CN113373146A - 一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在防治桃蚜中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在防治桃蚜中的应用。本发明确认桃蚜取食植物质体，筛选获得桃蚜RNAi致死基因MpDhc64C之后，构建表达dsMpDhc64C的烟草质体转化载体，转化获得质体转基因烟草。桃蚜取食转基因植物之后目的基因表达水平显著下调，存活率及后代数显著降低，幸存桃蚜体重显著下降，说明植物质体表达的dsRNA成功进入桃蚜体内并引发RNAi效应，进而导致昆虫靶标基因出现下调，引发多种针对桃蚜的不利征状，本发明显著提高了植物的桃蚜抗性，为桃蚜防治提供了新的技术方案。

Description

一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在防治桃蚜 中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在防治桃蚜 中的应用。

背景技术

昆虫类害虫依照口器类型可以划分为咀嚼式害虫和非咀嚼式害虫。许多非咀嚼式害虫都属于半 翅目类昆虫，例如蚜虫，烟粉虱，褐飞虱，盲蝽等，它们中的大部分都是重要的农业害虫，对农业生 产造成极大危害。

桃蚜是一种属于半翅目蚜科的典型刺吸式害虫，也是世界范围内危害最大的农业害虫之一，其 寄主植物多达400余种，包括桃、李、樱桃、马铃薯、白菜、甘蓝、萝卜、甜椒、芸苔、烟草等许多 重要的经济作物。桃蚜会在外界环境良好的情况下进行无性繁殖，快速扩大种群虫口数，因此少数桃 蚜的感染发生就会导致后续大规模的虫害爆发。桃蚜排泄分泌的蜜露含有大量的糖分，利于有害真菌 孢子的萌发和生长，引发煤污病，最终导致植物光合作用效率下降。在吸取寄主植物韧皮部汁液，争 夺植物营养的同时，桃蚜还能传播100余种植物病毒，其中包括黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃 薯卷叶病毒、烟草蚀纹病毒等，进而引发严重的植物病毒病。因此，植物桃蚜虫害爆发往往还叠加真 菌病害、病毒病害的发生，对农业生产的开展带来了严峻的挑战。

传统的桃蚜防治主要依赖于各类化学杀虫剂。化学类杀虫剂杀灭桃蚜具有起效快、效果显著的 特点，但同时也面临环境污染、天敌误杀、目标害虫抗性增强等问题。苏云金芽孢杆菌δ-内毒素(Bt 蛋白)转基因植物虽然对鳞翅目、鞘翅目等咀嚼式口器害虫有着良好的抗虫效果，但是对刺吸式害虫 的防治效果则较差，盲蝽类刺吸式害虫甚至成为Bt蛋白转基因棉田里的主要害虫。目前，基于RNAi 基因沉默原理发展起来的抗虫技术已经逐步成熟起来，该类技术有着序列特异性高，环境友好等特点， 为刺吸式害虫的防控提供了新的思路和方向。RNAi是一种广泛存在于真核生物体内，由dsRNA诱发 的基因沉默机制。当dsRNA被吸收进入真核细胞以后，胞内的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成21-24 nt的siRNA，随后siRNA与胞内的AGO蛋白等形成RNA诱导沉默复合体(RISC)，进而对与siRNA 互补的mRNA进行切割，导致靶标mRNA降解，最终诱发基因沉默现象。在害虫防治领域，RNAi 技术通过抑制害虫关键基因的表达，从而实现针对害虫的各种不利征状，如生长迟缓、后代数下降、 体重下降甚至致死等。该技术具有序列特异性，极大减少对作物和人畜的危害，具有较大的应用潜力。

在过去的十多年里，利用植物介导RNAi技术防治半翅目非咀嚼式害虫方面取得了良好的进展。 2019年，Kanakala等在让烟粉虱取食核转表达靶标烟粉虱Cyclophilin B和Hsp70基因dsRNA的烟 草之后，烟粉虱靶标基因的表达水平出现显著下调，两周内烟粉虱致死率则分别达到了82％和86％。 Liu等在玉米和大豆中成功核转表达了靶标绿盲蝽V-ATPase-E基因的dsRNA，绿盲蝽在取食两种转基 因植物之后，致死率在一周内均达到了60％以上。Sun等通过核转成功获得了表达靶标麦长管蚜SaZFP 基因dsRNA的转基因小麦，取食转基因小麦的蚜虫在九天内死亡率超过了40％。针对桃蚜的植物介 导RNAi研究同样成果颇丰。2015年，Coleman等在拟南芥中核转表达了靶标桃蚜C002基因的dsRNA， 与对照组相比，取食转基因拟南芥的桃蚜种群虫口数下降了60％。2018年，Bhatia等发现桃蚜在取食 了表达靶标桃蚜表皮蛋白基因dsRNA的转基因拟南芥之后，蚜虫后代数减少了近40％。

近年来，利用植物质体介导RNAi抗虫技术在防治马铃薯甲虫方面取得了理想的结果， 取食dsRNA质转植物的马铃薯甲虫幼虫在5天内死亡率达到了100％。质体是一种植物特有 的细胞器，是前质体、叶绿体、白色体、造粉体等质体的总称。其中叶绿体是植物进行光合 作用的重要场所，质体基因组相对而言比较小(150kb左右)，主要负责编码光合作用、转录 翻译等相关基因。质体基因组还具有明显的原核细胞表达特征，例如基因成簇排列、多顺反 子序列共表达等。质体基因工程技术兴起于上世纪90年代初，该技术首先在烟草当中取得了 成功。与传统的植物细胞核转化不同，质体转化采用了同源重组的方式，利用基因枪轰击， 将外源基因整合到质体基因组特定位点中。利用aadA作为植物再生过程中的抗性筛选标记 基因，使得质体转化效率得到了极大提高。相比于传统的核转化技术，质体转化技术具有如 下优势：①外源基因表达量高。质体基因组在植物细胞内以多拷贝的形式存在，一个成熟的 叶肉细胞中质体基因组拷贝数可达1900-5000份，使得外源目的基因可以进行超量表达；② 多基因共转化。质体基因组结构及表达模式与原核生物类似，质体基因组规模小，便于遗传 操作，可以实现多基因共同表达；③环境安全性高。大多数被子植物质体遗传为母系遗传方 式，转化植物的花粉(雄配子)中不含转基因成份，转基因序列不会随花粉传播，杜绝了转 基因植物花粉田间扩散的风险，利于生态稳定；④质体基因表达无基因沉默现象。质转过程 中，外源基因通过同源重组而定点整合到质体基因组特定位置中，没有T-DNA随机插入而 引发的基因表达位置效应。由于质体基因的表达不存在甲基化、乙酰化、组蛋白修饰等表观 遗传学调控，不产生基因沉默现象，外源基因可以在质体转基因系统中均一表达；⑤基因表 达产物区域化。质体具有完整的内膜与外膜屏障，目的基因表达产物区域化在质体体内，因 此高水平的基因表达产物对于植物其它部位的生理功能的影响较小。尽管核转植物核介导的 RNAi技术在防治桃蚜等半翅目非咀嚼式害虫方面取得了大量进展，但半翅目非咀嚼式害虫

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在 防治桃蚜中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明以桃蚜和烟草为主要研究对象，通过dsRNA人工饲料饲喂法筛选出了桃蚜有效RNAi靶 标致死基因MpDhc64C，在此基础之上构建了表达dsMpDhc64C的烟草质转载体，通过基因枪法获得 了表达dsMpDhc64C的质转烟草植株。本发明筛选获得了一种全新的桃蚜RNAi致死基因MpDhc64C， 对表达dsMpDhc64C的质转植物进行了桃蚜抗性评估，发现dsRNA质转烟草植物对于桃蚜具有显著 的抗性，为植物介导RNAi防治桃蚜等半翅目非咀嚼式害虫提供了新的技术路线。

