DE60019134T2

DE60019134T2 - Verfahren und zusammensetzungen für die abgabe von pharmazeutischen wirkstoffen

Info

Publication number: DE60019134T2
Application number: DE60019134T
Authority: DE
Inventors: Kesavan Esuvaranathan; Ratha Mahendran; Carmel Lawrencia
Original assignee: Genecure Pte Ltd
Current assignee: Genecure Pte Ltd
Priority date: 1999-09-01
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2020-09-02
Also published as: US20090054364A1; JP2003508456A; ATE292187T1; US7320963B2; CA2384425C; WO2001015755A3; DE60019134D1; TWI262085B; JP4995388B2; WO2001015755A2; US7709457B2; EP1208218A2; NO329773B1; NO20020983D0; AUPQ259399A0; AU781684B2; CA2384425A1; ES2240157T3; EP1208218B1; US20020146830A1

Description

QUERVERWEIS ZU VERWANDTEN ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der australischen provisorischen Anmeldung Nr. PQ2593/99, deren gesamter Inhalt in diese Anmeldung durch Bezugnahme hier aufgenommen wird.
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen die Abgabe von pharmazeutischen Agenzien in Zellen hinein, insbesondere die Abgabe von Polynukleotiden in Zellen hinein durch nicht-virale Verfahren, entweder in vitro oder in vivo. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Abgabe von pharmazeutischen Agenzien für die Behandlung von Krebs, insbesondere die Behandlung von Blasenkrebs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Trotz vieler jüngster Fortschritte in gentherapeutischen Verfahren ist die therapeutische Abgabe von Genen in verschiedene Zelltypen, insbesondere die in vivo Abgabe, nicht erreicht worden, einfach, weil Verfahren für die Abgabe von therapeutisch wirksamen Mengen solcher Gene in die bestimmten Zellen eines Patienten, die einer Behandlung bedürfen, nicht verfügbar sind. Die wirksame Abgabe von therapeutisch ausreichenden Mengen an Genen als auch anderer therapeutischer Moleküle hat sich häufig als schwierig dargestellt, wenn nicht unmöglich, weil z.B. die Zellmembran eine selektiv permeable Barriere darstellt. Dazu können, selbst wenn Gene oder andere biologisch aktive Moleküle erfolgreich in die Zielzellen eintreten, diese abgebaut, fehlgeleitet, oder im Falle von Genen, nicht richtig transkribiert werden.
Ein Beispiel eines Zielzelltyps für den wirksame Abgabeverfahren, insbesondere für die Gentherapie, fehlen, sind die Urothelzellen der Blase. Diese Verfahren würden insbesondere bei der Behandlung von Blasenkrebs nützlich sein. Trotz Fortschritten bei endoskopischen und intravesikalen chemotherapeutischen Methoden, weist der Blasenkrebs an der Oberfläche immer noch eine hohe Rekurrenz- und Progressionsrate auf (Nseyo, UO, Lamm DL. (1996) Semin. Oncol. 5: 598–604). Derzeit gehört zur erfolgreichsten Behandlung die wöchentliche Instillation von 'lebenden' Bacillus Calmette-Guérin (BCG) für zwei Stunden in die Blase (Morales, A. et al. (1976) J. Urol., 116: 180–183; Brosman, S. A. (1992) Urol. Clin. North Am., 19: 557–564). Obwohl wirksam, mit regelmäßigen Ansprechraten von 60–70%, sind Nebenwirkungen, wie z.B. Dysurie, Hämaturie, Rhytmus und Cystitis üblich und manchmal heftig (Lamm, D. L. (1992) Urol. Clin. North Am., 19: 565–572). Darüber hinaus reagieren eine signifikante Anzahl von Patienten nicht auf die BCG-Therapie und die Toxizität ist allgemein bekannt. Die Erforschung des Mechanismus der BCG-Aktivierung der Immunantwort führte zur Identifikation von Cytokinen, kostimulatorischen Molekülen und Adhäsionsmolekülen, die eine wichtige Rolle bei der Förderung der cytotoxischen Antwort gegen die Tumoren spielen (Taniguchi, K. et al. (1999) Clin. Exp. Immunol., 115: 131–5, 1999; Patard, J. J. et al. (1998) Urol. Res., 26: 155–9; Kurisu, K. et al. (1994) Cancer Immunol. Immunother, 39: 249–53; Sander, B. et al. (1996) J. Urology, 156: 536–41; Chow, N. H. et al. (1998) Urology, 52: 1015–9; Jackson, A. M. et al. (1995) Clin. Exp. Immunol., 99: 369–75).
Blasenkrebse an der Oberfläche haben einige Eigenschaften, die sie besonders attraktiv für die in vivo Gentherapie machen, nämlich, dass die Tumoren häufig örtlich begrenzt sind und therapeutische Gene durch einfache intravesikale Verabreichung in direkten Kontakt mit dem Tumor gebracht werden können. Ferner kann die Reaktion des Tumors auf die Behandlung durch Zystoskopie und Urin-Cytologie einfach bestimmt werden. Eines der Haupthindernisse bei der erfolgreichen Transfektion des Übergangszellepithels ist die Gegenwart einer Glykosaminoglycanschicht, die ein entscheidendes Hindernis bei der Aufnahme der DNA-Komplexe spielen kann (Ruponen, M. et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta, 1415: 331–41).
Virale Expressionsvektoren sind verwendet worden, um spezifische Gene lokal in die Blase einzuführen (Sutton, M. A. et al. (1997) Urology, 49: 173–80; Lee, S. S. et al. (1994) Cancer Res., 54: 3325–8). Jedoch weisen virale Vektoren einige Einschränkungen in der klinischen Praxis, wie z.B. Immunogenität und Sicherheit, auf. Eine neuere Studie von Li et al. hat die Wirksamkeit der adenoviralen Gentherapie für Blasenkrebs infolge der Unterschiede in viralen Rezeptorniveaus, die in menschlichen Blasenkrebszelllinien beobachtet wurden (Li, Y. et al. (1999) Cancer Res., 59: 325–30), in Frage gestellt.
Ein alternatives Verfahren der Gentherapie schließt die Liposomen vermittelte Abgabe von DNA in Zellen ein. Der Vorteil eines nicht-viralen Systems ist, dass es nicht von einem Rezeptor abhängt und daher bei allen Tumoren einsetzbar sein sollte. Brigham et al. berichtete zuerst über die Abgabe von DNA in Gewebe unter Verwendung von kationischen Liposomen (Brigham, K. L. et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298: 278–81). Seitdem haben sich die kationischen Lipide als wirksame Träger für die örtlich begrenzte und systemische Abgabe von DNA an Gewebe in vivo herausgestellt (Plautz, G. E. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4645–9; Nabel, G. J. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11307–11; Zhu, N. et al. (1993) Science, 261: 209–11). Kationische Liposomen weisen einige wichtige Vorteile gegenüber viralen Gen-Abgabesysteme in der klinischen Praxis auf. Diese beinhalten die Fähigkeit, eine Vielzahl von Genkonstrukten, von einfachen Plasmiden bis zu chromosomalen Fragmenten, verwenden zu können und geringere Sicherheitsbedenken. Ihr prinzipieller Nachteil ist jedoch ihre relativ geringe Transfektionseffizienz im Vergleich zu viralen Techniken.
Deshalb werden immer noch Verfahren für die Steigerung der Transfektionseffizienz, insbesondere von Urothelzellen, benötigt, wie auch allgemeine Verfahren für die Abgabe von pharmazeutischen Wirkstoffen an die Blase.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt verbesserte Verfahren für die Abgabe von pharmazeutischen Agenzien, insbesondere Polynukleotiden, in Zellen, insbesondere Uroepithelzellen, bereit. Es stellte sich jetzt heraus, dass die Verwendung von solubilisiertem Cholesterol als Additiv die Transfektionseffizienz von DNA, die mit einem kationischen Lipid, einem kationischen Polymer oder einem Dendrimer komplexiert ist, steigern kann. Bevorzugt wird das Cholesterol mittels eines Cyclodextrins, bevorzugt Methyl-β-cyclodextrin, solubilisiert. Obwohl sie für die Transfektion von Urothelzellen entweder in vitro oder in vivo besonders vorteilhaft sind, können die Transfektionsverfahren der Erfindung für die Transfektion einer Vielzahl von anderen Zelltypen eingesetzt werden. Darüber hinaus kann die steigernde Wirkung von solubilisiertem Cholesterol auf den Eintritt von DNA, dass entweder mit einem kationischen Lipid, einem kationischen Polymer oder einem Dendrimer komplexiert ist, für die Abgabe anderer Typen pharmazeutischer Agenzien in Urothelzellen eingesetzt werden, entweder in vitro oder in vivo durch intravesikuläre Abgabe.
Dementsprechend stellt die Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zum Transfizieren eines oder mehrerer Polynukleotide in die Zelle bereit. Das Verfahren schließt das Kombinieren (i) des/der Polynukleotids(e) mit (ii) einem kationischen Lipid, einem kationischen Polymer oder einem Dendrimer oder Kombinationen davon und (iii) eine solubilisierte Cholesterolzubereitung ein, um eine Transfektionszusammensetzung zu bilden, und das Anwenden der Transfektionszusammensetzung auf Zellen, so dass die Zellen mit dem/den Polynukleotid(en) transfiziert werden. Die solubilisierte Cholesterolzubereitung umfasst bevorzugt mit einem Cyclodextrin solubilisiertes Cholesterol. Das Cyclodextrin ist bevorzugt ein Methyl-β-cyclodextrin. Andere geeignete Cyclodextrine beinhalten Alpha-Cyclodextrin, Beta-Cyclodextrin, Gamma-Cyclodextrin, sulfatiertes Beta-Cyclodextrin, tertiäres Amin Beta-Cyclodextrin, quaternäres Amin Beta-Cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, 2,6-Di-O-methyl-beta-cyclodextrin, Hydroxyethyl-beta-cyclodextrin, 6-Desoxy-6-S-beta-D-galactopyranosyl-6-thio-cyclomalto-heptaose, Sulfobutylether-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-ethyl-beta-cyclodextrin, Diethyl-beta-cyclodextrin, Dimethyl-beta-cyclodextrin, zufallsverteiltes Methyl-beta-cyclodextrin, Glucosyl-beta-cyclodextrin und Maltosyl-beta-cyclodextrin. Ein bevorzugtes kationisches Lipid ist DOTAP, wohingegen ein bevorzugtes Dendrimer Superfect ist. Andere geeignete kationische Lipide und Dendrimere beinhalten DOPE, DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM, Polylysin, Polyhistidin, Polyarginin, Polyethylenimin, Poly(4-vinylpyridin), Poly(vinylamin), Poly(4-vinyl-N-alkyl-pyridiniumhalogenid) oder Kombinationen davon. Das Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Polynukleotiden, wie z.B. Plasmid-DNA, virale DNA, chromosomale Fragmente, Antisense-Oligonukleotide, Antisense-Phosphorthioat-Oligonukleotide, RNA-Moleküle und Ribozyme oder Kombinationen davon zu transfizieren.
