NO329773B1 - In vitro fremgangsmate for transfeksjon av et polynukleotid inn i celler, et transfeksjonsmiddel og en farmasoytisk sammensetning. - Google Patents

Description

KRYSSHENVISNING TIL BESLEKTEDE SØKNADER

Denne søknad hevder prioritet fra australsk patentskrift PQ2593/99.

TEKNISK OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt tilførsel av farmasøytiske agenser inn i celler, særskilt tilførsel av polynukleotider inn i celler ved ikke virale fremgangsmåter, enten in vitro eller in vivo. Således vedrører den foreliggende oppfinnelse en in vitro fremgangsmåte for transfeksjon av et polynukleotid inn i celler, en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament, et transfeksjonsmiddel og en farmasøytisk sammensetning. Slike farmasøytiske agenser anvendes til behandling av kreft, særskilt behandling av blærekreft.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Trass i mange nylige fremskritt innen fremgangsmåter for genterapi, har virksom terapeutisk tilførsel av gener inn i ulike celletyper, særskilt in vivo tilførsel, ikke blitt oppnådd ganske enkelt fordi det ikke foreligger fremgangsmåter for å bevirke tilførsel av terapeutisk virksomme mengder av slike gener inn i de særskilte celler tilhørende en pasient i behov av behandling. Virksom tilførsel av terapeutisk tilstrekkelige mengder gener, så vel som andre terapeutiske molekyler, har ofte vist seg vanskelig, om ikke umulig, siden eksempelvis celle-membranet fremviser en selektivt permeabel barriere. Dessuten, selv når gener, eller andre biologisk aktive molekyler, med fremgang kommer inn i tilsiktede celler, kan de bli degradert, uegnet transportert, eller i tilfellet med gener, ikke lykkes i å bli skikkelig transkribert.

Et eksempel på en tilsiktet celletype for hvilken det mangler virksomme tilførselsrfemgangs-måter, særskilt for genterapi, er blærens urotelialceller. Slike fremgangsmåter ville være særskilt nyttige i behandlingen av blærekreft. Trass i fremskritt innen endoskopiske og intrave-sikale kjemoterapeutiske prosedyrer, har overflatisk blærekreft fremdeles en høy forekomst av tilbakefall og progresjon (Nseyo UO, Lamm DL. (1996) Semin. Oncol. 5:598-604). For tiden involverer den mest fremgangsrike behandling ukentlig installasjon av "levende" Bacillus Calmette-Guerin (BCG) inn i blæren i løpet av to timer (Morales, A. et al. (1976) J. Uroi., 116:180-183; Brosman, S.A. (1992) Uroi. Clin. North Am., 19:557-564). Selv om dette er virksomt, med rutinemessige responsandeler på 60-70%, er bivirkninger slik som dysuria, haematuria, hyppighet og cystitis vanlige og noen ganger alvorlige (Lamm, D.L. (1992) Uroi. Clin. North Am., 19:565-572). Videre gir et signifikant antall pasienter ikke respons til BCG-terapi og giftighet er vanlig. Utnyttelse av mekanismen for BCG-aktivering av immunre-sponsen har resultert i identifikasjon av cytokiner, kostimulatoriske molekyler og adhesjons-molekyler som spiller viktige roller i å lette den cytotoksiske respons overfor tumorer (Tani-guchi, K. et al. (1999) Clin. Exp. ImmunoL, 115:131-5, 1999; Patard, J.J. et al. (1998) Uroi. Res., 26:155-9; Kurisu, K. et al. (1994) Cancer Immunol. Immunother, 39:249-53; Sander, B. et al. (1996) J. Urology, 156:536-41; Chow, N.H. et al. (1998) Urology, 52:1015-9; Jackson, A.M. et al. (1995) Clin. Exp. ImmunoL, 99:369-75).

Overflatisk blærekreft har noen trekk som gjør dem særskilt attraktive for in vivo genterapi, nemlig det at tumorer ofte er lokaliserte og terapeutiske gener kan plasseres i direkte kontakt med tumoren via enkel intravesikal administrering. Videre kan tumorens respons overfor behandling med letthet bestemmes med cytoskopi og urin-cytologi. En av de større hind-ringer for den vellykkede transfeksjon av de transisjonelle celleepitel er tilstedeværelsen av en glykosaminglukanlag, hvilket kan fungere som en signifikant barriere mot opptaket av DNA-komplekser (Ruponen, M. et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta, 1415:331-41).

Virale ekspresjonsvektorer har vært benyttet til å introdusere spesifikke gener lokalt til blæren (Sutton, M.A. et al. (1997) Urology, 49:173-80; Lee, S.S. et al. (1994) Cancer Res., 54:3325-8). Imidlertid har virale vektorer et antall begrensninger i kliniske omgivelser, slik som immunogenisitet og sikkerhet. En nylig studie ved Li et al. har stilt spørsmål ved effek-tiviteten av adenovirus-basert genterapi for blærekreft p.g.a. forskjellene i virale reseptornivå-er som observert i humane blærekreft-cellelinjer (Li, Y. et al. (1999) Cancer Res., 59:325-30).

En alternativ fremgangsmåte for genterapi involverer liposom-formidlet tilførsel av DNA inn i celler. Fordelen med et ikke viralt system er at det ikke er reseptoravhengig og derfor bør kunne benyttes overfor alle tumorer. Brigham et al. rapporterte først tilførsel av DNA inn i vev ved anvendelse av kationiske liposomer (Brigham, K.L. et al. (1989) Am. J. Med. Sei., 298:278-81). Siden da har kationiske lipider vært vist å være virksomme bærere for lokalisert og systematisk tilførsel av DNA til vev in vivo (Plautz, G.E., et al. (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:4645-9; Nabel, G.J. et al. (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:11307-11; Zhu, N. et al. (1993) Science, 261:209-11). PCT publikasjon nr. WO/98/040499 frembringer sammensetninger og fremgangsmåter for transfeksjon av pattedyrsslimhinne epi-tel med nukleiske/kationiske lipidkomplekser. PCT publikasjon nr. WO/98/51285 og PCT publikasjon nr. WO/98/13026 frembringer kationiske amfipater som fremmer transport av biologisk aktive molekyler inn i celler. Kationisk liposomer har et antall betydelige fordeler sammenliknet med virale gentilførselssystemer i de kliniske omgivelser. Disse inkluderer evnen til å benytte et utvalg av genkonstruksjoner fra enkle plasmider til kromosomale fragmenter og færre problemer med sikkerhet. Deres hovedsakelige ulempe er imidlertid deres forholdsvis lave transfriksjonseffektivitet sammenliknet med virale teknikker.

Dermed behøves det fremdeles fremgangsmåter for å øke transfiksjonseffektivitet, særskilt for uroteliale celler, og det samme gjelder generelle fremgangsmåter for tilførsel av farmasøytis-ke agenser blæren.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Således er fremgangsmåten for transfeksjon i samsvar med oppfinnelsen kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter:

å kombinere:

i det minste et polynukleotid;

et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller en kombina-

sjon derav; og

et solubilisert kolesterolpreparat som omfatter kolesterol solubilisert med et cyklodekstrin for dannelse av et transfeksjonsmiddel; og påføring av trans-

feksjonsmiddelet til celler, slik at cellene transfekteres med polynukleotidet.

Videre er fremgangsmåten for fremstilling av et medikament i samsvar oppfinnelsen kjennetegnet ved at medikamentet inneholder et farmasøytisk agens og et solubilisert kolesterol-preparat for terapeutisk og/eller profylaktisk behandling av urotelialceller ved intravesikulær påføring til subjektets blære, hvor kolesterolet er blitt solubilisert med et cyklodektrin, og hvor det farmasøytiske agens omfatter: (i) i det minste et polynukleotid og (ii) et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller kombinasjoner derav.

Ytterligere utførelser av fremgangsmåtene til oppfinnelsen er beskrevet i medfølgende krav 2 og 4-23.

Således er transfeksjonsmiddelet i samsvar med oppfinnelsen kjennetegnet ved at det omfatter: et polynukleotid;

et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller kombinasjo-

ner derav; og

et solubilisert kolesterolpreparat omfattende kolesterol solubilisert med cyklodekstrin.

Ytterligere utførelser av transfeksjonsmiddelet til oppfinnelsen er beskrevet i medfølgende krav 25-31.

Således er den farmasøytiske sammensetninen, i samsvar med oppfinnelsen kjennetegnet ved at den omfatter transfeksjonsmiddelet beskrevet ovenfor.

Denne oppfinnelse frembringer derved forbedrede fremgangsmåter for tilførsel av farmasøy-tiske agenser, særskilt polynukleotider, inn i celler, særskilt uroepitelceller. Det er nå blitt funnet at anvendelsen av solubilisert kolesterol som additiv kan forbedre transfeksjonseffektiviteten for DNA som kompleksert med et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer. Fortrinnsvis solubiliseres kolesterolet ved anvendelse av cyklodekstrin, fortrinnsvis metyl-|$-cyklodekstrin. Selv om de særskilt foretrekkes for transfeksjon av urotelialceller enten in vitro eller in vivo, kan transfeksjons-fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen benyttes for transfeksjon av et utvalg andre celletyper. Videre kan den forbedrende effekt av solubilisert kolesterol på inntreden av DNA som kompleksert med enten et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer inn i urotelialceller benyttes for tilførsel av andre typer farmasøytiske agenser inn i urotelialceller, enten in vitro eller in vivo ved intravesikulær til-førsel.

Dermed, i et aspekt, frembringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å transfektere en eller flere polynukleotider inn i celler. Fremgangsmåten involverer det å kombinere (i) polynukleotidet/polynukleotidene med (ii) et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller kombinasjoner derav, og (iii) et solubilisert kolesterolpreparat for å danne et transfeksjonsmiddel, og påføre transfeksjonsmiddelet til cellene, slik at cellene transfekteres med polynukleotidet/polynukleotidene. Fortrinnsvis omfatter det solubiliserte kolesterolpreparat kolesterol som solubilisert med et cyklodekstrin. Fortrinnsvis er cyklodekstrinet metyl-p-cyklodekstrin. Andre egnede cyklodekstriner inkluderer alfa-cyklodekstrin, beta-cyklodekstrin, gamma-cyklodekstrin, sulfatert beta-cyklodekstrin, tertiært amin beta-cyklodekstrin, kvaternært amin beta-cyklodekstrin, 2-hydroxypropyl-beta-cyklodekstrin, 2,6-di-O-metyl-beta-cyklodekstrin, hydroxyetyl-beta-cyklodekstrin, 6-deoxy-6-S-beta-D-galaktopyranosyl-6-tio-cyklomalto-heptaose, sulfobutyleter-beta-cyklodekstrin, carboxymetyl-beta-cyklodekstrin, carboksymetyl-etyl-beta-cyklodekstrin, dietyl-beta-cyklodekstrin, dimetyl-beta-cyklodekstrin, tilfeldig metyl-beta-cyklodekstrin, glucosyl-beta-cyklodekstrin og maltosyl-beta-cyklodekstrin. Et foretrukket kationisk lipid er DOTAP, mens en foretrukken dendrimer er Superfect. Andre egnede kationiske lipider og dendrimere inkluderer DOPE,

DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM,

polylysin, polyhistidin, polyarginin, polyetyleneimin, poly(4-vinylpyridin), poly(vinylamin), poly(4-vinyl-N-alkyl-pyridinhalid), eller kombinasjoner derav. Fremgangsmåten kan benyttes for å transfektere et utvalg polynukleotider, slik som plasmid DNA, viralt DNA, kromosomale fragmenter, antiretnings-oligonukleotider, antiretnings-fosfortioat-oligonukleotider, RNA-molekyler og ribozymer, eller kombinasjoner derav.

