CN101854918A - 核酸复合体及核酸转运用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种低毒性且高安全性的、可以将siRNA等核酸持续地保持在细胞内的核酸复合体；以及能够有效地将核酸复合体转运至细胞内的核酸转运用组合物。通过使用导入细胞内的核酸与高支化环糊精形成复合体，可以得到低毒性且高安全性的、可以将核酸持续地保持在细胞内的核酸复合体。进而，通过使用含有下述物质的载体作为用于将该核酸复合体导入细胞内的核酸转运用载体，可以进一步提高安全性、细胞内转运的有效性、及细胞内核酸的持续性，所述物质包括：(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物、及(C)脂肪族伯胺。

Description

核酸复合体及核酸转运用组合物
技术领域
本发明涉及一种可持续地滞留在细胞内、低毒性且高安全性的核酸复合体，及核酸转运用组合物。
背景技术
近年，随着生物技术的发展，已经发现了多种在细胞内发挥生理活性功能的核酸。例如已知siRNA(small interfering RNA：小干涉RNA)可引起存在于细胞内的靶基因的mRNA分解，阻碍靶基因表达(RNAinterference：RNA干涉)。由此RNA干涉产生的阻碍靶基因表达的功能，在缓解或治疗由特定的基因或基因组的异常表达而引起的疾病症状方面是有用的，故人们期待将siRNA开发用作治疗药。但是，在包括siRNA治疗的基因治疗中，由于核酸是具有负电荷的水溶性高分子，所以其具有非常低的向细胞内的基因转运效率，导致无法得到有效的治疗效果。
目前，为了有效地将基因转运至细胞内，已知有利用载体(运载体)的技术。运载体分为病毒性运载体及非病毒性运载体。病毒性运载体显示出高核酸导入效率，但是在病原性、免疫原性及细胞毒性等安全性方面存在许多不明之处。因此，在临床应用中期待使用非病毒性运载体。
非病毒性运载体的例子包括已经市售的Lipofectamine TM2000。进而，报道了一种具有特定结构的阳离子性脂质(参见专利文献1)；一种含有两亲性化合物及聚阳离子的组合物(参见专利文献2)。利用非病毒性运载体将核酸转运至细胞内如下进行：首先将应转运的核酸与非病毒性运载体混合形成复合体，然后使该复合体与靶细胞接触。非病毒性运载体可以形成脂质体时，核酸在被封入脂质体内的状态下参入到细胞内，从而使核酸转运至细胞内。
但是，siRNA等核酸具有稳定性低、电荷强的特有的性质。因此，核酸与非病毒性运载体混合时，导致稳定性降低、持续的核酸向细胞内的导入被抑制。虽然已知通过形成siRNA与阳离子性聚合物的复合体将核酸封入脂质体内的例子(参见非专利文献1)，但从阳离子性聚合物的细胞毒性的观点考虑，一般认为在实用性上并不可用。进而，即使利用核酸与现有的非病毒性运载体形成稳定的复合体时，该复合体也可能具有低的向细胞内的转运能力或者可能迅速地被转运到细胞内。因此，上述现有的非病毒性运载体无法将核酸持续地保持在细胞内，无法发挥基于核酸的所期望的效果。
鉴于上述现有技术，迫切期望开发出一种低毒性且高安全性、能有效地将核酸(例如siRNA)转运至细胞内、并且持续地保持核酸的技术。
专利文献1：日本特表2002-529439号公报
专利文献2：日本特表2005-508394号公报
非专利文献1：Kentaro Kogure et al.，Development of a non-viral-multifunctional-envelope-type nano device by a novel lipid filmhydration method，J.Control.Release，98(2004)317-323
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术课题。具体而言，本发明的目的在于提供一种低毒性且高安全性的、可以将siRNA等核酸持续地保持在细胞内的核酸复合体，以及能够有效地将核酸复合体转运至细胞内的核酸转运用组合物。本发明的另一个目的在于提供一种含有核酸转运用组合物的药物组合物，以及通过使核酸转运用组合物与细胞接触，将核酸转运至细胞内的方法。
本发明人等为了解决上述问题，经过反复研究，结果发现通过使用导入细胞内的核酸与高支化环糊精形成复合体，可以得到低毒性且高安全性的、能够将核酸持续地保持在细胞内的核酸复合体。本发明人等还发现通过使用含有下述物质的载体作为用于将该核酸复合体导入细胞内的核酸转运用载体，可以进一步提高安全性、细胞内转运的有效性及细胞内核酸的持续性，所述物质包括：(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物、以及(C)脂肪族伯胺。本发明是基于上述发现通过进一步深入研究而完成的。
本发明提供下述项：
项1、一种核酸复合体，其特征在于，含有核酸及高支化环糊精。
项2、如项1所述的核酸复合体，其中，相对于1重量份核酸，高支化环糊精的量为1～4000重量份。
项3、如项1或2所述的核酸复合体，其中，核酸为siRNA。
项4、如项1～3中任一项所述的核酸复合体，其中，高支化环糊精是具有内支环结构部分和外支化结构部分的、聚合度为50～5000的葡聚糖，所述内支环结构部分由α-1，4-糖苷键及至少一个α-1，6-糖苷键形成，所述外支化结构部分与所述内支环结构部分连接。
项5、如项1～4中任一项所述的核酸复合体，上述核酸复合体是通过将核酸与高支化环糊精在水溶液中混合而得到的聚集体。
项6、一种核酸转运用组合物，含有项1～5中任一项所述的核酸复合体及核酸转运用载体。
项7、如项6所述的核酸转运用组合物，其中，核酸转运用载体为含有下述物质的组合物：
(A)二酰基磷脂酰胆碱；
(B)选自胆固醇及其衍生物中的至少一种；及
(C)脂肪族伯胺。
项8、如项7所述的核酸转运用组合物，其中，核酸转运用载体中的成分(A)为酰基部分的碳原子数为4～23的二酰基磷脂酰胆碱。
项9、如项7所述的核酸转运用组合物，其中，核酸转运用载体中的成分(B)为胆固醇。