Die Transfektionsverfahren der Erfindung werden bevorzugt mit eukaryotischen Zellen, noch bevorzugter Säugetierzellen und am meisten bevorzugt Urothelzellen verwendet. Die Transfektionsverfahren können in vitro durchgeführt werden, z.B., wobei die Transfektionszusammensetzung auf Zellen in Kultur angewendet wird. Alternativ dazu können die Verfahren in vivo durch Anwenden der Transfektionszusammensetzung auf Zellen in vivo durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Transfektionszusammensetzung durch intravesikale Abgabe an eine Blase eines Subjekts auf Urothelzellen in vivo angewendet.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren für die Abgabe eines pharmazeutischen Agens in die Urothelzellen eines Subjekts bereit. Das Verfahren schließt das Kombinieren des pharmazeutischen Agens mit einer solubilisierten Cholesterolzubereitung, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden, und die intravesikuläre Abgabe der pharmazeutischen Zusammensetzung in die Blase des Subjekts ein, so dass das pharmazeutische Agens an Urothelzellen des Subjekts abgegeben wird. Die solubilisierte Cholesterolzubereitung umfasst bevorzugt mit einem Cyclodextrin solubilisiertes Cholesterol. Das Cyclodextrin ist bevorzugt Methyl-β-cyclodextrin. Andere geeignete Cyclodextrine beinhalten Alpha-Cyclodextrin, Beta-Cyclodextrin, Gamma-Cyclodextrin, sulfatiertes Beta-Cyclodextrin, tertiäres Amin Beta-Cyclodextrin, quaternäres Amin Beta-Cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, 2,6-Di-O-methyl-beta-cyclodextrin, Hydroxyethyl-beta-cyclodextrin, 6-Desoxy-6-S-beta-D-galactopyranosyl-6-thio-cyclomalto-heptaose, Sulfobutylether-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-ethyl-beta-cyclodextrin, Diethyl-beta-cyclodextrin, Dimethyl-beta-cyclodextrin, zufallsverteiltes Methyl-beta-cyclodextrin, Glucosyl-beta-cyclodextrin und Maltosyl-beta-cyclodextrin. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das pharmazeutische Agens (i) mindestens ein Polynukleotid und (ii) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer oder ein Dendrimer oder Kombinationen davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Behandlung von Blasenkrebs in einem Subjekt. Das Verfahren schließt das Kombinieren eines pharmazeutischen Agens mit einer solubilisierten Cholesterolzubereitung, um eine therapeutische Zusammensetzung zu bilden, wobei das pharmazeutische Agens eine Anti-Krebsaktivität gegen Blasenkrebszellen aufweist, und die intravesikuläre Abgabe der therapeutischen Zusammensetzung in die Blase des Subjekts ein, so dass die Blasenkrebszellen des Subjekts mit dem pharmazeutischen Agens behandelt werden. Die solubilisierte Cholesterolzubereitung umfasst bevorzugt mit einem Cyclodextrin solubilisiertes Cholesterol. Das Cyclodextrin ist bevorzugt Methyl-β-cyclodextrin. Andere geeignete Cyclodextrine beinhalten Alpha-Cyclodextrin, Beta-Cyclodextrin, Gamma-Cyclodextrin, sulfatiertes Beta- Cyclodextrin, tertiäres Amin Beta-Cyclodextrin, quaternäres Amin Beta-Cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, 2,6-Di-O-methyl-beta-cyclodextrin, Hydroxyethyl-beta-cyclodextrin, 6-Desoxy-6-S-beta-D-galactopyranosyl-6-thio-cyclomalto-heptaose, Sulfobutylether-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-ethyl-beta-cyclodextrin, Diethyl-beta-cyclodextrin, Dimethyl-beta-cyclodextrin, zufallsverteiltes Methyl-beta-cyclodextrin, Glucosyl-beta-cyclodextrin und Maltosyl-beta-cyclodextrin.
Ein bevorzugtes pharmazeutisches Agens für die Behandlung von Blasenkrebs umfasst mindestens ein Polynukleotid und entweder ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer oder ein Dendrimer, wobei das/die Polynukleotid(e) eine Anti-Krebsaktivität vermittelt(n). Zum Beispiel kann das/die Polynukleotid(e) mindestens einen Expressionsvektor umfassen, der für ein Protein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Interleukinen, Interferonen, koloniestimulierenden Faktoren, anti-angiogenischen Faktoren, anti-metastasebildenden Faktoren, Membranrezeptoren und Tumorsuppressoren besteht. Bevorzugte Proteine schließen Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 9 (IL-9), Interleukin-11 (IL-11), Interleukin-12 (IL-12), Interleukin-13 (IL-13), Interleukin-18 (IL-18), Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, den Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF), den Granulozyten koloniestimulierenden Faktor (G-CSF), den Makrophagen koloniestimulierenden Faktor (M-CSF), ein Hitzeschockprotein (HSP), p53, anti-angiogenische Faktoren, z.B., Antagonisten des Vaskular-endothelialen Zellwachstumsfaktors (VEGF), wie zum Beispiel Antisense-Moleküle, anti-metastasebildende Faktoren, z.B., Gewebeinhibitoren der Metalloproteinasen (TIMP's) und Faktoren, welche die BCG-Aktivität steigern, wie z.B. Fibronektinrezeptoren ein. Besonders bevorzugte Proteine beinhalten IL-2, GMCSF und Interferon-γ und Kombinationen davon.
Das Verfahren der Erfindung zur Behandlung von Blasenkrebs kann auch das Durchführen einer zusätzlichen Anti-Blasenkrebsbehandlung am Subjekt einschließen. Eine bevorzugte zusätzliche Anti-Blasenkrebsbehandlung, die mit dem Behandlungsverfahren der Erfindung zum Beispiel kombiniert werden kann, ist die Bacillus Calmette-Guérin (BCG)-Therapie.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Transfektionszusammensetzungen. Die Erfindung stellt eine Transfektionszusammensetzung bereit, die umfasst: mindestens ein Polynukleotid; entweder ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer oder ein Dendrimer; und eine solubilisierte Cholesterolzubereitung. Die solubilisierte Cholesterolzubereitung umfasst bevorzugt mit einem Cyclodextrin solubilisiertes Cholesterol. Das Cyclodextrin ist bevorzugt Methyl-β-cyclodextrin. Andere geeignete Cyclodextrine beinhalten Alpha-Cyclodextrin, Beta-Cyclodextrin, Gamma-Cyclodextrin, sulfatiertes Beta-Cyclodextrin, tertiäres Amin Beta-Cyclodextrin, quaternäres Amin Beta-Cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, 2,6-Di-O-methyl-beta-cyclodextrin, Hydroxyethyl-beta-cyclodextrin, 6-Desoxy-6-S-beta-D-galactopyranosyl-6-thio-cyclomalto-heptaose, Sulfobutylether-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-ethyl-beta-cyclodextrin, Diethyl-beta-cyclodextrin, Dimethyl-beta-cyclodextrin, zufallsverteiltes Methyl-beta-cyclodextrin, Glucosyl-beta-cyclodextrin und Maltosyl-beta-cyclodextrin. Ein bevorzugtes kationisches Lipid ist DOTAP, wohingegen ein bevorzugtes Dendrimer Superfect ist. Andere geeignete kationische Lipide und Dendrimere beinhalten DOPE, DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM, Polylysin, Polyhistidin, Polyarginin, Polyethylenimin, Poly(4-vinylpyridin), Poly(vinylamin), Poly(4-vinyl-N-alkyl-pyridiniumhalogenid) oder Kombinationen davon. Die Transfektionszusammensetzung kann ein oder mehrere einer Vielzahl von Polynukleotiden, wie z.B. Plasmid-DNA, virale DNA, chromosomale Fragmente, Antisense-Oligonukleotide, Antisense-Phosphorthioat-Oligonukleotide, RNA-Moleküle und Ribozyme oder Kombinationen davon umfassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A–1C sind Photographien von entweder untransfizierten Zellen oder Zellen, die mit DOTAP oder DMBC transfiziert wurden, wobei das Expressionsniveau des pCMVlacZ-Rezeptorplasmids verglichen wird. Untransfizierte Zellen (1A) färben sich nicht mit X-gal. Ein paar Zellen wurden mit pCMVlacZ/DOTAP transfiziert und diese färbten sich positiv mit X-gal (1B). Die Transfektion mit pCMVlacZ/DMBC ergab eine Steigerung der Anzahl der X-gal-positiven Zellen (1C). Das heißt, dass sich die Transfektionseffizienz nach der Zugabe von Methyl-β-cyclodextrin, das Cholesterol (MBC) bis DOTAP (D) enthält, steigerte.
1D ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung von MBC und herkömmlichen Transfektionsagenzien zeigt. Mit DOTAP + Cholesterol enthaltendem Methyl-β-cyclodextrin (DMBC) oder Superfect + Cholesterol enthaltendem Methyl-β-cyclodextrin (SMBC) transfizierte Zellen zeigten eine Zunahme bei der Anzahl von Zellen, die sich bezüglich der β-gal-Aktivität im Vergleich zu DOTAP oder Superfect alleine positiv färbten. MBC steigerte nicht die Aufnahme von nackter DNA.
1E ist ein Balkendiagramm, das einen Vergleich der Transfektionseffizienz von DMBC und herkömmlichen DOTAP:Cholesterol (AVDC) zeigt. Wie bei der optischen Dichte bei 420 nm gemessen zeigten untransfizierte Zellen (KON) keine β-gal-Aktivität. AVDC war in der Lage, Cos-7-Zellen zu transfizieren, konnte jedoch MB49-Zellen nicht effizient transfizieren. Im Gegensatz dazu war DMBC in der Lage, MB49-Zellen zu transfizieren und die Transfektionseffizienz in Cos-7-Zellen zu steigern.
2A–2B sind Balkendiagramme, welche die Expression des pCMVLacZ-Gens gegen die Zeit zeigen. Die β-gal-Aktivität sah man erst eine Stunde nach der Transfektion und sie stieg ununterbrochen bis zur 48 h (2A). Die Zellen wurden, wie im Abschnitt Beispiele beschrieben, transfiziert und mittels des ONPG-Assays nach 2, 4, 6, 8 und 12 Tagen auf ihre β-gal-Aktivität untersucht. Die β-gal-Expression war bei 12 Tagen viel niedriger (2B).
3A–3B zeigen die DNA-Internalisation durch Zellen, die entweder DOTAP (D) oder DMBC ausgesetzt waren. Die Anwesenheit des LacZ-Gens wurde für untransfizierte und transfizierte Zellen mittels einer PCR bestimmt (3A). GADPH wurde als Positiv-Kontrolle verwendet. Die Expression des LacZ-Gens relativ zu GADPH wurde durch densitometrisches Scannen der PCR-Produkte nach einer Agarose-Gelelektrophorese bestimmt (3B).
4A–4B zeigen die Lokalisation der Plasmid-DNA durch PCR. Die 4A zeigt PCR-Amplifikations-produkte. Das lacZ-Gen fand man sowohl in den Kern- (N) als auch in den cytoplasmatischen (CY)-Fraktionen von Zellen, die mit DMBC transfiziert wurden, jedoch nur in der cytoplasmatischen Fraktion von Zellen, die mit DOTAP (D) transfiziert wurden. 4B zeigt eine densitometrische Analyse der Kern- (N) und cytoplasmatischen (CY)-Fraktionen relativ zu GADPH.
5A–5B sind Balkendiagramme, welche die anti-proliferative Wirkung des DNA:DMBC-Komplexes zeigen. Die anti-proliferative Wirkung der nachfolgenden Agenzien; DMBC/DNA, DOTAP(D)/DNA, DNA, DMBC, DOTAP(D) und MBC wurde mit unbehandelten MB49-Zellen (KON) nach 2-stündiger (5A) und 24-stündiger (5B) Exposition verglichen. Die relative anti-proliferative Wirkung wurde 48 h später durch Vergleich des Einbaus von [¹⁴C]-Thymidin in transfizierte und untransfizierte Zellen verglichen.
6A–6B sind Photographien, welche die Transfektion von Urothelzellen in vivo zeigen. Transfizierte Blasen wurden 2 Tage später entnommen und auf β-Galactosidase-Aktivität gefärbt. Die untransfizierte Blase wurde als eine Negativkontrolle verwendet (6A). In der transfizierten Blase färbten sich Epithelzellen, die dem Lumen zugewandt waren, positiv (6B). (Vergrößerung × 40).
7 zeigt die zelluläre Lokalisation des pCMVLacZ nach der kurzzeitigen Transfektion. Organe von untransfizierten Mäusen werden mit C für Kontrollgewebe gekennzeichnet. Organe, die von den mit dem pCMVLacZ/DMBC-Komplex transfizierten Mäusen entnommen wurden, werden mit DMBC gekennzeichnet. Das Nichtvorhandensein des β-Galactosidasegens in allen Organen mit Ausnahme der Blase wurde durch PCR bestätigt.
8A ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung der Aussetzungszeiten auf die Transfektionseffizienz in vitro zeigt. Die Zellen wurden dem DNA:DMBC Komplex in vitro für 15, 30, 60 und 120 Minuten ausgesetzt. Längere Aussetzungszeiten steigerten die Transfektionseffizienz, wie es durch den Prozentsatz an Zellen, die positiv mit X-gal gefärbt wurden, gemessen wurde.
8Bi–8Biv sind Photographien, welche die Wirkung der Aussetzungszeit auf die Transfektionseffizienz in vivo zeigen. Die Blasen wurden dem pCMVLacZ/DMBC-Komplex für i) 15 Minuten, ii) 30 Minuten, iii) 60 Minuten und iv) 120 Minuten (Vergrößerung × 40) ausgesetzt. Mehr Urothelzellen wurden im Laufe der Zeit mit X-gal gefärbt.