Transfeksjons-fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen benyttes fortrinnsvis med eukaryotiske celler, eller pattedyrceller og enda mer foretrekkes urotelialceller. Transfeksjons-fremgangsmåten kan gjennomføres in vitro, eksempelvis hvori transfeksjonsmiddelet påføres til cellene i kultur. Alternativt kan fremgangsmåtene gjennomføres in vivo ved å påføre transfeksjonsmiddelet til celler in vivo. I en foretrukken utførelsesform, påføres transfeksjonsmiddelet til urotelialceller in vivo ved intravesikal tilførsel til et subjekts blære.

I et annet aspekt, frembringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å tilføre en farmasøytisk agens inn i et subjekts urotelialceller. Fremgangsmåten involverer kombinasjonen av det farmasøytiske agens med et solubilisert kolesterolpreparat til dannelse av et farmasøytisk middel, og tilførsel av det farmasøytiske middel intravesikulært inn i subjektets blære, slik at det farmasøytiske middel tilføres inn i subjektets urotelialceller. Fortrinnsvis omfatter det solubiliserte kolesterolpreparat kolesterol som solubilisert med et cyklodekstrin. Fortrinnsvis er cyklodekstrinet metyl-p-cyklodekstrin. Andre egnede cyklodekstriner inkluderer alfa-cyklodekstrin, beta-cyklodekstrin, gamma-cyklodekstrin, sulfatert beta-cyklodekstrin, tertiært amin beta-cyklodekstrin, kvaternært amin beta-cyklodekstrin, 2-hydroksypropyl-beta-cyklodekstrin, 2,6-di-O-metyl-beta-cyklodekstrin, hydroksyetyl-beta-cyklodekstrin, 6-deoxy-6-S-beta-D-galaktopyranosyl-6-thio-cyklomalto-heptaose, sulfobutyleter-beta-cyklodekstrin, karboksymetyl-beta-cyklodekstrin, karboksymetyl-etyl-beta-cyklodekstrin, dietyl-beta-cyklodekstrin, dimetyl-beta-cyklodekstrin, tilfeldig metyl-beta-cyklodekstrin, glukosyl-beta-cyklodekstrin og maltosyl-beta-cyklodekstrin. I en foretrukken utførelsesform, omfatter det farmasøytiske agens (i) minst et polynukleotid og (ii) et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller kombinasjoner derav.

Nok et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament til behandling av blærekreft i et subjekt. Medikamentet omfatter et farmasøytisk agens med et solubilisert kolesterol-preparat, hvor det farmasøytiske agens har antikreft-virkning overfor blærekreftceller, og hvor det terapeutiske middel tilføres intravesikulært inn i et subjekts blære, slik at subjektets blærekreftceller behandles med det farmasøytiske agens. Det solubiliserte kolesterolpreparat omfatter fortrinnsvis kolesterol som solubilisert med et cyklodekstrin. Fortrinnsvis er cyklodekstrinet metyl-^-cyklodekstrin. Andre egnede cyklodekstriner inkluderer alfa-cyklodekstrin, beta- cyklodekstrin, gamma-cyklodekstrin, sulfatert beta-cyklodekstrin, tertiært amin beta-cyklodekstrin, kvaternært amin beta-cyklodekstrin, 2-hydroksypropyl-beta-cyklodekstrin, 2,6-di-O-metyl-beta-cyklodekstrin, hydroksyetyl-beta-cyklodekstrin, 6-deoxy-6-S-beta-D-galaktopyranosyl-6-thio-cyklomalto-heptaose, sulfobutyleter-beta-cyklodekstrin, karboksymetyl-beta-cyklodekstrin, karboksymetyl-etyl-beta-cyklodekstrin, dietyl-beta-cyklodekstrin, dimetyl-beta-cyklodekstrin, tilfeldig metyl-beta-cyklodekstrin, glukosyl-beta-cyklodekstrin og maltosyl-beta-cyklodekstrin.

Et foretrukket farmasøytisk agens til behandling av blærekreft omfatter minst et polynukleotid og enten et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, hvori polynukleotidet/polynukleotidene bibringer antikreft-aktivitet. Eksempelvis kan polynukleotidet/polynukleotidene omfatte minst en ekspresjonsvektor som koder for et protein som utvelges fra den gruppe som består av interleukiner, interferoner, kolonistimulerende faktorer, anti-angiogene faktorer, anti-metastatiske faktorer, membran reseptorer og tumor-undertrykkere. Foretrukne proteiner inkluderer interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), interleukin-9 (IL-9), interleukin-11 (IL-11), interleukin-12 (IL-12), interleukin-13 (IL-13), interleukin-18 (IL-18), interferon-a, interferon-p, interferon-y, granulocytt-makrofag koloni stimulerende faktor (GMCSF), granulocyt koloni-strimulerende faktor (GCSF), makrofag-kolonistimulerende faktor (MCSF), varmesjokkprotein (HSP), p53, anti-angiogene faktorer, eksempelvis antagonister for vaskulær endotel cellevektsfaktor (VEGF) slik som antiretnings-molekyler, antimetastatiske faktorer, eksempelvis vevsinhibitorer for metallproteinaser (TIMP-er), og faktorer som øker BCG-aktivitet, slik som fibronektin-reseptorer. Særskilt foretrukne proteiner inkluderer IL-2, GMCSF og interferon-y, og kombinasjoner derav.

Behandling av blærekreft kan også involvere gjennomføring av en ytterligere antiblærekreft-behandling på subjektet. Eksempelvis er en ytterligere antiblærekreft-behandling som kan kombineres med medikamentet i følge oppfinnelsen Bacillus Calmette-Guerin (BCG)-terapi.

Nok et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører transfeksjonsmidler. Oppfinnelsen frembringer et transfeksjonsmiddel som omfatter: minst et polynukleotid; enten et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer; og et solubilisert kolesterolpreparat. Fortrinnsvis omfatter det solubiliserte kolesterolpreparat kolesterol som solubilisert med et cyklodekstrin. Fortrinnsvis er cyklodekstrinet metyl-p-cyklodekstrin. Andre egnede cyklodekstriner inkluderer alfa-cyklodekstrin, beta- cyklodekstrin, gamma-cyklodekstrin, sulfatert beta-cyklodekstrin, tertiært amin beta-cyklodekstrin, kvaternært amin beta-cyklodekstrin, 2-hydroksypropyl-beta-cyklodekstrin, 2,6-di-O-metyl-beta-cyklodekstrin, hydroksyetyl-beta-cyklodekstrin, 6-deoxy-6-S-beta-D-galaktopyranosyl-6-thio-cyklomalto-heptaose, sulfobutyleter-beta-cyklodekstrin, karboksymetyl-beta-cyklodekstrin, karboksymetyl-etyl-beta-cyklodekstrin, dietyl-beta-cyklodekstrin, dimetyl-beta-cyklodekstrin, tilfeldig metyl-beta-cyklodekstrin, glukosyl-beta-cyklodekstrin og maltosyl-beta-cyklodekstrin. Et foretrukket kationisk lipid er DOT AP, mens en foretrukken dendrimer er Superfect. Andre egnede kationiske lipider og dendrimere inkluderer DOPE, DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM, polylysin, polyhistidin, polyarginin, polyetylenimin, poly(4-vinylpyridin), poly(vinylamin), poly(4-vinyl-N-alkyl pyridin halid), eller kombinasjoner derav. Trasfeksjonsmiddelet kan omfatte en eller flere av et utvalg polynukleotider, slik som plasmid DNA, viralt DNA, kromosomale fragmenter, antiretnings-oligonukleotider, antiretnings-fosfortioat-oligonukleotider, RNA-molekyler og ribozymer, eller kombinasjoner derav.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figurer 1A-1C er fotografier av enten utransfekterte celler eller celler som transfektert med DOTAP eller DMBC, som sammenlikner nivået av ekspresjon for rapportørplasmidet pCMVlacZ. Utransfekterte celler (figur IA) ble ikke farget med X-gal. Noen få celler ble transfeksert med pCMVlacZ/DOTAP og disse ble farget positivt med X-gal (figur IB). Transfeksjon med pCMVlacZ/DMBC resulterte i en økning i antallet av X-gal-positive celler (figur 1C). Således økte transfeksjonseffektiviteten etter tilsatsen av metyl-|}-cyklodekstrin som inneholdt kolesterol (MBC) til DOTAP (D). Figur ID er et stolpediagram som viser virkningen av MBC på konvensjonelle transfeksjon-sagenser. Celler som transfektert med DOTAP+ metyl-^-cyklodekstrin som inneholder kolesterol (DMBC) eller Superfect + metyl-^-cyklodekstrin som inneholder kolesterol (SMBC) fremviste en økning i antallet celler som farger positivt for |$-gal aktivitet sammenliknet med DOTAP eller Superfect alene. MBC forbedret ikke opptaket av nakent DNA. Figur 1E er et stolpediagram som viser en sammenlikning av transfeksjonseffektiviteten for DMBC og konvensjonelt DOTAP: kolesterol (AVDC). Utransfekterte celler (CON) viste ingen p-gal aktivitet som målt ved optisk tett- het ved 420 nm. AVDC var i stand til å transfektere Cos-7-celler men transfekterte ikke MB49-celler effektivt. Derimot var DMBC i stand til å transfektere MB49-celler og forbedre transfeksjonseffektivitet i Cos-7-celler. Figurene 2A-2B er stolpediagrammer som viser ekspresjon av pCMVLacZ-genet over tid. |$-gal aktivitet ble sett så tidlig som en time etter transfeksjon og økte stadig opp til 48 timer (figur 2A). Celler ble transfektert som beskrevet i avsnittet Eksempler og assosiert med hensyn til P-gal aktivitet ved anvendelse av ONPG-assay etter 2,4, 6, 8 og 12 dager. P-gal ekspresjon var meget lavere ved 12 dager (figur 2B). Figurene 3A-3B demonstrerer DNA-internalisering ved celler som eksponert overfor enten DOTAP (D) eller DMBC. Tilstedeværelsen av LacZ-genet ble bestemt for utransfekterte og transfekterte celler ved anvendelse av PCR (figur 3A). GADPH ble benyttet som en positiv kontroll. Ekspresjonen av LacZ-genet i forhold til GAPDH ble bestemt ved densitometrisk skanning av PCR-produktene etter agarose-gelelektroforese (figur 3B). Figurene 4A-4B demonstrerer lokalisering av plasmid DNA ved PCR. Figur 4A viser PCR-amplifiseringsprodukter. LacZ-genet ble funnet både i de nukleonære (N) og cytoplasmiske (CY) fraksjoner fra celler som transfektert med DMBC men utelukkende i den cytoplasmiske fraksjon for celler som transfektert med DOTAP (D). Figur 4B viser en densitometrisk analyse av kjerne (N) og cytoplasmiske (CY) fraksjoner i forhold til GADPH. Figurene 5A-5B er stolpediagrammer som viser den antiproliferative virkning av komplekset DNA:DMBC. Den antiproliferative virkning av de følgende agenser; DM BC/DNA, DOTAP(D)/DNA, DNA, DMBC, DOTAP(D) og MBC ble sammenliknet med ubehandlede MB49-celler (CON) etter eksponering i 2 timer (figur 5 A) og 24 timer (figur 5B). Den rela-tive antiproliferative virkning ble bestemt 48 timer senere ved å sammenlikne inkorporeringer av [<14>C]-tymidin i transfekterte og utransfekterte celler. Figurene 6A-6B er fotografier som viser transfeksjon av urotelialceller in vivo. Transfekterte blærer ble høstet inn 2 dager senere og farget med hensyn til p-galaktosidase-aktivitet. Den utransfekterte blære ble benyttet som en negativ kontroll (figur 6A). I den transfekterte blære, ble epitelceller som vender seg mot lumen farget positive (figur 6B). (Forstørrelse X40) Figur 7 viser cellulær lokalisering av pCMVLacZ etter transient transfeksjon. Organer fra utransfekterte mus etiketteres C for kontrollvev. Organer som høstet fra mus som er transfektert med pCMVLacZ/DMBC-komplekset er etikettert DMBC. Fravær av p-galaktosidasegenet i alle organer bortsett fra blæren ble bekreftet ved PCR. Figur 8A er et stolpediagram som viser virkningen av eksponeringstider på transfeksjonseffektivitet in vitro. Celler ble eksponert overfor DNA:DMBC-komplekset i 15, 30, 60 og 120 minutter in vitro. Lengre eksponeirngstider forbedret transfeksjonseffektiviteten som målt ved den prosentandel celler som farget positivt med X-gal. Figur 8Bi-8Biv er fotografier som viser virkningen av eksponeringstid på transfeksjonseffektivitet in vivo. Blærer ble eksponert overfor pCMVLacZ/DMBC-komplekset i i) 15 minutter, ii) 30 minutter, iii) 60 minutter og (iv) 120 minutter (forstørrelse X40). Flere urotelialceller ble farget med X-gal over tid. Figurene 9A-9B er fotografier som viser va- righeten av ekspresjon in vivo etter enkeltstående intravesical installering. To dager etter transfeksjon farget majoriteten av celler som var vendt mot lumen positivt med X-gal (figur 9A). Tretti dager senere kunne |$-gal-ekspresjon fremdeles observeres i et redusert antall celler (figur 9B) (forstørrelse X100). Figurene 10A-10B er fotografier som viser X-gal farging av normale (figur 10A) og hyperpla-si (figur 10B) blæresnitt. Blærer som implantert med MB49 tumorceller ble transfektert med pCMVlacZ:DMBC i 2 timer. Blåfarging ble observert i overflatemessige luminale cellelag på hyperplasia. (Forstørrelse X100). Figur 11 er et diagram som viser tumorvolumet på dag 7 i mus som behandlet med cytokin-genterapi (IL-2, GMCSF, IL-2 + GMCSF eller IFN-y), eller med DMBC eller i en ubehandlet kontroll. Figur 12 er et diagram som viser tumorvolumet ved dag 38 i mus som behandlet med cytokin-genterapi (IL-2, GMCSF, IL-2 + GMCSF eller IFN-y), eller med DMBC eller i en ubehandlet kontroll. Figur 13 er et stolpediagram som viser tumorvolumet over tid (dager 7-37) i mus som behandlet med cytokin-genterapi (IL-2, GMCSF, IL-2 + GMCSF eller IFN-y), eller med DMBC eller i en ubehandlet kontroll.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

