JP2003508456A - 製剤のデリバリー方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
デリバリー、特に非ウイルス法による細胞の中へのポリヌクレオチドのデリバリ
ーに関する。本発明は、さらに、癌の治療、特に膀胱癌の治療用製剤のデリバリ
ーに関する。 発明の背景 遺伝子治療法における多数の最近の進歩にかかわらず、種々の細胞タイプの中
への遺伝子の有効な療法的デリバリー、特にin vivoデリバリーは、治療を必要
とする患者の特定細胞中にこのような遺伝子を治療的に有効な量で送達するため
に利用不可能であるので、簡単に達成されてきていない。治療的に十分な量の遺
伝子、および治療用分子の有効なデリバリーは、例えば、細胞膜が選択的に透過
性のバリヤーを表すので、不可能でないにしても、困難であることが証明された
。さらに、遺伝子または他の生物学的に活性な分子が首尾よくターゲット細胞の
中に入ったときでさえ、それらは分解され、不適切に輸送されるか、あるいは遺
伝子の場合において、適切に転写されないことがある。
イプの1例は、膀胱の尿路上皮(urothelial)細胞である。このような方法は膀
胱癌の治療において特に有効であろう。内視鏡および膀胱内化学療法の進歩にか
かわらず、表在性膀胱癌はなお高い再発性および進行速度を有する(Nseyo UO
、Lamm DL(1996)Semin. Oncol. 5:598−604)。現在、最も有望な治療は
毎週「生」カルメット−ゲラン杆菌(BCG)を膀胱の中に2時間点滴注入すること
を包含する(Morales、A. 他(1976)、J. Urol.、116:180−183;Brosman、
S. A.(1992)Urol. Clin. North Am.、19:557−564)。有効であるが、60
〜70%の日常的応答速度で、副作用、例えば、排尿困難、血尿、脈拍数および膀
胱炎は普通であり、時には苛酷である(Lamm DL(1992)Urol. Clin. North
Am.、19:565−572)。その上、有意な数の患者はBCG治療に対して応答せず、
毒性は普通である。免疫応答のBCG活性化メカニズムの探査において、腫瘍に対
する細胞障害性応答の促進において重要な役割を演ずるサイトカイン、共刺激分
子および接着分子が同定された(Taniguchi、K. 他(1999)Clin. Exp. Immu
nol.、115:131−5、1999;Patard、J. J. 他(1998)Urol. Res.、26:155
−9;Kurisu、K. 他(1994)Cancer Imunol. Immunother.、39:249−53;Sa
nder、B. 他(1996)J. Urology、156:536−41;Chow、N. H. 他(1998)U
rology、52:1015−9;Jackson、A. M. 他(1995)Clin. Exp. Immunol.、9
9:369−75)。
子を簡単な膀胱内投与により腫瘍と直接接触させて配置することができる治療、
のために特に魅力的とする、いくつかの特徴を有する。さらに、治療に対する腫
瘍の応答は膀胱鏡検査および尿細胞学により容易に測定することができる。トラ
ンジション細胞上皮の首尾よいトランスフェクションの主要な障害の1つは、DNA
複合体の吸収に対する有意なバリヤーとして作用することがある、グリコサミノ
グリカン層の存在である(Ruponen、M. 他(1999)Biochim. Biophys. Acta
、1415:331−41)。
使用されてきている(Sutton、M. A. 他(1997)Urology、49:173−80;Lee
、S. S. 他(1994)Cancer Res.、54:3325−8)。しかしながら、ウイルス
ベクターは臨床的設定、例えば、免疫原性および安全性において多数の制限を有
する。Li他による最近の研究において、膀胱癌のためのアデノウイルスに基づく
遺伝子治療の有効性は、ヒト膀胱癌細胞系統において観測されたウイルスレセプ
ターレベルの差のために問題とされた(Li、Y. 他(1999)Cancer Res.、59:
325−30)。
ウイルス系の利点は、それがレセプター依存性でなく、したがってすべての腫瘍
に適用可能であるということである。Brigham他は、カチオンリポソームを使用
する組織の中へのDNAのデリバリーを最初に報告した(Brigham、K. L. 他(19
89)Am. J. Med. Sci.、298:278−81)。それ以来カチオン脂質は、in viv
oにおける組織への局在化、系統的デリバリーのための効率よいキャリヤーであ
ることが示された(Plautz、G. E. 他(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA、90:4645−9;Nabel,G. J. 他(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA
、90:11307−11;Zhu N. 他(1993)Science、261:209−11)。カチオンリ
ポソームは、臨床的設定においてウイルス遺伝子デリバリーを超えた、多数の重
要な利点を有する。これらは簡単なプラスミドから染色体フラグメントの範囲を
使用する能力、およびより少ない安全性の問題を包含する。しかしながら、それ
らの主要な欠点は、ウイルス技術と比較したとき、トランスフェクション効率が
比較的低いことである。
、ならびに製剤を膀胱に送達する一般的方法は、なお必要とされている。 発明の要約 本発明は、製剤、特にポリヌクレオチドを細胞、特に尿路上皮細胞の中に送達
する改良された方法を提供する。また、可溶化コレステロールをカチオン脂質と
して使用すると、カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーと複合化
したDNAのトランスフェクション効率を増強できることが今回発見された。好ま
しくは、シクロデキストリン、好ましくはメチル−β−シクロデキストリンを使
用してコレステロールを可溶化する。in vitroまたはin vivoにおいて尿路上
皮細胞をトランスフェクトすることが特に好ましいが、本発明のトランスフェク
ション法は種々の他の細胞タイプのトランスフェクションに適用することができ
る。その上、カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーで複合化した
DNAの尿路上皮細胞の中へのエントリーに対する可溶化コレステロールの作用を
増強することは、in vitroまたはin vivoにおいて膀胱内デリバリーによる、
他のタイプの製剤デリバリーに適用することができる。
オチドを(ii)カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそ
れらの組合わせ、および(iii)可溶化コレステロール調製物を組合わせてトラ
ンスフェクション組成物を形成し;そしてトランスフェクション組成物を細胞に
適用し、こうして細胞を1またはそれ以上のポリヌクレオチドでトランスフェク
トすることを包含する。好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキ
ストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる。好ましくは、シクロ
デキストリンはメチル−β−シクロデキストリンである。他のシクロデキストリ
ンは、アルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−
シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ
−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロ
キシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−メチル−ベータ−
シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デ
オキシ−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタ
オース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチ
ル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロ
デキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シ
クロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−
ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンを
包含する。好ましいカチオン脂質はDOTAPであるが、好ましいデンドリマーはス
ーパーフェクト(Superfect)である。他の適当なカチオン脂質およびデンドリ
マーは、DOPE、DOTMA、DOGS、DODAB、DODAC、DOSPA、DC−Chol、DOIC、DOPC、DM
RIE、PAMAM、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミ
ン、ポリ(4−ビニルピリジン)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(4−ビニル−N
−アルキルピリジニウムハライド)、またはそれらの組合わせを包含する。この
方法を使用して種々のポリヌクレオチド、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA
、染色体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの
組合わせをトランスフェクトするために使用することができる。
乳動物細胞、なお最も好ましくは尿路上皮細胞とともに使用される。トランスフ
ェクション法は、in vitroで、例えば、トランスフェクション組成物を培養中
の細胞に適用するとき、実行することができる。選択的に、この方法は、トラン
スフェクション組成物をin vivoにおいて細胞に適用することによって、in vi
voにおいて実行することができる。他の好ましい態様において、本発明のトラン
スフェクション組成物を被検体の膀胱への膀胱内デリバリーによりin vivoにお
いて尿路上皮細胞に適用する。
を提供する。この方法は、製剤を可溶化コレステロール調製物と組合わせて医薬
組成物を形成し、医薬組成物を膀胱内的に被検体の膀胱の中に送達し、こうして
製剤を被検体の尿路上皮細胞の中に送達させることを包含する。好ましくは、可
溶化コレステロール調製物はシクロデキストリンで可溶化されているコレステロ
ールを含んでなる。好ましくは、シクロデキストリンはメチル−β−シクロデキ
ストリンである。他の適当なシクロデキストリンは、アルファ−シクロデキスト
リン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベー
タ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級ア
ミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデ
キストリン、2,6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシ
エチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−S−ベータ−D−ガラクト
ピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−
ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン
、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ
−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチ
ルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよ
びマルトシル−ベータ−シクロデキストリンを包含する。他の好ましい態様にお
いて、製剤は、(i)少なくとも1つのポリヌクレオチドおよび(ii)カチオン脂
質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせを含んでな
る。
方法は、製剤を可溶化コレステロール調製物と組合わせて医薬組成物を形成し、
ここで製剤は膀胱癌細胞に対する抗癌活性を有し、そして医薬組成物を膀胱内的
に被検体の膀胱の中に送出して、被検体の膀胱癌細胞を製剤で治療することを含
んでなる。好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキストリンで可
溶化されているコレステロールを含んでなる。好ましくは、シクロデキストリン
はメチル−β−シクロデキストリンである。他の適当なシクロデキストリンは、
アルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロ
デキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シク
ロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプ
ロピル−ベータ−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロ
デキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ
−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース
、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベ
ータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキス
トリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデ
キストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ
−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンを包含す
る。
チオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせと
を含んでなる。例えば、1またはそれ以上のポリヌクレオチドは、インターロイ
キン、インターフェロン、コロニー刺激因子、抗血管形成因子、抗転移因子、膜
レセプターおよび腫瘍抑制因子から成る群から選択されるタンパク質をコードす
る少なくとも1つの発現ベクターを含んでなることができる。好ましいタンパク
質は、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−2(IL−2)、インタ
ーロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−9(IL−9)、インターロイキン−
11(IL−11)、インターロイキン−12(IL−12)、インターロイキン−13(IL−
13)、インターロイキン−18(IL−18)、インターフェロン−α、インターフェ
ロン−β、インターフェロン−γ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(
GMCSF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、マクロファージコロニー刺激因子
(MCSF)、熱ショックタンパク質(HSP)、p53、抗血管形成因子、例えば、血管
内皮細胞増殖因子(VEGF)のアンタゴニスト、例えば、アンチセンス分子、抗転
移因子、例えば、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)、およびBC
