CN109628483A - 一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，把人工改造的Bt‑cry1C基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证和PCR验证后，再经测序验证后，获得Bt‑cry1C基因山新杨质体转化载体pYY25；再用金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到2个阳性抗性芽，再经过3轮叶片抗性再生后，获得同质化的转Bt‑cry1C基因山新杨植株。本发明得到的质体转Bt‑cry1C基因山新杨对美国白蛾幼虫是高致死的，由此获得了一种高抗美国白蛾质体转Bt基因杨树新品种。

Description

一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
杨树(Populus L.)是杨属的植物，全属有约100多种，是世界上分布最广、适应性最强的树种。我国约62种(包括6杂交种)，其中分布中国的有57种，引入栽培的约4种，此外还有很多变种、变型和引种的品系。在中国分布范围跨北纬25°～53°，东经76°～134°，遍及东北、西北、华北和西南等地。
杨树是一种重要的经济林木和模式木本植物。杨树因速生丰产、实用性强、分布广、无性繁殖能力强，且基因组较小而成为研究林木生理和利用基因工程方法进行遗传改良的理想模式植物。杨树也是一种重要的可再生资源，杨木的用途很广。另外，杨树对环境保护也很重要，包括土地重新造林和污染土壤植物修复。
我国是世界上木材及木制品的生产大国，同时也是一个消费大国。人均占有森林资源很少的国家，1998年实施了天然林保护工程，使得我国木材供需矛盾更加突出。所以，种植杨树，不仅有巨大的经济效益，而且有很大的生态效益和社会效益。现我国已成为世界上杨树人工林面积最大的国家。对于我国来说，大力发展转基因杨树具有重大的意义，但由于杨树具有生长周期长、树体高大等特点以及杨树人工林容易发生大规模的虫害，而导致杨树发生虫害的害虫大多数是食叶类的害虫，危害杨树的鳞翅目害虫种类最多，有15科41种，以美国白蛾、春尺蠖食叶危害最大，舟蛾科、尺蛾科种类最为丰富，其中美国白蛾和杨扇舟蛾的幼虫危害最为严重。杨树虫害尤其对3年龄之内的杨树危害更大，极大地限制了杨树传统育种和栽培工作的开展。利用基因工程技术培育抗虫杨树品种已成为研究的热点之一。为了解决我国林木短缺，加快人工林的发展，急需进行优良抗虫杨树品种的开发和利用，在2001年批准了2种转Bt杨树可以进行商业化种植，分别是转Bt-cry1A基因的黑杨(Populus nigra)和转Bt-cry1Ac基因和API(慈姑蛋白酶抑制剂)基因的741杨[P.alba(P.davidiana×P.simonii)×P.tomentosa]，使我国成为唯一批准转基因杨树商业化种植的国家，目前，已有近22个抗虫杨树品种获准进行小规模田间试验、环境释放或中试生产，出于对转基因商业化的慎重，我国没有再批准新的商业杨树品种。
山新杨是一种优良的杨树品种，它以采自嫩江县高峰林场山杨为母本，父本新疆杨来源于乌鲁木齐，于1964年进行杂交组合，经20年栽培试验，表现良好，性状稳定。适应性强，抗逆性好，常用于防风固沙。树干通直，树皮光滑淡绿色，披白粉，20年生树皮尚未开裂，果序自然脱落且不飞絮。
近年来，质体基因转化技术成为植物基因工程研究的热点之一，质体基因转化有诸多的优点，如：母系遗传、高效表达、无基因沉默、无位置效应、无基因污染等优点，而山新杨的繁殖是无性繁殖、不飞絮等特点，使其质体转基因更安全。用质体转基因技术转抗虫基因到杨树质体中，既能够达到相应的抗虫效果，又增加了生物安全性。
综上所述，现有技术存在的问题是：
现有技术的杨树质体抗虫性能差，导致杨树利用短缺。
在抗虫性能，核转Bt基因杨树比质体转Bt基因杨树差，导致杨树利用短缺。
在基因的表达量方面，核转Bt基因杨树中Bt蛋白的表达量大多数较低，而且在杨树的各个组织中都有表达，在杨木中积累量较高。
核转Bt基因整合存在不确定性，容易造成位置效应。
在生物安全性方面，核转Bt基因杨树容易通过花粉使基因逃逸，农杆菌介导的转化容易造成带有Bt基因的农杆菌逃逸。
解决上述技术问题的难度：
目前所有的转Bt基因杨树均为核转基因，核转基因的缺点，如基因整合位点的不确定性、表达量不稳定和基因逃逸等，这些缺点目前较难克服。
解决上述技术问题的意义：
而与核转基因相比，质体转基因较好的解决了这些问题，如定点整合到叶绿体基因组中；表达产物固定在叶绿体中；母系遗传方式，不会通过花粉传播外源基因；基因表达量大都较高。这些优点使得质体转基因生物安全性更高。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法。
本发明是这样实现的，一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：
将Bt-cry1C基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切、PCR和测序验证后，获得Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体pYY25质粒；