项10、如项7所述的核酸转运用组合物，其中，核酸转运用载体中的成分(C)为碳原子数为10～20的烷基胺。
项11、如项7所述的核酸转运用组合物，其中，成分(A)∶成分(B)∶成分(C)的摩尔比为5～9∶1～5∶1。
项12、如项7所述的核酸转运用组合物，其中，所述核酸转运用载体是由成分(A)～(C)形成脂质体膜的脂质体制剂。
项13、一种药物组合物，含有项6～12中任一项所述的核酸转运用组合物。
项14、如项13所述的药物组合物，其中，核酸为siRNA。
项15、项6～12中任一项所述的核酸转运用组合物在制备用于将核酸转运至细胞内的药物中的应用。
项16、如项15所述的应用，其中，核酸为siRNA。
项17、一种将核酸转运至细胞内的方法，包括使项6～12中任一项所述的核酸转运用组合物与细胞接触的步骤。
项18、如项17所述的方法，其中，核酸为siRNA。
通过使用高支化环糊精将核酸形成复合体可以得到本发明的核酸复合体，由此可以高安全性、且长时间地将核酸复合体稳定地保持在细胞内，持续地发挥基于该核酸的有用效果。另外，本发明的核酸复合体易于与核酸转运用载体形成复合体，即使为脂质体形态的核酸转运用载体，也易于被封入其中。因此从核酸转运用组合物制备的容易性方面考虑，本发明的复合体也优异。进而，本发明的核酸转运用组合物可以将上述核酸复合体导入细胞内。
为了将本发明的核酸复合体转运至细胞内，通过使用含有下述物质的载体作为细胞转运用载体，可以提高核酸复合体向细胞内的转运效率，并且可以进一步提高向细胞内转运的持续性及安全性，所述物质包括：(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物、以及(C)脂肪族伯胺。
如上所述，本发明的核酸复合体及核酸转运用组合物可以有效且持续地发挥基于该核酸的有用效果，并且具有高安全性，因此该复合体及组合物作为基因治疗中使用的药物特别有用。因此，本发明中的药物组合物或将核酸转运至细胞内的方法可以更有效地将核酸转运至细胞内。
具体实施方式
以下详细地说明本发明。
(1)核酸复合体
本发明的核酸复合体的特征在于含有核酸及高支化环糊精。
本发明的核酸复合体中使用的核酸只要是需要转运至细胞内的核酸即可，对类型或结构没有特别限定。上述核酸的具体例包括siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核酶、反义寡核苷酸、诱饵寡核苷酸(decoy oligonucleotide)、质粒DNA、肽核酸、三链形成性寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides(TFOs))、适体(aptamer)、基因等，其中优选为siRNA。虽然siRNA在与现有的非病毒性运载体的共存的条件下具有稳定性低的缺点，但将siRNA形成为本发明的核酸复合体时，兼有优异的稳定性和持续地向细胞内转运的能力。本发明的核酸复合体中使用的核酸可以是来自人、动物、植物、细菌、病毒等的核酸，或者也可以是通过化学合成制备得到的核酸。上述核酸可以是单链、双链或三链中的任一种，并且对其分子量也没有特别限定。另外，在本发明中，核酸也可以是被化学物质、酶或肽修饰的核酸。进而，在本发明中，核酸可以单独使用，或者也可以组合两种以上进行使用。
本发明的核酸复合体中使用的高支化环糊精是使分支酶作用于例如支链淀粉等具有α-1，4-糖苷键及至少一个α-1，6-糖苷键的糖类而生产得到的，是具有内支环结构(inner branched cyclic structure)部分及外支化结构(outer branched structure)部分的、聚合度为50～5000的葡聚糖。内支环结构部分是由α-1，4-糖苷键及至少一个α-1，6-糖苷键形成的环状结构部分，外支化结构部分是与内支环结构部分连接的非环状结构部分。外支化结构部分通过至少一个α-1，6-糖苷键与内支环结构部分连接。高支化环糊精的优选方案包括：上述葡聚糖的内支环结构部分的聚合度为10～100，上述葡聚糖的外支化结构部分的聚合度为40以上，上述葡聚糖的外支化结构部分的单元链的聚合度的平均值为10～20。上述高支化环糊精例如如图1所示，图1中(i)表示内支环结构部分，(ii)表示外支化结构部分。
可以从已知聚合度的原料的洗脱部位使用差示折光仪采用凝胶过滤测定聚合度。在该测定中，差示折光仪的输出与葡聚糖的浓度成比例，小角激光散射光度计的输出与聚合度的产生及葡聚糖的浓度成比例。因此，葡聚糖的聚合度可以通过测定如差示折光仪及小角激光散射光度计两种检测器的输出比率来确定。具体条件如US6248566B1(日本专利第3107358号)所示。
上述高支化环糊精及其制备方法如US6248566B1(日本专利第3107358号)所示，高支化环糊精由Ezaki Glico株式会社以“ClusterDextrin”为注册商标销售。
本发明的核酸复合体中，上述高支化环糊精与上述核酸的比率没有特别限定，但相对于1重量份核酸，高支化环糊精通常为1～4000重量份，优选为10～1000重量份，更优选为100～400重量份。从摩尔比的观点考虑，作为该比率例如可以举出：相对于1摩尔核酸，高支化环糊精为0.1～1000摩尔、优选为1～100摩尔、更优选为10～20摩尔。通过满足上述比率，可以使通过核酸转运用载体获得的向细胞内转运核酸的持续性、及安全性越发显著。
本发明的核酸复合体的平均粒径通常为6～60nm，优选为8～30nm，更优选为10～20nm。核酸复合体的平均粒径使用激光动态光散射法作为体积平均粒径进行测定。
本发明的核酸复合体是由上述核酸与上述高支化环糊精聚集而形成的复合体。本发明的核酸复合体，通过在可以稳定地分散上述核酸与上述高支化环糊精的溶液中将两者混合进行制备。作为可以稳定地分散上述核酸与上述高支化环糊精的溶液，具体而言可以举出Tris等缓冲液。上述缓冲液可以含有乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂。作为上述核酸与上述高支化环糊精混合的条件，可以举出：在上述溶液中，将例如0.1μM～100μM左右、优选1μM～10μM左右的核酸与1μM～1000μM左右、优选10μM～100μM左右的高支化环糊精，在室温下混合1～100分钟左右、优选5～10分钟左右。如上所述制备的本发明的核酸复合体以分散于溶液中的状态存在。可以将该分散体直接与核酸转运用载体混合进行使用，或者根据需要稀释后或浓缩后与核酸转运用载体混合进行使用。
