MX2011009724A - Inhibicion mediada por interferencia de acido ribonucleico de la expresion del gen del factor de transcripcion basico de cierre de leucina 1 de homologia de btb y cnc 1, usando el listado de secuencias de acido nucleico corto de interferencia. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos para el estudio, diagnóstico y tratamiento de rasgos, enfermedades y afecciones que responden a la modulación de la expresión y/o actividad del gen Bachi, y/o modulan la ruta de la expresión del gen Bachi; específicamente, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico de doble cadena que incluyen moléculas de ácido nucleico pequeñas, tales como moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (ANci), ARN corto de interferencia (ARNci), ARN de doble cadena (ARNdc), micro-ARN (miARN) y ARN corto de horquilla (ARNch), que son capaces de mediar o que median la interferencia de ARN (i-ARN) contra la expresión del gen Bach1.

Description

INHIBICIÓN MEDIADA POR INTERFERENCIA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE LA EXPRESIÓN DEL GEN DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN BÁSICO DE CIERRE DE LEUCINA 1 DE HOMOLOGÍA DE BTB Y CNC 1. USANDO EL LISTADO DE SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO CORTO DE INTERFERENCIA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. No. 61/161 ,699, presentada el 19 de marzo de 2009. La solicitud antes mencionada se incorpora aquí como referencia en su totalidad, incluyendo los dibujos.

El listado de secuencias presentado vía EFS, en cumplimiento con el título 37 §1.52 (e)(5) del CFR, se incorpora aquí como referencia. El archivo de texto del listado de secuencias presentado vía EFS contiene el archivo "SequenceListing 75WPCT", creado el 25 de febrero de 2010, que tiene un tamaño de 109,874 bytes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Bachl es un represor transcripcional de Hemo-Oxigenasa 1 (HO-1) y otros genes de fase II dependientes de Nrf2. El factor de transcripción Bachl pertenece a la superfamília de reguladores transcripcionales del factor de cierre de leucina de la región básica y de casquete y collar (CNC) (conocido como CNC-bZip). Además, Bachl presenta un complejo amplio denominado dominio tram-track, bric-a-brac (BTB) (conocido también como dominio de poxvirus y de dedo de zinc (POZ)) en su región N-terminal. El dominio BTB/POZ está implicado en la represión transcripcional al interaccionar con co-represores; estos dominios BTB/POZ facilitan las interacciones de proteína-proteína y la formación de homo- o hetero-oligómeros con otras proteínas. Bachl y Nrf2 (otro miembro de la familia CNC-bZip, conocido también como factor 2 relacionado con NF-E2, factor nuclear (derivado de eritroide 2) de tipo 2), forman heterodímeros con miembros de la familia de proteínas Maf; estos heterodímeros se unen a elementos de reconocimiento de Maf (MARE, elementos de respuesta antioxidante relacionados con Maf) en regiones promotoras del gen y regulan la transcripción del gen [Dhakshinamoorthy, S. et al (2005) J. Biol. Chem. 280, p. 16891-16900; Ogawa.K. et al (2001 ), EMBO J. 20, p. 2835-2843; Reichard J.F. et al (2007) Nucleic Acids Res. 35, p. 7074-7086; Reichard J.F. et al (2008) J. Biol. Chem. 283, p. 22363-22370]. Aunque el Nrf2 es un regulador positivo de la transcripción del gen de fase II (por ejemplo, Hemo Oxigenasa 1 (HO-1 ), NAD(P)H quinona oxidorreductasa 1 (NQO1), subunidad modificadora de glutamato cisteina ligasa (GCLM), glutatión S-transferasa, glutatión peroxidasa, tiorredoxina, y otros), Bachl actúa como un represor de muchos de estos genes. La capacidad de Bachl para reprimir a HO-1 parece dominante sobre los estimuladores de transcripción, incluso Nrf2; el equilibrio entre Bachl y Nrf2 en el núcleo modula la transcripción del gen dependiente de ARE. En general, los datos disponibles sugieren que la supresión de la represión de Bachl es suficiente para inducir la expresión de HO-1 , incluso en ausencia de estímulos.

Bachl es expresado en muchas células y tejidos, que incluyen células epiteliales y endoteliales del pulmón, y también en macrófagos. Como consecuencia de la expresión extensa de Bachl , la expresión de HO-1 (la forma inducible de HO) es generalmente baja en condiciones básales, ya sea en cultivo celular o en tejidos normales no dañados in vivo; sin embargo, la expresión de HO-1 es regulada positivamente por daño o estrés en la mayoría de los tejidos. En los pulmones de pacientes de COPD se ha detectado un grado de expresión reducido de HO-1 (y otros genes de fase II), sugiriendo que HO-1 es regulado positivamente de manera insuficiente en la enfermedad pulmonar crónica. Más recientemente, varios grupos han reportado diferentes grados de expresión de Nrf2 y sus reguladores Keapl , DJ-1 y Bachl en sujetos sanos en comparación con sujetos de COPD [Slebos.D.J et al (2004) Eur. Respir. J. 23, p. 652-653; Maestrelli, P. et al, (2003) Eur. Respir. J. 21 , p. 971-976]. La expresión de genes de fase II dependientes de Nrf2 fue significativamente diferente en pulmones normales en comparación con pulmones enfermos, observándose grados de expresión significativamente más bajos de HO-1 , NQO1 y GLCM en los pulmones con enfisema severo [Goven, D. et al, (2008) Thorax, 63, p.916-924; Malhotra, D. et al (2008), Am. J. Respir. Crit Care Med., 178, p. 592-604; Suzuki, M. et al (2008) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 39, p. 673-682.] En general, los datos de la expresión en pulmón humano apoyan la hipótesis de que el equilibrio alterado entre los moduladores de la actividad de Nrf2, incluyendo los factores positivos (DJ-1 ) y negativos (Keap 1 y Bachl ), en los pulmones de COPD, resulta en la pérdida de antioxidantes dependientes de Nrf2. Como parte de esta respuesta anormal, la expresión de Bachl se eleva y concomitantemente la expresión de HO-1 es regulada negativamente en pacientes con COPD avanzada o enfisema severo.

