TWI262085B

TWI262085B - Methods and compositions for increasing transfection efficiency of cells in vitro

Info

Publication number: TWI262085B
Application number: TW090103013A
Authority: TW
Inventors: Kesavan Esuvarnathan; Ratha Mahendran; Carmel Lawrencia
Original assignee: Genecure Pte Ltd
Priority date: 1999-09-01
Filing date: 2001-02-12
Publication date: 2006-09-21
Also published as: US20090054364A1; JP2003508456A; ATE292187T1; US7320963B2; CA2384425C; DE60019134T2; WO2001015755A3; DE60019134D1; JP4995388B2; WO2001015755A2; US7709457B2; EP1208218A2; NO329773B1; NO20020983D0; AUPQ259399A0; AU781684B2; CA2384425A1; ES2240157T3; EP1208218B1; US20020146830A1

Description

1262085 五、發明說明（1) ..袓..關ijfr案之交叉^^ 本案請求以澳洲專利文件，其整内容併述於此：：：PQ 2 5 9 3 / 9 9號做為優先權技術領邊 u "。概略而言，本發明係毒方法於試管内或活體入細·，特別藉非病 -步係有關輸送癌症治…酸至細胞。本發明進發明背景療用樂劑特別是針對膀胱癌。儘管基因療法晚近已夕、的輸送入各種類型細胎夕2進展，但有效的將基因治療性原因在於並無方法可；：：別係活體内輸送尚未能達r生療分子，若非不可能：；：!？上足量的基因以及其它；具有選擇滲透性屏障。吊疋困難的，原因在於細胞膜分子成功地進入目標細，卩，田基因或其它生物活性或是在基因的例子中，^ ^ I此被分解、不當地被運送，無法適當轉錄。目標細胞缺乏有效輪送方法，曰個例子為膀胱之尿路上皮&肖if # ΐ i 土因治療上的一膀胱癌。嶽内視鏡以及膀胱内化學治療」：：= 的進展，表淺膀胱癌仍有高復發率及侵襲率（Nsey〇 υ〇相虽 Lamm DL· ( 1 9 9 6 )Sennn 〇ncol· m6〇4)。目前，’最成功的治療係每週滴注「活」卡介苗（BCG)至膀胱2小時取 (Morales， A·等人（1976) J· Urol·， 116: 18〇 —183 ;

Brosman, S.A. (1992) Urol. Clin. North Am., 19*

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第 6 頁 1262085 五、發明說明（2) 5 5 7 - 5 6 4 )。雖然有效，例行反應率為6 〇 — 了〇 %，但常見例如排尿困難、血尿、頻尿及膀胱炎等副作用，且有時非常嚴重（Lamm DL· (1992)北美泌尿科臨床，565-572) ◦此外’有相^數目的病人對BCG治療無反應，且常出現毒性。探討BCG活化免疫反應的機轉，結果證實細胞激素、共同刺激分子以及黏著分子於輔助對抗腫瘤的胞毒反應上扮演要角（Tamguchi， K.等人（ 1 9 9 7 ) Clln. Exp. Immunol ·，，li^: 131-5， 1999 ;Patard， J.J.等人（1998) Urol. Res·，155-9 ;Kurisu， K.等人（I 9 94 )cancer Immunol. Immunother j 3 9:24 9- 5 3 ; Sander, B 等人 ( 1 9 9 6 ) J. Urology，JL51:5 3 6 -4 1 ; CHow， Ν· H·等人 ( 1 9 98 )Ur〇l〇gy，M: 1015-9 ;jacks〇n，A.M.等人（ 1 9 9 5 )

Clin. Exp. Immunol. , : 3 6 9 - 7 5 ) ° 表；^月方脱癌具有某些4寸色使其特別有利於採用活體基因治療’也就是腫瘤常為侷限性，治療基因可經由簡單的膀胱内投藥而直接接觸腫瘤。此外，腫瘤對治療的反應可和易地使用膀胱鏡及尿液細胞學來判定。成功地轉移感染^ 渡性細胞上皮的一大障礙為糖胺基聚糖層的存在，該層變成DNA複體攝取上的顯著障礙（Ruponen，μ等人（ 1 9 9 9 )曰又 Biochim. Biophys. Acta，1415 : 331 -41 ) ° 病毒表現載體已經用來將特定基因局部導引至膀胱 (Sutton，Μ·Α·等人（ 1 9 9 7 )Ur〇l〇gy，1 73-8 0 ; Lee， S.S·荨人（1994) Cancer Res·，3325-8)。但病毒載體於臨床上有多項限制，例如免疫原性及安全性。晚近，由

1262085 五、發明說明（3) L 1等人從事的研究，由於在人膀胱癌細胞系觀察到病毒受體層面差異，故質疑以腺病毒為基礎的基因治療膀胱癌的效果（Li，γ·等人（ 1 9 9 9 )Cancer Res·，”： 3 2 5 — 3 〇)。基因治療的替代方法涉及微脂粒媒介輸送入DNA細胞。非病毒性系統之優點為其非受體依賴型，因此可應用至全部腫瘤。Br 1 gham等人首次報告使用陽離子性微脂粒將 DNA 輸送入組織（Brigham，LK·等人（ 1 9 8 9 )Am· j· Med.、 S c 1 : 2 7 8 - 8 1 ) ◦由於當陽離子性脂質已經為於活體 =局部或系統性輸送DNA至組織的有效載劑（Plautz，G f 等人（ 1 9 9 3 )Proc· Natl. Acad. Sci· USA，：y· 4 64 5-9·

Na=;n G.J..等人（ 1 9 9 3 )Pr〇c. NaU. Acad厂Sci· usA,^〇 • 11 ，Zhu， N·等人（1 9 9 3 )Scienee，261 · 2 0 9- 1 1 )。陽離子性微脂粒於臨床上有多種優於毒^因優點。包括使用由簡單質體至染色體：达一糸定庫巳圍的基因構成體，且安全性之憂慮較少。但盆為，相較於病毒技術，其轉移感染效率相對較低。、… 如此，仍然需要有一種可提高轉移感染效率，-特別是尿路上皮細胞之轉移感染效率 ' 胱之一般性方法。 +方法帛作為輪送藥劑至膀發明概論本發明提供輸送藥劑至細胞的改良方法苔酸輸送至尿路上皮細胞。今日發 f別1將承 .^ 〜兄便用增溶的膽固醇作為〜加劑可提升與陽離子性脂質、陽離子性體複合之D N A的轉移感染效率。較佳地。" 人千竿乂仏地，膽固醇係使用環

1262085

五、發明說明（4: 糊精’較佳為曱基-/9 -環糊精來、、六木 g >谷。雖妙管试驗或活體試驗轉移感染尿敗 …、特佳係用於試吩上皮細偷，1 -感染方法可應用於轉移感染多種A ^ 本發明之轉移溶膽固醇對與陽離子性脂質、陽 ^蜗型。此外，增 1污離子性平人心合之D N A進入尿路上皮細胞的提升力文果 Ό物或樹狀體複内輸送而將其它類型之藥劑輸送至^尿’可應用至藉膀胱於試管試驗或活體試驗中。上皮細胞，不論是種或多種聚罐至細胞。該方法:方法’以轉移感染因此，在一特徵方面，本發明提供酸與（i i)陽離子性脂質、陽離子性妓:匕含將（1 )聚核苷合，以及（i i i )增溶的膽固醇製劑組人-物或彳对狀體或其組合物，以及將轉移感染組合物施用至"纟而形成轉移感染組轉移感染以聚核苷酸。較佳增溶的.胞，如此細胞即被精增溶的膽固醇。較佳環糊精為甲^〜固知製劑包含以環糊當環糊精包括α -環糊精，召—環糊二，万—環糊精。其它適化/3 -環糊精，第三胺/3 -環糊精，ϋ，Τ —環糊精，硫酸羥丙基-/3 -環糊精，2, 6-二〜〇_曱其乐四胺万―環糊精，2 — 万-環糊精，6-去氧-6-S- y5〜D_丰二召~裱糊精，羥乙基— 麥芽糖-庚糖，磺丁基醚nU糖吼喃糖基+硫-環，緩甲基-乙基十環糊精，：：：1甲基環糊精 /5-環糊精’隨機曱基—/5-環糊浐土 ,環糊精’二曱基-

及，夕牙糖基-/3-環糊精。較佳陽離子性脂質為1)〇口1^，較佳树狀體為舒派費（S u p e r f e c t)。其它適當陽離子性脂質及相ί 片大體包才舌DOPE ，D0TMA ，DOGS ，DODAB ，D〇DAC ，DOSPA

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第9頁 1262085 五、發明說明 -，DC-Chol，D0IC，D0PC，DMRIE，PAMAM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸，聚伸乙基亞胺，聚（4 -乙烯基呲啶），聚（乙烯基胺），聚（4 -乙烯基-N -烷基鹵化啦啶錄），或其組合◦該方法可用於轉移感染多種聚核苷酸，例如質體 DNA、病毒DNA、染色體片段、反訊息寡核苷酸、反訊息硫代磷酸酯寡核苔酸、R N A分子及核糖酶（r i b ◦ z y m e s )或其組合。本發明之轉移感染方法較佳用於真核細胞，更佳用於哺乳類細胞及更佳用於尿路上皮細胞。轉移感染方法可於試管試驗進行，例如轉移感染組合物施用於培養中的細胞。另外，該方法可經由施用轉移感染組合物至活體細胞而於活體試驗進行。較佳具體實施例中，轉移感染組合物係藉膀胱内輸送至個體膀胱而施用至活體尿路上皮細胞。另一特徵方面，本發明提供一種輸送藥劑至個體尿路上皮細胞之方法。該方法包含將藥劑與增溶的膽固醇製劑組合而形成製劑組合物，以及經由膀胱内輸送該醫藥組合物至個體膀胱，故藥劑被輸送至個體的尿路上皮細胞。較佳增溶的膽固醇製劑包含使用環糊精增溶的膽固醇。較佳環糊精為曱基_ /5 - ί展糊精。其它適當壞糊精包括α -壞糊精，/3 -環糊精，r -環糊精，硫酸化石-環糊精，第三胺冷― 環糊精，第四胺/3 -環糊精，2 -羥丙基-/3 -環糊精，2，6 -二-〇-曱基-/3 -環糊精，經乙基-/3 -環糊精，6 -去氧-6-S-/3-D-半乳糖咄喃糖基-6-硫-環麥芽糖-庚糠，磺丁基醚-召-環糊精，羧甲基-/5 -環糊精，羧曱基-乙基-/3 -環糊精

