TWI426922B - 核酸複合物以及核酸輸送組成物 - Google Patents

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Description

核酸複合物以及核酸輸送組成物 發明領域
本發明係關於一種可持續生存於細胞中且具有低毒性及高安全性之核酸複合物；及一種用於核酸輸送的組成物。
 發明背景
隨著近來生物工藝學的發展，已在細胞中發現多種具有生理活性功能之核酸。例如，已知siRNA(小干擾RNA)可在細胞中造成標的基因之mRNA降解及干擾該標的基因的表現性(RNA干擾)。由於此RNA干擾而在標的基因表現上之抑制功能可對減輕或治療由特定基因或基因簇之異常表現所造成的疾病症狀有用，且已預計可發展出使用siRNA的治療藥物。但是，因為核酸為具有負電荷之可溶於水的大分子，它們具有極低的細胞內基因輸送效率而導致在包括siRNA療法之基因療法下具有效能差的治療效應。
已知使用載體(媒介體)可有效率地將基因輸送進入細胞中。該媒介體包括病毒媒介體及非病毒媒介體。病毒媒介體具有高核酸引進效率；但是，其有多種未知的安全性觀點，包括致病性、致免疫性及細胞毒害性。因此，臨床應用上想要使用非病毒媒介體。
非病毒媒介體之實施例包括已經可商業購得的里剖費克塔胺(Lipofectamine)TM 2000。再者，已報導出具有特定結構的陽離子脂質(參見專利文件1)及包含兩親化合物與聚陽離子的組成物(參見專利文件2)。藉由下列方式來進行使用非病毒媒介體的細胞內核酸輸送：首先混合欲輸送的核酸與非病毒媒介體以形成一複合物，然後將該複合物帶至與標的細胞接觸。當該非病毒媒介體可形成脂粒時，該媒介體與包圍在該脂粒中之核酸將併入細胞中，因此進行細胞內的核酸輸送。
但是，核酸(諸如siRNA)具有差的穩定性及強電荷之特定特徵。因此，當核酸與非病毒媒介體混合時，其會有問題地減低穩定性而抑制核酸連續引進細胞中。雖然藉由形成siRNA與陽離子聚合物之複合物將核酸捕捉在脂粒中的實施例已知(參見非專利文件1)，但考慮到陽離子聚合物之細胞毒害性，其事實上無法使用。再者，甚至當可使用已知的非病毒媒介體與核酸來形成穩定的複合物時，該複合物可具有低的細胞內輸送能力或可快速地輸送進入細胞中。因此，此已知的非病毒媒介體無法將核酸持續維持在細胞中，而無法保持由該核酸所獲得之想要的效應。
按照先述技藝，已經想要發展出用來將核酸(例如，siRNA)有效率地輸送進入細胞中且以低毒性及高安全性持續維持該核酸的技術。
專利文件1：日本未審查的專利公告案號2002-529439
專利文件2：日本未審查的專利公告案號2005-508394
非專利文件1：小暮健太郎(Kentaro Kogure)等人，使用新穎的脂質薄膜水合方法之非病毒多功能性包膜型式奈米裝置的發展，J. Control. Release，98(2004)311-323
本發明之目標為解決先述技藝的問題。特別是，本發明之目標為提供一種具有低毒性及高安全性的核酸複合物，其可在細胞中持續維持核酸(諸如，siRNA或其類似物)；及一種核酸輸送組成物，其可有效率地將該核酸複合物輸送進入細胞中。本發明的另一個目標為提供一種包含該核酸輸送組成物之醫藥組合物，及一種藉由將該核酸輸送組成物帶至與細胞接觸將核酸輸送進入細胞中之方法。
本發明家進行大量研究以解決上述問題，並已發現一種具有低毒性、高安全性且可在細胞中持續維持核酸的核酸複合物，其可使用欲引進細胞的核酸與高分枝環狀糊精來形成複合物而獲得。本發明家進一步發現可藉由使用一種包含下列物質的載體作為用來將核酸複合物引進細胞中之核酸輸送載體來進一步改良安全性、核酸之細胞內輸送效率及細胞內持續性：(A)二醯基磷脂醯膽鹼、(B)膽固醇及/或其衍生物、及(C)脂肪族一級胺。本發明根據這些研究結果來進行進一步研究而達成。
本發明提供下列項目：
項目1一種包含核酸與高分枝環狀糊精的核酸複合物。
項目2如項目1的核酸複合物，其中該高分枝環狀糊精的量為每重量份之核酸含1至4000重量份。
項目3如項目1或2之核酸複合物，其中該核酸為siRNA。
項目4如項目1至3之任何一項的核酸複合物，其中該高分枝環狀糊精為一種具有聚合程度50至5000之葡聚糖，其具有一從α-1,4-葡萄糖苷鍵與至少一個α-1,6葡萄糖苷鍵所形成的內部分枝環狀結構部分，及一鍵結至該內部分枝環狀結構部分的外部分枝結構部分。
項目5如項目1至4之任何一項的核酸複合物，其為一種藉由在水溶液中混合核酸與高分枝環狀糊精所獲得之團聚物。
項目6一種核酸輸送組成物，其包含如項目1至5之任何一項的核酸複合物及一種核酸輸送載體。
項目7如項目6之核酸輸送組成物，其中該核酸輸送載體為一種包含下列物質的組成物：(A)二醯基磷脂醯膽鹼、(B)至少一種選自於膽固醇及其衍生物之成員、及(C)脂肪族一級胺。
項目8如項目7之核酸輸送組成物，其中在該核酸輸送載體中之組分(A)為該醯基部分具有4至23個碳原子的二醯基磷脂醯膽鹼。
項目9如項目1之核酸輸送組成物，其中在該核酸輸送載體中的組分(B)為膽固醇。
項目10如項目7之核酸輸送組成物，其中在該核酸輸送載體中的組分(C)為具有10至20個碳原子的烷基胺。
項目11如項目7之核酸輸送組成物，其中該組分(A)：(B)：(C)的莫耳比率為5-9：1-5：1。
項目12如項目7之核酸輸送組成物，其中該核酸輸送載體為一種脂粒製劑，其中該脂粒薄膜從組分(A)至(C)形成。
項目13一種醫藥組合物，其包含如項目6至12之任何一項的核酸輸送組成物。