G活性を増加する因子、例えば、フィブロネクチンレセプターを包含する。特に
好ましいタンパク質は、インターロイキン−2(IL−2)、GMCSFおよびインター
フェロン−γ、およびそれらの組合わせを包含する。
することをさらに含むことができる。例えば、本発明の治療方法と組合わせるこ
とができる、好ましい追加の抗膀胱癌治療は、カルメット−ゲラン杆菌(BCG)
療法である。
なくとも1つのポリヌクレオチド;カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデン
ドリマー、またはそれらの組合わせ;および可溶化コレステロール調製物を含ん
でなる。好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキストリンで可溶
化されているコレステロールを含んでなる。好ましくは、シクロデキストリンは
メチル−β−シクロデキストリンである。他の適当なシクロデキストリンは、ア
ルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデ
キストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロ
デキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロ
ピル−ベータ−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデ
キストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−S
−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、ス
ルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ
−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリ
ン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキス
トリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シ
クロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンを包含する。
好ましいカチオン脂質はDOTAPであるが、好ましいデンドリマーはスーパーフェ
クトである。他の適当なカチオンおよびデンドリマーは、DOPE、DOTMA、DOGS、D
ODAB、DODAC、DOSPA、DC−Chol、DOIC、DOPC、DMRIE、PAMAM、ポリリシン、ポリ
ヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ(4−ビニルピリジン
)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(4−ビニル−N−アルキルピリジニウムハライ
ド)、またはそれらの組合わせを包含する。トランスフェクション組成物は、1
またはそれ以上の種々のポリヌクレオチド、例えば、プラスミドDNA、ウイルスD
NA、染色体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれら
の組合わせを含んでなることができる。 発明の詳細な説明 この開示を通じて、種々の刊行物、特許および公開された特許出願は識別引用
により参照される。本発明が関係する技術水準をいっそう完全に記載するために
、これらの刊行物、特許および公開された特許出願の開示は引用することによっ
てこの開示の中に組込まれる。
スフェクトする」または「トランスフェトした」)の種々の形態は、ポリヌクレ
オチド分子を外部の位置から細胞の内部の中に導入するプロセスを意味すること
を意図する。
ボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)分子を包含する、2またはそれ以上の共有
結合したヌクレオチド塩基から構成された分子を包含する。ポリヌクレオチド分
子を形成するヌクレオチドは典型的にはホスホジエステル結合により互いに結合
されているが、用語「ポリヌクレオチド分子」はまた他の結合、例えば、ホスホ
ロチオエート結合により結合されたヌクレオチドを包含することを意図する。ポ
リヌクレオチド分子の非限定的例は、プラスミドDNA、ウイルスDNA、染色体フラ
グメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイムを包含する。
最も典型的には2つの、脂肪酸鎖および正に帯電した極性ヘッド基から構成され
た分子を意味することを意図する。典型的なカチオン脂質は、ドデシル(C12)
またはヘキサデシル(セチル、C16)脂肪酸鎖を有するが、用語「カチオン脂質
」はまた他の長さの脂肪酸鎖を有する脂質を包含することを意図する。カチオン
脂質の非限定的例は、次の通りである: DOTAP(1,2−ジアシル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、 DOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)、 DOTMA([2,3−ビス(オレオイル)プロピル]トリメチルアンモニウムクロ
ライド)、 DOGS(ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン)、 DODAB(ジオクタデシルジアンモニウムブロミド)、 DODAC(ジオクタデシルジアンモニウムクロライド)、 DOSPA(2,3−ジオレオイルオキシ−N−[スペルミンカルボキシアミノエチル
]−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウム)、 DC−Chol(3β[N−n',N'−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレス
テロール、ジオレオイル)、 DOIC(1−[2−(オレオイルオキシ)−エチル]−2−オレオイル−3−(2−
ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロライド)、 DOPC(ジオレオイルホスファチジルコリン)、 DMRIE(ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブ
ロミド)。
能力を有する正に帯電したポリマー(例えば、DNA)である。カチオンポリマー
はポリ電解質およびカチオンポリペプチドを包含する。カチオンポリマーの非限
定的例は、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン
(PEI)、ポリ(4−ビニルピリジン)、ポリ(ビニルアミン)およびポリ(4−
ビニル−N−アルキルピリジニウムハライド)である。
ストポリマーを意味することを意図する。これらは層中の球形成長によりアンモ
ニウムコアから派生する球形ポリマーである。デンドリマーの非限定的例は、ス
ーパーフェクト(Superfect)およびPAMAMである。
有する天然に存在するステロイドアルコール(ステロール)、ならびに長鎖脂肪
酸とのそのエステル、および膜流動性をモジュレートする能力を保持するそれら
のアナローグを意味することを意図する。コレステロールおよびコレステロール
エステルは、血漿リポタンパク質および動物細胞の外側細胞数の成分であり、そ
して膜流動性をモジュレートする能力を有する。膜流動性をモジュレートするコ
レステロールアナローグはこの分野において知られており(例えば、Gimpl、G.
、他(1997)Biochemistry 36:10959−10974参照)そして、例えば、5−コレ
ステン、5−プレグネン−3β−オール−20−オン、4−コレステン−3−オンおよ
び5−コレステン−3−オンを包含する。
レステロールの水溶性を増加させる可溶化剤を使用してコレステロールが水可溶
化されている(すなわち、可溶化コレステロール調製物の水溶性はコレステロー
ル単独の水溶性よりも高い)調製物を意味することを意図する。典型的には、可
溶化剤は親油性分子をパッケージすることができるキャビティを有する水溶性化
合物である。好ましい可溶化剤はシクロデキストリンである。コレステロールの
可溶化(例えば、可溶化剤、例えば、シクロデキストリンの中への組込み)は、
コレステロール、例えば、[1,2,6,7−3H(N)]コレステロール(Dupont/N
ew England Nuclearから商業的に入手可能である)の放射能標識化によりモニ
ターすることができる、例えば、下記の文献を参照のこと:Pang、L. 他(1999
)Biochemistry 38:12003−12011)。用語「可溶化コレステロール調製物」は
、リポソームの2層の中に組込まれたコレステロールを意味することを意図しな
い。
面および疎水性中心キャビティを有する、オリゴ糖の環状トルス形分子を意味す
ることを意図し、この疎水性中心キャビティは親油性物質(例えば、コレステロ
ール)を担持することができる。「シクロデキストリン」は6、7または8つのグ
リコピラノース単位を有する分子(それぞれ、アルファ−、ベータ−およびガン
マ−シクロデキストリン)、ならびにより大きい環を有する分子(9〜13のグリ
コピラノース単位を有するシクロデキストリンが単離された)を包含するが、ベ
ータ−シクロデキストリンは本発明において使用するために好ましい。用語「シ
クロデキストリン」はまたアルファ−、ベータ−およびガンマ−シクロデキスト
リン(またはさらになおより大きい環)の誘導体を包含することを意図し、それ
らの非限定的例は硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シ
クロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシ
プロピル−ベータ−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−メチル−ベータ−シク
ロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキ
シ−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオー
ス、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−
ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキ
ストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロ
デキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベー
タ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンを包含
する。本発明において使用するために好ましいシクロデキストリンは、メチル−
β−シクロデキストリンである。シクロデキストリンの構造および薬学上の応用
は下記の文献において概観されている:Szejtli、J.(1994)Med. Res. Rev
iews 14:353−386およびRajewski、R. A. およびStella、V. J.(1996)J.
Pharm. Sci. 85:1142−1169。
リヌクレオチドと、カチオン脂質またはデンドリマーと、可溶化コレステロール
調製物とから生ずる組成物を意味する。
包含することを意図し、それらの非限定的例はポリヌクレオチド、タンパク質、
ポリペプチド、ペプチド、化学療法剤、抗生物質およびその他を包含する。
と可溶化コレステロール調製物とを組合わせることによって形成した組成物を意
味することを意図するが、治療組成物は追加の成分(例えば、追加の製剤、カチ
オン脂質、デンドリマーまたは治療組成物のデリバリーまたは治療活性を増強す
る1またはそれ以上の他の成分)を含有することができる。
する、例えば、膀胱癌のような癌の治療を必要とする、生きている生物を意味す
ることを意図する。好ましい被検体は哺乳動物である。被検体の例は、ヒト、サ
ル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、雌牛、ウマ、ヤギおよびヒツジである。また
、被検体は他の脊椎動物、例えば、魚類および鳥類(例えば、ニワトリ)を包含
する。
生活能力または転移を、直接的に(すなわち、癌細胞に対して直接的に作用する
ことによって、例えば、癌細胞に対して毒性である化学療法剤)あるいは間接的
に(例えば、癌細胞に対する免疫応答を刺激することによって)阻害する能力を
有することを意味する。
以上の症状の軽減を意味することを意図する。
治療を達成するために十分な量(例えば、製剤の)を意味することを意図する。
」は、BCGを膀胱の中に膀胱内的に投与する、膀胱癌の治療養生法を意味するこ
とを意図する。
細胞のトランスフェクション効率を改善することができるという発見に基づく。
コレステロールの好ましい可溶化剤はシクロデキストリン、例えば、メチル−β
−シクロデキストリンである。実験において、メチル−β−シクロデキストリン
を含有するコレステロールはそれ自体裸DNAのトランスフェクションを改良せず
、カチオン脂質(DOTAP)と組み合わせて、それはトランスフェクションを増強
することを示した。in vitroにおいて、この添加はカチオン脂質(DOTAP)単独
に比較してトランスフェトした3.8倍の増加を生ずる(実施例1参照)。in vivo
において、管腔に面する膀胱上皮細胞は、カチオン脂質単独を使用して達成でき
ない程度に、首尾よくトランスフェクトされた(実施例6参照)。使用するカチ
オン脂質がDOTAPであるとき、2.7:1(重量:重量)のDOTAP/DNA比および6:1
(重量:重量)のDOTAP/コレステロール比を使用して最適なトランスフェクシ
ョンが得られた。Crook他はDOTAPとの混合物を使用して、1:1(重量:重量)の
DOTAP/コレステロール比を使用したとき、トランスフェクションは最適である
ことを発見した(Crook、K. 他(1998)Gene Ther. 5:137−43)。コレステ
ロールを増加させると、血清の存在下にトランスフェクション効率が増加するこ
とを彼らのデータは示した。しかしながら、DOTAP:コレステロールのこの組合
わせを使用すると、ネズミ尿路上皮細胞系統MB49の非常にわずかのトランスフェ
クションが存在したが、COS−7細胞は効率よくトランスフェトされた。
テロールを細胞膜に付加することができる。メカニズムにより制限されることを
意図しないが、コレステロールの付加は細胞膜の流動性/剛性および透過性に影
響を与えるであろう。膜中のコレステロールレベルはエンドソーム中のGPIアン
カードタンパク質のソーティングに影響を与えることが示され、消耗はエンドソ
ームを介してこれらのタンパク質の再循環を増加した(Rodal、S. K. 他(199
9)Mol. Biol. Cell 10:961−74)。また、DOTAP/メチル−β−シクロデキ
ストリン/コレステロール(DMBC)複合体はコレステロールをDOTAP分子に付加
して、形成するDOTAP:DNA複合体の構造に影響を与えることができる。ベータ−
シクロデキストリンは腸細胞によるアデノウイルスの内在化を改良することが示
された(Croyle、M. A. 他(1998)Pharm. Res. 15:1348−1355)。改良さ
れた吸収は細胞膜を崩壊するシクロデキストリンの能力に帰属される。その研究
において使用されたシクロデキストリンのいずれもコレステロールを担持してい
なかった。メチル−β−シクロデキストリンそれ自体のみをDOTAPおよびDNAと組
み合わせて使用するとき、ネズミ膀胱上皮細胞のトランスフェクションは存在せ
ず、本発明により提供されるトランスフェクション効率の増加のためにシクロデ
キストリンの中にパッケージされたコレステロールが重要であることが示された
。
される遺伝子デリバリーのメカニズムを解析し、首尾よい遺伝子転移のための制
限因子として、細胞質から核へのプラスミドDNAの運動を同定した(Zabner、J.
