WO2002051446A2 - Transfektionskomplexe (transoplex) mit reduzierter toxizität - Google Patents

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WO2002051446A2
WO2002051446A2 PCT/EP2001/015287 EP0115287W WO02051446A2 WO 2002051446 A2 WO2002051446 A2 WO 2002051446A2 EP 0115287 W EP0115287 W EP 0115287W WO 02051446 A2 WO02051446 A2 WO 02051446A2
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Carsten Olbrich
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Definitions

  • Transfection complexes with reduced toxicity, high physical stability and high transfection efficiency as well as processes for their production
  • the invention relates to new complexes for transfection which are produced by assembling material to be transfected with surface-modified particles from lipids which are solid at room temperature or from lipid mixtures of lipids which are solid at room temperature and lipids which are semi-solid or liquid at room temperature.
  • genetic information eg polynucleotides
  • Carrier systems used for such purposes are, for example:
  • viruses are their high effectiveness, since the infectivity of viruses is based on the fact that they infiltrate viral DNA into cells.
  • the genetic information is integrated into the eukaryotic genome, there is a risk of a mutation due to the integration of the gene into the genome.
  • the use of viruses poses a high security risk for the patient.
  • adenoviruses Another advantage of adenoviruses is its high effectiveness.
  • a disadvantage is that they are not integrated into the eukaryotic genome but are present as extrachromosomal DNA in the cell nucleus, so that only transient transfection takes place. This requires repeated application of the viral gene transfer system over the entire duration of the disease, i.e. usually lifelong, because the cause is not the final therapy.
  • Non-viral infection systems such as liposomes have the advantage that they avoid the dangers of viral systems. However, they have the disadvantage that the transfection efficiency is significantly lower.
  • liposomes have problems with physical stability. In addition, they are relatively expensive. "Cheap" liposomes for pharmaceutical purposes do not yet exist.
  • Polymer particles are being examined intensively and have not yet found their way to the market for various reasons. Many of the polymers used are toxicologically problematic and have therefore not been approved by the responsible authorities. So for example, polyalkylcyanoacrylates release potentially carcinogenic formaldehyde when degraded in vivo, polymethacrylates have a too long degradation time (years). Also for polymers approved in vivo as implant material such as polylactic acid (PLA) and the copolymer of lactic and glycolic acid (PLA / GA) have toxicity problems at the cellular level. For example, PLA particles showed cytotoxicity after uptake in cells (see A. Smith and IA Hunneyball, Evaluation of poly (lactic acid) as a biodegradable drug delivery System for parenteral administration, Int. J. Pharm. 30, 215-220 (1986) ).
  • PLA polylactic acid
  • PLA / GA copolymer of lactic and glycolic acid
  • Polymers are also used in molecular form as a transfection agent, e.g. Polyethyleneimine (pEI) (see Rudolph, C, Lausier, J., Naundorf, S., Müller, RH, Rosenecker, J., In vivo gene delivery to the lung using polyethylenimine and fractured polyamidoamine dendrimers, The Journal of Gene Medicine 2, 269-278, 2000).
  • pEI Polyethyleneimine
  • the problem changes little when polymers are not in particulate form but as individual macromolecules. On the contrary, with the same dose, the toxicity increases in part, since the entire polymer is already dissolved and does not dissolve in smaller quantities due to degradation of the particles.
  • enhancer of the transfecting effect e.g. chloroquine
  • lipid particles in a size of approximately 10 nm to approximately 30 ⁇ m are produced using conventional methods from textbooks and literature. In contrast to liposomes, they consist of lipids that are solid at room temperature, or mixtures of lipids that are solid at room temperature with lipids that are semi-solid or liquid at room temperature.
  • the surface of these lipid particles is modified with modifying agents, in particular surfactants or polymers or mixtures thereof.
  • lipid particles are then mixed in an appropriate ratio with the material to be transfected (e.g. polynucleotides), incubated for a time to form the complex and then mixed into the cells for transfection.
  • material to be transfected e.g. polynucleotides
  • the transfection efficiency can be increased by adding so-called enhancers.
  • Drugs such as chloroquine (CQ) or substances that interact strongly with membranes, e.g. Poly-L-lysine.
  • the tendency to form complexes via an aggregation mechanism can be slight in some mixtures of surface-modified lipid particles with material to be transfected, especially in lipid particles with a low positive charge ( ⁇ + 20 mV) or negatively charged particles.
  • the aggregation can be promoted by adding electrolytes such as 1: 1 electrolytes (eg NaCl), 1: 2 electrolytes (eg CaCl 2 ) or 1: 3 electrolytes, the complex-promoting effect of the electrolytes increasing in the order mentioned.
  • the complex formation leads to condensation of the polynucleotides.
  • the condensation is necessary so that the probability of success of a transfection increases.
  • the extent of the condensation in the complex can be tracked via particle size measurement. If the condensation is insufficient or a higher condensation is required for certain purposes, this can also be achieved in the manner described above by adding electrolyte.
  • the complex is therefore optionally supplemented by lysosomotropic or endosomolytic substances and electrolyte.
  • Lipids are natural building blocks of the body, so the toxicity of the lipid particles is several times lower than the transfection promoters previously used - both particulate and molecular. This is particularly true when lipids from glycerides of fatty acids occurring in the organism or the target cell are used.
  • the lipid particles according to the invention show high physical stability. They can even be sterilized at temperatures of around 121 ° C without impairing stability by autoclaving.
  • the transfection efficiency is generally superior to the previous systems, or at least equivalent, but at the same time TransoPlex has the advantages mentioned above.
  • the resulting transfection complex is characterized by good transfection efficiency combined with reduced toxicity and high physical stability and the possibility of incorporating auxiliary substances.
  • Fig. 1 AFM image of the complexes (example 2).
  • A Overview image 50 x 50 ⁇ m.
  • B-D are enlarged detail shots.
  • B Inclusion of the 2 different types of complex.
  • Fig. 3 DNA binding in the complex with increasing lipid particle to DNA ratio: determination of the decrease in free DNA by increasing the binding in the complex with gel electrophoresis (open diamonds, example 2), determining the decrease in EB intercalation due to increasing binding ( full circles).
  • Fig. 4 Transfection efficiency of complexes without chloroquine (DMEM) and complexes with chloroquine (DMEM + CQ) made from different weight ratios of lipid particles to plasmid (10 to 200, 0 is plasmid alone). The complexes were added to the Cos-1 cells dispersed in DME medium (DMEM). Quantification of efficiency via luminescence units (LCPS - Luminescence Counts Per Second). Detailed description of the invention
  • the lipid particles are produced by common methods. In the course of cold production, lipid particles - especially in the size in the lower micrometer range - can be produced by liquid grinding (colloid mill) or by gas jet grinding. During hot production, the lipid is melted, dispersed in an aqueous solution of the surface modifier (e.g. Tween 80) and converted into a fine-particle emulsion by high-speed stirring, for example with a propeller stirrer, blade stirrer, a toothed disk or a rotor-stator disperser.
  • the surface modifier e.g. Tween 80
  • surface modifiers can be dissolved or dispersed in the molten lipid.
  • the lipid crystallizes partially or completely and the lipid particles necessary for the complex are formed.
  • High-pressure homogenization can also be used to produce very fine particles in the nanometer range, both for hot comminution and cold comminution.
  • Lipids in the broadest sense can be used as matrix material, ie all lipophilic substances including waxes.
  • Lipids from the body's own / cell's own substances are preferably used, such as glycerides with the body's own fatty acids.
  • lipids can be used to produce the lipid particles. These are both chemically uniform lipids and their mixtures. When lipid mixtures are used, liquid lipids (e.g. oils, lipophilic hydrocarbons, lipophilic organic liquids such as oleyl alcohol) can also be mixed into the solid lipids (e.g. glycerides, lipophilic hydrocarbons such as hard paraffin) (so-called "lipid blends").
  • liquid lipids e.g. oils, lipophilic hydrocarbons, lipophilic organic liquids such as oleyl alcohol
  • solid lipids e.g. glycerides, lipophilic hydrocarbons such as hard paraffin
  • lipids are used as the dispersed phase. You can use it as an individual component or as a mixture be applied. Suitable are: natural or synthetic triglycerides or mixtures thereof, monoglycerides and diglycerides, alone or mixtures thereof or with, for example, triglycerides, self-emulsifying modified lipids, natural and synthetic waxes, fatty alcohols, including their esters and ethers, and in the form of lipid peptides, or any mixtures of the same.
  • Synthetic monoglycerides, diglycerides and triglycerides are particularly suitable as individual substances or as a mixture (eg hard fat), Imwitor 900, triglycerides (eg glycerol trilaurate, glycerol myristate, glycerol palmitate, glycerol stearate and glycerol behenate) and waxes such as cetyl palmitate ).
