CN104711285A - 一种可稳定自发光的重组载体的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可稳定自发光的重组载体的构建方法及其应用。本发明的重组载体是将叶绿体rps7基因上游同源臂、脂肪酸还原酶编码基因、转移酶编码基因、荧光素酶α亚基编码基因、荧光素酶β亚基编码基因、合成酶编码基因、黄素还原酶编码基因和叶绿体ndhB基因下游同源臂插入叶绿体表达载体中得到的载体。本发明的重组载体上有两段来源于杨树(山新杨)叶绿体DNA的序列作为同源重组片段，将来可将发光基因定点插入杨树叶绿体基因组的rps7基因和ndhB基因之间的间隔区，并使之在杨树叶绿体基因组中高效表达，可以获得自发光的转基因杨树，具有很好的应用前景。

Description

一种可稳定自发光的重组载体的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可稳定自发光的重组载体的构建方法及其应用。

背景技术

细菌发光基因(lux)的成功分离和表达极大地促进了其在基础和应用研究上的进展，lux基因是编码和调控发光细菌生物发光的操纵子，它可作为报告基因，具有快速、简便、灵敏和对细胞无伤害的优点。另外，可以通过植物基因工程技术将分离出的发光基因导入较大植物和树木上，获得一些可以自发光的植物，夜晚可以当路灯，减少碳的排放量。

一个完整的细菌发光系统由多个基因融合而成，必须在一个启动子下启动表达。叶绿体载体具有在同一启动子调控之下同时表达多个外源基因的特点，为细菌发光基因在真核中表达提供了可行性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体的制备方法如下1)或2)所示：

1)所述重组载体是将叶绿体rps7基因上游同源臂、脂肪酸还原酶编码基因、转移酶编码基因、荧光素酶α亚基编码基因、荧光素酶β亚基编码基因、合成酶编码基因、黄素还原酶编码基因和叶绿体ndhB基因下游同源臂插入叶绿体表达载体中得到的载体；

2)所述重组载体是将所述脂肪酸还原酶编码基因、所述转移酶编码基因、所述荧光素酶α亚基编码基因、所述荧光素酶β亚基编码基因、所述合成酶编码基因和所述黄素还原酶编码基因插入叶绿体表达载体中得到的载体。

上述重组载体中，所述脂肪酸还原酶、所述转移酶、所述荧光素酶α亚基、所述荧光素酶β亚基、所述合成酶和所述黄素还原酶均来源于细菌。

上述重组载体中，所述脂肪酸还原酶如序列表中序列表6所示；所述转移酶如序列表中序列表7所示；所述荧光素酶α亚基的氨基酸序列如序列表中序列表4所示；所述荧光素酶β亚基如序列表中序列表5所示；所述合成酶如序列表中序列表8所示；所述黄素还原酶如序列表中序列表9所示。

上述重组载体中，所述脂肪酸还原酶编码基因、所述转移酶编码基因、所述荧光素酶α亚基编码基因、所述荧光素酶β亚基编码基因、所述合成酶编码基因和所述黄素还原酶编码基因是以从上游至下游依次由脂肪酸还原酶编码基因、转移酶编码基因、荧光素酶α亚基编码基因、荧光素酶β亚基编码基因、合成酶编码基因和黄素还原酶编码基因串联而成的DNA片段插入叶绿体表达载体；

所述DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列1所示；

所述叶绿体rps7基因上游同源臂的序列如序列表中序列2所示；

所述叶绿体ndhB基因下游同源臂的序列如序列表中序列3所示。

上述重组载体中，1)中，所述插入为将所述叶绿体rps7基因上游同源臂、所述DNA片段和所述叶绿体ndhB基因下游同源臂共同插入叶绿体表达载体的多克隆位点中，得到所述重组载体；

2)中，所述插入为将所述DNA片段插入叶绿体表达载体的多克隆位点中，得到所述重组载体。

上述重组载体中，所述叶绿体表达载体为pPTC2载体。

上述重组载体中，1)中所述的重组载体为将序列表中序列1所示的DNA片段替换pPTC2载体的NheⅠ和AgeⅠ酶切位点间的DNA片段，且将序列表中序列2所示的叶绿体rps7基因上游同源臂替换pPTC2载体的KpnⅠ和BbvⅡ位点间的片段，且将序列表中序列3所示的叶绿体ndhB基因下游同源臂替换pPTC2载体的SphⅠ和Bsu36Ⅰ酶切位点间的DNA片段后得到的载体。