(2)核酸转运用组合物
上述核酸复合体通过与核酸转运用载体混合，参入核酸转运用载体中，该核酸可以被转运至细胞内。即，本发明还提供一种含有上述核酸复合体及核酸转运用载体的核酸转运用组合物。
核酸转运用载体是指为了将核酸转运(导入)至细胞内而作为核酸载体使用的非病毒性运载体。核酸转运用组合物是指为了将该组合物中含有的核酸导入细胞内而与成为导入对象的细胞接触的组合物。
核酸转运用载体的组成
本发明的核酸转运用组合物中使用的核酸转运用载体，只要可以将核酸参入细胞内即可，没有特别限定。作为上述核酸转运用载体，例如可以使用LipofectamineTM2000等公知的载体。
从进一步提高上述核酸复合体中所含核酸的细胞内持续性、以及进一步提高细胞内转运效率及安全性的观点考虑，例如优选使用含有下述物质的载体：(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物、及(C)脂肪族伯胺(以下称作“载体1”)。
载体1中使用的二酰基磷脂酰胆碱(以下有时记作“成分(A)”)，只要药理学上允许即可，没有特别限定，例如可以举出酰基部分的碳原子数为4～23的二酰基磷脂酰胆碱。构成该二酰基磷脂酰胆碱的两个酰基的碳原子数可以相同或不同。
二酰基磷脂酰胆碱的具体例包括：二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱、二丁酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、二庚酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二苯二甲酰磷脂酰胆碱、二月桂基磷脂酰胆碱、二花生酰磷脂酰胆碱、二(二十一烷酰基)磷脂酰胆碱、二芥酸酰磷脂酰胆碱、二花生四烯酸酰磷脂酰胆碱、双(二十三烷二酰基)磷脂酰胆碱(bis(tricosadinoyl)phosphatidylcholine)等。其中，优选例包括酰基部分的碳原子数为12～18的二酰基磷脂酰胆碱；更优选例包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱等酰基部分的碳原子数为13～17的二酰基磷脂酰胆碱；特别优选例包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱及二硬脂酰磷脂酰胆碱；最优选例包括二硬脂酰磷脂酰胆碱。上述二酰基磷脂酰胆碱可以单独使用或者组合两种以上进行使用。
载体1中使用的胆固醇及/或其衍生物(以下有时记作“成分(B)”)只要药理学上允许即可，没有特别限定。胆固醇的衍生物为具有胆固醇骨架的阳离子性脂质，具体而言包括3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)，3β-[N’，N’，N’-三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇(TC-Chol)，(N’，N-双胍乙基氨基乙烷)氨基甲酰-胆固醇(bis(guanidinium)-tren-cholesterol)(BGTC)，N-胆甾烯基氧基羰基-3，7-二氮杂壬烷-1，9-二胺、β-丙氨酸-二乙醇胺-胆固醇、N4-精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-67)，N[N4-3-氨基丙基亚精胺]胆固醇氨基甲酸酯(GL-78)，N4-精胺胆固醇甲酰胺(GL-90)，N1，N8-双(精氨酸甲酰胺)-N4-亚精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-95)、及N-[N1，N4，N8-三(3-氨基丙基)亚精胺]胆固醇氨基甲酸酯(GL-96)。成分(B)的优选例包括胆固醇。载体1中，作为成分(B)可以单独使用胆固醇及其衍生物、或者也可以组合两种以上进行使用。
载体1中使用的脂肪族伯胺(以下有时也记作“成分(C)”)只要药理学上允许即可，没有特别限定，例如可以举出烷基部分的碳原子数为10～20的烷基胺。
脂肪族伯胺的具体例包括月桂胺、肉豆蔻胺、棕榈胺、硬脂胺、油胺、癸酰胺、苯二甲酰胺(phthanoylamine)等。其中，优选烷基部分的碳原子数为12～18的烷基胺；更优选硬脂胺、油胺和棕榈酰胺；特别优选硬脂胺。上述脂肪族伯胺可以单独使用或者组合两种以上进行使用。
载体1含有上述成分(A)～(C)的组合。为了进一步提高核酸向细胞内的转运效率、及进一步降低毒性，优选下述组合：(A)酰基部分的碳原子数为4～23的二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物以及(C)碳原子数为10～20的烷基胺的组合；更优选(A)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱及/或二硬脂酰磷脂酰胆碱、(B)胆固醇、以及(C)硬脂胺的组合。
载体1中，成分(A)～(C)的比率没有特别限定，例如可以举出成分(A)∶成分(B)∶成分(C)的摩尔比为5～9∶1～5∶1，优选为6～9∶1～4∶1，更优选为7～8∶2～3∶1。通过满足上述比率，可以进一步提高核酸向细胞内的转运效率及进一步降低毒性。
相对于载体1的总量，成分(A)～(C)的总量例如可以举出1～100重量％，优选为20～90重量％，更优选为30～70重量％。