本发明是这样实现的，一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，通过质体转化技术将表达桃 蚜Dhc64C基因dsRNA的质转表达质粒转化至植物中。

进一步地，所述桃蚜Dhc64C基因dsRNA通过将SEQ ID NO：1所示序列和其反向互补序列通 过马铃薯intron-loop序列连接获得，最终表达产物形成一种hairpinRNA结构。

SEQ ID NO：1序列位于桃蚜Dhc64C基因CDS区间内。

进一步地，所述马铃薯intron-loop序列如SEQ ID NO：17所示。

进一步地，表达桃蚜Dhc64C基因dsRNA的质转表达质粒的制备方法包括：以桃蚜cDNA为模 板，分别以引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8进行PCR扩增，得 到Dhc64C-1^st(XhoI/BglII)片段和Dhc64C-2^nd(NotI/BamHI)片段；将Dhc64C-1^st(XhoI/BglII)片 段和载体pUC-RNAi载体进行XhoI/BglII双酶切后连接，获得pUC-Dhc64C^1st中间质粒，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10对pUC-Dhc64C^1st中间质粒进行扩增，获得Dhc64C^1st-intron(Pst1/BamHI)片 段；将Dhc64C-2^nd(NotI/BamHI)片段和Dhc64C^1st-intron(Pst1/BamHI)片段分别进行BamHI单酶 切后连接，获得dsDhc64C质转表达质粒。

进一步地，将桃蚜Dhc64C基因dsRNA连接至抗性质粒pYY12中，再通过质体转化技术转化至 植物中。

进一步地，所述植物包括烟草。

进一步地，所述质体转化包括基因枪介导的质体转化。

本发明还提供了如上述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法在制备抗抗桃蚜的植物中 的应用。

本发明还提供了如上述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法制备的转基因植物。

本发明还提供了桃蚜Dhc64C基因dsRNA在防治桃蚜中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明通过dsRNA人工饲料饲喂法筛选获得了一种针对于桃蚜的必须基因-Dhc64C，并成功构建 了靶向表达Dhc64C基因dsRNA的质体转化载体，之后通过基因枪法成功获得了烟草dsMpDhc64C 质转烟草。桃蚜取食该种转基因烟草后，其目的基因表达水平、后代数和幸存桃蚜平均体重均出现了 显著性下降。本发明的抗桃蚜方法对环境友好，成本低廉，为植物介导RNAi抗桃蚜等半翅目非咀嚼 式害虫提供了新的技术选择。

附图说明

图1：dsMpDhc64C植物表达载体图；

图2：检测质体转化植物阳性及同质化状态鉴定Southern Blot图；

图3：质体转化植物表达dsMpDhc64C的Northern Blot图；

图4：取食表达dsMpDhc64C质转植物桃蚜的生存曲线；

图5：取食表达dsMpDhc64C质转植物桃蚜的MpDhc64C基因表达检测；

图6：取食表达dsMpDhc64C质转植物桃蚜的后代数统计；

图7：取食表达dsMpDhc64C质转植物幸存桃蚜平均体重统计。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细 说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具 体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种 改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性 质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本 领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范 围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数 字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说 明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而 加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得 的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不 进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组 技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在防治桃蚜中的应用。本发明利用 植物质体表达dsDhc64C达到了桃蚜防治目的。确认桃蚜取食植物质体，筛选获得桃蚜RNAi致死基 因MpDhc64C之后，构建表达dsMpDhc64C的烟草质体转化载体，转化获得质体转基因烟草；利用 Southern blot和Northern blot确认转基因植物质体同质化状态及dsMpDhc64C的高效表达。桃蚜取食 转基因植物之后目的基因表达水平显著下调，存活率及后代数显著降低，幸存桃蚜体重显著下降，说 明植物质体表达的dsRNA成功进入桃蚜体内并引发RNAi效应，进而导致昆虫靶标基因出现下调， 引发多种针对桃蚜的不利征状，本发明显著提高了植物的桃蚜抗性，为桃蚜防治提供了新的技术方案。 具体如下实施例所示。

实施例1Dhc64C基因的获得

1、桃蚜饲养于25±1℃，75-80％相对湿度，16L：10D光照周期的人工环境中。用于dsRNA合 成的桃蚜Dhc64C基因cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；桃蚜Dhc64C基因CDS区间序列如SEQ ID NO：2所示。

桃蚜Dhc64C基因特异性引物序列如下：

上游引物F：5'-CTCATGTAATTGATCCAAAAGCCAT-3'，SEQ ID NO.3；

下游引物R：5'-TCGAACATTGGGTGGAAGAGAT-3'，SEQ ID NO.4。

2、采用Takara公司RNAiso Plus试剂提取桃蚜的总RNA。

3、逆转录反应

残留基因组DNA去除

在RNase free离心管中配制如下混合液，微量离心混匀，42℃孵育2min。

逆转录反应体系配制(20μL体系)

在第1步的反应管中直接加入2×Hifair^TMⅡSuperMix plus，微量离心混匀。

逆转录程序设置

将上述混合液按照下表程序进行孵育。

反应后可分装后储存于-80℃长期保存。

4、特异性扩增Dhc64C基因及其验证

以桃蚜cDNA为模板，在SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4序列的基础上添加酶切位点和保护性碱 基形成新的引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行PCR反应， 得到Dhc64C-1^st(XhoI/BglII)片段和Dhc64C-2^nd(NotI/BamHI)片段。下划线序列为酶切位点所在 位置。

上游引物F₁：5'-CCGCTCGAGCTCATGTAATTGATCCAAAAGCCATTT-3'，引入XhoI酶切位点， SEQ ID NO.5；

下游引物R₁：5'-GGAAGATCTTCGAACATTGGGTGGAAGAGATAAAC-3'，引入BglII酶切位点， SEQ ID NO.6。

上游引物F₂：5'-ATAAGAATGCGGCCGCCTCATGTAATTGATCCAAAAGCCATTT-3'，引入NotI酶切位点，SEQ ID NO.7；

下游引物R₂：5'-CGCGGATCCTCGAACATTGGGTGGAAGAGATAAAC-3'，引入BamHI酶切 位点，SEQ ID NO.8。

反应体系如下：

混匀后，进行PCR反应：

95℃，3min；95℃，15s，58℃，15s，72℃，30s(1min/kb)，循环数34；72℃，5min，上样、 电泳，在凝胶成像系统中观测目的条带。

对目的条带进行回收处理，将PCR产物测序确认目的序列与桃蚜Dhc64C基因SEQID NO.1序 列相同。

实施例2植物表达载体的构建

1、pUC-Dhc64C^1st中间载体构建

1.1载体片段双酶切

采用pUC-RNAi中间载体来引入intron结构。pUC-RNAi为我们实验室先前科研成果，2015年发 表在文章Full crop protection from an insect pest by expression oflong double-stranded RNAs in plastids于 期刊Science上。将Dhc64C-1^st(XhoI/BglII)片段和中间载体pUC-RNAi载体进行XhoI/BglII双酶切， 反应3h，体系如下：

对中间载体酶切体系进行上样、电泳，在紫外凝胶成像系统中观测目的条带，对目的片段进行胶 回收，方法同上。对片段酶切体系进行溶液回收。

1.2载体片段连接

将上述得到载体回收产物和片段回收产物进行连接，连接过程中保持载体和片段摩尔比为1：3～1： 10之间，连接3h，体系如下：

1.3阳性菌落验证

将连接产物转化到XL10-gold感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃ 培养14h后从平板上随机挑取单菌落进行菌落PCR阳性克隆验证，并进行序列送测，确认结果。具 体步骤如下：

