述初步确定为阳性结果的发芽种子置于滤纸上进行生长，待长出3小叶具有叶柄植株时，植株叶片绿，再次确定为阳性结果；植株叶片黄，为阴性结果；10)将再次确定为阳性结果的植株的根、茎和叶在荧光下均显示绿色荧光，浸花后的草莓植株转化成功；所述滤纸被浓度为5～10μg/mL的卡那霉素溶液浸透；所述步骤1)与步骤2)-6)没有时间顺序限定。
本发明将通过匍匐茎繁殖的草莓子苗种植于营养土中，培养至现蕾期。本发明对草莓子苗没有特殊要求，采用本领域技术人员常规选用的二倍体和/八倍体草莓的子苗即可。
在本发明中，所述营养土优选包括泥炭土、珍珠岩和蛭石；所述泥炭土与珍珠岩、蛭石的质量比优选为(3～8):(1～5):(0.5～1.5)，更优选为(4～7):(2～4):(0.8～1.2)，最优选为6:3:1。本发明对所述泥炭土、珍珠岩和蛭石的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明中，所述营养土优选用水浸透后，再撒播草莓种子。
本发明将所述通过匍匐茎繁殖的草莓子苗种植于营养土上，培养至现蕾期。在本发明中，所述培养优选采用光暗交替进行培养，所述光暗交替培养优选光培养后再暗培养。在本发明实施例中具体优选为单次12～20h光培养，单次4～12h暗培养，更优选为14～18h光培养，6～10h暗培养，最优选为16h光培养，8h暗培养。在本发明中，所述光培养的光照强度优选为300～1400μM m-2s-1，更优选为500μM m-2s-1。在本发明中，所述光培养的温度优选为20～28℃，更优选为22～26℃，最优选为24℃；所述暗培养的温度优选为12～20℃，更优选为14～18℃，最优选为16℃。
本发明将转化载体与农杆菌感受态细胞混合后依次进行第一冰浴、液氮处理、水浴和第二冰浴，再与复苏培养基混合，混合后进行涂皿培养，得到单克隆菌落。
在本发明中，所述转化载体优选包括pK7WG2D，所述pK7WG2D包含有新霉素磷酸转移酶基因和绿色荧光蛋白基因，所述pK7WG2D的结构如图1所示，所述转化载体从左往右依次含有35S启动子、绿色荧光蛋白基因、35S启动子和新霉素磷酸转移酶基因。本发明对所述pK7WG2D的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。
在本发明中，所述农杆菌感受态细胞优选为LBA4404农杆菌感受态细胞或GV3101农杆菌感受态细胞，在本发明实施例中优选为GV3101农杆菌感受态细胞。本发明对所述农杆菌感受态细胞的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。
在本发明中，所述pK7WG2D的质量与农杆菌感受态细胞的体积比优选为(0.5～1.5)μg:(150～250)μL，更优选为(0.8～1.2)μg:(180～220)μL，最优选为1μg:200μL。
本发明将所述pK7WG2D与农杆菌感受态细胞混合后依次进行第一冰浴、液氮处理、水浴和第二冰浴，得到第二冰浴混合物。
在本发明中，所述第一冰浴的时间优选为25～35min，更优选为28～32min，最优选为30min。
在本发明中，所述液氮处理的时间优选为3～8min，更优选为4～6min，最优选为5min。
在本发明中，所述水浴的温度优选为25～45℃，更优选为30～40℃，最优选为37℃；所述水浴的时间优选为3～8min，更优选为4～7min，最优选为5min。
在本发明中，所述第二冰浴的时间优选为1～3min，更优选为2min。
本发明将得到的第二冰浴混合物与复苏培养基混合进行复苏培养，得到涂皿混合物。在本发明中，所述第二冰浴混合物与复苏培养基的体积比优选为(50～100):(400～800)。
在本发明中，所述复苏培养基以水为溶剂，优选包括以下组分：胰蛋白胨5～15g/L，酵母提取物3～8g/L，NaCl 5～15g/L；更优选包括胰蛋白胨5～15g/L，酵母提取物3～8g/L，NaCl 5～15g/L；最优选包括胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。在本发明中，所述复苏培养基的pH值优选为6.5～7.5，更优选为6.8～7.2，最优选为7.0。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明中，所述复苏培养基优选经过灭菌后使用，本发明对所述灭菌的条件没有特殊限定，采用本领域技术人员常规培养基灭菌的条件即可。
在本发明中，将得到的第二冰浴混合物与复苏培养基混合进行复苏培养；所述复苏培养的条件优选包括：所述复苏培养的温度优选为25～35℃，更优选为27～30℃，最优选为28℃；所述复苏的转速优选为150～230rpm，更优选为170～200rpm，最优选为180rpm；所述复苏的时间优选为3～6h，更优选为4～5h。