载体1中除成分(A)～(C)之外还可以含有其他阳离子性脂质。可用的阳离子性脂质的具体例包括角鲨胺(Squalamine)、3a，7a，12a-三(3-氨基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N，N-双(3-氨基丙基)胺(3a，7a，12a-Tris(3-aminopropoxy)-5β-cholan-24-(N，N-bis(3-aminopropyl)amine)、3a，7a，12a-三(3-氨基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N-(N-(3-氨基丙基))-3-氨基丙基)-胺(3a，7a，12a-Tris(3-aminopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(N-(3-aminopropyl))-3-aminopropyl)-amine)、3a，7a，12a-三(3-叠氮基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N，N-双(2-氰基乙基)胺)(3a，7a，12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N，N-bis(2-cyanoethyl)amine))、3a，7a，12a-三(3-叠氮基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N-(苄氧基羰基)-N-(羟基丙基)-胺)(3a，7a，12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(benzyloxycarbonyl)-N-(3-hydroxypropyl)-amine))等甾族化合物结合的阳离子性脂质；伞状精胺复合体(Umbrella-spermineconjugates)等胆酸结合的阳离子性脂质；甾醇糖苷结合的阳离子性脂质；甾类皂苷结合的阳离子性脂质；二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、1，2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、N-(1-(2，3-双(油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基铵盐酸盐(DOTMA)、二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵盐(DMRIE)、二油酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵(DORIE)、二甲基(二)十二烷基溴化铵、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-(二)十二烷基-D-谷氨酰胺盐酸盐、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-O，O’-双-(1H，1H，2H，2H-全氟癸基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、O，O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化铵、N-{p-(w-三甲基铵基丁基氧基)-苯甲酰基}-二(十二烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、9-(w-三甲基铵基丁基)-3，6-双(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)铵盐酸盐、N-w-三甲基铵基十二烷酰基-二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N-{p-(w-三甲基铵基己基氧基)-苯甲酰基}-二(十四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、p-(w-三甲基铵基癸基氧基)-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-1-0810)、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-3-0810)、O，O’，0”-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐(TC-1-12)、1，2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二硬脂酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱等季铵盐型阳离子性脂质等。
载体1含有除成分(A)～(C)之外的其他阳离子性脂质时，该阳离子性脂质的比例只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，例如可以举出下述比例，即相对于100重量份上述成分(A)～(C)的总量，该阳离子性脂质为1～10重量份，优选为2～8重量份，更优选为4～6重量份。
根据需要，载体1也可以含有油性基剂。配合油性基剂，利用其特性，由此能控制载体1的核酸导入效率。例如通过配合油性基剂调节载体1的比重，可以控制细胞与载体1的接触性，改善体外的导入效率。另外，例如通过配合具有温度感受性功能的基剂作为油性基剂，能够在规定的温度条件下使核酸载体组合物的芯破碎，从而诱发细胞表面的波动，提高核酸的导入效率。进而，例如通过配合具有外部刺激破碎性的基剂作为油性基剂，可以通过外部刺激使载体1的芯破碎，从而诱发细胞表面的波动，提高核酸的导入效率。
