PT2217208E - Complexo de ácido nucleico e composição para transferir ácido nucleico - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPLEXO DE ÁCIDO NUCLEICO E COMPOSIÇÃO PARA TRANSFERIR ÁCIDO NUCLEICO"

DOMÍNIO TÉCNICO A invenção presente diz respeito a um complexo de ácido nucleico que consegue residir persistentemente numa célula e tem uma pequena toxicidade e uma elevada segurança, bem como a uma composição para a transferência de ácido nucleico.

ESTADO DA TÉCNICA

Com os recentes desenvolvimentos em biotecnologia foram descobertos muitos ácidos nucleicos diferentes, exibindo funções fisiologicamente activas em células. Por exemplo, sabe-se que o siARN (pequeno ARN interferente) provoca a degradação do mARN de um gene alvo numa célula, e interfere com a expressão do gene alvo (interferência com o ARN) . A função inibidora sobre a expressão do gene alvo devida a essa interferência com o ARN é útil para se mitigarem ou para se tratarem sintomas de doenças provocadas pela expressão anormal de genes ou de conjuntos de genes específicos, e é de esperar que se desenvolvam agentes terapêuticos utilizando siARN. No entanto, uma vez 2 que os ácidos nucleicos são macromoléculas solúveis em água tendo uma carga negativa, Teles têm uma eficiência extremamente pequena no que toca à sua transferência para genes intracelulares, resultando efeitos terapêuticos não eficazes para as terapias genéticas, incluindo as terapias com siARN.

Sabe-se que a utilização de um veículo (vector) permite transferir genes de forma eficaz para dentro de células. Incluem-se nos vectores os vectores virais e os vedores não virais. Os vectores virais apresentam uma eficiência elevada na introdução de ácidos nucleicos; no entanto, existem diversos aspectos de segurança desconhecidos incluindo a patogenicidade, a imunogenicidade e a citotoxicidade. Portanto, é desejável utilizarem-se vedores não virais em aplicações clinicas.

Inclui-se nos exemplos de vectores não virais a Lipofectamine™ 2000, que se encontra já comercialmente disponível. Além disto, foram descritos um lípido catiónico com uma estrutura especifica (veja-se o Documento de Patente 1), e uma composição (veja-se o Documento de Patente 2) que contém um composto anfifílico e um policatião. A entrega intracelular de ácidos nucleicos utilizando um vector não virai é levada a cabo misturando em primeiro lugar o ácido nucleico a transferir com o vector não virai para formar um complexo, e depois levando o complexo ao contacto com a célula alvo. Quando o vector não virai consegue formar um lipossoma, incorpora-se o 3 vector numa célula com um ácido nucleico dentro do lipossoma, fazendo-se deste modo uma transferência intracelular do ácido nucleico.

Os ácidos nucleicos tais como o siARN, têm no entanto caracteristicas especificas de uma fraca estabilidade e uma forte carga eléctrica. Portanto, o ácido nucleico tem uma estabilidade problematicamente diminuída quando é misturado com um vector não virai, inibindo a introdução contínua de ácido nucleico numa célula. Embora se conheça um exemplo no qual se armadilha um ácido nucleico num lipossoma formando um complexo do siARN com o polímero catiónico (veja-se o Documento Não de Patente 1), ele não é utilizável na prática atenta a citotoxicidade do polímero catiónico. Além disto, mesmo quando se consegue formar um complexo estável utilizando um vector não virai conhecido e um ácido nucleico, o complexo pode ter uma capacidade pequena para ser transferido para dentro de uma célula, ou pode ser transferido rapidamente. Portanto, estes vectores não virais não conseguem manter persistentemente o ácido nucleico na célula; o que significa que não conseguem manter os efeitos desejáveis obtidos pelo ácido nucleico.

Atento o estado da técnica, o desenvolvimento de técnicas para se transferir eficazmente um ácido nucleico (por exemplo, siARN) para dentro de uma célula e para se manter o ácido nucleico persistentemente, com uma pequena 4 toxicidade e segurança elevada, tem sido um objectivo desej ado. O Documento de Patente 3 descreve composições para utilização terapêutica de interferência com o ADN. Entre estas estão construções de ARNi que são formulados a titulo de complexos supramoleculares de polímeros tais como polímeros contendo β-ciclodextrina ou polímeros ramificados de ciclodextrina. 0 documento também descreve a transferência de ADN plasmídico codificando para siARN, que está complexado com polímero PEI25k-hi-CD ramificado (polietilenoimina com elevado grau de enxertia com ciclodextrina), para dentro de células. 0 Documento de Patente 4 descreve uma dextrina cíclica altamente ramificada e um processo para a sua produção.

Documento de Patente 1: Publicação Não-examinada de Patente Japonesa No. 2002-529439.

Documento de Patente 2: Publicação Não-examinada de Patente Japonesa No. 2005-508394

Documento de Patente 3: WO 2004/033620 A2 Documento de Patente 4: US 6248566 BI Documento Não de Patente 1: Kentaro Kogure et al., Development of a non-viral-multifunctional-envelope-type nano device by a novel lipid film hydration method, J. Control. Release, 98 (2004) 317-323 5

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMAS A RESOLVER PELA INVENÇÃO

Um objecto da invenção presente é resolver os problemas da técnica anterior. Especificamente, um objecto da invenção presente é proporcionar um complexo de ácido nucleico com pequena toxicidade e elevada segurança que possa manter um ácido nucleico persistentemente, tal como um siARN ou outros semelhantes, numa célula; e uma composição para transferir ácido nucleico que consiga transferir eficazmente o complexo de ácido nucleico para dentro de uma célula. Outro objecto da invenção presente é proporcionar uma composição farmacêutica incluindo uma composição para transferir um ácido nucleico, e um método de transferir um ácido nucleico para dentro de uma célula ao levar uma composição para transferência de um ácido nucleico ao contacto com a célula.

MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS

Os inventores presentes levaram a cabo uma investigação extensiva para resolver os problemas acima, e verificaram que um complexo de ácido nucleico com pequena toxicidade e com uma segurança elevada consegue manter persistentemente um ácido nucleico dentro de uma célula, podendo formar-se a partir de um complexo utilizando um ácido nucleico que se pretende introduzir na célula e uma dextrina cíclica altamente ramificada, em que a dextrina 6 cíclica altamente ramificada seja uma glucana com um grau de polimerização de entre 50 e 5.000, que tenha uma estrutura cíclica interna ramificada formada por ligações glicosídicas a-1,4 e pelo menos uma ligação glucosídica a-1,6, e uma porção externa com estrutura ramificada ligada à porção interna ramificada com estrutura cíclica. Os inventores presentes verificaram que a segurança, a eficácia da transferência para dentro da célula, e a persistência intracelular de um ácido nucleico pode ser ainda melhorada utilizando-se, a título de veículo para se introduzir o complexo de ácido nucleico numa célula, um veículo contendo (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) colesterol e/ou um seu derivado, e (C) uma amina primária alifática. A invenção presente foi conseguida levando a cabo investigação suplementar baseada nestes novos aspectos. A invenção presente proporciona os seguintes itens

Item 1: Um complexo de ácido nucleico que inclua um ácido nucleico e uma dextrina cíclica altamente ramificada, em que a dextrina cíclica altamente ramificada seja uma glucana com um grau de polimerização de entre 50 e 5.000, possuindo uma poção com uma estrutura cíclica ramificada, formada a partir de ligações glucosídicas a-1,4 e pelo menos uma ligação glucosídica a-1,6, e uma porção externa com 7 estrutura ramificada ligada à porção interna ramificada e cíclica.

Item 2. 0 complexo de ácido nucleico de acordo com o Item 1, no qual a quantidade de dextrina cíclica altamente ramificada seja de entre 1 e 4.000 partes, em peso, por parte, em peso, do ácido nucleico.

Item 3. O complexo de ácido nucleico de acordo com o Item 1 ou o 2, no qual o ácido nucleico seja s iARN.

Item 4. O complexo de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos Itens 1 a 3, que seja um agregado obtido misturando um ácido nucleico com uma dextrina cíclica altamente ramificada, numa solução aquosa.

Item 5. Uma composição para transferência de um ácido nucleico, que inclua um complexo de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos Itens 1 a 4 e um veículo para transferir o ácido nucleico. Item 6. A composição para transferir o ácido nucleico de acordo com o Item 5, em que o veículo para a transferência do ácido nucleico seja uma composição que inclua (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) pelo menos um membro seleccionado de entre colesterol e os seus derivados, e (C) uma amina primária alifática. Item 7. A composição para transferência de um ácido nucleico de acordo com o Item 6, em que a Componente (A) do veículo para transferir o ácido nucleico seja uma diacilfosfatidilcolina ma qual a espécie acilo tenha 4 a 23 átomos de carbono.