項目14如項目13之醫藥組合物，其中該核酸為siRNA。
項目15一種如項目6至12之任何一項的核酸輸送組成物之用途，其使用來製造一種用來將核酸輸送進入細胞中的藥物。
項目16如項目15之用途，其中該核酸為siRNA。
項目17一種用來將核酸輸送進入細胞中之方法，該方法包括將如項目6至12之任何一項的核酸輸送組成物帶至與細胞接觸之步驟。
項目18如項目17之方法，其中該核酸為siRNA。
本發明之核酸複合物藉由使用高分枝環狀糊精與核酸形成一複合物而獲得，因此使得該核酸複合物可具有高度安全性且能夠在細胞中穩定地維持該核酸一段長時間，以便以該核酸為主的有用效應可持續存在。再者，本發明之核酸複合物可容易地形成一種含有核酸輸送載體的複合物，甚至可容易地以脂粒形式囊封在核酸輸送載體中。因此，本發明之複合物就容易調配成核酸輸送組成物來說亦優良。再者，本發明的核酸輸送組成物可將該核酸複合物引進細胞中。
對將本發明之核酸複合物輸送進入細胞中來說，使用包含(A)二醯基磷脂醯膽鹼、(B)膽固醇及/或其衍生物及(C)脂肪族一級胺的載體作為用於細胞內輸送之載體可增加該核酸複合物的細胞內輸送效率，並可進一步改良此細胞內輸送的持續性及安全性。
如上所述，本發明之核酸複合物及核酸輸送組成物可有效、持續地顯示出以該核酸為主的有用效應且具有高安全性；因此，該複合物及組成物作為基因療法的藥物特別有用。因此，根據本發明之醫藥組合物或將核酸輸送進入細胞中的方法可更有效地將核酸輸送進入細胞中。
 較佳實施例之詳細說明 用來進行本發明的最好模式
本發明詳細描述在下列。
(1)核酸複合物
本發明之核酸複合物包含核酸及高分枝環狀糊精。
使用於本發明之核酸複合物的核酸不限型式或結構，只要其需要輸送進入細胞中。此核酸的特定實施例包括siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核糖酶、反義寡核苷酸、誘騙寡核苷酸、質體DNA、胜肽核酸、形成三股螺旋的寡核苷酸類(TFOs)、適體(aptamers)、基因等等；在此當中，siRNA較佳。siRNA具有於迄今為止已知的非病毒媒介體存在下低穩定性之缺點，但是當siRNA形成本發明之核酸複合物時，其具有連續輸送進入細胞中的能力和具有優良的穩定性。在本發明之核酸複合物中所使用的核酸可來自人類、動物、植物、細菌、病毒或其類似來源，或可化學合成。此核酸可為單股、雙股或三股且不由分子量所限制。再者，在本發明中，可使用以化學物質、酵素或胜肽改質的核酸。再者，在本發明中，該核酸可單獨或二或更多種組合著使用。
在本發明之核酸複合物中所使用的高分枝環狀糊精可藉由讓分枝酵素作用在一具有α-1,4-葡萄糖苷鍵及至少一個α-1,6-葡萄糖苷鍵的醣類(諸如，支鏈澱粉)上來製造，且其為一種具有聚合程度50至5000、具有內部分枝環狀結構部分與外部分枝結構部分的聚葡糖。該內部分枝環狀結構部分為一從α-1,4-葡萄糖苷鍵結與至少一個α-1,6-葡萄糖苷鍵所形成的環狀結構部分；及該外部分枝結構部分為一鍵結至該內部分枝環狀結構部分之非環狀結構部分。該外部分枝結構部分經由至少一個α-1,6-葡萄糖苷鍵鍵結至該內部分枝環狀結構部分。該高分枝環狀糊精的較佳形式包括上述提及該內部分枝環狀結構部分具有聚合程度10至100之聚葡糖、上述提及該外部分枝結構部分具有聚合程度40或更多之聚葡糖及上述提及該外部分枝結構部分的單位鏈具有平均聚合程度10至20之聚葡糖。該高分枝環狀糊精可例如闡明如在第1圖中，其中該內部分枝環狀結構部分由(i)指出及該外部分枝結構部分由(ii)指出。
該聚合程度可藉由凝膠層析法使用微分折射計，從聚合程度已知的材料之沖提位置來測量。在此測量中，微分折射計之輸出與聚葡糖濃度呈比例，及低角度雷射光散射光度計之輸出與聚合程度和聚葡糖濃度的乘積呈比例。因 此，該聚葡糖的聚合程度可藉由測量二種偵測器(即，微分折射計與低角度雷射光散射光度計)之輸出比率來測量。特定條件描述在US 6248566B1(日本專利案號3107358)中。
因此，該高分枝環狀糊精及其製造方法描述在US 6248566B1(日本專利案號3107358)中，及該高分枝環狀糊精以江崎固力果有限公司(Ezaki Glico Co.,Ltd.)之註冊商標“分子簇糊精(Cluster Dextrin)”出售。
在本發明之核酸複合物中，該高分枝環狀糊精對該核酸的比率無限制，但是通常為每重量份的核酸含1至4000重量份之高分枝環狀糊精，較佳為10至1000重量份及更佳為100至400重量份。就莫耳比率而論，上述比率例如為每莫耳的核酸含0.1至1000莫耳之高分枝環狀糊精，較佳為1至100莫耳及更佳為10至20莫耳。滿足此比率可對該核酸輸送載體之核酸細胞內輸送提供更明顯的連續性及其安全性。
本發明之核酸複合物的平均顆粒直徑通常為6至60奈米，較佳為8至30奈米及更佳為10至20奈米。使用動態雷射光散射方法，以體積平均顆粒直徑來測量該核酸複合物之平均顆粒直徑。
本發明之核酸複合物為一種藉由團聚該核酸與該高分枝環狀糊精所形成的複合物。本發明之核酸複合物藉由在一可穩定地分散該二種化合物之溶液中混合該核酸與該高分枝環狀糊精來製造。可穩定地分散該核酸與該高分枝環狀糊精之溶液的特定實施例包括緩衝劑，諸如Tris及其類似物。該緩衝劑可包含螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)及其類似物。用來混合該核酸與該高分枝環狀糊精的條件可為在室溫下，於上述提及溶液中，混合例如約0.1μM至約100μM(較佳約1μM至約10μM)的核酸與約1μM至約1000μM(較佳約10μM至約100μM)的高分枝環狀糊精約1至約100分鐘(較佳約5至約10分鐘)。從而製造的本發明之核酸複合物呈現出如為在該溶液中的分散液。該分散液可如其所是般或在稀釋或濃縮(若需要的話)後與核酸輸送載體混合。