可以在载体1中配合的油性基剂的例子包括：全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、大豆油、精制大豆油、氢化大豆油、大豆油非皂化物、角鲨烯、蓖麻油、丁香油、失水山梨醇三油酸酯、松节油、红花油、红花油脂肪酸、油酸、棕榈油、菜子油、杂醇油、橄榄油、亚麻仁油、芝麻油、叶绿素油、巴豆油、佛手油、雪松油、橙油、茴香油、桉树油、玉米油、熏衣草油、香马郁兰油、柠檬油、棉籽油、椰子油、蛋黄油、玫瑰花油、松油、杏仁油、花生油、山茶油、白樟油、春黄菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生姜油、罗马春黄菊油、蛇油、留兰香油、向日葵油、可可脂、小麦胚芽油、氧化锌油、氢化油、氢化植物油、轻质液体石蜡、液体石蜡、中链脂肪酸三甘油酯、貂油、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、聚氧乙烯氢化蓖麻油100、聚氧乙烯氢化蓖麻油20、聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯氢化蓖麻油5、聚氧乙烯氢化蓖麻油50、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蓖麻油聚烃氧酯35、操作油等。在上述油性基剂中，全氟戊烷具有温度感受性、具有在29.5℃下通过沸腾气化的特性。另外，全氟己烷、溴代全氟辛烷及全氟三丁基胺具有下述特性，即具有外部刺激破碎性，在由超声波照射产生的刺激等来自外部的刺激作用下，使载体1的芯产生空腔，使其破碎。
当含有油性基剂时，该油性基剂的比例只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，例如可以为下述比例，即相对于100重量份上述成分(A)～(C)的总量，该油性基剂为0.1～50重量份、优选为1～30重量份、更优选为5～20重量份。
根据需要载体1也可以含有膜融合性脂质(辅助脂质)。通过含有上述膜融合性脂质，载体1可以进一步提高核酸向细胞内的转运效率。上述膜融合性脂质的例子包括：二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱、反式磷脂酰基磷脂酰基乙醇胺、1，2-双(10，12-二十三烷二酰基)-磷酸乙醇胺、1，2-二反油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二(十六烷基)磷酸乙醇胺、1，2-二己酰基磷酸乙醇胺、1，2-二月桂酰基磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1，2-二植烷酰磷酸乙醇胺、1，2-二硬脂酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-(10，12-二十三烷二酰基)磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、N，N-二甲基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N，N-二甲基-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-乳糖、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺苯基)丁酸盐]、N-甲基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-甲基-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐、N-(琥珀酰)-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-(琥珀酰)-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺等。其中，在载体1中优选使用二油酰基磷脂酰乙醇胺。
当含有该膜融合性脂质时，该膜融合性脂质的比例只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，可以举出下述比例，即相对于100重量份上述成分(A)～(C)的总量，该膜融合性脂质为1～500重量份、优选为10～250重量份、更优选为25～100重量份。
根据使用形态，载体1可以含有等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等各种添加剂；及/或精制水、糖水溶液、缓冲液、生理盐水、高分子水溶液、不含RNase的水等水性载体。上述添加剂和水性载体的配合量可以根据核酸转运用载体的使用形态适当地设定。
核酸转运用载体的形态
核酸转运用载体的形态没有特别限定，只要能够封入转运至细胞内的核酸即可，但优选为脂质体形态。例如将载体1制成脂质体形态时，上述成分(A)～(C)及根据需要选择使用的其他脂质形成脂质体膜。
将核酸转运用载体制成脂质体形态时，可以为小单层脂质体(smallunilamellar.vesicles：SUV)、大单层脂质体(large unilamellar vesicles：LUV)、及多层脂质体(multilamellar vesicles：MLV)中的任一种。核酸转运用载体的粒径可以根据转运对象的细胞种类适当设定，例如可以举出为SUV时粒径为20～100nm左右、为LUV时粒径为200～1000nm左右、为MLV时粒径为400～3500nm左右。脂质体的粒径是根据动态光散射法而测定得到的。
脂质体的制备及其粒径的调节按照本领域公知的方法实施。例如为载体1时，可以使用含有上述成分(A)～(C)的油相和水相(水性载体)，通过薄膜法、逆向蒸发法、醚注入法、表面活性剂法、加热法等形成脂质体。另外，可以通过挤压法、French press法、均质化法等调节粒径。
核酸转运用组合物的形态、组成、使用方法
核酸转运用载体为脂质体形态时，在本发明的核酸转运用组合物中，核酸复合体可以以被封入在脂质体内水相中的状态存在，或也可以以通过离子键或疏水键键合在脂质体膜的内侧或外侧的状态存在。核酸转运用载体为脂质体以外的形态时，在本发明的核酸转运用组合物中，只要核酸复合体与核酸转运用载体的成分通过离子键或疏水键形成复合体即可。