他(1995)J. Biol. Chem. 270:18997−9007)。本発明において、コレス
テロールの添加はトランスフェクション効率を増強したが、細胞によるプラスミ
ドDNAの吸収に対して作用をほとんどもたないことが見出された。しかしながら
、DMBCを使用すると、プラスミドDNAは核の中に見出されることが発見され(実
施例4参照)、DMBCの添加はエンドソームからのDNAの逃散においてある役割を演
ずることができ、多分リソソーム中の分解を回避する。
はトランスフェクション事象後1月まで観測することができる。これはin vivo
における尿路上皮細胞のより遅い代謝回転に関係づけることができる。なぜなら
、複数の細胞複製後に遺伝子発現はin vitroにおいて低下したからである。Mor
ris、B. D. 他(J. Urol.(1994)152:506−509)は、アデノウイルスを使
用して膀胱をトランスフェクトし、遺伝子発現は少なくとも7日間明らかである
ことが示された。Harimoto他(Br. J. Urol.(1998)81:870−874)は、遺伝
子発現がHVJ−リポソームを使用して10日まで観測され、単一パーティクルガン
衝撃で2週まで観測されることを示した。こうして本発明のDMBCトランスフェク
ション系は、それほどでないにしても、in vivo膀胱トランスフェクションの現
在好ましい技術よりも耐久性がある。
されなかった(実施例5参照)。MBCそれ自体は24時間後に細胞増殖の減少を引き
起こさなかったが、DOTAPは減少させた。しかしながら、これは統計的に有意で
なかった。延長した暴露の抗増殖作用は、治療用遺伝子が仲介する腫瘍細胞の殺
しを増強する働きをするので、好都合であることがある。研究において、メチル
−β−シクロデキストリンそれ自体を使用したとき、それは無胸腺ヌードマウス
におけるヒト腫瘍異種移植片に対して抗腫瘍作用を有することが示された(Gros
se、P. Y. 他(1998)Br. J. Cancer 78:1165−9)。この作用は細胞から
のコレステロールの流出に関係するように思われる。
体に対するウロセリウムの暴露を最大にしかつ効率よいトランスフェクションを
保証する(実施例7参照)。リポーター遺伝子(β−ガラクトシダーゼ)の発現
は膀胱に制限された。Morris,B. D. 他(J. Urol.(1994)152:506−509)
は、アデノウイルスを使用して膀胱をトランスフェクトし、この制限が多分膀胱
の構築の結果であり、使用したデリバリー系のためでないことを示す、同様な観
測を行った。
遺伝子をin vivo送達するとき有効であることが示された(実施例9参照)。
チドを細胞の中にトランスフェクトする方法に関する。実施例においてさらに記
載するように、可溶化コレステロールを使用すると、カチオン脂質、カチオンポ
リマーおよびデンドリマーのような因子で複合化されたポリヌクレオチドのトラ
ンスフェクション効率が増強される。したがって、1つの面において、本発明は
、工程: (i)少なくとも1つのポリヌクレオチド; (ii)カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの
組合わせ;および (iii)可溶化コレステロール調製物; を組合わせてトランスフェクション組成物を形成し;そして トランスフェクション組成物を細胞に適用し、こうして細胞をポリヌクレオチ
ドでトランスフェクトする; を含んでなる、ポリヌクレオチドを細胞の中にトランスフェクトする方法を提供
する。
くはメチル−β−シクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含ん
でなる。他の適当なシクロデキストリンは上に列挙したものを包含する。好まし
いカチオン脂質はDOTAPである。好ましいデンドリマーはスーパーフェクトであ
る。他の適当なカチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーは上に列挙
したものを包含する。カチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーは商
業的に入手可能な源から入手することができる。トランスフェクション組成物は
、試薬(ii)の1つのタイプ、すなわち、カチオン脂質、カチオンポリマーまた
はデンドリマーを包含することができるか、あるいは、選択的に、試薬(ii)は
組合わせ、例えば、カチオン脂質およびカチオンポリマーの両方、またはカチオ
ン脂質の2つの異なるタイプ、またはカチオンポリマーの2つの異なるタイプの組
合わせであることができる。試薬(i)、(ii)および(iii)を組合わせるとき
、好ましくは1またはそれ以上のポリヌクレオチドの添加の直前に可溶化コレス
テロール調製物をカチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーと混合し
、次いでこの混合物を室温においてある時間、例えば、15分間インキュベートし
て、トランスフェクション組成物を形成する。
トすべき細胞のタイプに依存して変化させることができる。しかしながら、最適
なトランスフェクション条件は標準法により、例えば、実施例に記載するトラン
スフェクション系を使用して決定することができる。例えば、カチオン脂質(ま
たはカチオンポリマーまたはデンドリマー)/可溶化コレステロールの最適比は
異なる細胞タイプについて異なることがあるが、1:2(DOTAP:MBC)の比はin
vitroにおいて尿路上皮細胞について最適であることが見出された。カチオン脂
質(またはカチオンポリマーまたはデンドリマー)/可溶化コレステロールの比
の非限定的範囲は2:1〜1:3(重量/重量)である。可溶化コレステロール調製
物(例えば、メチル−β−シクロデキストリン/コレステロール、またはMBC)
を調製するとき、コレステロール/シクロデキストリンの好ましい比率は50mgの
コレステロール/600gのシクロデキストリン(メチル−β−シクロデキストリン
)(すなわち、1:12重量/重量のコレステロール:シクロデキストリン)であ
るが、再びこの比率は使用する特定の試薬および関係する条件に依存して最適化
することができる。コレステロール/シクロデキストリンの比の非限定的範囲は
1:1〜1:20である。また、ポリヌクレオチドの使用量は、使用する試薬および
トランスフェクトすべき宿主細胞に依存して変化させることができる。ポリヌク
レオチド(例えば、DNA)の使用量の非限定的範囲は0.1〜100μg、より好ましく
は1〜50μgである。カチオン脂質の使用量の非限定的範囲は1〜200μg、好まし
くは10〜50μgである。デンドリマー(例えば、スーパーフェクト)の使用量の
非限定的範囲は1〜300μg、好ましくは5〜25μgである。in vivo適用のために
、各試薬の量は前述の好ましい量から増加させることが必要であろう。
NA+20μgのDOTAP+40μgのメチル−β−シクロデキストリン可溶化コレステロ
ール。スーパーフェクトを使用するとき、好ましい量の非限定的例は次の通りで
ある:2μgのDNA+22.5μgのスーパーフェクト+10μgのメチル−β−シクロデ
キストリン可溶化コレステロール。
、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA、染色体フラグメント、アンチセンスオ
リゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA
分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせをトランスフェクトすることが
できる。遺伝子治療の目的で、1またはそれ以上のポリヌクレオチドは典型的に
は療法的利益を提供するためのタンパク質をコードする発現ベクター(下記にお
いてさらに詳細に説明する)である。真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞を
トランスフェクトするために、トランスフェクション法を使用する。トランスフ
ェクション法は、多数の他のタイプのトランスフェクション法に対して耐性に止
まる、尿路上皮細胞をトランスフェクトするとき特に有効である。トランスフェ
クション法は、in vitroにおいて、例えば、トランスフェクション組成物を培
養中の細胞に適用することによって、実施することができる。トランスフェクシ
ョン組成物を培養中の細胞と接触させる時間は、標準法により最適化することが
できる。in vitroトランスフェクション時間の非限定的例は48時間であり、次
いで細胞を洗浄(例えば、リン酸塩緩衝液で)する。選択的に、トランスフェク
ション法はin vivoにおいて、例えば、トランスフェクション組成物を細胞にin
vivo適用することによって実施することができる。好ましい態様において、ト
ランスフェクション組成物を被検体の膀胱への膀胱内デリバリー(例えば、カテ
ーテルを介して)によりin vivoにおいて尿路上皮細胞に適用する。in vivoト
ランスフェクションのための他のターゲット組織は、例えば、胃、筋肉、肺、上
皮細胞、結腸、子宮、腸、心臓、腎臓、前立腺、皮膚、眼、脳、陰茎組織および
鼻組織を包含する。
コレステロールの能力に基づいて、製剤を膀胱の尿路上皮細胞の中に送達する方
法を提供する。したがって、本発明は、工程: 製剤を可溶化コレステロール調製物と組合わせて医薬組成物を形成し;そして 医薬組成物を膀胱内的に被検体の膀胱の中に送出して、製剤を被検体の尿路上
皮細胞の中に送出す; を含んでなる、被検体の尿路上皮細胞の中に製剤を送出す方法を提供する。
くはメチル−β−シクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含ん