本发明将涂皿混合物涂布到平皿上进行培养，得到单克隆菌落。本发明对所述涂皿混合物涂布使用的平皿的规格没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的即可，本发明对所述涂皿混合物涂布的量没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的即可，本发明对所述平皿中盛放的培养基的量没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的量即可。
本发明将得到的单克隆菌落接种于LB液体培养基中培养，得到培养液。在本发明中，所述单克隆菌落与LB液体培养基的体积比优选为(0.5～1.5):(80～120)，更优选为(0.8～1.2):(90～110)，最优选为1:100。
在本发明中，所述LB液体培养基以水为溶剂，优选包括以下组分：胰蛋白胨5～15g/L，酵母提取物3～8g/L，NaCl 5～15g/L，壮观霉素40～60mg/L；更优选包括胰蛋白胨8～12g/L，酵母提取物4～6g/L，NaCl 8～12g/L，壮观霉素45～55mg/L；最优选包括胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，壮观霉素50mg/L。在本发明中，所述LB液体培养基的pH值优选为6.5～7.5，更优选为6.8～7.2，最优选为7.0。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。本发明中，所述LB培养基优选经过灭菌后使用，本发明对所述灭菌的条件没有特殊限定，采用本领域技术人员常规培养基灭菌的条件即可。
在本发明中，所述单克隆菌落接种于LB液体培养基中培养，所述培养的条件优选包括：所述培养的温度优选为25～32℃，更优选为26～30℃，最优选为28℃；所述培养的转速优选为200～300rpm，更优选为220～280rpm，最优选为280rpm；所述培养的时间优选为25～35h，更优选为28～32h，最优选为30h。
本发明将得到的培养液与LB液体培养基混合、调整至OD600值为0.8～1.2，离心收集单克隆菌体。在本发明中，所述培养液与LB液体培养基的体积比优选为(3～8):(450～550)，更优选为(4～6):(480～520)，最优选为5:500。在本发明中，所述培养液的OD600值为0.4～1.4，更优选为0.6～1.3，最优选为0.65～1.2。
在本发明中，所述培养过夜的条件优选包括：培养的温度为25～35℃，培养的转速为200～300rpm；所述培养的温度优选为25～35℃，更优选为26～30℃，最优选为28℃；所述培养的转速优选为200～300rpm，更优选为220～280rpm，最优选为250rpm。
在本发明中，所述离心收集菌体的条件优选包括：离心的温度为1～8℃，离心的时间为5～15min，离心的转速为2500～3500rpm；所述离心的温度优选为1～8℃，更优选为2～6℃，最优选为4℃；所述离心的时间优选为5～15min，更优选为8～12min，最优选为10min；所述离心的转速优选为2500～3500rpm，更优选为2800～3200rpm，最优选为3000rpm。本发明对所述离心使用的设备没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的设备即可，如离心机。
本发明将收集得到的单克隆菌体与渗透液混合，调节得到的菌体悬浮液OD600值为1.0～1.5，得到浸花液。
在本发明中，所述渗透液以水为溶剂，包括以下的组分：MS培养基1.5～2.5g/L，蔗糖40～60g/L，Triton X-100 300～500μL/L，Silwet L-77 300～500μL/L，6-苄氨基腺嘌呤15～100μg/L，吲哚丁酸2～10μg/L和乙酰丁香酮200～400mg/L；优选包括MS培养基1.8～2.3g/L，蔗糖45～55g/L，Silwet L-77 350～450μL/L，Triton X-100 350～450μL/L，6-苄氨基腺嘌呤20～80μg/L，吲哚丁酸3～8μg/L和乙酰丁香酮250～350mg/L；更优选包括MS培养基2.15g/L，蔗糖50g/L，SilweetL-77 400μL/L，Triton X-100 400μL/L，6-苄氨基腺嘌呤50μg/L，吲哚丁酸5μg/L和乙酰丁香酮300mg/L。在本发明中，所述渗透液的pH值为5.0～6.5，优选为5.5～6.0，更优选为5.8。本发明对所述MS培养基的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明中，所述渗透液的作用为更高效提高转化效率。在本发明中，所述6-苄氨基腺嘌呤和吲哚丁酸的作用为：载体进入花粉受体的生长激素，通过提高花粉的萌发、开裂，促进花粉管生长，提高转化效率；所述Silwet L-77和Triton X-100的作用为表面活性剂，具有超级展扩能力，帮助溶液更有效更大范围地接触花药等转化受体，单独使用效果较两者共同作用要差；所述乙酰丁香酮通过诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进农杆菌T-DNA的加工与转移，使农杆菌T-DNA更易进入植株基因组并与其整合。