For at oppfinnelsen mer umiddelbart skal kunne forstås, blir visse termer først definert.

Ved anvendelse heri, menes de ulike former av termen "transfekt" (eksempelvis "transfektere", "transfekterte") og vise til den prosess å introdusere et polynukleotidmolekyl fra en eks-tern lokalisering inn i det indre av en celle.

Ved anvendelse heri, menes termen "polynukleotid molekyl" å romme molekyler som består av to eller flere kovalent forbundede nukleotidbaser, inklusive deoksyribonukleinsyre (DNA)-molekyler og ribonukleinsyre (RNA)-molekyler. De nukleotider som danner polynukleotid-molekylet er typisk forbundet med hverandre ved fosfodiester-koplinger, selv om termen "polynukleotidmolekyl" også menes å skulle romme nukleotider som forbundet ved andre koplinger, slik som fosfortioat-koplinger. Ikke begrensende eksempler på polynukleotidmoleky-ler inkluderer plasmid DNA, viralt DNA, kromosomale fragmenter, antiretnings-oligonukleotider, antiretnings-fosfortioat-oligonukleotider, RNA-molekyler og ribozymer.

Ved anvendelse heri menes termen "kationisk lipid" å vise til molekyler som består av minst en, og mest typisk to, fettsyrekjeder og en positivt ladet polar frontgruppe. Typiske kationiske lipider har enten dodecyl (C12)- eller heksadecyl (cetyl, Ci6)-fettsyrekjeder, selv om termen "kationisk lipid" også er ment å skulle omfatte lipider med fettsyrekjeder av andre lengder. Ikke begrensende eksempler på kationiske lipider inkluderer: DOTAP (1,2-diacyl-3-trimetylammonium-propan)

DOPE (dioleoyl-fosfatidyletanolamin)

DOTMA ([2,3-bis(oleoyl)propyl] trimetyl ammonium klorid)

DOGS (dioktadekyl amido glycyl spermin)

DODAB (dioktadekyl diammonium-bromid)

DODAC (dioktadekyl diammonium-klorid)

DOSPA (2,3 dioleoyloksy-N-[sperrninkarboksarninoetyl]-N-N-dimetyl-l-propanaminium)

DC-Kol (3p[N-(n', N'-dimetylaminoetane)-karbamoyl]kolesterol, dioleoyl) DOIC (l-[2-(oleoyloksy)-etyl]-2-oleoyl-3-(2-hydroksyetyl) imidazolinium klorid)

DOPC (dioleoyl fosfatidylcholin)

DMRIE (dimyristooksypropyl dimetyl hydroksyetyl ammonium bromid)

Ved anvendelse heri, menes termen "kationisk polymer" å vise til positivt ladede polymerer med evnen til å konversere nukleinsyre (eksempelvis DNA). Kationiske polymerer inkluderer polyelektrolytter og kationiske polypeptider. Ikke begrensende eksempler på kationiske polymerer inkluderer polylysin, polyhistidin, polyarginin, polyetyleneimin (PEI), poly(4-vinylpyridin), poly(vinylamin) og poly(4-vinyl-N-alkyl pyridinium halid).

Ved anvendelse heri, er termen "dendrimer" ment å skulle vise til kationiske stjerneskuddpo-lymerer (starburst polymers). Disse er sfæriske polymerer som stammer fra en ammonium-kjerne ved sfærisk vekst i lag. Ikke begrensende eksempler på dendrimerer inkluderer Superfect og PAMAM.

Ved anvendelse heri, er termen "kolesterol" ment å skulle vise til en normalt forekommende steroid alkohol (sterol) med fire sammensmeltede ringer, så vel som dens estere med langkje-dede fettsyrer, og analoger derav som beholder evnen til å modulere membran-fluiditet. Kolesterol og kolesterolestere er komponenter i plasma lipoproteiner og dyrecellers ytre celle-membran, og har evnen til å modulere membranfluiditet. Kolesterolanaloger som beholder evnen til å modulere membranfluiditet er kjent innen faget (se eksempelvis Gimpl, G. et al.

(1997) Biochemistry 36:10959-10974) og inkluderer eksempelvis 5-kolesten, 5-pregnen-3|$-ol-20-on, 4-kolesten-3-on og 5-kolesten-3-on.

Ved anvendelse heri er termen "solubilisert kolesterol preparat" ment å skulle vise til et preparat hvori kolesterol har blitt vann-solubilisert ved anvendelse av et solubiliseirngsagens som øker kolesterolets vandige løselighet (d.v.s. vannløseligheten av det solubiliserte kolesterol preparat er høyere enn vannløseligheten av kolesterol alene). Solubiliseringsagenset er typisk en vannløselig forbindelse som her en kavitet inn i hvilken lipofile molekyler kan pakkes. Foretrukne solubiliseirngsagenser er cyklodekstriner. Solubilisering av kolesterolet (eksempelvis inkorporering inn i et solubiliseirngsagens slik som et cyklodekstrin) kan overvåkes ved radioaktiv merking av kolesterolet, eksempelvis [1,2,6,7-3H(N)] kolesterol (kommersielt tilgjengelig fra Dupont/New England Nuclear), se eksempelvis Pang, L. et al. (1999) Biochemistry 38:12003-12011. Termen "solubilisert kolesterol preparat" er ikke ment å skulle vise til kolesterol som er inkorporert inn i et liposoms dobbeltlag.

Som brukt heri, er termen "cyklodekstrin" ment å skulle vise til oligosacchaird-molekyler av syklisk formet torus med en hydrofil ytre overflate og en hydrofob sentral kavitet, hvori dets hydrofobe sentrale kavitet er i stand til å bære lipofile substanser (eksempelvis kolesterol). "Cyklodekstriner" inkluderer molekyler med 6, 7 eller 8 glukopyranose-enheter (hhv. alfa-, beta- og gamma-cyklodekstriner), så vel som større ringer (cyklodekstriner som inneholder fra 9-13 glukopyranoseenheter har vært isolert), selv om beta-cyklodekstriner foretrekkes til anvendelse i den foreliggende oppfinnelse. Termen "cyklodekstrin" er også ment å skulle omfatte derivater av alfa-, beta- og gamma- cyklodekstriner (eller endog større ringer), ikke begrensende eksempler på dette inkluderer sulfatert beta-cyklodekstrin, tertiær amin-beta-cyklodekstrin, kvaternær amin-beta-cyklodekstrin, 2-hydroksypropyl-beta-cyklodekstrin, 2,6-di-O-metyl-beta-cyklodekstrin, hydroksyetyl-beta-cyklodekstrin, 6-deoxy-6-S-beta-D-galaktopyranosyl-6-thio-cyklomalto-heptaose, sulfobutyleter-beta-cyklodekstrin, karboksymetyl-beta-cyklodekstrin, karboksymetyl-etyl-beta-cyklodekstrin, dietyl-beta-cyklodekstrin, dimetyl-beta-cyklodekstrin, tilfeldig metyl-beta-cyklodekstrin, glukosyl-beta-cyklodekstrin og maltosyl-beta-cyklodekstrin. Et foretrukket cyklodekstrin til anvendelse i oppfinnelsen er metyl-^-cyklodekstrin. Strukturen og farmasøytiske anvendelser av cyklodekstriner er gjen-nomgått i Szejtli, J. (1994) Med. Res. Reviews 14:353-386 og Rajewski, R.A. og Stella, V.J.

(1996)7. Pharm. Sei. 85:1142-1169.

Ved anvendelse heri, viser termen "transfeksjon-middel" til et middel som resulterer fra kombinasjonen av et polynukleotid, enten et kationisk lipid eller en dendrimer, og et solubilisert kolesterolpreparat.

Ved anvendelse heri, er termen "farmasøytisk agens" ment å skulle omfatte forbindelse med farmasøytisk aktivitet, hvorav ikke begrensende eksempler inkluderer polynukleotider, proteiner, polypeptider, peptider, kemoterapeutiske agenser, antibiotika og liknende.