でなる。他の適当なシクロデキストリンは上に列挙したものを包含する。製剤は
、例えば、少なくとも1つのポリヌクレオチドと、カチオン脂質、カチオンポリ
マーまたはデンドリマーとであることができる。選択的に、製剤は、例えば、化
学療法剤、抗生物質、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子
、抗血管形成因子、抗転移因子、膜レセプターまたは療法的活性を有する他の因
子であることができる。製剤がポリヌクレオチドであるとき、好ましいカチオン
脂質はDOTAPであるが、好ましいデンドリマーはスーパーフェクトである。他の
適当なカチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーは上に列挙したもの
を包含する。
製剤は膀胱癌細胞に対する抗癌活性を有し;そして 医薬組成物を膀胱内的に被検体の膀胱の中に送出して、被検体の膀胱癌細胞を
製剤で治療する; を含んでなる、被検体における膀胱癌を治療する方法を提供する。
くはメチル−β−シクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含ん
でなる。他の適当なシクロデキストリンは上に列挙したものを包含する。製剤は
、例えば、少なくとも1つのポリヌクレオチドと、カチオン脂質、カチオンポリ
マーまたはデンドリマーとであることができる。好ましくは、製剤は治療的に有
効な量で送出される。製剤が1またはそれ以上のポリヌクレオチドであるとき、
好ましいカチオン脂質はDOTAPであるが、好ましいデンドリマーはスーパーフェ
クトである。他の適当なカチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーは
上に列挙したものを包含する。
以上のタンパク質をコードする少なくとも1つの発現ベクターを含んでなること
が好ましい。発現ベクターはトランスフェクトすべき細胞中のポリヌクレオチド
発現に適当な形態のポリヌクレオチドを含んでなり、これは組換え発現ベクター
が1またはそれ以上の調節配列を含み、これらの調節配列が通常トランスフェク
トすべき細胞のタイプに基づいて選択され、発現すべきポリヌクレオチドに作用
可能に連鎖されていることを意味する。組換え発現ベクター内において、「作用
可能に連鎖された」はポリヌクレオチド発現(例えば、ベクターが宿主細胞の中
に導入されるとき、宿主細胞中の転写/翻訳)を可能とする方法で問題のポリヌ
クレオチドが1またはそれ以上の調節配列連鎖されていることを意味することを
意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現コ
ントロール因子(例えば、ポリアデニル化シグナル)を包含することを意図する
。このような調節配列はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、
下記の文献に記載されている:Goeddel;Gene Expression Technology:Metho
ds in Enzymology 185、Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ(
1990)。調節配列は、多数のタイプの宿主細胞中のポリヌクレオチドの連続的発
現を指令する配列およびある種の宿主細胞中のポリヌクレオチド発現のみを指令
する配列(例えば、組織特異的調節配列)を包含する。当業者は理解されるよう
に、発現ベクターの設計は、因子、例えば、形質転換すべき宿主細胞の選択、所
望のタンパク質の発現レベル、およびその他に依存するであろう。
329:840)およびpMT2PC(Kaufman 他(1987)EMBO J. 6:187−195)。哺
乳動物細胞において使用するとき、発現ベクターのコントロール機能はしばしば
ウイルス調節因子により提供される。例えば、普通に使用されているプロモータ
ーは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウ
イルス40に由来される。選択的に、特定細胞タイプにおいてポリヌクレオチド発
現を優先的に指令することができる哺乳動物発現ベクター(すなわち、組織特異
的調節因子を含んでなる発現ベクター)を使用することができ、そしてこの分野
においてよく知られている。
パク質の例は、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、抗血
管形成因子、抗転移因子、膜レセプターおよび腫瘍抑制因子である。好ましいタ
ンパク質は、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−2(IL−2)、
インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−9(IL−9)、インターロイ
キン−11(IL−11)、インターロイキン−12(IL−12)、インターロイキン−13
(IL−13)、インターロイキン−18(IL−18)、インターフェロン−α、インタ
ーフェロン−β、インターフェロン−γ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激
因子(GMCSF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、マクロファージコロニー刺
激因子(MCSF)、熱ショックタンパク質(HSP)、p53、抗血管形成因子、例えば
、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のアンタゴニスト、アンチセンス分子、抗転移
因子、例えば、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)、およびBCG
活性を増加する因子、例えば、フィブロネクチンレセプター、インターロイキン
、インターフェロン、コロニー刺激因子および腫瘍サプレッサーを包含する。発
現すべき好ましいタンパク質は、IL−2、GMCSFおよびインターフェロン−γ、お
よびそれらの組合わせ(例えば、IL−2、GMCSFおよびインターフェロン−γの少
なくとも2つ)を包含する。
ターロイキン、コロニー刺激因子、または療法的活性を有する他の因子であるこ
とができる。
と組合わせることができる。好ましい追加の治療法はBCG治療である。追加の癌
治療の他の例は、化学療法および放射線治療を包含する。
本発明のトランスフェクション組成物は、 (i)ポリヌクレオチド; (ii)カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの
組合わせ;および (iii)可溶化コレステロール調製物; を含んでなる。
くはメチル−β−シクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含ん
でなる。他の適当なシクロデキストリンは上に列挙したものを包含する。好まし
いカチオン脂質はDOTAPであるが、好ましいデンドリマーはスーパーフェクトで
ある。他の適当なカチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーは上に列
挙したものを包含する。本発明のトランスフェクション組成物は、包装処方物、
例えば、各成分試薬が容器手段の中に提供される包装処方物として提供すること
ができる。さらに、包装処方物は、細胞をトランスフェクトするためにトランス
フェクション組成物を使用するための使用説明書を含むことができる。
釈すべきではない。
ルト)から入手した。マウストランジション細胞癌腫細胞系統は、アイオワ大学
のTimothy Ratliff博士から入手した。エンドフリー・プラスミド・クイアゲン
(Endofree plasmid Qiagen)キット(Qiagen GmbH、ドイツ国)を使用して
、プラスミドDNAを調製した。フジーン(Fugene)はロシェ・ダイアグノスティ
クス(Roche Diagnostics、ドイツ国マンハイム)から購入し、スーパーフェク
ト(Superfect)はクイアゲン(Qiagen GmbH、ドイツ国)から購入し、DEAEデ
キストランはプロメガ(Promega、アメリカ合衆国マディソン)から購入し、そ
してリン酸カルシウムはメルク(Merck、ドイツ国フランクフルト)から購入し
た。 DMBCトランスフェクション効率についてのin vitroアッセイ 6ウェルの組織培養プレート中において10%のPBS(Biosciences、オーストラ
リア国)、2mMのL−グルタミン、50U/mlのペニシリンおよび0.05mg/mlのスト
レプトマイシン(Sigma Chemical Co.、アメリカ合衆国ミゾリー州セントルイ
ス)を補充したRPMI 1640中でオーバースリップ上に2×105細胞をプレートした
。細胞を1×PBSで2回洗浄し、20μgのDOTAP(Roche Diagnostics、ドイツ国マ
ンハイム)および40μgのメチル−β−シクロデキストリン可溶化コレステロー
ル(Sigma)で複合化したpCMVlacZの7.5μgでトランスフェクトした。DNAおよび
DMBCを20mMのHepes緩衝液(Gibco BRL、アメリカ合衆国マリイランド州ロック
ビレ)で165μlに構成し、15分間混合することによって、複合体を形成した。こ
れをRPMI 1640培地で1mlとし、ウェルに適当な時間の間添加し、次いで洗浄し
、3mlのRPMI 1640培地で置換した。48時間後、下記の文献に記載されているよ
うに、細胞をPBSで洗浄し、固定し、染色した:Weiss、D. J. 他(1997)Hum.