本发明的另一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌是将上述重组载体导入宿主菌中得到的菌。

上述重组菌中，所述宿主菌为大肠杆菌。

上述重组载体或上述重组菌在制备自发光产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明从发光菌株中克隆了发光基因，将其构建到叶绿体表达载体中，得到重组载体。通过实验表明：本发明的重组载体转化到大肠杆菌后可稳定存在于大肠杆菌中，并可大量复制质粒，发出肉眼可见的蓝绿光。本发明的重组载体上还有两段来源于杨树(山新杨)叶绿体DNA的序列作为同源重组片段，将来可将发光基因定点插入杨树叶绿体基因组中的rps7基因和ndhB基因之间的间隔区，并使之在杨树叶绿体基因组中高效表达，可以获得自发光的转基因杨树。本发明不仅在一定程度上克服了核基因转化的不足，而且具有外源基因可定点插入、外源基因表达效率高、变异小、便于遗传操作、安全性好(母系遗传，外源基因不随花粉扩散)等优越性，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为重组载体pPTC2-seq6612的构建示意图。

图2为重组载体pPTC2-seq6612的酶切鉴定图。其中1为Marker；2为pstⅠ单酶切；3为未酶切。

图3为不同生长时期的含有重组载体pPTC2-seq6612的大肠杆菌。其中，左边是衰亡期；右边是对数生长期。

图4为含有重组载体pPTC2-seq6612的大肠杆菌和不含有重组载体pPTC2-seq6612的大肠杆菌的对比图。其中左边为含有重组载体的大肠杆菌；右边为含有转空载体的大肠杆菌。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pPTC2载体在文献“王玉华，张秀海，吴忠义，杨清，陈国强，吴琼，黄丛林.通过叶绿体基因工程在烟草中合成中长链羟基脂肪酸聚酯.科学通报，2005，50(10)：979-986.”中公开过，公众可从北京市农林科学院获得。

实施例1、可稳定自发光的重组载体及其应用

一、重组载体的构建

1、发光基因luxCDABEG的获得

提取鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi，IA00149)的基因组DNA，以鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi，IA00149)的基因组DNA为模板，采用PF和PR引物进行PCR扩增，得到如序列表中序列1所示的发光基因luxCDABEG。引物序列如下所示：

PF：5'-ATACCGAAACTACATACTCAG-3'；

PR：5'-TACCCAGAATAAGTAGGTCGA-3'。

发光基因luxCDABEG是依次由脂肪酸还原酶编码基因(luxC)、转移酶编码基因(luxD)、荧光素酶α亚基编码基因(luxA)、荧光素酶β亚基编码基因(luxB)、合成酶编码基因(luxE)和黄素还原酶编码基因(luxG)串联在一起组成的。所述脂肪酸还原酶如序列表中序列表6所示；所述转移酶如序列表中序列表7所示；所述荧光素酶α亚基的氨基酸序列如序列表中序列表4所示；所述荧光素酶β亚基如序列表中序列表5所示；所述合成酶如序列表中序列表8所示；所述黄素还原酶如序列表中序列表9所示。

luxA和luxB基因是紧密相连的，它们分别编码荧光素酶的α、β亚基。荧光素酶分别将还原态的还原型黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为氧化型黄素单核苷酸(FMN)及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为450-490nm的蓝绿光。luxC和luxD基因位于luxA和luxB基因的上游一侧，分别编码脂肪酸还原酶和转移酶；luxE基因位于luxA和luxB基因的下游一侧，编码合成酶；luxC、luxD和luxE基因形成脂肪酸还原酶复合物，将长链脂肪酸转化为长链脂肪醛。luxG基因位于luxE基因下游，编码黄素还原酶，参与氧化型黄素单核苷酸的还原。

2、同源臂的获得

提取杨树(山新杨)的叶绿体DNA，以杨树叶绿体DNA为模板，采用PF1和PR1：5'-AGATCGTGATTGGATCCGCAT-3'；PR1：5'-GAGGGCTTAATTGATCCATG-3')引物进行PCR扩增，得到如序列表中序列2所示的F1同源臂；以杨树叶绿体DNA为模板，采用PF2和PR2引物进行PCR扩增，得到如序列表中序列3所示的F2同源臂。引物序列如下所示：