本发明的核酸转运用组合物通过混合核酸复合体与核酸转运用载体制成所期望的形态，或以任意顺序混合核酸复合体及核酸转运用载体的配合成分制成所期望的形态而进行制备。
在本发明的核酸转运用组合物中，核酸复合体与核酸转运用载体的比率根据核酸复合体的种类、核酸转运用载体的种类、成为核酸转运对象的细胞的种类等而不同。可以举出下述比率，即相对于核酸转运用载体的总量100重量份，核酸复合体为1～100重量份、优选为10～100重量份、更优选为20～100重量份。更具体而言，使用载体1作为核酸转运用载体时，例如可以举出下述比率，即相对于载体1中的成分(A)～(C)的总量100重量份，核酸复合体为1～100重量份、优选为10～100重量份、更优选为20～100重量份。
进而，使用载体1作为核酸转运用载体时，载体1中含有的成分(A)～(C)的总量相对于核酸转运用组合物的总量，例如可以举出10～90重量％、优选为30～80重量％、更优选为40～60重量％。
根据其使用形态，本发明的核酸转运用组合物可以含有等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等各种添加剂；及/或精制水、葡萄糖水溶液、缓冲液、生理盐水等水性载体。上述添加剂和水性载体的配合量可以根据核酸转运用组合物的使用形态而适当地设定。
本发明的核酸转运用组合物可以单独用作基因治疗药物等药物组合物。使用本发明的核酸转运用组合物作为药物组合物时，选择药理学上允许的核酸转运用载体、基质、运载体等。本发明的药物组合物可以制成各种药物形态。本发明的药物组合物的形态的例子包括液体制剂，如溶液剂(包括糖浆剂等)、滴剂、注射剂等；固体制剂，如片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)等。本发明的药物组合物为液体制剂时，其可以通过冷冻或冻干等方法除去水分进行保存。冻干制剂、干糖浆剂等可以在使用时再次溶解于注射用蒸馏水、灭菌水等中。本发明的药物组合物为固体制剂时，可以在使用时再次溶解于注射用蒸馏水、灭菌水等中。
在本发明中，成为核酸转运对象的细胞、即应用本发明的药物组合物的细胞，没有特别限定，可以为培养细胞、从生物体中分离的细胞(包括株化的细胞)、体内细胞等，可以来自于人或非人的动物。本发明的药物组合物可以用于体外或体内。
在本发明中，可以通过使本发明的药物组合物与细胞接触的步骤将核酸转运至细胞内。使药物组合物与细胞接触的方法没有特别限定，只要使适当量的核酸转运用组合物与成为核酸导入对象的细胞接触即可。例如，该方法可以与基因治疗中迄今为止公知的方法相同，与细胞接触的量也同样适用，可以适当选择方法及量。将本发明的药物组合物用于细胞可以使核酸的细胞内转运变得容易，持续且稳定地将被转运的核酸保持在细胞内。
例如，为了使本发明的药物组合物在体外与细胞接触，可以在适当量的药物组合物存在下培养细胞。为了使本发明的药物组合物在体外与培养的细胞或从生物体分离得到的细胞接触，可以在血清存在下进行上述接触。使本发明的药物组合物在体内与细胞接触时，本发明的药物组合物可以通过下述方法与细胞接触，例如向组织内直接注入；向静脉、皮下、肌肉、腹腔、眼内、消化器官内、牙内等注射；从鼻腔、口腔、肺等吸入给与；口服给与；经皮肤给与；通过口腔粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、直肠粘膜、子宫粘膜的经粘膜给与等。
根据需要，本发明的药物组合物可以进一步含有药理学上允许的载体或基质。载体及基质只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，根据使用形态适当选择。例子如上所述。在上述情况下，药物组合物、载体及基质的配合比例只要不妨碍本发明的效果即可，没有限定，根据使用形态适当选择。
使用本发明的药物组合物时，使用其有效量。例如药物组合物的使用量如下，即相对于每一个细胞，含有的核酸复合体的量为0.001～10pM、优选为0.001～1pM、更优选为0.01～0.1pM。
本发明的药物组合物可以将特定的核酸转运至细胞内。即，本发明的药物组合物通过使药物组合物与细胞接触，可以有效地将存在于药物组合物中的、及形成核酸复合体的特定核酸转运至细胞内。
本发明还提供一种将核酸转运至细胞内的方法。根据本发明，将核酸转运至细胞内的方法包括使上述核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞接触的步骤。核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞之间的接触，只要将适当量的核酸复合体或核酸转运用组合物与成为核酸导入对象的细胞接触即可，没有特别限定。例如，接触方法、与细胞接触的量可以与迄今为止在基因治疗中公知的方法、与细胞接触的量相同，可以适当选择方法及量
通过按照上述方法使核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞接触，可以将核酸持续且稳定地保持在细胞内。为了与细胞接触，核酸复合体可以直接使用，或者与上述载体或基质组合进行使用。核酸转运用组合物也可以直接使用，或者与上述载体或基质组合进行使用。为了更有效地进行细胞内核酸的转运，优选使核酸转运用组合物与细胞接触。
本发明中，如上所述，成为核酸转运对象的细胞没有限定，可以为培养细胞、从生物体中分离的细胞(包括株化的细胞)、体内细胞等，可以来自于人或非人的动物。上述接触可以在体外或体内进行。