(2)核酸輸送組成物
該核酸複合物藉由與一核酸輸送載體混合來併入該核酸輸送載體中，因此該核酸能夠被輸送進入細胞中。也就是說，本發明亦提供一種包含該核酸複合物與一核酸輸送載體的核酸輸送組成物。
該核酸輸送載體為一種非病毒媒介體，其使用作為核酸載體來將核酸輸送(引進)進入細胞中。該核酸輸送組成物為一種使用來將核酸帶至與欲輸送核酸的細胞接觸之組成物，以將包含在該組成物中之核酸引進該細胞中。
核酸輸送載體之調配物
使用在本發明之核酸輸送組成物中的核酸輸送載體無限制，只要其能將核酸併入細胞中。可使用的核酸輸送載體之實施例包括已知的載體，諸如里剖費克塔胺TM 2000及其類似物。
從進一步改良包含在該核酸複合物中之核酸的細胞內持續性及進一步改良該細胞內輸送之效率及安全性的觀點來看，使用例如一包含(A)二醯基磷脂醯膽鹼、(B)膽固醇及/或其衍生物及(C)脂肪族一級胺(於此之後指為“載體1”)的載體較佳。
該在載體1中所使用的二醯基磷脂醯膽鹼(於此之後有時指為“組分(A)”)無限制，只要其藥理學可接受且可例如為該醯基部分具有4至23個碳原子之二醯基磷脂醯膽鹼。構成該二醯基磷脂醯膽鹼的二個醯基之碳數可相同或不同。
該二醯基磷脂醯膽鹼的特定實施例包括二月桂醯基磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼、二亞麻醯基磷脂醯膽鹼、肉豆蔻醯基棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、肉豆蔻醯基硬脂醯基磷脂醯膽鹼、棕櫚醯基硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二丁醯基磷脂醯膽鹼、二己醯基磷脂醯膽鹼、二庚醯基磷脂醯膽鹼、二癸醯基磷脂醯膽鹼、二酞醯基磷脂醯膽鹼、雙十二烷基磷脂醯膽鹼、雙二十烷醯基磷脂醯膽鹼、雙二十一烷醯基磷脂醯膽鹼、雙二十二碳烯醯基磷脂醯膽鹼、二花生四烯醯基磷脂醯膽鹼、雙(二十三烷二醯基)磷脂醯膽鹼等等。在這些當中，較佳的實施例包括該醯基部分具有12至18個碳原子之二醯基磷脂醯膽鹼，更佳的實施例包括二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、肉豆蔻醯基棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、肉豆蔻醯基硬脂醯基磷脂醯膽鹼、棕櫚醯基硬脂醯基磷脂醯膽鹼、及如該醯基部分具有13至17個碳原子之二醯基磷脂醯膽鹼；特別佳的實施例包括二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼；及最佳的實施例包括二硬脂醯基磷脂醯膽鹼。該等二醯基磷脂醯膽鹼可單獨或以二或更多種組合著使用。
在載體1中所使用的膽固醇及/或其衍生物(於此之後有時指為“組分(B)”)無限制，只要其藥理學可接受。該膽固醇之衍生物為具有膽固醇骨架的陽離子脂質，及特定的實施例包括3β-[N-(N’,N’-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基]膽固醇(DC-Chol)、碘化3β-[N’,N’,N’-三甲基胺基乙烷]膽固醇(TC-Chol)、雙(胍鹽)-三(2-胺基乙基)胺-膽固醇(BGTC)、N-膽脂醇基氧基羰基-3,7-二吖壬烷-1,9-二胺、β-丙胺酸-二乙醇胺-膽固醇、N4 -精四胺胺甲酸膽脂醇酯(GL-67)、N[N4 -3-胺基丙基精三胺]胺甲酸膽脂醇酯(GL-78)、N4 -精四胺膽脂醇基甲醯胺(GL-90)、N1,N8-雙(精胺酸甲醯胺)-N4 -精三胺胺甲酸膽脂醇酯(GL-95)及N-[N1 ,N4 ,N8 -三(3-胺基丙基)精三胺]胺甲酸膽脂醇酯(GL-96)。組分(B)的較佳實施例包括膽固醇。在載體1中，該膽固醇及其衍生物可單獨或以二或更多種組合著使用作為組分(B)。
在載體1中所使用的脂肪族一級胺(於此之後有時指為“組分(C)”)無限制，只要其藥理學可接受且可例如為烷基部分具有10至20個碳原子之烷基胺。
該脂肪族一級胺的特定實施例包括月桂胺、肉豆蔻胺、棕櫚胺、硬脂胺、油胺、癸醯胺、酞醯胺等等。在這些當中，烷基部分具有12至18個碳原子之烷基胺較佳；硬脂胺、油胺及棕櫚醯胺更佳；及硬脂胺特別佳。這些脂肪族一級胺可單獨或以二或更多種組合著使用。
載體1包含上述描述的組分(A)至(C)之組合。為了進一步改良核酸的細胞內輸送效率及進一步減低毒性，下列組合較佳：(A)該醯基部分具有4至23個碳原子之二醯基磷脂醯膽鹼、(B)膽固醇及/或其衍生物及(C)C10-20 烷基胺；及更佳為(A)二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼及/或二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、(B)膽固醇及(C)硬脂胺。
在載體1中，組分(A)對(C)的比率無限制及可例如為組分(A)：(B)：(C)之莫耳比率為5-9：1-5：1，較佳為6-9：1-4：1及更佳為7-8：2-3：1。滿足此比率可以更經改良的效率及較低的毒性來達成細胞內核酸輸送。