  • triglycerides eg glycerol trilaurate, glycerol myristate, glycerol palmitate, glycerol stearate and glycerol behenate
  • waxes such as cetyl palmitate
  • Surfactants and / or polymers are used in particular for surface modification, some of which also have a sterically stabilizing effect.
  • surfactants examples are:
  • ionic stabilizers such as diacetyl phosphates, phosphatidyl glycerol, lecithins of various origins (e.g. egg lecithin or soy lecithin), chemically modified lecithins
  • lecithins e.g. hydrogenated lecithins
  • phospholipids and sphingolipids e.g. phospholipids and sphingolipids
  • Zwitterionic surfactants such as, for example, (3- [(3-cholamido propyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-l-propanesulfonate) [CHAPSO], (3- [(3-cholamido propyl) dimethylammonio] -1-propane sulfonate) [CHAPS ] and N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-l-propanesulfonate.
  • Cationic surfactants for example benzyldimethylhexadecylammonium chloride, methylbenzethonium chloride, benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride.
  • cationic surfactants are, for example, DOTMA (N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), DDAB (didodecyldimethylammonium bromide), DOSPA (2,3-dioleyloxy-N- [2 (spermidine-carboxamide) ethyl] -N, N-dimethyl-l-propylammonium trifluoroacetate), TLC-chol (3ß - [N- (N ', N' -dimethylaminoethane) carbamoyl] -cholesterol), ester quats (ester compounds containing at least one contain quaternary nitrogen atom), e.g. B. EQ1, DDA (Dirnethyldioctadecylammonium bromide).
  • DOTMA N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl
  • Examples of usable steric stabilizers or polymers are:
  • Poloxamers and poloxamines polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers
  • ethoxylated sorbitan fatty acid esters especially polysorbates (eg Polysorbate 80 or Tween 80 ® ), ethoxylated mono- and diglycerides, ethoxylated lipids, ethoxylated fatty alcohols or fatty acids, and esters and ethers of Sugars or of sugar alcohols with fatty acids or fatty alcohols (eg sucrose monostearate);
  • Viscosity-increasing substances such as e.g. Cellulose ethers and cellulose esters (e.g. methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose), polyvinyl derivatives and polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl acetate, alginates, polyacrylates (e.g. Carbopol), xanthans and pectins.
  • Cellulose ethers and cellulose esters e.g. methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose
  • polyvinyl derivatives and polyvinyl alcohol e.g. methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose
  • polyvinyl derivatives and polyvinyl alcohol e.g. methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl
  • mixtures of surfactants and polymers can also be used for surface modification.
  • Particles produced and the complex produced with them were characterized in terms of particle size and charge (quantified as zeta potential).
  • the particle size was determined with Photon correlation spectroscopy (PCS, Malvern Zetasizer 4, Malvern, UK), the determination of the zeta potential in conductivity water (conductivity set to 50 ⁇ S / cm by adding NaCl) with laser Doppler anemometry (LDA) (Zetasizer 4). Conversion of mobility into zeta potential was carried out using the Helmholtz-Smoluchowski equation.
  • lipid particles are formed in different size ranges. Both micrometer particles (approx. 1-30 ⁇ m) and submicron particles ( ⁇ 1 ⁇ m) are used for the production of the transfection complex TransoPlex according to the invention.
  • the lipid microparticles have an average diameter from 1 ⁇ m to 20 ⁇ m, preferably an average diameter from 1 ⁇ m to 10 ⁇ m, in particular from 1 ⁇ m to 5 ⁇ m.
  • the lipid nanoparticles used have an average diameter of 10 nm to 1000 nm, preferably 10 nm to 500 nm, and in particular 10 nm to 200 nm.
  • the resulting complex according to the invention has a size> 1 ⁇ m to 30 ⁇ m, preferably> 1 ⁇ m to 10 ⁇ m, in particular> 1 ⁇ m to 5 ⁇ m.
  • the resulting complex has a size of ⁇ 1000 nm, preferably 100 to 800 nm, and in particular 300 nm to 800 nm.
  • the charge of the lipid particles differs depending on the surface modifiers used.
  • three groups can be distinguished, ie lipid particles in which the zeta potential: a) is positive, preferably> 0 mV to +100 mV, in particular +20 mV to 60 mV, b) is in the range from -20 mV to +20 mV (ie uncharged or very weakly charged lipid particles), c) is negative , preferably ⁇ 0 mV to -100 mV, in particular -20 mV to -60 mV.
  • the surface-modified lipid particles are mixed with the material to be transfected, e.g. Polynucleotides such as DNA, recombinant DNA, in particular circular or linearized plasmids for the expression of therapeutic proteins, RNA, in particular mRNA, polynucleotide analogs, antisense nucleotides, and usually incubated for 15 minutes.
  • Polynucleotides such as DNA, recombinant DNA, in particular circular or linearized plasmids for the expression of therapeutic proteins, RNA, in particular mRNA, polynucleotide analogs, antisense nucleotides, and usually incubated for 15 minutes.
  • Electrolytes can only initiate complex formation via aggregation, whereby with increasing shift of the particle charge from the positive over the uncharged area to the negative area, more aggregation-promoting electrolytes must be used in different concentrations, i.e. analogous to a) - c) above preferably:
  • electrolytes such as NaCl and KCL, preferably concentrated in isotonic concentration or less
  • 1: 2 electrolytes such as CaCl 2 or 2: 1 electrolyte, preferably in isotonic concentration
  • electrolyte can remain in the suspension or - if necessary - the excess electrolyte can also be removed again (for example by dialysis), the aggregation process to the complex is usually irreversible.
  • certain medicinal substances in particular substances which are suitable for preventing the lysosomal degradation of the polynucleotides - such as chloroquine, monensin, weakly basic nitrogen compounds or other weak bases can also be added.
  • substances can be used which interact with membranes and influence their structure and fusion properties, e.g. Dimethyl sulfoxide (DMSO), azone and membrane-destabilizing peptides such as amino acid sequences from the influenza virus haemagglutinin or the bee venom mellitin.
  • the structure of the complexes formed is described in Example 2 and Fig. 2.
  • the complexes are primarily characterized in that DNA is not solely complexed on the surface of a particle, but rather aggregates are formed in which lipid particles are connected via DNA strands.
  • the complexes are aggregates, the aggregate structure consisting of strands of transfection material that binds together lipid particles.
  • the units consist of sub-units that are grouped together.
  • the complexes formed can be used both in vitro (eg cell culture) and in vivo.
  • the Application takes place in a variety of ways, for example orally via the gastrointestinal tract (GIT) or parenterally in various ways, from intravenous injection to lymphatic absorption after injection in the vicinity of lymphatic vessels.
  • GIT gastrointestinal tract
  • the complexes produced can themselves be provided with surface modifiers. This ranges from lectins for improved uptake from the GIT to polymers (Poloxamer 407 for bone market targeting, Poloxamine for blood targeting) and non-ionic surfactants (Tween 80, brain targeting) including antibodies.
  • the complexes according to the invention can therefore contain, for example, additional substances, in particular lectins, antibodies or adhesion factors, which improve the binding and the uptake by the cells to be transfected.
  • the complexes according to the invention can additionally contain substances, in particular peptides, which have the ability to induce a translocation of the transfected DNA into the cell nucleus, these additional substances being coupled to the lipid particles or the DNA.
  • the complexes are used in a variety of ways, e.g. :
  • a) for the specific or non-specific transfer of genetic information in cells b) for the stable storage of polynucleotides, c) generally for therapy in vivo and ex vivo, d) for local, oral or systemic in vivo therapy of diseases, e) for transfection in general, f) for gene therapy.
  • the lipid compritol was melted in water with 4% of a surfactant mixture of Tween 80 / Span 85 (ratio 7: 3) and 1% EQ1 (N, N-Di ( ⁇ -stearoylethyl) -N, N-dimethylammonium chloride) by stirring dispersed at the same temperature and then the resulting emulsion (lipid content 4%) at 85 ° C high pressure homogenized (LAB 60 homogenizer, APV Homogenizer GmbH, Lübeck). Homogenization took place in the circulation mode over 30 minutes at 500 bar at the main pressure valve.
  • the PCS diameter of the lipid particles was 101 nm, the associated polydispersity 0.101, the zeta potential was +42 mV.
  • the lipid particle dispersion was mixed with pCMV ⁇ plasmid in HEPES buffer (pH 7.4), the concentration of lipid in the final mixture was 600 ⁇ g / ml and that of plasmid was 10 ⁇ g / ml.