9A–9B sind Photographien, welche die Dauer der Expression in vivo nach einer einfachen intravesikalen Instillation zeigen. Zwei Tage nach der Transfektion färbten sich die meisten Zellen, die dem Lumen zugewandt sind, positiv mit X-gal (9A). Dreißig Tage später konnte die β-gal-Expression immer noch in einer verringerten Anzahl von Zellen beobachtet werden (9B) (Vergrößerung × 100).
10A–10B sind Photographien, welche die X-gal-Färbung von normalen (10A) und Hyperplasie (10B) Blasenabschnitten zeigen. Blasen, denen MB49 Tumorzellen implantiert wurden, wurden mit pCMVlacZ:DMBC für 2 h transfiziert. Eine Blaufärbung wurde in den Lumenzellschichten an der Oberfläche der Hyperplasie beobachtet (Vergrößerung × 100).
11 ist ein Graph, der das Tumorvolumen am 7. Tag in Mäusen, die mit einer Cytokin-Gentherapie (IL-2, GMCSF, IL-2 + GMCSF oder IFN-γ) oder mit DMBC behandelt wurden oder in einer unbehandelten Kontrolle zeigt.
12 ist ein Graph, der das Tumorvolumen am 38. Tag in Mäusen, die mit einer Cytokin-Gentherapie (IL-2, GMCSF, IL-2 + GMCSF oder IFN-γ) oder mit DMBC behandelt wurden oder in einer unbehandelten Kontrolle zeigt.
13 ist ein Graph, der das Tumorvolumen gegen die Zeit (Tage 7–37) in Mäusen, die mit einer Cytokin-Gentherapie (IL-2, GMCSF, IL-2 + GMCSF oder IFN-γ) oder mit DMBC behandelt wurden oder in einer unbehandelten Kontrolle zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Während dieser ganzen Offenbarung werden zahlreiche Publikationen, Patente und veröffentlichte Patentanmeldungen durch eine sie identifizierende Zitierung bezeichnet. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen werden hiermit in die vorliegende Offenbarung mit aufgenommen, um den Stand der Technik, der diese Erfindung betrifft, näher zu beschreiben.
Damit die Erfindung einfacher zu verstehen ist, werden zunächst bestimmte Begriffe definiert.
Wie hier verwendet, sollen die zahlreichen Formen des Begriffs „transfizieren" (z.B., „transfizieren", „transfiziert") sich auf das Verfahren des Einführens eines Polynukleotidmoleküls aus einer Außenposition in das Innere einer Zelle beziehen.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Polynukleotidmolekül" Moleküle umfassen, die aus zwei oder mehreren kovalent verknüpften Nukleotidbasen bestehen, Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Moleküle und Ribonukleinsäure (RNA)-Moleküle eingeschlossen. Die Nukleotide, welche die Polynukleotidmoleküle bilden, sind für gewöhnlich miteinander durch Phosphordiesterverknüpfungen verknüpft, obwohl der Begriff „Polynukleotidmolekül" ebenfalls Nukleotide umfassen soll, die durch andere Verknüpfungen, wie z.B. Phosphorthioatverknüpfungen verknüpft sind. Nicht zur Begrenzung gedachte Beispiele von Polynukleotidmolekülen beinhalten Plasmid-DNA, virale DNA, chromosomale Fragmente, Antisense-Oligonukleotide, Antisense-Phosphorthioat-Oligonukleotide, RNA-Moleküle und Ribozyme.
Wie hier verwendet soll der Begriff „kationisches Lipid" Moleküle betreffen, die mindestens eine und am herkömmlichsten zwei Fettsäureketten und eine positiv geladene polare Kopfgruppe umfassen. Herkömmliche kationische Lipide weisen entweder Dodecyl (C₁₂) oder Hexadecyl (Cetyl, C₁₆) -Fettsäureketten auf, obwohl der Begriff „kationisches Lipid" auch Lipide mit Fettsäureketten anderer Längen umfassen soll. Nicht zur Begrenzung gedachte Beispiele von kationischen Lipiden beinhalten:

DOTAP: (1,2-Diacyl-3-trimethylammonium-propan)
DOPE: (Dioleoyl-phosphatidylethanolamin)
DOTMA: ([2,3-Bis(oleoyl)propyl]trimethylammoniumchloride)
DOGS: (Dioctadecyl-amido-glycyl-spermin)
DODAB: (Dioctadecyl-diammoniumbromid)
DODAC: (Dioctadecyl-diammoniumchloride)
DOSPA: (2,3-Dioleoyloxy-N-[spermincarboxaminoethyl]-N-N-dimethyl-1-propanaminium)
DC-Chol: (3β[N-(n',N'-dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterol, dioleoyl)
DOIC: (1-[2-(oleoyloxy)-ethyl]-2-oleoyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid)
DOPC: (dioleoyl-phosphatidylcholin)
DMRIE: (dimyristooxypropyl-dimethyl-hydroxyethylammoniumbromid)

Wie hier verwendet, soll der Begriff „kationisches Polymer" positiv geladene Polymere mit der Fähigkeit eine Nukleinsäure (z.B., DNA) zu kondensieren betreffen. Kationische Polymere beinhalten Polyelektrolyte und kationische Polypeptide. Nicht zur Begrenzung gedachte Beispiele kationischer Polymere beinhalten Polylysin, Polyhistidin, Polyarginin, Polyethylenimin (PEI), Poly(4-vinylpyridin), Poly(vinylamin) und Poly(4-vinyl-N-alkyl-pyridiniumhalogenid).
Wie hier verwendet, soll der Begriff „Dendrimer" kationische Sternpolymere betreffen. Dies sind sphärische Polymere, die einen Ammoniumkern durch sphärisches Schichtenwachstum entspringen. Nicht zur Begrenzung gedachte Beispiele für Dendrimere beinhalten Superfect PAMAM.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „Cholesterol" einen natürlich auftretenden Steroidalkohol (Sterol) mit vier kondensierten Ringen betreffen als auch einen Ester mit langen Fettsäureketten und Analoga davon, welche die Fähigkeit zur Modulation der Membranfluidität beibehalten. Cholesterol und Cholesterolester sind Bestandteile von Plasmalipoproteinen und der äußeren Zellmembran von tierischen Zellen und haben die Fähigkeit die Membranfluidität zu modulieren. Cholesterol-Analoga, welche die Fähigkeit zur Modulation der Membranfluidität beibehalten, sind im Stand der Technik bekannt (siehe z.B., Gimpl, G., et al. (1997) Biochemistry 36: 10959–10974) und beinhalten zum Beispiel 5-Cholesten, 5-Pregnen-3β-ol-20-on, 4-Cholesten-3-on und 5-Cholesten-3-on.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „solubilisierte Cholesterolzubereitung" eine Zubereitung betreffen, in der Cholesterol mittels eines solubilisierenden Agens, das die Wasserlöslichkeit des Cholesterols (d.h., die Wasserlöslichkeit der solubilisierten Cholesterolzubereitung ist größer als die Wasserlöslichkeit des Cholesterols alleine) erhöht, im Wasser solubilisiert worden ist. Das solubilisierende Agens ist für gewöhnlich eine wasserlösliche Verbindung, das eine Höhlung aufweist, in die lipophile Moleküle gepackt werden können. Bevorzugte solubilisierende Agenzien sind Cyclodextrine. Die Solubilisierung des Cholesterols (z.B., Einbau in ein solubilisierendes Agens, wie zum Beispiel ein Cyclodextrin) kann mittels Radiomarkierung des Cholesterols, z.B., [1,2,6,7-3H(N)cholesterol (kommerziell erhältlich bei Dupont/New England Nuclear) beobachtet werden, siehe zum Beispiel Pang, L. et al. (1999) Biochemistry 38: 12003–12011. Der Begriff „solubilisierte Cholesterolzubereitung" soll kein Cholesterol betreffen, das in die Bilayer eines Liposoms eingebaut ist.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „Cyclodextrin" zyklisch geformte Oligosaccharid Torus-Moleküle mit einer hydrophilen Außenoberfläche und einer hydrophoben zentralen Höhlung betreffen, wobei diese hydrophobe zentrale Höhlung lipophile Substanzen (z.B., Cholesterol) tragen kann. „Cyclodextrine" beinhalten Moleküle mit 6, 7 oder 8 Glucopyranose-Einheiten (Alpha-, Beta- bzw. Gamma-Cyclodextrine) als auch größere Ringe (Cyclodextrine, die 9–13 Glucopyranose-Einheiten enthalten, sind isoliert worden), obwohl Beta-Cyclodextrine für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden. Der Begriff „Cyclodextrin" soll auch Derivate der Alpha-, Beta- und Gamma-Cyclodextrine (oder noch größere Ringe) umfassen, wobei die nicht zur Begrenzung gedachten Beispiele sulfatiertes Beta-Cyclodextrin, tertiäres Amin Beta-Cyclodextrin, quaternäres Amin Beta-Cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, 2,6-Di-O-methyl-beta-cyclodextrin, Hydroxyethyl-beta-cyclodextrin, 6-Desoxy-6-S-beta-D-galactopyranosyl-6-thio-cyclomalto-heptaose, Sulfobutylether-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-beta- cyclodextrin, Carboxymethyl-ethyl-beta-cyclodextrin, Diethyl-beta-cyclodextrin, Dimethyl-beta-cyclodextrin, zufallsverteiltes Methyl-beta-cyclodextrin, Glucosyl-beta-cyclodextrin und Maltosyl-beta-cyclodextrin beinhalten. Ein bevorzugtes Cyclodextrin für die Verwendung in der Erfindung ist Methyl-β-cyclodextrin. Die Struktur und die pharmazeutischen Anwendungen von Cyclodextrinen werden in einer Übersicht von Szejtli, J. (1994) Med. Res. Reviews 14: 353–386 and Rajewski, R. A. and Stella, V. J. (1996) J. Pharm. Sci. 85: 1142–1169 beschrieben.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Transfektionszusammensetzung" eine Zusammensetzung, die sich aus der Kombination eines Polynukleotids, entweder eines kationischen Lipids oder eines Dendrimers, und einer solubilisierten Cholesterolzubereitung ergibt.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „pharmazeutisches Agens" Verbindungen mit pharmazeutischer Aktivität umfassen, wobei die nicht zur Begrenzung gedachten Beispiele Polynukleotide, Proteine, Polypeptide, Peptide, chemotherapeutische Agenzien, Antibiotika und ähnliches beinhalten.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „therapeutische Zusammensetzung" eine Zusammensetzung betreffen, die durch das Kombinieren mindestens eines pharmazeutischen Agens und einer solubilisierten Cholesterolzubereitung gebildet wird, auch wenn die therapeutische Zusammensetzung zusätzliche Bestandteile (z.B., zusätzliche pharmazeutische Agenzien, ein kationisches Lipid, ein Dendrimer oder andere(n) Bestandteil(e), welche die Abgabe oder therapeutische Aktivität der therapeutischen Zusammensetzung steigern) enthalten kann.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „therapeutische Zusammensetzung" eine Zusammensetzung betreffen, die durch das Kombinieren mindestens eines pharmazeutischen Agens und einer solubilisierten Cholesterolzubereitung gebildet wird, obwohl die therapeutische Zusammensetzung zusätzliche Bestandteile (z.B., zusätzliches pharmazeutisches Agens, ein kationisches Lipid, ein Dendrimer oder andere(n) Bestandteil(e), welche die Abgabe oder therapeutische Aktivität der therapeutischen Zusammensetzung steigern) enthalten kann.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „Subjekt" lebende Organismen betreffen, die einer Behandlung mit pharmazeutischen Agenzien bedürfen, z.B., der Bedarf einer Behandlung für Krebs, wie zum Beispiel Blasenkrebs. Bevorzugte Subjekte sind Säugetiere. Beispiele für Subjekte beinhalten Menschen, Affen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Kühe, Pferde, Ziegen und Schafe. Die Subjekte beinhalten auch andere Vertebraten, wie zum Beispiel Fische und Vögel (z.B., Hühner).
Wie hier verwendet, soll der Begriff „Anti-Krebs-Aktivität" bedeuten, dass ein pharmazeutisches Agens die Fähigkeit hat das Wachstum, die Lebensfähigkeit oder Metastase von Krebszellen entweder direkt (d.h., durch direktes Einwirken auf die Krebszellen, wie zum Beispiel ein chemotherapeutisches Agens, das für Krebszellen toxisch ist) oder indirekt (z.B., durch Stimulieren einer Immunantwort auf die Krebszellen) zu inhibieren.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „Behandlung" eine Linderung eines oder mehrerer Symptome der zu behandelnden Krankheit betreffen.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „therapeutisch wirksame Menge" eine Menge betreffen (z.B., eines pharmazeutischen Agens), die zum Erzielen einer Behandlung der zu behandelnden Krankheit ausreichend ist.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „Bacillus Calmette-Guérin (BCG)-Therapie" eine Behandlungskur für Blasenkrebs betreffen, in der BCG intravesikal in die Blase verabreicht wird, um eine Immunantwort zu stimulieren.