La indicación primaria para este objetivo es la COPD; indicaciones secundarias para este objetivo incluyen el asma severa y fibrosis quística, y otras enfermedades respiratorias tales como enfermedad respiratoria, tal como por ejemplo, sin limitación, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis y sinusitis, dada la función potencial del estrés oxidativo en la patogénesis de estas enfermedades. La importancia de los mecanismos antioxidantes es destacada por el aumento de inflamación, hipersensibilidad de las vías respiratorias y producción de citocina Th2, observadas en los modelos de asma que usan ratones deficientes en Nrf2. Además, la regulación positiva farmacológica de HO-1 ha mostrado efectos benéficos en modelos de animal de enfermedad alérgica y citoprotección de células en fibrosis quística [Rangasamy T. et al (2005) J. Exp. Med. 202, p. 47-59; Williams M.A et al (2008) J. Immunol. 181 , p. 4545-4559; Xia Z.W. et al (2006) J. Immunol. 177, p. 5936-5945; Xia Z.W. et al (2007) Am. J. Pathol. 171 , p. 1904-1914; Zhou H. et al (2004) Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, p. 633-640]. Varios mecanismos que incluyen inflamación, desequilibrio de proteasa/antiproteasa y apoptosis celular inducida por estrés oxidativo (células epiteliales y endoteliales), contribuyen a la destrucción alveolar y daño del pulmón en la COPD. El estrés oxidativo (definido como un desequilibrio entre la generación de especies oxidantes y la capacidad antioxidante celular) se encuentra aumentado en los pacientes de COPD, particularmente durante las exacerbaciones, y la contribución de las ROS a la patofisiología de la COPD está bien establecida [Demedts J.K. et al (2006) Respir. Res. 7, p. 53-57; Macnee W (2007) Clin. Chest Med. 28, p. 479-513; Barnes PJ (2008) Proc. Am. Thorac. Soc. 5, p. 857-864]. Se sugiere la activación de la ruta de Nrf2 como una aproximación factible para la restauración de las defensas antioxidantes y la reducción de la carga del estrés oxidativo, lo que proveería un beneficio clínico por reducción de la inflamación y posiblemente aumento del efecto de la terapia esferoide en estos pacientes.

En ausencia de estrés oxidativo, Bachl se une a elementos de reconocimiento de Maf (MARE) como un heterodímero con un miembro de la familia de proteínas Maf pequeñas (MafK o MafG), y suprime la expresión de HO-1 y otros genes de fase II. Los heterodímeros Bachl /MafK se unen con afinidad alta a racimos de secuencias de MARE presentes en el promotor de HO-1 ; estas secuencias, que contienen 2-3 motivos de MARE, están localizados dentro de los incrementadores E1 (268 p.b., localizado aproximadamente a -4 kb) y E2 (161 p.b., localizado a -10 kb) del promotor HO-1. El activador transcripcional Nrf2 normalmente (es decir, en condiciones básales) es retenido en el citoplasma por la proteína regulada por óxido-reducción Keap 1 ; el estrés oxidativo resulta en la disociación del complejo Nrf2-Keap 1 y el traslado subsiguiente de Nrf2 al núcleo. Entonces los heterodímeros Nrf2/Maf se unen a secuencias de MARE/ARE e inducen la transcripción de genes de fase II. En condiciones de estrés oxidativo, o si la concentración intracelular de hemo libre está elevada, la unión de hemo a Bachl causará la disociación de Bach1/MafK de las secuencias de MARE e inducirá exportación nuclear y degradación de Bachl [Ozono R. (2006) Curr. Pharm. Biotechnol. 7, p. 87-93]. Como resultado, Nrf2/MafK se une a MARE y la transcripción de HO-1 y otros genes de fase II es activada.

Se ha mostrado que los activadores de molécula pequeña de la ruta de Nrf2, en particular por interrupción de la interacción de Nrf2/Kcap1 y permitiendo así el traslado de Nrf2 al núcleo para iniciar la transcripción del gen, son protectores contra la destrucción del pulmón inducida por el humo del cigarro. Específicamente, se ha mostrado que el triterpenoide CDDO-lm (que regula fuertemente de manera positiva a HO-1 y otros genes de fase II dependientes de Nrf2, tanto ín vivo como in vitro) reduce significativamente los marcadores del estrés oxidativo en el pulmón, la apoptosis de células alveolares y la subsiguiente destrucción del pulmón e hipertensión pulmonar [Sussan, T.E. et al (2009) Proc. Nal Acad. Sci. 106, p. 250 a 255].

Haciendo blanco en Bachl se restaurarían los mecanismos de protección contra la carga excesiva de estrés oxidativo en el pulmón de COPD, aumentando la expresión y actividad de HO-1 (y a un menor grado otros genes de fase II). Específicamente, esto disminuiría la apoptosis de células estructurales (que incluyen células epiteliales y endoteliales alveolares) y aumentaría la resolución de la inflamación. Juntas, estas actividades aumentarían la citoprotección, conservarían la estructura del pulmón y favorecerían la reparación del pulmón de COPD, retardando así el avance de la enfermedad. De esta manera, existe la necesidad de nuevas terapias dirigidas a Bachl .