90103013.ptd 第10頁 1262085 五、發明說明（6) 二乙基-/5 -環糊精，二甲基-/3 -環糊精，隨機曱基-/3 -環糊精，葡萄糖基-/5 -環糊精及麥芽糖基-/3 -環糊精。較佳具體實施例中，製劑包含（1 )至少一種聚核苷酸以及 (i 1 )陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體或其組合。本發明之又一特徵方面係有關一種治療個體之膀胱癌之方法。該方法包含將一種藥劑與增溶的膽固醇製劑組合而形成治療性組合物，其中該藥劑對膀胱癌細胞具有抗癌活性，以及藉膀胱内輸送治療組合物至個體膀胱，故個體的膀胱癌細胞接受藥劑處理。較佳增溶的膽固醇製劑包含以環糊精增溶的膽固醇。較佳環糊精為曱基-/5 -環糊精。其它適當環糊精包括α -環糊精，/5 -環糊精，r -環糊精，硫酸化石-環糊精，第三胺/5 -環糊精，第四胺/3 -環糊精，2 -經丙基-/3 -環糊精，2，6 -二- 0 -曱基-/3 -環糊精，羥乙基- /3 -環糊精，6-去氧-6-S- /3 -D-半乳糖吼喃糖基-6-硫-環麥芽糖-庚糖，磺丁基醚-点-環糊精，羧曱基-/3 -環糊精，羧曱基-乙基--環糊精，二乙基-万-環糊精，二甲基-/5 -環糊精，隨機甲基-/?-環糊精，葡萄糖基-万-環糊精及麥牙糖基-/5 _壞糊精。較佳治療膀胱癌之藥劑包含至少一種聚核誓酸以及陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體，其中該聚核苷酸可提供抗癌活性。例如聚核苔酸包含至少一種表現載體編碼一種選自介白素、干擾素、群落刺激因子、抗血管生成因子、抗轉移因子、膜受體及腫瘤抑制劑組成的組群之蛋白質◦較佳蛋白質包括介白素-1(IL-1)，介白素-2(IL-2)，

90103013.ptd 第11頁 1262085 五、發明說明（7) 介白素—9(il—9)，介白素mil-⑴，八白素-12(IL-12)，介白素—i3(IL-13)，八 18)，干擾素_α ，干擾素—厶，干擾素、τ J白素18(1 L-噬細胞群落刺激因子（GMCSF )，粒狀細胞粒狀細胞-巨 (GCSF)，巨噬細胞群落刺激因子（MCS /各放因子 )，3,抗血管新生因子，例如血管内皮：^白， (V朗拮抗劑如反訊息分子，抗轉移因= : = 織抑制劑（TIMPS)，以及提高BCG活性;f蛋白％、、且癌抗膀耽膀胱處，卡介苗⑽)治療，療方法使用之較佳額外抗提r二關轉移感染組合物。本發明環糊精，羧甲基〜乙美 β 子性脂質、陽離子性聚合物式w至少一種聚核普酸；陽離劑。較佳增溶的膽固醇製劑句；J狀體；及增溶的膽固醇製。較佳環糊精為甲基環二以以環糊精增溶的膽固醇 -環糊精，/5 —環糊精，r 1 J。其它適當環糊精包括α 三胺/5-環糊精，第四胺/^精，硫酸化環糊精，第，2,6-…基*環二精^精，2-經丙基卞環糊精氧mD_半乳糖吼喃糖基經乙基_ 環糊精，6一去丁基醚-万-環糊精，羧甲基广石硫-銥麥牙糖-庚糖，磺 —環糊精，二乙基-/5-環糊精， 1262085 五、發明說明（8) .曱基-/5 -環糊精，葡萄糖基-β -環糊精及麥芽糖基-/3 -環糊精。較佳陽離子性脂質為DOTΑΡ，而較佳樹狀體為舒派 ~費。其它適當陽離子性脂質及樹狀體包括DOPE，D0TMA， DOGS ， D0DAB ， D0DAC ， D0SPA ， DC-Choi ， D0IC ， D0PC ， DMR IE，PAM AM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸，聚伸乙基亞胺，聚（4 -乙烯基吼啶），聚（乙烯基胺），聚（4 -乙烯基-N -烧基鹵化吼咬1¾)，或其組合。轉移感染組合物可包含多種聚核苷酸中之一或多者，例如質體DNA、病毒DNA、染色體片段、反訊息寡核苷酸、反訊息硫代磷酸酯寡核苷酸、RNA分子及核糖酶，或其組合。發明之詳細說明本揭示内容中，各別公開文獻、專利案及公告專利申請案係以識別引述參照。此等公開文獻、專利案及公告專利申請案之揭示併述於此以供更完整說明本發明之相關的業界現況。因此為了更方便了解本發明首先定義若干術語。文中「轉移感染」一詞（例如「轉移感染的」、「被轉移感染的」）係表示將聚核苷酸分子由外在位置引進細胞内部的過程。文中「聚核苷酸分子」一詞用於涵蓋由兩個或兩個以上共價鍵聯結之聚核菩酸鹼基組成的分子，包括去氧核糖核酸（DNA)分子及核糖核酸（RNA)分子。形成聚核苷酸分子之核苷酸典型係藉填酸二酯鍵聯彼此聯結，但「聚核苷酸分子」一詞也用於涵蓋藉其它鍵聯聯結的核苷酸，例如藉硫

90103013.ptd 第13頁 1262085 五、發明說明（9) _代磷酸酯鍵聯聯結。聚核苷酸分子之非限制性實例包括質體DNA、病毒DNA、染色體片段、反訊息寡核苷酸、反訊息 '硫代磷酸酯、RNA分子及核糖酶。文中「陽離子性脂質」用於表示包含至少一個及最典型兩個脂肪酸鏈以及一個帶正電荷之極性頭基組成的分子。典型陽離子性脂質具有十二基（C12)或十六基（錄堪基，C16) 脂肪酸鏈，但「陽離子性脂質」一詞用於也涵蓋帶有其它長度脂肪酸鏈之脂質◦陽離子性脂質之非限制性實例包含： D0TAP(1，2 —二醯基—3 —三曱基敍丙烧） DOPE (二油醯基石粦月旨基乙醇胺） D0TMA( [2, 3 -貳（油醯基）丙基]三甲基氯化銨 DOGS(二-十八基醯胺基甘胺醯基精胺） D 〇 D A B ( ^ —十 >臭 4 匕二 4安） D〇DAC( 十^ |漠、化^氣） 0〇3?八（2,3-二油醯基氧1-[精胺羧胺基乙基]^-二曱基-1 -丙銨） DC-Ch〇l(3 /3[N —(n，，N’ —二甲基胺基乙院）胺基曱陳基] 膽固醇，二油醯基） D〇IC(l-[2-(油酸基氧）-乙基]-2 -油酸基-3-(2 -經乙基）咪嗤琳4¾氯化物） 0 P C (二油睡基填脂基膽驗） DMRIE(二肉豆蔻醯基氧丙基二甲基羥乙基溴化銨）文中「陽離子性聚合物」一詞用於表示可縮合核酸（例

90103013.ptd 第14頁 1262085 五’‘發明說明（10) 如D N A )之帶正電荷聚合物。陽離子性聚合物包括聚電解質及陽離子性聚肽類。陽離子性聚合物之非限制性實例包括聚離胺酸、聚組胺酸、聚精胺酸、聚伸乙基亞胺（PE I ) 、聚（4 -乙烯基咄啶）、聚（乙烯基胺）以及聚（4 -乙烯基-N -烧基鹵化吼咬f為）。文中「樹狀體」一詞用於表示陽離子性星爆形聚合物。此乃球狀聚合物係來自於銨中心藉多層球狀生長形成。樹狀體之非限制性實例包括舒派費及帕碼（PAM AM )。文中「膽固醇」一詞用於表示帶有四個稠合環的天然類固醇（固醇），以及其與長鏈脂肪酸形成的酯以及保有調節膜流體性的類似物。膽固醇及膽固醇酯類屬於血漿脂蛋白之組成分及動物細胞之外細胞膜組成分，其可調節膜之流體性。保有調節膜流體性能力之膽固醇類似物為業界已知 (例如參考 Gimpl，G·等人（1997)Biochemistry 3 6 : 1 0 9 5 - 1 0 9 74 )，包括例如5 -膽固烯、5 -孕烯-3 /?-醇-20 -酮、4 -膽固烯-3 -酮及5 -膽固烯-3 -酮。文中「增溶的膽固醇製劑」一詞用於表示膽固醇已經使用可提高膽固醇的水中溶解度之增溶劑而增溶於水的膽固醇製劑（亦即增溶的膽固醇製劑之水中溶解度係高於單獨膽固醇之水中溶解度）。增溶劑典型為水可溶性化合物，其有個空穴而讓親脂分子可填塞於其中。較佳增溶劑為環糊精。膽固醇的增溶作用（例如結合入增溶劑如環糊精）可以放射性標記膽固醇例如[1，2，6，7 - 3 H ( N )]膽固醇監視（市面上得自杜邦/新英格蘭核公司），例如參考P a n g等人

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第15頁 1262085 五、發明說明（π) (1999) Biochemistry 38:12003-12011。「增溶膽固醇製劑」一詞非用於表示膽固醇結合於微脂粒雙層。文中「環糊精」一詞用於表示寡醣環狀環圈分子其具有親水性外表面以及疏水性中央空穴，其中疏水中央空穴可攜帶親脂物質（例如膽固醇）◦ 「環糊精」包括含具有6、7 或8葡萄糖吼喃糖單位（分別為α -、/9 -及r -環糊精）以及更大環（已經分離出含9 - 1 3葡萄糖ϋ比喃糖單位之環糊精）之分子，但較佳使用/5 -環糊精於本發明。「環糊精」一詞也用於包括α -、/3 -及r -環糊精（或甚至更大環）衍生物，其非限制性實例包括硫酸化点-環糊精，第三胺/3 -環糊精’第四胺yS -環糊精’ 2 -說丙基-万-環糊精，2，6 -二-〇-甲基-/3 -環糊精，經乙基-/5 -環糊精，6 _去氧-6 - S - /5 - D -半乳糖13比喃糖基-6 -硫-環麥芽糖-庚糖’續丁基鍵-/5 -環糊精，魏曱基-yS -環糊精，敌曱基-乙基-/3 -環糊精，二乙基-/5 -環糊精，二曱基-/3 _環糊精’隨機曱基-_環糊精，葡萄糖基-/3 -環糊精及麥芽糖基-/3 -環糊精。較佳用於本發明之環糊精為甲基-/?-環糊精。環糊精之結構及藥理應用綜論於Szejtli，J. (1994) Med. Res. Reviews 1 4 : 353-386 及Rajewski，R.A.及Stella，V.J. (1996) J. Pharm. Sci. 1 1 42 - 1 1 6 9。文中「轉移感染組合物」一詞表示由聚核苷酸，陽離子性脂質或樹狀體，以及增溶膽固醇製劑的組合製成的組合物。文中「藥劑」一詞用於包括具有藥物活性之化合物，其