Ved anvendelse heri er termen "terapeutisk middel" ment å skulle vise til et middel som dannes ved kombinasjon av i det minste et farmasøytisk agens og et solubilisert kolesterolpreparat, selv om det terapeutiske middel kan inneholde ytterligere komponenter (eksempelvis ytterligere farmasøytiske agenser, et kationisk lipid, en dendrimer eller annen komponent/andre komponenter som forbedrer tilførselen eller den terapeutiske aktivitet av det terapeutiske middel).

Ved anvendelse heri, er termen "subjekt" ment å skulle vise til levende organismer som kan være i behov av behandling med farmasøytiske agenser, eksempelvis i behov av behandling for kreft, slik som blærekreft. Foretrukne subjekter er pattedyr. Eksempler på subjektet inkluderer humaner, apekatter, hunder, katter, mus, rotter, kuer, hester, geiter og får. Subjekter inkluderer også andre vertebrater, slik som fisk og fugler (eksempelvis kyllinger).

Ved anvendelse heri, er termen "antikreft-aktivitet eller anti-cancer-aktivitet" ment å skulle bety at et farmasøytisk agens har en evne til å inhibere veksten, overlevelsesevnen eller meta-stasen hos kreftceller, enten direkte (d.v.s. ved å virke direkte på kreftcellene, slik som et kemoterapeutisk agens som er giftig overfor kreftceller) eller indirekte (eksempelvis ved å stimulere en immunrespons hos kreftcellene).

Ved anvendelse heri, er termen "behandling" ment å skulle vise til en letting av ett eller flere symptomer for den sykdom som behandles.

Ved anvendelse heri er termen "terapeutisk virksom mengde" ment å skulle vise til en mengde (eksempelvis et farmasøytisk agens) som er tilstrekkelig til å oppnå behandling av en sykdom som behandles.

Ved anvendelse heri, er termen "Bacillus Calmette-Guerin (BCG)-terapi" ment å skulle vise til et behandlingsregime for blærekreft hvori BCG administreres intraveiskalt inn i blæren for å stimulere en immunrespons.

Den foreliggende oppfinnelse er i det minste delvis basert på den oppdagelse at et solubilisert kolesterol kan benyttes som et additiv for å forbedre cellers transfeksjonseffektivitet. Et foretrukket solubiliseringsagens for kolesterol er et cyklodekstrin, slik som et metyl-p-cyklodekstrin. Eksperimenter viser at metyl-|$-cyklodekstrin som inneholdt kolesterol i seg selv ikke forbedrer transfeksjonen av nakent DNA men i samband med et kationisk lipid (DOTAP) forbedrer det transfeksjon. In vitro, gav denne tilsats opphav til en 3,8-gangers økning i transfekterte celler sammenliknet med kationisk lipid (DOTAP) alene (se eksempel 1). In vivo, blæreepiteliserte celler lumen ble vellykket transfektert, noe som ikke kunne blitt oppnådd med kationisk lipid alene (se eksempel 6). Når det kationiske lipid som benyttes er DOTAP, ble optimal transfeksjon oppnådd med et DOTAP-DNA-forhold på 2,7:1 (vektvekt) og et forhold DOTAP til kolesterol på 6:1 (vektvekt). Crook et al fant ved anvendelse av en blanding av DOTAP og kolesterol at transfeksjon var optimal når et forhold på 1:1 (vektvekt) av DOTAP:kolesterol ble benyttet (Crook, K. et al (1998) Gene Ther. 5:137-43). Deres data indikerte at det å øke kolesterol økte transfeksjonseffektiviteten i nærvær av serum. Imidlertid var det ved anvendelse av denne kombinasjon av DOTAP:kolesterol meget liten transfeksjon av den murine uroteliale cellelinje MB49 selv om COS-7-celler ble transfektert effektivt.

Metyl-P-cyklodekstrin/kolesterol (MBC)-komplekset er i stand til å donere kolesterol til cel-lemembranet. Selv om meningen ikke er å være begrenset av mekanisme, ville doneringen av kolesterol påvirke cellemembranets fluiditet/rigiditet og permeabilitet. Kolesterolnivåer i membraner har vært vist å påvirke utgående av GPI-forankrede proteiner i endosomer, idet utmatning økte resykleringen av disse proteiner via endosomer (Rodal, S.K. et al. (1999) Mol. Biol. Cell. 10:961 -74). Det er også mulig at DOTAP/metyl-p-cyklodekstrin/kolesterol (DMBC)-komplekset som donerer kolesterol til DOTAP molekylene påvirker strukturen av de DOTAP:DNA-komplekser som dannes. Beta cyklodekstriner har vært vist å forbedre internaliseringen av adenoviruser ved tarmceller (Croyle, M.A. et al. (1998) Pharm. Res. 15:1348-1355). Det forbedrede opptak ble tilregnet til cyklodekstriners evne til å rive opp cellemembraner. Ingen av de cyklodekstriner som ble benyttet i denne studie bar kolesterol. Ved anvendelse av utelukkende metyl-|$-cyklodekstrin i seg selv i kombinasjon med DOTAP og DNA skjedde de ingen transfeksjon av murine blæreepitelceller, noe som indikerer betyd-ningen av det kolesterol som er pakket i cyklodekstriner for den økte transfeksjonseffektivitet som frembringes ved den foreliggende oppfinnelse.

I en nylig studie, analyserte Zabner og medarbeidere den mekanisme for gentilførsel som formidles av kationiske lipider og identifiserte bevegelsen av plasmid DNA fra cytoplasma til kjernen som den begrensende faktor for vellykket genoverføring (Zabner, J. et al. (1995) J. Biol. Chem., 270:18997-9007). I den foreliggende oppfinnelse ble det funnet at selv om inkluderingen av kolesterol forbedret transfeksjonseffektiviteten hadde det liten virkning på opptaket av plasmid DNA ved celler. Imidlertid ble det funnet at med DMBC, ble plasmid DNA funnet i kjernen (se eksempel 4), noe som antyder at inkluderingen av DMBC kan spille en rolle i unnslipningen av DNA fra endosomer, som muligens unngår degradering i lysosomer.

I det foreliggende system, kan ekspresjon av et transfektert gen i urotelialceller observeres in vivo opp til en måned etter transfeksjonshendelsen. Dette kan være relatert til den langsommere omsetning av urotelialceller in vivo, idet genekspresjonen hurtig gikk tapt in vitro etter multiple cellereplikasjoner. Morris, B.D. et al, ( J. Uroi. (1994) 152:506-509), som benyttet adenoviruser for å transfektere blæren, viste at genekspresjon var innlysende i minst 7 dager. Harimoto et al. ( Br. J. Uroi. (1998) 8_!:870- 874) viste at genekspresjon ble observert opptil 10 dager med HVJ-liposomer og opptil to uker med et enkelt partikkelkanon-bombardement. Således er DMBC-transfeksjonssystemet ifølge den foreliggende oppfinnelse like varig om ikke mer enn de for tiden foretrukne teknikker for in vivo blæretransfeksjon.

En to timers eksponering av celler overfor DMBC/DNA-komplekset viste ingen virkning på celleformering (se eksempel 5). MBC i seg selv forårsaket ikke en minsking i celleformering etter en 24 timers eksponering men DOTAP syntes å gjøre dette. Imidlertid var dette ikke statistisk signifikant. De anti-formeringsmessige virkninger av forlenget eksponering kan være fordelaktig, idet den ville tjene til å forbedre den terapeutiske genformidlede avliving av tumorceller. En studie viste at når metyl-P-cyklodekstrin ble benyttet for seg selv, hadde det en antitumor effekt på humant tumor-xenograft i atymiske nakne mus (Grosse, P.Y. et al.

(1998) Br. J. Cancer 78:1165-9). Denne virkning er trolig relatert til utstrømningen av kolesterol fra celler.

Intravesikulært instillering av DMBC/DNA-komplekset, i bare to timer, var tilstrekkelig til å maksimalisere eksponering av endotelet overfor liposom/DNA-komplekset og sikre effektiv transfeksjon (se eksempel 7). Ekspresjon av et rapportørgen (|$-galactosidase) var begrenset til blæren. Morris, B.D. et al. ( J. uroi. (1994) 152:506-509), som benyttet adenoviruser for å transfektere blæren, gjorde en liknende observasjon som indikerer at denne oppdemning er et resultat av blærens arkitektur og ikke på grunn av det tilførselssystem som ble benyttet.

Transfeksjonssystemet ifølge oppfinnelsen har også vært vist å være virksomt og tilføre cytokingener in vivo for utsletting av tumorer (se eksempel 9).

Tatt i betraktning det foregående, vedrører et aspekt ifølge oppfinnelsen fremgangsmåter for

transfeksjon av i det minste et polynukleotid inn i celler. Som beskrevet videre i eksemplene, forbedrer anvendelsen av solubilisert kolesterol transfeksjonseffektiviteten av polynukleotider som kompleksert med agenser slik som kationiske lipider, kationiske polymerer og dendrimerer. Dermed, i et aspekt, frembringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for transfeksjon av i

det minste et polynukleotid inn i celler, idet fremgangsmåten omfatter:

kombinere:

(i) i det minste et polynukleotid; (ii) et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller kombinasjoner derav; og

(iii) et solubilisert kolesterolpreparat

til dannelse av et transfeksjonsmiddel; og

anvendelse av transfeksjonsmiddelet overfor celler, slik at cellene transfekteres med polynukleotidet.

Det solubiliserte kolesterolpreparat omfatter fortrinnsvis kolesterol som solubilisert med et cyklodekstrin, aller helst metyl-|$-cyklodekstrin. Andre egnede cyklodekstriner inkluderer de som er opplistet i det foregående. Cyklodekstriner kan tilveiebringes fra kommersielt tilgjengelige kilder. Et foretrukket kationisk lipid er DOTAP. En foretrukken dendrimer er Superfect. Andre egnede kationiske lipider, kationiske polymerer og dendrimerer inkluderer de som er opplistet i det foregående. Kationiske lipider, kationiske polymerer og dendrimerer kan tilveiebringes fra kommersielt tilgjengelige kilder. Transfeksjonsmiddelet kan inkludere en type av reagens (ii), d.v.s. enten et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller alternativt kan reagens (ii) være en kombinasjon, slik som både et kationisk lipid og en kationisk polymer, eller to ulike typer av kationiske lipider eller to ulike typer av kationiske polymerer. Når reagensen (i), (ii) og (iii), dannes fortrinnsvis det solubiliserte kolesterolpreparat med det kationiske lipid, den kationiske polymer eller dendrimeren umiddelbart forut for tilsatsen av polynukleotidet/polynukleotidene og blandingen blir deretter inkubert i løpet av et tidsrom, eksempelvis 15 minutter ved romtemperatur, til dannelse av transfeksj onsmiddelet.