1)使用白色小枪头挑取单菌落放入盛有30μL ddH₂O的200μL离心管中。

2)按如下体系配制单个PCR反应体系；

3)吸取步骤1中离心管内的含菌ddH2O溶液2ul至步骤2PCR体系中，混匀后进行PCR反应： 95℃，3min；95℃，15s，58℃，15s，72℃，30s(1min/kb)，循环数30；72℃，5min，之后进行 琼脂糖凝胶电泳，根据电泳筛选步骤1中的阳性菌落样品。

1.4中间载体质粒抽提

将含有阳性菌落的样品接入3mL含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中进行扩大培 养14h。随后对菌液进行质粒抽提并对质粒进行测序验证，质粒抽提步骤如下：

1)室温条件下10,000×g离心1min收集菌体沉淀。

2)弃上清，往沉淀中加入250μL Solution I(含RNase A)，剧烈旋涡震荡重悬菌液。

3)加入250μL Solution II，轻轻颠倒混匀7～10次，获得澄清的裂解液，冰上孵育2min

4)加入350μL Solution III，并立刻上下颠倒离心管混匀，直至形成白色絮状沉淀。

5)室温13,000×g离心10min。

6)将DNA吸收柱放入2mL收集管中，小心转移上清液到柱子中，每次700μL。10000×g离心 1min，重复该步骤直至所有上清液都过柱完毕。

7)倒弃滤液，把柱子套回收集管。加入500μL Buffer HB至柱子中。10000×g离心1min。

8)倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入700μL DNA Wash Buffer至柱子中。10,000×g离心1min， 重复该步骤一次(Wash Buffer使用前必须用无水乙醇稀释)。

9)倒弃滤液，将柱子套回收集管中。13,000×g离心2min干燥吸收柱。

10)将吸收柱置于新的1.5mL离心管中，加入30μL elution buffer，室温静置2min。13000×g 离心1min，洗脱DNA。

11)对抽提质粒进行浓度检测，最终获得pUC-Dhc64C^1st中间质粒。

2、dsDhc64C质转表达载体构建，载体图如图1所示

2.1Dhc64C^1st-intron(Pst1/BamHI)连接片段获取

以pUC-Dhc64C^1st中间质粒为PCR模版，利用带有酶切位点的引物序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10进行PCR反应，获取478bp大小的目的片段。

上游引物F：5'-AAAACTGCAGCTCATGTAATTGATCCAAAAGCCATTT-3'，引入PstI酶切位点， SEQ ID NO.9。

下游引物R：5'-CGCGGATCCCCTATATAATTTTAAGTGGAAAAAAAA-3'，引入BamHI酶切位点，SEQ ID NO.10。

之后对PCR片段进行琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、PstI/BamHI双酶切，最终获得Dhc64C^1st-intron (Pst1/BamHI)片段。

2.2dsDhc64C质转表达质粒获取

将实施例1中得到的Dhc64C-2^nd(NotI/BamHI)片段和上述获得的Dhc64C^1st-intron(Pst1/BamHI) 片段分别进行BamHI单酶切，反应3h，之后回收带有黏性末端的目的片段。按照通用方法将回收后 的Dhc64C-2^nd(NotI/BamHI)和Dhc64C^1st-intron(Pst1/BamHI)进行双片段连接，反应3h。琼脂糖 凝胶电泳对连接液进行分离，对目的片段(747bp)进行切胶回收，最终获得完整的Dhc64C目的插 入片段Dhc64C(PstI/NotI)。

本发明采用含有prrn启动子且具有氨苄霉素抗性质粒pYY12为表达载体作为表达桃蚜Dhc64C 基因dsRNA的最终植物载体。质粒pYY12为发明人实验室先前科研成果，2017年发表在文章In vivo assembly in Escherichia coli of transformation vectors forplastid genome engineering于期刊Frontiers in Plant Science上。对pYY12载体和Dhc64C(PstI/NotI)片段进行PstI/NotI双酶切，反应3h。对载体 酶切液进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收酶切目的载体，对片段酶切液进行溶液回收获得酶切目的 片段。之后将酶切载体和酶切片段进行连接反应。之后将连接产物进行转化，涂板，菌落PCR挑选 阳性菌落，使用阳性菌落样品进行扩大培养，抽提质粒进行测序验证并命名为pDY12。最后对得到验 证的质粒进行提取，获取足够的质粒进行基因枪轰击。

实施例3质体转化的植物的制备

1、植物材料准备：

在无菌环境下培养烟草种子，温度：25℃/20℃，光照周期：16h光照/8h黑暗，光强：25μE。 当植物达到瓶子1/2至1/3的高度时，取2-4片最幼嫩的叶子，气孔面朝上铺在RMOP(不含抗生素) 塑料平板上(平板要薄一些约含30mL培养基)。

2、基因枪轰击准备：主要步骤为：

1)使用前半小时开启粒子枪的真空泵(气压调至1350psi)；

2)灭菌后的大玻璃板；无水乙醇；每一枪：1个可裂膜(1100psi)和7微载片；每个质粒的1 个阻拦网；

3)用无水乙醇清洗可裂膜(不超过1min)、微载片(5min)、阻拦网及基因枪零件(5min)， 然后使其自然风干。

3、金粉预处理及DNA包裹(n次轰击)，以下操作在冰上进行：

3.1材料及试剂：2个冰浴盒，无水乙醇(GR或色谱级)，无菌超纯水，n×(1.4-1.5)mg金粉(n ×175μl)2.5M CaCl2，(n×35μl)0.1M亚精胺(free base,组培级别,分装，-20℃保存)，灭菌后 的枪头(3种大小)及1.5ml EP管。

3.2金粉处理：

1)向称好的金粉中加入600-1150μl无水乙醇，涡旋1min；

2)5000rpm微离心，用200μl枪吸去乙醇；

3)加入1ml无菌超纯水重悬；

4)5000rpm微离心，用200μl枪吸去水。

3.3DNA包裹：

1)加入n×175μl水，用200μl枪重悬金粉；

2)分装至1.5ml EP管n×172μl；

3)在向其中加DNA 20μg，涡旋；

4)175μl 2.5M CaCl2，涡旋；

5)35μl 0.1M亚精胺，涡旋；(按以上顺序加，不要颠倒)；

6)在冰上10min,每隔1分钟重悬一次；

7)3500rpm微离心，用200μl枪吸去上清；

8)600μl无水乙醇洗，5000rpm微离心，用200μl枪吸去上清，再洗一次；

9)用50μl无水乙醇重悬。

3.4基因枪轰击：

1)放入可裂膜；

2)放置阻拦网；

3)放入微载片，用红色塑料杯固定；

4)将DNA包裹金粉均匀涂在微载片中心，每个微载片涂6.5μl；

5)组装基因枪；

6)将铺有烟草叶片的平板放入基因枪，关闭塑料门；

7)打开真空按钮(中间的按钮，按到最上)直到压力达到27.5inches Hg，迅速将真空按钮按到 最下(不要在中间停顿)；

8)迅速按下fire键(第三个按钮)，不要松手，直至可裂膜破裂；

9)将真空钮按到中间，使气压恢复到0后再拿出平板；

10)在平板上标记质粒名称，压力。如果再次轰击同一个质粒，可以再次使用相同的阻拦网，只 要将其转换到相反的一侧。轰炸结束时：关闭氦压力阀，将压力降到0；关闭基因枪和真空泵。

3.5筛选阳性芽

轰击后的烟叶样品在切割前可以存储0-2天。

1)在没有抗生素的薄平板上放置2-3片无菌滤纸，将叶子移到无菌滤纸上，用无菌手术刀把叶 子切成5mm的长条，然后再切成5×5mm，使用无菌镊子将切样放置在含有壮观霉素的RMOP平板 (MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+500mg/L spec)中(气孔面朝下)，确保样品与介质完全接触， 注意做好标记(包括质粒名称和日期)。