  • the structure of the complex can be influenced in a targeted manner by the type of preparation, for example lipid particle size, lipid: plasmid ratio, and sequence, type and concentration of added electrolytes.
  • the complex products from Example 1 were examined using atomic force microscopy (AFM).
  • the complexes were adsorbed on the surface of a silicon wafer and examined with AFM in contact mode with a purple nanoscope (Digital Instruments).
  • the spring rate of the cantilever was 34 N / m, the scan speed 0.5 Hz with a resolution of 512 x 512 pixels.
  • the overview (Fig. 1A) shows the complexes, in addition individual lipid particles with a size of approx. 100 nm can be seen.
  • Fig. 1B and IC show that the complexes consist of subunits that have fused
  • Fig. IC shows the comparison of the original, individual lipid particle to the complex produced.
  • Fig ID shows a snapshot of the complex's process of formation. Free DNA strands, DNA strands already filled with lipid particles and free SLN are in the process of fusing into a large complex (aggregate in the lower left half).
  • Transfection complexes were prepared by mixing lipid particles and pCMVß plasmid in 200 ⁇ l HEPES buffer (pH 7.4) at a plasmid concentration of 20 ⁇ g / ml as in Example 1.
  • pCMVß DNA from 200 to 5 were mixed and one-dimensional gel electrophoresis on agarose gel was carried out with these mixtures (2 hours at 5V / cm).
  • the gel obtained was examined using a UV transilluminator and the Geldoc2000 gel documentation system (Biorad, Kunststoff, Germany), the bands were integrated and background correction was carried out using the Molecular Analyst Version 1.1 software (Bioread). Binding of the DNA in a complex leads to a change (shift) in the migration in the gel towards higher molecular weights or DNA is immobilized in such a way that it remains in the gel at the application site (well). Above a lipid particle ratio of 50, 100% of the DNA was shifted to higher molecular weights or completely immobilized (Fig. 2)
  • Fig. 2 Example 4:
  • lipid particles to pCMVß DNA were mixed to produce the complexes of the invention.
  • DNA was diluted in 50mM Hepes buffer (pH 7.4) to a concentration of 10 ⁇ g / ml, then mixed with different amounts of particle dispersion and made up to 2 ml.
  • the transfection efficiency was investigated on African Green Monkey Kidney fibroblast-like Cos-1 cells.
  • Complexes were prepared by mixing as described in Example 1, the lipid particle concentrations varied, the final concentration of plasmid in the mixture was 20 ⁇ g / ml.
  • the complexes were incubated with buffer or double-concentrated cell culture medium - 1 (Dulbecco ⁇ s Modified Eagle s DME) diluted 1, and incubating the monolayers of Cos-1 cells in the well of the microtiter plates with 100 ul of this mixture for 4 hours at 37 ° C.
  • the cells were washed with buffer and cultured for a further 48 hours in DME with the addition of 10% fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • the pCMVß plasmid effects ß-galactosidase expression.
  • the transfection efficiency was subsequently determined via the activity of the ⁇ -galactosidase determined using the Luminescence Galacto-Star assay system (PE Biosystems, CCC). The cells were washed with buffer, lysed and incubated with 100 ⁇ l reaction solution over 90 minutes at room temperature in order to achieve maximum luminescence signals. The luminescence was determined using a Wallac beta (PE Biosystems) over an integration time of one second. Purified recombinant ⁇ -galactosidase was used as the standard. The transfection efficiency was maximal at a ratio of approx. 40-60 (Fig. 4).
  • Example 5 The preparation and testing was carried out as described in Example 5, and the complex system additionally contained 100 ⁇ M chloroquine.
  • the complex system of lipid particles, plasmid and chloroquine has a far higher transfection efficiency, maximum transfection occurs even at the lowest weight ratio of 10 (Fig. 4).
  • the Cos-1 cells were incubated with increasing concentrations of the transfection agent for 4 hours and then, after washing with buffer, examined directly with the LDH assay (lactate dehydrogenase) (Boehringer Mannheim, Mannheim Germany). With increasing membrane damage, the LDH release increases.
  • the transfection agents lipid particles from Example 1 were examined in comparison to the conventional agent polyethyleneimine (pEI) (molecular weight 60 kDa) and to poly-L-lysine.
  • the ED50 in the LDH assay was 3000 ⁇ g / ml for the lipid particles, but 20 ⁇ g / ml for pEI (ie pEI has approximately 150 times higher membrane toxicity) and 10 ⁇ g / ml for poly-L-lysine.
  • Example 8
  • Cos-1 cells were incubated with increasing concentrations of the transfection agent for 4 hours, washed and - in contrast to Example 7 - not examined directly but, after washing with buffer, cultured for a further 48 hours in DME medium with the addition of 10% FCS.
  • the WST-1 assay (Boehringer Mannheim, Mannheim Germany), an improved form of the MTT test, was used to determine cell viability. The dose that led to the death of 50% of the cells was determined (LD50).
  • the transfection agents lipid particles from example 1 were examined in comparison to the conventional agent polyethyleneimine (pEI) and to poly-L-lysine as standard.
  • the LD50 was 600 ⁇ g / ml for the lipid particles, but 20 ⁇ g / ml for pEI and 10 ⁇ g / ml for poly-L-lysine.
  • Lipid particles were prepared as in Example 1, but from 4% solid paraffin as the lipid.
  • the membrane damage was determined analogously to Example 7: ED50> 5000 ⁇ g / ml (pEI 20 ⁇ g / ml), the viability determined analogously to Example 8: LD50 700 ⁇ g / ml (pEI 20 ⁇ g / ml).
  • Lipid particles were produced analogously to Example 1, the behenic acid-glyceride mixture Compritol (Gattefosse, France) was used as the lipid, 1% cetylpyridinium chloride (CPC) as the additional cationic surfactant.
  • the PCS diameter was 105 nm, the polydispersity index 0.112 and the zeta potential +40 mV (ie identical physical characteristics to the lipid particles from example 1). Simple mixing of these lipid particles with HEPES buffer without complex-promoting electrolyte addition did not lead to complex formation, no "mobility shift" was detected in the EMSA.
  • Example 1 The particles produced in Example 1 were sterilized by autoclaving at 121 ° C for 15 minutes.
  • the PCS diameter before sterilization was 103 nm, the polydispersity index 0.110, the values after sterilization 101 nm and 0.101.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Komplexe zur Transfektion, die zu transfizierendes Material und Lipidpartikel, die aus bei Raumtemperatur festen Lipiden oder Lipidmischungen aus bei Raumtemperatur festen Lipiden mit bei Raumtemperatur halbfesten oder flüssigen Lipiden bestehen, umfassen, wobei die Lipidpartikel an ihrer Oberfläche Modifizierungsmittel aufweisen.

Description

Transfektionskomplexe (TransoPlex) mit reduzierter Toxizität, hoher physikalischer Stabilität und hoher Transfektionseffizienz sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft neue Komplexe zur Transfektion die durch Zusammenlagerung von zu transfizierendem Material mit oberflächenmodifizierten Partikeln aus bei Raumzustand festen Lipiden oder aus Lipidmischungen aus bei Raumtemperatur festen Lipiden mit bei Raumtemperatur halbfesten oder flüssigen Lipiden hergestellt werden.
In der rekombinanten Gentechnologie und in der Gentherapie führt man Erbinformation (z.B. Polynukleotide) effizienter in Zellen ein, wenn man sie in einen Träger einarbeitet oder an ihn bindet. Für solche Zwecks eingesetzte Trägersysteme sind beispielsweise:
1. Viren
2. Adenoviren
3. Liposomen
4. Polymerpartikel
5. Makromoleküle
Ein Vorteil von Viren ist die hohe Effektivität, da die Infektiö- sität von Viren ja gerade darauf beruht, virale DNA in Zellen einzuschleusen. Die Erbinformation wird zwar in das eukaryon- tische Genom integriert, jedoch besteht dabei die Gefahr einer Mutation durch Integration des Gens in das Genom. Zusätzlich bedeutet die Verwendung von Viren ein hohes Sicherheitsrisiko für den Patienten.
Ein Vorteil von Adenoviren ist wiederum die hohe Effektivität. Ein Nachteil ist jedoch, daß sie nicht in das eukaryontische Genom integriert werden sondern als extrachromosomale DNA im Zellkern vorliegen, so daß nur eine transiente Transfektion stattfindet. Dies erfordert eine wiederholte Applikation des viralen Gentransfersystems über die gesamte Dauer der Erkrankung, d.h. in der Regel lebenslang, da nicht ursächlich einmal abschließend therapiert wird.