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第16頁 1262085 五、發明說明（12) 非限制性實例包括聚核苷酸、蛋白質、多肽、肽、化學治療劑、抗生素等。文中「治療性組合物」一詞用於表示經由組合至少一種藥劑以及增溶膽固醇製劑製成的組合物，但治療性組合物可含有額外組成分（例如額外藥劑、陽離子性脂質、樹狀體或其它可增強治療性組合物的輸送或治療活性之組成分）。文中「個體」一詞用於表示需要使用藥劑處理例如需要治療癌症如膀胱癌之活有機體。較佳個體為哺乳類。個體例如包括人類、猴、犬、貓、小鼠、大鼠、牛、馬、山羊及綿羊。個體也包括其它脊椎動物如魚類及鳥類（例如雞）。文中「抗癌活性」一詞用於表示一種直接（亦即直接作用於癌細胞，如對癌細胞有毒的化學治療劑）或間接（例如經由刺激對癌細胞的免疫反應）抑制癌細胞的生長、存活或轉移的藥劑。文中「治療」一詞用於表示緩和一或多種接受治療的疾病症狀。文中「治療有效量」一詞用於表示足夠達成欲治療疾病的治療用量（例如藥劑用量）。文中「卡介苗（BCG)治療」一詞用於表示膀胱癌之治療方案，其中BCG係經膀胱内投藥至膀胱而刺激免疫反應。本發明至少有部分係基於發現增溶膽固醇可用作為添加劑俾改良細胞的轉移感染效率。膽固醇之較佳增溶劑為環

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第17頁 1262085 五、發明說明（13) 〜米月‘如甲基厶—環糊精。實驗顯示含膽固醇之甲基—召、戸 ^精本身無法改良裸DNA的轉移感染，但#合併使用展子性脂質（D0TAP)時可提升其轉移感染。於試管試驗，2 種添加較單獨陽離子性脂質（D〇TAp)於轉移感染細胞提 3. 8倍（麥考實例n。於活體試驗，面對内腔的膀胱上胞可成功地被轉移感染，此乃單獨使用陽離子性脂質所: 法達成的（參考實例6)。當使用的陽離子性脂質為D〇TAp “、、時，使用D0TAP-DNA比2.7:1(重量：重量）以及D〇TAp對膽，醇比6: 1(重量：重量）時可獲得最佳的轉移感染。Cr〇^ 寺人使用DOTAP與膽固醇之混合物發現當使用丨.1 (重量· 重量）D0TAP :膽固醇之比時轉移感染最為理想（以〇(^等· (1998)〇61^了1^厂_5:1 37-43 )。資料指出於血清存在下，增加膽固醇可提高轉移感染效率。但使用D〇TAp :膽固妒的組合時，雖然C0S-7細胞可被有效轉移感染，但，鼠^ 路上皮細胞系Μ B 4 9的轉移感染極少。曱基-/S -環糊精/膽固醇（MBC)複體可對細胞膜提供膽固醉。雖然非意圖受任何機轉所限，但膽固醇的給予會影響細胞膜的流體性/剛硬性及滲透性。細胞膜之膽固醇濃度影響GPI錨定蛋白質於胞内小體（end〇s〇mes)的分類，透過胞内小體用盡而增加蛋白質的循環（Rodal， s· κ•等人 ( 1 9 9 9 )M〇1. Biol. Cell· JJ:9 6 1 — 74 ) °D〇TAP/ 曱基—/5- 環糊精/膽固醇（DMBC)複體提供膽固醇給DOTAP分子而影響形成的DOTAP : DNA複體結構。顯示—環糊精可藉腸細胞改良腺病毒之進入胞内（Croyle，Μ· A.等人（ 1 9 9 8 )Pharm.

90103013.ptd 第18頁 1262085 五、發明說明（14)

Res.珏：1 3 8 4 - 1 3 5 5 )。攝取改良有助於環糊精摧 r : Ϊ : ί用的環糊精皆未載有膽固#。僅使用甲又: =壞醇包裝的環糊精用於提高藉本發明提= 矛夕感^效率的重要性。 I晚Ϊ研究中，Ζ^η6Γ及其同仁分析陽離子性脂質媒介的基因輸送機轉，證實質體DNA由胞質移動至胞核為成功1 因移轉的限制性因素（Zabner， j等人（1 9 9 5 )】β•力基

Chei，l〇:1 8 9 97_ 9 0 0 7 )。本發明中，發現雖然含膽固醇可提升轉移感染效率，但對質體DNA由細胞的攝取變極小。但發現使用DMBC，質體DNA出現於細胞核（泉考^曰例 4)，意味著含括DMBC對DNA由胞内小體脫逃扮演貝色，或許避免於溶小體内分解。本系統中，轉移感染後的基因於尿路上皮細胞表現於活體内可觀察得轉移感染長達1個月時間。可能與尿路上皮細胞於活體内的周轉率較慢有關，原因為試管試驗中基因表現於多次細胞複製之後快速喪失。Morris，BD•等二， (J· Urol·，（1994)1^: 506-509)使用腺病毒轉移感染膀胱，顯示基因表現明顯至少經歷7日。Harim〇t〇等人（Br. J· Urol· ( 1 9 9 8 : 8 7 0 -8 74 )使用HVJ微脂粒可觀察得基因表現長達1 0日，以及使用單粒子搶撞擊基因表現可長達 2週。如此本發明之DMBC轉移感染系統用於活體内膀胱轉移感染與目前偏好使用技術同等（即使非更常）持久。細胞曝露於DMBC/DNA複體2小時顯示對細胞增生無影響

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第19頁 1262085

(Λ考Λ例5)。MBC的本身於曝露24小時後不會造成細胞辦 ^的下降，但D0TAP顯然會造成下降。但此點不農曰五、發明說明— 户療ί :曝露的抗增生效果有利’原因在於其有助於提、 α療基因媒介的殺滅細胞腫瘤效果。研究顯示杰 =單獨使用時，對於無胸腺裸小鼠的工類；瘤：種二直月豆具有抗腫瘤效果（Grosse，Ρ·γ.等人（1 9 9 8 )計J -植

CanCer d:U65_9)。此種效·· 出有關。％係/、膽固酉子由細胞流 = = ^MBC/DNA複體僅2小時，即足夠讓尿路上 &侍取大曝露於微脂粒/DNA複體，以及 (參考實例7)。報告子基因半乳糖㈣：f轉移感染賠咏M · 土 u、p千礼糖甘酶）的表現侷限於膀胱。M〇rris’ B.D.等人（JUr〇 1 ( 1 9 94 ) 1 5 2:5 〇6_5〇9)使二腺病毒轉移感染膀胱也觀察得類似結果，此處此種褐限十月況可能係由於膀胱架構而非使用的輸送系統所致。 % ί i ί轉移感染系統也顯示可於活體内有效輸送細胞激素基因來清除腫瘤（參考實例g )。鑑於前文說明’本發明之一特徵方面係有關轉移感染至口 =酸至細胞之方法。如實例之進-步說明，使用s冷膽口醇可提升聚核苷酸複合陽離子性脂性聚合物及樹狀體等化學劑的轉移感染效果。如此於一特，方：：本發明提供一種轉移感染至少-種聚核；酸至細胞之方法’该方法包含將： (i )至少一種聚核苷酸； (χ ：ί) —種陽離子性脂質、一種陽離子性聚合物或一種樹

1262085 五、發明說明U6) 狀體或其組合；以及 (111) 一種增溶膽固醇製劑組合而形成一種轉移感染^且人施用該轉移感染至細胞，、田D物，以及染。口而細胞以聚核苷酸轉移感較佳增溶膽固醇製劑包^ /?-環糊精增溶。其它適卷衣糊精且最佳以甲基〜精可得自商業上來源。較精包括前文列舉者。環糊樹狀體為舒派費。其它適先g :子性脂質為D 0 T A P。較佳物及樹狀體包括前文列以;陽，T性脂質、陽離子性聚合合物及樹狀體可得自商鞏决、陽離子性脂質、陽離子性聚類試劑(1 1 )，亦即陽離；;生所轉T感染組合物可包括— 體；或另外試劑（i i)可為:貝、陽離子性聚合物或樹狀子性聚合物的組合，或雨播"^例如陽離子性脂質與陽離不同類型陽離子性聚合物。^型陽離子性脂質或兩種時，較佳增溶膽固醇製H二;^試劑（1)、（11)及離子性脂質、陽離子性τ加聚核普酸之前混合陽溫培育-段時間例咖，然後混合物於室各試劑用量可隨多種；成轉移感染組合物。及種細胞類型。但最理想轉移感染= 如，陽離子性脂質（或陽離子性聚合物或樹狀體)對二固醇之最理想比值因不同類型細胞而*，但發現於= 驗中丨：2(D0TAP ·· MBC)比對尿路上皮細胞為最理想/ y式