Die vorliegende Erfindung basiert zumindest in Teilen auf der Entdeckung, dass solubilisiertes Cholesterol als ein Additiv zur Verbesserung der Transfektionseffizienz von Zellen verwendet werden kann. Ein bevorzugtes Solubilisierungsagens für das Cholesterol ist ein Cyclodextrin, wie zum Beispiel Methyl-β-cyclodextrin. Experimente zeigten, dass Cholesterol enthaltendes Methyl-β-cyclodextrin selber nicht die Transfektion von nackter DNA verbessert, in Verbindung mit einem kationischen Lipid (DOTAP) jedoch die Transfektion steigert. In vitro führt diese Zugabe zu einer 3,8-fachen Erhöhung bei transfizierten Zellen verglichen mit kationischem Lipid (DOTAP) alleine (siehe Beispiel 1). In vivo wurden Blasenepithelzellen, die dem Lumen zugewandt sind, erfolgreich transfiziert, etwas das mit einem kationischen Lipid alleine nicht erreicht werden konnte (siehe Beispiel 6). Wenn das verwendete kationische Lipid (DOTAP) ist, wurde eine optimale Transfektion mit einem DOTAP-DNA-Verhältnis von 2,7:1 (wt:wt) und einem DOTAP zu Cholesterol-Verhältnis von 6:1 (wt:wt). Crook et al. fanden bei der Verwendung einer Mixtur von DOTAP und Cholesterol heraus, dass die Transfektion optimal war, wenn ein Verhältnis von 1:1 (wt:wt) von DOTAP:Cholesterol verwendet wurde (Crook, K. et al. (1998) Gene Ther. 5: 137–43). Ihre Daten zeigten, dass das Erhöhen von Cholesterol die Transfektionseffizienz in Gegenwart von Serum erhöhte. Bei der Verwendung dieser Kombination aus DOTAP:Cholesterol wurde jedoch die murine Urothelzelllinie MB49 sehr wenig transfiziert, obwohl die COS-7-Zellen effizient transfiziert worden waren.
Der Methyl-β-cyclodextrin/Cholesterol (MBC)-Komplex kann der Zellmembran Cholesterol zuführen. Obwohl nicht beabsichtigt ist durch den Mechanismus begrenzt zu sein, würde das Zuführen von Cholesterol die Fluidität/Steifigkeit und Permeabilität der Zellmembran beeinflussen. Es hat sich herausgestellt, dass die Cholesterolniveaus in Membranen das Sortieren der GPI-verankerten Proteine in Endosomen beeinflussen, wobei die Depletion das Recycling dieser Proteine über die Endosomen steigert (Rodal, S. K. et al. (1999) Mol. Biol. Cell. 10: 961–74). Es ist auch möglich, dass der DOTAP/Methyl-β-cyclodextrin/Cholesterol (DMBC)-Komplex den DOTAP-Molekülen Cholesterol zuführt, was die Struktur der gebildeten DOTAP:DNA-Komplexe beeinflusst. Es hat sich gezeigt, dass die Beta-cyclodextrine die Internalisation der Adenoviren mittels intestinaler Zellen verbessert (Croyle, M. A. et al. (1998) Pharm. Res. 15: 1348–1355). Die verbesserte Aufnahme wurde der Fähigkeit der Cyclodextrine zum Zerstören von Zellmembranen beigemessen. Keines der Cyclodextrine, die in dieser Studie verwendet wurden, trug Cholesterol. Wenn nur Methyl-β-cyclodextrin selber in Kombination mit DOTAP und DNA verwendet wurde, gab es keine Transfektion der murinen Blasenepithelzellen, was die Bedeutung des Cholesterols, das in den Cyclodextrinen für die Erhöhung der Transfektionseffizienz, welche durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, verpackt war, deutlich macht.
In einer neueren Studie analysierten Zabner und Mitarbeiter den Mechanismus der Genabgabe, die durch kationische Lipide vermittelt wird, und identifizierten die Bewegung der Plasmid-DNA aus dem Cytoplasma in den Kern als den begrenzenden Faktor für den erfolgreichen Gentransfer (Zabner, J. et al. (1995) J. Biol. Chem., 270: 18997–9007). In der vorliegenden Erfindung fand man heraus, dass obwohl der Einschluss des Cholesterols die Transfektionseffizienz steigert, hatte er jedoch wenig Auswirkung auf die Aufnahme von Plasmid-DNA durch Zellen. Jedoch fand man heraus, dass mit DMBC Plasmid-DNA im Kern (siehe Beispiel 4) gefunden wurde, was vermuten lässt, dass der Einschluss von DMBC beim Entweichen der DNA aus den Endosomen, vielleicht Umgehen der Degradation in den Lysosomen, eine Rolle spielen könnte.
In der vorliegenden Erfindung kann die Expression eines transfizierten Gens in Urothelzellen in vivo bis zu einem Monat nach dem Transfektionsereignis beobachtet werden. Dies kann mit der langsameren Erneuerung der Urothelzellen in vivo im Zusammenhang stehen, da die Genexpression in vitro nach mehreren Zellreplikationen schnell verloren ging. Morris, B. D. et al. (J. Urol., (1994) 152: 506–509), der Adenoviren verwendete, um die Blase zu transfizieren, zeigte, dass die Genexpression für mindestens 7 Tage erwiesen war. Harimoto et al. (Br. J. Urol. (1998) 81: 870–874) zeigte, dass die Genexpression bis zu 10 Tage bei HVJ-Liposomen und bis zu zwei Wochen bei einem einzelnen Partikelbeschlussbombardement beobachtet werden konnte. Daher ist das GMBC-Transfektionssystem der vorliegenden Erfindung genauso, wenn nicht sogar beständiger als die derzeit favorisierten Techniken für die in vivo Blasentransfektion.
Ein zweistündige Exposition der Zellen gegenüber dem DMBC/DNA-Komplex zeigte keine Wirkung auf die Zellproliferation (siehe Beispiel 5). MBC selber verursacht keine Verringerung der Zellproliferation nach 24 h Exposition, DOTAP jedoch schien dies zu tun. Dies war jedoch nicht statistisch signifikant. Die anti-proliferativen Wirkungen der anhaltenden Exposition können vorteilhaft sein, da es dazu dienen würde, das durch ein therapeutisches Gen vermittelte Töten von Tumorzellen zu steigern. Eine Studie zeigte, dass wenn Methyl-β-cyclodextrin selbst verwendet wurde, es eine Anti-Tumorwirkung auf menschliche Tumorheterotransplantate in athymischen nackten Mäusen hatte (Grosse, P. Y. et al. (1998) Br. J. Cancer 78: 1165–9). Diese Wirkung steht wahrscheinlich in Beziehung mit dem Efflux von Cholesterol aus Zellen.
Eine intravesikale Instillation des DMBC/DNA-Komplexes für nur zwei Stunden war ausreichend, um die Exposition des Urothels gegenüber dem Liposomen/DNA-Komplexes zu maximieren und um eine wirksame Transfektion sicherzustellen (siehe Beispiel 7). Die Expression eines Reporter-Gens (β-Galactosidase) war auf die Blase begrenzt. Morris, B. D. et al. (J. Urol. (1994) 152: 506–509), der Adenoviren zum Transfizieren der Blase verwendete, machte eine ähnliche Beobachtung, was zeigt, dass diese Einkapselung möglicherweise das Resultat der Bauweise der Blase ist und nicht eine Folge des verwendeten Abgabesystems.
Das Transfektionssystem der Erfindung zeigte sich auch als wirksam bei der Abgabe von Cytokingenen in vivo für das Auslöschen von Tumoren (siehe Beispiel 9).
Im Hinblick auf das zuvor gesagte betrifft ein Aspekt der Erfindung Verfahren zum Transfizieren mindestens eines Polynukleotids in Zellen. Wie in den Beispielen weiter beschrieben, steigert die Verwendung von solubilisiertem Cholesterol die Transfektionseffizienz von Polynukleotiden, die mit Agenzien, wie zum Beispiel kationischen Lipiden, kationischen Polymeren und Dendrimeren komplexiert sind. In einem Aspekt stellt die Erfindung dementsprechend ein Verfahren zum Transfizieren mindestens eines Polynukleotids in Zellen bereit, wobei das Verfahren umfasst: Kombinieren:

(i) mindestens eines Polynukleotids;
(ii) eines kationischen Lipids, eines kationischen Polymers oder eines Dendrimers oder Kombinationen davon; und
(iii) einer solubilisierten Cholesterolzubereitung, um eine Transfektionszusammensetzung zu bilden; und

Anwenden der Transfektionszusammensetzung auf Zellen, so dass die Zellen mit dem Polynukleotid transfiziert werden.
Die solubilisierte Cholesterolzubereitung umfasst bevorzugt das mit einem Cyclodextrin, am meisten bevorzugt Methyl-β-cyclodextrin, solubilisierte Cholesterol. Andere geeignete Cyclodextrine beinhalten die weiter oben aufgelisteten. Cyclodextrine können von kommerziell erhältlichen Quellen bezogen werden. Ein bevorzugtes kationisches Lipid ist DOTAP. Ein bevorzugtes Dendrimer ist Superfect. Andere geeignete kationische Lipide, kationische Polymere und Dendrimere beinhalten die weiter oben aufgelisteten. Kationische Lipide, kationische Polymere und Dendrimere können von kommerziell erhältlichen Quellen bezogen werden. Die Transfektionszusammensetzung kann eine Art von Reagenz (ii) beinhalten, d.h., entweder ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer oder ein Dendrimer oder alternativ dazu kann Reagenz (ii) eine Kombination sein, wie zum Beispiel sowohl ein kationisches Lipid als auch ein kationisches Polymer oder zwei verschiedene Arten von kationischen Lipiden oder zwei verschiedene Arten von kationischen Polymeren. Wenn die Reagenzien (i), (ii) und (iii) kombiniert werden, wird bevorzugt die solubilisierte Cholesterolzubereitung mit dem kationischen Lipid, dem kationischen Polymer oder dem Dendrimer genau vor der Zugabe des/der Polynukleotids(e) vermischt und die Mischung wird dann für einen Zeitraum, z.B. 15 Minuten bei Raumtemperatur, inkubiert, um die Transfektionszusammensetzung zu bilden.
Die Mengen jedes verwendeten Reagenzes können abhängig von den Bedingungen variiert werden, wie zum Beispiel welche bestimmten Reagenzien ausgewählt werden und welcher Zelltyp transfiziert werden soll. Jedoch können die optimalen Transfektionsbedingungen durch Standardverfahren bestimmt werden, wie zum Beispiel beim Verwenden des Transfektionssystems, das in den Beispielen beschrieben wird. Zum Beispiel kann sich das optimale Verhältnis von kationischem Lipid (oder kationischem Polymer oder Dendrimer) zu solubilisiertem Cholesterol für unterschiedliche Zelltypen unterscheiden, obwohl das Verhältnis von 1:2 (DOTAP:MBC) sich als das Optimale für Urothelzellen in vitro herausstellte. Ein nicht zur Begrenzung gedachter Bereich von Verhältnissen des kationischen Lipids (oder kationischen Polymers oder Dendrimers) zu solubilisiertem Cholesterol ist 2:1 zu 1:3 (w/w). Wenn die solubilisierte Cholesterolzubereitung hergestellt wird (z.B., Methyl-β-cyclodextrin/Cholesterol, oder MBC) ist ein bevorzugtes Verhältnis von Cholesterol zu Cyclodextrin 50 mg Cholesterol zu 600 mg Cyclodextrin (Methyl-β-cyclodextrin) (d.h., 1:12 w/w Cholesterol:Cyclodextrin), obwohl dieses Verhältnis wiederum abhängig von den spezifischen verwendeten Reagenzien und zugehörigen Bedingungen optimiert werden kann. Ein nicht zur Begrenzung gedachter Bereich von Verhältnissen des Cholesterols zu Cyclodextrin ist 1:1 bis 1:20. Die Menge des verwendeten Polynukleotids kann auch abhängig von den verwendeten Reagenzien und zu transfizierenden Wirtszellen variiert werden. Ein nicht zur Begrenzung gedachter Bereich für die Menge des verwendeten Polynukleotids (z.B., DNA) ist 0,1 bis 100 μg, noch bevorzugter 1–50 μg. Ein nicht zur Begrenzung gedachter Bereich für die Menge des kationischen Lipids ist 1–200 μg, bevorzugt 10–50 μg. Ein nicht zur Begrenzung gedachter Bereich für die Menge des Dendrimers (z.B., Superfect) ist 1–300 μg, bevorzugt 5–25 μg. Für in vivo-Anwendungen würde die Menge für jedes Reagenz wahrscheinlich bezüglich der oben genannten bevorzugten Mengen erhöht werden müssen.