用金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到阳性抗性芽，再经过叶片抗性再生后，获得同质化的转Bt-cry1C基因山新杨植株。
进一步，所述高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法具体包括：
步骤一，质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体的构建：以pBar13-cry1C质粒DNA为模板，用cry1C-F和cry1C-R这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增得到cry1C基因片段，然后把该基因片段克隆到平末端载体Simple上构建质粒pYY23；
用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切pYY23质粒DNA后得到的小片段与用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把经测序验证正确的重组子命名为pYY25，即为质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体；
步骤二，转Bt-cry1C基因山新杨植株的获得和分子鉴定：用0.6μm的金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪法导入山新杨基因组中，在含30mg/L壮观霉素的PaSIM1培养基上筛选抗性芽，阳性芽在含30mg/L壮观霉素的PaSIM2培养基上经过2-4轮的抗性筛选得到同质化的阳性芽，通过Southern blot检测阳性芽和达到同质化的阳性芽；通过筛选获得了2株同质化的阳性芽，把此阳性芽进一步的培养得到质体转Bt-cry1C基因山新杨组培苗。
进一步，步骤二后，还需进行：质体转Bt-cry1C基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型分析:把得到的2株同质化的质体转Bt-cry1C基因山新杨组培苗经过炼苗后，移栽到温室中生长。
进一步，质体转Bt-cry1C基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型分析后，还需进行：
转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白的定量分析:用Bt-cry1C蛋白ELISA检测试剂盒检测山新杨野生型和转基因山新杨植株上幼嫩叶片、成熟叶片、衰老叶片、根、表皮和木质部的样品中Bt蛋白的含量；
进一步，转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白的定量分析后，还需进行：转Bt-cry1C基因山新杨抗虫试验:山新杨野生型叶片和转Bt-cry1C基因山新杨叶片对美国白蛾的喂食试验。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明公开了通过基因枪转化法把人工改造的Bt-cry1C基因导入山新杨叶绿体基因组中，通过抗性筛选获得高抗美国白蛾的质体转Bt-cry1C基因山新杨植株。首先，把人工改造的Bt-cry1C基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证和PCR验证后，再经测序进一步验证后，获得了Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体，命名为pYY25。再用金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到2个阳性抗性芽，再经过3轮叶片抗性再生后，获得同质化的转Bt-cry1C基因山新杨植株。ELISA试验发现：质体转Bt-cry1C基因山新杨植株叶片中Bt-cry1C蛋白的表达量最高为20.74μg/g叶鲜重，而且Bt-cry1C蛋白在叶片中的积累量从嫩叶、成熟叶到衰老叶片急剧下降，嫩叶中Bt-cry1C蛋白的表达量是衰老叶片中的9倍左右。质体转Bt-cry1C基因山新杨叶片喂食美国白蛾幼虫发现：喂食质体转Bt-cry1C基因杨树叶片的美国白蛾1龄幼虫，2天后致死率为100％；喂食质体转Bt-cry1C基因山新杨叶片的美国白蛾2-4龄幼虫，3天后致死率为100％，而对照组美国白蛾几乎没有死亡。从而证明本发明得到的质体转Bt-cry1C基因山新杨对美国白蛾幼虫是高致死的，由此获得了一种高抗美国白蛾质体转Bt基因杨树新品种。
在杨树质体转化得到的转Bt-cry1C基因山新杨中Bt-cry1C基因蛋白的最高表达量为20.74μg/g叶鲜重，比核转Bt-cry1C基因其他植物中Bt-cry1C蛋白最高表达量(4.86μg/g叶鲜重)的4倍多，在杨树植株不同叶片Bt-cry1C蛋白的表达量在2.31-20.74μg/g叶鲜重之间波动，在根中未检测到Bt-cry1C蛋白的表达，而在表皮和木质部中检测微弱的表达，同样也是在不同的组织或器官中Bt-cry1C蛋白的表达量不同，但在不同株系中表达没有显著差异，这是由于质体转化是定点插入，且得到的质体转Bt-cry1C基因杨树是达到同质化的。另外，在温室生长的质体转Bt-cry1C基因山新杨植株和野生型山新杨植株在表型上没有明显差异，不影响植株的生长。