Item 8. A composição para transferência de um ácido nucleico de acordo com o Item 6, em que a Componente (B) do veiculo para transferir o ácido nucleico seja o colesterol.

Item 9. A composição para transferência de um ácido nucleico de acordo com o Item 6, em que a Componente (C) do veiculo para transferir o ácido nucleico seja uma alquilamina contendo 10 a 20 átomos de carbono.

Item 10. A composição para transferência de um ácido nucleico de acordo com o Item 6, em que a razão molar entre as Componentes (A) : (B) : (C) sej a de 5-9:1-5:1.

Item 11. A composição para transferência de um ácido nucleico de acordo com o Item 6, em que o veiculo para transferir o ácido nucleico seja uma preparação de lipossoma na qual se forme a membrana do lipossoma a partir das Componentes (A) a (C) .

Item 12. Uma composição farmacêutica que inclua a composição para transferir o ácido nucleico de acordo com qualquer um dos Itens 5 a 11.

Item 13. Uma composição farmacêutica de acordo com o Item 12, em que o ácido nucleico seja siARN. 9

Item 14. Utilização da composição para transferência do ácido nucleico de acordo com qualquer um dos Itens 5 a 11, para se produzir um produto farmacêutico para transferir um ácido nucleico para dentro de uma célula.

Item 15. A utilização de acordo com o Item 14, em que o ácido nucleico seja siARN.

Item 16. A composição para transferir um ácido nucleico de acordo com qualquer um dos Itens 5 a 11, para transferir um ácido nucleico para dentro de uma célula.

Item 17. 0 método de acordo com o Item 16, em que o ácido nucleico seja o siARN.

EFEITOS DA INVENÇÃO 0 complexo de ácido nucleico da invenção presente é obtido formando-se um complexo a partir de um ácido nucleico recorrendo à utilização de uma dextrina cíclica altamente ramificada que é uma glucana com um grau de polimerização de entre 50 e 5.000, possuindo uma porção interna com uma estrutura cíclica ramificada, formada por intermédio de ligações glucosídicas a-1,4, e pelo menos uma ligação glucosídica oí-1,6, e uma porção externa com uma estrutura ramificada que se liga à porção interna com estrutura cíclica ramificada, tornando possível deste modo que o complexo de ácido nucleico seja altamente seguro e capaz de manter o ácido nucleico estável dentro de uma célula durante um período de tempo longo , de modo a que os 10 efeitos úteis baseados no ácido nucleico possam ser exibidos persistentemente. Além disto, o complexo de ácido nucleico da invenção presente pode formar facilmente um complexo com um veiculo para transferência do ácido nucleico, e pode ser facilmente encapsulado mesmo quando no veiculo de transferência do ácido nucleico, sob a forma de um lipossoma. O complexo da invenção presente é portanto também excelente em quanto diga respeito à facilidade da sua formulação numa composição para transferir ácido nucleico. Além disto, a composição para transferir o ácido nucleico da invenção presente consegue introduzir o complexo de ácido nucleico numa célula.

Para se transferir o complexo de ácido nucleico para dentro de uma célula, a utilização de um veiculo que contenha (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) colesterol e/ou um seu derivado, e (C) uma amina primária alifática, para a transferência do complexo de ácido nucleico para dentro de uma célula consegue aumentar a eficácia da transferência intracelular do complexo de ácido nucleico, e além disto consegue melhorar a persistência e a segurança da referida transferência intracelular.

Tal como se descreveu acima, o complexo de ácido nucleico e a composição para a transferência do ácido nucleico da invenção presente podem exibir efeitos úteis baseados na no ácido nucleico, de uma forma eficaz, persistente, e com elevada segurança; portanto, o complexo e a composição são especialmente úteis a titulo de produtos 11 farmacêuticos para a terapia genética. Deste modo, a composição farmacêutica ou o método de transferir um ácido nucleico para dentro de uma célula de acordo com a invenção presente podem transferir um ácido nucleico para dentro de uma célula mais eficazmente.

MELHOR MODO DE LEVAR A CABO A INVENÇÃO A invenção presente é descrita adiante em pormenor. (1) Complexo de Ácido Nucleico 0 complexo de ácido nucleico da invenção presente inclui um ácido nucleico e uma dextrina cíclica altamente ramificada. 0 ácido nucleico utilizado para o complexo de ácido nucleico da invenção presente não se limita através do seu tipo ou da sua estrutura, desde que necessite de ser transferido para dentro de uma célula. Incluem-se nos exemplos específicos destes ácidos nucleicos , siARN, mARN, tARN, rARN, cADN, miARN (microARN), ribozimas, oligos de sentido reverso, oligonucleótidos chamarizes, ADN plasmídico, ácidos nucleicos peptídicos, oligonucleótidos formadores de triplex (TFO), aptâmeros, genes, etc., entre os quais se prefere o siARN. 0 siARN tem a desvantagem de ter uma pequena estabilidade na presença de vectores não virais até hoje conhecidos, mas quando o siARN é formado 12 num complexo de ácido nucleico da invenção presente, ele tem a possibilidade de ser continuamente transferido para dentro de uma célula, bem como excelente estabilidade. 0 ácido nucleico utilizado no complexo de ácido nucleico da invenção presente pode ser derivado de seres humanos, de animais, de plantas, de bactérias, de virus, ou outras semelhantes, ou pode ser obtido por síntese química. Estes ácidos nucleicos podem ser de cadeia singela, de dupla cadeia, ou de tripla cadeia, e não são limitados pela massa molecular. Além disto, na invenção presente, podem utilizar-se ácidos nucleicos modificados com produtos químicos, com enzimas, ou com péptidos. Além disto, na invenção presente, podem utilizar-se ácidos nucleicos de forma singela ou em combinações de dois ou mais. A dextrina cíclica altamente ramificada que se utiliza no complexo de ácido nucleico da invenção presente é fabricada permitindo a um enzima de ramificação que actua sobre um sacárido com ligações glicosídicas oí-1,4 e pelo menos uma ligação glicosídica oí-1,6, tal como a amilopectina, e seja uma glucana com um grau de polimerização de entre 50 e 5.000 contendo uma porção interior com uma estrutura cíclica ramificada e uma porção exterior com uma estrutura ramificada. A porção interior com uma estrutura cíclica ramificada é uma estrutura cíclica formada a partir de ligações glicosídicas oí-1,4 e pelo menos uma ligação glicosídica oí-1,6; e a porção exterior ramificada é uma porção com estrutura não cíclica ligada à porção interior com estrutura cíclica. A porção 13 exterior com estrutura ramificada está ligada à porção interior com estrutura cíclica ramificada através pelo menos de uma ligação glicosídica oí-1,6. Incluem-se nas formas preferidas da dextrina cíclica altamente ramificada a glucana mencionada acima na qual a porção interna com a estrutura cíclica ramificada tenham um grau de polimerização de entre 10 e 100, a glucana mencionada acima na qual a porção exterior com estrutura ramificada tenha um grau de polimerização de 40 ou mais, e a glucana mencionada acima na qual as cadeias que são unidades da porção exterior com estrutura ramificada apresentem um grau de polimerização de entre 10 e 20. Pode ilustrar-se a dextrina cíclica altamente ramificada tal como, por exemplo, na Fig. 1, na qual a porção interna com estrutura cíclica ramificada está indicada por (i), e a porção exterior com estrutura ramificada está indicada por (ii).

Pode determinar-se o grau de polimerização por filtração através de gel utilizando um refractómetro diferencial, a partir da posição de eluição de um material cujo grau de polimerização seja conhecido. Nesta determinação, o resultado num refractómetro diferencial é proporcional à concentração da glucana, e o resultado de um fotómetro de dispersão em pequenos ângulos da luz laser é proporcional ao produto do grau de polimerização pela concentração da glucana. Deste modo, pode determinar-se o grau de polimerização da glucana medindo a razão entre os resultados obtidos em ambos os detectores, isto é, um refractómetro diferencial e um fotómetro de difracção em 14 pequenos ângulos de luz laser. As condições especificas podem encontrar-se descritas na US 6.248.566 BI (Patente Japonesa No. 3.107.358). A dextrina cíclica altamente ramificada bem como o processo para o seu fabrico estão descritos na US 6.248.566 BI (Patente Japonesa No. 3.107.358), e uma dextrina cíclica altamente ramificada é vendida sob a marca registada "Cluster Dextrin" pela Ezaki Glico Co., Ltd.