La alteración de la expresión génica, específicamente la expresión del gen Bachl , por medio de interferencia de ARN (en adelante "i-RNA") es una propuesta para cubrir esta necesidad. La i-ARN es inducida por moléculas de ARN corto de doble cadena ("ARNdc"). Las moléculas de ARNdc cortas, denominadas "ARN corto de interferencia" o "ARNci" o "inhibidores de i-ARN" silencian la expresión de ARN mensajeros ("ARNm") que comparten homología de secuencia con el ARNci. Esto puede ocurrir mediante el corte del ARNm mediado por un complejo de endonucleasa que contiene un ARNci, denominado comúnmente el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El corte del ARN objetivo normalmente ocurre en la parte media de la región complementaria a la secuencia guía del dúplex de ARNci (Elbashir et al, 2001 , Genes Dev., 15, 188). Además, la interferencia de ARN también puede implicar silenciamiento de gen mediado por ARN pequeño (por ejemplo micro-ARN o miARN), presumiblemente mediante mecanismos celulares que regulan la estructura de la cromatina y previenen así la transcripción de secuencias del gen objetivo (véase por ejemplo Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al, 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al, 2002, Science, 297, 2232-2237).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee compuestos, composiciones y métodos útiles para modular la expresión de genes Bachl , específicamente los genes Bachl asociados con el desarrollo o mantenimiento de enfermedades y afecciones inflamatorias o respiratorias por interferencia de ARN (i-ARN) usando moléculas pequeñas de ácido nucleico.

En particular, la presente invención presenta moléculas pequeñas de ácido nucleico, es decir, moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (ANci), que incluyen sin limitación moléculas de ARN corto de interferencia (ARNci), ARN de doble cadena (ARNdc), micro-ARN (miARN), ARN corto de horquilla (ARNch) y ARN circular, y los métodos usados para modular la expresión de genes Bachl u otros genes implicados en las rutas de la expresión o actividad del gen Bachl .

En un aspecto, la presente invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que comprende una primera cadena y una segunda cadena que tienen complementariedad entre sí, en donde por lo menos una cadena comprende por lo menos 15 nucleótidos de: 5'-GGAAUCCUGCUUUCAGUUU -3' (SEQ 1D N0: 1 ); 5'-AAACUGAAAGCAGGAUUCC-3' (SEQ ID NO: 143 ); 5'-GUCUGAGUGUCCGUGGUUA-3' (SEQ ID NO: 10); 5'-UAACCACGGACACUCAGAC-3' (SEQ ID NO: 144); 5 -GCAGUUACUUCCACUCAAG -3' (SEQ ID NO: 1 1 ); 5 '-CUUGAGUGGAAGUAACUGC-3' (SEQ ID NO: 145); 5 -CUACACUGCUAAACUGAUU-3' (SEQ ID NO: 15); 5'-AAUCAGUUUAGCAGUGUAG-3' (SEQ ID NO: 146); 5'-GAUUUGCAGGUGAUGUUAA-3' (SEQ ID NO: 18); 5'-UUAACAUCACCUGCAAAUC-3' (SEQ ID NO: 147); 5'-AUUUGAACCUUUAAUUCAG-3' (SEQ ID NO: 42); 5'- CUGAAUUAAAGGUUCAAAU-3' (SEQ ID NO: 148); 5'-GUUAAAGGAUUUGAACCUU-3' (SEQ ID NO: 38); o 5'-AAGGUUCAAAUCCUUUAAC -3' (SEQ ID NO: 150); y en donde opcionalmente uno o más de los nucleótidos están modificados químicamente.

En algunas modalidades de la invención ningún nucleótido está modificado. En otras modalidades están modificadas una o más de las posiciones de nucleótido en una o las dos cadenas de una molécula de ANci (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos modificados). Las modificaciones incluyen modificaciones de azúcar del ácido nucleico, modificaciones de base, modificaciones de esqueleto (enlace internucleotídico), modificaciones no nucleotídicas, o cualquier combinación de las mismas. En algunos casos los nucleótidos de purina y pirimidina están modificados diferentemente. Por ejemplo, los nucleótidos de purina y pirimidina se pueden modificar diferentemente en la posición 2'-azúcar (es decir, por lo menos una purina tiene una modificación diferente de por lo menos una pirimidina en la misma cadena o en una cadena diferente en la posición 2'-azúcar). En otros casos, por lo menos un nucleótido modificado es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, un 2'-desoxinucleótido, o un 2'-0-alquil-nucleótido.

En algunas modalidades la molécula de ANci tiene tramos salientes 3' de uno, dos, tres o cuatro nucleótidos en una o las dos cadenas. En algunas modalidades el ANci carece de tramos salientes (es decir, tiene extremos rasurados). Preferiblemente la molécula de ANci tiene tramos salientes 3' de dos nucleótidos, tanto en la cadena de sentido como en la de antisentido. Los tramos salientes pueden estar modificados o no modificados. Los ejemplos de nucleótidos modificados en los tramos salientes incluyen, sin limitación, 2'-0-alquil-nucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, o 2'-desoxinucleótidos. Los nucleótidos salientes de la cadena de antisentido pueden comprender nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la secuencia de Bachl objetivo. Similarmente, los tramos salientes en la cadena de sentido pueden comprender nucleótidos que están en la secuencia de Bachl objetivo. En algunas modalidades las moléculas de ANci de la invención tiene dos nucleótidos salientes 3' en la cadena de antisentido que son 2'-0-alquil-nucleótidos, y dos nucleótidos salientes 3' en la cadena de sentido que son 2'-desoxinucleótidos.

En algunas modalidades la molécula de ANci tiene casquetes (también denominados en la presente "casquetes terminales"). El casquete puede estar presente en el extremo 5' (casquete 5') o en el extremo 3' (casquete 3'), o pueden estar presentes en los dos extremos, por ejemplo en los extremos 5' y 3' de la cadena de sentido del ANci.