Mengdene av hvert reagens som benyttes kan variere avhengig av betingelser slik som hvilke særskilte reagenser som benyttes og hvilken celletype som skal transfekteres. Imidlertid kan optimale transfeksjonsbetingelser bestemmes ved vanlige fremgangsmåter, slik som anvendelse av det transfeksjonssystem som er beskrevet i eksemplene. Eksempelvis kan det optimale forhold for kationisk lipid (eller kationisk polymer eller dendrimer) til solubilisert kolesterol være forskjellig for ulike celletyper, selv om forholdet på 1:2 (DOTAP:MBC) ble funnet å være optimalt for urotelialceller in vitro. Et ikke begrensende spenn av forhold mellom kationisk lipid (eller kationisk polymer eller dendrimer) og solubilisert kolesterol er 2:1 til 1:3 (vekt/vekt). Ved fremstilling av det solubiliserte kolesterolpreparat (eksempelvis metyl-|$-cyklodekstrin/kolesterol, eller MBC), er en foretrukken proporsjon av kolesterol til cyklodekstrin 60 mg kolesterol til 600 mg cyklodekstrin (metyl-|$-cyklodekstrin) (d.v.s. 1:12 vekt/vekt kolesterolxyklodekstrin), selv om denne proporsjon igjen kan bli optimalisert avhengig av de spesifikke reagenser som benyttes og forhold som er involvert. Et ikke begrensende spenn av forhold mellom kolesterol og cyklodekstrin er 1:1 til 1:20. Den mengde polynukleotid som benyttes kan også varieres avhengig av de reagenser som benyttes og i vertsceller som transfekteres. Et ikke begrensende spenn for mengden polynukleotid (eksempelvis DNA) som benyttes er 0,1 til 100 u,g, fortrinnsvis 1-50 u,g. Et ikke begrensende spenn for mengden kationisk lipid er 1 til 200 fig, fortrinnsvis 10-50 fig. Et ikke begrensende spenn for mengden dendrimer (eksempelvis Superfect) er 1 til 300 fig, fortrinnsvis 5-25 fig. For in vivo anvendelse, ville mengden av hver reagens trolig prøve å bli økt fra de foretrukne mengder

som er fremlagt i det foregående.

Et ikke begrensende eksempel på foretrukne reagensmengder når DOTAP benyttes som et kationisk lipid er: 7,5 fig DNA + 20 fig DOTAP + 40 fig metyl-|$-cyklodekstrin-solubilisert kolesterol. Et ikke begrensende eksempel på foretrukne reagensmengder når Superfect benyttes som dendrimeren er: 2 fig DNA + 22,5 fig Superfect + 10 fig metyl-|$-cyklodekstrin-solubilisert kolesterol.

Transfeksjonsmetoden ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å transfektere et utvalg av ulike polynukleotider, slik som plasmid DNA, viralt DNA, kromosomale fragmenter, antiretnings-oligonukleotider, antiretnings-fosfortioat-oligonukleotider, RNA-molekyler og ribozymer, eller kombinasjoner derav. For genterapi-formål, er polynukleotidet/polynukleotidene typisk en ekspresjonsvektor (beskrevet mer detaljert i det følgende) som koder for et protein som skal frembirnges for terapeutisk bedring. Transfeksjonsmetoden benyttes fortirnnsvis for å transfektere eukaryotiske celler, enda heller pattedyrceller. Transfeksjonsmetoden er særskilt effektiv i transfeksjon av urotelialceller, som forblir resistente overfor mange andre typer transfeksjonsmetoder. Transfeksjonsmetoden kan utføres in vitro, eksempelvis ved å påføre transfeksjonsmiddelet til celler i kultur. Tidsrommet for å kontakte transfeksjonsmiddelet med cellene i kultur kan optimaliseres ved vanlige fremgangsmåter. Et ikke begrensende eksempel på en transfeksjonstid in vitro er 48 timer, fulgt av vasking av cellene (eksempelvis med fosfatbufferet salin). Alternativt kan transfeksjonsmetoden utføres in vivo, ved å påføre transfeksjonsmiddelet til celler in vivo. I en foretrukken utførelsesform, påføres transfeksjonsmiddelet til urotelialceller in vivo ved intravesikal tilførsel (eksempelvis via et kateter) til et subjekts blære. Andre målvev for transfeksjon in vivo inkluderer eksempelvis mage, muskel, lunge, epitelceller, colon, uterus, tarm, hjerte, nyre, prostata, hud, øye, hjerne, penisvev og nesevev.

I et annet aspekt, frembringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament for tilførsel av et farmasøytisk agens inn i blærens urotelialceller, basert på solubilisert kolesterols evne til å forbedre urotelialcellers opptak av materiale. Dermed frembringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å tilføre et farmasøytisk agens inn i et subjekts urotelialceller, idet medikamentet omfatter:

det farmasøytiske agens og et solubilisert kolesterolpreparat; og

medikamentet tilføres intravasikulært inn i subjektets blære, slik at det farmasøytiske agens tilføres inn i subjektets urotelialceller.

Fortrinnsvis omfatter det solubiliserte kolesterolpreparat kolesterol som solubilisert med et cyklodekstrin, aller helst metyl-|$-cyklodekstrin. Andre egnede cyklodekstriner inkluderer de som er opplistet i det foregående. Det farmasøytiske agens kan være eksempelvis minst et polynukleotid og et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer. Alternativt kan det farmasøytiske agens eksempelvis være et kemoterapeutisk agens, et antibiotikum, et interferon, et interleukin, en kolonistimulerende faktor, en anti-angiogen faktor, en antimetastatisk faktor, en membran reseptor eller annet agens med terapeutisk virkning. Når det farmasøy-tiske agens er et polynukleotid, er et foretrukket kationisk lipid DOTAP, mens en foretrukken dendrimer er Superfect. Andre egnede kationiske lipider, kationiske polymerer og dendrimerer inkluderer de som er opplistet i det foregående.

I et annet aspekt frembringer oppfinnelsen fremgangsmåter for fremstilling av et medikament for å behandle blærekreft i et subjekt, idet medikamentet omfatter: et farmasøytisk agens og et solubilisert kolesterolpreparat, hvori det farmasøytiske agens har antikreft-virkning overfor blærekreftceller; og

hvor medikamentet tilføres intravesikulært inn i et subjekts blære, slik at subjektets blærekreftceller behandles med det farmasøytiske agens.

Fortrinnsvis omfatter det solubiliserte kolesterolpreparat kolesterol som solubilisert med et

cyklodekstrin, aller helst metyl-P-cyklodekstrin. Andre egnede cyklodekstriner inkluderer de som er opplistet i det foregående. Det farmasøytiske agens kan eksempelvis være i det minste et polynukleotid og et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer. Fortrinnsvis tilføres det farmasøytiske agens i terapeutisk virksomme mengder. Når det farmasøytiske agens er et polynukleotid/polynukleotider, er et foretrukket kationisk lipid DOTAP, mens en foretrukken dendrimer er Superfect. Andre egnede kationiske lipider, kationiske polymerer og dendrimerer inkluderer de som er opplistet i det foregående.

Polynukleotidet omfatter fortrinnsvis i det minste en ekspresjonsvektor som koder for et protein/proteiner av terapeutisk nytte i behandlingen av blærekreft. En ekspresjonsvektor omfatter et polynukleotid i en form som er egnet for ekspresjon av polynukleotidet i celler som skal transfekteres, noe som betyr at den rekombi- nante ekspresjonsvektor inkluderer en eller flere regulatoriske sekvenser, vanligvis utvalgt på basis av den type celler som skal transfekteres, som er operativt forbundet med det polynukleotid som skal uttrykkes. Innen en rekom-binant ekspresjonsvektor, siktes det mot at "operativt forbundet" skal bety at polynukleotidet av interesse er forbundet med den regulatoriske sekvens/de regulatoriske sekvenser på en måte som muliggjør ekspresjon av polynukleotidet (eksempelvis transkripsjon/translasjon i en vertscelle når vektoren følges inn i vertscellen). Termen "regulatorisk sekvens" er ment å skulle inkludere promotorer, forbedrere og andre ekspresjonskontroll-elementer (eksempelvis polyadenylerings-signaler). Slike regulatoriske sekvenser er velkjente innen faget og er eksempelvis beskrevet i Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Regulatoriske sekvenser inkluderer de som dirigerer konstitutiv ekspresjon av et polynukleotid i mange typer vertsceller og de som dirigerer ekspresjon av polynukleotidet bare i visse vertsceller (eksempelvis vevsspesifikke regulatoriske sekvenser). Det vil av fagfolk kunne innses at utformingen av ekspresjonsvektoren kan avhenge av slike faktorer som valget av den vertscelle som skal transformeres, det ønskede nivå for ekspresjon av protein, etc.

Eksempel på pattedyrs ekspresjonsvektorer inkluderer pMex-Neol, pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329:840) og pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195). Ved anvendelse i pattedyrceller, blir ekspresjonsvektorens styringsfunksjoner ofte frembrakt av virale regulatoriske elementer. Eksempelvis avledes vanlig anvendte promotorer fra polyoma, Adenovirus 2, cytomegalovirus og Simian Virus 40. Alternativt kan pattedyrs ekspresjonsvektorer som er i stand til dirigere ekspresjonen av et polynukleotid fortrinnsvis i en bestemt celletype, benyttes (d.v.s. en ekspresjonsvektor som omfatter vevsspesifikke regulatoriske elementer) noe som er velkjent innen faget.

Eksempler på egnede proteiner for ekspresjon ved hjelp av en ekspresjonsvektor i blæren for behandling av blærekreft inkluderer interleukiner, interferoner, kolonistimulerende faktorer, anti-angiogene faktorer, anti-metastatiske faktorer, membran reseptorer og tumor-undertrykkere. Foretrukne proteiner inkluderer interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), interleukin-9 (IL-9), interleukin-11 (IL-11), interleukin-12 (IL-12), interleukin-13 (IL-13), interleukin-18 (IL-18), interferon-a, interferon-[$, interferon-y, granulocytt-macrofag-kolonistimulerende faktor (GMCSF), granulocytt-kolonistimulerende faktor (GCSF), macrofag-kolonistimulerende faktor (MCSF), varmesjokkprotein (HSP), p53, anti-angiogene faktorer, eksempelvis antagonister til vaskulære endotel cellevekstfaktor (VEGF) slik som antiretnings-molekyler, anti-metastatiske faktorer, eksempelvis vevsinhibitorer for metallproteinase (TIMPs), og faktorer som øker BCG aktivitet, slik som fibronektirnresepto-rer [ sic.], interleukiner, interferoner, kolonistimulerende faktorer og tumor-undertrykkere. Foretrukne proteiner som skal uttrykkes er IL-2, GMCSF eller interferon-y, eller kombinasjoner derav (eksempelvis minst to av IL-2, GMCSF og interferon-y).

Alternativt kan det farmasøytiske agens eksempelvis være et kemoterapeutisk agens, et antibiotikum, et interferon, et interleukin, en kolonistimulerende faktor eller annet agens med terapeutisk aktivitet.

Behandling av blærekreft med et medikament i samsvar med oppfinnelsen kan kombineres med en eller flere ytterligere anti-blærekreft-behandlingsmetoder. En foretrukken ytterligere behandlingsmetode er BCG-terapi. Andre eksempler på ytterligere kreftbehandlinger inkluderer kemoterapi og strålingsterapi.

I et annet aspekt, frembringer oppfinnelsen også transfeksjonsmidler. Transfeksjonsmidlene ifølge oppfinnelsen omfatter: (i) i det minste et polynukleotid; (ii) et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller kombinasjoner derav; og

(iii) et solubilisert kolesterolpreparat.

Fortrinnsvis omfatter det solubiliserte kolesterolpreparat kolesterol som solubiliserer med et cyklodekstrin, aller helst metyl-P-cyklodekstrin. Andre egnede cyklodekstriner inkluderer de som er opplistet i det foregående. Et foretrukket kationisk lipid er DOTAP, mens en foretrukken dendrimer er Superfect. Andre egnede kationiske lipider, kationiske polymerer og dendrimerer inkluderer de som er opplistet i det foregående. Transfeksj onsmidlene ifølge oppfinnelsen kan frembringes som en innpakket formulering, eksempelvis hvori hver reagens-komponent er frembrakt i en beholderanordning. Den innpakkede formulering kan videre inkludere instruksjoner for anvendelse av transfeksjonsmiddelet for å transfektere celler.