2)培养环境：

在无菌环境下培养烟草种子温度：25℃/20℃；光照周期：16h光照/8h黑暗；光强：25μE；盖 子内没有水汽。

3)重生芽产生后将其带有茎的部分转移到含有壮观霉素的生根培养基(MS+0.1mg/L NAA+ 500mg/L spec)中，将其叶片切小分别放到含有壮观霉素的RMOP平板(额外筛选2-4次以达到同质 化)和含有壮观霉素和链霉素的RMOP平板(MS+0.1mg/L NAA+500mg/L spec+500mg/L strep) 中(鉴定是否为阳性芽)。

实施例4Southern blot检测质体转化的转基因植物阳性及同质化

1.试剂配置：

SouthernⅠ：0.25mol/L HCl；

SouthernⅡ：0.5mol/L NaOH；

SouthernⅢ：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl；

SouthernⅣ：1mol/L Tris-HCl，3mol/L NaCl，用浓盐酸将pH调至6.5；

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠(sodium citrate)，用浓盐酸将pH调至7.0；

冷洗液：2×SSC，0.1％SDS；

热洗液：0.1×SSC，0.1％SDS；

马来酸缓冲液：0.1mol/L Maleic acid，0.15mol/L NaCl，用NaOH(S)将pH调至7.5(每升缓冲液 约加入8g NaOH)(20℃)；

洗涤缓冲液：向马来酸缓冲液中加入0.3％(V/V)的Tween 20(20℃)；

检测缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，用浓盐酸将pH调至pH＝9.5(20℃)；

Southern试剂盒：DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ(Roche)；

1号管：DIG-High prime(每2μL分装，保存于-20℃)。

4号管：Anti-Digoxigenin-AP Conjugate(能结合地高辛的抗体，其上耦联有碱性磷酸酶，该酶能 催化底物(一代：五号管)变为蓝色，(二代：五号管)在AI600下显影)取出4号管后，4℃，10000g 离心5min，分装，并保存在4℃冰箱；

5号管：一代：NBT/BCIP(底物)(保存于-20℃)。二代：已分装保存于4℃冰箱。

6号管：10×Blocking Solution(保存于-20℃)(即10×封闭液)。使用前用马来酸缓冲液将其 稀释到1×。

7号管：DIG Easy Hyb(保存于-20℃)。向其中分两次加入64mL ddH2O，在37℃中摇匀。

2.地高辛标记探针的制备：

以烟草总DNA为模板，用探针特异性引物进行PCR扩增，胶回收PCR产物(注意回收的浓度 至少在70ng/μL以上)。

PCR程序如下：

运行PCR反应30个循环。

引物如下：

pasb-F：cccagaaagaggctggccc，SEQ ID NO.11；

psab-R:gcagttcccgccccttggg，SEQ ID NO.12。

取回收的PCR产物约0.5-1μg，补加ddH2O至8μL；然后沸水浴10min，立即转入冰水混合物 中。之后再将其转入分装有2μL DIG-High prime的PCR管中，混匀，微离心，37℃温浴10-20h； 65℃加热10min终止反应，并保存于-20℃冰箱待用。

3.提取植物总DNA

3.1试剂制备：

CTAB-Extraction Buffer(100mL)：

最后使用时加入β-ME，按1：100的比例稀释(100ml buffer加入1mLβ-ME)。

3.2操作步骤：

1)取约100mg烟草叶片(大拇指盖大小)置于装有三颗灭菌钢珠的2ml EP管中，放在液氮中快 速冷冻，在打样机中研磨，先用液氮浸泡，对称放样，55HZ 40S，研磨充分(研磨不充分的样中可能 有RNase)，防止解冻。

2)加入500μL CTAB提取液，vortex，60℃温浴，30min(每隔十分钟混匀一下)。

3)加入200μL氯仿/异戊醇(24:1)混合液，混匀至乳白色。

4)4℃离心12000rpm，10min，取400μL上清液于新的1.5ml EP管中，加入360μL异丙醇(0.8-0.9 体积)，混匀。

5)4℃离心12000rpm，30min。

6)弃上清，加入70％乙醇洗涤沉淀(0.5-1mL)1-2次。

7)微离心，弃上清，自然干燥，加入40μL左右ddH2O溶解，测浓度，-20℃保存。

4.Southern blot检测

具体步骤如下：

1)选择合适的限制性内切酶将抽取的DNA酶切过夜。

2)1％的琼脂糖凝胶电泳；先用30V让样品跑出上样孔，再用50V继续跑，直至溴酚蓝跑至凝胶 底部。

3)用SouthernⅠ洗15min，至溴酚蓝完全变成黄色，洗完后快速用去离子水冲洗；(脱嘌呤)；

4)用SouthernⅡ洗30min，至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色，洗完后快速用去离子水冲洗；(使 DNA变性)；

5)用SouthernⅢ洗30min，洗完后快速用去离子水冲洗；

6)SouthernⅣ洗15min；(中和残留的碱，使DNA析出以便转膜)。

7)将尼龙膜切成11.6×12cm大小，快速在去离子水中浸湿，然后在20×SSC中浸泡15min(与 SouthernⅣ洗胶同时进行)。另准备6张11.6×12cm大小的滤纸，一叠同样大小的吸水纸，及一张长 条状滤纸。

8)按图2所示顺序摆放，注意盐桥与胶，胶与尼龙膜及尼龙膜与滤纸之间不要有气泡，凝胶四 周放上Parafilm，防止短路，转膜12h以上。

9)转膜结束后拿出尼龙膜(注意标明尼龙膜的正反面，正面为有DNA的一面)，待其干后再置 于杂交仪中，紫外杂交0.5min。交联完成后的膜可以在4℃中保存。

10)42℃水浴预热杂交液(由7号管配置)，再取预杂交液10mL加到杂交管中，注意尽量不要 起泡；将交联后的膜反面贴壁放入杂交管中，拧好管口防止漏液；将杂交管置于杂交仪中42℃杂交 12-24h；

11)新配置的杂交液：将探针沸水浴5min后立即转入冰浴，微离心，用枪将探针加到10mL预 杂交液中(探针不要碰到膜，小心混匀，不要起泡)即为杂交液；

已使用过的杂交液：杂交液可以储藏在-15℃到-25℃，可以反复使用几次，每次使用前需要提前 68℃重新变性10分钟，随后放置于42℃水浴；使用变性的杂交液替换预杂交液，将杂交管放回42℃ 的杂交仪中，杂交10-12h；

12)在摇床上将膜用冷洗液洗两次，每次洗5min；将热洗液提前预热至68℃，在68℃水浴锅中 用热洗液洗膜两次，每次洗15min；再用洗涤缓冲液洗2min；最后用马来酸缓冲液泡3min；

13)取20mL 1×Blocking Solution(6号管稀释)于杂交管中，再将膜反面贴壁放入杂交管中， 常温(25℃)，在杂交仪中封闭1h；向杂交管中加入1μL抗体，杂交仪中常温杂交30min；

14)取出尼龙膜，在脱色摇床上用洗涤缓冲液洗三次，每次15min；洗完后再将膜在检测缓冲液 中浸泡2min；

15)加反应底物

一代：取100μL底物(即5号管)用检测缓冲稀释至5mL并加入到大培养皿中，将膜也放入培 养皿中，暗处理过夜。

二代：取100μL底物(即5号管)用检测缓冲稀释至5mL并加入到大培养皿中，将膜也放入培 养皿中，暗处理30min(可以延长)。

结果如图2所示。

实施例5dsRNA的植物表达及检测

1、试剂配置：

Northern Blot所用的试剂盒为：DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit II。