在本发明中，所述浸花液的OD600值为0.6～1.2。
本发明将现蕾期草莓的花蕾浸入浸花液中，得到浸花后的草莓植株。在本发明中，所述花蕾的浸入方式优选为将花蕾倒放浸入浸花液中，所述花蕾优选采用未开放的花蕾。所述花蕾浸入浸花液后，轻轻搅动浸花液，使浸花液覆于花序上。
在本发明中，所述花蕾浸入浸花液的时间优选为0.5～5min，更优选为1.0～2.5min。
本发明优选将浸花后的草莓植株竖放，浇水保湿，全部覆盖保鲜膜，黑暗的条件下生长24h后，置于光照强度为300μM m-2s-1～1400μM m-2s-1条件下生长，直至开花结果收集草莓种子。
本发明对收集草莓种子的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的方法即可，在本发明实施例中具体为用小刀削取薄薄的一层草莓果实的果皮，在20～25℃下晾晒2～4天后，收集草莓种子。
本发明将浸花后的草莓植株的种子在3～5℃下贮藏2周，得到贮藏种子；将所述贮藏种子进行催芽处理，得到发芽种子。
本发明将所述发芽种子在荧光下进行观察，将在荧光下发绿色荧光的发芽种子初步确定为阳性结果。
本发明将所述初步确定为阳性结果的发芽种子置于滤纸上进行生长，待长出3小叶具有叶柄植株时，植株叶片绿，再次确定为阳性结果；植株叶片黄，为阴性结果。
本发明将再次确定为阳性结果的植株的根、茎和叶在荧光下均显示绿色荧光，转化后的草莓植株转化成功。
在本发明中，所述滤纸被浓度为5～10μg/mL的卡那霉素溶液浸透。
本发明优选使用荧光显微镜在荧光下观察浸花后的长出3小叶具有叶柄草莓植株。
本发明对所述贮藏种子进行催芽处理的方法没有特殊限定，采用常规催芽草莓种子的方法即可。
在本发明中，将浸花后的草莓植株的种子在3～5℃下贮藏2周能够提高草莓种子的发芽率以及保证草莓种子发芽的一致性。
下面结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
通过匍匐茎繁殖的草莓子苗种植于营养土中，培养至现蕾期，在24℃，光照强度300-1400μM m-2s-1下光照16h，在16℃下暗培养8h，光暗交替培养，直至到草莓的现蕾期。营养土的组分为泥炭土、珍珠岩和蛭石，泥炭土与珍珠岩、蛭石的质量比为6:3:1。
将1μg转化载体pK7WG2D转入200μL GV3101农杆菌感受态细胞，枪头吸打匀，然后进行第一冰浴30min，液氮处理5min，37℃水浴5min，第二冰浴2min，得到第二冰浴混合物，第二冰浴混合物与400μL复苏培养基混合后进行复苏培养，在28℃、180rpm条件下复苏培养4h，培养后进行涂皿，涂皿后在28℃下培养2d后选取单克隆菌落。转化载体pK7WG2D包含有新霉素磷酸转移酶基因和绿色荧光蛋白基因；复苏培养基以水为溶剂，包括胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，复苏培养基的pH值为7.0。
将单克隆菌落接种于5ml LB液体培养基中，在28℃、250rpm条件下培养30h，得到培养液；将5ml培养液转移到500mL的LB液体培养基中，在28℃、250rpm条件下培养过夜，至OD600＝0.8，培养过夜后在4℃、3000rpm条件下离心10min收集单克隆菌体；将收集的单克隆菌体与渗透液混合，调整得到的菌体悬浮液的OD600为1.0，得到浸花液；将浸花液倒入直径为10cm的培养皿里，轻轻摇放后静置1min，将草莓倒置，使未开放的花蕾朝下浸入浸花液1min，并轻轻搅动，有水珠覆于花序上，得到转化后的草莓植株。将转化后的草莓植株竖放，浇水保湿，盖好保鲜膜，黑暗的条件下生长24h后，置于光照强度为500μM m-2s-1条件，直到开花结果收集种子；LB液体培养基以水为溶剂，包括10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸出物，5g/L氯化钠，壮观霉素50mg/L，pH7.0；渗透液以水为溶剂，包括以下的组分：MS培养基2.15g/L，蔗糖50g/L，SilweetL-77 400μL/L，Triton X-100 400μL/L，6-苄氨基腺嘌呤20μg/L，乙酰丁香酮300mg/L，pH值为5.8；渗透液的OD600值为0.8。
用小刀削取薄薄的一层草莓果实的果皮，在20～25℃下晾晒2～4天后，收集草莓种子。