No complexo de ácido nucleico da invenção presente, a razão entre a dextrina cíclica altamente ramificada e o ácido nucleico não tem limitações, mas ela é habitualmente de entre 1 e 4.000 partes em peso, preferivelmente 10 a 1000 partes em peso, e mais preferivelmente 100 a 400 partes em peso, da dextrina cíclica altamente ramificada por parte em peso do ácido nucleico. Em termos de razão molar, a razão acima é, por exemplo, de entre 0,1 e 1.000 mol, preferivelmente 1 a 100 mol, e mais preferivelmente 10 a 20 mol, da dextrina cíclica altamente ramificada por mol do ácido nucleico. Satisfazendo uma tal razão torna possível fazer com que seja mais notável a continuidade do transporte do ácido nucleico para dentro das células por um veículo de transporte do ácido nucleico, e a sua segurança. O diâmetro médio de partícula do complexo de ácido nucleico da invenção presente é em geral de entre 6 e 60 nm, preferivelmente 8 a 30 nm, e mais preferivelmente 10 15 a 20 nm. O diâmetro médio de partícula do complexo de ácido nucleico é medido sob a forma de um diâmetro médio em volume das partículas, utilizando um método baseado na dispersão dinâmica da luz de um laser. O complexo de ácido nucleico da invenção presente é um complexo formado por agregação do ácido nucleico e da dextrina cíclica altamente ramificada. O complexo de ácido nucleico da invenção presente é fabricado misturando o ácido nucleico com dextrina cíclica altamente ramificada numa solução que consiga dispersar estavelmente ambos os compostos. Incluem-se nos exemplos específicos de soluções que conseguem dispersar de forma estável o ácido nucleico e a dextrina cíclica altamente ramificada, tampões tais como Tris e outros semelhantes. Os tampões podem conter agentes quelantes tais como o ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) e outros semelhantes. As condições de mistura do ácido nucleico com a dextrina cíclica altamente ramificada pode ser tal que, na solução mencionada acima, por exemplo, misturam-se entre cerca de 0,1 μΜ e cerca de 100 μΜ, preferivelmente entre cerca de 1 μΜ e cerca de 10 μΜ, do ácido nucleico, com entre cerca de 1 μΜ e cerca de 1.000 μΜ, e preferivelmente entre cerca de 10 μΜ e cerca de 100 μΜ, da dextrina altamente ramificada, à temperatura ambiente, durante entre cerca de 1 e cerca de 100 minutos, e preferivelmente entre cerca de 5 e cerca de 10 minutos. O complexo assim produzido de ácido nucleico da invenção presente está presente sob a forma de uma dispersão na solução. Pode misturar-se a dispersão tal e qual, ou depois 16 de se diluir ou de se concentrar caso seja necessário, com o veiculo de transferência do ácido nucleico. (2) Composição de Transferência do Ácido Nucleico 0 complexo de ácido nucleico é incorporado num veiculo de transferência do ácido nucleico misturando-o com o veiculo de transferência do ácido nucleico, e deste modo permite-se que o ácido nucleico seja transportado para as células. Isto é, a invenção presente também proporciona uma composição para transferência do ácido nucleico que inclui o complexo de ácido nucleico e um veiculo de transferência do ácido nucleico. 0 veiculo de transferência do ácido nucleico é um vector não virai utilizado como veiculo do ácido nucleico para transferir (introduzir) um ácido nucleico para dentro de uma célula. A composição para transferência do ácido nucleico é uma composição utilizada para levar o ácido nucleico ao contacto com a célula para dentro da qual há que transferir o ácido nucleico, de modo a que o ácido nucleico contido na composição seja introduzido na célula.

Formulação do Veículo de Transporte do Acido

Nucleico 0 veiculo para transferência do ácido nucleico para células que se utiliza na composição para transferência do ácido nucleico da invenção presente não é 17 limitado desde que seja capaz de incorporar um ácido nucleico numa célula. Incluem-se nos exemplos de veículos para transporte do ácido nucleico incluem-se veículos conhecidos tais como a Lipofectamine™ 2000 e outros semelhantes.

Do ponto de vista de mais melhorias da persistência intracelular do ácido nucleico contido no complexo de nucleico, e de mais melhorias da eficiência e da segurança da transferência para dentro das células, é preferível utilizar, por exemplo, um veiculo que contenha (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) colesterol e/ou um seu derivado, e (C) uma amina alifática primária (doravante referido neste documento como "Veículo 1"). A diacilfosfatidilcolina (doravante referida neste documento por vezes como "Componente (A)") utilizada no Veículo 1 não tem qualquer limitação, uma vez que seja farmacologicamente aceitável, e pode ser, por exemplo, uma diacilfosfatidilcolina na qual a espécie acilo possua 4 a 23 átomos de carbono. O número de carbonos de ambos os grupos acilo integrando a diacilfosfatidilcolina pode ser igual ou eles podem ser diferentes um do outro. a

Incluem-se nos exemplos específicos de diacilfosfatidilcolinas as dilauroílfosfatidilcolina, a dimiristoílfosfatidilcolina, a dipalmitoílfosfatidilcolina, a diestearoílfosfatidilcolina, a dioleoílfosfatidilcolina, a dilinoleílfosfatidilcolina, 18 miristoílpalmitoílfosfatidilcolina, a miristoílestearoílfosfatidilcolina, a palrai toí lestearoí lfosf atidil colina, a dibutiloilfosfatidilcolina, a dihexanoílfosfatidilcolina, a diheptanoílfosfatidilcolina, a didecanoílfosfatidilcolina, a diftanoílfosfatidilcolina, a didodecilfosfatidilcolina, a dieicosanoílfosfatidilcolina, a dihenicosanoilfosfatidilcolina, a dierucoilfosfatidilcolina, a diaraquidonoílfosfatidilcolina, a bis(tricosadinoil) fosfatidilcolina, etc. Entre estas, incluem-se nos exemplos preferidos as diacilfosfatidilcolinas nas quais a espécie acilo tem 12 a 18 átomos de carbono; os exemplos mais preferidos incluem dimiristoilfosfatidilcolina, a dipalmitoílfosfatidilcolina, a diestearoilfosfatidilcolina, a miristoílpalmitoílfosfatidilcolina, a miristoílestearoílfosfatidilcolina, a palmitoílestearoílfosfatidilcolina, e outras diacilfosfatidilcolinas nas quais a espécie acilo tenha 13 a 17 átomos de carbono; incluem-se nos exemplos especialmente preferíveis a dimiristoilfosfatidilcolina, a dipalmitoílfosfatidilcolina, e a diestearoilfosfatidilcolina; e incluem-se nos exemplos mais preferidos de todos a diestearoilfosfatidilcolina. Podem utilizar-se estas diacilfosfatidilcolinas por si sós ou em combinações de duas ou mais. 0 colesterol e/ou um seu derivado (doravante referido por vezes neste documento como "Componente (B)") 19 que se utiliza no Veiculo 1 não tem qualquer limitação desde que seja farmacologicamente aceitável. Os derivados do colesterol são lipidos catiónicos com um esqueleto de colesterol, e nos exemplos específicos incluem-se ο 3β-[Ν-(N', N'-dimetilaminoetano)-carbamoíl]colesterol (DC-Chol), o iodeto de 3β-[Ν',Ν',Ν'-trimetilaminoetano]colesterol (TC— Chol), o bis(guanidínio)-tren-colesterol (BGTC), a N-colesteriloxicarbonil-3,7-diazanonan-l,9-diamina, ο β-alanina-dietanolamina-colesterol, o carbamato de N4-espermina-colesterilo (GL-67), o carbamato de N[N4-3-aminopropilespermidina]colesterilo (GL-78), a N4-espermina-colesterilcarboxamida (GL-90), o carbamato de N1,N8-bis(arginina-carboxamida)-N4-espermidina-colesterilo (GL-95), e o carbamato de N-[N1,N4,N8-tris (3-aminopropil)espermidina]colesterilo (GL-96). Inclui-se nos exemplos preferíveis da Componente (B) o colesterol. No veículo 1, o colesterol e os seus derivados podem ser utilizados por si sós ou em combinações de dois ou mais deles, a título de Componente (B). A amina alifática primária (referida por vezes doravante neste documento como "Componente (C)") que se utiliza no Veículo 1 não tem qualquer limitação desde que seja farmacologicamente aceitável, e pode ser, por exemplo, uma alquilamina na qual a espécie alquilo contenha 10 a 20 átomos de carbono.