En algunas modalidades se proveen moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, en donde la molécula tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido y comprende la fórmula A: B NX3 (?)?2 B -3' B (N)X 1 NX4 [N]X5 -5' (A) en donde la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; en donde la cadena de antisentido comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, o SEQ ID NO: 150, y la cadena de sentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la cadena de antisentido; cada N es, independientemente, un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente: cada B es un casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o está modificado químicamente; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son, independientemente, enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 17 a 36; X4 es un entero de 11 a 35; y X5 es un entero de 1 a 6, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; En una modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de fórmula A; en donde: (a) uno o más nucleótidos de pirimidina en las posiciones Nx4 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-0-alquil-nucleótidos, 2'-desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos; (b) uno o más nucleótidos de purina en las posiciones Nx4 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-0-alquil-nucleótidos, 2'-desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos; (c) uno o más nucleótidos de pirimidina en las posiciones Nx3 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-0-alquil-nucleótidos, 2'-desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos; (d) uno o más nucleótidos de purina en las posiciones NX3 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-0-alquil-nucleótidos, 2'-desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ARNci) de doble cadena de fórmula (A), en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido; (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desox¡nucleótido, o ribonucleótido; y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ARNci) de doble cadena de fórmula (A), en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-0-alquil-nucleótido; (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxinucleótido.

En una modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ARNci) de doble cadena de fórmula (A), en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-0-alquil-nucleótido¡ (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es independientemente un ribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ARNci) de doble cadena de fórmula (A), en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es independientemente un ribonucleótido; (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido¡ y (d) cada nucleótido dé purina en las posiciones NX3 es independientemente un ribonucleótido.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, en donde el ANci es: '- BGGAAuccuGcuuucAGuuuTTB -3' (Sentido) (SHQ ID NO: 43) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ?- UU c cuu AGGAcGAAAGu cAAA -5' (Antisentido) (SEQ ID NO: 44) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina¡ A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; A es adenosina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, en donde el ANci es: 5 ' - BGucu GAGuGuccGuGGuuATTB -3 ' (Sentido) (SHQ I NO:6l) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' UUcAGAcucAcAGGcAccAAU -5 ' (Antisentido) (SHQ D NO: 62) en donde: cada B es un casquete abásico invertido como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2 -desoxiadenosina; G es 2'desoxiguanosina; T es timidina; A es adenosina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'-0-metil-uridina¡ y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, en donde el ANci es: 5 ' BGcAGuuAcuuccAcucAAGTTB 3 ' (Sentido) (SHQ II) NO:63) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' UUcGucAAuGAAGGuGAGUUC 5 ' (Antisentido) (S Q ID NO:64) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'desoxiguanosina; T es timidina; C es citidina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina¡ U es 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, en donde el ANci es: 5 ' - Bcu.¾c.¾cuGcu.¾A.¾cuG.¾uuTTB -3 ' (Sentido) (SHQ 1 0:71) I I I I I I I I I M M I M I I I 3 ' UUGAuGuGAcGAuuuGAcUAA -5 ' (Antisentido) (SHQ ID NO:72) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina¡ A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; A es adenosina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-met¡l-guanosina; U es 2'-0-metil-uridina¡ y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, en donde el ANci es: 5 ' - B GAu u u Ge A G Gu GAu Guu TT B -3 ' (Sentido) (SHQ ID NO:77) I I I I I I I I I I I I I I I I I I. I 3 ' UUcuAAAcGuccAcuAcAAUU -5 ' (Antisentido) (SRQ ID NO:78) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina¡ A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; A es adenosina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'-0-metil-urid¡na; y los enlaces ¡nternucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, en donde el ANci es: 5'- B.¾uuuGAAccuuuAAuucAGTTB -3' (Sentido) (SHQ ID NO: G25) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3' UUuAAAcuuGGAAAuuAAGUC -5' (Anti sentido) (SEQ ID NO:126) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina¡ G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; G es guanosina; U es uridina; C es citidina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'-0-metil-uridina; y los enlaces ¡nternucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, en donde el ANci es: 5 ' - BGuuAAAGGAuuuGAAccuuTTB -3 ' (Sentido) (SEQ ID NO: 117) I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' U UcAAuuu ccuAAAcu uGGAA -5 ' (Antisentido) (SEQ ID NO:118) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; G es guanosina; A es adenosina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2 -O-metil-guanosina; U es 2'-0-metil-uridina¡ y los enlaces ¡nternucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

La presente invención provee, además, composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de ácido nucleico de doble cadena descritas en la presente y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La administración de la composición farmacéutica se puede hacer mediante los métodos conocidos, en donde el ácido nucleico se introduce a una célula objetivo deseada in vitro o in vivo.

Las técnicas usadas comúnmente para introducir las moléculas de ácido nucleico de la invención a las células, tejidos y organismos, incluyen el uso de varios sistemas de vehículo, reactivos y vectores. Los ejemplos no limitativos de dichos sistemas de vehículo adecuados para usarse en la presente invención incluyen partículas de ácido nucleico-lipido, nanopartículas de lipido (LNP), liposomas, lipoplexos, micelas, virosomas, partículas de tipo virus (VLP), complejos de ácido nucleico, y mezclas de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de un aerosol, dispersión, solución (por ejemplo una solución inyectable), una crema, ungüento, tableta, polvo, suspensión o similares. Estas composiciones se pueden administrar en cualquier forma adecuada, por ejemplo por vía oral, sublingual, bucal, parenteral, nasal, o tópica. En algunas modalidades las composiciones se hacen un aerosol y se suministran por medio de inhalación.

Las moléculas y composiciones farmacéuticas de la presente invención tienen utilidad sobre una amplia gama de aplicaciones terapéuticas; por consiguiente, otro aspecto de esta invención se refiere al uso de los compuestos y composiciones farmacéuticas de la invención para el tratamiento de un sujeto. Asi, la invención provee un método de tratamiento de un sujeto, tal como un humano, que padece una afección que es mediada por la acción, o la pérdida de la acción, de BacM , en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de la invención. En algunas modalidades, la afección es una enfermedad respiratoria tal como por ejemplo, sin limitación, COPD, fibrosis quística, asma, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis y sinusitis.