1M 90103013.ptd 第21頁 l262〇85 五、發明說明（17) 例之』貝或刼離子性聚合物或樹狀體）對增溶胪π 例之非限制性範圍為2:1至卜去:岭膽固醇之比製劑（例如曱基-石产糊_ /陷田準備增溶膽固醇 -^ ^ ± 万—銥糊精/膽固醇或MBC)時，脑π U酉子糊精之較佳比例為5〇毫克膽：膽固醇對環用的特定化學劑及條件而定，此項比例可但依據使醇對環糊精比例之非限制性範圍為至丨^里邊化。膽固用量也可隨使用的化學劑以及欲轉移感染的。=酸。使用的聚核誓酸（例如dNA)用量之非限制性、m受 1 0 0微克，更佳為卜5 0微克。陽離子性旨質二·至性範圍為⑴。。微克’較们。娜克。樹費）用量之非限制性範圍為}至3〇〇微克，較佳5 舒派用於活體應用，各化學劑用量可能需由前述較佳數量提高。當DOTAP用作為陽離子性脂質時，較佳化學劑用量之限制性實例有：7.5微克DNA + 20微克DOTAP + 40微克曱基-/5 -環糊精增溶膽固醇。當舒派費用作為樹狀體時，化學劑之較佳用量之非限制性實例有：2微克DNA + 22. 5微克舒派費+ 1 〇微克甲基-/3 —環糊精增溶膽固醇。本發明之轉移感染方法可用於轉錢染多衫同聚酸例如質體DNA、病毋ΜΑ、&訊息募核；酸、反訊息硫代磷酸酯寡核苔酸、RNA分子及核糖酶或其組合。用於基因治療目的’聚核苷酸典型為編碼欲提供治療效果之表現載體（容後詳述）。轉移感染方法較佳用於轉移感染真核細胞 1262085 五、發明說明（18) 及更佳為哺乳類細胞。轉移感染方法用於轉移感染尿路上皮細胞特別有效，但尿路上皮細胞對多種其它轉移感染方 -法有抗性。轉移感染方法可於試管内進行，例如將轉移感染組合物應用至培養中的細胞進行。轉移感染組合物接觸培養中的細胞之時間可標準方法變成最理想化◦於試管内轉移感染時間之非限制性實例為4 8小時，接著洗滌細胞 (例如使用填酸鹽緩衝鹽水洗務）。另外，轉移感染方法可於活體進行，將轉移感染組合物活體施用至細胞。於較佳具體實施例中，轉移感染組合物係透過膀胱内輸送（例如經由套管輸送）至個體膀胱而活體施用至尿路上皮細胞。其它於活體試驗之轉移感染目標組織包括例如胃、肌肉、肺、上皮細胞、結腸、子宮、腸、心、腎、攝護腺、皮膚、目艮、腦、陰莖組織及鼻組織。於另一特徵方面，本發明提供一種輸送藥劑至膀胱之尿路上皮細胞之方法，該方法係基於增溶膽固醇可提升物質被尿路上皮細胞攝取。如此，本發明提供一種輸送一種藥劑至個體尿路上皮細胞之方法，該方法包括：將藥劑與一種增溶膽固醇製劑組合而形成一種醫藥組合物；以及膀胱内輸送該醫藥組合物至個體膀胱，因此藥劑被輸送至個體尿路上皮細胞。較佳增溶膽固醇製劑包含以環糊精，最佳以曱基-/3 -環糊精增溶的膽固醇。其它適當環糊精包括前文列舉之環糊精。藥劑例如為至少一種聚核苷酸以及陽離子性脂質、陽

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第23頁 1262085 五、發明說明（19: 離子性聚合物或樹狀一生素、干擾素、群落；激因子’樂劑可為化學治療劑、抗因子、膜受體或其它罝有么抗血官新生因子、抗轉移核、“時，較佳陽離；性：J為化學劑。當藥劑為聚派費：其它適當陽離子性脂f ’而較佳樹狀體為體包括前文列舉者。、肖子性聚合物及樹狀古^另Γ特徵方面，本發明提供一種治疼/ 方法’遺方法包含：療個體之膀胱癌之將種樂劑與一種辦：宠瞻性組合物，i巾 +日/ " 予衣剜組合而形成一種；:A瘆刃其中該樂劑對膀胱癌細胎1女j 禋/口療膀胱内輸送治療性組合物至個雕二有抗癌活性；以及胞使用治療劑處理。 ^知胱，故個體膀胱癌細較佳增溶膽固醇製劑包含 /5-環糊精增溶的膽固醇。W精’最佳使用甲基— 者。藥劑例如可為至少—種取k §裱糊精包括前文列舉陽離子性聚合物或樹狀體。=陽離子性脂質、。當藥劑為聚核皆酸時，二^剑係以治療有效量輸送車父佳樹狀體為舒派費。其它a j，子性脂質為D 0 T P A，而合物及樹狀體包括前文列舉者陽離子性脂質、陽離子性聚聚核苷酸較佳包含至少— 、癌治療上具有療效的蛋白質。^現載體其編碼一種於膀胱呈適合於欲轉移感染細胞1 =現，體包含聚核苷酸其係表現載體包含一或多個調節=核=酸的形式，表示重組胞類型的選擇，調節序列 ^通常係基於欲轉移感染細 ’、U操作方式聯結至欲被表現的

1262085

1262085 五、發明說明白素-9(IL-9)，介白素一 ii(IL-11)，介白素-12(IL-12)，介白素-13(IL-13)，介白素-18(IL-18)，干擾素-α ，干擾素-/3 ，干擾素〜γ ，粒狀細胞—巨噬細胞群落刺激因子 (GMCSF )，粒狀細胞群落刺激因子（gcSF )，巨噬細胞群落刺激因子（MCSF)，熱震蛋白質（HSP)，Ρ53，抗血管新生^ 子，例如血管内皮細胞生長因子（VEGF)拮抗劑如反訊息分子’抗轉移因子如金屬杳白酶抑制劑（T I Μ P s )，及提高β c g 活性因子如纖維蛋白膠受體、介白素、干擾素、群落刺激

因子及腫瘤抑制劑。較值欲表現的蛋白質為I L-2，GMCSF 及干擾素-γ ，及其組合（例如IL-2、GMCSF及干擾素—γ中之至少二者）。 μ 另夕卜，‘劊例如可為化，于/ 口深削、抗生素、干擾辛、介白素、群落刺激因子或其它具有治療活性劑。素本舍明之膀脱癌治療方法可人治療方法。較佳其它治療方法二4種上它抗膀脱癌之實例包括化學治療及輻射户化療。八匕癌症治療 1一特徵方面，本發明也i供轉_片、九之轉移感染組合物包含· 專心感染組合物。本發明 (1 )至少一種聚核苷酸； (1 i ) 一種陽離子性脂質、其組合，以及聚合物或樹狀體，或 θ π眾劑。較佳增溶膽固醇製劑包含膽 /5 -環糊精增溶。其它適卷。-子Μ環糊精最佳為曱基田衣糊精包括前文列舉者。較/

1262085 五又發明說明（22) ^ .陽離子性脂質為D0TAP，而較佳樹狀體為舒派費。盆它當陽離子性脂質、陽離子性聚合物及樹狀體包括前文者。本發明之轉移感染組合物可提供成包裝調配劑，例+ 其中各組分劑係提供於容器裝置。包括調配劑進一步包^ 使用轉移感染組合物轉移感染細胞的指示。進一步藉下列實例舉例說明本發明，但非視為限制性。下列貫例使用之特定材料及方法說明如後：材料及方法 P C Μ V 1 a c Z係得自美國，加州，保路奥圖，康特克 (Ciontech)公司。鼠過渡細胞癌細胞系仙49係得自愛荷華大學，Timothy Ratliff博士。胞質DNA係使用安多富利 (E n d〇f r e e )貝體快爾琴（q i a g e n)套件組（德國，快爾琴公司）製備。富金（Fugene)係購自德國曼罕，羅氏診斷公司，舒派費係購自德國快爾琴公司，DEAE葡萄聚糖係購自美國，麻里森，波密加（pr〇mega)公司，及磷酸鈣係購自德、國，法蘭克福，默克（M e r c k )公司。 DMBC轉試驗檢定分析 2 X 1 05細胞接種於蓋玻片上置於6孔組織培養平板置於 RPMI 1 640 ’培養基補充1〇% FBS(澳洲生物科學公司） mM,L-麵^ ’50單位/毫升青黴素及〇.〇5毫克/毫升鏈黴素 (美國，蒙大拿：M'l ，聖路易，西格瑪化學公司）。細胞以、 1XPBS洗2次：，以及使用7·5微克pCMVlacZ複合20微克 D〇TAP(德國哭罕’羅氏診斷公司）及40微克曱基-/3 -環糊精增溶膽固醇（西格瑪公司）轉移感染。複體係經由使用20

第27頁 1262085 五、發明說明（23) ，mM亥派斯（Hepes)緩衝液（美國，馬里蘭州，洛克維爾，士伯可BRL (GibcoBRL))調整DNA及DMBC至165微升及混人^" 分鐘製造。使用RPMI 1640培養基調整至工毫升，添:"至内經歷適當時間然後洗滌且更換3毫升新鮮⑽们拉孔基。經48小時後’細胞以PBS洗滌、固定及如Weiss，dd^ 等人（ 1 9 9 7 ) Hum· Gene Ther· H 5 4 5- 54 所述染色。以1〇· 倍放大，相對於四個象限的細胞總數，藍色群落平均數來決定轉移感染效率。轉移感染係以雙套且重複兩次用行。人運 j曾生檢定分析增生係藉測量[14 C ]-胸腺核苷的結合而檢定分析。每 1 X 1 04細胞接種於96孔平底組織培養平板（丹麥，洛斯來，挪克（Nunc)公司），如前述於最理想條件轉移^毕細歷適當長度時間（曝露2小時及24小時），洗滌及於” ^ 新鮮RPMI 1 64 0共同培育。於32小時後，取出上清液，^ 胞以1XPBS洗滌。重複三孔接種〇2 we"毫升[14 腹田 Μ比活性56· 5mCl/毫莫耳；美國，德拉威州，威明頓象核杜邦公司）經歷16小時。樣本係如Zhang，γ.等人（199了）

Int· J· Cancer η:851—7所述收穫。[14c]—胸腺核苔之廷合係以占結合於對照細胞的百分比表示。對照細胞係由= 經轉移感染的細胞組成。非參數曼—惠特尼（Mant Whitney)!!試驗用於計算統計意義。機率值p<〇統計上有意義。傲优為

1262085 發明說明（24) 5-7週齡C57BL6雌小鼠經麻醉；將膀胱插管24號靜脈套管且使用IX PBS沖洗。DMBC及DNA複體如前述混合15分鐘。取終混合物使用1 X PBS調整至最終容積4 5 6微升方便滴注及作膀胱内導入。評估轉移感染曝露時間丨5分鐘、3〇分鐘、1小時或2小時。於不同時間點’膀胱以ιχ pBS沖洗去除DNA/DMBC複體。處理後48小時犧牲小鼠。實驗係重複進行。組織化學取出膀胱、肺、腎、心、肝及脾，且於液態氮中冷凍 (Werthmam，P.E.等人（ 1 9 9 6 )J. Ur〇1·匕5:53一6)。厚6微