Incluem-se nos exemplos específicos de aminas primárias alifáticas a laurilamina, a miristilamina, a 20 palmitilamina, a estearilamina, a oleilamina, a decanoílamina, a ftanoílamina, etc. Entre estas, as alquilaminas nas quais a espécie alquilo contenha 12 a 18 átomos de carbono são preferíveis; a estearilamina, a oleilamina, e a palmitoílamina são mais preferíveis; e a estearilamina é especialmente preferível. Estas aminas primária alifáticas podem ser utilizadas por si sós ou em combinações de duas ou mais. O Veículo 1 inclui uma combinação das Componentes (A) a (C) descritas acima. Para se melhorar ainda mais e eficiência da transferência intracelular de um ácido nucleico, e para diminuir a mais a toxicidade, são preferíveis as seguintes combinações: (A) uma diacilfosfatidilcolina na qual a espécies acilos contenham 4 a 23 átomos de carbono, (B) colesterol e/ou um seu derivado, e (C) uma alquilamina C10-20; e mais preferivelmente, (A) a dimiristoílfosfatidilcolina, a dipalmitoílfosfatidilcolina, e/ou a diestearoílfosfatidilcolina, (B) colesterol, e (C) estearilamina.

No Veículo 1, a razão entre as Componentes (A) e (C) não é limitada, e pode ser, por exemplo, uma razão molar das Componentes (A) : (B) : (C) de 5-9:1-5:1, preferivelmente 6-9:1-4:1, e mais preferivelmente 7-8:2-3:1. Satisfazer uma tal razão torna possível conseguir-se uma transferência intracelular de ácido nucleico com uma melhor eficiência e uma menor toxicidade. 21 A quantidade total das Componentes (A) a (C) na quantidade total de Veículo 1 é, por exemplo, 1 a 100 %, em peso, preferivelmente 20 a 90 %, em peso, e mais preferivelmente 30 a 70 %, em peso. 0 Veículo 1 pode conter, para além das Componentes (A) a (C) , outros lípidos catiónicos. Incluem-se nos exemplos específicos de lípidos catiónicos utilizáveis, a esqualamina, a 3a,7a,12a-tris (3-aminopropoxo)-5β-οοΐ3η-24-(Ν,Ν-bis(3-aminopropil)amina), a 3a, 7a, 12a-tris (3-aminopropoxy) -5β-ο1ιοΐ3η-24- (N- (N- (3-aminopropil))-3-aminopropil)amina, a 3a,7a,12a-tris(3-azidopropoxi)-5β-οοΐ3η-24-(Ν,Ν-bis(2-cianoetil)amina)), a 3a,7a,12a-tris(3-azidopropoxi)-5β-οοΐ3η-24-(N-(benziloxicarbonil)-N-(3-hidroxipropil)amina), e outros lípidos catiónicos semelhantes aos quais se ligam esteróides; conjugados de espermina em chapéu-de-chuva e outros lípidos catiónicos aos quais se liga o ácido eólico; lípidos catiónicos aos quais se ligam glicósidos de esteróis; lípidos catiónicos aos quais se ligam saponinas esteróides; sal brometo de dimetildioctadecilamónio (DDAB), 1,2-dimiristoí1-3-trimetilamónio-propana, 1,2-dioleoí1-3-trimetilamónio-propano (DOTAP), metilsufato de 1,2-dioleoí1-3-trimetilamónio-propano, 1,2-dipalmitoí1-3- trimetilamónio-propana, 1,2-distearoí1-3-trimetilamónio-propano, cloridrato de N-(1-(2,3-bis(oleoíloxi)propil)-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA), sal brometo de dimiristoíloxipropil-dimetil-hidroxietilamónio (DMRIE), 22 brometo de dioleoíloxipropildimetil-hidroxietilamónio (DORIE), brometo de dimetildidodecilamónio, cloridrato de N-(a-trimetilamonioacetil)didodecil-D-glutamina, N-(a- cloridrato de trimetilamonioacetil)-0,0'-bis-(1H,1H,2H,2H-perfluorodecil)-L-glutamina, cloridrato de 0,0'- didodecanoí1-N-(a-trimetilamonioacetil)dietanolamina, brometo de metilalildidodecilamónio, cloridrato de N-(p-(w-trimetilamoniobutiloxi)benzoil)-didodecil-L-glutamina, brometo 9-(w-trimetilamoniobutil)-3,6- bis(dodecanoí1)carbazole, cloridrato de dimetildioctadecilamónio, brometo de N-w- trimetilamoniodecanoí1-dihexadecil-D-glutamina, brometo de N-{p-(w-trimetilaminohexiloxi)-benzoil}-ditetradecil-L-glutamina, sal brometo de p-(w-trimetilamoniodeciloxi)-p'-octiloxiazobenzeno (MC-1-0810), sal brometo de p-{w-(b-hidroxietil)dimetil-amónio-deciloxi}-p'-octiloxiazobenzeno (MC-3-0810), sal brometo de 0,0',0"-tridodecanoí1-N-(w-trimetil-amoniodecanoí1)-tris(hidroximetil)aminometano (TC-1-12), 1,2-dilauril-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2- dimiristoíl-glicero-3-etilfosfocoline, 1,2-dipalmitoíl- glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-diestearoíl-glicero-3- etilfosfocolina, 1,2-dioleoil-glicero-3-etilfosfocholina, l-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-etilfosfocolina, e outros lipidos catiónicos do tipo sal de amónio quaternário; etc.

Quando o Veiculo 1 contém um lipido catiónico para além das Componentes (A) to (C), a proporção de lipido catiónico não tem nenhuma limitação desde que os efeitos da invenção presente não sejam prejudicados, e pode ser, por 23 exemplo, 1 a 10 partes em peso, preferivelmente 2 a 8 partes em peso, e mais preferivelmente 4 a 6 partes em peso, por 100 partes em peso do total das Componentes (A) a (C) . O Veiculo 1 pode conter também uma base oleosa, caso tal seja necessário. A adição de uma base oleosa para se utilizarem as suas propriedades permite controlar a eficiência da introdução do ácido nucleico pelo Veiculo 1. Por exemplo, quando se adiciona uma base oleosa para ajustar a massa especifica do Veiculo 1, o contacto de uma célula como Veiculo 1 pode ser controlado, melhorando desta forma a eficiência da introdução in vitro. Além disto, por exemplo, quando se adiciona uma base oleosa que tenha uma função de sensibilidade à temperatura, pode observar-se a desintegração da parte nuclear do veiculo do ácido nucleico em condições de temperatura previamente determinadas, de modo a induzir flutuações na superfície da célula, melhorando deste modo a eficiência da introdução do ácido nucleico. Além disto, por exemplo, quando se adiciona uma base oleosa capaz de ser alterada por um estímulo externo, pode desintegrar-se o núcleo do Veículo 1 por um estímulo externo para se induzirem flutuações na superfície da célula, melhorando deste modo a eficiência da introdução do ácido nucleico.

Podem incluir-se nos exemplos de bases oleosas que se podem adicionar ao Veículo 1, perfluorocarbonetos, perfluoropentano, brometo de perfluoro-octilo, 24 perfluorohexano, perfluorotributilamina, óleo de soja, óleo de soja refinado, óleo de soja hidrogenado, óleo de soja não saponifiçado, esqualeno, óleo de rícinos, óleo de cravo, trioleato de sorbitan, óleo de terebentina, óleo de cártamo, ácidos gordos de óleo de cártamo, ácido oleico, óleo de palma, óleo de colza, álcoois amílicos, azeite, óleo de linhaça, óleo de gergelim, óleo de clorofila, óleo de cróton, óleo de bergamota, óleo de cedro, óleo de laranja, óleo de funcho, óleo de eucalipto, óleo de milho, óleo de lavanda, óleo de mangerona, óleo de limão, óleo de semente de algodão, óleo de coco, óleo de gema de ovo, óleo de rosa, óleo de pinho, óleo de amêndoas, óleo de amendoim, óleo de camélia, óleo branco de cânfora, óleo de camomila, óleo de canela, óleo de hortelã-pimenta, óleo de milho esterifiçado, óleo de gengibre, óleo de camomila Romana, óleo de cobra, óleo de hortelã, óleo de girassol, manteiga de cacau, óleo de gérmen de trigo, óleo de óxido de zinco, óleos endurecidos, óleos vegetais hidrogenados, parafina líquida leve, parafina líquida, triacilgliceróis de ácidos gordos de cadeia intermédia, óleo de vison, óleo de laranja amarga, óleo de rícinos polioxietilenado, óleo de rícinos polioxietilenado e hidrogenado f óleo de rícinos polioxietilenado e hidrogenado 10, óleo de rícinos polioxietilenado e hidrogenado 100, óleo de rícinos polioxietilenado e hidrogenado 20, óleo de rícinos polioxietilenado e hidrogenado 40, óleo de rícinos polioxietilenado e hidrogenado 5, óleo de rícinos polioxietilenado e hidrogenado 50, óleo de rícinos polioxietilenado e hidrogenado 60, óleo de rícinos 25 polioxilado 35, óleos de processo, etc. Entre estas bases oleosas, o perfluoropentano é sensível à temperatura, tendo a propriedade de entrar em ebulição a 29,5°C tornando-se portanto gasoso. Além disto, o perfluorohexano, o brometo de perfluoro-octilo, e a perfluorotributilamina têm a capacidade de sofrer perturbações aquando de estímulos externos, e a propriedade de provocarem cavitação no núcleo do Veículo 1, desintegrando-o, quando são atingidos por um estímulo externo, tal como a radiação de ultra-sons.