在載體1的總量中之組分(A)至(C)的總量為例如1至100重量%，較佳為20至90重量%及更佳為30至70重量%。
除了組分(A)至(C)外，載體1可包含其它陽離子脂質。可使用的陽離子脂質之特定實施例包括角鯊胺(squalamine)、3a,7a,12a-三(3-胺基丙氧基)-5β-膽烷-24-(N,N-雙(3-胺基丙基)胺)、3a,7a,12a-三(3-胺基丙氧基)-5β-膽烷-24-(N-(N-(3-胺基丙基))-3-胺基丙基)胺、3a,7a,12a-三(3-疊氮丙氧基)-5β-膽烷-24-(N,N-雙(2-氰乙基)胺))、3a,7a,12a-三(3-疊氮丙氧基)-5β-膽烷-24-(N-(苄氧基羰基)-N-(3-羥丙基)胺)、及如鍵結有類固醇之陽離子脂質；傘狀精四胺軛合物及如鍵結有膽酸的陽離子脂質；鍵結有甾醇醣苷的陽離子脂質；鍵結有類固醇皂素的陽離子脂質；溴化二甲基雙十八烷基銨鹽(DDAB)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-三甲基銨丙烷、1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、丙烷甲基硫酸1,2-二油醯基-3-三甲基銨、1,2-二棕櫚醯基-3-三甲基銨丙烷、1,2-二硬脂醯基-3-三甲基銨丙烷、N-(1-(2,3-雙(油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨鹽酸(DOTMA)、溴化二肉豆蔻醯氧基丙基二甲基羥基乙基銨鹽(DMRIE)、溴化二油醯氧基丙基二甲基羥基乙基銨(DORIE)、溴化二甲基雙十二烷基銨、N-(a-三甲基銨乙醯基)雙十二烷基-D-麩醯胺酸鹽酸、N-(a-三甲基銨乙醯基)-O,O’-雙-(1H,1H,2H,2H-全氟癸基)-L-麩醯胺酸鹽酸、O,O’-雙十二烷醯基-N-(a-三甲基銨乙醯基)二乙醇胺鹽酸、溴化甲基烯丙基雙十二烷基銨、N-{對-(w-三甲基銨丁氧基)苄醯基}-雙十二烷基-L-麩醯胺酸鹽酸、溴化9-(w-三甲基銨丁基)-3,6-雙(十二烷醯基)咔唑、二甲基雙十八烷基銨鹽酸、N-w-三甲基銨癸醯基-雙十六烷基-D-麩醯胺酸溴、N-{對-(w-三甲基銨己氧基)-苄醯基}-雙十四烷基-L-麩醯胺酸溴、對-(w-三甲基銨癸氧基)-對’-辛氧基偶氮苯溴鹽(MC-1-0810)、對-{w-(b-羥乙基)二甲基-銨基-癸氧基}-對’-辛氧基偶氮苯溴鹽(MC-3-0810)、O,O’,O”-三十二烷醯基-N-(w-三甲基-銨癸醯基]-三(羥甲基)胺基甲烷溴鹽(TC-1-12)、1,2-二月桂基-甘油基-3-乙基磷膽鹼、1,2-二肉豆蔻醯基-甘油基-3-乙基磷膽鹼、1,2-二棕櫚醯基-甘油基-3-乙基磷膽鹼、1,2-二硬脂醯基-甘油基-3-乙基磷膽鹼、1,2-二油醯基-甘油基-3-乙基磷膽鹼、1-棕櫚醯基-2-油醯基-甘油基-3-乙基磷膽鹼，及如四級銨鹽型式陽離子脂質等等。
當載體1包含除了組分(A)至(C)外之陽離子脂質時，該陽離子脂質的比例無限制，只要其不損害本發明之效應且可例如為每總共100重量份的組分(A)至(C)含1至10重量份，較佳為2至8重量份及更佳為4至6重量份。
若需要的話，載體1可進一步包含一油狀基礎物。加入該油狀基礎物，以便使用其能夠控制載體1的核酸引進效率之性質。例如，當加入該油狀基礎物以調整載體1之比重時，此可控制細胞與載體1的接觸因此改良試管內引進效率。再者，例如，當加入具有溫度敏感功能之油狀基礎物時，該核酸載體的核心可在預定溫度條件下瓦解以在細胞表面中引發變動，因此改良核酸引進效率。再者，例如，當加入具有由外部刺激而分裂的能力之油狀基礎物時，該載體1的核心可藉由外部刺激瓦解以在細胞表面中引發變動，因此改良核酸引進效率。
該可加入至載體1的油狀基礎物之實施例包括全氟碳、全氟戊烷、全氟辛基溴、全氟己烷、全氟三丁胺、大豆油、精鍊的大豆油、氫化的大豆油、未皂化的大豆油、鯊烯、蓖麻油、丁香油、三油酸脫水山梨糖醇酯、松節油、紅花油、紅花油脂肪酸、油酸、棕櫚油、油菜籽油、雜醇油、橄欖油、亞麻子油、芝麻油、葉綠素油、巴豆油、佛手柑油油、雪松木油、橙油、茴香油、桉油、玉米胚芽油、薰衣草油、黑角蘭油、檸檬油、棉籽油、椰子油、蛋黃油、玫瑰油、松木油、扁桃仁油、花生油、山茶油、白樟油、甘菊油、肉桂油、薄荷油、酯化的玉米胚芽油、生薑油、羅馬甘菊油、蛇油、綠薄荷油、向日葵油、可可脂、小麥胚芽油、氧化鋅油、硬化的油、氫化的蔬菜油、輕液態石蠟、液態石蠟、中鏈脂肪酸三酸甘油脂、水貂油、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、聚氧乙烯氫化蓖麻油100、聚氧乙烯氫化蓖麻油20、聚氧乙烯氫化蓖麻油40、聚氧乙烯氫化蓖麻油5、聚氧乙烯氫化蒽麻油50、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧乙烯35蓖麻油、操作油等等。在該等油狀基礎物當中，全氟戊烷具有溫度敏感性及具有在29.5℃下沸騰因此變成氣體的性質。再者，全氟己烷、全氟辛基溴及全氟三丁胺具有由外部刺激而分裂的能力，及具有當接受外部刺激(諸如超音波照射)時會在或體1的核心中造成空化現象而瓦解之性質。
當包含該油狀基礎物時，其比例無限制，只要其不損害本發明之效應且可例如為每總共100重量份的組分(A)至(C)含0.1至50重量份，較佳為1至30重量份及更佳為5至20重量份。