Gene Ther. 8:1545−54。100×の倍率で4回の四分円中の細胞の総数に関して
、青色コロニーの平均数を使用して、トランスフェクション効率を決定した。ト
ランスフェクションを二重反復実験により実行し、2回反復した。 増殖アッセイ [14C]−チミジンの組込みを測定することによって、増殖をアッセイした。9
6ウェルの平底組織培養プレート(Nunc、デンマーク国ロスクライド)中で1×10 4 細胞/ウェルをプレートし、前述の最適条件下に適当な時間の間(2時間および
24時間の暴露)トランスフェクトし、洗浄し、新鮮なRPMI 1640と37℃において
インキュベートした。32時間後、上清を除去し、細胞を1×PBSでリンスした。ト
リプリケートウェルを0.2μCi/mlの[14C]−チミジン(比活性56.5mCi/mmol
;Du Pont、アメリカ合衆国デラウェア州ウィルミントン)と16時間インキュベ
ートした。試料を下記の文献に記載されているように収集した:Zhang、Y. 他
(1997)Int. J. Cancer 71:851−7。[14C]−チミジンの組込みを非トラ
ンスフェクション細胞から成る対照細胞中の組込みの百分率として表した。非パ
ラメトリックマン−ウィトネイ(non−parametric Mann−Whitney)U試験を使
用して、統計的有意性を計算した。p<0.05の確率値を統計的に有意であると考
えた。 DNA−DMBCの膀胱内デリバリー後のリポーター遺伝子のin vivo発現の検出 5〜7週齢の雌C57BL6マウスを麻酔した;マウスの膀胱に24G血管内カテーテル
を挿入し、1×PBSでフラッシュした。DMBCおよびDNA複合体を前述したように15
分間混合した。点滴注入が容易であるように最終混合物を1×PBSで465μlに構成
し、膀胱内に導入した。15分、1時間または2時間のトランスフェクション暴露時
間を評価した。異なる時点後、膀胱を1×PBSでフラッシュしてDNA/DMBC複合体
を除去した。処置後48時間に、マウスを殺した。二重反復実験を実施した。 組織化学 膀胱、肺、腎臓、心臓、肝臓および脾臓を取出し、液体窒素中で凍結させた(
Werthman、P. E. 他(1996)J. Urol. 55:53−6)。厚さ6μmのクリオスタ
ット切片を4℃において1.25%のグルタルアルデヒド中で10分間固定し、次いで3
7℃においてX−galと4時間インキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色した。 器官に対するPCRの実行 トランスフェクトしたプラスミドの存在を検出するために、lacZ遺伝子に対し
てユニークなPCRプライマーを使用した。使用した上流プライマーは5'−GCCGACC
GCACGCCGCATCCAGC−3'(配列番号1)であり、そして下流調製は5'−CGCCGCGCCAC
TGGTGT−3'(配列番号2)であった。100ngのゲノムDNA、2μl(2.5Mm)のdNTP(
New England Biolabs、アメリカ合衆国ベバーリイ)、2.5μl(10×)の反応
緩衝液、1μlの各プライマー(10μM)および1μl(2U)のTaqポリメラーゼ(Fi
nnzymes、フィンランド)を含有する総体積25μl中でPCRを実施した。PCRプログ
ラムは次の通りであった:94℃において40秒間、次いで60℃において30秒間およ
び72℃において30秒間の40サイクル。GADPHをPCR分析の対照として使用した。GA
DPHのプライマー配列は上流プライマー5'−CTGCGACTTCAACAG−3'(配列番号3)
および下流プライマー5'−CACCCTGTTGCTGTAG−3'(配列番号4)であった。PCRプ
ログラムは次の通りであった:94℃において30秒間、58℃において30秒間および
72℃において30秒間の40サイクル。増幅されたDNAを1%アガロースゲル上の電気
泳動により分析し、紫外線下に臭化エチジウムで可視化した。イメージマスター
VDSソフトウェアを使用してデンシトメトリー走査を実施し、分析用イメージン
グシステムソフトウェア(Imaging Research Inc.、カナダ国オンタリオ)を
使用してバンドを分析した。 トランスフェクションのONPGアッセイ トランスフェトした細胞を1×PBSで2回洗浄し、次いで150μlの溶解緩衝液で
溶解した。標準としてウシ血清アルブミンを使用するマイクロBCAタンパク質ア
ッセイ(Pierce、アメリカ合衆国イリノイ州ロックフォード)により、ライゼイ
トのタンパク質含量を測定した。4mg/mlのONPGを含有する反応混合物中で、ゲ
ルタンパク質ライゼイトをアッセイし、37℃において1時間インキュベートした
。500μlの1M Na2CO3の添加により、反応を停止させ、420nmにおける吸収を測
定した。 PCRによる核および細胞質の分析 TNE緩衝液(10mM Tris、pH(pH8)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Igepecal
)を使用するおだやかな溶解により、トランスフェクトした細胞の核および細胞
質の分画を実施し、氷上に10分間放置し、次いで4℃においてマイクロフージ中
で7Kで5分間遠心した。そのように形成した上清を細胞質抽出物と標識し、新鮮
な管に移した。ペレット化した物質をプロテイナーゼK消化(100mM NaCl、10mM
Tris、pH8、0.5%SDS、25mM EDTAおよび0.1mg/ml プロテイナーゼK)で50
℃において一夜処理することによって、核抽出物を調製した。核DNAをフェノー
ル/クロロホルムで2回抽出し、次いでエタノール沈殿させた。前述したように
、PCR分析を実施した。 細胞系統およびサイトカイン遺伝子 ネズミトランジション細胞癌腫細胞系統MB49およびサイトカイン遺伝子は、ア
イオワ大学のTimothy Ratliff博士から提供された。サイトカイン遺伝子をpCI
−neo発現ベクター(Promega)の中にクローニングした。エンドフリープラスミ
ドクイアゲン(Endofree plasmid Qiagen)キット(Qiagen GmbH、ドイツ国
)を使用して、プラスミドDNAを調製した。 動物 シンガポールのナショナル大学の実験動物センター(The Laboratory Cente
r of the National University of Singapore)から大学の動物保持ユニ
ット(Animal Holding Unit)において、C57/BL6雌マウス(ほぼ4〜6週齢)
入手した。 表面マーカーのin vitro発現 6ウェルの組織培養プレートの中において10%FIBS(Biosciences、オーストラ
リア国)、2mMのL−グルタミン、50U/mlのペニシリンおよび0.05mg/mlのスト
レプトマイシン(Sigma Chemical Co.、アメリカ合衆国ミゾリー州セントルイ
ス)を補充したRPMI 1640中に2×105細胞をプレートした。細胞を1×PBSで2回
洗浄し、3.75μgの単一サイトカイン遺伝子および3.75μgの各サイトカイン遺伝
子(20μgのDOTAP(Roche Diagnostics、ドイツ国マンハイム)および40μgの
メチル−β−シクロデキストリン可溶化コレステロール(Sigma)で複合化した
、IL−2+GMCSF組合わせについての)でトランスフェクトした。DNAおよびDMBC
を20mMのHepes緩衝液(Gibco BRL、アメリカ合衆国マリイランド州ロックビレ
)で165μlに構成し、15分間混合することによって、複合体を形成した。これを
RPMI 1640培地で1mlとし、ウェルに適当な時間の間添加し、次いで洗浄し、3ml
のRPMI 1640培地で置換した。48時間後、細胞をPBSで洗浄し、固定し、抗MHC
I、抗MHC IIおよび抗FAS抗体で標識化した。使用した二次抗体はフルオレセイ
ンイソチオシアネート(FITC;Pharmingen、アメリカ合衆国カリフォルニア州)
であった。また、アイソタイプ対照の抗体を含めた。二重レーザー流サイトメー
ター(Couletr Epics Elite、アメリカ合衆国フロリダ州)により、標識化細
胞を分析した。 異なるサイトカイン処置の抗腫瘍作用 0.1mlのPBS中の5×105生存可能なMB49細胞を有する単細胞懸濁液を、処置7〜1
0日前に、側腹部に皮下注射した。ほぼ0.15〜0.25cm3の均一な腫瘍可溶化を有す
るマウスのみを選択し、腫瘍内処置のためにグループにランダム化した。腫瘍内
注射により、処置を週2回3週間実施し、そして100μlの1×PBS、DMBC(Dotap+
メチル化−β−シクロデキストリンを含有するコレステロール)、IL−2+DMBC
、GMCSF+DMBC、IFNγ+DMBC、またはIL−2+DMBC+GMCSFの組合わせから成って
いた。週齢が合致する腫瘍実験に使用されてない対照には処置を与えなかった。
注射前から第38日まで3日前毎に、腫瘍サイズをキャリパーで測定した。腫瘍体
積を下記式により計算した:長さ×幅×高さ 単細胞懸濁液およびフローサイトメトリー 脾臓を記載したように収集した。フィコエリトリン(PE)に複合化した抗CD4
、αβ、γδ、NKおよび抗CD−8で単細胞懸濁液を標識化し、そしてフルオレセ
インイソチオシアネート(FITC)に複合化した抗体でCD3+細胞を標識化した。
すべての抗体をファーミンゲン(Pharmingen、アメリカ合衆国カリフォルニア州
)から購入した。標識化した細胞を二重レーザーフローサイトメーターで分析し
た。 mRNA抽出およびRT−PCR 全RNA抽出のために、脾臓を製造業者の使用説明書に従い1mlのトリゾル(Triz
ol)試薬(Gibco BRL、アメリカ合衆国マリイランド州ロックビレ)中の均質化
した。 実施例 実施例1: 非ウイルス剤のin vitroトランスフェクション効率 pCMVlacZ発現プラスミドを使用して、MB49細胞について、2時間の期間におい
て、種々の非ウイルス剤のトランスフェクション効率を評価した。DOTAPおよび
スーパーフェクトの両方は、それぞれほぼ20.4%および14.8%の効率で2時間以
内にMB49細胞をトランスフェクトすることができた(下記表1参照)。
けるトランスフェクションを最大にした。X−galで青色に染色された細胞の百分
率を計数することによって、トランスフェクション効率を測定した。7.5μgのDN
Aおよび20μgのDOTAPを使用して、最適なトランスフェクションを得た。スーパ
ーフェクトを使用すると、DOTAPと同様なトランスフェクション率を得るために
、非常に少ない量のDNAを必要とした、すなわち、2μgのDNA+7.5μgのスーパー
フェクト。フジーン(Fugene)で非常にで低い1.02%のトランスフェクション率
を得られた。塩化カルシウム(0〜40μg)、DEAE−デキストラン(0〜2μg)お
よび裸DNAのいずれもMB49細胞をトランスフェクトすることができなかった。
、この混合物を室温において15分間インキュベートした。MBCを添加すると、第1
A図〜第1C図に示すように首尾よくトランスフェクトされる細胞の数は増加した
。トランスフェクション効率の増加は、MBCをDOTAPと組み合わせて使用したとき
、3.9倍であり、そしてスーパーフェクトと組み合わせて使用したとき、2.4倍で
あった(第1D図)。しかしながら、トランスフェクション効率のこの増加を発生
させるために必要なMBCの量は、使用する非ウイルス剤とともに変化した。最適
なDOTAPトランスフェクションは40μgのMBCで得られたが、スーパーフェクトに
ついて10μgは最適であった。最良のトランスフェクション率はDOTAP+MBC(DMB
C)を使用して得られたので、この組合わせをすべてのそれ以上の実験において
使用した。また、DMBCおよび慣用のDOTAP:コレステロール(1:1)混合物(AVD
C)のトランスフェクション効率を比較した。AVDCはCos−7細胞をトランスフェ
クトすることができが、MB49細胞を非常によくトランスフェクトしなかった。対
照的に、DMBCはMB49細胞をトランスフェクトし、ならびにAVDCに比較したときCo
s−7のトランスフェクションを増強した(第1E図)。 実施例2: β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の期間 DMBCを使用するトランスフェクション後の時間の関数としてβ−ガラクトシダ
ーゼ(β−gal)遺伝子発現の特性決定を実施した。第2A図に示すように、ONPG
アッセイにより測定して、タンパク質発現は因子の除去の1時間以内に起こり、
トランスフェクション後48時間まで増加した。48時間後、タンパク質発現は一定
に減少し、トランスフェクション後12日では、β−gal活性は第2日における発現
に比較して7分の1に減少した(第2B図)。細胞が複製するとき、遺伝子は失われ
および/またはサイレンスとなるように思われる。 実施例3: トランスフェクション後のDNA吸収 DOTAPおよびDMBCを使用するとき、DNA吸収の差が存在するかどうかを決定する
ために、細胞から抽出したプラスミドDNAの量をトランスフェクションして2時間
後に測定した。表面結合DNAの量を最小にし、かつ真のDNA吸収の推定をよりよく
するために、1×PBSで複数回洗浄し、DNアーゼで消化した。MB49細胞から抽出し
たDNAのPCR分析を第3A図および第3B図に示す。MB49細胞は両方の因子で同様な量
のプラスミドDNAを内在化したように思われる。したがって、トランスフェクシ
ョン効率において観測された差はプラスミドDNAの吸収が異なるためでなく、多
分いったん細胞の中に取り込まれたDNAの安定性のためである。 実施例4: プラスミドDNAの核および細胞質中の蓄積 DOTAPおよびDMBCを使用するトランスフェクション後のDNAの局在化を決定する
ために、核および細胞質の抽出物をトランスフェクトした細胞から調製した。こ
れらの抽出物中のDNAの存在はDMBCでトランスフェクトした細胞において、lacZ
遺伝子は核および細胞質の両方の画分の中に局在化された。しかしながら、DOTA
P単独では、プラスミドDNAは細胞質の中にのみ見出された(第4A図および第4B図
)。GADPH遺伝子を使用して、核抽出物中の核DNAの存在および核DNAによる細胞
質画分の汚染の欠如を確証した。 実施例5: DMBC/DNA複合体の毒性 細胞増殖アッセイを使用して、トランスフェクション因子の毒性を測定した。
プレート後48時間に、トランスフェクトした細胞および非トランスフェクション
細胞における増殖を測定することによって、比較毒性を測定した。細胞をトラン
スフェクション因子に2時間および24時間暴露した。DOTAP(D)またはDMBCに2時
間暴露したトランスフェクトした細胞および非トランスフェクション細胞間の14 C−チミジン組込みレベルの差は存在しなかった(第5A図)。DNAを含むか、ある