Ein nicht zur Begrenzung gedachtes Beispiel bevorzugter Reagenzmengen wenn DOTAP als kationisches Lipid verwendet wird, ist: 7,5 μg DNA + 20 μg DOTAP + 40 μg mit Methyl-β-cyclodextrin solubilisiertem Cholesterol. Ein nicht zur Begrenzung gedachtes Beispiel für bevorzugte Reagenzmengen wenn Superfect als Dendrimer verwendet wird, ist: 2 μg DNA + 22,5 μg Superfect + 10 μg mit Methyl-β-cyclodextrin solubilisiertem Cholesterol.
Das Transfektionsverfahren der Erfindung kann verwendet werden, um eine Vielzahl von unterschiedlichen Polynukleotiden, wie zum Beispiel Plasmid-DNA, virale DNA, chromosomale Fragmente, Antisense-Oligonukleotide, Antisense-Phosphorthioat-Oligonukleotide, RNA-Moleküle und Ribozyme oder Kombinationen davon zu transfizieren. Für gentherapeutische Zwecke ist/sind das/die Polynukleotid(e) üblicherweise ein Expressionsvektor (im Detail weiter unten beschrieben), das für ein Protein kodiert, das für einen therapeutischen Vorteil bereitgestellt wird. Das Transfektionsverfahren wird bevorzugt verwendet, um eukaryotische Zellen, noch bevorzugter Säugetierzellen, zu transfizieren. Das Transfektionsverfahren ist besonders wirksam beim Transfizieren von Urothelzellen, die gegenüber vielen anderen Arten von Transfektionsverfahren resistent bleibt. Das Transfektionsverfahren kann in vitro durchgeführt werden, z.B. durch Anwenden der Transfektionszusammensetzung auf Zellen in Kultur. Der Zeitraum zum in Kontakt bringen der Transfektionszusammensetzung mit den Zellen in Kultur kann durch Standardverfahren optimiert werden. Ein nicht zur Begrenzung gedachtes Beispiel einer Transfektionszeit in vitro ist 48 Stunden, gefolgt vom Waschen der Zellen (z.B., mit Phosphat gepufferter Salzlösung). Alternativ dazu kann das Transfektionsverfahren in vivo durch das Anwenden der Transfektionszusammensetzung auf Zellen in vivo durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Transfektionszusammensetzung auf Urothelzellen in vivo durch intravesikale Abgabe (z.B., über einen Katheter) an eine Blase eines Subjekts angewandt. Andere Zielgewebe für die Transfektion in vivo beinhalten, zum Beispiel den Magen, den Muskel, die Lungen, die Epithelzellen, den Dickdarm, den Uterus, den Darm, das Herz, die Niere, die Prostata, die Haut, das Auge, das Gehirn, das Penilgewebe und das Nasengewebe.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Abgabe eines pharmazeutischen Agens in die Urothelzellen der Blase, basierend auf der Fähigkeit des solubilisierten Cholesterols die Aufnahme des Materials durch Urothelzellen zu erhöhen, bereit. Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Abgabe eines pharmazeutischen Agens in Urothelzellen eines Subjekts bereit, wobei das Verfahren umfasst:
Kombinieren des pharmazeutischen Agens mit einer solubilisierten Cholesterolzubereitung, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden; und
intravesikuläre Abgabe der pharmazeutischen Zusammensetzung in die Blase des Subjekts, so dass das pharmazeutische Agens in die Urothelzellen des Subjekts abgegeben wird.
Die solubilisierte Cholesterolzubereitung umfasst bevorzugt ein mit einem Cyclodextrin solubilisiertes Cholesterol, am meisten bevorzugt Methyl-β-cyclodextrin. Andere geeignete Cyclodextrine beinhalten die weiter oben aufgelisteten. Das pharmazeutische Agens kann zum Beispiel mindestens ein Polynukleotid und ein kationisches Lipid, kationisches Polymer oder ein Dendrimer sein. Alternativ dazu kann das pharmazeutische Agens zum Beispiel ein chemotherapeutisches Agens, ein Antibiotika, ein Interferon, ein Interleukin, ein koloniestimulierender Faktor, ein anti-angiogenischer Faktor, ein anti-metastasebildender Faktor, ein Membranrezeptor oder ein anderes Agens mit therapeutischer Aktivität sein. Wenn das pharmazeutische Agens ein Polynukleotid ist, ist ein bevorzugtes kationisches Lipid DOTAP, wohingegen ein bevorzugtes Dendrimer Superfect ist. Andere geeignete kationische Lipide, kationische Polymere und Dendrimere beinhalten die weiter oben aufgelisteten.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Behandeln von Blasenkrebs in einem Subjekt bereit, wobei das Verfahren umfasst:
Kombinieren eines pharmazeutischen Agens mit einer solubilisierten Cholesterolzubereitung, um eine therapeutische Zusammensetzung zu bilden, wobei das pharmazeutische Agens eine Anti-Krebs-Aktivität gegen Blasenkrebszellen aufweist; und
intravesikuläre Abgabe der therapeutischen Zusammensetzung in die Blase eines Subjekts, so dass die Blasenkrebszellen des Subjekts mit dem pharmazeutischen Agens behandelt werden.
Bevorzugt umfasst die solubilisierte Cholesterolzubereitung ein mit einem Cyclodextrin, am meisten bevorzugt Methyl-β-cyclodextrin, solubilisiertes Cholesterol. Andere geeignete Cyclodextrine beinhalten die weiter oben aufgelisteten. Das pharmazeutische Agens kann zum Beispiel mindestens ein Polynukleotid und ein kationisches Lipid, kationisches Polymer oder ein Dendrimer sein. Bevorzugt wird das pharmazeutische Agens in therapeutisch wirksamen Mengen abgegeben. Wenn das pharmazeutische Agens ein Polynukleotid(e) ist/sind, ist ein bevorzugtes kationisches Lipid DOTAP, wohingegen ein bevorzugtes Dendrimer Superfect ist. Andere geeignete kationische Lipide, kationische Polymere und Dendrimere beinhalten die weiter oben aufgelisteten.
Das Polynukleotid umfasst bevorzugt mindestens einen Expressionsvektor, der für ein Protein(e) von therapeutischem Vorteil in der Behandlung von Blasenkrebs kodiert. Ein Expressionsvektor umfasst ein Polynukleotid in einer für die Expression des Polynukleotids in den zu transfizierenden Zellen geeigneten Form, was bedeutet, dass der rekombinante Expressionsvektor eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, für gewöhnlich ausgewählt auf der Basis des zu transfizierenden Zelltyps, die mit dem zu exprimierenden Nukleotid operativ verknüpft sind, beinhaltet. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors soll „operabel verknüpft" bedeuten, dass das entsprechende Polynukleotid mit der/den regulatorische(n) Sequenz(en) auf eine Art und Weise verknüpft ist, die eine Expression des Polynukleotids (z.B., Transkription/Translation in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird) erlaubt. Der Begriff „regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B., Polyadenylationssignale) beinhalten. Solche regulatorischen Sequenzen sind im Stand der Technik gut bekannt und werden zum Beispiel in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) beschrieben. Regulatorische Sequenzen beinhalten solche, die eine konstitutive Expression eines Polynukleotids in vielen Arten von Wirtszellen und solche, welche die Expression des Polynukleotids nur in bestimmten Wirtszellen (z.B., gewebespezifische regulatorische Sequenzen) regeln. Der Fachmann wird bevorzugen, dass das Design des Expressionsvektors von solchen Faktoren abhängt, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Expressionsniveau des gewünschten Proteins, etc.
Beispiele für Säugetierexpressionszellen beinhalten pMex-NeoI, pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufmann et al. (1987), EMBO J. 6: 187–195). Wenn sie in Säugetierzellen verwendet werden, werden die Expressionsvektorkontrollfunktionen häufig durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Zum Beispiel stammen herkömmlich verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian Virus 40 ab. Alternativ dazu können Säugetierexpressionsvektoren, welche die Expression eines Polynukleotids bevorzugt in einem bestimmten Zelltyp steuern können (d.h., ein Expressionsvektor, der gewebespezifische regulatorische Elemente umfasst) und im Stand der Technik gut bekannt sind, verwendet.
Beispiele für geeignete Proteine, die durch einen Expressionsvektor in der Blase zur Behandlung von Blasenkrebs exprimiert werden, beinhalten Interleukine, Interferone, koloniestimulierende Faktoren, anti- angiogenische Faktoren, anti-metastasebildende Faktoren, Membranrezeptoren und Tumorsuppressoren. Bevorzugte Proteine beinhalten Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 9 (IL-9), Interleukin-11 (IL-11), Interleukin-12 (IL-12), Interleukin-13 (IL-13), Interleukin-18 (IL-18), Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, einen Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF), einen Granulozyten koloniestimulierendem Faktor (G-CSF), einen Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (M-CSF), ein Hitzeschockprotein (HSP), p53, einen anti-angiogenische Faktoren, z.B. Antagonisten des vaskularen Endothelzellwachstums (VEGF), wie zum Beispiel Antisense-Moleküle, anti-metastasebildende Faktoren, z.B. Gewebeinhibitoren der Metalloproteinasen (TIMP's) und Faktoren, welche die BCG-Aktivität erhöhen, wie zum Beispiel Fibronektinrezeptoren, Interleukine, Interferone, koloniestimulierende Faktoren und Tumorsuppressoren. Bevorzugte zu exprimierende Proteine sind IL-2, GMCSF oder Interferon-γ oder Kombinationen davon (z.B., mindestens zwei von IL-2, GMCSF und Interferon-γ).
Alternativ dazu kann das pharmazeutische Agens zum Beispiel ein chemotherapeutisches Agens, ein Antibiotika, ein Interferon, ein Interleukin, ein koloniestimulierender Faktor oder ein anderes Agens mit therapeutischer Aktivität sein.
Das Verfahren der Erfindung zur Behandlung von Blasenkrebs kann mit einer oder mehreren zusätzlichen Anti-Blasenkrebsbehandlungsverfahren kombiniert werden. Eine bevorzugte zusätzliche Behandlungsmethode ist die BCG-Therapie. Andere Beispiele für zusätzliche Krebsbehandlungen beinhalten Chemotherapie und Strahlungstherapie.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung auch Transfektionszusammensetzungen bereit. Die Transfektionszusammensetzungen der Erfindung umfassen:

(i) mindestens ein Polynukleotid;
(ii) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein Dendrimer oder Kombinationen davon; und
(iii) eine solubilisierte Cholesterolzubereitung.

Bevorzugt umfasst die solubilisierte Cholesterolzubereitung ein mit einem Cyclodextrin, am meisten bevorzugt Methyl-β-cyclodextrin, solubilisiertes Cholesterol. Andere geeignete Cyclodextrine beinhalten die weiter oben aufgelisteten. Ein bevorzugtes kationisches Lipid ist DOTAP, wohingegen ein bevorzugtes Dendrimer Superfect ist. Andere geeignete kationische Lipide, kationische Polymere und Dendrimer beinhalten die weiter oben aufgelisteten. Die Transfektionszusammensetzungen der Erfindung können als eine zusammengepackte Formulierung bereitgestellt werden, z.B., wobei jeder Reagenzbestandteil in einer Behältervorrichtung bereitgestellt wird. Die gepackte Formulierung kann weiter Instruktionen für die Verwendung der Transfektionszusammensetzung zum Transfizieren von Zellen beinhalten.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die nicht als in irgendeiner Weise begrenzend angesehen werden sollen, weiter illustriert.