Estos y otros aspectos de la invención se harán evidentes haciendo referencia a la siguiente descripción detallada y las figuras anexas. Para ese fin, se citan en toda la especificación patentes, solicitudes de patente y otros documentos para describir y exponer más específicamente varios aspectos de la invención. Cada una de estas referencias citadas se incorpora aquí como referencia en su totalidad, incluyendo los dibujos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra una representación mecanística propuesta, no limitativa, de la degradación de ARN objetivo implicada en la i-ARN. ARN de doble cadena (ARNdc), que es generado por ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP) de ARN ajeno de una sola cadena, por ejemplo ARN viral, de transposón, u otro ARN exógeno, activa la enzima DICER, que a su vez genera los dúplex de ANci. Alternativamente, el ANci sintético o expresado se puede introducir directamente en una célula por medio de los métodos adecuados. Se forma un complejo de ANci activo que reconoce un ARN objetivo, dando como resultado la degradación del ARN objetivo por el complejo de endonucleasa de RISC, o la síntesis de ARN adicional por ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP), que puede activar la DICER, resultando moléculas de ANci adicionales y amplificando así la respuesta de i-ARN.

Las figuras 2A-2F muestran ejemplos no limitativos de construcciones de ANci químicamente modificado de la presente invención. En las figuras, N representa cualquier nucleótido (adenosina, guanosina, citosina, uridina, u opcionalmente timidina; por ejemplo, la timidina puede estar sustituida en las regiones salientes designadas entre paréntesis (N N)). Se muestran varias modificaciones para las cadenas de sentido y antisentido de las construcciones de ANci. Las posiciones de nucleótido (N N) pueden estar químicamente modificadas como aquí se describe (por ejemplo, 2'-0-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, etc.) y pueden derivar o no de una secuencia correspondiente de ácido nucleico objetivo (véase por ejemplo la figura 4C). Además, aunque no se representa en las figuras, las secuencias mostradas en las figuras 2A-2F opcionalmente pueden incluir un ribonucleótido en la novena posición desde el extremo 5' de la cadena de sentido, o la onceava posición basada en el extremo 5' de la cadena guía, contando 1 1 posiciones de nucleótido desde el extremo 5' de la cadena guía (véase la figura 4C). La cadena de antisentido de las construcciones mostradas en las figuras 2A-2F comprenden complementariedad de secuencia con cualquier secuencia de ácido nucleico objetivo de la invención. Además, cuando está presente una porción glicerilo (L) en el extremo 3' de la cadena de antisentido en cualquiera de las construcciones mostradas en las figuras 2A-2F, el enlace internucleotídico modificado es opcional.

La figura 2A muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas, y en donde todos los nucleótidos presentes son ribonucleótidos excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3'-terminal en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, y en donde todos los nucleótidos presentes son ribonucleótidos excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Un enlace internucleotídico modificado, tal como fosforotioato, fosforoditioato, fosfonoacetato, tiofosfonoacetato, u otro enlace internucleotídico modificado como se describe en la presente, mostrado como "s", une opcionalmente los nucleótidos (N N) en la cadena de antisentido.

La figura 2B muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-0-metilo, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3' terminal en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-0-metilo, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Opcionalmente, un enlace internucleotídico modificado, tal como fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado como se describe en la presente, mostrado como "s", une los nucleótidos (N N) en la cadena de sentido y antisentido.

La figura 2C muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos que tienen casquetes termínales 5' y 3', en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-O-metilo o 2'-desoxi-2'-fluoro, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3' terminal, en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Opcionalmente, un enlace internucleotidico modificado, tal como fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotidico modificado como se describe en la presente, mostrado como "s", une los nucleótidos (N N) en la cadena de antisentido.

La figura 2D muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos que tienen casquetes terminales 5' y 3', en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente, y en donde todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos 2'-desoxi. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3' terminal, y en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-0-metilo, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Opcionalmente, un enlace internucleotídico modificado, tal como fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado que se describe en la presente, mostrado como "s", une los nucleótidos (N N) en la cadena de antisentido.

La figura 2E muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos que tienen casquetes terminales 5' y 3', en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. La cadena de antísentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3' terminal, y en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-0-metilo, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Opcionalmente, un enlace internucleotídico modificado, tal como fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado que se describe en la presente, mostrado como "s", une los nucleótidos (N N) en la cadena de antisentido.

La figura 2F muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos que tienen casquetes terminales 5' y 3', en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente, y en donde todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos 2'-desoxi. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3' terminal, y en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' termínales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, y tiene un enlace internucleotídico de fosforotioato 3' terminal, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos 2'-desoxi, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Opcionalmente, un enlace internucleotídico modificado, tal como fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado que se describe en la presente, mostrado como "s", une los nucleótidos (N N) en la cadena de antisentido.

Las figuras 3A-3F muestran ejemplos no limitativos de secuencias del ANci específico químicamente modificado de la invención. Las figuras 3A-3F se aplican a las modificaciones químicas descritas en las figuras 2A-2F para una secuencia de ANci de Bachl ejemplar. Tales modificaciones químicas se pueden aplicar a cualquier secuencia de Bachl . Además, aunque esto no se representa en las figuras 3A-3F, opcionalmente las secuencias mostradas en las figuras 3A-3F pueden incluir un ribonucleótido en la novena posición desde el extremo 5' de la cadena de sentido o la onceava posición basada en el extremo 5' de la cadena guía, contando 11 posiciones de nucleótido desde el extremo 5' de la cadena guía (véase la figura 4C). Además, opcionalmente las secuencias mostradas en las figuras 3A-3F pueden incluir ribonucleótidos terminales en hasta aproximadamente 6 posiciones en el extremo 5' de la cadena de antisentido (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, o 4, 5 o 6 ribonucleótidos terminales en el extremo 5' de la cadena de antisentido).