例如，为了使核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞在体外接触，可以在适当量的核酸复合体或核酸转运用组合物的存在下培养细胞。为了使核酸复合体或核酸转运用组合物与培养的细胞或从生物体中分离的细胞在体外接触，可以在血清存在下进行上述接触。使核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞在体内接触时，核酸复合体或核酸转运用组合物可以通过下述方法与细胞接触，例如向组织内直接注入；向静脉、皮下、肌肉、腹腔、眼内、消化器官内、牙内等注射；从鼻腔、口腔、肺等吸入给与；口服给与；经皮肤给与；通过口腔粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、直肠粘膜、子宫粘膜的经粘膜给与等。
根据本发明，将核酸转运至细胞内的方法中，使有效量的核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞接触，将核酸导入细胞内。例如可以选择核酸复合体或核酸转运用组合物的给与量，使向每个细胞给与0.001～10pM，优选0.001～1pM，更优选0.01～0.1pM的核酸复合体。
本发明的将核酸转运至细胞内的方法可以通过使药物组合物与细胞接触来进行。使用药物组合物时，本发明的方法可以采用与上述同样的方法。
实施例
以下基于实施例等详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。在以下实施例及试验例中，使用GL3-siRNA(相对于萤火虫荧光素酶的siRNA；Dharmacon公司(Boulder，CO)，USA；有意：5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT，反义：5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)作为siRNA。使用Cluster dextrin(Ezaki Glico株式会社制)作为高支化环糊精。
实施例1
含有siRNA与高支化环糊精的复合体的制备
使用Tris-EDTA(TE)缓冲液(Fluka公司制)，制备以2μM的浓度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。另外，使用Tris-EDTA(TE)缓冲液(Fluka公司制)制备以25μM的浓度含有高支化环糊精的溶液(高支化环糊精溶液)。将等量的上述溶液混合1分钟，形成siRNA复合体。得到的siRNA复合体的物性示于表1。
表1
Figure GPA00001135064400181
#粒径表示使用ZETASIZER 3000HSA(MALVERN INSTRUMENT)
(利用激光衍射法测定体积平均粒径)测定得到的平均粒径(nm)。
Zeta电位利用ZETASIZER 3000HSA(MALVERN INSTRUMENT)测定。
实施例2
含有siRNA复合体的核酸转运用组合物的制备
称量二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇及硬脂胺使其摩尔比为二硬脂酰磷脂酰胆碱∶胆固醇∶硬脂胺＝7∶3∶1，用茄型瓶(回收瓶)使之溶解于氯仿。用旋转蒸发仪使溶液减压干燥，形成脂质薄膜。将实施例1中得到的含有0.028mg/ml siRNA复合体的溶液添加到所得脂质薄膜中，使溶液的DSPC的浓度为30mg/mL，然后将其混合。用挤出机通过孔径为800nm及200nm的膜来调节溶液的粒径，制备阳离子性脂质体形态的siRNA转运用组合物。得到的siRNA转运用组合物的粒径约为200nm，为粒度均匀的粒子的脂质体形态。上述组合物的Zeta电位约为50mV。粒径表示为使用ZETASIZER 3000HSA(MALVERNINSTRUMENT)(利用激光衍射法测定体积平均粒径)测定得到的平均粒径(nm)。Zeta电位为利用ZETASIZER 3000HSA(MALVERNINSTRUMENT)测定得到的。
实施例3
含有siRNA复合体的核酸转运用组合物的制备
除DSPC∶胆固醇∶硬脂胺＝7∶3∶2之外，与实施例2同样地制备阳离子性脂质体形态的核酸转运用组合物。与实施例2同样地，得到的siRNA转运用组合物的粒径约为200nm，为粒度均匀的粒子的脂质体形态。上述组合物的Zeta电位约为50mV。
试验例1
siRNA的封入率(inclusion efficiency)的评价
使用预先用FITC标记的siRNA，与上述实施例1同样地制备FITC标记的siRNA复合体。使用FITC标记的siRNA复合体，在与实施例2及3同样的条件下制备阳离子性脂质体形态的核酸转运用组合物。将刚制备好的siRNA转运用组合物通过离心(75,000rpm、1小时)使之沉淀，测定存在于上清中的FITC标记的siRNA的荧光强度，算出siRNA的封入率(相对于全部的siRNA，被封入脂质体内的siRNA的比例(％))。
结果，在与实施例2、实施例3同样的条件下制备时，siRNA的封入率显示出高水平，分别为97.2％、99.8％。这表明本发明的核酸复合体具有有效地以脂质体形态导入核酸转运用载体的特性。虽然限定性解释并不理想，但推测这是由于高支化环糊精与siRNA形成紧密的复合体。
试验例2
细胞安全性评价试验
利用MTS试验法进行评价。MTS试验利用Promega公司制的“CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay”进行。具体而言，在96孔板上将A594细胞(ATCC，USA)以3.16×104细胞/孔接种在200μL含有10容量％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s Modification ofEagle’s培养基(DMEM)中，在37℃下培养24小时。用Hank’s缓冲盐溶液(HBSS)洗涤3次后，将培养基更换为不含FBS的DMEM。向每1孔中分别加入20μL上述每种核酸转运用组合物，在37℃、5％CO2条件下培养4小时。然后，将孔中的培养上清液更换为含有10容量％FBS的DMEM，进一步在37℃、5％CO2条件下培养20小时。向各孔中加入20μL MTS(四唑鎓盐)试剂及100μL含有10容量％FBS的DMEM培养基，培养2小时。测定在492nm处的吸光度，计算细胞存活率(cellviability)。细胞存活率是以不添加核酸转运用组合物在上述条件下培养时测定的492nm处的吸光度为100％计算得到的。