20×SSC：3M NaCl 175.5g，0.3M柠檬酸钠88.23g,pH 7.0。

马来酸缓冲液：0.1M马来酸，0.15M NaCl(用NaOH调pH到7.5，1L约加8g固体)。

洗涤缓冲液：马来酸缓冲液+0.3％Tween20,作用是去除未结合的抗体。

检测缓冲液：0.1M Tris-HCl,0.1M NaCl，pH9.5。

DEPC H2O：搅拌过夜后灭菌(将DEPC水分解成二氧化碳和水)。0.03％的DEPC水是在1L超 纯水中加入0.3mL的DEPC。

10×MOPS电泳缓冲液：MOPS配置完成后加DEPC搅拌过夜后灭菌。

20×SSC：配置后1L里面加1mL DEPC搅拌过夜后灭菌。

10％SDS：可直接配置，因为SDS与DEPC会反应，SDS有蛋白变性功能，可使RNA变性。SDS 避免吸入粉尘，避免与皮肤和眼睛接触。

马来酸缓冲液：配完后加DEPC，1L+1mL DEPC。

洗涤缓冲液：因为洗涤缓冲液中有吐温，不能用DEPC处理，是在灭过菌的马来酸缓冲液中加吐 温。

检测缓冲液：检测缓冲液中有Tris-HCl，不能加DEPC，两者会反应。

2、实验用具准备：

制胶用的胶板，梳子，跑胶用的胶槽用0.5％的SDS处理一晚。

量筒、镊子玻璃棒等用品灭菌处理。

转膜用的塑料板用0.4N的NaOH处理，用前用灭菌的DEPC水洗3次。

实验用的滤纸用DEPC水泡后灭菌。

必备：烧杯、三角瓶(配胶)、量筒、大培养皿、玻棒、灭菌滤纸、EP管、黄白枪头等。

3、制备含有甲醛的凝胶(1.0％)和电泳液。

称取1.0g琼脂糖，加入90mL 1×MOPS中，加热融化后冷却至约60℃，加入10ml甲醛，摇匀 后倒入制胶槽。

将20.9g的MOPS溶解于350mL的DEPC处理的水中，用2M的NaOH调PH到7.0，加10mLDEPC 处理的1M NaAc(4.10g/50mL)和10mL DEPC处理的0.5MNa2 EDTA(9.03g/50mL，PH8.0)，用 DEPC处理水定容到500mL，过滤灭菌。

4、Trizol法提取RNA样品，参照桃蚜总RNA获取步骤。

5、RNA探针制备

1)以目的基因做探针为例，PCR扩增目的基因作为探针(长度必须大于25bp，若目的基因较长， 可选取其中一段做探针)，注意胶回收的浓度，1μg样品不超过8μL；

2)将胶回收的探针模板取1μg左右于PCR管中；

3)沸水浴10min，之后立即转入到冰水混合物中；

4)向其中加入2μL地高辛高效引物混合物(1号管)，混匀，微离心，37℃温浴10h-20h；

5)100℃加热10min终止反应后立即冰浴降温再使用(使用二代显色时，第一次使用的探针可稍 微减量，避免显色时背景过深)。

5、Northern实验步骤

1)RNA样品使用前80℃处理2min(普通mRNA的变性，若为dsRNA应为10min)。

2)加入加样缓冲液(2倍体积于上样量)，每泳道点样量为30μL，50V电压下电泳约2.5小时。

3)溴酚蓝距前沿1～2cm时停止电泳。

4)上样凝胶用20×SSC中浸泡20分钟，尼龙膜先用DEPC水短暂浸润，然后在20×SSC浸泡 5min。

5)以20×SSC做转膜缓冲液，利用毛细管洗脱的方法将RNA转移至Hybond+尼龙膜上。

6)转膜16-18小时，结束后将膜与胶接触的一面标记为正面。

7)杂交膜室温晾干30分钟以上，之后用254nm U.V交联两次，每次30S，对膜上的RNA样品 进行固定，将膜用保鲜膜包裹后，可贮存于-20℃备用。

8)将RNA膜浸入42℃预热的预杂交液Church buffer中，预杂交4小时；将变性的cDNA探针 加入预杂交液中，42℃杂交过夜；

冷洗液1L	热洗液1L
		2×SSC(100ml 20×SSC)	0.1×SSC(5ml 20×X SSC)
0.1％SDS(10ml 10％SDS)	0.1％SDS(10ml 10％SDS)

9)冷洗：2×SSC/0.1％SDS(室温)，5分钟×2次。

10)热洗：0.1×SSC/0.1％SDS(68℃)，15分钟×2次(热洗液要提前预热)。

11)洗涤缓冲液，5分钟×3次。

12)马来酸缓冲液泡，3min。

13)封阻抗体。封闭液：用马来酸缓冲液将10×的Blocking solution稀释至1×。取20mL 1×封 闭液于杂交管中，将尼龙膜放入(正面朝上)，在杂交仪中常温封闭1h,向20mL封闭液中加入1μl 抗体，在杂交仪中常温30min。

14)洗抗体。取出尼龙膜，用Washing buffer洗三次，每次15min，将膜在检测缓冲液中浸泡2min.

15)加底物显色。根据膜的大小配制适量显色液，配制比例：100μL底物用检测缓冲液稀释至5mL。尼龙膜放在大培养皿中，用1ml枪将显色液均匀滴于膜上后，暗处理30min后用蛋白成像仪显 色。

实验结果如图3所示。

实施例7dsDhc64C质转烟草植物抗桃蚜效果测定

挑取30头成蚜至六周野生型烟草上生产若蚜，24h之后移去成蚜，保留若蚜。待若蚜生长至成 虫1天时，将新育成蚜转移到野生型烟草(Nt-wt)和dsRNA质转烟草(Nt-cpDhc64C#4和 Nt-cpDhc64C#5)，每株10头成蚜进行若蚜扩繁。24h之后对实验烟草上的若蚜数目进行统计，每株 仅保留45头若蚜，其余全部移除。将带有若蚜的实验烟草移入生测装置中进行生测。每天对烟草上 的若蚜数目进行统计，每3天对烟草进行浇水，第七天对对照组(Nt-wt)和处理组(Nt-cpDhc64C#4 和Nt-cpDhc64C#5)进行蚜虫取样，抽提总RNA，反转录cDNA，进行荧光定量qPCR，对样品目的 基因MpDhc64C的表达量进行检测和比较分析。步骤如下：

1)qPCR引物序列

MpActin基因上游引物F：5'-GGTCGTACTACTGGTATCGTTTTG-3'，SEQ ID NO.13；

MpActin基因下游引物R：5'-CTCAGCGGTGGTGGTGAAG-3'，SEQ ID NO.14；

MpDhc64C基因上游引物F:5'-GCGGTCCTCCTGGTTCTGGTAA-3'，SEQ ID NO.15；

MpDhc64C基因下游引物R:5'-AGTTCTGGCGTGGTTGCTGATG-3'，SEQ ID NO.16。

2)qPCR反应体系

组份	使用量
		10μM F	0.2μL
10μM R	0.2μL
		模板cDNA	1.0μL
TB Green Premix Ex Taq II	5.0μL
		ddH<sub>2</sub>O	3.6μL

3)PCR程序

混匀后，进行PCR反应：95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s,39cycles；95℃，5s；60℃，30s。

-ΔΔCT

计算MpDhc64C基因表达量时，以Mpactin为内参，使用2法计算表达量。取食dsDhc64C质转 烟草桃蚜的MpDhc64C基因表达量显著低于对照组(如图5，P<0.01)，说明植物质体表达的dsRNA 进入桃蚜体内后诱发了RNAi效应，进而降解了MpDhc64C基因的mRNA。

蚜虫数目统计持续10天，实验结束后对实验桃蚜生存曲线、幸存实验蚜虫平均体重，桃蚜后代 数均进行了测量和统计分析。统计结果表明dsDhc64C质转烟草上桃蚜的存活率与野生型烟草上桃蚜 的存活率具有显著差异(如图4，P<0.01)，幸存桃蚜体重和后代数也同样存在显著差异(如图6和 图7)。上述结果表明，植物质体表达Dhc64C基因dsRNA可以有效防治非咀嚼式害虫桃蚜。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在防治桃蚜中的应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 269