Las figuras 4A-4C muestran ejemplos no limitativos de diferentes construcciones del ANci de la invención.

Los ejemplos mostrados en. la figura 4A (construcciones 1 , 2 y 3) tienen 19 pares de bases representativos; sin embargo, diferentes modalidades de la invención incluyen cualquier número de pares de bases descritos en la presente. Las regiones entre paréntesis representan tramos salientes de nucleótidos que comprenden, por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3 o 4 nucleótidos de longitud, de preferencia aproximadamente 2 nucleótidos. Las construcciones 1 y 2 se pueden usar independientemente para la actividad de i-ARN. La construcción 2 puede comprender un polinucleótido o enlazador no nucleotídico, que opcionalmente puede ser diseñado como un enlazador biodegradable. En una modalidad, la estructura de asa mostrada en la construcción 2 puede comprender un enlazador biodegradable que resulta en la formación de la construcción 1 in vivo o in vitro. En otro ejemplo, la construcción 3 se puede usar para generar la construcción 2 bajo el mismo principio, en donde se usa un enlazador para generar la construcción 2 de ANci activo in vivo o in vitro, usando opcionalmente otro enlazador biodegradable para generar la construcción 1 del ANci activo in vivo o in vitro. Por lo tanto, la estabilidad o actividad de las construcciones de ANci se pueden modular basándose en el diseño de la construcción del ANci para uso in vivo o in vitro y/o in vitro.

Los ejemplos mostrados en la figura 4B representan diferentes variaciones de la molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención, tal como microARN, que pueden incluir tramos salientes, protuberancias, asas y estructuras de tallo y asa que resultan de complementariedad parcial. Tales motivos que tienen protuberancias, asas y estructuras de tallo y asa generalmente son características del miARN. Las protuberancias, asas y estructuras de tallo y asa pueden originarse de cualquier grado de complementariedad parcial, tal como discordancias o protuberancias de aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos en una o las dos cadenas de la molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención.

El ejemplo mostrado en la figura 4C representa una molécula de ácido nucleico de doble cadena modelo de la invención que comprende un dúplex de 19 pares de bases de dos secuencias de 21 nucleótidos que tienen tramos salientes 3' de dinucleótido. La cadena superior (1 ) representa la cadena de sentido (cadena de pasajero), la cadena media (2) representa la cadena de antisentido (cadena guía), y la cadena inferior (3) representa una secuencia de polinucleótido objetivo. Los tramos salientes de dinucleótido (NN) pueden comprender una secuencia derivada del polinucleótido objetivo. Por ejemplo, la secuencia 3'-(NN) de la cadena guía puede ser complementaria a la secuencia 5'-[NN] del polinucleótido objetivo. Además, la secuencia 5'-(NN) de la cadena de pasajero puede comprender la misma secuencia que la secuencia 5'-[NN] de la secuencia de polinucleótido objetivo. En otras modalidades, los tramos salientes (NN) no derivan de la secuencia de polinucleótido objetivo, por ejemplo en donde la secuencia 3'-(NN) de la cadena guía no es complementaria a la secuencia 5'-[NN] del polinucleótido objetivo, y la secuencia 5'-(NN) de la cadena de pasajero puede comprender una secuencia diferente de la secuencia 5'-[NN] de la secuencia de polinucleótido objetivo. En modalidades adicionales, cualquier nucleótido (NN) está modificado químicamente, por ejemplo, como las modificaciones 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, u otras modificaciones de la presente. Además, la cadena de pasajero puede comprender una posición de ribonucleótido N de la cadena de pasajero. Para el dúplex representativo mostrado de 21 elementos y 19 pares de bases, la posición N puede ser 9 nucleótidos desde el extremo 3' de la cadena de pasajero. Sin embargo, en dúplex de longitud diferente, la posición N se determina basándose en el extremo 5' de la cadena guía, contando 1 posiciones de nucleótido desde el extremo 5' de la cadena guía, y escogiendo el nucleótido de base apareada correspondiente en la cadena de pasajero. El corte con Ago2 ocurre entre las posiciones 10 y 1 1 como lo indica la flecha. En modalidades adicionales, hay dos ribonucleótidos, NN, en las posiciones 10 y 11 basadas en el extremo 5' de la cadena guía, contando 10 y 11 posiciones de nucleótido desde el extremo 5' de la cadena guía y escogiendo los nucleótidos de bases apareadas correspondientes en la cadera de pasajero.

La figura 5 muestra ejemplos no limitativos de diferentes químicas de estabilización (1-10) que se pueden usar, por ejemplo, para estabilizar los extremos 5' o 3' de las secuencias de ANci de la invención, que incluyen (1 ) desoxirribosa [3-3']-invertida¡ (2) desoxirribonucleótido; (3) [5'-3']-3'-desoxirr¡bonucleótido; (4) [5'-3']-ribonucleótido; (5) [5'-3']-3'-0-metil-ribonucleótido; (6) 3'-glicerilo; (7) [3'-5']-3'-desoxirribonucleótido¡ (8) [3'-3']-desoxirribonucleótido; (9) [5'-2']-desoxirribonucleótido; y (10) [5-3']- didesoxirribonucleótido. Además de las químicas del esqueleto modificado y no modificado indicadas en la figura, estas químicas se pueden combinar con diferentes modificaciones de azúcar y base de nucleótido como se describe en la presente.