Den foreliggende oppfinnelse illustreres videre ved de følgende eksempler.

Spesifikke materialer og fremgangsmåter som benyttes i de følgende eksempler er beskrevet nedenfor:

Materialer og fremgangsmåter

PCMVlacZ ble tilveiebrakt fra Clontech, Palo Alto, CA, USA. Den murine overgangscelles carcinom-cellelinje MB49 ble tilveiebrakt fra Dr. Timothy Ratliff ved University of Iowa, USA. Plasmid DNA ble preparert ved anvendelse av Endofree plasmid Qiagen sats (Qiagen GmbH, Tyskland). Fugene ble innkjøpt fra Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland, Superfect fra Qiagen GmbH, Tyskland, DEAE dextran fra Promega, Madison, USA og kalsiumfos-fat fra Merck, Frankfurt, Tyskland.

In vitro assay for DMBC transfeksjonseffektivitet

2xl0<5>celler ble utplatet på dekkglass, i 6-fordypningers vevskulturskåler i RPMI1640 supplert med 10% FBS (Biosciences, Australia), 2med mer L-glutamin, 50U/ml penicillin og 0,05 mg/ml streptomycin (Sigma Chemical Company St. Louis, MO, USA). Celler ble vasket to ganger med 1XPBS og transfektert med 7,5 j4g pCMVlacZ som kompleksert med 20 \ x% DOTAP (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og 40 jig metyl-|$-cyklodekstrin-solubilisert kolesterol (Sigma). Kompleksene ble dannet ved å fylle opp DNA og DMBC til 165 \ il med 20 mM Hepes buffer (GibcoBRL, Rockville, MD, USA) og blande i 15 minutter. Dette ble ført til 1 ml med RPMI 1640 medium, og tilsatt til fordypningene i det egnede tidsrom, deretter vasket og erstattet med 3 ml frisk RPMI 1640 medium. Etter 48 timer, ble cellene vasket med PBS, fiksert og farget som beskrevet i Weiss, DJ. et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8:1545-54. Det gjennomsnittlige antall blå kolonier, i forhold til det totale antall celler i fire kvadranter i X 100 forstørrelse, ble benyttet for å bestemme transfeksjonseffektiviteten. Transfeksjoner ble utført i duplikater og gjentatt to ganger.

Formerings- assays

Formering ble bestemt ved å måle [<14>C]-tymidin-inkorporering. lxlO<4>celler ble utplatet per skål i en 96 fordypningers fiatebundet vevskulturskål (Nunc, Roskilde, Danmark) og transfek tert ved optimale betingelser som beskrevet i det foregående i løpet av det passende tidsrom (2 timer og 24 timer eksponering), vasket og inkubert med frisk RPMI 1640 ved 31°C. Etter 32 timer, ble supernatanter fjernet, og cellene ble skylt med 1XPBS. Triplikat-fordypninger ble inkubert med 0,2 jiCi/ml, [<14>C]-tymidin (spesifikk aktivitet 56,5 mCi/mmol; Du Pont, Wilmington, DE, USA) i 16 timer. Prøvene ble høstet som beskrevet i Zhang, Y. et al. (1997) Int. J. Cancer 7J_: 851 -7. [<14>C]-tymidin-inkorporering ble uttrykt som en prosentandel av inkorporeringen i kontrollceller, som besto av utransfekterte celler. Den ikke-parametriske Mann-Whitney U-test ble benyttet for å beregne statistisk signifikans. Sann-synlighetsverdier på p<0,05 ble betraktet som statistisk signifikant.

Påvisning av rapportørgen- ekspresjon in vivo etter intravesikal tilførsel av DNA- DMBC

5-7 uker gamle C57BL6 hunnmus ble anaestisert; deres blærer ble kateterisert med 24 G i.v. kateter og skylt med IX PBS. DMBC- og DNA-kompleks ble blandet i 15 minutter som beskrevet i det foregående. Den endelige blanding ble ført til et sluttvolum på 465 (il med IX PBS av hensyn til enkel instillering og introdusert intravesikalt. Transfeksjons-eksponeringstider på 15 minutter, 30 minutter og 1 time eller 2 timer ble evaluert. På ulike tidspunkter ble blærene skylt med IX PBS for å fjerne DNA/DMBC-kompleks. Musene ble avlivet 24 timer etter behandling. Forsøk ble utført i duplikater.

Histokjemi

Blærer, lunger, nyrer, hjerte, lever og milt ble fjernet og hurtigfryst i flytende nitrogen (Werthman, P.E. et al. (1996) J. Uroi. 55:53-6). Kryostatsnitt av 6 (im i tykkelse ble fiksert i 1,25% glutaraldehyd i 10 minutter ved 4<*>C fulgt av inkubering med X-gal i 4 timer ved 37^ og ble motfarget med hematoksylin.

Gjennomføring av PCR på organer

For å påvise tilstedeværelsen av det transfekterte plasmid ble PCR-primere som var unike for genet lacZ benyttet. Den anvendte oppstrøms primer var 5'-GCCGACCGCACGCCGCATCCAGC-3' (SEKV. ID NR: 1) og den nedstrøms primer var 5'-CGCCGCGCCACTGGTGT-3' (SEKV. ID NR:2). PCR ble utført på et totalvolum av 25 \ i\ som inneholdt 100 ng genomisk DNA, 2 |il (2,5 Med mer) dNTPs (New England Biolabs, Beverly, USA), 2,5 (il (10 X) reaksjonsbuffer, 1 (il av hver primer (10 uM) og 1 (il (2U) Taq polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland). Det anvendte PCR-program var som følger: 94<0>C i 30 sekunder, fulgt av 60^ i 30 sekunder og 72°C i 30 sekunder i 40 sykluser. GADPH ble benyttet som en kontroll for PCR-analyse. Primsekvensene for GADPH er opp-strøms primer 5'-CTGCGACTTCAACAG-3' (SEKV. ID NR:3) og nedstrøms primere 5'-CACCCTGTTGCTGTAG-3' (SEKV. ID NR:4). PCR-programmet var som følger: 94°C i 30 sekunder, 58^ i 30 sekunder og 72^ i 30 sekunder i 40 sykluser. Amplifisert DNA ble analysert ved elektroforese på 1% agarosegel og visualisert med etidium bromid under UV-lys. Densitometir-skanning ble utført ved anvendelse av programvaren Image master VDS og bånd ble analysert ved anvendelse av programvaren Analytical Imaging System (Imaging Research Inc., Ontario, Canada).

ONPG Assay for transfeksjon

Transfekterte celler ble vasket to ganger med IX PBS og deretter lyset med 150 (il lysebuffer. Proteininnholdet av lysatene ble målt ved Micro BCA Protein assay (Pierce, Rockford, IL, USA) med bovint serumalbumin som norm. Celleprotein-lysater ble testet i en reaksjons- blanding som inneholdt 4 mg/ml ONPG og inkubert ved 31°C i 1 time. Reaksjoner ble stoppet med tilsats av 500 (ti IM Na2C03og absorbansen ved 420 nm ble målt.

Radioaktiv og cytoplasmisk analyse ved PCR

Radioaktiv og cytoplasmisk fraksjonering av transfekterte celler ble utført ved anvendelse av mild lysing med TNE buffer (lOmM Tris, pH (pH8), lmM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Igepa-cal) og etterlatt på is i 10 minutter fulgt av sentrifugering ved 7K i 5 minutter ved 4°C i en mikrosentrifuge. Den således frembrakte supernatant ble etikettert som cytoplasmisk ekstrakt og ble overført til et friskt rør. Det radioaktive ekstrakt ble preparert ved behandling med en proteinase K-digerering (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH8, 0,5% SDS 25 mM EDTA og 0,1 mg/ml proteinase K) av det pelleterte materialet over natten ved 50°C. Radioaktivt DNA ble ekstrahert med fenol/kloroform to ganger fulgt av etanolutfelling. PCR-analyse ble utført som beskrevet i det foregående.

Cellelinjer og cytokin- gener

Den murine transisjonelle celle carcinomcellelinje MB49 og cytokingener ble velvillig tilveiebrakt av Dr. Timothy Ratliff ved University of Iowa, USA. Cytokingene ble klonet inn i pCI-neo ekspresjonsvektoren (Promega). Plasmid DNA ble preparert ved anvendelse av Endofree plasmid Qiagen sats (Qiagen GmbH, Tyskland).

Dyr

Hunnmus C57/BL6 (ca. 4-6 uker gamle) ble tilveiebrakt fra Laboratory Animals Centre of the National University of Singapore og holdt ved universitetets Animal Holding Unit.

In vitro ekspresjon av overflatemarkører

2 x 10<5>celler ble utplatet i 6 fordypningers vevskulturskåler i RPMI 1640 supplert med 10% FIBS (Biosciences, Australia), 2mM L-glutamin, 50U/ml penicillin og 0,05 mg/ml streptomycin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Celler ble vasket to ganger med IX PBS og transfektert med 7,5 fig enkeltstående cytokingener og 3,75 fig av hvert cytokingen for IL-2 + GMCSF-kombinasjonen, hvilket ble kompleksert med 20 fig DOTAP (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og 40 fig metyl-|}-cyklodekstrin-solubilsert kolesterol (Sigma). Kompleksene ble dannet ved å føre DNA og DMBC til 165 yX med 20 mM Hepes buffer (Gibco BRL, Rockville, MD, USA) og blanding i 15 minutter. Dette ble ført til 1 ml med RPMI 1640 medium, og tilsatt til fordypningene i 2 timer og deretter vasket og erstattet med 3 ml friskt RPMI 1640 medium. Etter 48 timer, ble cellene vasket med PBS og fiksert og etikettert med anti-MHC I, anti-MHC II og anti-FAS, antistoffer. Det sekundære antistoff som ble benyttet var fluorescein isotiocynat (FITC; Pharmingen, CA, USA). Isotype kontroll-antistoffer ble også inkubert. De etiketterte celler ble analysert på et strømnings cytome-ter med dobbelt laser (Coulter Epics Elite, Florida, USA).

Antitumorvirkninger av ulike cytokinbehandlinger

En enkelt cellesuspensjon med 5 x 10<5>levedyktige MB49 celler i 0,1 ml PBS injisert subcu-tant inn i flanken, 7 til 10 dager før behandling. Bare mus med en jevn tumorstørrelse av ca. 0,15 - 0,25 cm<3>ble utvalgt og tilfeldig fordelt inn i grupper for intratumoral behandling. Behandlinger ble utført to ganger om uken i tre uker ved intratumoral injeksjon og besto av 100 \ il av enten IX PBS, DMBC (DOTAP + metylert-p-cyklodekstrin inneholdende kolesterol), IL-2 + DMBC, GMCSF + DMBC, UNy + DMBC eller kombinasjonen av IL-2 + GMCSF + DMBC. Aldertilpassede naive tumorkontroller mottok ikke noen behandling. Tumorstørrelse ble målt krompassere hver tredje dag før injeksjon opptil dag 38. Be-regningen av tumorvolum ble utført ved formelen: lengde X bredde X høyde.