Nichtvirale InfektionsSysteme wie Liposomen haben den Vorteil, daß sie die Gefahren viraler Systeme vermeiden. Sie haben jedoch den Nachteil, daß die Transfektionseffizienz deutlich geringer ist. Zusätzlich gibt es bei Liposomen - wie bereits bekannt von liposomalen Arzneimitteln - Probleme mit der physikalischen Stabilität. Zusätzlich sind sie relativ teuer. "Billige" Liposomen für pharmazeutische Zwecke gibt es noch nicht.
Polymerpartikel werden intensiv untersucht, haben bisher aus diversen Gründen nicht den Weg zum Markt gefunden. Viele der eingesetzten Polymere sind toxikologisch problematisch und sind von den zuständigen Behörden daher nicht zugelassen worden. So setzen beispielsweise Polyalkylcyanoacrylate beim Abbau in vivo potentiell kanzerogenes Formaldehyd frei, Polymethacrylate haben eine zu lange Abbauzeit (Jahre) . Auch für in vivo als Implantatmaterial zugelassene Polymere wie PolymiIchsäure (PLA) und das Copolymer aus Milch- und Glykolsäure (PLA/GA) haben Toxizitäts- probleme auf zellulärer Ebene. So zeigten PLA-Partikel nach Aufnahme in Zellen Zytotoxizität (siehe A. Smith and I.A. Hunneyball, Evaluation of poly(lactic acid) as a biodegradable drug delivery System for parenteral administration, Int. J. Pharm. 30, 215-220 (1986)).
Polymere werden auch in molekularer Form als Transfektionsagens eingesetzt, z.B. Polyethylenimin (pEI) (siehe Rudolph, C, Lausier, J., Naundorf, S., Müller, R. H., Rosenecker, J. , In vivo gene delivery to the lung using polyethylenimine and fractured polyamidoamine dendrimers, The Journal of Gene Medicine 2, 269- 278, 2000) . Die Problematik ändert sich wenig, wenn Polymere nicht in partikulärer Form vorliegen sondern als einzelne Makromoleküle. Im Gegenteil, erhöht sich bei gleicher Dosis teilweise die Toxizität, da das gesamte Polymer bereits gelöst vorliegt und nicht in kleineren Mengen verzögert durch Abbau der Partikel in Lösung geht .
Zur Umgehung der oben geschilderten Probleme wie Toxizität, Sicherheit, mangelnder physikalischer Stabilität und relativ hoher Kosten war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein TransfektionsSystem zu schaffen, daß diese Probleme minimiert oder vermeidet.
Diese Aufgabe wurde durch den erfindungsgemäß Transfektionskom- plex "TransoPlex" auf der Basis einer Kombination von 1. Lipidpartikeln
2. Oberflächenmodifizierer für diese Lipidpartikel
3. zu transfizierendem Material und
4. gegebenenfalls Verstärker (Enhancer) der transfizierenden Wirkung (z.B. Chloroquin) sowie
5. gegebenenfalls Elektrolyt (insbesondere CaCl2)
gelöst.
Die Lipidpartikel in einer Größe von etwa 10 nm bis zu etwa 30 μm werden mit konventionellen Methoden der Lehrbücher und Literatur hergestellt . Sie bestehen - im Gegensatz zu Liposomen - aus Lipiden, die bei Raumtemperatur fest sind, bzw. Mischungen von bei Raumtemperatur festen Lipiden mit bei Raumtemperatur halbfesten oder flüssigen Lipiden.
Die Oberfläche dieser Lipidpartikel wird zur Erhöhung der physikalischen Stabilität sowie der Komplexbildungsfähigkeit mit dem zu transfizierenden Material, mit Modifizierungsmittel, insbesondere Tensiden oder Polymeren oder Mischungen derselben modifiziert.
Diese Lipidpartikel werden dann in einem geeigneten Verhältnis mit dem zu transfizierendem Material (z.B. Polynukleotide) gemischt, eine Zeitlang zur Ausbildung des Komplexes inkubiert und dann den Zellen zur Transfektion zugemischt.
Die Transfektionseffizienz kann durch Zumischung von sogenannten Enhancern verstärkt werden. Hierfür sind Arzneistoffe wie Chloroquin (CQ) oder Substanzen geeignet, die stark mit Membranen interagieren, z.B. Poly-L-Lysin.
Die Tendenz Komplexe über einen Aggregationsmechanismus zu bilden kann bei einigen Mischungen von oberflächenmodifizierten Lipidpartikeln mit zu transfizierendem Material gering ausgeprägt sein, insbesondere bei Lipidpartikeln mit geringer positiver Ladung (< + 20 mV) bzw. negativ geladenen Partikeln. Hier kann die Aggregation durch Zusatz von Elektrolyten wie 1 : 1 Elektrolyte (z.B. NaCl) , 1:2 Elektrolyte (z.B. CaCl2) oder 1:3 Elektrolyte gefördert werden, wobei die komplexfördernde Wirkung der Elektrolyte in der genannten Reihenfolge zunimmt .
Die Komplexbildung führt zu einer Kondensation der Polynukleotide. Die Kondensation ist notwendig, damit die Erfolgswahrscheinlichkeit einer Transfektion steigt. Das Ausmaß der Kondensation im Komplex kann über Partikelgrößenmessung verfolgt werden. Ist die Kondensation nicht ausreichend oder ist für bestimmte Zwecke eine höhere Kondensation erforderlich, so kann diese ebenfalls in der oben beschriebenen Weise durch Elektrolytzusatz erzielt werden.
Optional wird Komplex daher durch lysosomotrope oder endosomoly- tische Substanzen und Elektrolyt ergänzt.
Lipide sind natürliche Bausteine des Körpers, somit ist die Toxizität der Lipidpartikel um ein mehrfaches geringer als die bisher eingesetzten Transfektionspromotoren - sowohl partikuläre als auch molekulare. Insbesondere trifft dies zu wenn Lipide aus Glyceriden von im Organismus bzw. der Zielzelle vorkommenden Fettsäuren verwendet werden.
Im Gegensatz zu Liposomen zeigen die erfindungsgemäßen Lipidpartikel eine hohe physikalische Stabilität. Sie können sogar bei Temperaturen von etwa 121° C ohne Stabilitätsbeeinträchtigung durch Autoklavieren sterilisiert werden.
Die Transfektionseffizienz ist bei geeigneter Auswahl des Komplexes den bisherigen Systemen in der Regel überlegen, oder zumindest gleichwertig wobei TransoPlex gleichzeitig jedoch die oben erwähnten Vorteile aufzuweisen hat.
Der resultierende Transfektionskomplex zeichnet sich im Vergleich zu bisherigen GentransferSystemen durch gute Transfektionseffizienz bei gleichzeitig reduzierter Toxizität und hoher physikalischer Stabilität sowie der Möglichkeit zur Inkorporation von Hilfsstoffen aus.
Erklärungen zu den Abbildungen:
Abb. 1: AFM-Auf ahmen der Komplexe (Beispiel 2) . A: Übersichtsaufnahme 50 x 50 μm. B-D sind vergrößerte Detailaufnahmen. B: Aufnahme der 2 verschiedenen Komplextypen.
C. Komplexstruktur - Komplex bestehend aus fusionierten 100 nm Untereinheiten.
D. Momentaufnahme aus Komplexbildungsprozeß.
Abb. 2: Bindung von Plasmid in den Komplex, Untersuchung mit Gelelektrophorese (Linien von links: Molekularge- wichtsmarker, Mischungen Lipidpartikel : Plasmid (w/w) = 200, 100, 50, 30, 20, 10, 5, Plasmid allein) .
Abb. 3: DNA-Bindung im Komplex mit ansteigendem Verhältnis Lipidpartikel zu DNA: Bestimmung der Abnahme an freier DNA durch Zunahme der Bindung im Komplex mit Gelelektrophorese (offene Rauten, Beispiel 2) , Bestimmung der Abnahme der EB-Interkalation infolge Zunahme der Bindung (volle Kreise) .
Abb. 4: Transfektionseffizienz von Komplexen ohne Chloroquin (DMEM) und von Komplexen mit Chloroquin (DMEM+CQ) hergestellt aus verschiedenen Gewichtsverhältnissen von Lipidpartikeln zu Plasmid (10 bis 200, 0 ist Plasmid alleine) . Die Komplexe wurden den Cos-1 Zellen dispergiert in DME Medium (DMEM) zugesetzt. Quantifizierung der Effizienz über Lumineszenzeinheiten (LCPS - Luminescence Counts Per Second) . Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Herstellung der Lipidpartikel erfolgt durch gängige Methoden. Im Rahmen der Kaltherstellung können Lipidpartikel - vor allem in einer Größe im unteren Mikrometerbereich - durch Flüssigmahlung (Kolloidmühle) oder durch GasStrahlmahlung hergestellt werden. Bei der Heißherstellung wird das Lipid geschmolzen, in einer wäßrigen Lösung des Oberflächenmodifizierers (z.B. Tween 80) dispergiert und durch hochtouriges Rühren beispielsweise mit einem Propellerrührer, Blattrührer, einer Zahnscheibe oder einen Rotor-Stator-Dispergator in eine feinteilige Emulsion überführt.