从转基因杨树对美国白蛾1龄幼虫的致死情况来看，质体转Bt-cry1C基因杨树的抗虫效果比Liu等(2016)和Yang等(2016)核转Bt-cry1Ac基因杨树的抗虫效果要好(如表1所示)，而且不管喂食质体转Bt-cry1C基因杨树叶片的年龄，均对美国白蛾有同样的致死效果。从人工改造Bt-cry1C基因在其他植物中的表达情况看，在杨树质体中表达cry1C蛋白的表达量是最高的，如表2所示。
表1转Bt基因杨树蛋白表达量和抗虫性比较
表2人工改造的cry1C基因在不同转基因植物中的积累量比较
从转Bt基因杨树的生物安全性：对于转基因生物安全评价和监管，国内和国外都建立了相应的评价体系、法律法规和监管机构。对于转Bt基因杨树除了关注自身的转化受体情况、转化用Bt基因种类的安全性、遗传方式和方法、Bt蛋白的表达量和杀虫效果、Bt蛋白在植物中的残留问题等，更多是关注基因流和基因的多效性和生态影响。对于本发明获得的质体转Bt-cry1C基因山新杨而言，本发明使用的转化受体是山新杨，山新杨是不飞絮的杨树；转化方式是质体转化，质体遗传方式是母系遗传；基因整合方式是定点整合；在筛选基因aadA的两端引入了loxP序列，可以通过Cre-loxP重组酶系统把aadA基因消除掉，这些设计增加了转基因的安全性，特别是解决基因流的问题。另外，在对得到的质体转Bt-cry1C基因山新杨的研究发现，转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白的表达量从幼嫩叶片、成熟叶片、衰老叶片、表皮、到木质部是急剧下降的，到了表皮和木质部含量很少，而在根中检测不到Bt-cry1C蛋白的表达，这对于经济林木杨树来说，是至关重要的，是较为安全的。目前，从Bt-cry1C蛋白的动物实验和转Bt-cry1C基因水稻生态方面的研究来看，转Bt-cry1C基因植物是安全的；从核转Bt基因杨树的生态方面的研究来看，转Bt基因杨树也是安全的。而从生物安全性和抗虫效果来看，质体转Bt-cry1C基因山新杨对美国白蛾1-4龄幼虫的3天致死率均为100％，质体转Bt-cry1C基因山新杨植株和野生型山新杨植株在表型上没有明显区别，所以质体转Bt基因杨树比核转Bt基因杨树更安全一些，对于Bt抗虫基因工程，最佳的效果是杀虫效果好，而且Bt蛋白的表达量要适量，减缓目标害虫对Bt蛋白抗性，转基因后不影响植物的正常生长，同时使用多种Bt基因或结合RNAi技术来抗虫。转基因植物对生态的影响是长期的，所以需要对转基因植物进行长期的观察研究，从而进一步确认其安全性，消除公众对转基因的担忧，以利于人们对转基因的认识、认可和接受，推动转基因植物的商业化进程。
附图说明
图1是本发明实施例提供的高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法流程图。
图2是本发明实施例提供的质粒pYY25构建图。
图3是本发明实施例提供的阳性芽的PCR检测泳道2、3、4和5检测cry1C基因是否导入质体基因组中(以JC-Pa-F和JC-Pa-R这对引物扩增)图。其中，泳道6、7、8和9检测cry1C基因是否导入细胞中(以基因特异性引物cry1C-F和cry1C-R这对引物扩增)。
图4是本发明实施例提供的质体转cry1C基因杨树质体基因组和分子鉴定图。
图中：A：Nde I酶切杨树基因组图；B：Southern blot检测图；C：Northern blot检测图。
图5是本发明实施例提供的质体转cry1C基因杨树表型图。
图6是本发明实施例提供的质体转cry1C基因杨树不同组织中cry1C蛋白积累和抗虫图。
图中：A：杨树各个组织示意图；B：质体转cry1C基因杨树不同组织中cry1C蛋白积累曲线；C：杨树不同叶片抗虫图。
图7是本发明实施例提供的质体转cry1C基因杨树叶片抗虫图A：喂食24小时后幼虫存活率；B：喂食48小时后幼虫存活率；C：喂食72小时后幼虫存活率；D：喂食24小时后，1龄幼虫对杨树叶片的损害情况图；E：喂食24小时后，2龄幼虫对杨树叶片的损害情况图；F：喂食24小时后，3龄幼虫对杨树叶片的损害情况图；G：喂食24小时后，4龄幼虫对杨树叶片的损害情况图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术的杨树质体抗虫性能差，导致杨树利用短缺
为解决上述问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。
如图1所示，本发明实施例提供的高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：