Enkeltcelle- suspensjon og strømningscytometri

Milter ble høstet inn som beskrevet. Enkeltcellesuspensjoner ble etikettert med anti-CD4, ap, y6, NK og anti CD-8-antistoffer som hadde blitt konjugert med phycoerithrin (PE) og CD3+ celler ble etikettert med antistoffer konjugert med fluorescein isotiocynat (FITC). Alle antistoffer ble innkjøpt fra Pharmingen, CA, USA. Etiketterte celler ble analysert på et strømningscytometer med dobbelt laser.

mRNA- ekstrahering og RT- PCR

For total RNA-ekstrahering, ble milt homogenisert i 1 ml Trizol reagens (Gibco BRL, Rockville, MD, USA) ifølge produsentens instruksjoner. RT-PCR ble utført som beskrevet.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1; In vitro transfeksjonseffektivitet av ikke-virale agenser Ekspresjonsplasmidet pCMVlacZ ble benyttet for å fastsette transfeksjonseffektiviteten for ulike ikke virale agenser, over en 2 timers periode, på MB49 celler. Både DOTAP og Superfect var i stand til å transfektere MB49 celler innen en 2 timers periode med effektiviteter av ca. hhv. 20,4% og 14,8% (se tabell 1 i det følgende).

Transfeksjonsbetingelse ble optimalisert for hvert agens, for å sikre maksimal transfeksjon ved 2 timer. Transfeksjonseffektivitet ble målt ved å telle opp den prosentandel celler som ble farget blått med X-gal. Optimal transfeksjon ble oppnådd ved anvendelse av 7,5 jig DNA og 20 fig DOTAP. Med Superfect behøvdes en mye mindre mengde DNA for å oppnå liknende transfeksjonsandeler som for DOTAP, nemlig 2 jig DNA med 7,5 (il Superfect. En meget lav transfeksjonsandel på 1,02% ble oppnådd med Fugene. Verken kalsium klorid (0-40fig) eller DEAE-Dekstran (0-2fig) eller nakent DNA kunne transfektere MB49 celler.

For å forbedre tranfeksjonsandeler, ble MBC blandet med DOTAP umiddelbart forut for tilsatsen av DNA og blandingen ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. Tilsats av MBC resulterte i en økning i det antall celler som ble vellykket transfektert som vist i figur 1 A-C. Økningen i transfeksjonseffektivitet var 3,9 foldig når MBC ble benyttet i kombinasjon med DOTAP og 2,4 ganger med Superfect (figur ID). Imidlertid varierte den mengde MBC som behøvdes for å produsere denne økning i transfeksjonseffektivitet med det agens som ble benyttet. Optimal DOTAP transfeksjon ble tilveiebrakt ved anvendelse av 40 fig MBC mens 10 jig var optimalt for Superfect. Idet de beste transfeksjonsandeler ble oppnådd med DOTAP + MBC (DMBC), ble denne kombinasjon benyttet i alle senere eksperimenter. En sammenlikning ble også utført mellom transfeksjonseffektiviteten for DMBC og en konvensjonell DO TAP:kolesterol (1:1) blanding (AVDC). AVDC var i stand til å transfektere Cos-7 celler men transfekterte ikke MB49 celler særlig bra. Derimot var DMBC i stand til å transfektere MB49-celler så vel som å forbedre transfeksj onen av Cos-7 celler som sammenliknet med AVDC (figur 1E).

EKSEMPEL 2; Varighet av [3-galaktosidase-genekspresjon

Undersøkelse av p-galaktosidase (P-gal)-genekspresjon som en funksjon av tid etter transfeksjon med DMBC ble utført. Som vist i figur 2A, opptrådte proteinekspresjon, som bestemt -ved ONPG-assay, innen 1 time etter fjerningen av agenset og økte opp til 48 timer etter transfeksjon. Etter 48 timer, forelå det en stabil minsking i proteinekspresjon og ved 12 dager etter transfeksjon, hadde |$-gal-aktiviteten minsket 7 foldig sammenliknet med ekspresjonen på dag 2 (figur 2B). Det virker som når cellene replikeres, går genet tapt og/eller stil-lenes.

EKSEMPEL 3; DNA opptak etter transfeksjon

For å kunne bestemme hvorvidt det forelå en forskjell i DNA opptak ved anvendelse av DOTAP og DMBC, ble den mengden plasmid DNA som ble ekstrahert fra celler målt 2 timer etter transfeksjon. For å minimalisere mengden overflatebundet DNA og få et bedre estimat av sant DNA opptak, ble det utført multiple vaskinger med 1XPBS så vel som digerering med DNAse. Figurene 3A og 3B viser PCR analysen av DNA som ekstrahert fra MB49 celler. MB49 celler synes å ha internalisert liknende mengder plasmid DNA med begge agenser. Derfor skyldes de observerte forskjeller i transfeksjonseffektiviteter ikke det differensielle opptak av plasmid DNA men muligens stabiliteten av DNA når det en gang er tatt inn i cellene.

EKSEMPEL 4; Radioaktiv og cytoplasmisk akkumulering av plasmid DNA

For å bestemme lokaliseringen av DNA etter transfeksjon med DOTAP og DMBC, ble radioaktive og cytoplasmiske ekstrakter preparert fra transfekterte celler. Tilstedeværelsen av DNA i disse ekstrakter ble bestemt ved anvendelse av PCR. I celler som transfektert med DMBC, ble LacZ genet lokalisert både i kjernen og i de cytoplasmiske fraksjoner. Imidlertid med DOTAP alene, ble plasmid DNA bare funnet å foreligge i cytoplasmaet (figurene 4A og 4B). GADPH-genet ble benyttet for å bekrefte tilstedeværelsen av radioaktivt DNA i radioaktive ekstrakter og mangelen på kontaminering av cytoplasmiske fraksjoner med radioaktivt

DNA.

EKSEMPEL 5; Giftighet av DMBC/DNA-komplekser

Et celleformerings-assay ble benyttet for å måle giftigheten av transfeksjonsagensene. Rela-tiv giftighet ble målt ved å sammenlikne cellevekst i transfekterte og utransfekterte celler, 48 timer etter utplating. Celler ble eksponert til transfeksjonsagensene i 2 timer og 24 timer. Det forelå ingen forskjell i nivået av<14>C-tymidin inkorporering mellom transfekterte og utransfekterte celler som var eksponert til enten DOTAP (D) eller DMBC i 2 timer (figur 5A). Når celler ble eksponert til DMBC med eller uten DNA eller til DOTAP i 24 timer, forelå det en reduksjon i celleformeringskapasitet men dette var ikke statistisk signifikant (figur 5B).

EKSEMPEL 6; Transfeksjon av murine blærer ved intravesikal innstillering av transfeksj onsagenset og DNA

I mus (n=16) som mottok transfeksjonsagensene DMBC/DNA via en intravesikal innstillering, ble blære-epitelceller som vendte mot lumen vellykket transfektert (figurene 6A og 6B) i alle mus. In vivo DOTAP alene resulterte ikke i effektiv transfeksjon av blæreepitelceller. Så vel som blæren, ble lungene, nyrene, mil- ten, hjertet og leveren også høstet fra transfekterte dyr og kontroller og ble funnet å farge negativt for P-gal, noe som viser at transfeksjon var begrenset til blæren, som oppsummert i tabell 2 i det følgende:

Dette ble bekreftet ved PCR analyse (figur 7) som utført på to mus. I mus ble miltceller høs-tet på samme tid som blærene og nivåene av CD3+, CD4+, CD8+, ap og y6 T celler i kontroll og transfekterte dyr bestemt ved strømningscytometri. Ingen forskjell ble funnet mellom kontroll- og eksprementgrupper.

Dessuten ble tumorer implantert i museblærer og straks de var etablert ble disse mus også behandlet intravesikalt med pCMVlacZ og DMBC. De overflatiske luminale cellelag i hyperplasia fremviste p-gal-farging (figur 10A-10B).

Virkningen av DMBC og DOTAP på transfekterte blærer ble analysert ved transmisjons-elektronmikroskopi. Analysene indikerte at den 2 timers transfeksjons-eksponeringstid med et av agensene ikke resulterte i noen påviselig strukturell forskjell i de celler som vendte mot lumen ved sammenlikning med en utransfektert kontrollblære. Det var heller ikke noen indi-kasjon på akkumulering av kationiske lipider eller kolesterol i vakuoler. Blærens epitelceller inneholder generelt mange vakuoler men det syntes ikke å være noen økning i antallet av slike vakuoler etter behandling.

EKSEMPEL 7; Effektivitet av transfeksjon med hensyn til tid for eksponering overfor transfeksj onsagenser

For å kunne bestemme transfeksjonseffektiviteten med kortere eksponeringstider, ble transfeksj onskomplekset (pCMVlacZ:DMBC) påført til cellene i ulike tidsrom, hvoretter det ble fjernet og cellene ble dyrket i komplett medium i 48 timer før høsting og enzymatisk analyse, p-gal-aktivitet er påviselig endog når transfeksjonstiden er så kort som 15 minutter og denne aktivitet øker med varigheten av eksponering overfor transfeksjonsagenset (figur 8A). Det foreligger en 4,8 foldig forskjell i transfeksj onsandeler mellom en 15 minutters eksponering og en 2 timers eksponering. In vivo, med lengre eksponeringstider ble flere av de epitelceller som vender mot lumen transfektert (figur 8B).

EKSEMPEL 8; Varighet av ge- nekspresjon in vivo

I mus ble P-gal ekspresjon overvåket ved 14,21 og 30 dager etter transfeksjon. Etter 30 dager, var ekspresjon generelt redusert men fremdeles klart påviselig (figurer 9A og 9B). Varigheten av signalet kunne være resultatet av en lavere omsetning av urotelialceller in vivo hvilket ville resultere i tilstedeværelsen av pCMVlacZ-genet i løpet av et lengre tidsrom.

EKSEMPEL 9: Undersøkelse av effektene av DOTAP + metylert-p-cyklodekstrin-solubilisert kolesterol (DMBC) og tranfekterte cytokingener på MB49 celler og tumorvekst

In vitro ekspresjon av overflateproteinmarkører

MB49 celler ble transfektert med cytokingener enkeltvis og i kombinasjon. To dager senere ble ekspresjon bestemt ved strømningscytometri. En økning i den andel av celler som uttrykte MHC klasse I, MHC klasse II, FAS, ICAM I, ICAMII, B71 og B72 ble sett i celler som transfektert med cytokingenet under sammenlikning med utransfekterte celler, som oppsummert i tabell 3 i det følgende.