<212> DNA

<213> 桃蚜(Myzus persicae)

<400> 1

ctcatgtaat tgatccaaaa gccatttcta aagaggcctt gtatggggct ttagacccca 60

atactaggga atggactgat ggattattta ctcatatatt aagaaaaatt gttgataatg 120

ttcgtggtga aattaacaaa agacaatgga tcatttttga tggtgatgtt gatcccgaat 180

gggttgaaaa tttaaattag gttttggatg ataacaaatt attaaccttg cctaatggag 240

aacgtttatc tcttccaccc aatgttcga 269

<210> 2

<211> 14088

<212> DNA

<213> 桃蚜(Myzus persicae)

<400> 2

atgacggagt cgctggacag cggcacagcc aacgccttgt cgtcgctgga cgacaacgcg 60

gccaactcgc tgtccatcat ggacacggcc gtgtttgtcg actacttaaa aaaaacggtg 120

tccaccgttt tgcacggcga caagtcggcc accacgtcca tgctggatct ggcgttcgac 180

gatcctgtca acctcgaatg cgtcaaaaag tttctgtccg accccaacac ctcgacaatt 240

tttgtccaga agagcgtcaa caaagacgaa gaaaccgaaa acggcgcaga cggagaagac 300

gataaagata taccaatatt ttatttgtcc aacgaagtcg ttttcaccaa tcaaaaaatg 360

acaagcttgt cttttatgaa aagagcaaca gtgatagaag ccgataaacc aattccaagt 420

caagtgcgac ttgtacagtt taacgatggt tcaccctatg aaacattgca tgcattagtt 480

agtaaagcta ttactccata cttcaagagt tatgtaaaag aatcaggaag agctgataga 540

gatggtgata aaatggctcc atcagtagaa aagactatgg ttgaattaga aatgggtcta 600

cttcatttac aacaaaatat tgatattcct gaagtgacat taacaattaa tccaactgta 660

ttatctgtaa taagcaaatt tgctgatgac ccaaatcgta aaccaaaagt atctgatttt 720

ggagctcttg ttgaagattc caagtttctt aatcagcttc aagctggtgt taaccgttgg 780

atcaaagaaa tacaaaaagt aaccaattta gatagagatc cattaaatgg aacagcttta 840

caagaaatta gtttttggtt aaataaagaa agagctttac atcgtataca agataagcgt 900

gatagtttag aagtgggcct tacattagat attttaaaac atggcaaacg ttttcatgca 960

actgtcagtt ttgatagtga tactggactc aagactgctt tagctactgt caatgattat 1020

aacactttaa tgaaagattt tcctatcaat gatcttctag ctgcaacaga tttagatcgt 1080

attcgtactg ctattgaaca tatttttatt catttacgta aaatacggag cacgaagtat 1140

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ttaaaagtgt taggtactag atttttaatg catataccct atgatgaatt tgaaaaagtc 1260

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gagtggagcg catttaatga aataatcaaa cgcaaagata aatctattca aactcaagtt 3720

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gtagctaaag ctaaagaagc tttagaactt aaagatccag cgggcagcgc attatcaagt 3960

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gctcgtttca gacaatattc ttcgtatgaa tatgtgaaga agcttttgca aagttatgtg 4200

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cagttaatgc gtaaacttag agtgaactgg acattttctg atataacatt gggacaaatc 4320

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ggagaaatgg ctctagaaga atttttgaaa caagtccgag atacttggca gtcatattct 4440

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gtttttgaag aagaagcttt aacatgggaa gaaaaactca atcgaattaa tactttgttc 4620

gatgtttgga ttgatgttca aagacgttgg gtttatttgg aaggtatttt ctcaggaagt 4680

gctgatatta aaactttgct accagttgaa acttcaagat tccacaatat tagttctgac 4740

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cttggagaat atttggagag agaaagaatg tcttttcctc gattttattt tgttggcgat 4920

gaagatcttt tagaaattat tggaaacagt aaaaatattt caagattaca gaaacatttc 4980

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ggagtagcat ctcgtgaagg tgaagaagtt atatttacca accctatatc tacaactgac 5100

catcccaaaa tcaacgaatg gcttacattg gttgagaagg aaatgcgatt tacattggca 5160

tcacgtctaa gtgaagcagt tactaatagc aagcaattta aacaagaaac tattgaccac 5220

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gaaaatgatt ctgtacctaa attaactcca ttagaaaatg tattggccca agttgaaaca 5400

tctttaaact ttttagcaga ttctgttttg caagagcaac caccattaag gcggaagaaa 5460

cttgaatatt taattaacga atatgttcat aaacgaatga tcactagaag actgatttct 5520

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actaatcaaa ctgatgtctt aaaacaactt accattcaaa tggctaatgc taatttttat 5640