La figura 6 muestra un ejemplo no limitativo de una estrategia usada para identificar las construcciones de ANci químicamente modificadas de la invención, que son resistentes a nucleasa pero que conservan la capacidad para mediar la actividad de i-ARN. Las modificaciones químicas se introducen en la construcción de ANci basándose en parámetros de diseño preparados (por ejemplo introduciendo modificaciones 2', modificaciones de base, modificaciones de esqueleto, modificaciones de casquete terminal, etc.). La construcción modificada se prueba en un sistema adecuado (por ejemplo en suero humano para resistencia a nucleasa, mostrado, o un modelo de animal para los parámetros de PK/suministro). En paralelo, se prueba la actividad de i-ARN de la construcción de ANci, por ejemplo en un sistema de cultivo de células, tal como una prueba de reportero de luciferasa. Entonces se identifican las construcciones de ANci principales que poseen una característica particular pero que mantienen la actividad de i-ARN, y se pueden modificar más y volverse a probar. Esta misma propuesta se puede usar para identificar moléculas de conjugado de ANci con perfiles farmacocinéticos, de suministro y actividad de i-ARN mejorados.

La figura 7 muestra ejemplos no limitativos de moléculas de ANci fosforiladas de la invención, que incluyen construcciones lineales y dúplex y derivados asimétricos de las mismas.

La figura 8 muestra ejemplos no limitativos de grupos fosfato terminales químicamente modificados de la invención.

La figura 9 muestra un ejemplo no limitativo de una fosforamidita enlazada a colesterol que se puede usar para sintetizar las moléculas de ANci de la invención conjugadas con colesterol. Se muestra un ejemplo con la porción de colesterol enlazada al extremo 5' de la cadena de sentido de una molécula de ANci.

La figura 10 representa una modalidad de casquete abásico invertido 5' y 3' enlazado a una cadena de ácido nucleico.

La figura 11 son datos de TaqMan de células TLR8-U20S transfectadas, que muestran el efecto de los ANci sobre las concentraciones de ARNm de IL8.

La figura 12 son datos de TaqMan de células TLR7-U20S transfectadas, que muestran el efecto de los ANci sobre las concentraciones de ARNm de IL8.

La figura 13 son datos que ponen en evidencia la expresión de la proteína HO-1 incrementada por ANci de manera dependiente de la concentración en células epiteliales de pulmón por tratamiento con ANci.

La figura 14 muestra que no hay aumentos significativos en la afluencia de células inflamatorias o en la producción de citocina después de la administración intratraqueal de cada uno de los ANci objetivo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Términos y definiciones La siguiente terminología y definiciones se aplican como se usa en la presente solicitud.

El término "abásica" se refiere a porciones de azúcar que carecen de una nucleobase o que tienen un átomo de hidrógeno (H) u otros grupos químicos que no son de nucleobase en lugar de una nucleobase, en la posición 1 ' de la porción de azúcar; véase por ejemplo Adamic et al., patente de EE. UU. No. 5,998,203. En una modalidad, una porción abásica de la invención es un azúcar ribosa, desoxirribosa, o didesoxirribosa.

El término "nucleótido acíclico", como se usa aquí, se refiere a cualquier nucleótido que tiene un azúcar acíclico de ribosa, por ejemplo en donde cualquiera de los enlaces carbono-carbono o carbono-oxígeno de la ribosa están ausentes del nucleótido, independientemente o en combinación.

El término "alquilo" se refiere a hidrocarburos saturados o insaturados que incluyen grupos alquenilo y alquinilo de cadena recta y ramificada y grupos cíclicos, pero excluye los grupos aromáticos. No obstante lo anterior, el alquilo también se refiere a grupos heterocíclicos no aromáticos. Preferiblemente, el grupo alquilo tiene de 1 a 12 carbonos. Preferiblemente es un alquilo inferior de 1 a 7 carbonos, de preferencia de 1 a 4 carbonos. El grupo alquilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo sustituido es preferiblemente hidroxilo, ciano, alcoxi de C1-C4, =0, =S, NO2, SH, NH2, o NR^, en donde R- y R2 son independientemente H o alquilo El término "arilo" se refiere a un grupo aromático que tiene por lo menos un anillo que tiene un sistema conjugado de electrones p¡ e incluye grupos de arilo carbocíclico, arilo heterocíclico y diarilo, todo los cuales pueden estar sustituidos opcionalmente. Los sustituyentes preferidos de los grupos arilo incluyen halógeno, trihalometilo, hidroxilo, SH, OH, ciano, alcoxi de C1-C4, alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, alquinilo de C2-C4, NH2 y grupos NRiR2l en donde R1 y R2 son independientemente H o alquilo de C C4.

El término "alquilarilo" se refiere a un grupo alquilo (como se describe arriba) unido covalentemente a un grupo arilo (como se describe arriba). Los grupos de arilo carbocíclico son grupos en donde los átomos de anillo del anillo aromático son todos átomos de carbono. Opcionalmente los átomos de carbono están sustituidos. Los grupos de arilo heterocíclico son grupos que tienen de 1 a 3 heteroátomos como átomos de anillo en el anillo aromático, y el resto de los átomos de anillo son átomos de carbono. Los heteroátomos adecuados incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno, y los ejemplos de los grupos de arilo heterocíclico que tienen dichos heteroátomos incluyen furanilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, N-alquilo inferior-pirrólo, pirimidilo, pirazinilo, imidazolilo, etc., todos sustituidos opcionalmente. Preferiblemente el grupo alquilo es un grupo alquilo de C1-C4.

El término "amida" se refiere a un -C(0)-NH-R, en donde R es alquilo, arilo, alquilarilo o hidrógeno.

La frase "región de antisentido" se refiere a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ANci que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico objetivo. Además, la región de antisentido de una molécula de ANci puede comprender opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que tiene complementariedad con una región de sentido de la molécula de ANci. En una modalidad, la región de antisentido de la molécula de ANci se denomina la cadena de antisentido o la cadena guia.