Quando está presente uma base oleosa, a sua proporção não tem qualquer limitação desde que os efeitos da invenção presente não sejam prejudicados, e ela pode ser, por exemplo, de 0,1 a 50 partes em peso, preferivelmente 1 a 30 partes em peso, e mais preferivelmente 5 a 20 partes em peso, por 100 partes em peso do conjunto das Componentes (A) a (C). 0 Veículo 1 pode ainda conter um lípido membrana-fusogénico (lípido auxiliar) caso seja necessário. Quando o Veículo 1 contiver um lípido membrana-fusogénico, ele apresenta melhor eficiência na transferência intracelular do ácido nucleico. Incluem-se nos exemplos destes lípidos que se podem fundir com a membrana a dioleoílfosfatidiletanolamina, a dioleoílfosfatidilcolina, a transfosfatidilfosfatidiletanolamina, a 1,2-bis-(10,12-tricosadinoi1)-fosfoetanolamina, a 1,2-dielaidoílfosfoetanolamina, a 1,2-dihexadecilfosfoetanolamina, a 1,2- 26 26 1,2-1/2-1/2-1/2-1,2-1,2-1,2-1,2- a l-palmitoíl-2- 1-palmitoí1-2-(10,12-a 1,2- a a a a a a a dihexanoílfosfoetanolamina, dilauroílfosfoetanolamina, dilinoleoílfosfoetanolamina, dimiristoílfosfoetanolamina, dioleoílfosfoetanolamina, dipalmitoleoílfosfoetanolamina, dipalmitoilfosfoetanolamina, difitanoílfosfoetanolamina, diestearoílfosfoetanolamina, oleoilfosfoetanolamina, a tricosadinoí1)fosfoetanolamina, dioleoilfosfoetanolamina-N-caproilamine, a 1,2- dipalmitoílfosfoetanolamina-N-caproílamina, a N,N-dimetil-1,2-dioleoílfosfoetanolamina, a N,N-dimetil-l,2- dipalmitoílfosfoetanolamina, a N-dodecanoí1-1,2- dipalmitoílfosfoetanolamina, a N-dodecanoí1-1,2- dioleoílfosfoetanolamina, a 1,2-dioleoílfosfoetanolamina-N-dodecanilamina, a 1,2-dipalmitoílfosfoetanolamina-N- dodecanilamina, a N-glutaril-1,2-dioleoílfosfoetanolamina, a N-glutaril-1,2-dipalmitoílfosfoetanolamina, a 1,2-dioleoílfosfoetanolamina-N-lactose, a 1,2- dioleoílfosfoetanolamina-N-[4(p- maleimidametil)ciclohexanocarboxilato] , a dipalmitoilfosfoetanolamina-N-[4(p- maleimidametil)ciclohexano-carboxilato] , a 1,2- dipalmitoílfosfoetanolamina-N-[4(p- maleimidafenil)butilamida], a 1,2-dioleoílfosfoetanolamina-N-[4(p-maleimidafenil)butirato], a 1,2- N-metil- dioleoílfosfoetanolamina, a N-metil- 27 dipalmitoílfosfoetanolamina, a 1,2- dioleoílfosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato], a 1,2-dipalmitoílfosfoetanolamina-N-[3-(2- piridilditio)propionato], a 1,2-dioleoílfosfoetanolamina-N-(succinil), a 1,2-dipalmitoílfosfoetanolamina-N-(succinil), etc. Ente estes lípidos, pode utilizar-se vantajosamente a dioleoílfosfatidiletanolamina no Veículo 1.

Quando estiver presente um dos lípidos que favorece a fusão com a membrana, a proporção em que está presente não tem qualquer limitação, desde que os efeitos da invenção presente não sejam prejudicados, e pode ser, por exemplo, de 1 a 500 partes em peso, preferivelmente 10 a 250 partes em peso, e mais preferivelmente 25 a 100 partes em peso, por 100 partes em peso do total das Componentes (A) a (C). O Veículo 1 pode conter diversos aditivos tais como agentes de isotonicidade, excipientes, diluentes, espessantes, estabilizadores, tampões, conservantes, etc.; e/ou veículos aquosos tais como água purificada, soluções aquosas de açúcares, soluções tampão, soro salino fisiológico, soluções aquosas de polímeros, água isenta de RNase, etc.; consoante a forma de utilização. As quantidades destes aditivos e veículos aquosos a adicionar podem ser adequadamente seleccionadas consoante a forma de utilização do veículo para transferência do ácido nucleico. 28

Forma do Veiculo de Transferência do Acido

Nucleico A forma do veículo de transferência do ácido nucleico não tem qualquer limitação, desde que o ácido nucleico que há que transferir para dentro de uma célula consiga ser encapsulado, mas assume preferivelmente a forma de um lipossoma. Por exemplo, quando o Veículo 1 existe sob a forma de um lipossoma, as Componentes (A) a (C) , e os outros lipidos opcionalmente utilizados formam uma membrana lipossomal.

Quando o veiculo de transferência do ácido nucleico assume a forma de um lipossoma, pode tratar-se de uma pequena vesícula unilamelar (SUV), de uma grande vesícula unilamelar (LUV), ou de uma vesícula multilamelar (MLV) . 0 diâmetro de partícula do veículo de transferência do ácido nucleico pode ser adequadamente seleccionado consoante o tipo de célula para a qual o ácido nucleico é transferido, e pode ser, por exemplo, de entre cerca de 20 e cerca de 100 nm para um SUV, de entre cerca de 200 e cerca de 1.000 nm para um LUV, e de entre cerca de 400 e cerca de 3.500 nm para um MLV. O diâmetro de partícula do lipossoma é medido utilizando um método de dispersão dinâmica de luz de laser.

Podem utilizar-se métodos conhecidos na técnica para produzir o lipossoma e para ajustar o diâmetro de partícula deste lipossoma. Por exemplo, no casa do Veículo 29 1, pode formar-se um lipossoma por um método de película fina, por um método de evaporação em fase reversa, por um método de injecção de éter, um método envolvendo um tensioactivo, e um método de aquecimento, ou outros semelhantes, utilizando uma fase oleosa contendo as

Componentes (A) a (C) e uma fase aquosa (veículo aquoso). Pode ajustar-se o diâmetro de partícula por um método de extrusão, por um método utilizando uma prensa Francesa, por um método de homogeneização, ou outros semelhantes.

Forma, Formulação, e Método de Utilização da

Composição para Transferir Ácido Nucleico

Quando o veículo de transferência de ácido nucleico assume a forma de um lipossoma, o complexo de ácido nucleico na composição de transferência de ácido nucleico da invenção presente pode estar presente num estado encapsulado na fase aquosa interna do lipossoma, ou num estado ligado à superfície interna ou externa da membrana lipossomal através de uma ligação iónica ou hidrofóbica. Quando o veículo de transferência do ácido nucleico assumir uma forma que não seja a de um lipossoma, o complexo de ácido nucleico na composição de transferência do ácido da invenção presente forma um complexo com as componentes do veículo do ácido nucleico através de uma ligação iónica ou hidrofóbica. A composição de transferência do ácido nucleico da invenção presente é produzida misturando o complexo de 30 ácido nucleico com o veiculo de transferência do ácido nucleico e formulando a mistura sob a forma pretendida, ou misturando as componentes do complexo de ácido nucleico e a composição de veiculo de transferência do ácido nucleico por uma ordem arbitrária e formulando a mistura sob uma forma pretendida.