若需要的話，載體1可進一步包含膜融合脂質(輔助脂質)。當包含該膜融合脂質時，載體1具有進一步改良的細胞內核酸輸送效率。此可膜融合的脂質之實施例包括二油醯基膦脂醯基乙醇胺、二油醯基磷脂醯膽鹼、反膦脂醯基膦脂醯基乙醇胺、1,2-雙-(10,12-二十三烷二醯基)-磷乙醇胺、1,2-二反油酸醯基磷乙醇胺、1,2-雙十六烷基磷乙醇胺、1,2-二己醯基磷乙醇胺、1,2-二月桂醯基磷乙醇胺、1,2-二亞麻油醯基磷乙醇胺、1,2-二肉豆蔻醯基磷乙醇胺、1,2-二油醯基磷乙醇胺、1,2-二棕櫚油醯基磷乙醇胺、1,2-二棕櫚醯基磷乙醇胺、1,2-二植烷醯基磷乙醇胺、1,2-二硬脂醯基磷乙醇胺、1-棕櫚醯基-2-油醯基磷乙醇胺、1-棕櫚醯基-2-(10,12-二十三烷二醯基)磷乙醇胺、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N-己醯胺、1,2-二棕櫚醯基磷乙醇胺-N-己醯胺、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N,N-二甲基、1,2-二棕櫚醯基磷乙醇胺-N,N-二甲基、1,2-二棕櫚醯基磷乙醇胺-N-十二烷醯基、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N-十二烷醯基、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N-十二烷基胺、1,2-二棕櫚醯基磷乙醇胺-N-十二烷基胺、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N-戊二基、1,2-二棕櫚醯基磷乙醇胺-N-戊二基、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N-乳糖、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N-[4-(對-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-羧酸鹽]、二棕櫚醯基磷乙醇胺-N-[4(對-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-羧酸鹽]、1,2-二棕櫚醯基磷乙醇胺-N-[4(對-馬來醯亞胺基苯基)丁醯胺]、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N-[4(對-馬來醯亞胺基苯基)丁酸鹽]、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N-甲基、二棕櫚醯基磷乙醇胺-N-甲基、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸鹽]、1,2-二棕櫚醯基磷乙醇胺-N-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸鹽]、1,2-二油醯基磷乙醇胺-N-(琥珀醯基)、1,2-二棕櫚醯基磷乙醇胺-N-(琥珀醯基)等等。在該等脂質當中，於載體1中使用二油醯基磷乙醇胺可有利。
當包含此膜融合脂質時，其比例無限制，只要其不損害本發明之效應且可例如為每總共100重量份的組分(A)至(C)含1至500重量份，較佳為10至250重量份及更佳為25至100重量份。
載體1可根據使用形式包含多種添加劑，諸如等張劑、賦形劑、稀釋劑、凝膠劑、穩定劑、緩衝劑、防腐劑等等；及/或水性媒劑，諸如純水、糖水溶液、緩衝溶液、生理鹽液、水性聚合物溶液、無水核糖核酸酶等等。可根據該核酸輸送載體所使用的形式合適地選擇該等添加劑及欲加入的水性媒劑之量。
核酸輸送載體之形式
該核酸輸送載體的形式無限制，只要其可囊封該欲輸送進入細胞中之核酸，但是其呈脂粒形式較佳。例如，當載體1呈脂粒形式時，組分(A)至(C)及選擇性所使用的其它脂質形成一脂粒薄膜。
當該核酸輸送載體呈脂粒形式時，其可為單層小微脂粒(SUV)、單層大微脂粒(LUV)或多層微脂粒(MLV)。可根據欲輸入核酸的細胞型式合適地選擇該核酸輸送載體之顆粒直徑；及對SUV來說，其可例如為約20至約100奈米，對LUV來說為約200至約1000奈米，對MLV來說為約400至約3500奈米。使用動態雷射光散射方法來測量該脂粒的顆粒直徑。
可使用在此項技藝中已知之方法來製造脂粒及調整脂粒的顆粒直徑。例如，在載體1的實例中，該脂粒可藉由薄膜方法、逆相蒸發方法、醚注入方法、界面活性劑方法及加熱方法或其類似方法，使用一包含組分(A)至(C)的油相與一水相(水性媒劑)來形成。該顆粒直徑可藉由擠壓方法、法式加壓方法(French press method)、均化方法或其類似方法來調整。
該核酸輸送組成物之形式、調配物及使用方法
當該核酸輸送載體呈脂粒形式時，在本發明之核酸輸送組成物中的核酸複合物可以囊封在該脂粒的內部水相中之狀態，或藉由離子或疏水鍵鍵結至該脂粒薄膜的內部或外部表面之狀態呈現。當該核酸輸送載體為除了脂粒外的形式時，在本發明之核酸輸送組成物中的核酸複合物透過離子或疏水鍵與該核酸輸送載體之組分形成一複合物。
本發明的核酸輸送組成物藉由下列方式製造：混合該核酸複合物與該核酸輸送載體，及將該混合物配製成想要的形式；或藉由任意順序混合該核酸複合物組分與該核酸輸送載體組成物，及將該混合物配製成想要的形式。