草莓种子直接在荧光显微镜下检测，即可初步鉴定阳性转化子，由于种皮干扰，会有假阳性出现，为了更准确鉴定阳性转化子，将初步鉴定阳性转化子的种子在4℃下贮藏2周后用于发芽，将草莓种子放于培养皿内，培养皿下垫3层浸湿滤纸，盖上皿盖，在25℃下发芽，待发芽后，滤纸被8μg/mL的卡那霉素浸湿选择，待长出3小叶具有叶柄植株时，阳性植株叶片绿，非阳性植株叶片较黄，再通过荧光显微镜检测植株的根、茎和叶均显示绿色荧光为阳性，若为红色荧光即为阴性，能更准备确定幼苗转化效率。显示阳性结果见图2。
转化效率评价指标：
转化效率(％)＝荧光种子或植株×100/总种子数。
采用本发明的转化方法，共收获草莓种子1772颗，播种后发芽1418颗，发芽率达80％，在发芽的种子中检测GFP荧光发现呈现荧光种子有40粒，发芽后有叶片绿色和GFP荧光的幼苗17棵，转化率为1.19％，从植株播种到获得转基因阳性植株，需要的时间为6个月。
对比例1
草莓‘红颜’高效快速稳定基因转化方法
1、菌种活化
1)将含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105在固体培养基上划线，28℃培养2天；其中固体培养基为：LB固体培养基50mL+壮观霉素50mg/L+利福平100mg/L；其中LB固体培养基配方：每一升LB固体培养基中包含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g以及琼脂15g。
2)挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50mL液体培养基中，28℃，220rpm在摇床中振荡培养至OD600值0.4(约12-16h)；其中液体培养基为：LB液体培养基50mL+壮观霉素50mg/L+利福平100mg/L；其中LB液体培养基配方：每一升LB液体培养基中包含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。
3)常温下，5000rmp离心8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100mLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定OD600值为0.2，此数据为最佳。活化好的菌液可以用来做下一步植物材料侵染。
2、植物材料准备
取在草莓继代培养基FMS1上继代草莓“红颜”组培苗上的幼嫩、平展的30天叶龄的叶片，剪去剪去叶尖和叶缘，剪成大约0.4cm2的叶块用于菌液侵染。尽量使得草莓叶片上四周都有伤口，这样剪容易长愈伤。FMS1培养基：MS4.4g/L，蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，6-BA0.5mg/L，NAA0.1mg/L，pH5.8高压灭菌，备用。
3、侵染
将悬浮的菌液倒入剪好的叶片中，轻微摇匀，浸染40分钟，过程中每隔5分钟摇动一次，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液。
4、共培养
侵染后的叶片接种在草莓共培养基FMS2中，25±2℃培养箱中黑暗培养3天。FMS2培养基：MS4.4g/L，蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，TDZ 2mg/L，2,4-D 0.1mg/L，pH5.8，高压灭菌，冷却至60℃左右分装平板备用。
5、筛选培养
将共培养3天的草莓‘红颜’叶片，接种在草莓筛选培养基FMS3上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2℃，光照培养。培养20天左右，草莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，大大减小下一步工作量。保留下的抗性愈伤经过约40d左右的培养以后，可分化出抗性植株。此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉。FMS3培养基：MS4.4g/L，蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，TDZ 2mg/L，2,4-D 0.1mg/L，pH5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素0-50mg/L，羧苄青霉素100-400mg/L分装培养瓶备用。
6、生根培养