Na composição de transferência do ácido nucleico da invenção presente, a razão entre o complexo de ácido nucleico e o veiculo de transferência de ácido nucleico depende do tipo de complexo de ácido nucleico, do tipo de veiculo de transferência de ácido nucleico, e do tipo de célula para a qual o ácido nucleico é transferido, etc. A razão pode ser, por exemplo, de 1 a 100 partes em peso, preferivelmente 10 a 100 partes em peso, e mais preferivelmente 20 a 100 partes em peso, do complexo de ácido nucleico por 100 partes em peso da quantidade total do veiculo de transferência de ácido nucleico. Mais especificamente, quando o Veiculo 1 é utilizado a titulo de veiculo de transferência do ácido nucleico, a razão pode ser, por exemplo, de 1 a 100 partes em peso, preferivelmente 10 a 100 partes em peso, e mais preferivelmente 20 a 100 partes em peso, do complexo de ácido nucleico por 100 partes em peso da quantidade total das Componentes (A) a (C) contida no Veiculo 1.

Além disto, quando se utiliza o Veiculo 1 a titulo de veiculo de transferência do ácido nucleico, a quantidade total das Componentes (A) a (C) contidas no 31 veículo 1 pode ser, por exemplo, de 10 a 90 %, em peso, preferivelmente 30 a 80 %, em peso, e mais preferivelmente 40 a 60 %, em peso, em relação á quantidade total da composição de transferência do ácido nucleico. A composição de transferência de ácido nucleico da invenção presente pode conter diversos aditivos tais como agentes de isotonificação, excipientes, diluentes, espessantes, estabilizadores, tampões, conservantes, etc.; e/ou veículos aquosos tais como água purificada, soluções aquosas de glucose, soluções tampão, soro salino fisiológico, etc.; consoante a forma de utilização. As quantidades destes aditivos e destes veículos aquosos podem ser adequadamente seleccionadas consoante a forma de utilização da composição de transferência do ácido nucleico. A composição de transferência do ácido nucleico da invenção presente pode ser utilizada por si própria a título de fármaco em terapia genética, isto é, como uma composição farmacêutica. Quando a composição de transferência do ácido nucleico da invenção presente for utilizada a título de composição farmacêutica, são seleccionados um veículo de transferência de ácido nucleico, uma base, um veículo, etc. que sejam farmacologicamente aceitáveis. Pode formular-se a composição de transferência da invenção presente sob diversas formas farmacêuticas. Incluem-se nos exemplos das formas da composição farmacêutica da invenção presente 32 preparações líquidas tais como soluções (incluindo xaropes e outras semelhantes), gotas, injecções, etc./ e preparações sólidas tais como comprimidos, pílulas, pós, grânulos, cápsulas (incluindo cápsulas moles), etc. Quando a composição farmacêutica da invenção presente é uma preparação líquida, ela pode ser conservada por congelação ou por liofilização ou outro processo semelhante para remover água. As preparações liofilizadas, xaropes secos, etc., podem voltar a ser dissolvidas em água destilada para injecção na altura da utilização, em água esterilizada, etc. Quando uma composição farmacêutica da invenção presente é uma preparação sólida, ela pode voltar a ser dissolvida na altura da utilização, em água destilada para injecção, em água esterilizada, etc.

Na invenção presente, a célula para a qual um ácido nucleico é transferido, isto é, a célula para a qual uma composição farmacêutica da invenção presente se aplica, não tem qualquer limitação, e pode tratar-se de uma célula de cultura, de uma célula isolada de um organismo (incluindo linhas de células conhecidas), uma célula in vivo, etc., e pode ser derivada de um ser humano ou de um animal não humano. A composição farmacêutica da invenção presente pode ser aplicada quer in vitro, quer in vivo.

Na invenção presente, pode transferir-se um ácido nucleico para uma célula por um passo em que se leva a composição farmacêutica da invenção presente ao contacto com a célula. 0 método para proporcionar o contacto entre a 33 composição farmacêutica e uma célula não tem qualquer limitação, desde que seja proporcionado o contacto entre uma quantidade adequada da composição farmacêutica de transferência do ácido nucleico e a célula na qual se pretende introduzir o ácido nucleico. Por exemplo, o método pode ser o mesmo que um método já hoje em dia conhecido em terapia genética, e o mesmo se aplica à quantidade que é levada ao contacto: o método e a quantidade são adequadamente seleccionadas. Deste modo, uma aplicação da composição farmacêutica da invenção presente a uma célula permite a transferência intracelular fácil de um ácido nucleico, e mantém o ácido nucleico transferido de uma forma estável e persistente na célula.

Por exemplo, para se proporcionar o contacto entre a composição farmacêutica da invenção presente e uma célula in vitro, pode fazer-se uma cultura da célula na presença de uma quantidade adequada da composição farmacêutica. Para se levar a composição farmacêutica da invenção presente ao contacto in vitro com uma cultura de uma célula ou com uma célula isolada de um organismo, pode estabelecer-se o contacto na presença de soro de sangue. Quando se estabelece o contacto entre a composição farmacêutica da invenção presente e uma célula in vivo, pode levar-se a composição farmacêutica da invenção presente ao contacto com a célula, por exemplo, por injecção directa num tecido; injecção endovenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, ou intraocular, ou por injecção no tracto digestivo, num dente, ou outro 34 órgão semelhante; administração na cavidade nasal ou na cavidade oral por inalação, ou ainda nos pulmões, ou noutro órgão semelhante; por administração oral; por administração transdérmica; por administração transmucosal através da mucosa oral, da mucosa vaginal, da mucosa ocular, da mucosa rectal, ou da mucosa uterina; ou outra semelhante. A composição farmacêutica da invenção presente pode também conter, caso tal seja necessário, um veiculo ou uma base farmacologicamente aceitáveis. 0 veiculo e a base are não têm qualquer limitação desde que os efeitos da invenção presente não sejam prejudicados, e são adequadamente seleccionados de acordo com a forma de utilização. Incluem-se nos exemplos aqueles que se mencionaram acima. Neste caso, as proporções da composição farmacêutica, do veiculo, e da base também não têm qualquer limitação desde que os efeitos da invenção presente não sejam prejudicados, e desde que se j am adequadamente seleccionadas consoante a forma de utilização.

Na aplicação da composição farmacêutica da invenção presente, aplica-se uma quantidade eficaz desta composição. Por exemplo, aplica-se a composição farmacêutica numa quantidade tal que o complexo de ácido nucleico que contém seja aplicado numa quantidade de entre 0,001 e 10 pM, preferivelmente entre 0,001 e 1 pM, e mais preferivelmente entre 0,01 e 0,1 pM, por célula. 35 A composição farmacêutica da invenção presente é capaz de transferir um ácido nucleico especifico para dentro de uma célula. Isto é, a composição farmacêutica da invenção presente é eficaz em transferir para dentro de uma célula um ácido nucleico especifico que está presente na composição farmacêutica e que forma o complexo de ácido nucleico, quando se leva a composição farmacêutica ao contacto com a célula. A invenção presente também proporciona um método para se transferir um ácido nucleico para dentro de uma célula. 0 método para transferir um ácido nucleico para uma célula, consoante a invenção presente, inclui o passo de se proporcionar o contacto entre o complexo de ácido nucleico ou a composição de transferência do ácido nucleico e a célula. 0 contacto entre o complexo de ácido nucleico ou a composição de transferência do ácido nucleico e a célula não tem qualquer limitação, desde que se leve ao contacto uma quantidade adequada do complexo de ácido nucleico ou da composição de transferência de ácido nucleico com a célula dentro da qual de pretende introduzir um ácido nucleico. Por exemplo, pode conseguir-se este contacto usando o mesmo modo que o que já era conhecido anteriormente na terapia genética, e o mesmo se aplica à quantidade que há que levar ao contacto: o modo e a quantidade de contacto são seleccionados adequadamente.

Levando o complexo de ácido nucleico ou a composição de transferência de ácido nucleico ao contacto 36 com uma célula, do modo descrito acima, o ácido nucleico pode ser mantido de uma forma estável e persistente na célula. Para o contacto com a célula, pode utilizar-se o complexo de ácido nucleico por si próprio ou em combinação com um veiculo ou com uma base tal como se descreveu acima. A composição de transferência de ácido nucleico também pode ser utilizada por si própria ou em combinação com um veiculo ou com uma base tal como se descreveu acima. Para uma transferência intracelular mais eficiente do ácido nucleico, é preferível levar a composição de transferência do ácido nucleico ao contacto com a célula.