S101:质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体的构建：以pBar13-cry1C质粒DNA为模板，用cry1C-F和cry1C-R这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增cry1C基因序列，然后克隆到平末端载体Simple上构建了质粒pYY23。用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切pYY23质粒DNA后得到的小片段与用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把经测序验证正确的重组子命名为pYY25，即得到了质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体。
S102:转Bt-cry1C基因山新杨植株的获得和分子鉴定:用0.6μm的金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪法导入山新杨基因组中，在含30mg/L壮观霉素的PaSIM1培养基上筛选抗性芽，阳性芽在含30mg/L壮观霉素的PaSIM2培养基上经过2-4轮的抗性筛选即可得到同质化的阳性芽，通过Southern blot检测阳性芽和达到同质化的阳性芽。通过筛选获得了2株同质化的阳性芽，把此阳性芽进一步的培养得到质体转Bt-cry1C基因山新杨组培苗(Pa-YY25#3和Pa-YY25#4)。通过Northern blot分析显示，cry1C基因在叶绿体中成功转录。
S103:质体转Bt-cry1C基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型:把得到的2株同质化的质体转Bt-cry1C基因山新杨组培苗经过炼苗后，移栽到温室中生长，发现在温室中生长的转Bt-cry1C基因山新杨植株与野生型杨树植株在表型上没有明显差异。
S104:转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白的定量分析:用Bt-cry1C蛋白ELISA检测试剂盒检测山新杨野生型和转基因山新杨植株上幼嫩叶片、成熟叶片、衰老叶片、根、表皮和木质部的样品中Bt蛋白的含量。研究发现：在幼嫩叶片、成熟叶片、衰老叶片、表皮和木质部均检测到Bt-cry1C蛋白的存在，而根中却没有发现Bt-cry1C蛋白的存在。Bt-cry1C蛋白在植株不同部位表达量不同，Bt-cry1C蛋白表达量在幼嫩叶片＞成熟叶片＞衰老叶片＞表皮＞木质部。Bt-cry1C蛋白在幼嫩叶片表达量最高达到20.74μg/g叶鲜重，在幼嫩叶片中的表达量约是在成熟叶片中的表达量的3-4倍，在成熟叶片中的表达量是衰老叶片中表达量的2倍左右，而在表皮中的表达量则比在衰老叶片中表达量下降了10倍左右，在表皮中的表达量是在木质部中的表达的2-3倍，在木质部的表达量约为0.066-0.086μg/g鲜重。
S105:转Bt-cry1C基因山新杨抗虫试验:山新杨野生型叶片和转Bt-cry1C基因山新杨叶片对美国白蛾的喂食试验研究发现：美国白蛾1-4龄幼虫在分别喂食野生型叶片3天后几乎全部存活，而喂食质体转Bt-cry1C基因山新杨叶片的，3天后全部死亡。从美国白蛾对叶片损害程度来看：野生型叶片，随着美国白蛾幼虫年龄的增大，对叶片损害程度明显加大，到了4龄幼虫把叶片完全吃光，只留下主叶脉，而转Bt-cry1C基因山新杨叶片的损害程度，相对较小，只有零星的叶片被吃掉，虽然随着美国白蛾幼虫年龄的增大，叶片损害程度增大，但总体变化较小。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体的构建：
以pBar13-cry1C质粒DNA为模板，
用cry1C-F(5’GCGGCCGCCTACTTTTGTGCTCTTTCAAGGTCAGATT3’SEQ ID NO：2)和cry1C-R(5’CCATGGAGGAGAACAATCAGAACCAGTG3’SEQ ID NO：3)这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增cry1C基因序列，PCR产物经PCR洁净试剂盒纯化后，与平末端载体Simple连接后转化大肠杆菌XL10-gold，把得到的重组经PCR验证和酶切验证后，送测序公司测序验证，经验证正确的重组子命名为pYY23。用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切pYY23质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳后，切取对应的凝胶上的小片段胶块，用凝胶回收试剂盒回收，把得到小片段和用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把得到的重组子经PCR验证和酶切验证后，送测序公司测序验证，经验证正确的重组子命名为pYY25(带有cry1C基因)，即为质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体SEQ ID NO：1，见图2。
实施例2
用基因枪法把pYY25质粒DNA导入山新杨基因组和抗性芽的筛选：