米的冷；東切片於4 〇C於1. 25%戊二醛固定1〇分鐘，接著與 X-gal於37C共同培育4小時，以及使用血氧素 (haematoxylin)作相對染色〇對器官進行PCR 為了偵測是否存在有轉移感染後的質體，採用丨acZ基因獨特的PCR引子。使用的上游引子為$，— GCCGACCGCACGCCGCATCCAGC_3’（序列識別編號：丨）及下游引子為5’ -CGCCGCGCCACTGGTGT_3’（序列識別編號：2)。 PCR係於總容積25微升進行，含有丨〇〇毫微克基因組MA，2 微升（2.5 mM)dNTPs(美國，貝佛利，新英格蘭生物實驗室 )’2.5微升（10X)反應缓衝液’各^升引子（i〇#M)Am 升（2U)TaQ聚合酶（芬蘭，伊斯普，芬展（Finnzymes))。 PCR程式如下：94t30秒，接著6『c3〇秒，及？2。〇3〇秒共 40週期。GADPH用作為PCR分析之對照。GADpH之引子

1262085

為上游引子5 -CTGCGACTTCAACAG-3,（序列識別編號：3)及下游引子5, -CACCCTGTTGCTGTAG-3, C序列識別編號：4)。 PCR程式如下·· 94它30秒，58〇c3〇秒及72t：3〇秒共週期。擴增後的DNA於1%瓊脂糖凝膠藉電泳分析，於紫外光下使用乙靈溴（ethidium bromide)目測觀察。使用影像主 VDS軟體（Image master VDS software)進行密度計量掃描，以及使用分析影像系統軟體（加拿大，安大略省，研究公司）分析頻帶。 ~ 轉移感染之0NPG檢定分妍轉移感染細胞以1 X PBS洗兩次，然後使用1 5 〇微升溶解缓衝液分解。溶解產物之蛋白質内容物藉顯微BCA蛋白質檢定分析（美國，伊利諾州，洛克福，皮爾斯（p i e r c e ))，使用牛血清白蛋白作為標準品。細胞蛋白質分解產物於含 4宅克/毫升0 N P G反應混合物檢定分析，及於3 7 °C培育1小時。藉力口入5 0 0微升1 Μ碳酸鈉中止反應，及測量於4 2 0毫微米之吸光率。藉PCR進行胞核及胞質分析轉移感染細胞之胞核及胞質分選之方式係使用ΤΝΕ緩衝液（10mM Tris， pH (pH8)，lmM EDTA，l〇〇mM 氣化鈉，1% 艾吉皮可（Igepecal)溫和分解，及於冰上放置10分鐘接著於微離心機於4 °C於7K離心5分鐘。如此獲得的上清液加標示，胞質經過萃取及移至新鮮試管。胞核萃取物於5 0 °C使用蛋白酶K消化（100mM氯化鈉，l〇mM Tris， pH8，0.5% SDS 25mM EDTA及0· 1毫克/毫升蛋白酶K)造粒產物隔夜處

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第30頁 1262085 發明說明（ία 理後製備。胞核DNA使用酚/氯仿萃取兩次，接著藉乙殿◦如前述進行pCR分析。 ’儿激素基因 #小=過渡細胞癌細胞系ΜΒ49及細胞激素基因感謝愛荷 f大學，Tlmothy Ratllff博士提供。細胞激素基因轉殖方、P C I n e 〇表現載體波密加（p r〇m e g a )公司。質體⑽a係使用安多萄利質體快爾琴套件組（德國，快爾琴公司）備。動物 C5 7/BL6雌小鼠（約4-6週齡）得自國立新加坡大學實驗動物中心，且於大學動物維持中心養育。 i面標^A因之試管試 2 X 105細胞接種於6孔組織培養平板KRpMI 164〇，培養基補充1 0% FIBS(澳洲生物科學公司），2mM L_麩胺，5〇單位/毫升青黴素及0.05毫克/毫升鏈黴素（美國，蒙大拿州，聖路易，西格瑪化學公司）。細胞以1X pBS洗2次，及以 7· 5微克單一細胞激素基因及各3· 7 5微克細胞激素基因用於IL-2 + GMCSF組合[其複合2〇微克D0TAP(德國曼罕，羅氏診斷公司）及40微克曱基—石―環糊精增溶膽固醇（西格瑪么司）]轉私感染。複體之形成方式係使用2 〇 m Μ亥派斯緩衝液（美國，馬里蘭州，洛克維爾，吉伯可BRL)調整DNΑ及 DMBC至165微升，及混合15分鐘製造。使用RPMI 164〇培養基調整至1毫升，添加至孔内歷2小時，然後洗滌後更換3 毫升新鮮RPMI 1 6 4 0培養基。經48小時後，細胞以pBS洗滌

1262085 五、發明說明（27) ，及固定，且以抗MHC-I，抗MHC-II及抗FAS抗體標示◦使用的二次抗體為螢光素異硫氰酸酯（F I τ c ;美國，加州，法明金（Phairnungen)公司）。也含括同型對照抗體。加標示之細胞係於雙重流細胞分析儀（美國，佛羅里達州，庫特伊皮伊來（Coulter Epics Elite)公司）分析。 3UJ田胞激素處理之抗腫瘤效果 5 X 1 05活存MB49細胞於〇· 1毫升之單一細胞懸浮液處理前7至1 〇日皮下注入脅腹。僅選用有一致腫瘤大小約〇, 1 5 —〇 · 2 5立方厘米的小鼠，且隨機分成多組接受腫瘤内處理。處理係每週進行兩次共計三週，藉腫瘤内注射進行，注射包含100微升IX PBS，DMBC(D〇tap +含膽固醇之曱基化-石-環糊精），IL-2 + DMBC，GMCSF + DMBC，INFr + DMBC 或I L - 2 + G M C S F + D Μ B C的組合。年齡匹配之腫瘤對照組未接受任何處理。於注射後前至第3 8日每3日使用卡規測量腫瘤大小。腫瘤大子係以下式計算：長X寬X高。 jL·二細胞懸浮液及流量細胞分析如所述收穫脾臟。單一細胞懸浮液以抗—CD4，α /5，τ 占’ Ν Κ及抗C D - 8抗體（已經結合法可艾利林 (Phycoerithrin)(PE))加標示，而CD3 +細胞係以結合至勞光素異硫氰酸酯（F I TC)之抗體加標示。全部抗體皆係構自美國’加州，法明金公司。標示細胞係於雙重雷射流量細胞分析儀分析。

萃取及RT-PCR 對全部RNA萃取物，脾臟係根據製造商的指示於1毫升蔡

1262085 五、發明說明（28)

洛克維爾，吉伯可BRL -佐（Tr 1 Z0 1 )試劑（美國，馬里蘭州 )均化。RT-PCR係如所述進行。、實例直·非病毒化學劑之試管試驗轉 4%及14· 8% (參考 pCMVlacZ表現質體以2小時時間^私感乐效果種化學劑之轉移感染效率。D〇TAp々MB49細胞用以評估多内轉移感染MB49細胞，而效率分/派f可於2小時時間下表1)。馮20· 表1 類別樹狀體非微脂粗化學品化學品 — _____—___ 轉移感染效率』旨質 —_ 20. 4% 14. 8% 1. 02% ------ 0°/〇 0% 非病毒劑 D0TAP 舒派費富金氣i化約 DEAE-葡萄聚糖 μ」二…于a奶竹π微木條件調整為最理想，俾於2小時獲：取大轉移感染。轉移感染效率係計算使用x__gai染色 ^，色的細胞百分比。使用7· 5微克DNA及2〇微克D〇TAp獲 ^最理想的轉移感染。使用舒派費，需要遠更低量關A來獲得如同D0TAP之轉移感染率，換言之，2微克DNA使用7.: 从升舒派費。使用萄金獲得極低轉移感染率1 . Q 2 %。氯化每（〇-40微克）DEAE-葡萄聚糖（0-2微克）、裸DNA皆無法轉移感染Μ B 4 9細胞。為了改良轉移感染率，MBC恰於添加DNA之前混合

90103013.pid 第33頁 1262085 :29、五‘發明說明

DfT:P ’、以及混合物於室溫培育1 5分鐘。添加MBC結果導致 'MR^人地被轉移感染的細胞數目的增加，如圖1A-C所述。當日士揾口使用日寺，轉移感染效率3·9倍，併用舒派費兩=.七圖1D)。但產生此種轉移感染效率提高之MBC 而d n里返使用的化學劑改變。最理想的D0TAP轉移感毕俜糊微克MBC獲得，而丨◦微克對舒派費為最理想= iD()TAP + MBC (DMBC)可獲得最佳轉移感染率，故此項組 3用於全部進一步實驗。也對DMBC與習知D〇TAp :膽固萨 (1:、υ混合物（AVDC)轉移感染效率間作比較。AVDC可轉^ 感染C〇S —7細胞，但轉移感染MB49細胞並不佳。相反地;" DMBC可轉移感染MB49細胞，比較AVDC可提升c〇s —7細胞轉移感染效果（圖1 E)。 :万-半乳糖苷酶基因表現持續時間進行使用DMBC轉移感染後卢―半乳糖苔酶（万一gal)基因表現之特徵化。如圖2A所示，藉〇NPG檢定分析測得蛋白柄之表現係於化學劑移開之1小時以内發生，且提高直到轉、移感染後4 8小時。4 8小時後，蛋白質表現穩定下降，至移感染後1 2曰’ /5 -ga 1活性比第2曰的表現降低7倍（圖 2B)。顯然當細胞複製時，基因喪失及/或變成無聲。 i例3 :轉移感染後DNA的攝取為了決定使用D0TAP及DMBC時DNA的攝取是否有差異，、 ’、〉則量轉移感染後2小時由細胞提取的質體DMA量。為了讓表結合D N A量減至最低，且獲得真正D N A攝取量的較佳估* 使用1XPBS進行多次洗滌及使用DNAse消化。圖3A及3B ^ ^