在本發明的核酸輸送組成物中，該核酸複合物對該核酸輸送載體之比率依核酸複合物的型式、核酸輸送載體的型式及欲輸入核酸的細胞型式等等而定。該比率可例如為每總量100重量份的核酸輸送載體含1至100重量份之核酸複合物，較佳為10至100重量份及更佳為20至100重量份。更特別的是，當使用載體1作為該核酸輸送載體時，該比率可例如為每總量100重量份包含在載體1中之組分(A)至(C)含1至100重量份的核酸複合物，較佳為10至100重量份及更佳為20至100重量份。
再者，當使用載體1作為該核酸輸送載體時，包含在載體1中的組分(A)至(C)之總量可例如為10至90重量%，較佳為30至80重量%及更佳為40至60重量%(相對於該核酸輸送組成物的總量)。
本發明之核酸輸送組成物可根據使用形式而包含多種添加劑，諸如等張劑、賦形劑、稀釋劑、凝膠劑、穩定劑、緩衝劑、防腐劑等等；及/或水性媒劑，諸如純水、葡萄糖水溶液、緩衝溶液、生理鹽液等等。可根據所使用的核酸輸送組成物之形式合適地選擇此添加劑及水性媒劑的量。
本發明之核酸輸送組成物自身可使用作為基因療法的藥物(即，作為醫藥組合物)。當本發明之核酸輸送組成物使用作為醫藥組合物時，可選擇藥理學可接受的核酸輸送載體、基礎物、媒劑等等。本發明之醫藥組合物可配製成多種醫藥形式。本發明之醫藥組合物形式的實施例包括液體製劑，諸如溶液(包括糖漿及其類似物)、滴劑、注射劑等等；及固體製劑，諸如錠劑、藥片、粉末、顆粒、膠囊(包括軟膠囊)等等。當本發明之醫藥組合物為液體製劑時，其可藉由冷凍或藉由冷凍乾燥法或其類似方法移除水而保存。該經冷凍乾燥的製劑、乾糖漿等等可於使用那時再溶解在用於注射的蒸餾水、無菌水等等中。當本發明之醫藥組合物為固體製劑時，其可在使用那時再溶解於用於注射的蒸餾水、無菌水等等中。
在本發明中，欲輸入核酸的細胞(即，欲施加本發明之醫藥組合物的細胞)無限制，及可為培養細胞、分離自有機體的細胞(包括確立細胞株)、活體內細胞等等，及可來自人類或非人類動物。本發明之醫藥組合物可應用於試管內或活體內。
在本發明中，核酸可經由將本發明之醫藥組合物帶至與細胞接觸的步驟來輸送進入細胞中。將該醫藥組合物帶至與細胞接觸的方法無限制，只要將合適的量之核酸輸送組成物帶至與欲引進該核酸的細胞接觸。例如，該方法可與迄今已知的基因療法相同，且其亦適用於將帶至接觸的量：該方法及量可合適地選擇。因此，將本發明之醫藥組合物施加至細胞能夠讓核酸的細胞內輸送容易，及維持所輸送的核酸在細胞中穩定及持續。
例如，為了試管內將本發明之醫藥組合物帶至與細胞接觸，可於合適的量之醫藥組合物存在下培養該細胞。為了試管內將本發明的醫藥組合物帶至與培養細胞或分離自有機體之細胞接觸，可於血清存在下進行該接觸。當活體內將本發明之醫藥組合物帶至與細胞接觸時，本發明的醫藥組合物可藉由下列方式帶至與細胞接觸：例如，直接注入組織中；靜脈內、皮下、肌肉內、腹膜間位或眼內注射、或注入消化道、牙齒或其類似位置中；吸入給藥至鼻腔、口腔、肺或其類似位置；口服給藥；經皮給藥；經由口黏膜、陰道黏膜、眼睛黏膜、直腸黏膜或子宮黏膜來經黏膜給藥；或其類似方式。
若需要的話，本發明之醫藥組合物可進一步包含一藥理學可接受的媒劑或基礎物。該媒劑及基礎物無限制，只要其不損害本發明之效應且可根據使用形式合適地選擇。其實施例包括上述提及的那些。於此實例中，該醫藥組合物、媒劑及基礎物的比例亦無限制，只要其不損害本發明之效應且可根據使用形式合適地選擇。
在施加本發明之醫藥組合物時，施加其有效量。例如，該醫藥組合物的施加量為包含在其中之核酸複合物的施加量為每細胞0.001至10pM，較佳為0.001至1pM及更佳為0.01至0.1pM。
本發明之醫藥組合物能將特定的核酸輸送進入細胞中。也就是說，本發明之醫藥組合物在將特定核酸(其存在於該醫藥組合物中且形成該核酸複合物)輸送至細胞中有效，此藉由將該醫藥組合物帶至與細胞接觸來進行。
本發明亦提供一種用來將核酸輸送進入細胞中的方法。根據本發明之用來將核酸輸送進入細胞中的方法包括將上述描述的核酸複合物或核酸輸送組成物帶至與細胞接觸之步驟。在該核酸複合物或核酸輸送組成物與細胞間之接觸無限制，只要將合適的量之核酸複合物或核酸輸送組成物帶至與欲引進核酸的細胞接觸。例如，可使用與迄今已知之基因療法相同的方式來進行接觸，及同樣亦適用於將帶至接觸的量：可合適地選擇接觸方式及量。
藉由上述方式將核酸複合物或核酸輸送組成物帶至與細胞接觸，該核酸可在細胞中穩定及持續維持。對與細胞接觸來說，該核酸複合物可自身使用或與如上所述的媒劑或基礎物組合著使用。該核酸輸送組成物亦可自身使用或與如上所述的媒劑或基礎物組合著使用。對更有效率的細胞內核酸輸送來說，將該核酸輸送組成物帶至與細胞接觸較佳。
如上述提及，在本發明中欲輸入核酸之細胞無限制，及可為培養細胞、分離自有機體的細胞(包括確立細胞株)、活體內細胞或其類似細胞，及可來自人類或非人類動物。上述提及的接觸可試管內或活體內進行。
例如，為了試管內將該核酸複合物或核酸輸送組成物帶至與細胞接觸，可於合適的量之核酸複合物或核酸輸送組成物存在下培養該細胞。為了試管內將該核酸複合物或核酸輸送組成物帶至與培養細胞或分離自有機體的細胞接觸，可於血清存在下進行接觸。當活體內將該核酸複合物或核酸輸送組成物帶至與細胞接觸時，該核酸複合物或核酸輸送組成物可帶至與細胞接觸，例如，直接注入組織中；靜脈內、皮下、肌肉內、腹膜間位或眼內注射、或注入消化道、牙齒或其類似位置中；吸入給藥至鼻腔、口腔、肺或其類似位置；口服給藥；經皮給藥；經由口黏膜、陰道黏膜、眼睛黏膜、直腸黏膜或子宮黏膜來經黏膜給藥；或其類似方式。