用0.6μm的金粉包裹pYY25质粒DNA，利用Bio-Rad基因枪(PDS-1000/He)轰击杨树叶片，基因枪参数：氦气压为1100psi，轰击距离9cm(阻拦网到平铺的叶片距离为9cm)，真空度28。具体操作按基因枪操作手册进行，并参照杨树质体基因枪转化方法进行。经基因枪轰击后的叶片材料切成3*3mm大小，远轴面朝上置于含30mg/L壮观霉素的PaSIM1筛选培养基上直至抗性芽出现，在此培养基上每隔1-2月换1次培养基。筛选培养条件为：25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度：20-25μE·m-2·s-1。
实施例3
质体转Bt-cry1C基因山新杨植株的获得和分子鉴定：
转Bt-cry1C基因山新杨抗性芽的初步鉴定：取在30mg/L壮观霉素PaSIM2上生长的抗性芽的叶片和常规培养的野生型山新杨叶片，以提取其叶片总DNA为模板，用JC-Pa-F(5’GGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTGCAGTATTTG3’SEQ ID NO：4)和JC-Pa-R(5’CGGTACTTGTGATATTTCGGCTTG 3’SEQ ID NO：5)这对引物，经PCR检测，结果发现：以负对照和野生型对照没有扩增到与该基因大小(1903bp)相似的条带，而转Bt-cry1C基因山新杨Pa-YY25#3株系和Pa-YY25#4株系均扩增到与该基因大小(1903bp)相似的条带，则说明该基因转入了山新杨细胞中；以负对照和野生型对照没有扩增到1449bp大小的条带，而转基因植株扩增到1449bp大小的条带，则说明这些cry1C基因整合到了叶绿体基因组中，见图3。
转cry1C基因山新杨抗性芽的Southern blot分析：提取经PCR初步验证正确的转cry1C基因山新杨植株叶片和野生型山新杨植株叶片总DNA，用限制性内切酶Nde I将5μg山新杨野生型叶片总DNA和转基因山新杨叶片总DNA样品分别酶切后，经琼脂糖凝胶电泳后，通过半干转移法把RNA转移到尼龙膜上；以杨树基因组DNA为模板，用psaB-prpbe-F(5’TTAGCCAAAGGTGTACGTTCATGAG 3’SEQ ID NO：6)和psaB-prpbe-R(5’TTGCCCGGCTGGTTAAATGC3’SEQ ID NO：7)这对引物扩增得到的587bp的片段制备地高辛标记的psaB探针，探针的标记和杂交按照罗氏地高辛试剂盒手册进行操作。结果发现：野生型杨树叶片杂交出3504bp大小的带，转cry1C基因山新杨Pa-YY25#3株系和转cry1C基因山新杨Pa-YY25#4株系，均同时杂交出3504bp大小的带和8819bp大小的带，说明抗性芽未达到同质化。用金粉包裹pYY25质粒DNA，进行2次轰击后，得到2个阳性抗性芽，经Southern blot检测发现它们都没有达到同质化，再在30mg/L壮观霉素PaSIM1培养基上，经过3轮叶片再生后，经Southern blot分析后，发现它们均达到了同质化，见图4A，图4B，从而得到了2株转Bt-cry1C基因的山新杨植株。
转cry1C基因山新杨抗性芽的Northern blot分析：设计cry1C基因探针引物cry1C-probe-F(5’ATGGAGGAGAACAATCAGAACCAGTG 3’SEQ ID NO：8)和cry1C-probe-R(5’ATGTGCCTGATGAGTCTGTTGTAGTTC 3’SEQ ID NO：9)。分别把大约100mg的山新杨野生型叶片和转cry1C基因山新杨叶片转入1.5mL装有小钢珠的离心管中，然后置于液氮中冷冻后，放入研磨仪中，研磨细后，用TriZol法提取其总RNA。适量的总RNA样品变性后，然后在1.0％的甲醛变性的琼脂糖凝胶中，恒压50伏特条件下电泳3-4小时，电泳结束后，把琼脂糖凝胶转移到带正电荷的尼龙膜上，利用毛细管作用，通过半干转移法把RNA转移到尼龙膜上。以含有cry1C基因质粒为模板通过PCR扩增相应的基因片段作为探针，探针长度为596bp，用地高辛探针合成试剂盒标记并合成探针。RNA杂交温度是42℃。结果显示，cry1C基因在叶绿体中成功转录，如图4C所示。
实施例4
质体转Bt-cry1C基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型：
把同质化抗性苗置于30mg/L壮观霉素的生根培养基中培养，把生根完好，生长健壮的同质化抗性苗的培养瓶逐步开盖，向全开盖的培养瓶中倒入适量蒸馏水，开盖3-4天炼苗，加入蒸馏水以使固体培养基变软容易清洗，然后清洗根上的培养基，再将根浸泡在蒸馏水中过夜，以使根系上的培养基彻底清除。培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度：30-40μE·m-2·s-1，移栽入土培基质(土培基质配方为：蛭石:草炭土:珍珠岩＝5:3:2)中，置于培养箱中，每隔2-3天浇水1次，每隔1周浇1次1/8MS基本盐，光照条件为25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度逐渐加强，从40μE·m-2·s-1左右升高到80μE·m-2·s-1左右，每隔3天升高10μE左右的强度，湿度从90％下降至65％逐渐下降，每隔3天左右下降5％的湿度，大约在培养箱培养至株高30厘米左右便可移栽到温室中用盆钵培养，培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗，湿度50％左右。发现在温室中生长的质体转Bt-cry1C基因山新杨植株与野生型杨树植株在表型上没有明显差异，见图5。