90103013.ptd 第34頁 1262085 五、發明說明（30) 由MB4 9細胞萃取的DN A之PCR分析。MB4 9細胞使用兩種化學劑時質體DNA進入細胞内部之數量似乎類似。因此，轉移感染的效率觀察得的差異並非由於質體DNA的攝取差異，或許係由於DNA —旦攝取入細胞内部後不穩定之故。 :質體DNA之胞核及胞質積聚為了決定及侷限化DNA於使用D0TAP及DMBC轉移感染後的侷限化，由轉移感染後的細胞準備胞核及胞質萃取物。萃取物存在有DNA係使用PCR決定。以DMBC轉移感染的細胞， L a c Z基因係侷限於胞核及胞質部分。但單獨使用D 〇 τ a p，質體DNA僅出現於胞質（圖4A及4B)。GADPH基因用於證實胞核卒取物存在有胞核DNA，而胞質部分未污染胞核⑽八。 A例5 : DMBC/DNA複體的毒性細胞增生檢定分析用來計量轉移感染劑的毒 —.......，v 一 t匕較接，4 8 j日守後於轉私感染及未經轉移感染細胞的增生而測里相對毒性。細胞曝露於轉移感染劑2小時及2 4小時。暾露於DOTAP(D)或DMBC歷2小時的轉移感染後及未經轉移感 2細胞結合的14C一胸腺核苷的濃度無差異（圖…。細胞曝路於含或未含DNA之DMBC或曝露於⑽了^歷以小時，細士能力又降，但不具統計意義（圖5B)。 “曰例6 •藉知胱内滴注轉移感染劑及MA而轉移感染鼠膀肼透過膀胱内滴注而接受轉移感染DMBC/MA之小鼠（n^6既 )’面對内腔的膀胱上皮細胞在全部小鼠皆被成功感染（圖“及⑻。於活體内單獨D0TAP無法獲得膀胱上；細胞的有效轉嶋。膀耽、肺、腎 '脾、心及肝也由皮轉

1262085 五、發明說明（31) 移感染的動物及對照組動物收穫，發現冷〜g a丨的染色皆為陰性，顯示轉移感染限於膀胱，摘述於下表2。 -表2使用pCMVLacZ染色轰2 .染色限於膀胱器官 ___—— /5 -ga 1 活膀胱陽性 _ 肺陰性 _ 肝陰性心 ——________1 陰性 _ 腎陰性 _ 脾陰性 _ 經由對2小鼠進行PCR分析（圖7 )證實。於小鼠，脾細胞係與膀胱同時收穫，對照及轉移感染動物之CD3+，CD4 +

，CD8 +，α /5及τ占T細胞濃度係藉流量細胞計量術測得。對照組與實驗組間未見差異。此外，腫瘤植入小鼠膀胱，一旦建立其腫瘤，小鼠也使用pCMVLacZ之DMBC接受膀胱内處理。表淺增生的腔％胎厗顯示 /5-gal 染色（圖 1〇A —1〇B)。、、、I 盾

糌1^ 對轉移感染後膀胱的影響係藉透射”顧門何f 刀析指出使用任一種轉移感染劑曝霖2 j #护胞有任何可區別：以：照：=，無法獲得面對内腔細

或膽固醇於積聚於* r :任，不陽離子性脂質 I /包。月方胱上皮細胞通常含有介 σΤ夕空

1262085 五、發明說明（32) ^，但處理後此種空泡數目未見增加。 ·相對於曝露於轉移感染劑時間之轉移感染效率 _為了測定以較短曝曬時間之轉移感染效率，轉移感染複月豆（P C Μ V L a c Z · D Μ B C )施用於細胞經歷不等時間，隨後移開及、、、田胞方；元王培養基培養4 8小時收穫及作酶分析。即使，移感染時間短至1 5分鐘仍可偵測得冷_ga 1活性，隨著曝路於轉移感染劑時間的延長而增加（圖8 A )。曝露1 5分鐘與曝路2小時間的轉移感染率差異為4. 8倍。於活體内曝露時

間愈長，則面對内腔上皮細胞被轉移感染數目愈多（圖8B )° 复^ ··於活體之基因表現時間於小鼠’監視轉移感染後14、21及30日之/5-gal表現。至3 0日，表現大減，但仍可偵測（圖9 A及帅）。信號的持久性可能係由於尿路上皮細胞於活體内之周轉率低，結果導致pCMVLacZ基因可長時間存在所致。 · D0TAP +曱基化—万—環糊精增溶膽固醇（dMBc)以及轉移感染後細胞激素基因對M b 4 9細胞及腫瘤生長之影響之特徵化記基因之試管試驗表現 MB49細胞單獨及合併使用細胞激素基因轉移感染。2曰後藉流星細胞計量術測定表現。比較未經轉移感染細胞’ 使用細胞激素轉移感染的細胞發現可表現MHC I類，MHC I I類，FAS，iCAM I，ΚΑΜ II，B71及B72之細胞比例增高，摘述於下表3。

90103013.ptd 第37頁 1262085

五、發明說明〔33：; 表3表面蛋白質標記基因之試管試驗表現

已確立之腫瘤内治瘙測試本發明之轉移感染系統輸送細胞激素产咏的腫瘤的能力。包含D Ν Δ編碼下列細胞激夸Γ ^示已、、、二萑立牙、5 I NΡ ύ ，GMCSF及IL-2 + GMCSF)之轉移咸毕組人私〆 7 後7-10日於帶有腫瘤小鼠之右脅腹進行腫瘤内注射。第7 日小鼠腫瘤之體積示於圖11之線圖。使用細胞激素因基治療處理的小鼠比較未處理組&DMBC對照組驗證腫瘤生長較慢。使用INF r (ρ=〇· 〇41) ， GMCSF (p=0.0014)4IL一2 + GMCSF (ρ = 0· 0 0 4 )轉移感染之小鼠於第38日之腫瘤體積（顯示於圖1 2線圖）顯著較小。使用丨L— 2處理的小鼠僅驗證腫瘤生長較緩慢。以INF r ，GMCSF及IL-2 + GMCSF處理的全部小鼠中有3 0 %疾癒。腫瘤體積隨著時間接（第7 — 3 7日）摘述於第1 3線圖。未處理組有一頭小鼠顯示局部緩解，但快速減輕體重並過早死亡，提示疾病的轉移。小鼠痊癒率摘

1262085 五、發明說明（34) /述於下表4 : 表4 :疾癒率處理完全局部緩解未經處理 1/10 DMBC 1/10 IL-2 1/10 INF r 3/10 GMCSF 3/10 (GMCSF + IL-2 3/9 脾細胞之細胞激素表現於未經處理以及經過細胞激素處理之帶有腫瘤小鼠之脾細胞的細胞激素表現比較正常（未患腫瘤）小鼠的細胞激素表現而了解細胞激素的產量是否受影響。全部各組藉表現 IL-2，INF- r，TNF- α及GMCSF之mRNA。接受細胞激素處理小鼠比較未經處理之、DMBC及正常（未患有腫瘤）對照組之脾細胞之細胞激素m R N A產量全面性增高。使用G M C S F及 I L-2 + GMCSF處理小鼠比較其它細胞激素處理組顯示產生最大量GMCSF。結果摘述於下表5 : 表5 處理組/mRNA相對於 GADPH(提高倍數） I L - 2 INF- r GMCSF TNF- a IL-2 8.4 3.21 14. 5 7. 3 GMCSF 5.6 2. 92 22. 6 5. 25 INF- r 2. 3 6. 4 10.4 7. 8

90103013.ptd 第39頁 1262085 五、發明說明（35) JL-2 + GMCSF 1.5 6.2 28 7.3 親代 1 1 1 1 ’對照 0. 1 9 1.5 1.2 0.6 DMBC 0.18 0.6 1.4 5.5 IL-2+GMCSF+INF- r 4.3 1.9 8.8 8.9 IL-2+INF- r 1.7 1. 8 0. 97 1 0.9 脾細胞之表現型特徵化帶有表現型特異性單株抗體小鼠之脾細胞之流量細胞計量分析顯示未處理組及DMBC處理組之CD3、CD4+及CD8含量比正常對照組降低。帶有腫瘤的小鼠使用細胞激素基因治療對CD3、CD4+、CD8+、NK及α /5含量而言類似正常的對照組。結果摘述於下表6 :

90103013.ptd 第40頁 1262085 五、發明說明（36j .表6 處理 C D 4 % lc D 8 % C D 3 % N K % 未經處 1 1.89 ± 1.09 m

D Μ S C 5.32士 0.4< 0.59± 0.92 6.34± 0/ 12.7 1± L . 1 1 6 6.1 3 + 5.5 9 3 .0 4 ± 0.55 \12± 1.60 .6S± 4.9 13 I .61 ± i + 1 2 2 8.5 8 ± I .9 Ϊ 9 對照 16.81±0.94 11.7+ 0.60 j2 7 . 8 3 士 1-11 |7 4 · 1 5 土 4.59 |2 . 5 4 ± 0.32 31.2 土 5.03 I L-2 14 士 1.16 23.97±2.1 53土 4·57 2.84± 0.497 26.68± 2.53

G M C S F 17-92± 1.74 17.14土 1-73 2 2.4 2 ± 2.：、11± 0.46 29-02± 4.52 丨L 2 22.9± 2.46 4.47± 1.34 13 ί . 1 3 ± 4 . 49.33± 2.56 12.65± 2.72 64.42± 14.4

G M C S F INF-y 21 .5 0士 1.94 15.66± 1.77 22·54± 2.62 37.86+ 3.08 2.48± 0.4753 22.86土 2.56

90103013.ptd 第41頁 1262085 五，發明說明（37) , 本貫例所述結果證實小鼠膀脱癌細胞使用單一細胞激素基因轉移感染可誘使MHC I類、I I類及Fas表現的增高。此 '項反應讓癌細胞更具有免疫原性。由腫瘤内轉移感染實驗發現IL-2、INFr 、GMCSF及IL-2 + GMCSF對腫瘤生長具有類似的抑制效果。37日後，發現以INF τ、GMCSF、IL-2 + GMCSF轉移感染組比較未處理組之腫瘤大小有顯著差異。此項資料證貫D Μ B C為試官試驗及活體試驗轉移感染尿路上皮細胞的有效轉移感染劑。小鼠之腫瘤内研究指出藉非病毒載體輸送細胞激素基因轉移感染尿路上皮腫瘤細胞可導致腫瘤生長的停止。雖然前述發明已經就若干細節舉例說明本發明以求清晰且容易了解，但業界人士顯然易知可實施某些變化及修改。因此，說明及實例絕非視為囿限本發明之範圍，本發明之範圍係由隨附之申請專利範圍所闡釋。

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第42頁 1262085 五、發明說明（:38:) .序列明細

<110> LUSTRE IN\7ESTMENTS PTE LTD

<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF PHARMACEUTICAL AGENTS <130> Insert docket number <140> To be assigned <141> Herewith <160> 4 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> E. Coli <400> 1 gccgaccgca cgccgcatcc age <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> E. Coli <400> 2 cgccgcgcca ctggtgt <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213 > Mouse <400> 3 ctgcgacttc aacag <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213 > Mouse <40〇> 4 caccctgttg ctgtag