在根據本發明之用來將核酸輸送進入細胞之方法中，將有效量的核酸複合物或核酸輸送組成物帶至與細胞接觸以將核酸引進細胞中。例如，選擇欲給藥的核酸複合物或核酸輸送組成物之量，以便每細胞給藥0.001至10pM的核酸複合物，較佳為0.001至1pM及更佳為0.01至0.1pM。
可藉由將該醫藥組合物帶至與細胞接觸來進行根據本發明之將核酸輸送至細胞中的方法。當使用該醫藥組合物時，本發明之方法可使用與上所述相同的方式來進行。
實施例
現在，本發明將根據實施例及其類似例子詳細地描述，但是本發明不限於那裏。在下列實施例及測試實施例中，使用GL3-siRNA(siRNA至螢火蟲螢光素酶；美國包德(Boulder)，CO的大哈馬空研究公司(Dharmacon Research,Inc.)；正義；5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT，反義：5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)作為siRNA。使用分子簇糊精(江崎固力果有限公司)作為高分枝環狀糊精。
實施例1 包含siRNA與高分枝環狀糊精之複合物的製備
使用Tris-EDTA(TE)緩衝溶液(由弗魯卡有限公司(Fluka Co.,Ltd.)製造)來製備一包含siRNA濃度2μM的溶液(siRNA溶液)。再者，使用Tris-EDTA(TE)緩衝溶液(由弗魯卡製造)來製備一包含高分枝環狀糊精濃度25μM的溶液(高分枝環狀糊精溶液)。混合相等量的這些溶液一分鐘以形成siRNA複合物。表1顯示出所獲得的siRNA複合物之性質。
#所顯示出的顆粒直徑為平均顆粒直徑(奈米)，其使用日塔尺寸機(Zetasizer)3000HSA(馬爾文裝置(Malvern Instrument))來測量(使用雷射繞射方法來測量該體積平均顆粒直徑)。使用日塔尺寸機3000HSA(馬爾文裝置)來測量ζ-電位。
實施例2 含siRNA複合物的核酸輸送組成物之製備
以7：3：1之莫耳比率來稱出二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、膽固醇與硬脂醯胺，及使用茄子型式燒瓶(回收燒瓶)，將其溶解在氯仿中。在減壓下使用旋轉蒸發器來乾燥該溶液，以形成一脂質薄膜層。將包含0.028毫克/毫升在實施例1中所獲得的siRNA複合物溶液加入至所產生之脂質薄膜層，以便該溶液具有DSPC濃度30毫克/毫升，然後混合。之後，使用擠壓器讓該溶液通過具有孔洞直徑800奈米及200奈米的薄膜來調整其顆粒直徑，以製備一呈陽離子脂粒形式用於siRNA輸送之組成物。所產生用於siRNA輸送的組成物具有顆粒直徑約200奈米，及其呈顆粒具有均勻的顆粒尺寸之脂粒形式。該組成物具有ζ-電位約50毫伏特。所顯示出的顆粒直徑為使用日塔尺寸機3000HSA(馬爾文裝置)所測量之平均顆粒直徑(奈米)(使用雷射繞射方法來測量該體積平均顆粒直徑)。使用日塔尺寸機3000HSA(馬爾文裝置)來測量ζ-電位。
實施例3 含siRNA複合物的核酸輸送組成物之製備
使用與實施例2相同的方式來製備一呈陽離子脂粒形式的核酸輸送組成物，除了DSPC、膽固醇及硬脂醯胺之比率為7：3：2外。如在實施例2中般，所產生用於siRNA輸送的組成物具有顆粒直徑約200奈米及呈脂粒形式，其中該顆粒具有均勻的顆粒尺寸。該組成物具有約50毫伏特的ζ-電位。
測試實施例1 siRNA的包合效率之評估
利用與上述實施例1相同的方式，使用經FITC預先標定的siRNA來製備經FITC標定的siRNA複合物。使用該經FITC標定的siRNA複合物，在與實施例2及3相同之條件下製備一呈陽離子脂粒形式的核酸輸送組成物。該siRNA輸送組成物在製備後立即藉由離心機(在75,000rpm下1小時)沉澱，及測量存在於其上層液中之經FITC標定的siRNA之螢光強度，以計算siRNA包合效率(囊封在脂粒中的siRNA對總siRNA之比例(%))。
結果，當在與實施例2相同之條件下製備時，指出97.2%之高程度siRNA包合效率；及當在與實施例3相同之條件下製備時，其為99.8%。此顯露出本發明之核酸複合物具有能有效率地以脂粒形式引進用於核酸輸送的載體中之特徵。雖然不想要有限制的解釋，此大概因為高分枝環狀糊精與siRNA形成一緊密複合物。
測試實施例2 細胞安全性之評估測試
使用MTS試驗來進行評估。對該MTS試驗來說，使用由普羅美加股份(有限)公司(Promega Corporation)所製造的細胞滴定器96水性溶液細胞增殖試驗(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)。特別是，以3.16×104 細胞/井，將A594細胞(美國的ATCC)灌輸進入200微升在96井板中包含10體積%胎牛血清(FBS)的伊購氏媒質(Eagle’s Medium)之杜爾貝科氏改質物(Dulbecco’s Modification)(DMEM)中，及在37℃下培養24小時。在以漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s Balanced Salt Solution)(HBSS)沖洗三次後，將該媒質改變成沒有FBS的DMEM。以每井20微升的量加入每種核酸輸送組成物，並在37℃之5%CO2 下培養4小時。其次，將在井中的培養上層液改變成含有10體積%的FBS之DMEM，再次在37℃之5%CO2 下培養20小時。將20微升的MTS(四唑鎓鹽)試劑及100微升含有10體積%FBS的DMEM媒質加入至每個井，及培養二小時。然後，測量在492奈米處的吸收度及計算細胞生存能力。藉由將在沒有加入該核酸輸送組成物(其於上述條件下培養)下，於492奈米處所測量之吸收度設定為100%來計算細胞生存能力。