いは含まないDMBCにまたはDOTAPに細胞を24時間暴露したとき、細胞増殖能力の
減少があったが、これは統計的に有意でなかった(第5B図)。 実施例6: トランスフェクション因子およびDNAの膀胱内点滴注入によるネズミ
膀胱のトランスフェクション 膀胱内点滴注入を介してトランスフェクション因子であるDMBC/DNAを与えた
マウス(n=16)において、管腔に面する膀胱上皮細胞はすべてのマウスにおい
て首尾よくトランスフェクトされた(第6A図および第6B図)。in vivoDOTAP単
独は膀胱上皮細胞の効率よいトランスフェクションを生じなかった。膀胱と同様
に、肺、腎臓、脾臓、心臓および肝臓をトランスフェクトした動物および対照か
ら収集し、下記表2に要約するように、すべてはβ−galについて陰性に染色され
ることが見出され、トランスフェクションは膀胱に限定された。
ウスにおいて、脾臓を膀胱と同時に収集し、対照およびトランスフェクトした動
物におけるCD3+、CD4+、CD8+、αβおよびγδ T細胞のレベルをフローサイ
トメトリーにより測定した。対照グループおよび実験グループの間に差は存在し
なかった。
ウスをまたpCMVlacZおよびDMBCで膀胱内的に処置した。過形成の表在性管腔細胞
層はβ−galの染色を示した(第10A図〜第10B図)。
鏡検査により解析した。各因子を使用する2時間のトランスフェクション暴露は
、非トランスフェクション対照膀胱と比較したとき、管腔に面する細胞において
識別可能な構造的差を生じなかった。また、小胞中のカチオン脂質またはコレス
テロールの蓄積の指示は存在しなかった。一般に、膀胱上皮細胞は多数の小胞を
含有するが、処置後このような小胞の数が増加するように思われなかった。 実施例7: トランスフェクション因子に対する暴露時間に関するトランスフェ
クション効率 より短い暴露時間を使用するトランスフェクション効率を測定するために、ト
ランスフェクション複合体(pCMVlacZ:DMBC)を異なる時間の間細胞に適用し、
次いでトランスフェクション複合体を除去し、細胞を完全培地中で48時間培養し
た後、収集し、酵素的に分析した。β−gal活性はトランスフェクション時間が1
5分程度に短いときでさえ検出可能であり、そしてこの活性はトランスフェクシ
ョン因子に対する実験時間とともに増加する(第8A図)。15分の暴露と2時間の
暴露との間に4.8倍のトランスフェクション率の差が存在した。in vivoにおい
て、暴露時間をより長くすると、トランスフェクトされる管腔に面する上皮細胞
はより多くなった(第8B図)。 実施例8: in vivo遺伝子発現期間 マウスにおいて、トランスフェクション後14、21および30日にβ−gal発現を
モニターした。30日までに、発現は大きく減少したが、なお明瞭に検出可能であ
った(第9A図および第9B図)。このシグナルの耐久性は尿路上皮細胞のin vivo
代謝回転が低い結果であることがあり、この低い代謝回転はpCMVlacZ遺伝子の存
在時間をより長くするであろう。 実施例9: MB49細胞および腫瘍増殖に対するDOTAP+メチル−β−シクロデキス
トリン可溶化コレステロール(DMBC)の作用の特性決定 表面タンパク質マーカーのin vitro発現 MB49細胞をサイトカイン遺伝子の単独または組合わせでトランスフェクトした
。2日後、発現をフローサイトメトリーにより測定した。MHCクラスI、MHCクラス
II、FAS、ICAM I、ICAM II、B71およびB72を発現する細胞の比率の増加は、下
記表3において要約されているように、非トランスフェクション細胞と比較した
とき、サイトカイン遺伝子でトランスフェクトした細胞において見られた。
クション系の能力を試験した。下記のサイトカイン(IL−2、IFN−γ、GMCSFお
よびIL−2+GMCSF)をコードするDNAを含んでなるトランスフェクション組成物
を、腫瘍移植後7〜10日の腫瘍支持マウスの右側腹部に腫瘍内に注射した。第7日
にマウスの腫瘍体積を第11図のグラフに示す。サイトカイン遺伝子治療で処置さ
れたマウスは、未処置およびDMBC対照に比較して、より遅い腫瘍のグループを証
明した。第38日における腫瘍体積(第12図のグラフに示す)は、IFN−γ(p=0.
041)、GMCSF(p=0.0014)またはIL−2+GMCSF(p=0.004)でトランスフェク
トしたマウスについて有意により小さかった。IL−2で処置したマウスは、より
遅い腫瘍増殖のみを証明した。IFN−γ、GMCSFおよびIL−2+GMCSFで処置したす
べてのマウスの30%は治癒した。経時的腫瘍体積(第7〜37日)を第13図のグラ
フに要約する。未処置グループにおいて、1匹のマウスは局所的寛解を示したが
、体重を急速に喪失し、早期に死亡し、転移性疾患を示唆した。マウスにおける
治癒割合を下記表4に要約する。
発現を正常(腫瘍をもたない)マウスのサイトカイン発現と比較して、サイトカ
イン産生が影響を受けるかどうかを決定した。すべてのグループは、IL−2、IFN
−γ、TNF−αおよびGMCSFのmRNAを発現した。サイトカイン処置マウスは、未処
置、DMBCおよび正常(腫瘍をもたない)対照に比較して、サイトカインmRNA産生
の一般的増加を示した。GMCSFおよびIL−2+GMCSFで処置したマウスは、他のサ
イトカイン処置グループに比較して、大量のGMCSFを産生した。結果を下記表5に
要約する。
トメトリー分析は、未処置およびDMBC処置グループにおけるCD3、CD4+およびCD
8集団が、正常対照と比較したとき、減少することを示した。サイトカイン遺伝
子治療により処置された腫瘍支持マウスは、CD3、CD4+、CD8、NKおよびαβ集
団について、正常対照に類似するプロファイルを有した。結果を下記表6に要約
する。
するネズミ膀胱癌細胞のトランスフェクションはMHCクラスI、クラスIIおよびFa
s発現の増加を誘導する。この応答は癌細胞をいっそう免疫原性とする。腫瘍内
トランスフェクション実験から、IL−2、IFN−γ、GMCSFおよびIL−2+GMCSFが
腫瘍増殖に対して同様な阻害効果を有することが見出された。37日後、未処置グ
ループと比較したとき、IFN−γ、GMCSF、IL−2+GMCSFでトランスフェクトした
グループにおいて腫瘍サイズの有意差が存在することが見出された。このデータ
が証明するように、DMBCは尿路上皮細胞のin vitroおよびin vivoトランスフ
ェクションのために有効な因子である。マウスの腫瘍内研究において、非ウイル
スベクターを介するサイトカイン遺伝子デリバリーによる尿路上皮腫瘍細胞のト
ランスフェクションは腫瘍増殖を阻害できることが示された。
明したが、当業者にとって明らかなように、ある種の変化および変更が可能であ
る。したがって、説明および実施例は添付された特許請求の範囲により規定され
る本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
トランスフェクトした細胞の写真であり、pCMVlacZリポータープラスミドの発現
レベルを比較する。トランスフェクトしてない細胞(第1A図)はX−galで染色さ
れなかった。わずかの細胞はpCMVlacZ/DOTAPでトランスフェクトされ、これら
はX−galで陽性に染色された(第1B図)。pCMVlacZ/DMBCを使用するトランスフ
ェクションは、X−gal陽性細胞の数を増加させた(第1C図)。こうして、メチル
−β−シクロデキストリンを含有するコレステロール(MBC)をDOTAP(D)に添
加した後、トランスフェクション効率は増加した。
ある。DOTAP+メチル−β−シクロデキストリンを含有するコレステロール(DMB
C)またはスーパーフェクト+メチル−β−シクロデキストリンを含有するコレ
ステロール(SMBC)でトランスフェクトした細胞は、DOTAPまたはスーパーフェ
クト単独に比較して、β−gal活性について陽性に染色される細胞数の増加を示
した。MBCは裸DNAの吸収を増強しなかった。 第1E図は、DMBCおよび慣用DOTAP:コレステロール(AVDC)のトランスフェク
ション効率の比較を示す。非トランスフェクション細胞(CON)は、420nmにおけ
る光学密度により測定して、β−gal活性を示さなかった。AVDCはCOS−7細胞を
トランスフェクトすることができたが、MB49細胞を効率よくトランスフェクトし
なかった。対照的に、DMBCはMB49細胞をトランスフェクトし、COS−7細胞におい
てトランスフェクション効率を増強することができた。
gal活性はトランスフェクション後1時間程度に早く見られ、48時間まで絶えず増
加した(第2A図)。細胞を実施例の節に記載されているようにトランスフェクト
し、2、4、6、8および12日後、ONPGアッセイを使用してβ−gal活性についてア
ッセイした。β−gal発現は12日において非常に低かった(第2B図)。
内在化を証明する。LacZ遺伝子の存在を非トランスフェクション細胞およびトラ
ンスフェトした細胞についてPCRにより決定した(第3A図)。
に関するLacZ遺伝子の発現を決定した(第3B図)。
R増幅生成物を示す。LacZ遺伝子はDMBCでトランスフェクトした核(N)および細
胞質(CY)画分の両方の中に見出されたが、DOTAP(D)でトランスフェクトした
細胞については細胞質画分の中にのみ見出された。
分析を示す。
記の因子の抗増殖作用を、2時間(第5A図)および24時間(第5B図)の暴露後に
、未処理MB49細胞(CON)と比較した:DMBC/DNA、DOTAP(D)/DNA、DNA、DMBC
、DOTAP(D)およびMBC。トランスフェクトした細胞および非トランスフェクシ
ョン細胞における[14C]−チミジン組込みを比較することによって、相対的抗
増殖作用を48時間後に決定した。
ンを示す写真である。トランスフェクトした膀胱を12日後に収集し、β−ガラク
トシダーゼ活性について染色した。非トランスフェクション膀胱を陰性対照とし
て使用した(第6A図)。トランスフェクトした細胞において、管腔に面する上皮
細胞は陽性に染色された(第6B図)。(倍率40×)。
トランスフェクションマウスからの器官を対照組織についてCと標識する。pCMVL
acZ/DMBC複合体でトランスフェクトしたマウスから収集した器官をDMBCと標識
する。膀胱を除外するすべての器官におけるβ−ガラクトシダーゼの非存在をPC
Rにより確証した。
示す棒グラフである。細胞をDNA:DMBC複合体に対してin vitroにおいて15、30
、60および120分間暴露した。より長い暴露時間は、X−galで陽性に染色される
細胞の百分率により測定して、トランスフェクション効率を改良した。
露時間を示す写真である。膀胱をpCMVLacZ/DMBC複合体に対してi)15分間、ii) 30分間、iii) 60分間およびiv) 120分間暴露した(倍率40×)。より多くの尿
路上皮細胞がX−galで経時的に染色された。
真である。トランスフェクション後2日に、管腔に面する細胞の大部分はX−gal
で陽性に染色された(第9A図)。30日後、β−galの発現は減少した数の細胞に
おいてなお観測することができた(第9B図)(倍率100×)。
第10B図)を示す写真である。MB49腫瘍細胞を移植した膀胱をpCMVLacZ:DMBCで2
時間トランスフェクトした。過形成の表在性管腔細胞層において、青色染色が観
測された。(倍率100×)。
−γ)、またはDMBCで処置したマウスまたは未処置対照における第7日における
腫瘍体積を示すグラフである。
−γ)、またはDMBCで処置したマウスまたは未処置対照における第38日における
腫瘍体積を示すグラフである。
−γ)、またはDMBCで処置したマウスまたは未処置対照における経時的(第7〜3
7日)腫瘍体積を示すグラフである。
Claims (65)
- 【請求項1】 工程: (i)少なくとも1つのポリヌクレオチド; (ii)カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの
組合わせ;および (iii)可溶化コレステロール調製物; を組合わせてトランスフェクション組成物を形成し;そして トランスフェクション組成物を細胞に適用し、こうして細胞をポリヌクレオチ
ドでトランスフェクトする; を含んでなる、ポリヌクレオチドを細胞の中にトランスフェクトする方法。 - 【請求項2】 可溶化コレステロール調製物がシクロデキストリンで可溶化
されているコレステロールを含んでなる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリンであ
る、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 シクロデキストリンがアルファ−シクロデキストリン、ベー
タ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロ
デキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ
−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン
、2,6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベ
ータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル
−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シ
クロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキ
シメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデ
キストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−
シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシ
ル−ベータ−シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項2に記載の
方法。 - 【請求項5】 (ii)がDOTAPであるカチオン脂質である、請求項1に記載の
方法。 - 【請求項6】 (ii)がスーパーフェクト(Superfect)であるデンドリマ
ーであるカチオン脂質である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 (ii)がDOPE、DOTMA、DOGS、DODAB、DODAC、DOSPA、DC−Ch
ol、DOIC、DOPC、DMRIE、PAMAM、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン
、ポリエチレンイミン、ポリ(4−ビニルピリジン)、ポリ(ビニルアミン)、
ポリ(4−ビニル−N−アルキルピリジニウムハライド)、またはそれらの組合わ
せから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 ポリヌクレオチドがプラスミドDNAである、請求項1に記載の
方法。 - 【請求項9】 ポリヌクレオチドがウイルスDNA、染色体フラグメント、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせから成る群から選
択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】 細胞が真核細胞である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項11】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項12】 細胞が尿路上皮(urothelial)細胞である、請求項11に記
載の方法。 - 【請求項13】 トランスフェクション組成物を培養中の細胞に適用する、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項14】 トランスフェクション組成物をin vivoにおいて細胞に適
用する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】 トランスフェクション組成物を被検体の膀胱への膀胱内デ
リバリーによりin vivoにおいて尿路上皮細胞に適用する、請求項12に記載の方
法。 - 【請求項16】 ポリヌクレオチドをカチオン脂質、カチオンポリマーまた
はデンドリマーと複合化し、細胞に適用する、細胞の中にポリヌクレオチドをト
ランスフェクトする方法において、ポリヌクレオチドおよびカチオン脂質、カチ
オンポリマーまたはデンドリマーを可溶化コレステロール調製物で処方すること
を含んでなる改良。 - 【請求項17】 可溶化コレステロール調製物がシクロデキストリンで可溶
化されているコレステロールを含んでなる、請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリンで
ある、請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 シクロデキストリンがアルファ−シクロデキストリン、ベ
ータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シク
ロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベー
タ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリ
ン、2,6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−
ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−S−ベータ−D−ガラクトピラノシ
ル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−
シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボ
キシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロ
デキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ
−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルト
シル−ベータ−シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項17に記載
の方法。 - 【請求項20】 カチオン脂質がDOTAPである、請求項16に記載の方法。
- 【請求項21】 デンドリマーがスーパーフェクトである、請求項16に記載
の方法。 - 【請求項22】 カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーがDO
PE、DOTMA、DOGS、DODAB、DODAC、DOSPA、DC−Chol、DOIC、DOPC、DMRIE、PAMAM
、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ(
4−ビニルピリジン)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(4−ビニル−N−アルキル
ピリジニウムハライド)、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、
請求項16に記載の方法。 - 【請求項23】 ポリヌクレオチドがプラスミドDNAである、請求項16に記
載の方法。 - 【請求項24】 ポリヌクレオチドがウイルスDNA、染色体フラグメント、
アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌク
レオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせから成る群から
選択される、請求項16に記載の方法。 - 【請求項25】 細胞が真核細胞である、請求項16に記載の方法。
- 【請求項26】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項25に記載の方法。
- 【請求項27】 細胞が尿路上皮細胞である、請求項26に記載の方法。
- 【請求項28】 トランスフェクション組成物を培養中の細胞に適用する、
請求項16に記載の方法。 - 【請求項29】 トランスフェクション組成物をin vivoにおいて細胞に適
用する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項30】 トランスフェクション組成物を被検体の膀胱への膀胱内デ
リバリーによりin vivoにおいて尿路上皮細胞に適用する、請求項27に記載の方
法。 - 【請求項31】 工程: 製剤を可溶化コレステロール調製物と組合わせて医薬組成物を形成し;そして 医薬組成物を膀胱内的に被検体の膀胱の中に送出して、製剤を被検体の尿路上
皮細胞の中に送出す; を含んでなる、被検体の尿路上皮細胞の中に製剤を送出す方法。 - 【請求項32】 可溶化コレステロール調製物がシクロデキストリンで可溶
化されているコレステロールを含んでなる、請求項31に記載の方法。 - 【請求項33】 シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリンで
ある、請求項32に記載の方法。 - 【請求項34】 シクロデキストリンがアルファ−シクロデキストリン、ベ
ータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シク
ロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベー
タ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリ
ン、2,6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−
ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−S−ベータ−D−ガラクトピラノシ
ル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−
シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボ
キシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロ
デキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ
−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルト
シル−ベータ−シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項32に記載
の方法。 - 【請求項35】 製剤が(i)少なくとも1つのポリヌクレオチドおよび(ii
)カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わ
せを含んでなる、請求項31に記載の方法。 - 【請求項36】 (ii)がDOTAPであるカチオン脂質である、請求項35に記
載の方法。 - 【請求項37】 (ii)がスーパーフェクトであるデンドリマーであるカチ
オン脂質である、請求項35に記載の方法。 - 【請求項38】 カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーがDO
PE、DOTMA、DOGS、DODAB、DODAC、DOSPA、DC−Chol、DOIC、DOPC、DMRIE、PAMAM
、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ(
4−ビニルピリジン)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(4−ビニル−N−アルキル
ピリジニウムハライド)、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、
請求項35に記載の方法。 - 【請求項39】 ポリヌクレオチドがプラスミドDNAである、請求項35に記
載の方法。 - 【請求項40】 ポリヌクレオチドがウイルスDNA、染色体フラグメント、
アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌク
レオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせから成る群から
選択される、請求項35に記載の方法。 - 【請求項41】 工程: 製剤を可溶化コレステロール調製物と組合わせて医薬組成物を形成し、ここで
製剤は膀胱癌細胞に対する抗癌活性を有し;そして 医薬組成物を膀胱内的に被検体の膀胱の中に送出して、被検体の膀胱癌細胞を
製剤で治療する; を含んでなる、被検体における膀胱癌を治療する方法。 - 【請求項42】 可溶化コレステロール調製物がシクロデキストリンで可溶
化されているコレステロールを含んでなる、請求項41に記載の方法。 - 【請求項43】 シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリンで
ある、請求項42に記載の方法。 - 【請求項44】 シクロデキストリンがアルファ−シクロデキストリン、ベ
ータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シク
ロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベー
タ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリ
ン、2,6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−
ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−S−ベータ−D−ガラクトピラノシ
ル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−
シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボ
キシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロ
デキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ
−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルト
シル−ベータ−シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項42に記載
の方法。 - 【請求項45】 製剤が(i)少なくとも1つのポリヌクレオチドおよび(ii
)カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わ
せを含んでなる、請求項41に記載の方法。 - 【請求項46】 (ii)がDOTAPであるカチオン脂質である、請求項45に記
載の方法。 - 【請求項47】 (ii)がスーパーフェクトであるデンドリマーであるカチ
オン脂質である、請求項45に記載の方法。 - 【請求項48】 カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーがDO
PE、DOTMA、DOGS、DODAB、DODAC、DOSPA、DC−Chol、DOIC、DOPC、DMRIE、PAMAM
、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ(
4−ビニルピリジン)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(4−ビニル−N−アルキル
ピリジニウムハライド)、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、
請求項45に記載の方法。 - 【請求項49】 ポリヌクレオチドがインターロイキン、インターフェロン
、コロニー刺激因子、抗血管形成因子、抗転移因子、膜レセプターおよび腫瘍抑
制因子から成る群から選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少な
くとも1つの発現ベクターを含んでなる、請求項45に記載の方法。 - 【請求項50】 ポリヌクレオチドがインターロイキン−1(IL−1)、イン
ターロイキン−2(IL−2)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン
−9(IL−9)、インターロイキン−11(IL−11)、インターロイキン−12(IL−
12)、インターロイキン−13(IL−13)、インターロイキン−18(IL−18)、イ
ンターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、顆粒球−
マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)
、マクロファージコロニー刺激因子(MCSF)、熱ショックタンパク質(HSP)、p
53、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のアンタゴニスト、メタロプロテイナーゼの
組織インヒビター(TIMP)、およびフィブロネクチンレセプターから成る群から
選択されるタンパク質をコードする少なくとも1つの発現ベクターを含んでなる
、請求項45に記載の方法。 - 【請求項51】 ポリヌクレオチドがインターロイキン−2(IL−2)をコー
ドする発現ベクターを含んでなる、請求項45に記載の方法。 - 【請求項52】 ポリヌクレオチドが顆粒球−マクロファージコロニー刺激
因子(GMCSF)をコードする発現ベクターを含んでなる、請求項45に記載の方法
。 - 【請求項53】 ポリヌクレオチドがインターフェロン−γをコードする発
現ベクターを含んでなる、請求項45に記載の方法。 - 【請求項54】 ポリヌクレオチドがインターロイキン−2(IL−2)、顆粒
球−マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)およびインターフェロン−γの2
またはそれ以上をコードする発現ベクターを含んでなる、請求項45に記載の方法
。 - 【請求項55】 被検体に対する追加の抗膀胱癌治療を実行することをさら
に含む、請求項41に記載の方法。 - 【請求項56】 追加の抗膀胱癌治療がカルメット−ゲラン杆菌(BCG)療
法を含んでなる、請求項55に記載の方法。 - 【請求項57】 (i)ポリヌクレオチド; (ii)カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの
組合わせ;および (iii)可溶化コレステロール調製物; を含んでなるトランスフェクション組成物。 - 【請求項58】 可溶化コレステロール調製物がシクロデキストリンで可溶
化されているコレステロールを含んでなる、請求項57に記載の方法。 - 【請求項59】 シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリンで
ある、請求項58に記載の方法。 - 【請求項60】 シクロデキストリンがアルファ−シクロデキストリン、ベ
ータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シク
ロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベー
タ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリ
ン、2,6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−
ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−S−ベータ−D−ガラクトピラノシ
ル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−
シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボ
キシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロ
デキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ
−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルト
シル−ベータ−シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項58に記載
の方法。 - 【請求項61】 (ii)がDOTAPであるカチオン脂質である、請求項57に記
載の方法。 - 【請求項62】 (ii)がスーパーフェクトであるデンドリマーであるカチ
オン脂質である、請求項57に記載の方法。 - 【請求項63】 カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーがDO
PE、DOTMA、DOGS、DODAB、DODAC、DOSPA、DC−Chol、DOIC、DOPC、DMRIE、PAMAM
、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ(
4−ビニルピリジン)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(4−ビニル−N−アルキル
ピリジニウムハライド)、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、
請求項57に記載の方法。 - 【請求項64】 ポリヌクレオチドがプラスミドDNAである、請求項57に記
載の方法。 - 【請求項65】 ポリヌクレオチドがウイルスDNA、染色体フラグメント、
アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌク
レオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせから成る群から
選択される、請求項57に記載の方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005007850A1 (ja) * | 2003-07-16 | 2005-01-27 | Kumamoto Technology & Industry Foundation | 細胞にrnaを導入する方法 |
JP2010530906A (ja) * | 2007-06-11 | 2010-09-16 | ルレデーラ フンダシオン パラ エル デサローヨ テクノロジコ イ ソシアル | 不溶性薬剤の制御放出のための、シクロデキストリンおよびポリ(アミドアミン)に基づく超分岐ポリマー |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AUPQ259399A0 (en) * | 1999-09-01 | 1999-09-23 | Lustre Investments Pte Ltd | Therapeutic agents |
WO2001037665A1 (en) * | 1999-11-29 | 2001-05-31 | Mirus Corporation | Compositions and methods for drug delivery using amphiphile binding molecules |
WO2003038103A1 (en) * | 2001-10-29 | 2003-05-08 | Atso Raasmaja | Method for gene transfection using synergistic combinations of cationic lipids and cationic polymers |
US7153905B2 (en) * | 2003-03-21 | 2006-12-26 | The General Hospital Corporation | Hyperbranched dendron and methods of synthesis and use thereof |
US8545830B2 (en) * | 2003-03-24 | 2013-10-01 | University Of Tennessee Research Foundation | Multi-functional polymeric materials and their uses |
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WO2007046775A1 (en) | 2005-10-21 | 2007-04-26 | Cellresearch Corporation Pte Ltd | Isolation and cultivation of stem/progenitor cells from the amniotic membrane of umbilical cord and uses of cells differentiated therefrom |
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WO2014025795A1 (en) | 2012-08-07 | 2014-02-13 | Northeastern University | Compositions for the delivery of rna and drugs into cells |
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---|---|---|---|---|
US5703055A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
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US5614503A (en) | 1993-11-12 | 1997-03-25 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Amphipathic nucleic acid transporter |
US5691316A (en) | 1994-06-01 | 1997-11-25 | Hybridon, Inc. | Cyclodextrin cellular delivery system for oligonucleotides |
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JPH11508231A (ja) | 1995-05-26 | 1999-07-21 | ソマティックス セラピー コーポレイション | 安定な脂質/核酸複合体を含む送達ビヒクル |
US5932241A (en) | 1995-06-07 | 1999-08-03 | Valentis, Incorporated | Cationic lipid DNA complexes for gene targeting |
US5830878A (en) | 1995-06-07 | 1998-11-03 | Megabios Corporation | Cationic lipid: DNA complexes for gene targeting |
CA2263705C (en) | 1996-08-19 | 2007-12-04 | Nancy Smyth-Templeton | Novel sandwich liposome complexes comprising a biologically active agent |
WO1998040499A1 (en) * | 1997-03-10 | 1998-09-17 | Heather Lynn Davis | Gene delivery to mucosal epithelium for immunization or therapeutic purposes |
WO1998044909A1 (en) | 1997-04-04 | 1998-10-15 | Valentis Inc. | Improved methods of delivery using cationic lipids and helper lipids |
AU7490098A (en) * | 1997-05-15 | 1998-12-08 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphile formulations |
JP2001500897A (ja) * | 1997-06-10 | 2001-01-23 | ジエンザイム コーポレイション | 治療用分子の細胞内送達のための陽イオン性両親媒性組成物 |
US6391336B1 (en) | 1997-09-22 | 2002-05-21 | Royer Biomedical, Inc. | Inorganic-polymer complexes for the controlled release of compounds including medicinals |
AU9404398A (en) | 1997-09-23 | 1999-04-12 | Megabios Corporation | Methods for preparing lipids/polynucleotide transfection complexes |
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2007
- 2007-11-26 US US11/986,829 patent/US7709457B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6010051104, Nat. Biotechnol., 1997, Vol.15, pp.647−52 * |
JPN6010051105, Gene Ther., 1998, Vol.5, pp.137−43 * |
JPN6010051109, Mol. Biol. Cell, 199904, Vol.10, pp.961−74 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005007850A1 (ja) * | 2003-07-16 | 2005-01-27 | Kumamoto Technology & Industry Foundation | 細胞にrnaを導入する方法 |
JPWO2005007850A1 (ja) * | 2003-07-16 | 2006-08-31 | 財団法人くまもとテクノ産業財団 | 細胞にrnaを導入する方法 |
JP4649571B2 (ja) * | 2003-07-16 | 2011-03-09 | 英俊 有馬 | 細胞にrnaを導入する方法 |
JP2010530906A (ja) * | 2007-06-11 | 2010-09-16 | ルレデーラ フンダシオン パラ エル デサローヨ テクノロジコ イ ソシアル | 不溶性薬剤の制御放出のための、シクロデキストリンおよびポリ(アミドアミン)に基づく超分岐ポリマー |
Also Published As
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