Spezifische Materialien und Verfahren, die in den folgenden Beispielen verwendet worden sind, werden weiter unten beschrieben:
Materialien und Methoden
PCMVlacZ wurde bei Clontech, Palo Alto, CA, USA bezogen. Die murine Übergangszellkarzinom-Zelllinie MB49 wurde bei Dr. Timothy Ratliff von der University of Iowa bezogen. Die Plasmid-DNA wurde mittels der Endofree Plasmid Qiagen Kits (Qiagen GmbH, Deutschland) zubereitet. Fugene wurde bei Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland, bezogen, Superfect bei Qiagen GmbH, Deutschland, DEAE Dextran bei Promega, Madison USA und Kalziumphosphat bei Merck, Frankfurt, Deutschland.
In vitro-Assay für DMBC Transfektionseffizienz
2 × 10⁵-Zellen wurden auf Deckgläschen, in 6-Kammer-Gewebekulturplatten in RPMI 1640, das mit 10% FBS (Biosciences, Australien), 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 0,05 mg/ml Streptomycin (Sigma Chemical Company St. Louis, MO, USA) supplementiert war, plattiert. Die Zellen wurden zweimal mit 1 × PBS gewaschen und mit 7,5 μg pCMVlacZ, der mit 20 μg DOTAP (Roche Diagnostics, Mannheim Deutschland) und 40 μg mit Methyl-β-cyclodextrin solubilisiertem Cholesterol (Sigma) komplexiert war, transfiziert. Die Komplexe wurden durch Auffüllen der DNA und des DMBC mit 20 mM Hepes-Puffer (GibcoBRL, Rockville, MD, USA) auf 165 μl und Mischen für 15 Minuten gebildet. Dies wurde mit RPMI 1640 Medium auf 1 ml aufgefüllt und für den geeigneten Zeitraum zu den Kammern gegeben, dann gewaschen und durch 3 ml frisches RPMI 1640 Medium ersetzt. Nach 48 h wurden die Zellen mit PBS gewaschen, fixiert und, wie von Weiss, D. J. et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8: 1545–54 beschrieben, gefärbt. Die durchschnittliches Anzahl von blauen Kolonien relativ zur Gesamtzahl an Zellen in vier Quadranten bei einer Vergrößerung von × 100 wurde verwendet, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen. Die Transfektionen wurden doppelt durchgeführt und zweimal wiederholt.
Proliferationsassays
Die Proliferation wurde durch Messen des Einbaus von [¹⁴C]-Thymidin untersucht. 1 × 10⁴-Zellen wurden pro Kammer in einer flachbödigen 96-Kammer Gewebekulturplatte (Nunc, Rosklide, Dänemark) plattiert und bei optimalen Bedingungen, wie weiter oben beschrieben, für den entsprechenden Zeitraum (2 h und 24 h Aussetzung) transfiziert, gewaschen und mit frischem RPMI 1640 Medium bei 37°C inkubiert. Nach 32 h wurde der Überstand entfernt und die Zellen wurden mit 1 × PBS gewaschen. Die Kammern wurden in dreifacher Ausfertigung für 16 Stunden mit 0,2 μCi/ml, [¹⁴C]-Thymidin (spezifische Aktivität 56,5 mCi/mmol; Du Pont, Wilmington, DE, USA) inkubiert. Die Proben wurden wie von Zhang, Y. et al. (1997) Int. J. Cancer 71: 851–7 beschrieben gewonnen. Der Einbau von [¹⁴C]-Thymidin wurde als Prozentsatz des Einbaus in Kontrollzellen, die aus untransfizierten Zellen bestanden, dargestellt. Der nicht parametrische Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu berechnen. Wahrscheinlichkeitswerte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant gewertet.
Nachweis der Reportergen-Expression in vivo nach intravesikaler Abgabe von DNA-DMBC
5–7 Wochen alte, weibliche C57BL6-Mäuse wurden anästhesiert; ihre Blasen wurden mit einem 24 G i.v. Katheter katheterisiert und mit 1 × PBS ausgewaschen. Der DMBC- und DNA-Komplex wurde wie oben beschrieben für 15 Minuten vermischt. Die Endmischung wird mit 1 × PBS zur einfachen Instillation auf ein Endvolumen von 465 μl aufgefüllt und intravesikal eingeführt. Die Transfektionsaussetzungszeiten von 15 min, 30 min, 1 h oder 2 h wurden evaluiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden die Blasen mit 1 × PBS ausgewaschen, um den DNA/DMBC-Komplex zu entfernen. Die Mäuse wurden 48 Stunden nach der Behandlung getötet. Die Experimente wurden doppelt durchgeführt.
Histochemie
Blasen, Lungen, Nieren, das Herz, die Leber und die Milz wurden entfernt und in flüssigem Stickstoff (Werthman, P. E. et al. (1996) J. Urol. 55: 53–6) schnell eingefroren. Kryostatische Schnitte mit einer Dicke von 6 μM wurden für 10 min bei 4°C in 1,25 Glutaraldehyd fixiert, gefolgt von einer Inkubation mit X-gal für 4 h bei 37°C und wurden dann mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Durchführen der PCR an Organen
Um die Gegenwart des transfizierten Plasmids nachzuweisen, wurden PCR-Primer, die für das lacZ-Gen einzigartig sind, verwendet. Der verwendete Upstream-Primer war 5'-GCCGACCGCACGCCGCATCCAGC-3' (SEQ ID NO: 1) und der Downstream-Primer war 5'-CGCCGCGCCACTGGTGT-3' (SEQ ID NO: 2). Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 25 μl, das 100 ng genomischer DNA, 2 μl (2,5 Mm) dNTPs (New England Biolabs, Beverly, USA), 2,5 μl (10 ×) Reaktionspuffer, 1 μl von jedem Primer (10 μM) und 1 μl (2U) Taq-Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finnland) enthält, durchgeführt. Das PCR-Programm sah wie folgt aus: 94°C für 30 s, gefolgt von 60°C für 30 s und 72°C für 30 s, für 40 Zyklen. GADPH wurde als Kontrolle für die PCR-Analyse verwendet. Die Primer-Sequenzen für GADPH sind der Upstream-Primer 5'-CTGCGACTTCAACAG-3' (SEQ ID NO: 3) und der Downstream-Primer 5'-CACCCTGTTGCTGTAG-3' (SEQ ID NO: 4). Das PCR-Programm sah wie folgt aus: 94°C für 30 s, 58°C für 30 s und 72°C für 30 s, für 40 Zyklen. Die amplifizierte DNA wurde durch Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel analysiert und mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Densitometriemessungen wurden mittels der Image Master VDS-Software durchgeführt und die Banden wurden mittels der Analytical Imaging System Software (Imaging Research Inc., Ontario, Kanada) analysiert.
ONPG-Assay für die Transfektion
Die transfizierten Zellen wurden zweimal mit 1 × PBS gewaschen und dann mit 150 μl Lysepuffer lysiert. Der Proteingehalt der Lysate wurde mittels des Micro-BCA-Proteinassays (Pierce, Rockford, IL, USA) mit Rinderserumalbumin als ein Standard gemessen. Die Zellproteinlysate wurden in einer Reaktionsmischung, die 4 mg/ml ONPG enthält, untersucht und bei 37°C für 1 h inkubiert. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 500 μl 1 M Na₂CO₃ gestoppt und das Absorptionsvermögen wurde bei 420 nm gemessen.
Kern- und cytoplasmatische Analysen mittels PCR
Die Kern- und cytoplasmatische Fraktionierung der transfizierten Zellen wurde unter Verwendung einer sanften Lyse mit einem TNE-Puffer (10 mM Tris, pH (pH8), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Igepecal) durchgeführt und für 10 min auf Eis gelegt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 7 K für 5 min bei 4°C in einer Mikrozentrifuge. Der so hergestellte Überstand wurde als cytoplasmatisches Extrakt bezeichnet und in ein frisches Röhrchen übertragen. Das Kernextrakt wurde durch Behandlung mit einer Proteinase K-Verdauung (100 mM NaCl, 10 Mm Tris, pH8, 0,5% SDS 25 mM EDTA und 0,1 mg/ml Proteinase K) des pelletierten Materials über Nacht bei 50°C zubereitet. Die Zellkern-DNA wurde zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation. Die PCR-Analyse wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Zelllinien und Cytokingene
Die murine Übergangszellkarzinom-Zelllinie MB49 und die Cytokingene wurden freundlicherweise von Dr. Timothy Ratliff von der Universität von Iowa bereitgestellt. Die Cytokingene wurden in den pCI-neo-Expressionsvektor (Promega) geklont. Die Plasmid-DNA wurde mittels der Endofree Plasmid Quiagenkits (Qiagen GmbH, Deutschland) präpariert.
Tiere
Weibliche Mäuse C57/BL6 (etwa 4–6 Wochen alt) wurden vom Laboratory Animals Centre der National University of Singapore erhalten und im Tierstall der Universität gehalten.
In vitro-Expression der Oberflächenmarker
2 × 10⁵-Zellen wurden in 6-Kammer Gewebekulturplatten in RPMI 1640, das mit 10% FIBS (Biosciences, Australien), 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 0,05 mg/ml Streptomycin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA), supplementiert wurde, ausplattiert. Die Zellen wurden zweimal mit 1 × PBS gewaschen und mit 7,5 μg der einzelnen Cytokingene und 3,75 μg von jedem Cytokingen für die IL-2 + GMCSF-Kombination, die mit 20 μg DOTAP (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) und 40 μg mit Methyl-β-cyclodextrin solubilisiertem Cholesterol (Sigma) komplexiert war, transfiziert. Die Komplexe wurden durch Auffüllen der DNA und des DMBC auf 165 μl mit 20 mM Hepes-Puffer (Gibco BRL, Rockville, MD, USA) und 15 minütigem vermischen gebildet. Dies wurde auf 1 ml mit RPMI 1640-Medium aufgefüllt und für 2 h zu den Kammern zugegeben und dann gewaschen und mit 3 ml frischem RPMI 1640-Medium ersetzt. Nach 48 h wurden die Zellen mit PBS gewaschen und fixiert und mit anti-MHC I, anti-MHC II und anti-FAS Antikörpern markiert. Der verwendete sekundäre Antikörper war Fluorescein Isothiocyanat (FITC; Pharmingen, CA, USA). Isotype Kontrollantikörper wurden ebenso mit einbezogen. Die markierten Zellen wurden auf einem Mehrzwecklaser-Durchflusscytometer (Coulter Epics Elite, Florida, USA) analysiert.
Antitumorwirkungen verschiedener Cytokinbehandlungen
Eine einzelne Zellsuspension mit 5 × 10⁵ lebenden MB49-Zellen in 0,1 ml PBS wurde 7 bis 10 Tage vor der Behandlung subkutan in die Flanke injiziert. Nur Mäuse mit einer einheitlichen Tumorgröße von etwa 0,15–0,25 cm³ wurden ausgewählt und für die intratumorale Behandlung zufallsbedingt in Gruppen eingeteilt. Die Behandlungen wurden zwei Mal pro Woche für drei Wochen mittels intratumoraler Injektion durchgeführt und diese bestanden aus 100 μl entweder von 1 × PBS, DMBC (Dotap + methyliertes-β-Cyclodextrin enthaltendes Cholesterol), IL-2 + DMBC, GMCSF + DMBC, IFNγ + DMBC oder der Kombination aus IL-2 + GMCSF + DMBC. Altersgleiche natürliche Tumorkontrollen wurden nicht behandelt. Die Tumorgröße wurde mit Tastzirkeln alle drei Tage vor der Injektion bis zum 38 Tag gemessen. Die Berechnung des Tumorvolumens wurde mittels der Formel durchgeführt: Länge × Breite × Höhe.
Einzelzellsuspension und Durchflusscytometrie
Die Milz wurde wie beschrieben erhalten. Die Einzelzellsuspensionen wurden mit anti-CD4, αβ, γδ, NK und anti-CD-8 Antikörpern, die mit Phycoerithrin (PE) konjugiert worden sind, markiert und CD3+-Zellen wurden mit Antikörpern, die mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugiert waren, markiert. Alle Antikörper wurden bei Pharmingen, CA, USA erworben. Markierte Zellen wurden auf einem Mehrzwecklaser-Durchflusscytometer analysiert.
mRNA-Extraktion und RT-PCR
Für die Gesamt-RNA-Extraktion wurde die Milz entsprechend den Anweisungen des Herstellers in 1 ml Trizol-Reagenz (Gibco BRL, Rockville, MD, USA) homogenisiert. Die RT-PCR wurde wie beschrieben ausgeführt.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: In vitro Transfektionseffizienz nicht-viraler Agenzien
Das pCMVlacZ-Expressionsplasmid wurde verwendet, um die Transfektionseffizienz zahlreicher nicht-viraler Agenzien in einem 2-stündigen Zeitraum an MB49-Zellen zu berechnen. Sowohl DOTAP als auch Superfect waren in der Lage, MB-49-Zellen innerhalb eines 2 h Zeitraums mit einer Effizienz von etwa 20,4 bzw. 14,8 zu transfizieren (siehe Tabelle 1 unten).