第2圖顯示出結果。如顯示在第2圖中，變明顯的是實施例2及3之全部核酸輸送組成物皆具有低細胞毒害性及高度安全性。特別已証實的是，實施例2及3之核酸輸送組成物顯示出明顯高程度的安全性。
測試實施例3 siRNA輸送進入細胞中的效率之評估測試
使用流動式細胞測量術，藉由測量經FITC標定的siRNA之螢光強度來評估siRNA的細胞內引進效率。在此測試中，使用以經FITC預先標定的siRNA所製備之核酸輸送組成物。特別是，以5×105 細胞/井，將A594細胞(美國的ATCC)灌輸進入500微升在24井板中含有10體積%FBS的DMEM，及在37℃之5% CO2 下培養24小時。在以HBSS沖洗三次後，加入0.95毫升不含FBS的DMEM。進一步將0.05毫升實施例1及2之每種核酸輸送組成物加入至每個井，及在37℃之5%CO2 下培養4小時。其次，將在井中的培養上層液改變成含有10體積%FBS之DMEM，再次在37℃之5% CO2 下培養20小時，每井以HBSS沖洗一次，及加入0.2毫升的細胞擦洗緩衝劑(CellScrubBuffer)(由基因治療系統公司(Gene Therapt Systems,Inc.)製造)。在37℃之5% CO2 下進行培養15分鐘，再次，以HBSS沖洗該等井兩次，及使用胰蛋白酶來分離已附著至該井底部之細胞且藉由離心機收集。將所產生的細胞懸浮在HBSS中。讓該懸浮液過濾過具有孔洞直徑41微米之薄膜。使用流動式細胞測量術，在加入核酸輸送組成物後之2小時、12小時及24小時處測量細胞的螢光強度。至於對照組，則使用與上所述相同的方式，使用對照核酸輸送組成物來測量細胞之螢光強度，其中該對照核酸輸送組成物可藉由混合一里剖費克塔胺2000TM 溶液(其由因維錯俊股份(有限)公司(Invitrogen Corporation)製造，其經常使用作為可商業購得的基因媒介體，其以歐普替門(OptiMEM)媒質稀釋至0.1毫克/毫升)，與一siRNA溶液(其中siRNA以TE緩衝液在濃度2μM下以體積比率1：1稀釋)獲得。
第3圖顯示出結果。已從結果証實，在實施例1及2的核酸輸送組成物之任何實例中，siRNA持續維持且其在細胞中的濃度保持固定。相反地，對照核酸輸送組成物顯示出不僅具有低的起始siRNA細胞內輸送效率，而且細胞內siRNA亦隨著時間減少，而在細胞中於加入後12小時及24小時處產生不足量的siRNA。
第1圖顯示出高分枝環狀糊精的實施例。
第2圖顯示出測試實施例2的結果，即，該核酸輸送組成物對細胞安全性之評估結果。
第3圖顯示出siRNA藉由在測試實施例3中的每種核酸輸送組成物傳遞來引進細胞中之評估結果。在第3圖中的縱座標顯示出每個細胞之平均螢光強度。

Claims (15)

  1. 一種核酸複合物，其包含一核酸及一高分枝環狀糊精，其中該高分枝環狀糊精為一種具有聚合程度50至5000的聚葡糖，其具有一從α-1,4-葡萄糖苷鍵與至少一個α-1,6-葡萄糖苷鍵所形成之內部分枝環狀結構部分，及一已鍵結至該內部分枝環狀結構部分的外部分枝結構部分。
  2. 如申請專利範圍第1項之核酸複合物，其中該高分枝環狀糊精的量為每重量份之核酸含1至4000重量份。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之核酸複合物，其中該核酸為siRNA。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之核酸複合物，其為一種藉由在水溶液中混合該核酸與該高分枝環狀糊精所獲得的團聚物。
  5. 如申請專利範圍第3項之核酸複合物，其為一種藉由在水溶液中混合該核酸與該高分枝環狀糊精所獲得的團聚物。
  6. 一種核酸輸送組成物，其包含如申請專利範圍第1至5項中任一項之核酸複合物及一核酸輸送載體。
  7. 如申請專利範圍第6項之核酸輸送組成物，其中該核酸輸送載體為一種包含(A)二醯基磷脂醯膽鹼、(B)至少一種選自於膽固醇及具有膽固醇骨架的陽離子脂質之成員、及(C)脂肪族一級胺的組成物。
  8. 如申請專利範圍第7項之核酸輸送組成物，其中在該核 酸輸送載體中的組分(A)為一該醯基部分具有4至23個碳原子之二醯基磷脂醯膽鹼。
  9. 如申請專利範圍第7項之核酸輸送組成物，其中在該核酸輸送載體中的組分(B)為膽固醇。
  10. 如申請專利範圍第7項之核酸輸送組成物，其中在該核酸輸送載體中的組分(C)為具有10至20個碳原子之烷基胺。
  11. 如申請專利範圍第7項之核酸輸送組成物，其中該組分(A)：(B)：(C)的莫耳比率為5-9：1-5：1。
  12. 如申請專利範圍第7項之核酸輸送組成物，其中該核酸輸送載體為一種脂粒製劑，其中從該組分(A)至(C)形成一脂粒薄膜。
  13. 如申請專利範圍第6至12項中任一項之核酸輸送組成物，其用於將核酸輸送至細胞中。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第6至12項中任一項之核酸輸送組成物。
  15. 一種如申請專利範圍第6至12項中任一項之核酸輸送組成物之用途，其使用來製造用來將核酸輸送進入細胞中的藥物。
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