Oberflächenmodifizierer können auch alternativ im geschmolzenen Lipid gelöst oder dispergiert werden. Beim Abkühlen kristallisiert das Lipid teilweise oder vollständig und es entstehen die für den Komplex notwendigen Lipidpartikel. Zur Herstellung sehr feiner Partikel im Nanometerbereich kann auch Hochdruckhomogeni- sation eingesetzt werden, sowohl zur Heißzerkleinerung als auch Kaltzerkleinerung.
Als Matrixmaterial können Lipide im weitesten Sinne eingesetzt werden, das heißt sämtliche lipophilen Substanzen einschließlich Wachse. Bevorzugt werden Lipide aus körpereigenen/zelleigenen Substanzen eingesetzt, wie beispielsweise Glyceride mit körpereigenen Fettsäuren.
Eine Vielzahl unterschiedlicher Lipide kann zur Herstellung der Lipidpartikel eingesetzt werden. Dies sind sowohl chemisch einheitliche Lipide als auch ihre Mischungen. Bei eingesetzten Lipidmischungen können auch flüssige Lipide (z. B.Öle, lipophile Kohlenwasserstoffe, lipophile organische Flüssigkeiten wie Oleylalkohol) den festen Lipiden (z. B. Glyceride, lipophile Kohlenwasserstoffe wie Hartparaffin) zugemischt werden (sogenannte "lipid blends") .
Einsatz finden beispielsweise folgende Lipide als dispergierte Phase. Sie können als individuelle Komponente oder als Mischung angewendet werden. Geeignet sind: natürliche oder synthetische Triglyceride bzw. Mischungen derselben, Monoglyceride und Diglyceride, allein oder Mischungen derselben oder mit beispielsweise Triglyceriden, selbst-emulgierende modifizierte Lipide, natürliche und synthetische Wachse, Fettalkohole, einschließlich ihrer Ester und Ether sowie in Form von Lipidpeptiden, oder irgendwelche Mischungen derselben. Besonders geeignet sind synthetische Monoglyceride, Diglyceride und Triglyceride als individuelle Substanzen oder als Mischung (z.B. Hartfett), Imwitor 900, Triglyceride (z.B. Glyceroltrilaurat, Glyce- rolmyristat, Glycerolpalmitat, Glycerolstearat und Glyce- rolbehenat) und Wachse wie z.B. Cetylpalmitat und weißes Wachs (DAB) .
Zur Oberflächenmodifikation werden insbesondere Tenside und/oder Polymere eingesetzt, wobei diese teilweise auch sterisch stabilisierende Wirkung haben.
Beispiele für zum Einsatz kommende Tenside sind:
Geladene ionische Stabilisatoren so wie Diacetylphosphate, Phos- phatidylglycerin, Lecithine unterschiedlicher Herkunft (z.B. Ei- lecithin oder Sojalecithin) , chemisch modifizierte Lecithine
(z.B. hydrierte Lecithine) , genauso wie Phospholipide und Sphin- golipide, Mischung von Lecithinen mit Phospholipiden, Sterolen
(z.B. Cholesterol und Cholesterol-Derivate, genauso wie Stigma- sterin) und ebenfalls gesättigte und ungesättigte Fettsäuren,
Natriumcholat, Natriumglycocholat, Natriumtaurocholat, Natriumde- oxycholat oder ihre Mischungen, Aminosäuren oder Anti-Flokkulan- tien, wie z.B. Natriumeitrat, Natriumpyrophosphat, Natriumsorbat
[Lucks, J.S. et al. Int. J. Phar ., 1990, 58, 229 - 235].
Zwitterionische Tenside wie beispielsweise (3- [ (3-cholamido- propyl) -dimethylammonio] -2-hydroxy-l-propansulfonate) [CHAPSO] , (3- [ (3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] -1-propansulfonate) [CHAPS] und N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-l-propansulfonat . Kationische Tenside, z.B. Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid, Benzalkoniumchlorid, Cetylpyridinium- chlorid.
Weitere kationische Tenside sind beispielsweise DOTMA (N- [1- (2,3- Dioleyloxy)propyl] -N,N,N-trimethylammoniumchlorid) , DDAB (Didode- cyldimethylammoniumbromid) , DOSPA (2, 3-Dioleyloxy-N- [2 (spermidin- carboxamid) ethyl] -N,N-dimethyl-l-propylammoniumtrifluoroacetat) , DC-Chol (3ß - [N- (N' ,N' -dimethylaminoethan) carbamoyl] -cholesterol) , Esterquats (Esterverbindungen, die mindestens ein quartäres Stickstoffatom enthalten) , z. B. EQ1, DDA (Dirnethyldioctadecylam- moniumbromid) .
Beispiele für verwendbare sterische Stabilisatoren bzw. Polymere sind:
Poloxamere und Poloxamine (Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Block- Copolymere) , ethoxylierte Sorbitanfettsäure-Ester, besonders Polysorbate (z.B. Polysorbat 80 bzw. Tween 80®), ethoxylierte Mono- und Diglyceride, ethoxylierte Lipide, ethoxylierte Fettalkohole oder Fettsäuren, und Ester und Ether von Zuckern oder von Zuckeralkoholen mit Fettsäuren oder Fettalkoholen (z.B. Saccharose-Monostearat) ;
Ebenfalls verwendet werden können Viskositätserhöhende Substanzen wie z.B. Cellulose-Ether und Cellulose-Ester (z.B. Methylcellulo- se, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Natriumcarb- oxymethylcellulose) , Polyvinylderivate sowie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylacetat, Alginate, Polyacrylate (z.B. Carbopol) , Xanthane und Pektine.
Es ist anzumerken, daß auch Mischungen von Tensiden und Polymeren zur Oberflächenmodifikation eingesetzt werden können.
Hergestellte Partikel und der damit produzierte Komplex wurden bezüglich Partikelgröße und Ladung (Quantifiziert als Zetapoten- tial) charakterisiert. Bestimmung der Partikelgröße erfolgte mit Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS, Malvern Zetasizer 4, Malvern, UK) , die Bestimmung des Zetapotentials in Leitfähigkeitswasser (Leitfähigkeit eingestellt auf 50 μS/cm durch NaCl- Zusatz) mit Laser-Doppler-Anemometrie (LDA) (Zetasizer 4) . Umrechnung der Mobilität in das Zetapotential wurde mit der Helmholtz-Smoluchowski-Gleichung vorgenommen.
In Abhängigkeit vom eingesetzten Herstellungsverfahren entstehen Lipidpartikel in unterschiedlichen Größenbereichen. Eingesetzt für die Herstellung des erfindungsgemäßen Transfektionskomplexes TransoPlex werden sowohl Mikrometerpartikel (ca. 1-30 μm) als auch Submikrometerpartikel (< 1 μm) .
In der Regel besitzen die Lipidmikropartikel einen mittleren Durchmesser von lμm bis 20 μm, vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von lμm bis 10 μm, insbesondere von lμm bis 5 μm.
In der Regel besitzen die eingesetzten Lipidnanopartikel einen mittleren Durchmesser von 10 nm bis 1000 nm, vorzugsweise 10 nm bis 500 nm, und insbesondere 10 nm bis 200 nm.
In Abhängigkeit von den jeweils verwendeten Partikeln resultieren auch unterschiedliche Größen des gebildeten Komplexes . Bei Lipidmikrometerpartikeln hat der resultierende erfindungsgemäße Komplex eine Größe > 1 μm bis 30 μm, vorzugsweise > 1 μm bis 10 μm, insbesondere > 1 μm bis 5 μm. Bei Lipidnanopartikeln hat der resultierende Komplex eine Größe < 1000 nm, vorzugsweise 100 bis 800 nm, und insbesondere 300 nm bis 800 nm.
Die Ladung der Lipidpartikel ist in Abhängigkeit der verwendeten Oberflächenmodifikatoren unterschiedlich. Generell können drei Gruppen unterschieden werden, d.h. Lipidpartikel bei denen das Zetapotential : a) positiv ist, vorzugsweise > 0 mV bis +100 mV, insbesondere +20 mV bis 60 mV, b) im Bereich von -20 mV bis +20 mV liegt (d.h. ungeladene bzw. sehr schwach geladene Lipidpartikel) , c) negativ ist, vorzugsweise < 0 mV bis -100 mV, insbesondere -20 mV bis -60 mV.