Na invenção presente, tal como se mencionou acima, a célula para dentro da qual se transfere um ácido nucleico não tem qualquer limitação, e pode tratar-se de uma célula em cultura, uma célula isolada de um organismo (incluindo as linhas de células já conhecidas), uma célula in vivo, ou outras semelhantes, podendo ser derivada de um ser humano ou de um animal não humano. 0 contacto a que se fez referência acima pode ser conseguido in vitro ou in vi vo.

Por exemplo, para se levar o complexo de ácido nucleico ou a composição de transferência do ácido nucleico ao contacto com uma célula in vitro, pode submeter-se a célula a uma cultura na presença de uma quantidade adequada do complexo de ácido nucleico ou da composição de transferência do ácido nucleico. Para se levar o complexo de ácido nucleico ou a composição de transferência do ácido 37 nucleico ao contacto in vitro com uma célula em cultura ou com uma célula isolada de um organismo, pode estabelecer-se o contacto na presença de soro de sangue. Quando o complexo de ácido nucleico ou a composição de transferência de ácido nucleico é levada ao contacto com uma célula in vivo, o complexo de ácido nucleico ou a composição de transferência de ácido nucleico pode ser levada ao contacto com a célula através de, por exemplo, uma injecção directa num tecido; uma injecção endovenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, ou intraocular, ou uma injecção no tracto digestivo, num dente, ou outras semelhantes; uma administração por inalação à cavidade nasal, à cavidade oral, nos pulmões, ou outra semelhante; uma administração oral; uma administração transdérmica; uma administração transmucosal através da mucosa oral, da mucosa vaginal, da mucosa ocular, da mucosa rectal, ou da mucosa uterina; ou outras semelhantes.

No método para a transferência de ácido nucleico para dentro de uma célula de acordo com a invenção presente, leva-se uma quantidade eficaz do complexo de ácido nucleico ou da composição de transferência de ácido nucleico ao contacto com uma célula para se introduzir o ácido nucleico para dentro da célula. Por exemplo, a quantidade de complexo de ácido nucleico ou da composição para transferência de ácido nucleico que se vai administrar deve ser seleccionada de tal forma que entre 0,001 e 10 pM, preferivelmente entre 0,001 e 1 pM, e mais preferivelmente 38 entre 0,01 e 0,1 pM do complexo de ácido nucleico seja administrado a cada célula. O método de transferir um ácido nucleico para dentro de uma célula de acordo com a invenção presente pode ser levado a cabo levando a composição farmacêutica ao contacto com a célula. Quando se utiliza a composição farmacêutica, o método da invenção presente pode ser conduzido de um modo igual ao que se descreveu acima.

EXEMPLOS

Descrever-se-á agora a invenção em pormenor com base em Exemplos e outros semelhantes, mas a invenção não se limita a eles. Nos Exemplos e Exemplos de Teste que se seguem, utilizou-se a titulo de siARN a GL3-SÍARN (siARN da luciferase do pirilampo; Dharmacon Research, Inc., (Boulder, CO) , USA; sentido directo: 5'- CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT, sentido reverso: 5'- UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT). Utilizou-se a título de dextrina cíclica altamente ramificada uma dextrina agregada (Ezaki Glico Co., Ltd.).

Exemplo 1

Preparação de um Complexo contendo siARN e

Dextrina Ciclica Altamente Ramificada 39

Preparou-se uma solução contendo uma concentração de 2 μΜ de siARN (solução de siARN) utilizando uma solução de tampão Tris-EDTA (TE) (produzida pela Fluka Co., Ltd. Além disto, preparou-se uma solução contendo uma dextrina cíclica altamente ramificada com uma concentração de 25 μΜ (solução de dextrina cíclica altamente ramificada) partindo de uma solução tampão de Tris-EDTA (TE) (produzida pela Fluka). Misturaram-se volumes iguais de ambas estas soluções durante um minuto para se formar um complexo de siARN. A Tabela 1 mostra as propriedades do complexo de siARN que se obteve.

Tabela 1

Diâmetro de Partícula Potencial Zeta (nm) (mV)

Complexo 31,1 -42,9 # 0 diâmetro de partícula que se apresenta é um diâmetro médio de partícula (nm) medido utilizando um ZETASIZER 3000HSA (MALVERN INSTRUMENT) (o diâmetro de partícula médio em volume foi medido utilizando um método de difracção de laser) . 0 potencial Zeta foi medido utilizando um ZETASIZER 3000HSA (MALVERN INSTRUMENT).

Exemplo 2

Preparação de uma Composição de Transferência de Ácido Nucleico contendo um Complexo de siARN

Pesaram-se distearoílfosfatidilcolina (DSPC) , colesterol, e estearilamina a razões molares de 7:3:1, e dissolveu-se em clorofórmio utilizando um balão em forma de 40 pêra (balão de recuperação). Secou-se a solução sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se formar uma camada membranar lipídica fina. Adicionou-se uma solução contendo 0,028 mg/mL de um complexo de siARN obtido no Exemplo 1 à membrana lipidica fina resultante, de modo a que a solução tivesse uma concentração em DSPC de 30 mg/mL, e depois misturou-se. Em seguida, ajustou-se o diâmetro das partículas da solução passando a solução através de membranas com diâmetros de poro de 800 nm e de 200 nm, utilizando uma extrusora, para se preparar uma composição para a transferência de siARN sob a forma de um lipossoma catiónico. A composição resultante para a transferência de siARN apresentava um diâmetro de partícula de cerca de 200 nm, e uma forma de lipossoma no qual as partículas

apresentavam uma dimensão de partícula uniforme. A composição apresentava um potencial zeta de cerca de 50 mV. 0 diâmetro de partícula ilustrado é um diâmetro médio de partícula (nm) medido utilizando um ZETASIZER 3000HSA (MALVERN INSTRUMENT) (o diâmetro médio das partículas em volume foi medido utilizando um método de difracção de

laser). Mediu-se o potencial Zeta utilizando um ZETASIZER 3000HSA (MALVERN INSTRUMENT).

Exemplo 3

Preparação de uma Composição de Transferência de Ácido Nucleico contendo um Complexo de siARN 41

Preparou-se uma composição de transferência de ácido nucleico sob uma forma de lipossoma catiónico do mesmo modo que no Exemplo 2, excepto que a razão entre DSPC, colesterol, e estearilamina era de 7:3: 2. Tal como no Exemplo 2, a composição resultante para a transferência de siARN apresentava um diâmetro de partícula de cerca de 200 nm, e uma forma de um lipossoma no qual as partículas denotavam uma dimensão de partícula uniforme. A composição apresentava um potencial zeta de cerca de 50 mV.

Exemplo de Teste 1

Avaliação da Eficiência da Inclusão do siARN

Preparou-se um complexo de siARN marcado com FITC do mesmo modo que no Exemplo 1 acima, utilizando siARN previamente marcado com FITC. Utilizando o complexo de siARN marcado com FITC, preparou-se a composição de transferência de ácido nucleico sob a forma de um lipossoma catiónico nas mesmas condições que se utilizaram nos Exemplos 2 e 3. A composição de transferência do siARN foi precipitada por centrifugação logo após a sua preparação (a 75.000 rpm durante 1 hora), e mediu-se a fluorescência do siARN marcado com FITC presente no seu sobrenadante para se calcular a eficiência da inclusão do siARN (uma taxa (%) do siARN incluído dentro do lipossoma, em relação ao siARN total) . 42

Em resultado disto, a eficiência de inclusão do siARN indicava teores elevados de 97,2 % quando era preparada nas mesmas condições que o Exemplo 2, e de 99,8 % quando era preparada em condições iguais às da preparação do Exemplo 3. Isto revela que o complexo de ácido nucleico da invenção possui a caracteristica de ser eficientemente introduzido num veiculo para a transferência de ácido nucleico sob a forma de um lipossoma. Embora não se pretenda uma interpretação restritiva, isto deve-se presumivelmente ao facto de a dextrina cíclica altamente ramificada formar um complexo compacto com o siARN.