PF1：5'-AGATCGTGATTGGATCCGCAT-3'；

PR1：5'-GAGGGCTTAATTGATCCATG-3'；

PF2：5'-CCATGGAATAAGGTTTGAT-3'；

PR2：5'-AAAGCAACGACTGGAGTG-3'。

3、重组载体的构建

用限制性内切酶KpnⅠ和BbvⅡ对上述步骤2获得的F1同源臂和pPTC2载体进行双酶切，连接，得到重组载体1；用限制性内切酶SphⅠ和Bsu36Ⅰ对上述步骤2获得的F2同源臂和重组载体1进行双酶切，连接，得到重组载体2；用限制性内切酶NheⅠ和AgeⅠ对上述步骤1中获得的发光基因luxCDABEG和重组载体2进行双酶切，连接，得到重组载体pPTC2-seq6612(图1)。

对重组载体pPTC2-seq6612进行测序结果表明，重组载体pPTC2-seq6612为将如序列表中序列1所示的发光基因片段替换pPTC2载体的NheⅠ和AgeⅠ位点间的片段，且将如序列表中序列2所示的上游同源臂序列替换pPTC2载体的KpnⅠ和BbvⅡ位点间的片段，且将如序列表中序列3所示的下游同源臂序列替换pPTC2载体的SphⅠ和Bsu36Ⅰ位点间的片段后得到的载体。

用限制性内切酶pstⅠ对重组载体pPTC2-seq6612进行酶切，同时以未酶切的重组载体pPTC2-seq6612为对照，酶切结果如图2所示。

二、重组载体的应用

分别将上述步骤一得到的重组载体pPTC2-seq6612和空载体pPTC2转化大肠杆菌DH5α，得到含有重组载体pPTC2-seq6612的大肠杆菌和含有空载体pPTC2的大肠杆菌。37℃，200rpm过夜振荡培养含有重组载体pPTC2-seq6612的大肠杆菌和含有空载体pPTC2的大肠杆菌。

结果如图3和图4所示：转入重组载体pPTC2-seq6612的大肠杆菌可稳定的发出蓝绿色的光，而未转入重组载体pPTC2-seq6612的大肠杆菌是不发光的，并且不同生长时期的转入重组载体pPTC2-seq6612的大肠杆菌的发光强弱不同，生长对数期(图3中的右图)的发光效果最好。

Claims (9)

1.一种重组载体，其制备方法如下1)或2)所示：

1)所述重组载体是将叶绿体rps7基因上游同源臂、脂肪酸还原酶编码基因、转移酶编码基因、荧光素酶α亚基编码基因、荧光素酶β亚基编码基因、合成酶编码基因、黄素还原酶编码基因和叶绿体ndhB基因下游同源臂插入叶绿体表达载体中得到的载体；

2)所述重组载体是将所述脂肪酸还原酶编码基因、所述转移酶编码基因、所述荧光素酶α亚基编码基因、所述荧光素酶β亚基编码基因、所述合成酶编码基因和所述黄素还原酶编码基因插入叶绿体表达载体中得到的载体。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述脂肪酸还原酶如序列表中序列表6所示；所述转移酶如序列表中序列表7所示；所述荧光素酶α亚基的氨基酸序列如序列表中序列表4所示；所述荧光素酶β亚基如序列表中序列表5所示；所述合成酶如序列表中序列表8所示；所述黄素还原酶如序列表中序列表9所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于：

所述脂肪酸还原酶编码基因、所述转移酶编码基因、所述荧光素酶α亚基编码基因、所述荧光素酶β亚基编码基因、所述合成酶编码基因和所述黄素还原酶编码基因是以从上游至下游依次由脂肪酸还原酶编码基因、转移酶编码基因、荧光素酶α亚基编码基因、荧光素酶β亚基编码基因、合成酶编码基因和黄素还原酶编码基因串联而成的DNA片段插入叶绿体表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述叶绿体rps7基因上游同源臂的序列如序列表中序列2所示；

所述叶绿体ndhB基因下游同源臂的序列如序列表中序列3所示。

5.根据权利要求1-4中任一所述的重组载体，其特征在于：

1)中，所述插入为将所述叶绿体rps7基因上游同源臂、所述DNA片段和所述叶绿体ndhB基因下游同源臂插入叶绿体表达载体的多克隆位点中，得到所述重组载体；

2)中，所述插入为将所述DNA片段插入叶绿体表达载体的多克隆位点中，得到所述重组载体。

6.根据权利要求1-5中任一所述的重组载体，其特征在于：所述叶绿体表达载体为pPTC2。

7.一种重组菌，是将权利要求1-6中任一所述的重组载体导入宿主菌中得到的菌。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。

9.权利要求1-6中任一所述的重组载体或权利要求7或8所述的重组菌在制备自发光产品中的应用。