Zur Herstellung der Komplexe werden die oberflächenmodifizierten Lipidpartikel mit dem zu transfizierendem Material gemischt, z.B. Polynukleotide wie DNA, reko binante DNA, insbesondere zirkuläre oder linearisierte Plasmide zur Expression therapeutischer Proteine, RNA, insbesondere mRNA, Polynukleotidanaloga, Anti- sensenukleotide, und in der Regel für 15 Minuten inkubiert.
Positive Partikel zeigen oft - aber nicht immer - ein gutes Komplexierungsverhalten, es nimmt ab bei ungeladenen Partikeln und ist gering ausgeprägt bei negativ geladenen Lipidpartikeln. Die Komplexierung kann durch gezielten Elektrolytzusatz gefördert werden bzw. bei nicht komplexierenden Lipidpartikeln ausgelöst werden. Bei Förderung der Komplexierung erhält man dichter kondensierte Komplexe, in der Regel vorteilhaft für die Transfektion. Hierzu reichen schwach aggregierende 1:1 Elektrolyte aus . Elektrolyte können eine Komplexbildung über Aggregation auch erst auslösen, wobei mit zunehmender Verschiebung der Partikelladung aus dem positiven über den ungeladenen Bereich zum negativen Bereich stärker aggregationsfördernde Elektrolyte in unterschiedlicher Konzentration eingesetzt werden müssen, d.h. analog zu a) - c) oben vorzugsweise:
a) 1:1 Elektrolyte wie NaCl und KCL, vorzugsweise in isotonischer Konzentration oder geringer konzentriert, b) 1:2 Elektrolyte wie CaCl2 oder 2:1 Elektrolyte, vorzugsweise in isotonischer Konzentration, c) 1:3 Elektrolyte wie A1C13 oder 3:1 Elektrolyte, vorzugsweise in isotonischer Konzentration. Nach Herstellung des Komplexes mit Elektrolytzusatz kann der Elektrolyt in der Suspension verbleiben oder - falls erforderlich - auch der überschüssige Elektrolyt wieder entfernt werden (z.B. durch Dialyse), der AggregationsVorgang zum Komplex ist meistens irreversibel.
Zur Verstärkung der Transfektion können auch bestimmte Arznei- Stoffe - insbesondere Substanzen, die geeignet sind, den lysosomalen Abbau der Polynukleotide zu vermeiden, - wie Chloroquin, Monensin, schwach basische Stickstoffverbindungen oder andere schwache Basen zugesetzt werden. Alternativ kann man Substanzen verwenden, die eine Wechselwirkung mit Membranen zeigen und ihre Struktur sowie Fusionseigenschaften beeinflussen, z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO) , Azone und membrandestabilisierende Peptide wie beispielsweise Aminosäuresequenzen aus dem Influenzavirus Haemagglutinin oder dem Bienengift Mellitin.
Die Struktur der gebildeten Komplexe wird in Beispiel 2 und Abb. 2 beschrieben. Primär sind die Komplexe dadurch gekennzeichnet, daß DNA nicht alleinig auf der Oberfläche ko plexiert eines Partikels ist sondern sich primär Aggregate bilden, bei denen Lipidpartikel über DNA Stränge verbunden sind.
Es handelt sich bei den Komplexen um Aggregate, wobei die AggregatStruktur aus Strängen von Transfektionsmaterial besteht, das Lipidpartikel miteinander verknüpft . Die Aggregate bestehen dabei aus zusammengelagerten Untereinheiten. Kleinste Untereinheiten, die gleichzeitig auch einen eigenen Komplex (Aggregat) darstellen, bestehen teilweise aus nur wenigen Lipidpartikeln plus verknüpfendes Transfektionsmaterial (z.B. DNA-Stränge) . Es kommt auch vor, daß lediglich ein oder zwei Lipidpartikel einen Komplex mit dem zu transferierendem Material bilden, vorzugsweise haben dabei die Lipidpartikel eine Größe > 500 nm, insbesondere > 1 μm.
Die gebildeten Komplexe können sowohl in vitro (z.B. Zellkultur) als auch in vivo eingesetzt werden. Beim in vivo-Einsatz kann die Applikation auf vielfältigen Wegen erfolgen, z.B. oral über den Gastrointestinaltrakt (GIT) oder parenteral auf verschiedenen Wegen, von intravenöser Injektion bis zur lymphatischen Absorption nach Injektion in der Nähe von Lymphgefäßen. Um eine verbesserte Aufnahme aus bestimmten Organen (vom GIT, Erhöhung der Bioverfügbarkeit) oder in bestimmte Organe (z.B. Gehirn, Herz, Knochenmark, Niere nach intravenöser Injektion) zu erreichen, können die hergestellten Komplexe selbst wieder mit Oberflächenmodifikatoren versehen werden. Dies reicht von Lektinen zur verbesserten Aufnahme aus dem GIT bis hin zu Polymeren (Poloxamer 407 für Knochenmarktargeting, Poloxamine für Bluttargeting) und nichtionischen Tensiden (Tween 80, Gehirntargeting) einschließlich Antikörpern.
Die erfindungsgemäßen Komplexe können daher beispielsweise zusätzliche Stoffe enthalten, insbesondere Lektine, Antikörper oder Adhäsionsfaktoren, die die Bindung und die Aufnahme durch die zu transfizierenden Zellen verbessern.
Ferner können die erfindungsgemäßen Komplexe zusätzlich Stoffe, insbesondere Peptide, enthalten, die die Fähigkeit haben, eine Translokation der transfizierten DNA in den Zellkern zu induzieren, wobei diese zusätzlichen Stoffe an den Lipidpartikel oder die DNA gekoppelt sind.
Generell ist die Verwendung der Komplexe vielfältig, beispielsweise u.a. :
a) für den spezifischen oder unspezifischen Transfer genetischer Information in Zellen, b) zur stabilen Lagerung von Polynukleotiden, c) generell zur Therapie in vivo und ex vivo, d) zur lokalen, oralen oder systemischen in vivo Therapie von Krankheiten, e) zur Transfektion im Allgemeinen, f) zur Gentherapie. Beispiele
Beispiel 1:
Herstellung des Komplexes :
Das Lipid Compritol wurde geschmolzen, in Wasser mit 4% einer Tensidmischung aus Tween 80 / Span 85 (Verhältnis 7:3) und 1% EQ1 (N,N-Di (ß-stearoylethyl) -N,N-dimethylammoniumchlorid) durch Rühren bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend die erhaltene Emulsion (Lipidgehalt 4%) bei 85° C hochdruckhomogenisiert (LAB 60 Homogenisator, APV Homogenizer GmbH, Lübeck) . Homogenisation erfolgte im Zirkulationsmodus über 30 Minuten bei 500 bar am Hauptdruckventil. Der PCS-Durchmesser der Lipidpartikel betrug 101 nm, die dazugehörige Polydispersität 0,101, das Zetapotential war +42 mV. Zur Herstellung des Komplexes wurde die Lipidpartikeldispersion mit pCMVß Plasmid in HEPES-Puffer (pH 7,4) gemischt, in der Endmischung betrug die Konzentration an Lipid 600 μg/ml, die an Plasmid 10 μg/ml.
Beispiel 2:
Bestimmung der Struktur des Komplexes :
Die Struktur des Komplexes kann gezielt durch die Art der Herstellung beeinflußt werden, z.B. Lipidpartikelgröße, Verhältnis Lipid: Plasmid, sowie Reihenfolge, Art und Konzentration zugesetzter Elektrolyte. Die Komplex-Produkte aus Beispiel 1 wurde mit Kraftmikroskopie (AFM - Atomic Force Microscopy) untersucht . Die Komplexe wurden an der Oberfläche eines Silicium Wafers adsorbiert und mit AFM im Kontaktmode mit einem Nanoscope lila (Digital Instruments) untersucht. Die Federkonstante des Cantilevers war 34 N/m, die Scan Geschwindigkeit 0,5 Hz mit einer Auflösung von 512 x 512 Pixeln. Die Übersichtsaufnähme (Abb. 1A) zeigt die Komplexe, zusätzlich sind noch einzelne Lipidpartikel in einer Größe von ca. 100 nm zu sehen. Es gibt zwei Arten von Komplexen, den zahlenmäßig am häufigsten vorkommenden Komplextyp I mit mehr rundlicher Form in einer Größe von ca. 300 - 800 nm sowie Komplextyp II mit einer Größe von > 1 μm. Die höher auflösenden Aufnahmen (Abb. 1B und IC) zeigen, daß die Komplexe aus Untereinheiten bestehen, die fusioniert haben, Abb. IC zeigt den Vergleich von ursprünglichem, einzelnem Lipidpartikel zum hergestellten Komplex. Abb ID zeigt eine Momentaufnahme aus dem Bildungsprozeß des Komplexes. Freie DNA-Stränge, DNA-Stränge bereits besetzt mit Lipidpartikeln und freie SLN sind im Prozeß zur Fusionierung zu einem großen Komplex (Aggregat in linker unterer Hälfte) .