Tabelle 1
Die Transfektionsbedingungen wurden für jedes Agens optimiert, um eine maximale Transfektion in 2 h sicher zu stellen. Die Transfektionseffizienz wurde durch Zählen des Prozentsatzes der Zellen, die mit X-gal blau gefärbt wurden, gemessen. Die optimale Transfektion wurde bei Verwendung von 7,5 μg DNA und 20 μg DOTAP erzielt. Mit Superfect war nur eine sehr viel geringere Menge an DNA notwendig, um vergleichbare Transfektionsraten wie bei DOTAP zu erhalten, nämlich 2 μg DNA mit 7,5 μl Superfect. Eine sehr niedrige Transfektionsrate von 1,02 wurde mit Fugene erhalten. Weder Kalziumchlorid (0–40 μg), noch DEAE-Dextran (0–2 μg), noch nackte DNA konnte MB49-Zellen transfizieren.
Um die Transfektionsraten zu verbessern, wurde MBC mit DOTAP direkt nach der Zugabe von DNA vermischt und die Mischung für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zugabe von MBC ergab eine Zunahme in der Anzahl von Zellen, die, wie in 1A–C gezeigt, erfolgreich transfiziert wurden. Die Zunahme der Transfektionseffizienz lag beim 3,9-fachen wenn MBC in Kombination mit DOTAP verwendet wurde und beim 2,4-fachen mit Superfect (1D). Jedoch variierte die Menge an MBC, die zur Erzielung dieser Zunahme bei der Transfektionseffizienz erforderlich war, mit dem verwendeten Agens. Ein optimale DOTAP-Transfektion wurde mit 40 μg MBC erhalten, während 10 μg für Superfect optimal waren. Da die besten Transfektionsraten mit DOTAP + MBC (DMBC) erhalten wurden, wurde diese Kombination in allen weiteren Experimenten verwendet. Es wurde ebenso ein Vergleich zwischen der Transfektionseffizienz von DMBC und einer konventionellen DOTAP:Cholesterol (1:1) Mischung (AVDC) durchgeführt. AVDC war in der Lage Cos-7-Zellen zu transfizieren, transfizierte jedoch MB49-Zellen nicht sehr gut. Im Gegensatz dazu war DMBC dazu in der Lage sowohl MB49-Zellen zu transfizieren als auch die Transfektion der Cos-7-Zellen zu steigern, wenn man dies mit AVDC verglich (1E).
BEISPIEL 2: Dauer der β-Galactosidase-Genexpression
Es wurde die Charakterisierung der β-Galactosidase(β-Gal)-Genexpression als Funktion der Zeit nach der Transfektion mit DMBC durchgeführt. Wie in 2A dargestellt, trat die Proteinexpression, die durch das ONPG-Assay bestimmt wurde, innerhalb einer Stunde nach Entfernen des Agens auf und nahm bis zu 48 h nach der Transfektion zu. Nach 48 h trat eine stetige Verringerung in der Proteinexpression auf und 12 Tage nach der Transfektion verringerte sich die β-gal-Aktivität um das 7-fache verglichen mit der Expression am Tag 2 (2B). Es scheint, dass wenn sich die Zellen replizieren, das Gen verloren geht und/oder abgeschaltet wird.
BEISPIEL 3: DNA-Aufnahme nach der Transfektion
Um zu bestimmen, ob es einen Unterschied bei der DNA-Aufnahme gab, wenn DOTRP und DMBC verwendet wurde, wurde die Menge der Plasmid-DNA, die aus Zellen extrahiert wurde, 2 h nach der Transfektion gemessen. Um die Menge an oberflächengebundener DNA zu minimieren und um die wahre DNA-Aufnahme besser einschätzen zu können, wurden mehrere Waschungen mit 1 × PBS als auch ein Verdau mit DNAse durchgeführt. Die 3A und 3B zeigen die PCR-Analysen von DNA, die aus MB49-Zellen extrahiert wurde. MB49-Zellen scheinen mit beiden Agenzien vergleichbare Mengen an Plasmid-DNA internalisiert zu haben. Daher sind die Unterschiede, die bei der Transfektionseffizienz beobachtet wurden, nicht die Folge der unterschiedlichen Aufnahme der Plasmid-DNA, vielleicht jedoch der Stabilität der DNA sobald sie einmal in die Zelle aufgenommen worden ist.
BEISPIEL 4: Kern- und cytoplasmatische Ansammlung von Plasmid-DNA
Um die Lokalisation der DNA nach der Transfektion mit DOTAP und DMBC zu bestimmen, wurden Kern- und cytoplasmatische Extrakte aus transfizierten Zellen zubereitet. Die Anwesenheit von DNA in diesen Extrakten wurde mittels PCR bestimmt. In mit DMBC transfizierten Zellen wurde das LacZ-Gen sowohl im Kern als auch in den cytoplasmatischen Fraktionen lokalisiert. Mit DOTAP alleine jedoch fand man die Plasmid-DNA nur im Cytoplasma (4A und 4B). Das GADPH-Gen wurde verwendet, um die Anwesenheit der Kern-DNA in den Kern-Extrakten und das Fehlen einer Kontamination von cytoplasmatischen Fraktionen mit Kern-DNA zu bestätigen.
BEISPIEL 5: Die Toxizität von DMBC/DNA-Komplexen
Ein Zellproliferationsassay wurde verwendet, um die Toxizität der Transfektionsagenzien zu beurteilen. Die relative Toxizität wurde durch Vergleich der Proliferation in transfizierten und untransfizierten Zellen 48 h nach dem Ausplattieren gemessen. Die Zellen wurden den Transfektionsagenzien für 2 h und 24 h ausgesetzt. Es gab keinen Unterschied im Niveau des Einbaus von ¹⁴C-Thymidin zwischen transfizierten und untransfizierten Zellen, die entweder DOTAP (D) oder DMBC für 2 h ausgesetzt waren (5A). Wenn Zellen dem DMBC mit oder ohne DNA oder dem DOTAP für 24 h ausgesetzt waren, gab es eine Verringerung in der Zellproliferationskapazität, jedoch war diese nicht statistisch signifikant (5B).
BEISPIEL 6: Transfektion von murinen Blasen durch intravesikale Instillation des Transfektionsagens und DNA
In Mäusen (n = 16), welche die Transfektionsagenzien DMBC/DNA über eine intravesikale Instillation erhielten, wurden Blasenepithelzellen, die dem Lumen zugewandt waren, in allen Mäusen erfolgreich transfiziert (6A und 6B). In vivo führte DOTAP alleine nicht zu einer wirksamen Transfektion von Blasenepithelzellen. Wie auch die Blase wurden die Lungen, die Nieren, die Milz, das Herz und die Leber ebenso von transfizierten Tieren und Kontrollen gewonnen und es stellte sich bei allen eine negative Färbung für β-gal ein, was zeigt, dass die Transfektion auf die Blase, wie in Tabelle 2 unten zusammengefasst, begrenzt war:
TABELLE 2 Färbung mit pCMVLacZ Tabelle 2. Färbung auf die Blase begrenzt
Dies wurde durch PCR-Analysen (7), die an zwei Mäusen durchgeführt wurden, bestätigt. In Mäusen wurden Milzzellen zur gleichen Zeit erhalten wie die Blasen und die durch Durchflusscytometrie bestimmten Niveaus an CD3+, CD4+, CD8+, αβ und γδ-T-Zellen in der Kontrolle und den transfizierten Tieren. Man fand keinen Unterschied zwischen den Kontroll- und den experimentellen Gruppen.
Zusätzlich wurden Tumoren in Mäuseblasen implantiert und soweit sie einmal etabliert waren, wurden diese Mäuse auch intravesikal mit pCMVlacZ und DMBC behandelt. Die oberflächlichen Lumenzellschichten der Hyperplasie zeigten eine β-gal-Färbung (10A–10B).
Die Wirkung von DMBC und DOTAP auf transfizierte Blasen wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie analysiert. Die Analysen zeigten, dass die Transfektionsaussetzungszeit von 2 h mit jedem Agens zu keinem erkennbaren strukturellen Unterschied in den Zellen, die dem Lumen zugewandt sind, führte, wenn sie mit einer untransfizierten Kontrollblase verglichen wurden. Es gab auch kein Anzeichen für die Akkumulation von kationischen Lipiden oder Cholesterol in der Vakuole. Blasenepithelzellen enthalten für gewöhnlich viele Vakuolen, jedoch scheint es dort keine Zunahme in der Anzahl solcher Vakuolen nach der Behandlung zu geben.
BEISPIEL 7: Transfektionseffizienz in Bezug auf die Aussetzungszeit gegenüber Transfektionsagenzien
Um die Transfektionseffizienz mit kürzeren Aussetzungszeiten zu bestimmen, wurde der Transfektionskomplex (pCMVlacZ:DMBC) für unterschiedliche Zeiträume auf Zellen angewendet, anschließend wurde dieser entfernt und die Zellen wurden für 48 Stunden vor dem Einbringen und den enzymatischen Analysen in Vollmedium kultiviert. Die β-gal-Aktivität ist nachweisbar, auch wenn die Transfektionszeit nur 15 Minuten lang ist und sich diese Aktivität mit der Dauer des Aussetzens gegenüber dem Transfektionsagens steigert (8A). Es gibt einen 4,8- fachen Unterschied in den Transfektionsraten zwischen einem 15-minütigen Aussetzung und einem 2-stündigem Aussetzen. In vivo, mit längeren Aussetzungszeiten, wurden mehr Epithelzellen, die dem Lumen zugewandt sind, transfiziert (8B).
BEISPIEL 8: Dauer der Genexpression in vivo
In Mäusen wurde die β-gal-Expression 14, 21 und 30 Tage nach der Transfektion untersucht. Nach 30 Tagen war die Expression weitestgehend reduziert, jedoch immer noch klar nachweisbar (9A und 9B). Die Dauerhaftigkeit des Signals könnte das Ergebnis einer geringen Erneuerung der Urothelzellen in vivo sein, was zu einer Anwesenheit des pCMVlacZ-Gens für längere Zeit führen würde.
BEISPIEL 9: Charakterisierung der Wirkungen von DOTAP + Methyliertes-β-cyclodextrin solubilisiertes Cholesterol (DMBC) und transfizierten Cytokingenen auf MB49-Zellen und Tumorwachstum
In vitro Expression der Oberflächenproteinmarker MB49-Zellen wurden mit Cytokingenen einzeln und in Kombination transfiziert. Zwei Tage später wurde die Expression durch Durchflusscytometrie bestimmt. Eine Zunahme im Verhältnis der Zellen, die MHC-Klasse I, MHC-Klasse II, FAS, ICAM I, ICAM II, B71 und B72 exprimierten, konnte in Zellen, die mit den Cytokingenen transfiziert waren, beobachtet werden, wenn sie mit untransfizierten Zellen, wie in Tabelle 3 unten zusammengefasst, verglichen wurden.
TABELLE 3 In vitro Expression der Oberflächenproteinmarker
Intratumorale Therapie von etablierten Tumoren
Die Fähigkeit des Transfektionssystems der Erfindung Cytokine für das Auslöschen von etablierten Tumoren abzugeben wurde getestet. Die Transfektionszusammensetzungen, die DNA umfassen, welche für die folgenden Cytokine kodiert (IL-2, IFN-γ, GMCSF und IL-2 + GMCSF, wurden intratumoral in die rechte Flanke der tumortragenden Mäuse 7–10 Tage nach der Tumorimplantation injiziert. Das Tumorvolumen in den Mäusen am 7. Tag ist im Graphen der 11 dargestellt. Die mit einer Cytokin-Gentherapie behandelten Mäuse zeigten eine langsamere Tumorgruppierung verglichen mit den unbehandelten- und den DMBC-Kontrollen. Das Tumorvolumen am Tag 38 (dargestellt im Graphen der 12) war für Mäuse, die entweder mit IFN-γ (p = 0,041), GMCSF (p = 0,0014) oder IL-2 + GMCSF (p = 0,004) transfiziert wurden, signifikant geringer. Mäuse, die nur mit IL-2 behandelte wurden, zeigten ein langsameres Tumorwachstum. Dreißig Prozent aller Mäuse, die mit IFN-γ, GMCSF und IL-2 + GMCSF behandelt wurden, wurden geheilt. Das Tumorvolumen über die Zeit (Tage 7–37) wird im Graphen der 13 zusammengefasst. In der unbehandelten Gruppe zeigte eine Maus eine lokale Remission, verlor jedoch schnell an Gewicht und starb frühzeitig, was eine metastasebildende Erkrankung nahe legt. Die Heilungsrate bei den Mäusen ist in Tabelle 4 unten zusammengefasst.