tatgggtttg aataccttgg tgtgcaagac cgattagttc aaactccatt aactgatcgt 5700

tgttatttga ctatgacaca agctttagaa gctagattgg gaggatctcc atttggtcct 5760

gctggtactg gtaagactga gtccgtcaaa gctcttggtc atcagttggg acgttttgtc 5820

ttggtattca actgcgatga aacttttgat ttccaagcta tggggcgcat atttgttggt 5880

ctttgtcaag tgggagcatg gggatgtttt gatgagttta atagattaga ggaaagaatg 5940

ttatcagctg tctctcaaca gatacaaact attcaagaag cgcttaaatc ccaaatggat 6000

tctaagaaaa ctaatatcac tgtagagcta gttggaaagc aagtcagagt ttctacggat 6060

atggcaatat tcatcaccat gaatcctggt tatgctggcc gttcaaatct tccagacaat 6120

cttaaaaagt tattcaggtc attagccatg actaaacctg atagacaact tatagctgaa 6180

gttatgttgt tttctcaagg tttccgtaca gcggagaaac ttgcatgcaa aattgtaccg 6240

tttttcaaat tatgtgatga acagctttct aatcaatctc actatgattt tggactgcga 6300

gcattaaagt ctgttttagt atctgctgga aatgttaaaa gagaccgtat ccaacatatt 6360

aaaggtatta gcgcaacaac tgaaagacat agtttaaatg aagctgaaat cgcagaaaat 6420

ctaccagaac aagaaatatt gattcaatct gtgtgtgaaa caatggtacc taaactagtc 6480

gctgaagata ttccactttt attttctttg ttaaatgatg tgttccctca agttcaatat 6540

aaacgggctc aaatgacaga attgaaagaa caaataagaa aagtatgcca agaagagtac 6600

tatgtttgcg gagaagatga tgagcttggt ggtccttgga tggaaaagtg ttatatgggg 6660

gagacatgga ttcaaaaagt gctacaacta tatcaaattt gtgaattaaa tcatggttta 6720

atgatggttg gtccaagtgg atcgggtaaa tcaagtgctt ggaaagtatt attaaaagct 6780

ctcgaaagaa tggatggaat ggaaggacaa gctcatgtaa ttgatccaaa agccatttct 6840

aaagaggcct tgtatggggc tttagacccc aatactaggg aatggactga tggattattt 6900

actcatatat taagaaaaat tgttgataat gttcgtggtg aaattaacaa aagacaatgg 6960

atcatttttg atggtgatgt tgatcccgaa tgggttgaaa atttaaatta ggttttggat 7020

gataacaaat tattaacctt gcctaatgga gaacgtttat ctcttccacc caatgttcga 7080

ataatgtttg aggtacaaga tttaaaatat gccactcttg ctactgtatc tcgttgtggt 7140

atgatatggt ttagtgagga tgtcttaact actgagatga tatttgagaa ttatttgagt 7200

cgtttaaaaa gtatacctat tgatgaagga gacgaagatt caatatctct tattcctcaa 7260

ccagtttctg caacatcagg atctactgtt gaacaattta tgtccccatc tttacagctt 7320

cagttggata ttgtgacaat gctacaacct catctatcat cagatggttt agttgttaga 7380

tgcttagagt acgctataaa acaagaacat attatggact tcacccgatt gagagcatta 7440

ggatcattat tttctatgat taatcaaagc attaggaatg ttcttcaata caataggact 7500

cattcagact ttccacttcc acatgaccaa ttagaacagt atattccaaa atgcttggtt 7560

tatgctttat tatggagttt tgctggtgat gcaaaattga aagtgcgttc tgatattggc 7620

gaatttatta gatctgtaac aactgtagct ttacccccaa tgactgaaaa cataattgat 7680

tatgaagtca atgtccacgg agattgggtt ccttggtcta gtagagttcc acaagtagaa 7740

gtcgaaacac ataaagttgc atcacctgat gttgttgttc ctacattaga tactgtaaga 7800

catgaaacat tgctttacac gtggcttgca gagcacaaac ccttggtttt atgcggtcct 7860

cctggttctg gtaaaacgat gaccttattt tcggccttaa gagctctgcc tgatatggaa 7920

gttgtgggtt tgaacttttc atcagcaacc acgccagaac ttttattgaa aacgtttgat 7980

cattactgcg aataccgaaa aacacccaat ggaattttcc tatctcctat tcaacttggt 8040

aaatggttgg tattattctg tgatgaaatc aatttacctg atatggataa ctatggtact 8100

caaagagtaa tttcattctt gcgacaatta gtcgaacgaa gaggttttta caaaccaact 8160

ggagatcaag cttgggtatc tttggagaga atacaatttg ttggagcatg taatccaccg 8220

acagatcctg gtagaaagcc tttatcacat agattcttac gccatgtccc agtaatttat 8280

gttgactacc ctggtgaaac ctctttgaaa caaatttatg gaacattcag cagggcaatg 8340

ttgcgattaa ttcctaccct tcgtggttat gcagagcctc tgacaaatgc aatggttgaa 8400

ttttatttag catctcagga tcgttttact caagacatgc aacctcatta tgtatattct 8460

cctagagaga tgacccgttg ggttagagga atttgtgagg ccatcagacc tttggaaaca 8520

ttaagtgttg atggtctagt acgtctatgg gctcatgaag cattacgtct cttccaagat 8580

cgtctagtag atgatgttga acgtcaatgg acaaatgaaa atattgatat agttgccatg 8640

aaacattttc ctggaattaa taaagaagaa gctcttcaaa ggccaatact ttatagcaat 8700

tggttacata aagattatgt accggttgaa agaaaacaat tacgtgatta tgtagccgca 8760

agactgaagg tgttttatga agaagaatta gatgtaaaaa ttgtactttt tgatgaagta 8820

ttagatcatg ttttacgaat agacagaata tttagacaac ctcaaggtca tttgttgtta 8880

atcggtgttt ctggagctgg caagactaca ctttcgcgat ttgttgcatt tatgaatggt 8940

ctttctgtat ttcaaatcag agtacataat aaatacacaa gtgaagattt tgatgaagat 9000

ctgagagcag ttttgagaag atccggatgt aaaaatgaga aaataacatt tatactggat 9060

gaatcaaatg tattagaatc aggttttctt gaacgcatga acactctgtt ggctaatgga 9120

gaagttcctg gattatttga aggagatgaa tatactactt taatgaccca atgtaaggag 9180

ggaagtcaaa gagaaggtct tatgttagac tcaaatgaag aactttataa atggttcact 9240

ggtcaagtaa tgagaaattt gcatgttgtc ttcacaatga atcctagttc ggaaggatta 9300

aaggacagag cagctacctc tcctgcactt tttaacagat gtgttcttaa ttggtttgga 9360

gactggtcag atacagcatt attccaagtt ggccaagaat ttactcgatc tgtcgacttg 9420

gatggaccac caatgtggaa ggctcctgat ttcttcccat ctgcttgttc tttagttcct 9480

agtattccag actatcgtac tgcagttgtg aatgcctttg tttatgtaca tcaaacatta 9540

cataaggcaa acagccgatt ggtgaaaaga ggctcaagaa caatggcaat tacccctaga 9600

cattatttgg attttattaa tcattttgtg aaattacata aagaaaagag agctgaactt 9660

gaagaacaac aactccattt gaatgtaggt ctatcaaaaa tagctgaaac tgttgagcag 9720

gtggaagaga tgcaaaaatc attagcagtc aaatcgatag aattaaatac caaaaatgaa 9780

gcagccaatg ccaaattaca gcagatgttt aaagaacagc atgaagctga aaagcgtaaa 9840

gtacaatcac aagaaataca agcacaaatc aaagcacaac aagtattaat atcagaaaaa 9900

cgaaaagatg ttatggctga tcttgcacat gtggaaccgg ctgtcatgga tgctcagcaa 9960

gctgtaaagg aaatcaagaa acaacagtta gtcgaggtac ggtcgatggc taatccgcct 10020

gcagttgtta agttggcatt agaatccatt tgtttgttgc ttggcgaaaa tgcatctgat 10080

tggaaagcca tcagagcagt tgtcatgcga gagaatttca ttaattcgat tgttaataac 10140

tttagtacag aaaatatttc tgatgatgtt cgggaaaaaa tgcatagtag gtatttgaat 10200

aaccctgatt acacatttga aaaagtaaat cgtgctagta tggcctgtgg gcctatggtt 10260

aaatgggcta tagctcaggt tagttatgca gatgtactaa aaaaagtaga accattacga 10320

gatgaattaa aatctcttga aaatcaagca tcagaaaata aagttaaaaa tgaagaaact 10380

acatcactca tttctcagtt agaacaaaca atcactgagt accaagaaga gtatgcacaa 10440

ctaatttcac aagctcaagc aattaaatct gacttagaaa atgtccagag caaagttgat 10500

cgatcaattg ctcttttaaa atctttggta atcgaaaggg aaagatggga aagtacaaga 10560

gatactttca gatctcagat ggctacaatt attggagatg ttcttttatc atcagcttat 10620

ttagcttatg ctggttactt tgatcaacac tatcgtcaaa atctgtttac aacatggtgt 10680

cagcatttat atttagctgg tattcagtat agatctgata tagcattgac tgaatatttg 10740

tcaaatcctg atgaaaggct tcgttggcat gctaattcat tacctacaga tgacttatgt 10800

aacgaaaacg ctattatgtt gaagagatac aatagatatc cattaataat tgatccatca 10860

ggacaagcaa ctgagtttat cctcaaagaa tatgcagatg ctaagatcac aaaaacaagt 10920

ttcttggatg attcctttag aaaaaatctt gaatctgcat tacgttttgg aaatccattg 10980

cttgttcaag atgttgaaaa ctatgatcca attttgaatc ctgtattaaa tcgtgaacta 11040

cgtcgtactg gaggtcgtgt tttaataaca cttggcgacc aagatataga tttgtcacca 11100