Beispiel 3:
Bestimmung der Bindung der Komplexe für DNA durch Gelelektrophorese (EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay) :
Transfektionskomplexe wurden durch Mischen von Lipidpartikeln und pCMVß Plasmid in 200 μl HEPES-Puffer (pH 7,4) bei einer Plasmid- konzentration von 20 μg/ml analog Beispiel 1 hergestellt.
Verschiedene Verhältnisse von Lipidpartikeln : pCMVß DNA (von 200 bis 5) wurden gemischt und mit diesen Mischungen eindimensionale Gelelektrophorese auf Agarosegel durchgeführt (2 Stunden bei 5V/cm) . Das erhaltene Gel wurde mit einem UV Transilluminator und dem Geldoc2000 Gel Dokumentationssystem untersucht (Biorad, München, Deutschland) , Integration der Bänder und Hintergrundkorrektur erfolgte mit der Molecular Analyst Version 1.1 Software (Bioread) . Bindung der DNA in einen Komplex führt zu einer Änderung (shift) in der Wanderung im Gel hin zu höheren Molekulargewichten bzw. DNA ist so immobilisiert, daß sie an der Auftragstelle (well) im Gel verbleibt. Oberhalb eines Lipidpartikel- Verhältnisses von 50, 100% der DNA war zu höheren Molekulargewichten verschoben bzw. komplett immobilisiert (Abb. 2) Beispiel 4 :
Bestimmung der Bindungseffizienz des Komplexes für DNA über die Zugänglichkeit noch freier DNA für Ethidiumbromid (EB) :
Ansteigende Verhältnisse von Lipidpartikeln zu pCMVß DNA (von 10:90 zu 90:10) wurden gemischt, um die erfindungsgemäßen Komplexe herzustellen. DNA wurde in 50mM Hepes Puffer (pH 7,4) auf eine Konzentration von lOμg/ml verdünnt, dann wurde mit unterschiedlichen Mengen Partikeldispersion gemischt und auf 2 ml aufgefüllt. Nach 3 Minuten Inkubation zur Komplexbildung wurde 1 ml EB-Lösung (800ng/ml) zur Hälfte der Probe gegeben, 1 ml Wasser zur anderen Hälfte (Hintergrundmessung) und die Fluoreszenz bei λ=366nm (Exsikkation) und λ=590nm (Emmission) in einem F-2000 Fluoreszenzspektrophotometer gemessen.
Freie (zugängliche) DNA interkaliert mit EB, das Fluoreszenz- signal von interkalierten EB wird zur Quantifizierung genutzt, d.h. je geringer das Signal um so mehr ist EB ausgeschlossen und DNA gebunden (Abb. 3) .
Beispiel 5:
Transfektionseffizienz :
Die Transfektionseffizienz wurde an African Green Monkey Kidney Fibroblast-like Cos-1 Zellen untersucht. Komplexe wurden durch Mischen hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, die Lipid- partikelkonzentrationen variierten, die Endkonzentration an Plasmid in der Mischung betrug 20 μg/ml. Die Komplexe wurden mit Puffer oder doppeltkonzentriertem Zellkulturmedium (Dulbecco^s modified eagle s - DME) 1:1 verdünnt, und die Monolayer der Cos-1 Zellen im Well der Mikrotiterplatten mit 100 μl dieser Mischung für 4 Stunden bei 37° C inkubiert. Die Zellen wurden mit Puffer gewaschen, und für weitere 48 Stunden in DME unter Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert. Das pCMVß Plasmid bewirkt eine ß-Galactosidase Expression. Die Transfektionseffizienz wurde daher anschließend über die Aktivität der ß-Galactosidase bestimmt unter Verwendung des Luminescence Galacto-Star assay System (PE Biosystems, CCC) . Die Zellen wurde mit Puffer gewaschen, lysiert und mit 100 μl Reaktionslösung über 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert um maximale LumineszenzSignale zu erreichen. Die Bestimmung der Lumineszenz erfolgte mit einem Wallac beta (PE Biosystems) über eine Integrationszeit von einer Sekunde. Gereinigte rekombinante ß-Galactosidase wurde als Standard eingesetzt. Die Transfektionseffizienz war maximal bei einem Verhältnis von ca. 40-60 (Abb. 4) .
Beispiel 6:
Transfektionseffizienz von Komplexen mit zusätzlichem Chloroquin (CQ) :
Die Herstellung und Testung erfolgte wie in Beispiel 5 beschrieben, zusätzlich enthielt das Komplexsystem 100 μM Chloroquin. Das Komplexsystem aus Lipidpartikeln, Plasmid und Chloroquin hat eine weit höhere Transfektionseffizienz, maximale Transfektion tritt bereits beim kleinsten Gewichtsverhältnis von 10 auf (Abb. 4) .
Beispiel 7:
Bestimmung der Cytotoxizität (Membranschädigung) von Trans- fektionsagentien:
Zur Bestimmung der Membranschädigung wurden die Cos-1 Zellen mit ansteigenden Konzentrationen des Transfektionsagens 4 Stunden inkubiert und anschließend nach Waschen mit Puffer direkt mit dem LDH-Assay (LactatDehydrogenase) untersucht (Boehringer Mannheim, Mannheim Germany) . Mit zunehmender Membranschädigung nimmt die LDH-Freisetzung zu. Untersucht wurden die Transfektionsagentien Lipidpartikel aus Beispiel 1 im Vergleich zu dem konventionellen Agens Polyethylenimin (pEI) (Molekulargewicht 60 kDa) sowie zu Poly-L-Lysin. Die ED50 im LDH-Assay war 3000 μg/ml bei den Lipidpartikeln, jedoch 20 μg/ml bei pEI (d.h. pEI hat ca. 150 fach höhere Membrantoxizität) und 10 μg/ml bei Poly-L-Lysin. Beispiel 8 :
Viabilitätstest mit Transfektionsagentien:
Die Cos-1 Zellen wurden mit ansteigenden Konzentrationen des Transfektionsagens 4 Stunden inkubiert, gewaschen und - im Gegensatz zu Beispiel 7 - nicht direkt untersucht sondern nach dem Waschen mit Puffer weitere 48 Stunden in DME Medium unter Zusatz von 10% FCS kultiviert. Zur Bestimmung der Zellviabilität wurde das WST-1 Assay eingesetzt (Boehringer Mannheim, Mannheim Germany) , eine verbesserte Form des MTT-Tests . Bestimmt wurde die Dosis, die zum Absterben von 50% der Zellen führt (LD50) .
Untersucht wurden die Transfektionsagentien Lipidpartikel aus Beispiel 1 im Vergleich zu dem konventionellen Agens Polyethylenimin (pEI) sowie zu Poly-L-Lysin als Standard. Die LD50 war 600 μg/ml bei den Lipidpartikeln, jedoch 20 μg/ml bei pEI und 10 μg/ml bei Poly-L-Lysin.
Beispiel 9:
Membranschädigung und Viabilität:
Lipidpartikel wurden wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch aus 4% festem Paraffin als Lipid. Die Mebranschädigung wurde analog Beispiel 7 bestimmt: ED50 > 5000 μg/ml (pEI 20 μg/ml), die Viabilität analog Beispiel 8 bestimmt: LD50 700 μg/ml (pEI 20 μg/ml) .
Beispiel 10:
Komplexierungsvermδgen von Lipidpartikeln:
Es wurden Lipidpartikel analog Beispiel 1 hergestellt, als Lipid wurde das Behensäure-Glyceridgemisch Compritol eingesetzt (Firma Gattefosse, Frankreich) , als zusätzliches kationisches Tensid 1% Cetylpyridiniumchlorid (CPC) . Der PCS-Durchmesser betrug 105 nm, der Polydispersitätsindex 0,112 und das Zetapotential +40 mV (d.h. identische physikalische Kenndaten zu den Lipidpartikeln aus Beispiel 1) . Einfache Mischung dieser Lipidpartikel mit HEPES-Puffer ohne Komplex-fördernden Elektrolytzusatz führte zu keiner Komplexbildung, im EMSA wurde keine "mobility shift" detektiert .
Beispiel 11:
Physikalische Stabilität der zur Herstellung von Komplexen benutzten Lipidpartikel :
Die in Beispiel 1 hergestellten Partikel wurden durch Autoklavieren bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert. Der PCS-Durchmesser vor der Sterilisation betrug 103 nm, der Polydispersitatsindex 0,110, die Werte nach der Sterilisation 101 nm und 0,101.