90103013.ptd 第43頁 1262085 〔圖式簡單說嗯 ~~~ '~—^— ，圖1 A~1C為未轉移感染細胞或WD0TAP或0〇(:轉相片，比較P〇macZ報告子質體之表現程度。未經=== 染細胞（圖1A)未使用X-gai染色。少數細胞使 /D0TAP轉移感染且以X-gal作陽性染色（圖1B)。^MVlacZ pCMVlacZ/DMBC轉移感染結果導致χ—⑼丨細胞數目增加 1C)。如此，於添加含膽固醇之甲基_ ( D〇TAP(D)後轉移感染效率提高。 U队）至 U柱狀圖顯示MBC對習知轉移感染劑的 i: ϊ 精(smbc)轉移感染的細胞顯示對/5 :=八色為陽性之細胞數目比單獨D0TAP或舒派費增加。MBC不會提南裸DNA的攝取量。、曰柱狀圖顯示⑽此於習知D〇TAp ··膽固a 未經轉移感染細胞(⑽)細毫微米山又，、里未頒不任何石—gal活性。AVDC可轉移感染〇s 、，'田L，但無法有效轉移感染MB49細胞。相反地’， =轉移感細細胞以及提升係圖為Λ狀Λ顯示pCMVLacZ基因之表現與時間之關至以小時(圖：㈣感染後“、時出現’且穩定升高至才（圖2幻。細胞係如實例乙節所述轉移感染，且於 8及12日後使用0NPG檢定分析檢定分析万性。卢—糾之表現於12日遠較低（圖2B)。㈣活圖3A-3B驗證經由細胞曝露於D〇TAp(D)或⑽沉而讓⑽a進 90103013.ptcl 第44頁 1262085

圖式簡單說明入細胞内部。LacZ基因的存在對未經轉移感毕細胞使用PCR決定（圖3A)。GADPH用作為陽性料叩私感染因相對GAPDH之表現係於瓊脂糖凝膠電泳 /、、基掃描PCR產物決定（圖3B)。山"又外置圖4A-4B藉PCR驗證質體DNA的局部化。園^ Δ e 1 ιυ _ 4A顯示pcr供梯產物。LacZ基因出現於使用DMBC轉移感染的細胞匕曰分及胞質（cy)部分’但僅出現於以D0TAP(DM|移感口貝部分。圖4 B絲員示細胞核（N )部分及胞質（「v、立 y、已 i貝、l γ)部分相對 GADPH之密度計量分析。 π对1 圖5 A - 5 B為柱狀圖顯示D N A : D Μ B C複體的抗增生效果列化學劑之抗增生效果：DMBC/DNA，DOTAPoS/D二，DNA下，DMBC，DOTAP(D)及MBC係於曝露2小時（圖5A)及24小時 (圖5 B )後與未經處理的MB4 9細胞（C 0N )比較。經由比較 [14 C ]胸腺核苷結合於經轉移感染細胞及未經轉移感染細胞可決定4 8小時後之相對抗增生效果。圖6A-6B為相片顯示於活體内尿路上皮細胞之轉移感染。經轉移感染的膀胱於2日後收穫且染色測量沒—半乳糖答酶活性。未經轉移感染膀胱用作為陰性對照（圖6 A)。於經轉移感染膀胱’面對空腔的上皮細胞染色為陽性（圖6 β ) 。（放大4 0倍）圖7 f頌示於暫時性轉移感染後p c μ V 1 a c Ζ之細胞局限化。來自未經轉移感染小鼠的器官標示為C表示對照組織。由使用pCMV 1 acZ/DMBC複體轉移感染之小氣收穫器官標示為 DMBC。除了膀胱外，所有器官皆不存在有冷一半乳糖苷酶

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第45頁 1262085 圖式簡單說明 — .基因經過PCR證實。圖8 A為柱狀圖顯示於試管試驗曝曬時間對轉移感染效果的影響。於試管中細胞曝露於⑽人：DMBC複體經歷15、3〇、6 0及1 2 0分鐘。藉使用x — ga丄染色呈陽性之細胞百分比測量’曝露時間延長可改良轉移感染效率。圖8Βι-8Βιν為相片顯示於活體内曝露時間對轉移感染效果的影響。膀胱曝露於pCMVlacZ/DMBC複體經歷1)15分鐘，1 1 ) 3 0分鐘，丄！！）6 〇分鐘及i v ) 1 2 0分鐘（放大4 〇倍）。隨著時間的經過以X — ga i染色的尿路上皮細胞增加。圖9 A - 9 B為相片顯示於單次膀胱内滴注後，於活體内之表現持續時間。轉移感染後2日，大部分面對内腔的細胞皆以X-ga 1染色為陽性（圖9 A ) ^ 3 0日後於較少數細胞仍然可觀察到/3-gal的表現（圖9B)(放大1〇〇倍）。圖10A-10B為相片顯示正常（圖10A)及增生（圖1〇B)膀胱切片的X g a 1染色。膀胱植入μ B 4 9腫瘤細胞之膀胱以 p C Μ V 1 a c Ζ · D Μ B C轉移感染2小時。於增生之表淺内腔細胞層觀察得藍色染色。（放大1〇〇倍）。

圖1 1為線圖顯示使用細胞激素基因治療（IL —2，GMCSF ，IL-2 + GMCSF或IFN- r )或使用DMBC處理小鼠或未經處理對照組小鼠於第7曰之腫瘤體積。圖1 2為線圖頒示使用細胞激素基因治療（I ^ - 2，〇 μ c S F， IL-2 + GMCSF或IFN- r )或使用DMBC處理小鼠或未經處理對照組小鼠於第3 8日之腫瘤體積。

圖13為線圖顯示使用細胞激素基因治療（IL —2，GM(：SF

\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第46頁 1262085

90103013.ptd 第47頁

Claims

1262085 « 9〇1〇3〇13 ?η〇6 ί G JUN 年月日修正替換：本 A、申請專利範圍、1 . 一種於試管内轉移感染聚核苷酸至細胞之方法，該方法包含將： (1 )至少一種聚核苷酸； (1 1 ) 一種陽離子性脂質、一種陽離子性聚合物或一種樹狀體或其組合；以及 (ί ί ί ) 一種包含有以一種環糊精增溶之膽固醇的增溶膽固醇製劑組合而形成一種轉移感染組成物；以及施用該轉移感染組成物至細胞，因而細胞以聚核苷酸轉移感染。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該環糊精為曱基-/9 -環糊精。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該環糊精係選自 ck - ϊ哀糊精’ /3 -壞糊精’ 7^ -壞糊精’硫酸化/5 -壞糊精’ 第三胺/3 -環糊精，第四胺/3 -環糊精，2 -經丙基-/3 -環糊精，2，6-二-〇-曱基-yS -環糊精，經乙基環糊精，6_ 去氧-6-S- /3 -D-半乳糖吼喃糖基-6-硫-環麥芽糖-庚糖，磺丁基醚-石-環糊精，羧曱基-/3 -環糊精，羧曱基-乙基-/3 -環糊精，二乙基-/3 -環糊精，二曱基-万-環糊精，隨機曱基-yS -環糊精，葡萄糖基-万-環糊精及麥芽糖基-/5 -環糊精組成的組群。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中（i i)為一種陽離子性脂質，其為DOTAP。 5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中（i i)為一種樹狀

C:\總檔\90\90103013\90103013(替換）-2.ptc 第 48 頁 1262085

-—----iJ^_90]£3£]^3 六、申請專利範圍^' -'^·_月η 修正 _種包含有以—滁Μ ^ 種&糊精抽、、办配該聚核菩酸及陽離子=洛之膽固醇的增溶膽固醇製劑調月豆。月曰貝、陽離子性聚合物或樹狀 14.如申請專利範圍第工基—/5 ~環糊精。項之方法，其中該環糊精為甲 1 5 ·如申凊專利範圍第自α -環糊精，点〜環糊精項之方法，其中該環糊精係選精，第三胺/3 -環糊精，\^ —環糊精，硫酸化万-環糊環糊精，2, 6-二-^爲第四胺/5 -環糊精，2-羥丙基-冷- 精，6-去氧-6-S- /5—]):半石〜環糊精，羥乙基—召-環糊庚糖，磺丁基醚-石“扎糖吡喃糖基-6 -硫-環麥芽糖一 μ k糊牲 -乙基-/5 -環糊精，二乙％，魏曱基-/3 -環糊精，缓甲基精，隨機曱基-点—環糊於I石-環糊精，二甲基-/3 -環糊基- /5 -環糊精組成的級^ 葡萄糖基-/?-環糊精及麥芽糖 1 6 ·如申請專利範圍第。質為D0TAP。 d項之方法，其中該陽離子性脂 1 7 ·如申請專利範圍第派費。 d項之方法，其中該樹狀體為舒 1 8 ·如申请專利範圍第質、陽離子性聚合物或抖項之方法，其中該陽離子性脂 4树狀體係選自DOPE，D0TMA， DOGS ’ D0DAB ’ D0DAC ， dospa ， DC-Choi ， dqic ， dopc ， DMR I E，P AM AM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸，聚伸乙基亞胺，聚（4 -乙烯基π比啶），聚（乙烯基胺），聚（4 -乙烯基-N-烷基鹵化吼啶_)，或其組合組成的組群。

(：:\總檔\9〇\90103013\90103013(替換）-2.ptc 第 50 頁 1262085 案號 90103013_年月日__ 六、申請專利範圍，1 9.如申請專利範圍第1 3項之方法，其中聚核苷酸為質體DNA。 —2 0 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該聚核苷酸係選自病毒DNA，染色體片段、反訊息寡核苷酸、反訊息硫代磷酸酯寡核苷酸、R N A分子及核糖酶或其組合組成的組群。 2 1 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該細胞為真核細胞。 2 2.如申請專利範圍第2 1項之方法，其中該細胞為哺乳類細胞。 2 3.如申請專利範圍第2 2項之方法，其中該細胞為尿路上皮細胞。 2 4.如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該轉移感染組成物係施用至培養中的細胞。 2 5. —種由轉移感染組成物製備使用於輸送藥劑至個體尿路上皮細胞之藥物之方法，其中該轉移感染組成物之製備包含：將藥劑與一種包含有以一種環糊精增溶之膽固醇的增溶膽固醇製劑組合而形成該轉移感染組成物。 2 6.如申請專利範圍第2 5項之方法，其中該環糊精為甲基_ /3 •環糊精。 2 7.如申請專利範圍第2 5項之方法，其中該環糊精係選自6K -壞糊精，/5 _壞糊精’ X -壞糊精’硫酸化/5 -壞糊精，第三胺/3 -環糊精，第四胺々-環糊精，2 -羥丙基-/5 -