Intratumoral terapi av etablerte tumorer

Evnen for transfeksjonssystemet ifølge oppfinnelsen til å tilføre cytokiner for utsletting av etablerte tumorer ble testet. De transfeksjonsmidler som omfatter DNA som koder for de følgende cytokiner (IL-2, IFN-y, GMCSF og IL-2 + GMCSF) ble injeksert intratumoralt inn i tumorbærende mus høyre flanke 7-10 dager etter tumorimplantering. Tumorvolumet i mus ved dag 7 er vist i diagrammet fra figur 11. Mus som behandlet med cytokin genterapi demonstrerte langsommere tumorgruppe sammenliknet med de ubehandlede og DMBC-kontroller. Tumorvolum ved dag 38 (vist i diagrammet fra figur 12) var signifikant mindre for mus som transfektert med enten IFN-y (p=0,041), GMCSF (p=0,0014) eller IL-2 + GMCSF (p=0,0004). Mus som behandlet med IL-2 demonstrerte bare langsommere tumorvekst. 30% av alle mus som ble behandlet med IFN-y, GMCSF og IL-2 + GMCSF ble ku-rert. Tumorvolum over tid (dager 7-37) er oppsummert i diagrammet fra figur 13. I den ubehandlede gruppe fremviste en mus lokal remisjon men mistet raskt vekt og døde prematurt hvilket antyder metastatisk sykdom. Kureringsandelen i mus er oppsummert i tabell 4 i det følgende:

Cytokinekspresjon i splenocytter

Cytokinekspresjon i splenocyttene til ubehandlede og cytokinbehandlede tumorbærende mus ble sammenliknet med de for normale (ingen tumor) mus for å se om cytokinproduksjon ble påvirket. Alle grupper uttrykte mRNAs for IL-2, IFN-y, TNF-a og GMCSF. Cytokinbehandlede mus fremviste en generell økning i cytokin mRNA-produksjon fra splenocytter sammenliknet med de ubehandlede, DMBC og normale (ingen tumor) kontroller. Mus som behandlet med GMCSF og IL-2 + GMCSF produserte de største mengder av GMCSF sammenliknet med de andre cytokinbehandlede grupper. Resultatene er oppsummert nedenfor i tabell 5:

Phenotypeundersøkelse av splenocytter

Strømningscytometrisk analyse av splenocytter fra mus med phenotypespesifikke monoklona-le antistoffer viste at CD3, CD4+ og CD8-populasjoner i de ubehandlede og DMBC-behandlede grupper minsket ved sammenlikning med normale kontroller. Tumorbærende mus som behandlet med cytokin genterapi hadde liknende profiler i forhold til normale kontroller for CD3, CD4+, CD8, NK og ocp-populasjoner. Resultatene er oppsummert nedenfor i tabell 6:

De resultater som er beskrevet i dette eksempel demonstrerer at transfeksjon av murine blærekreftceller med enkeltstående cytokingener induserer en økning i MHC klasse I, klasse II og FAS-ekspresjon. Denne respons kunne gjøre kreftcellene mer immunogene. Fra det intra-tumorale transfeksjonseksperiment, ble det funnet at IL-2, IFN-y, GMCSF og IL-2 + GMCSF hadde lignende inhibitoriske virkninger på tumorvekst. Etter 37 dager, ble det funnet at det forelå en signifikant forskjell i tumorstørrelse i de grupper som ble transfektert med IFN-y, GMCSF, IL-2 + GMCSF ved sammenlikning med den ubehandlede gruppe. Disse data demonstrerer at DMBC er et effektivt agens for transformasjonen av urotelialceller in vitro og in vivo. Intratumoralstudiene i mus indikerer at transfeksjonen av uroteliale tumorceller med cytokingen-tilførsel ved ikke virale vektorer kan resultere i oppheving av tumorvekst.

Claims (32)

1. In vitro fremgangsmåte for transfeksjon av et polynukleotid inn i celler,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: å kombinere: (i) i det minste et polynukleotid; (ii) et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller en kombinasjon derav; og (iii) et solubilisert kolesterolpreparat som omfatter kolesterol solubilisert med et cyklodekstrin for dannelse av et transfeksjonsmiddel; og påføring av transfeksjonsmiddelet til celler, slik at cellene transfekteres med polynukleotidet.

2. Fremgangsmåte i ifølge krav 1,karakterisert vedat polynukleotidet er kompleksert med et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer og påført til celler, polynukleotidet og det kationiske lipid, den kationiske polymer eller dendrimer formuleres med et solubilisert kolesterolpreparat som omfatter kolesterol solubilisert med et cyklodektrin.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av et medikament,karakterisert vedat medikamentet inneholder et farmasøytisk agens og et solubilisert kolesterolpreparat for terapeutisk og/eller profylaktisk behandling av urotelialceller ved intravesikulær påføring til subjektets blære, hvor kolesterolet er blitt solubilisert med et cyklodektrin, og hvor det farmasøytiske agens omfatter: (i) i det minste et polynukleotid og (ii) et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller kombinasjoner derav.

4. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av krav 1-3,karakterisert vedat cyklodekstrinet er metyl-p-cyklodekstrin.

5. Fremgangsmåte i følge et eller flere av krav 1-3,karakterisert vedat cyklodekstrinet utvelges fra den gruppe som består av alfa-cyklodekstrin, beta-cyklodekstrin, gamma-cyklodekstrin, sulfatert beta-cyklodekstrin, tertiært amin beta-cyklodekstrin, kvaternært amin beta-cyklodekstrin, 2-hydroxypropyl-beta-cyklodekstrin, 2,6-di-O-metyl-beta-cyklodekstrin, hydroxyetyl-beta-cyklodekstrin, 6-deoxy-6-S-beta-D-galaktopyranosyl-6-tio-cyklomalto-heptaose, sulfobutyleter-beta-cyklodekstrin, carboxymetyl-beta-cyklodekstrin, carboksymetyl-etyl-beta-cyklodekstrin, dietyl-beta-cyklodekstrin, dimetyl-beta-cyklodekstrin, tilfeldig metyl-beta-cyklodekstrin, glucosyl-beta-cyklodekstrin og maltosyl-beta-cyklodekstrin.

6. Fremgangsmåte i følge et eller flere av krav 1-3,karakterisert vedat (ii) er et kationisk lipid som er DOTAP.

7. Fremgangsmåte i følge et eller flere av krav 1-3,karakterisert vedat (ii) er en dendrimer som er SUPERFECT™.

8. Fremgangsmåte i følge et eller flere av krav 1-2,karakterisert vedat (ii) utvelges fra den gruppe som består av DOPE, DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM, polylysin, polyhistidin, polyarginin, polyetylenimin, poly(4-vinylpyridin), poly(vinylamin), poly(4-vinyl-N-alkyl pyridin halid), eller kombinasjoner derav.

9. Fremgangsmåte i følge et eller flere av krav 1-3,karakterisert vedat polynukleotidet er plasmid DNA.

10. Fremgangsmåte i følge et eller flere av krav 1-3,karakterisert vedat polynukleotidet utvelges fra den gruppe som består av viralt DNA, kromosomale fragmenter, antiretnings-oligonukleotider, antiretnings-fosfortioat-oligonukleotider, RNA-molekyler og ribozymer, eller kombinasjoner derav.

11. Fremgangsmåte i følge et eller flere av krav 1-2,karakterisert vedat cellene er eukaryotiske celler.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat cellene er pattedyrceller.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat cellene er urotelialceller.

14. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av krav 1-3,karakterisert vedat det kationiske lipid, den kationiske polymer eller dendrimeren utvelges fra den gruppe som består av DOPE, DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM, polylysin, polyhistidin, polyarginin, polyetylenimin, poly(4-vinylpyridin), poly(vinylamin), poly(4-vinyl-N-alkyl pyridin halid), eller kombinasjoner derav.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat medikamentet er for behandling av cancer og hvor det farmasøytiske midlet har anti-cancer aktivitet.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat canceren er blærekreft.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat polynukleotidet omfatter i det minste en ekspresjonsvektor som koder for i det minste et protein som utvelges fra den gruppe som består av interleukiner, interferoner, kolonistimulerende faktorer, anti-angiogene faktorer, anti-metastatiske faktorer, membran reseptorer og tumor undertrykkere.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat polynukleotidet omfatter en ekspresjonsvektor som koder for et protein som utvelges fra den gruppe som består av interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), interleukin-9 (IL-9), interleukin-11 (IL-11), interleukin-12 (IL-12), interleukin-13 (IL-13), interleukin-18 (IL-18), interferon-a, interferon-p, interferon-y, granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GMCSF), granulocytt-kolonistimulerende faktor (GCSF), makrofag-kolonistimulerende faktor (MCSF), varmesjokkprotein (HSP), p53, en antagonisk for vaskulær endotelial cellevekstfaktor (VEGF), en vevs inhibitor for metallproteinaser (TIMP), og en fibronektin reseptor.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat polynukleotidet omfatter en ekspresjonsvektor som koder for interleukin-2 (IL-2).

20. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat polynukleotidet omfatter en ekspresjonsvektor som koder for granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GMCSF).

21. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat polynukleotidet omfatter en ekspresjonsvektor som koder for interferon-y.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat polynukleotidet omfatter i det minste en ekspresjonsvektor som koder for to eller flere av interleukin-2 (IL-2), granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GMCSF) og interferon-y.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat behandlingen av cancer omfatter Bacillus Calmette-Guerin (BCG)-terapi.

24. Transfeksj onsmiddel,karakterisert vedat det omfatter: (i) et polynukleotid; (ii) et kationisk lipid, en kationisk polymer eller en dendrimer, eller kombinasjoner derav; og (iii) et solubilisert kolesterolpreparat omfattende kolesterol solubilisert med cyklodekstrin.

25. Transfeksj onsmiddel ifølge krav 24,karakterisert vedat cyklodekstrinet er metyl- ^-cyklodekstrin.

26. Transfeksj onsmiddel ifølge krav 24,karakterisert vedat cyklodekstrinet utvelges fra den gruppe som består av alfa-cyklodekstrin, beta-cyklodekstrin, gamma-cyklodekstrin, sulfatert beta-cyklodekstrin, tertiært amin beta-cyklodekstrin, kvaternært amin beta-cyklodekstrin, 2-hydroxypropyl-beta-cyklodekstrin, 2,6-di-O-metyl-beta-cyklodekstrin, hydroxyetyl-beta-cyklodekstrin, 6-deoxy-6-S-beta-D-galaktopyranosyl-6-tio-cyklomalto-heptaose, sulfobutyleter-beta-cyklodekstrin, carboxymetyl-beta-cyklodekstrin, carboksymetyl-etyl-beta-cyklodekstrin, dietyl-beta-cyklodekstrin, dimetyl-beta-cyklodekstrin, tilfeldig metyl-beta-cyklodekstrin, glucosyl-beta-cyklodekstrin og maltosyl-beta-cyklodekstrin.

27. Transfeksj onsmiddel ifølge krav 24,karakterisert vedat (ii) er et kationisk lipid som er DOTAP.

28. Transfeksj onsmiddel ifølge krav 24,karakterisert vedat (ii) er en dendrimer som er SUPERFECT™

29. Transfeksj onsmiddel ifølge krav 24,karakterisert vedat det kationiske lipid, den kationiske polymer eller dendrimeren utvelges fra den gruppe som består av DOPE, DOTMA, DOGS, DODAB, DODAC, DOSPA, DC-Chol, DOIC, DOPC, DMRIE, PAMAM, polylysin, polyhistidin, polyarginin, polyetylenimin, poly(4-vinylpyridin), poly(vinylamin), poly(4-vinyl-N-alkyl pyridin halid), eller kombinasjoner derav.

30. Transfeksj onsmiddel ifølge krav 24,karakterisert vedat polynukleotidet er plasmid DNA.

31. Transfeksj onsmiddel ifølge krav 24,karakterisert vedat polynukleotidet utvelges fra den gruppe som består av viralt DNA, kromosomale fragmenter, antiretnings-oligonukleotider, antiretnings-fosforotioat-oligonukleotider, RNA-molekyler og ribozymer, eller kombinasjoner derav.

32. En farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter transfeksjonsmiddelet i samsvar med krav 24.