Exemplo de Teste 2

Teste de Avaliação da Segurança Celular

Levou-se a cabo uma avaliação utilizando um ensaio MTS. Utilizou-se um Ensaio de Proliferação de Uma Célula em Solução Aquosa CellTiter 96 (CellTiter 96 Aqueous One

Solution Cell Proliferation Assay) produzido pela Promega Corporation para o ensaio MTS. Especificamente, inocularam-se células A594 (ATCC, USA) a 3,16 *104 células/poço em 200 pL de Meio Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM) contendo 10 %, em volume, de soro fetal de bovino (FBS) numa placa de 96 poços, e incubou-se a 37°C durante 24 horas. Depois de se lavar com Solução Balanceada de Sais de Hank (HBSS) por três vezes, mudou-se o meio para DMEM isento de FBS. Adicionou-se uma quantidade de 2 0 pL por poço de cada uma das composições de transferência de ácido nucleico e 43 incubou-se a 37 °C sob 5 % de C02 durante 4 horas. Em seguida, mudou-se o sobrenadante da cultura das células nos poços para DMEM com 10 %, em volume, de FBS, e incubou-se a 37 °C sob 5 % de CO2 durante 20 horas mais uma vez. Adicionou-se a cada poço vinte pL de um reagente MTS (sal de tetrazólio) e 100 pL de um meio DMEM com 10 %, em volume, de FBS, e incubou-se durante duas horas.

Determinou-se então a absorvância a 492 nm, e calculou-se a viabilidade das células. Calculou-se a viabilidade das células ajustando a 100 % a absorvância a 492 nm determinada sem se adicionar a composição de transferência de ácido nucleico, que se incubara nas condições acima. A Fig. 2 mostra os resultados. Tal como se ilustra na Fig. 2, tornou-se aparente que todas as composições para transferência de ácido nucleico dos Exemplos 2 e 3 têm uma pequena toxicidade e são altamente seguras. Em especial, confirmou-se que as composições de transferência de ácido nucleico dos Exemplos 2 e 3 demonstravam um nível significativo de segurança.

Exemplo de Teste 3

Teste de Avaliação da Eficiência da Transferência de siARN para Células

Avaliou-se a eficiência da introdução de siARN em células medindo a intensidade da fluorescência de siARN marcado com FITC recorrendo à citometria de fluxo. Neste 44 teste, utilizou-se uma composição para transferência de ácido nucleico preparada com siARN previamente marcado com FITC. Especificamente, inoculou-se em células A594 (ATCC, USA) 5 x 105 células/poço em 500 pL de DMEM contendo 10 %, em volume, de FBS, numa placa de 24 poços, e incubou-se a 37 °C sob 5 % de CO2 durante 24 horas. Depois de se lavar por três vezes com HBSS, adicionou-se 0, 95 mL de DMEM isento de FBS. Adicionou-se a cada poço 0,05 mL de cada uma das composições de transferência de ácido nucleico dos Exemplos 1 e 2, e incubou-se a 37°C sob 5 % de CO2 durante 4 horas. Em seguida, alterou-se o sobrenadante da cultura nos poços para DMEM contendo 10 %, em volume, de FBS e incubou-se mais uma vez a 37°C sob 5 % de CO2 durante 20 horas. Lavaram-se os poços com HBSS uma vez, e adicionou-se-lhes 0,2 mL de Tampão CellScrub (produzido pela Gene Therapy Systems, Inc.). Levou-se a cabo a incubação a 37°C sob 5 % de CO2 durante 15 minutos. Mais uma vez, lavaram-se os poços com HBSS por duas vezes, e soltaram-se as células agarradas ao fundo de cada poço utilizando tripsina, recolhendo-se por centrifugação. Suspenderam-se as células resultantes em HBSS. Filtrou-se a suspensão através de uma membrana com um diâmetro de poro de 41 pm. Mediu-se a fluorescência das células utilizando citometria de fluxo às 2 horas, às 12 horas e às 24 horas após adição da composição de transferência do ácido nucleico. A titulo de controlo, mediu-se a fluorescência das células de mesmo modo que se descreveu acima, utilizando como controlo uma composição para transferência de ácido nucleico obtida misturando uma solução de Lipofectamine 2000™ (produzida 45 pela Invitrogen Corporation), habitualmente utilizada a titulo de vector de um gene disponível no comércio, diluída com meio OptiMEM até 0,1 mg/mL, e uma solução de siARN na qual o siARN havia sido diluído com tampão TE até uma concentração 2 μΜ numa razão de volumes de 1:1. A FIG. 3 mostra os resultados. Confirmou-se a partir dos resultados que o siARN se mantinha persistentemente, mantendo-se constante a sua concentração nas células em qualquer um dos casos para as composições de transferência de ácido nucleico dos Exemplos 1 e 2. De forma oposta, as composições de controlo para transferência de ácido nucleico evidenciavam não só uma pequena eficiência da transferência inicial intracelular de siARN, como também uma diminuição do siARN intracelular ao longo do tempo, resultando em quantidades de siARN insuficientes nas células às 12 horas, e às 24 horas após a adição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra um exemplo da dextrina cíclica altamente ramificada. A Fig. 2 mostra os resultados do Exemplo de Teste 2, isto é, os resultados da avaliação das composições para a transferência de ácido nucleico em termos de segurança celular. A Fig. 3 mostra os resultados da avaliação da introdução do siARN em células, mediada por cada uma das composições de transferência de ácido 46 nucleico do Exemplo de Teste 3. A ordenada na Fig. 3 indica a intensidade média de fluorescência por cada célula.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO. , LTD. <110> TAKEUCHI, Hirofumi

<120> COMPLEXO DE ÁCIDO E COMPOSIÇÃO PARA TRANSFERÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO <130> P08-118 <150> JP2007- 291317 <151> 2007-11 -08 <160> 2 <17 0> Patente na versão 3.1 <210> 1 <211> 21 <212> ARN <213> Artific ial <22 0> <223> Cadeia de sentido directo pirilampo da luciferase do 47 <22 0> <221> caracteristica miscelânea <222> (20) . . (21) <223> n é dT <4 0 0> 1 cuuacgcuga guacuucgann 21 <210> 2 <211> 21 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> Cadeia de sentido reverso de luciferase de pirilampo <22 0> <221> caracteristica miscelânea <222> (20) . . (21)

<223> n é dT <400> 2 ucgaaguacu cagcguaagnn 21

Lisboa, 28 de Outubro de 2011.

Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um complexo de ácido nucleico que inclua um ácido nucleico e uma dextrina cíclica altamente ramificada, em que a dextrina cíclica altamente ramificada seja uma glucana com um grau de polimerização de 50 a 5.000 contendo uma porção interna com uma estrutura cíclica, formada por ligações glucosídicas a-1,4 e pelo menos uma ligação glucosídica oí-1,6, e uma porção externa com uma estrutura ramificada, ligada à porção interna com uma estrutura cíclica.

2. 0 complexo de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, no qual a quantidade da dextrina com uma estrutura cíclica altamente ramificada seja de entre 1 e 4.000 partes em peso, por parte em peso do ácido nucleico.

3. 0 complexo de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou a 2, no qual o ácido nucleico seja siARN.

4. O complexo de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que seja um agregado obtido misturando um ácido nucleico com uma dextrina cíclica altamente ramificada, numa solução aquosa.

5. Uma composição para transferência de ácido nucleico que inclua o complexo de ácido nucleico de acordo 2 com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um veiculo para transferência do ácido nucleico.

6. A composição para transferência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, na qual o veiculo de transferência de ácido nucleico seja uma composição incluindo (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) pelo menos um membro seleccionado de entre o colesterol e os lípidos catiónicos com um esqueleto de colesterol, e (C) uma amina primária alifática.

7. A composição de transferência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, na qual a Componente (A) do veiculo de transferência do ácido nucleico seja uma diacilfosfatidilcolina na qual a espécie acilo possua 4 a 23 átomos de carbono. de transferência de ácido reivindicação 6, na qual a de transferência de ácido de transferência de ácido reivindicação 6, na qual a de transferência do ácido contendo 10 a 20 átomos de

8. A composição nucleico de acordo com a Componente (B) do veiculo nucleico seja o colesterol.

9. A composição nucleico de acordo com a Componente (C) do veiculo nucleico seja uma alquilamina carbono.

10. A composição de transferência de ácido 3 nucleico de acordo com a reivindicação 6, na qual a razão molar das Componentes (A):(B):(C) seja de 5-9:1-5:1.

11. A composição de transferência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, na qual o veiculo de transferência de ácido nucleico seja uma preparação de lipossoma na qual uma membrana lipossomal seja formada a partir das Componentes (A) a (C).

12. A composição de transferência de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, para transferir um ácido nucleico para uma célula.

13. Uma composição farmacêutica incluindo a composição de transferência de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11.

14. A utilização da composição de transferência de ácido nucleico ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, para se produzir um fármaco para transferir um ácido nucleico para uma célula. Lisboa, 28 de Outubro de 2011.