(：:\總檔\90\90103013\90103013(替換）-2.ptc 第 51 頁 1262085 修正

皇號9010J^ 六、申請專利範圍環糊精’ 2，6 -二-〇 —甲美— 精’ 6-去氧-6-Sn^^環糊精’經乙基1〜環糊庚糖，績丁基峻-^環糊精，幾K基-6-^環麥芽糖— -乙基-/3-環糊精，二乙基土万衣糊精，竣甲基精，隨機甲基1環糊精，葡萄二产甲基4環糊基—点—^糊精組成的組群。 ^ 土衣糊精及麥芽糠 2 8 ·如申凊專利範圍第2 ^ 至少-種聚核答酸及^ :之方法’其中該藥劑包含⑴ 性聚合物或-種樹狀體匕：：離子性脂質、-種陽離』 29.如中請專利範圍第28項之°方法，其中（離子性脂質，其為D〇TAp。马種％ 30·如申請專利範圍第28項之方法’其中⑴）為_種狀體，其為舒派費。 31 ·如申4專利範圍第2 §項之方法，其中該陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體係逡自DOPE，D0TMA， D 0 G S ’ D 0 D A B ’ D 0 D A C，D Q s P A，D C，。h 〇 1 ’ D 0 I C ’ D 0 P C， DMRIE，PAMAM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸，聚伸乙基亞胺’聚（4 -乙稀基p比淀），聚（乙你基胺）’聚（4 -乙稀基-Ν -完基鹵化吼咬錄），或其組合組成的組群。 3 2 ·如申請專利範圍第2 8項之方法’其中聚核苷酸為質體DNA 〇 3 3 ·如申請專利範圍第2 8項之方法，其中該聚核苷酸係選自病毒DNA ’染色體片段、反訊息券核甘酸、反息疏代磷酸酯寡核苷酸、RNA分子及核糠酶或其組合組成的組

(：:\總檔\90\90103013\90103013(替換），2.ptc 第 52 買 1262085 案號 90103013 年月曰_ifi__ 六、申請專利範圍 .群。 3 4。一種由轉移感染組成物製備使用於個體處理膀胱癌 _之藥物之方法，其中該轉移感染組成物之製備包含：將一種藥劑與一種包含有以一種環糊精增溶之膽固醇的增溶膽固醇製劑組合而形成一種治療性組成物，其中該藥劑對膀胱癌細胞具有抗癌活性。 3 5.如申請專利範圍第3 4項之方法，其中該環糊精為甲基-/3 -環糊精。 3 6.如申請專利範圍第34項之方法，其中該環糊精係選自α -壞糊精’ yS -壞糊精’ T _壞糊精’硫酸化/5 -壞糊精，第三胺/3 -環糊精，第四胺万-環糊精，2 -經丙基-卢-環糊精，2，6 -二- 0 -曱基-/5 _環糊精’經乙基-/3 -環糊精，6-去氧-6-S- /3-D-半乳糖吼喃糖基-6-硫-環麥芽糖-庚糖，磺丁基醚-万-環糊精，羧曱基-/3 -環糊精，羧甲基 -乙基-yS -環糊精，二乙基-/3 -環糊精，二曱基-石-環糊精，隨機曱基-/5 -環糊精，葡萄糖基-/3 -環糊精及麥芽糖基--環糊精組成的組群。 3 7.如申請專利範圍第34項之方法，其中該藥劑包含（i) 至少一種聚核苷酸及（i i) 一種陽離子性脂質、一種陽離子性聚合物或一種樹狀體或其組合。 3 8.如申請專利範圍第3 7項之方法，其中（i i)為一種陽離子性脂質其為DOTAP。 3 9.如申請專利範圍第3 7項之方法，其中（i i )為一種樹狀體其為舒派費。

(：:\總檔\9〇\90103013\90103013(替換）-2.ptc 第 53 頁 1262085 年月案號 90103013 六申請專利範圍 4 0.如申請專利範圍第3 7項之方法，其中該陽離子性月旨質、陽離子性聚合物或樹狀體係選自D〇pE，D〇TMA， DOGS ’ DODAB ’ DODAC ， DOSPA ， DC-Ch〇l ， DOIC ， DOPC ， DMRI E，PAM AM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸，聚伸乙基亞胺，聚（4 -乙烯基吡啶;），聚（乙烯基胺），聚㈠-乙基-N-烷基函化，比啶鑛），或其組合組成的組群。 41·如申請專利範圍第37項之方法，其中該聚核苔酸含至少一種表現載體，該表現載體編碼至少一種選自介素、干擾素、群落刺激因子、抗血管新生因子、抗轉移= 子、膜受體及腫瘤抑制劑組成的組群之蛋白質。 42·如申請專利範圍第37項之方法，其中該聚核誓酸含一種表現載體，該表現載體編碼一 (IL —D、，介白素-川"），介白素-6(IL:6)，介白素二二，13^ 白 Ϊ—，介白素—12(IL—12)，介白 f = 素，(IL-18)，干擾素…干擾素〜素 \ 7 ，粒狀細胞—巨噬細胞群落刺激因子 (GMCSF)，粒狀細胞群落刺激因子（Gcs 刺激因子（MCSF)，熱震蛋白質（Hsp)，p53，血洛生長因子拮抗齊](V E G F )，全屬疋& @ 5 皮、.、田胞 ,、Α π V viLur ;至屬蛋白S每組織抑制劑（丁 I MP )，及纖、、隹蛋白膠受體組成的組群之蛋白質。 43.如申請專利範圍第37項貝含-種編碼介白素—2(關之表方現V/。中該劃酸包 44·如申請專利範圍第3?項之含-種編碼粒狀細胞—巨噬細胞’ ’中該聚核苔酸包也群洛刺激因子（GMCSF)之表

1262085 _案號 90103013_年月日修正六、申請專利範圍 λ現載體。 4 5 ,如申請專利範圍第3 7項之方法，其中該聚核苷酸包 •含一種編碼干擾素-7之表現載體。 4 6.如申請專利範圍第3 7項之方法，其中該聚核苷酸包含至少一種表現載體其編碼介白素-2 ( I L ~~ 2 )，粒狀細胞-巨噬細胞群落刺激因子（GMCSF)及干擾素-r中之二者或二者以上。 4 7. —種轉移感染組成物，包含： (i ) 一種聚核苷酸； (1 i ) 一種陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體，或其組合；以及 (i i i ) 一種包含有以一種環糊精增溶之膽固醇的增溶膽固醇製劑。 48. 如申請專利範圍第47項之轉移感染組成物，其中該環糊精為曱基-/3 -環糊精。 49. 如申請專利範圍第47項之轉移感染組成物，其中該壞糊精係選自_壤糊精’ /5 _壞糊精’ 7^ -壤糊精’硫酸化/?-環糊精，第三胺/3 -環糊精，第四胺/5 -環糊精，2-經丙基-yS -環糊精，2，6 -二-0 -曱基-/3 -環糊精，經乙基-万-環糊精，6-去氧-6-S- /3 -D-半乳糖吼喃糖基-6-硫-環麥芽糖-庚糖，石黃丁基醚-/3 -環糊精，繞曱基--環糊精，竣甲基-乙基_万-環糊精，二乙基-/S -環糊精，二甲基- /5 -環糊精，隨機曱基-/5 -環糊精，葡萄糖基-yS -環糊精及麥芽糖基-/5 -環糊精組成的組群。

(：:\總檔\90\90103013\90103013(替換）-2.卩1^ 第 55 頁 1262085 -—---案號 901030]^_年月曰倏正_ 六、申請專利範圍 —5 0 ·如申請專利範圍第4 7項之轉移感染組成物，其中 (1 1 )為—種陽離子性脂質其為D〇TAp。 5 1 ·如申請專利範圍第4 7項之轉移感染組成物，其中 (1 1 )為一種樹狀體其為舒派費。 3 5 2 ·如申請專利範圍第4 7項之轉移感染組成物，其中該陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體係選自DOPE， DOTMA ’ DOGS ’ D0DAB ， D0DAC ， D0SPA ， DC-Choi ， D0IC ， ’ DMRIE：，PAMAM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸，伸乙基亞胺，聚（4 -乙烯基吼啶），聚（乙烯基胺），聚 (4乙稀基-Ν -；)：完基鹵化吼咬，編），或其組合組成的組群。 5 3 ·如申請專利範圍第4 7項之轉移感染組成物，其中聚核苷酸為質體DNA。 & 5 4 ·如申請專利範圍第4 7項之轉移感染組成物，其中該 $核答酸係選自病毒DNA，染色體片段、反訊息募核苷酸、反訊息硫代磷酸酯寡核苷酸、RNA分子及核糖酶或其組合組成的組群。、5 5.如申請專利範圍第47至54項中任一項之轉移感染組 f物’其中聚核苷酸、陽離子性脂質、陽離子性聚合物或树狀與增溶膽固醇製劑之比例為使與該組成物接觸之細胞可被聚核苷酸轉移感染。、 56·如申請專利範圍第47至54項中任一項之轉移感染組 j物，其中陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體與擗 '合，f §子之比例為2 : 1至1 : 3(W/w)以及聚核苷酸與陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體之比例為1 : 1 1至

1262085 _案號 90103013_年月日__ 六、曱請專利範圍，1 :3(w/w ) ° 5 7 .如申請專利範圍第4 7、5 3或5 4項之轉移感染組成 '物，其中當（1 1 )為陽離子性脂質而為DOTAP以及該增溶膽固醇製劑包含以曱基-/3 -環糊精增溶之膽固醇時，聚核苷酸和陽離子性脂質和增溶膽固醇之比例為 7. 5:20:40(w/w)。 5 8 .如申請專利範圍第4 7、5 3或5 4項之轉移感染組成物，其中當（1 1 )為樹狀體而為舒派費以及該增溶膽固醇製劑包含以曱基-/5 -環糊精增溶之膽固醇時，聚核苷酸和樹狀體和增溶膽固醇之比例為2 : 2 2 . 5 : 1 0 (w / w)。

匸：\總檔\90\9〇1〇3013\90103013(替換）-2.ptc 第 57 頁