Claims

Patentansprüche
1. Komplexe zur Transfektion dadurch gekennzeichnet, daß sie a) zu transfizierendes Material und b) Lipidpartikel, die aus bei Raumtemperatur festen Lipiden oder Lipidmischungen aus bei Raumtemperatur festen Lipiden mit bei Raumtemperatur halbfesten oder flüssigen Lipiden bestehen, umfassen, wobei die Lipidpartikel an ihrer Oberfläche Modifizierungsmittel aufweisen.
2. Komplexe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu transfizierende Material Polynukleotide, insbesondere DNA, und/oder Antisensenukleotide umfaßt.
3. Komplexe zur Transfektion nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Elektrolyt als Bestandteil umfassen oder zusätzlich Elektrolyt zu ihrer Herstellung verwendet worden ist, wobei anschließend ungebundener Elektrolyt aus der Komplex-Suspension wieder entfernt worden ist.
4. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß die zur Herstellung des Komplexes eingesetzten Lipidpartikel einen mittleren Durchmesser von 10 nm bis 1000 nm haben, vorzugsweise 10 nm bis 500 nm, und insbesondere 10 nm bis 200 nm.
5. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß die zur Herstellung des Komplexes eingesetzten Lipidpartikel einen mittleren Durchmesser von lμm bis 20 μm, vorzugsweise einen Durchmesser von lμm bis 10 μm, insbesondere von lμm bis 5 μm haben.
6. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Größe < 1000 nm haben, vorzugsweise 100 bis 800 nm, und insbesondere 300 nm bis 800 nm.
7. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Größe > 1 μm bis 30 μm haben, vorzugsweise > 1 μm bis 10 μm, insbesondere > 1 μm bis 5 μm.
8. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Zetapotential der zur Komplexierung eingesetzten Lipidpartikel positiv ist, vorzugsweise > 0 mV bis +100 mV, insbesondere +20 mV bis 60 mV.
9. Komplexe nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zu ihrer Herstellung Elektrolyte verwendet werden, vorzugsweise 1:1 Elektrolyte, insbesondere NaCl und KCL, bevorzugt in isotonischer Konzentration oder geringer konzentriert.
10. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel ungeladen oder nur geringfügig geladen sind, wobei das Zetapotential im Bereich von -20 mV bis +20 mV liegt.
11. Komplexe nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß zu ihrer Herstellung Elektrolyte verwendet werden, vorzugsweise 1:2 Elektrolyte, insbesondere CaCl2, oder 2:1 Elektrolyte, bevorzugt in isotonischer Konzentration.
12. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, daß das Zetapotential der zur Komplexierung eingesetzten Lipidpartikel negativ ist, vorzugsweise < 0 mV bis -100 mV, insbesondere -20 mV bis -60 mV.
13. Komplexe nach Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, daß zu ihrer Herstellung Elektrolyte verwendet werden, Vorzugs- weise 1:3 Elektrolyte, insbesondere A1C13, oder 3:1 Elektrolyte, bevorzugt in isotonischer Konzentration.
14. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die oberflächenmodifizierenden Substanzen an der Oberfläche der Lipidpartikel Tenside oder Polymere sind.
15. Komplexe nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die
Tenside ionische Tenside sind, insbesondere Natriumlauryl- sulfat, nichtionische Tenside sind, insbesondere aus den
® ® Serien von Tween und Span oder Zuckerester) , kationische
Tenside sind, insbesondere Cetylpyridiniumchlorid, DOTMA
(N- [1- (2, 3-dioleyloxy)propyl] -N, N, N-trimethylammonium- chlorid) , DDAB (Didodecyldimethylammoniumbromid) , DOSPA
(2 , 3-dioleyl-oxy-N- [2 (spermidincarboxamid) ethyl] -N, N- dimethyl-1-propyl-ammoniumtrifluoroacetat) , DC-Chol (3ß
- [N- (N' ,N' -dimethyl-aminoethan) carbamoyl] -cholesterol) ,
Esterquats (Esterverbindungen, die mindestens ein quartäres
Stickstoffatom enthalten) sind, insbesondere EQ1, DDA
(Dimethyldioctadecylammoniumbromid) , oder amphotere Tenside sind, insbesondere Lecithine, Phospholipide) .
16. Komplexe nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die
Polymere Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol oder Poly-
® mere ausgewählt aus den Serien der Poloxamere oder Polox-
® amine sind.
17. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Aggregaten bestehen, wobei die Aggregatstruktur Stränge von Transfektionsmaterial umfaßt, das Lipidpartikel miteinander verknüpft.
18. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aggregate aus zusammengelagerten Untereinheiten bestehen.
19. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß lediglich ein oder zwei Lipidpartikel einen Komplex mit dem zu transferierendem Material bilden, wobei die Lipidpartikel vorzugsweise eine Größe > 500 nm, insbesondere > 1 μm haben.
20. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie Zusätze von Arzneistoffen enthalten, insbesondere lysosomotrope oder endosomolytische Substanzen, die die Transfektionseffizienz steigern, insbesondere Chloroquin, Monensin, oder schwache Basen, bevorzugt basische StickstoffVerbindungen.
21. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie Zusätze von membranschädigenden Substanzen, insbesondere Poly-L-Lysin, oder mit Membranen wechselwirkenden Substanzen, insbesondere Dimethylsulfoxid, Azone oder membrandestabilisierende Peptide, insbesondere Aminosäuresequenzen aus dem Influenzavirus Haemagglutinin oder dem Bienengift Mellitin enthalten, die die Trans- fektionseffizienz steigern.
22. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf der Komplexoberfläche Oberflächenmodifikatoren enthalten, die die Verteilung im Organismus beeinflussen, insbesondere nach parenteraler Injektion (bevorzugt intravenöser Injektion) , oraler oder pulmonaler Applikation.
23. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzliche Stoffe enthalten, insbesondere Lektine, Antikörper oder Adhäsionsfaktoren, die die Bindung und die Aufnahme durch die zu transfizie- renden Zellen verbessern.
24. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Stoffe, insbesondere Peptide, enthalten, die die Fähigkeit haben, eine Trans- lokation der transfizierten DNA in den Zellkern zu induzieren, wobei diese zusätzlichen Stoffe an den Lipidpartikel oder die DNA gekoppelt sind.
25. Verfahren zur Herstellung von den Komplexen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst die Lipidpartikel mit einem an der Oberfläche befindlichem Oberflächenmodifizierungsmittel, insbesondere einem Tensid oder Polymer oder einer Mischung aus Tensid und Polymer hergestellt werden, und diese oberflächenmodifizierten Partikel dann mit dem Transfektionsmaterial gemischt und inkubiert werden.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischung aus Lipidpartikeln und Transfektionsmaterial Elektrolyte zugesetzt werden, die die Ausbildung des Komplexes fördern oder den bereits gebildeten Komplex verdichten, so daß die Komplexgröße reduziert wird, wobei die Elektrolyte nach beendeter Komplexbildung in der Komplexsuspension verbleiben oder alternativ entfernt werden.
27. Verwendung der Komplexe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 oder hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 für den spezifischen oder unspezifischen Transfer genetischer Information in Zellen sowie zur stabilen Lagerung von Polynukleotiden.
28. Verwendung der Komplexe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 oder hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 zur lokalen, oralen oder systemischen Therapie von Krankheiten in vivo und ex vivo.
29. Verwendung der Komplexe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 oder hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 zur Transfektion und zur Gentherapie.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000067728A2 (de) * 1999-05-07 2000-11-16 Pharmasol Gmbh Lipidpartikel auf der basis von mischungen von flüssigen und festen lipiden und verfahren zu ihrer herstellung

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000067728A2 (de) * 1999-05-07 2000-11-16 Pharmasol Gmbh Lipidpartikel auf der basis von mischungen von flüssigen und festen lipiden und verfahren zu ihrer herstellung

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOK, KENNETH W. C. ET AL: "Stabilized plasmid- lipid particles: factors influencing plasmid entrapment and transfection properties" BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (1999), 1419(2), 137-150 , XP000960971 *
OLBRICH, CARSTEN ET AL: "Cationic solid-lipid nanoparticles can efficiently bind and transfect plasmid DNA" JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE (2001), 77(3), 345-355 , XP004328586 *
ZHANG Y P ET AL: "Stabilized plasmid- lipid particles for regional gene therapy: formulation and transfection properties." GENE THERAPY, (1999 AUG) 6 (8) 1438-47. , XP008002816 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108779074A (zh) * 2016-03-01 2018-11-09 分子传递有限公司 植物病毒移动蛋白和其使用方法

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