Tabelle 4: Heilungsrate
Cytokinexpression in Splenocyten
Die Cytokinexpression in den Splenocyten von unbehandelten und mit Cytokinen behandelten tumortragenden Mäusen wurde mit derer von normalen (kein Tumor) Mäusen verglichen, um zu sehen, ob die Cytokinproduktion beeinflusst wurde. Alle Gruppen exprimierten mRNAs für IL-2, IFN-γ, TNF-α und GMCSF. Mit Cytokinen behandelte Mäuse zeigten eine allgemeine Zunahme in der Cytokin-mRNA-Herstellung bei Splenocyten verglichen mit den unbehandelten-, DMBC- und normalen (kein Tumor)-Kontrollen. Mäuse, die mit GMCSF und IL-2 + GMCSF behandelt wurden, stellten die größte Menge an GMCSF her, verglichen mit den anderen mit Cytokinen behandelten Gruppen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 unten zusammengefasst:
Tabelle 5
Phenotypische Charakterisierung von Splenocyten
Durchlusscytometrische Analysen von Splenocyten aus Mäusen mit phenotypisch spezifischen monoklonalen Antikörpern zeigten, dass CD3, CD4+ und CD8 Populationen in den unbehandelten- und den mit DMBC behandelten Gruppen verringert waren, wenn sie mit normalen Kontrollen verglichen wurden. Tumortragende Mäuse, die mit einer Cytokin-Gentherapie behandelt wurden, zeigten vergleichbare Profile mit den normalen Kontrollen für CD3-, CD4+-, CD8-, NK- und αβ-Populationen. Diese Ergebnisse werden in Tabelle 6 unten zusammengefasst:
Tabelle 6
Die in diesem Beispiel beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die Transfektion der murinen Blasenkrebszellen mit einzelnen Cytokingenen eine Zunahme in der MHC-Klasse I, -Klasse II und Fas-Expression induziert. Diese Reaktion könnte die Krebszellen immunogener machen. Beim intratumoralen Transfektionsexperiment fand man heraus, dass IL-2, IFN-γ, GMCSF und IL-2 + GMCSF vergleichbare inhibitorische Wirkungen auf das Tumorwachstum hatten. Nach 37 Tagen fand man heraus, dass es einen signifikanten Unterschied bei den Tumorgröße in den Gruppen, die mit IFN-γ, GMCSF, IL-2 + GMCSF transfiziert wurden, gab, wenn sie mit der unbehandelten Gruppe verglichen wurden. Diese Daten demonstrieren, dass DMBC ein wirksames Agens für die Transfektion von Urothelzellen in vitro und in vivo ist. Die intratumoralen Studien in Mäusen zeigen, dass die Transfektion von Urotheltumorzellen mit der Cytokingen-Abgabe durch nicht-virale Vektoren zum Abbruch des Tumorwachstums führen kann.
Sequenzliste

Claims

Ein „in vitro" Verfahren zum Transfizieren eines Polynukleotids in Zellen, wobei das Verfahren umfasst: Mischen: (i) mindestens eines Polynukleotids; (ii) eines kationischen Lipids, eines kationischen Polymers oder eines Dendrimers oder einer Mischung davon; und (iii) einer solubilisierten Cholesterolzubereitung, die ein mit einem Cyclodextrin solubilisiertes Cholesterol umfasst, um eine Transfektionszusammensetzung zu bilden; und Anwenden der Transfektionszusammensetzung auf Zellen, so dass die Zellen mit dem Polynukleotid transfiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Cyclodextrin Methyl-β-cyclodextrin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Cyclodextrin aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Alpha-Cyclodextrin, Beta-Cyclodextrin, Gamma-Cyclodextrin, sulfatiertem Beta-Cyclodextrin, tertiärem Amin Beta-Cyclodextrin, quaternärem Amin Beta-Cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, 2,6-Di-O-methyl-beta-cyclodextrin, Hydroxyethyl-beta-cyclodextrin, 6-Desoxy-6-S-beta-D-galactopyranosyl-6-thio-cyclomalto-heptaose, Sulfobutylether-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-ethyl-beta-cyclodextrin, Diethyl-beta-cyclodextrin, Dimethyl-beta-cyclodextrin, zufallsverteiltem Methyl-beta-cyclodextrin, Glucosyl- beta-cyclodextrin und Maltosyl-beta-cyclodextrin besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei (ii) ein kationisches Lipid ist, das DOTAP ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei (ii) ein Dendrimer ist, das Superfect ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei (ii) aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus DOPE, DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM, Polylysin, Polyhistidin, Polyarginin, Polyethylenimin, Poly(4-vinylpyridin), Poly(vinylamin), Poly(4-vinyl-N-alkyl-pyridiniumhalogenid) oder Mischungen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid Plasmid-DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus viraler DNA, chromosomalen Fragmenten, Antisense-Oligonukleotiden, Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotiden, RNA-Molekülen und Ribozymen oder Mischungen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen eukaryotische Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Zellen Säugetierzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zellen Urothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Transfektionszusammensetzung auf Zellen in Kultur angewendet wird.
Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung, die ein pharmazeutisches Agens und eine solubilisierte Cholesterolzubereitung enthält, für die Herstellung eines Medikamentes, das an Urothelzellen durch intravesikale Zulieferung an eine Blase eines Individiums angewendet wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Cholesterol mit einem Cyclodextrin solubilisiert worden ist.
Verwendung eines pharmazeutischen Agens und eines solubilisierten Cholesterols für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs, wobei das pharmazeutische Agens Anti-Krebs-Aktivität aufweist und das Cholesterol mit einem Cyclodextrin solubilisiert worden ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Krebs ein Blasenkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Cyclodextrin Methyl-β-cyclodextrin ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Cyclodextrin aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Alpha-Cyclodextrin, Beta-Cyclodextrin, Gamma-Cyclodextrin, sulfatiertem Beta-Cyclodextrin, tertiärem Amin Beta- Cyclodextrin, quaternärem Amin Beta-Cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, 2,6-Di-O-methyl-beta-cyclodextrin, Hydroxyethyl-beta-cyclodextrin, 6-Desoxy-6-S-beta-D-galactopyranosyl-6-thio-cyclomalto-heptaose, Sulfobutylether-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-beta-cyclodextrin, Carboxy-methyl-ethyl-beta-cyclodextrin, Diethyl-beta-cyclodextrin, Di-methyl-beta-cyclodextrin, zufallsverteiltem Methyl-beta-cyclodextrin, Glucosyl-beta-cyclodextrin und Maltosyl-beta-cyclodextrin besteht.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das pharmazeutische Agens umfasst: (i) mindestens ein Polynukleotid und (ii) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer oder ein (ii) Dendrimer oder Mischungen davon.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei (ii) ein kationisches Lipid ist, das DOTAP ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei (ii) ein Dendrimer ist, das Superfect ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das kationische Lipid, kationische Polymer oder Dendrimer aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus DOPE, DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM, Polylysin, Polyhistidin, Polyarginin, Polyethylenimin, Poly(4-vinylpyridin), Poly(vinylamin), Poly(4-vinyl-N-alkyl-pyridiniumhalogenid) oder Mischungen davon besteht.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Polynukleotid Plasmid-DNA ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Polynukleotid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus viraler DNA, chromosomalen Fragmenten, Antisense-Oligonukleotiden, Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotiden, RNA-Molekülen und Ribozymen oder Mischungen davon besteht.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das pharmazeutische Agens umfasst: (iii) mindestens ein Polynukleotid und (ii) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer oder ein (iv) Dendrimer oder Mischungen davon.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei (ii) ein kationisches Lipid ist, das DOTAP ist.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei (ii) ein Dendrimer ist, das Superfect ist.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das kationische Lipid, kationische Polymer oder Dendrimer aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus DOPE, DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM, Polylysin, Polyhistidin, Polyarginin, Polyethylenimin, Poly(4-vinylpyridin), Poly(vinylamin), Poly(4-vinyl-N-alkyl-pyridiniumhalogenid) oder Mischungen davon besteht.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Polynukleotid Plasmid-DNA ist.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Polynukleotid mindestens einen Expressionsvektor umfasst, der mindestens ein Protein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Interleukinen, Interferonen, koloniestimulierenden Faktoren, anti-angiogenischen Faktoren, anti-metastasenbildenden Faktoren, Membranrezeptoren und Tumorsuppressoren besteht.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Polynukleotid einen Expressionsvektor umfasst, der für ein Protein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 9 (IL-9), Interleukin-11 (IL-11), Interleukin-12 (IL-12), Interleukin-13 (IL-13), Interleukin-18 (IL-18), Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF), Granulozyten koloniestimulierendem Faktor (G-CSF), Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (M-CSF), Hitzeschockprotein (HSP), p53, einem Antagonisten des vaskulo-endothelialen Zellwachstumsfaktors (VEGF), einem Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen (TIMP) und einem Fibronektinrezeptor besteht.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Polynukleotid einen Expressionsvektor umfasst, der für Interleukin-2 (IL-2) kodiert.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Polynukleotid einen Expressionsvektor umfasst, der für den Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierenden Faktor (GMCSF) kodiert.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Polynukleotid einen Expressionsvektor, der für Interferon-γ kodiert, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Polynukleotid mindestens einen Expressionsvektor umfasst, der für zwei oder mehrere von Interleukin-2 (IL-2), Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierenden Faktor (GMCSF) und Interferon-γ kodiert.
Die Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Subjekt sich in einer zusätzlichen Behandlung gegen Blasenkrebs befindet.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei die zusätzliche Behandlung gegen Blasenkrebs die Bazillus Calmette-Guérin (BCG)-Therapie umfasst.
Transfektionszusammensetzung, die umfasst: (i) ein Polynukleotid; (ii) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer oder ein Dendrimer oder Mischungen davon; und (iii) eine solubilisierte Cholesterolzubereitung, die ein mit einem Cyclodextrin solubilisiertes Cholesterol umfasst.
Transfektionszusammensetzung nach Anspruch 37, wobei das Cyclodextrin Methyl-β-cyclodextrin ist.
Transfektionszusammensetzung nach Anspruch 37, wobei das Cyclodextrin aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Alpha-Cyclodextrin, Beta-Cyclodextrin, Gamma-Cyclodextrin, sulfatiertem Beta-Cyclodextrin, tertiärem Amin-beta-cyclodextrin, quaternärem Amin-beta-cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, 2,6-Di-O-methyl-beta-cyclodextrin, Hydroxyethyl-beta-cyclodextrin, 6-Desoxy-6-S-beta-D-galactopyranosyl-6-thio-cyclomalto-heptaose, Sulfobutylether-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-beta-cyclodextrin, Carboxymethyl-ethyl-beta-cyclodextrin, Diethyl-beta-cyclodextrin, Dimethyl-beta-cyclodextrin, zufallsverteiltem Methyl-beta-cyclodextrin, Glucosyl-beta-cyclodextrin und Maltosyl-beta-cyclodextrin besteht.
Transfektionszusammensetzung nach Anspruch 37, wobei (ii) ein kationisches Lipid ist, das DOTAP ist.
Transfektionszusammensetzung nach Anspruch 37, wobei (ii) ein Dendrimer ist, das Superfect ist.
Transfektionszusammensetzung nach Anspruch 37, wobei das kationische Lipid, kationische Polymer oder Dendrimer aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus DOPE, DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM, Polylysin, Polyhistidin, Polyarginin, Polyethylenimin, Poly(4-vinylpyridin), Poly(vinylamin), Poly(4-vinyl-N-alkyl-pyridiniumhalogenid) oder Mischungen davon besteht.
Transfektionszusammensetzung nach Anspruch 37, wobei das Polynukleotid Plasmid-DNA ist.
Transfektionszusammensetzung nach Anspruch 37, wobei das Polynukleotid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus viraler DNA, chromosomalen Fragmenten, Antisense-Oligonukleotiden, Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotiden, RNA-Molekülen und Ribozymen oder Mischungen davon besteht.