抗性植株长到大约2-3厘米高时，将抗性植株转入草莓生根筛选培养基FMS4上生根，1个月内获得完整的抗性苗。此时的抗性苗还不能完全确定是不是转基因苗，因此需要再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄都发亮绿光的可以确定。FMS4培养基：MS4.4g/L，蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，IBA 0.1mg/L，pH5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素0-50mg/L，羧苄青霉素100-400mg/L分装培养瓶备用。
此时获得的抗性苗为转基因阳性幼苗(T0代阳性苗)，从转化到获得的至少需要8个月；之后将T0代幼苗培养长到开花至少需要2个月，从开花再到收获T1代种子，至少需要2个月，再播种进行T1代阳性苗鉴定，至少需要2个月；前后共需的时间至少为14个月。
由以上实施例和对比例可以得出，采用本发明提供渗透液转化草莓，6个月就能够得到转化植株，而采用对比例1的方法需要14个月才能够得到转化植株，与对比例1相比，本发明缩短了8个月的时间，而且得到的转化率为1.19％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种渗透液，以水为溶剂，包括以下的组分：MS培养基1.5～2.5g/L，蔗糖40～60g/L，Triton X-100 300～500μL/L，Silwet L-77 300～500μL/L，6-苄氨基腺嘌呤15～100μg/L，吲哚丁酸2～10μg/L和乙酰丁香酮200～400mg/L；
所述渗透液的pH值为5.0～6.5。
2.一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法，包括以下步骤：
1)将通过匍匐茎繁殖的草莓子苗种植于营养土中，培养至现蕾期；
2)将转化载体与农杆菌感受态细胞混合后依次进行第一冰浴、液氮处理、水浴和第二冰浴，再与复苏培养基混合，混合后进行涂皿培养，得到单克隆菌落；
3)将所述步骤2)得到的单克隆菌落接种于LB液体培养基中培养，得到培养液；
4)将所述步骤3)得到的培养液与LB液体培养基混合、培养调整至OD600值为0.6～1.0，离心收集单克隆菌体；
5)将所述步骤4)得到的单克隆菌体与权利要求1所述的渗透液混合，调节得到的菌体悬浮液的OD600值为0.6～1.2，得到浸花液；
6)将所述步骤1)得到的花蕾浸入步骤5)得到的浸花液中，得到浸花后的草莓植株；
7)将浸花后的草莓植株的种子在3～5℃下贮藏2周，得到贮藏种子；将所述贮藏种子进行催芽处理，得到发芽种子；
8)将步骤7)所述发芽种子在荧光下进行观察，将在荧光下发绿色荧光的发芽种子初步确定为阳性结果；
9)将所述初步确定为阳性结果的发芽种子置于滤纸上进行生长，待长出3小叶具有叶柄植株时，植株叶片绿，再次确定为阳性结果；植株叶片黄，为阴性结果；
10)将再次确定为阳性结果的植株的根、茎和叶在荧光下均显示绿色荧光，浸花后的草莓植株转化成功；
所述滤纸被浓度为5～10μg/mL的卡那霉素溶液浸透；
所述步骤1)与步骤2)-6)没有时间顺序限制。
3.根据权利要求2所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤6)中的花蕾浸入浸花液的时间为0.5～5min。
4.根据权利要求2～3任意一项所述的遗传转化方法，其特征在于，所述浸花液的OD600值为0.6～1.2。
5.根据权利要求2所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2)中的转化载体包括pK7WG2D，所述pK7WG2D包含有新霉素磷酸转移酶基因和绿色荧光蛋白基因。
6.根据权利要求2或5所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2)中的转化载体pK7WG2D的质量与农杆菌感受态细胞的体积比为(0.5～1.5)μg:(150～250)μL。
7.根据权利要求2所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2)中的复苏培养基以水为溶剂，包括以下组分：胰蛋白胨5～15g/L，酵母提取物3～8g/L，NaCl 5～15g/L，所述复苏培养基的pH值为6.5～7.5。
8.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)和4)中的LB液体培养基以水为溶剂，独立地包括以下组分：胰蛋白胨5～15g/L，酵母提取物3～8g/L，NaCl 5～15g/L，壮观霉素40～60mg/L；所述LB液体培养基的pH值为6.5～7.5。
9.根据权利要求2所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4)中，培养液与LB液体培养基的体积比为(3～8):(450～550)。
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