aaatttgtga tatttttgtc tactcgtgat cctactgttg aattttcacc agatatatgt 11160

tctagagtaa tgtttgtcaa ctttacagta actaggtcgt cattacaaag tcaatgctta 11220

gatcgtgtat taaaggctga aaggcctgat attgacacaa aacgatctga cctactcaaa 11280

cttcaaggtg aattccactt gcgtttaaga cagttggaaa aatctctgtt acaagcatta 11340

aatgaagcta aaggtaaaat attggataat gattccgtaa taacaacatt agaaagactt 11400

aaacaagaag cagcagatat cagcaaaaag gtggaagaaa cagacaaagt tattgctgaa 11460

atcgaaacag tttcgcaaca atataaacct ttagctcaag cctgtagtaa catgtacttc 11520

acaatggaca gtttaaatca agttcatttt ctctatcagt attcattaaa attctttttg 11580

gatatcttca gttcagtttt attatctaat cccagattgg cgtccgtcac tgatcacaca 11640

tctcgattag atattgtcac taaggattta ttcacagtat gttatgaaag agtcgccaga 11700

gggatgttac ataatgatag gttgacatta gcaatattgt tatgtcgaat cagtttaaag 11760

ggatcgccaa ttggaaatat attggactct gagttccaat tcttcctccg tggtaaagaa 11820

ggagttttta gtgccaataa ctcatcagga cagggttctc ttagtagtct gaaccaagaa 11880

caaattgaag ccatgattag attatcacat agaatttcat catttaaaaa tttatcagaa 11940

cgagtcgagg agatgccaga gtttggccca tggcttgccc aaaatacacc tgaacaatgt 12000

gtacctaaat tgtgggacga atcaactccg tttagtcctg tggctactgc catgtatcaa 12060

cttcttgcta ttcaagcatt ccggccagat agagtgatag catcagctaa tctatttgtt 12120

gaagcaactc tgggtaccca attaacctct tcagcagagc gtgaacctga cttggcaact 12180

attgtcctaa atgaactgga ctgcagtgtt ccagctcttt tgtgttcggc tcctgggtat 12240

gatgcttctg gtcgtgttga tgatcttgct actcaacata accaactgtt gtcatctgta 12300

gcaattggtt cagctgaagg tttccgtcaa gctactgatg ccataaattc tgcagttcgt 12360

cttggacgat gggtcttgtt gaaaaatgtt catctggctc ctcaatggtt agtacagctt 12420

gaaaagaaac tacacagtct gcaacctcat accaacttca gactattttt aactatggaa 12480

ataaattctg ctgtacctgt aaatttattg agagcaggac gcatatttgt atttgaacca 12540

ccaccaggtg taaaagccaa tttgttacgg acattcaata ctattccggc atcacgcatg 12600

atgaaagtac ccaatgaaag agccagatta tactttttac ttgcatggtt ccatgctatt 12660

gtacaagagc gtctacgtta tactccactt ggttgggcca aacattatga attcaatgaa 12720

tctgatctac gagttgcttg tgatacattg gatacatgga ttgaagcaac agcaaaaagt 12780

cgtacaaatt tacctcctga gaaaattcct tgggacgcaa tagttacttt attgtcacaa 12840

tgtatctatg gtggtaaaat tgacaatgac tatgaccaaa ggctattgac atcattttta 12900

agcaagttgt tcacagcacg tagctttgaa acaggatttg cattagtagc taatgttgac 12960

ggtgttggag gagataatag gcatattaca atgcccaatg gatcaagacg agatcacttt 13020

ttacattgga ttgaaaattt gtcagataga caatcaccat cgtggttagg actaccaaat 13080

aatgctgaaa aagtactact gacaactaga ggtactgatt tggtgagcaa attattgaag 13140

atgcaacaac tcgaggatga agatgaactt gcttatgtta ccgaacaagc tgttaaagat 13200

ggaggacctg attccagtat tggacttcca acatctgatg gtcgtccagc ttggatgaga 13260

acattgcata actcagcaac tacctggcta caacttttac ctcaatcact tcagacttta 13320

aaacgtactg tagagaacat taaagatccg ctttatcgat atttcgagcg agaagtcaac 13380

tttggttcaa agttattaca ggaagttatt catgatttaa atgaagtagt agctatatgt 13440

caaggcgaaa agaaacaaac caactatcat aggagcttgt ttagtgattt ggttaaagga 13500

aaattgccag ttggttggcg tcgatacaca gtgcctagtg gatgtacagt aatccaatgg 13560

gtgtctgatt ttagccaacg tgtcaaacaa ctacaacaag tatcacagct tgtttctcaa 13620

cgaggtgcca atcaaatcaa atcattccca gtgtggcttg gaggtttatt aaatccagaa 13680

gcttatataa cagcaactag acagtgtatt gcacaagcca actcttggtc cttggaagaa 13740

ttaattctag atgtgactat tactgatgca ttagagtatg attcagttca acaagatgaa 13800

tgtagctttg gtgttattgg tttgaagcta caaggtgcac aatgtcgtaa taatcagttg 13860

ttgttaactt catctataat gactgattta ccagtgacat tattacgatg gactcatgtg 13920

tcggcagaag aacacttaag acctgataaa ctgtctctac cagtatattt aaattctacc 13980

cgagctgaat tattattcac tgtagaacta gatgtagctc ccggacaaga tcatcacaca 14040

ttctatgaaa gaggagttgc attattaaca tctgctgctt taaattag 14088

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcatgtaat tgatccaaaa gccat 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgaacattg ggtggaagag at 22

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgctcgagc tcatgtaatt gatccaaaag ccattt 36

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaagatctt cgaacattgg gtggaagaga taaac 35

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ataagaatgc ggccgcctca tgtaattgat ccaaaagcca ttt 43

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcggatcct cgaacattgg gtggaagaga taaac 35

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaaactgcag ctcatgtaat tgatccaaaa gccattt 37

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgcggatccc ctatataatt ttaagtggaa aaaaaa 36

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccagaaaga ggctggccc 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcagttcccg ccccttggg 19

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtcgtacta ctggtatcgt tttg 24

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctcagcggtg gtggtgaag 19

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcggtcctcc tggttctggt aa 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agttctggcg tggttgctga tg 22

<210> 17

<211> 203

<212> DNA

<213> 马铃薯(potato)

<400> 17

ggtacggacc gtactactct attcgtttca atatatttat ttgtttcagc tgactgcaag 60

attcaaaaat ttctttatta ttttaaattt tgtgtcactc aaaaccagat aaacaatttg 120

atatagaggc actatatata tacatattct cgattatata tgtaaatgag ttaacctttt 180

ttttccactt aaaattatat agg 203

Claims (10)

1.一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于：通过质体转化技术将表达桃蚜Dhc64C基因dsRNA的质转表达质粒转化至植物中。

2.根据权利要求1所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于：所述桃蚜Dhc64C基因dsRNA通过将SEQ ID NO：1所示序列和其反向互补序列通过马铃薯intron-loop序列连接表达获得。

3.根据权利要求1所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于：所述马铃薯intron-loop序列如SEQ ID NO：17所示。

4.根据权利要求1所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于：将桃蚜Dhc64C基因dsRNA连接至抗性质粒pYY12中，再通过质体转化技术转化至植物中。

5.根据权利要求1所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于，表达桃蚜Dhc64C基因dsRNA的质转表达质粒的制备方法包括：以桃蚜cDNA为模板，分别以引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8进行PCR扩增，得到Dhc64C-1^st(XhoI/BglII)片段和Dhc64C-2^nd(NotI/BamHI)片段；将Dhc64C-1^st(XhoI/BglII)片段和载体pUC-RNAi载体进行XhoI/BglII双酶切后连接，获得pUC-Dhc64C^1st中间质粒，以SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10对pUC-Dhc64C^1st中间质粒进行扩增，获得Dhc64C^1st-intron(Pst1/BamHI)片段；将Dhc64C-2^nd(NotI/BamHI)片段和Dhc64C^1st-intron(Pst1/BamHI)片段分别进行BamHI单酶切后连接，获得dsDhc64C质转表达质粒。

6.根据权利要求1所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于：所述植物包括烟草。

7.根据权利要求1所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于：所述质体转化包括基因枪介导的质体转化。

8.如权利要求1-7任一所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法在制备抗抗桃蚜的植物中的应用。

9.如权利要求1-7任一所述的所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法制备的转基因植物。

10.如权利要求2中所述的桃蚜Dhc64C基因dsRNA在防治桃蚜中的应用。

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