结果示于图2。图2表明实施例2及3的核酸转运用组合物均显示出低细胞毒性、高安全性。特别是确认了实施例2及3的核酸转运用组合物显示出明显高的安全性。
试验例3
siRNA向细胞内的转运效率的评价试验
通过使用流式细胞仪测定FITC标记的siRNA的荧光强度来评价siRNA的细胞内导入效率。在本试验中，使用的核酸转运用组合物是利用预先在siRNA上进行FITC标记的siRNA制备得到的。具体而言，在24孔板上将A594细胞(ATCC，USA)以5×105细胞/孔接种至500μL含有10容量％FBS的DMEM中，在37℃、5％CO2条件下培养24小时。用HBSS洗涤3次后，向其中加入0.95ml不含FBS的DMEM。再向各孔中分别加入0.05ml实施例1及2的核酸转运用组合物，在37℃、5％CO2条件下培养4小时。然后，将孔中的培养上清液更换为含有10容量％FBS的DMEM，进一步在37℃、5％CO2条件下培养20小时。将各孔用HBSS洗涤1次后，加入0.2mL CellScrubBuffer(Gene TherapySystems，Inc.制)，在37℃、5％CO2条件下培养15分钟。再用HBSS洗涤2次后，使用胰蛋白酶剥取附着于孔底部的细胞，通过离心分离回收细胞，使所得细胞悬浮于HBSS中。使上述悬浮液通过41μm孔径的膜。用流式细胞仪测定加入核酸转运用组合物2小时后、12小时后及24小时后的细胞的荧光强度。作为对照，使用下述对照用核酸转运用组合物，与上述相同地测定细胞的荧光强度，所述对照用核酸转运用组合物如下制备：以容量比1∶1混合用OptiMEM培养基将市售的常用作基因运载体的Lipofectamine 2000TM(Invitrogen公司制)稀释至0.1mg/mL的溶液、和用TE缓冲液以2μM的浓度稀释siRNA的siRNA溶液。
结果示于图3。由上述结果确认，为实施例1及2的核酸转运用组合物的任一种情况下，siRNA均持续地保持在细胞内且其浓度保持恒定。相对于此，对照用核酸转运用组合物不仅初期的向细胞内的siRNA转运率低，而且细胞内的siRNA还经时减少，加入12小时后及24小时后，细胞内的siRNA量不充分。
附图说明
图1表示高支化环糊精的例子。
图2表示试验例2的试验结果，即核酸转运用组合物的细胞内安全性的评价结果。
图3表示试验例3中由各核酸转运用组合物介导的将siRNA导入至细胞内的评价结果。图3中的纵坐标表示每一个细胞的平均荧光强度。
序列表
<110>大塚制药株式会社
<110>竹内  洋文
 
<120>核酸复合体及核酸转运用组合物
 
<130>P08-118
 
<150>JP2007-291317
<151>2007-11-08
 
<160>2
 
<170>PatentIn version 3.1
 
<210>1
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>有义
 
<220>
<221>被修饰的碱基
<222>(19)..(19)
<223>被″dTdT″修饰
 
<400>1
cuuacgcuga guacuucga                    19
 
<210>2
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<221>被修饰的碱基
<222>(19)..(19)
<223>被″dTdT″修饰
<400>2
ucgaaguacu cagcguaag                                                              19

Claims (15)

1.一种核酸复合体，其特征在于，含有核酸及高支化环糊精。
2.如权利要求1所述的核酸复合体，其中，相对于1重量份核酸，高支化环糊精的量为1～4000重量份。
3.如权利要求1或2所述的核酸复合体，其中，核酸为siRNA。
4.如权利要求1～3中任一项所述的核酸复合体，其中，高支化环糊精是具有内支环结构部分和外支化结构部分的、聚合度为50～5000的葡聚糖，所述内支环结构部分由α-1，4-糖苷键及至少一个α-1，6-糖苷键形成，所述外支化结构部分与所述内支环结构部分连接。
5.如权利要求1～4中任一项所述的核酸复合体，所述核酸复合体是通过将核酸与高支化环糊精在水溶液中混合而得到的聚集体。
6.一种核酸转运用组合物，含有权利要求1～5中任一项所述的核酸复合体及核酸转运用载体。
7.如权利要求6所述的核酸转运用组合物，其中，核酸转运用载体为含有下述物质的组合物：
(A)二酰基磷脂酰胆碱；
(B)选自胆固醇及其衍生物中的至少一种；及
(C)脂肪族伯胺。
8.如权利要求7所述的核酸转运用组合物，其中，核酸转运用载体中的成分(A)为酰基部分的碳原子数为4～23的二酰基磷脂酰胆碱。
9.如权利要求7所述的核酸转运用组合物，其中，核酸转运用载体中的成分(B)为胆固醇。
10.如权利要求7所述的核酸转运用组合物，其中，核酸转运用载体中的成分(C)为碳原子数为10～20的烷基胺。
11.如权利要求7所述的核酸转运用组合物，其中，成分(A)∶成分(B)∶成分(C)的摩尔比为5～9∶1～5∶1。
12.如权利要求7所述的核酸转运用组合物，其中，所述核酸转运用载体是由成分(A)～(C)形成脂质体膜的脂质体制剂。
13.一种药物组合物，含有权利要求6～12中任一项所述的核酸转运用组合物。
14.权利要求6～12中任一项所述的核酸转运用组合物在制备用于将核酸转运至细胞内的药物中的应用。
15.一种将核酸转运至细胞内的方法，包括使权利要求6～12中任一项所述的核酸转运用组合物与细胞接触的步骤。
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