实施例5
质体转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白SEQ ID NO：1的定量分析：
通过EnviroLogix公司的Bt-cry1C蛋白ELISA检测试剂盒检测山新杨野生型和转基因山新杨植株上幼嫩叶片、成熟叶片、衰老叶片、根、表皮和木质部的样品中Bt蛋白的含量。结果发现：在幼嫩叶片、成熟叶片、衰老叶片、表皮和木质部都检测到Bt-cry1C蛋白的存在，而根中没有发现Bt-cry1C蛋白的存在。Bt-cry1C蛋白在不同部位表达量不同，Bt-cry1C蛋白表达量在幼嫩叶片＞成熟叶片＞衰老叶片＞表皮＞木质部，见图6。Bt-cry1C蛋白在幼嫩叶片表达量最高达到20.74μg/g叶鲜重，在幼嫩叶片中的表达量约是在成熟叶片中的表达量的3-4倍，在成熟叶片中的表达量是衰老叶片中表达量的2倍左右，而在表皮中的表达量则比在衰老叶片中表达量下降了10倍左右，在表皮中的表达量是在木质部中的表达的2-3倍，在木质部的表达量约为0.066-0.086μg/g鲜重，见图6。
实施例6
质体转Bt-cry1C基因山新杨抗虫试验：
美国白蛾饲养条件：12h光照：12h暗光周期下，保持温度为26℃和相对湿度为60％。所有的测试也是在此条件下进行。美国白蛾幼虫分为幼龄期(1-4龄)和老龄期(5-6龄)，1龄龄期2天，2龄历期4天，3龄历期4天，4龄历期5天，5龄历期5-6天，6龄历期5-6天。待美国白蛾卵孵化后，每个龄期随机选择180只幼虫，分别饲喂两个株系转基因杨树叶片或野生型杨树叶片(n＝60)，把野生型山新杨叶片和转Bt基因山新杨叶片盛放在无菌直径为90mm的培养皿中，用无菌水浸湿包裹叶柄，使叶片保湿，用毛笔分别轻轻移到野生型山新杨叶片和转Bt基因山新杨叶片上，每皿放置20-30只美国白蛾幼虫，每个处理设3个重复，每隔24小时换一次叶片，每隔12小时左右，观察和记录幼虫的死亡情况。
用山新杨野生型叶片和转Bt-cry1C基因山新杨叶片对美国白蛾的喂食试验中，从美国白蛾死亡率的结果分析如下：美国白蛾1龄幼虫在分别喂食野生型叶片2天后全部存活，而喂食质体转Bt-cry1C基因山新杨叶片的，2天后全部死亡；美国白蛾2龄幼虫在分别喂食野生型叶片3天后全部存活，而喂食转Bt-cry1C基因山新杨叶片的，3天后全部死亡；美国白蛾3龄幼虫在分别喂食野生型叶片3天后，每个处理有1-2只死亡，而其余全部存活，而喂食转Bt-cry1C基因山新杨叶片的，3天后全部死亡；美国白蛾4龄幼虫在分别喂食野生型叶片3天后，每个处理有1只死亡，其余全部存活，而喂食质体转Bt-cry1C基因山新杨叶片的，3天后全部死亡。从对叶片损害程度来看：野生型叶片，随着美国白蛾幼虫年龄的增大，对叶片损害程度明显加大，到了4龄幼虫把叶片完全吃光，只留下主叶脉，而转Bt-cry1C基因山新杨叶片的损害程度，相对较小，只有零星的叶片被吃掉，虽然随着美国白蛾幼虫年龄的增大，叶片损害程度增大，但总体变化较小，见图7。不管喂食质体转Bt-cry1C基因山新杨叶片的年龄，均起到相同的杀虫效果，说明表达的Bt-cry1C蛋白足够杀死美国白蛾，见图6。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 630
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Glu Asn Asn Gln Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly Asn
20 25 30
Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser Asn
35 40 45
Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val Trp
50 55 60
Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu
65 70 75 80
Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala Ile
85 90 95
Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu Ala
100 105 110
Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Thr Arg
115 120 125
Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp Ile
130 135 140
Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr
145 150 155 160
Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile
165 170 175
Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn Tyr
180 185 190
Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala Asn
195 200 205
Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln Asp
210 215 220
Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro Ile
245 250 255
Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Ile
260 265 270
Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe Asn
275 280 285
Val Met Glu Ser Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile Leu
290 295 300
Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn Phe
305 310 315 320
Tyr Trp Gly Gly His Arg Leu Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly Asn
325 330 335
Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro Arg
340 345 350
Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro Thr
355 360 365
Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu Arg
370 375 380
Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Asp
405 410 415
Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala
420 425 430
Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val Val
435 440 445
Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp Pro
450 455 460
Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp Gly
465 470 475 480
Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu
485 490 495
Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile Asn
500 505 510
Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Ser
515 520 525
Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly Val
530 535 540
Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu Ile
545 550 555 560
Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser Asn
565 570 575
Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu Gln
580 585 590
Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile Asp
595 600 605
Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Ser Asp
610 615 620
Leu Glu Arg Ala Gln Lys
625 630
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggccgcct acttttgtgc tctttcaagg tcagatt 37
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccatggagga gaacaatcag aaccagtg 28
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggtatatct ccttcttaaa gttaaactgc agtatttg 38
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggtacttgt gatatttcgg cttg 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttagccaaag gtgtacgttc atgag 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgcccggct ggttaaatgc 20
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggaggaga acaatcagaa ccagtg 26
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgtgcctga tgagtctgtt gtagttc 27

Claims (5)

1.一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，所述高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：
将Bt-cry1C基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切、PCR和测序验证后，获得Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体pYY25质粒；
用金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到阳性抗性芽，再经过叶片抗性再生后，获得同质化的转Bt-cry1C基因山新杨植株。
2.如权利要求1所述的高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，所述高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法具体包括：
步骤一，质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体的构建：以pBar13-cry1C质粒DNA为模板，用cry1C-F和cry1C-R这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增得到cry1C基因片段，然后把此基因片段克隆到平末端载体-Blunt Simple上构建质粒pYY23；
用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切pYY23质粒DNA后得到的小片段与用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把经测序验证正确的重组子命名为pYY25，即为质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体；
步骤二，转Bt-cry1C基因山新杨植株的获得和分子鉴定：用0.6μm的金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪法导入山新杨基因组中，在含30mg/L壮观霉素的PaSIM1培养基上筛选抗性芽，阳性芽在含30mg/L壮观霉素的PaSIM2培养基上经过2-4轮的抗性筛选得到同质化的阳性芽，通过Southern blot检测阳性芽和达到同质化的阳性芽；通过筛选获得了2株同质化的阳性芽，把此阳性芽进一步的培养得到质体转Bt-cry1C基因山新杨组培苗。
3.如权利要求2所述的高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，步骤二后，还需进行：质体转Bt-cry1C基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型分析:把得到的2株同质化的质体转Bt-cry1C基因山新杨组培苗经过炼苗后，移栽到温室中生长。
4.如权利要求3所述的高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，质体转Bt-cry1C基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型分析后，还需进行：
转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白的定量分析:用Bt-cry1C蛋白ELISA检测试剂盒检测山新杨野生型和转基因山新杨植株上幼嫩叶片、成熟叶片、衰老叶片、根、表皮和木质部的样品中Bt蛋白的含量。
5.如权利要求4所述的高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白的定量分析后，还需进行：转Bt-cry1C基因山新杨抗虫试验:山新杨野生型叶片和转Bt-cry1C基因山新杨叶片对美国白蛾的喂食试验。
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