La frase "horquilla asimétrica" se refiere a una molécula de ANci lineal que comprende una región de antisentido, una porción de asa que puede comprender nucleótidos o compuestos no nucleotidicos, y una región de sentido que comprende menos nucleótidos que la región de antisentido, en una extensión en la que la región de sentido tenga suficientes nucleótidos de complementariedad para el apareamiento de bases con la región de antisentido y forme un dúplex con el asa. Por ejemplo, una molécula de ANci de horquilla asimétrica de la invención puede comprender una región de antisentido que tiene una longitud suficiente para mediar i-ARN en una célula o en un sistema in vitro (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos, o aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos), una región de asa que comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 , o 12 nucleótidos), y una región de sentido que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25) que son complementarios a la región de antisentido. La molécula de ANci de horquilla asimétrica también puede comprender un grupo fosfato 5' terminal que se puede modificar químicamente. La porción de asa de la molécula de ANci de horquilla asimétrica puede comprender nucleótidos, compuestos no nucleotídicos, moléculas enlazadoras o moléculas conjugadas como se describe en la presente.

El término "Bachl" se refiere al gen del factor de transcripción básico de cierre de leucina 1 de homología a BTB y CNC 1 , o a los genes que codifican las proteínas de Bachl , péptidos de Bachl , polipéptidos de Bachl , polinucleótidos reguladores de Bachl (por ejemplo miARN y ARNci de Bachl), genes mutantes de Bachl y variantes de empalme de genes Bachl , así como también otros genes implicados en las rutas de la expresión o actividad del gen Bachl . De esta manera, cada una de las modalidades aquí descritas que hacen referencia al término "Bachl" son aplicables a las moléculas de proteína, péptido, polipéptido o polínucleotido cubiertas por el término "Bachl" como se define este término en la presente. De manera incluyente, tales objetivos de gen también se denominan en la presente en general secuencias "objetivo" (incluso el cuadro 10).

El término "biodegradable" se refiere a la degradación en un sistema biológico, por ejemplo degradación enzimática o degradación química.

El término "enlazador biodegradable" se refiere a una molécula enlazadora de ácido nucleico, o diferente de ácido nucleico, que se diseña para unir una molécula con otra molécula, por ejemplo una molécula biológicamente activa a una molécula de ANci de la invención, o las cadenas de sentido y antisentido de una molécula de ANci de la invención, y es biodegradable. El enlazador biodegradable se diseña de tal manera que su estabilidad se puede modular para un fin particular, tal como el suministro a un tipo particular de tejido o célula. La estabilidad de una molécula enlazadora biodegradable basada en ácido nucleico se puede modular usando varias técnicas de química, por ejemplo combinaciones de ribonucleótidos, desoxirribonucleotidos y nucleótidos químicamente modificados, tales como nucleótidos 2'-0- metilo, 2'-fluoro, 2'-amino, 2'-O-amino, 2 -C-alilo, 2'-0-alilo, y otros nucleótidos 2'-modificados o de base modificada. La molécula enlazadora biodegradable de ácido nucleico puede ser un dímero, trímero, tetrámero o molécula de ácido nucleico mas grande, por ejemplo un oligonucleótido de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleótidos de longitud, o puede comprender un solo nucleótido con un enlace basado en fósforo, por ejemplo un enlace de fosforamidato o fosfodiéster. La molécula enlazadora biodegradable de ácido nucleico también puede comprender modificaciones de esqueleto de ácido nucleico, azúcar de ácido nucleico, o de base de ácido nucleico.

La frase "molécula biológicamente activa" se refiere a compuestos o moléculas que son capaces de provocar o modificar una respuesta biológica en un sistema, o son capaces de modular la farmacocinética o farmacodinámica de otras moléculas biológicamente activas. Los ejemplos no limitativos de moléculas biológicamente activas incluyen las moléculas de ANci solas o en combinación con otras moléculas que incluyen, sin limitación, moléculas terapéuticamente activas tales como anticuerpos, colesterol, hormonas, antivirales, péptidos proteínas, agentes quimioterapéuticos, moléculas pequeñas, vitaminas, cofactores, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos enzimáticos, ácidos nucleicos de antisentido, oligonucleótidos formadores de triplex, poliaminas, poliamidas, polietilenglicol, otros poliésteres, quimeras 2-5A, ANci, A Ndc, alozimas, aptámeros, señuelos y análogos de los mismos.

La frase "sistema biológico" se refiere a un material, en forma purificada o no purificada, de fuentes biológicas que incluyen, sin limitación, humano o animal, en donde el sistema comprende los componentes requeridos para la actividad de i-ARN. De esta manera, la frase incluye por ejemplo una célula, tejido, sujeto u organismo, o extracto de los mismos. El término también incluye material reconstituido de una fuente biológica.

La frase "extremo rasurado" se refiere a un extremo de una molécula de ANci de doble cadena que no tiene nucleótidos salientes. Las dos cadenas de una molécula de ANci de doble cadena se alinean una con la otra sin nucleótidos salientes en los extremos.

El término "casquete" también referido aquí como "casquete terminal" se refiere a modificaciones químicas que se pueden incorporar en el extremo 5' o 3' del oligonucleótido de la cadena de sentido o la cadena de antisentido (véase por ejemplo, Adamic et al., patente de EE. UU. No. 5,998,203, que se incorpora aquí como referencia). Estas modificaciones terminales protegen a la molécula de ácido nucleico de degradación por exonucleasa, y pueden ayudar al suministro o localización dentro de una célula. El casquete puede estar presente en el extremo 5' (casquete 5') o en el extremo 3' (casquete 3'), o puede estar presente en los dos extremos. En ejemplos no limitativos, el casquete 5' incluye, sin limitación, glicerilo, residuo (porción) desoxi abásico invertido; 4',5'-metilen-nucleótido¡ 1-(beta-D-eritrofuranosil)-nucleótido, 4'-tio-nucleótido; nucleótido carbocíclico 1 ,5-anhidrohexitol-nucleótido; L-nucleótidos; alfa-nucleótidos; nucleótido de base modificada; enlace de fosforoditioato; freo-pentofuranosil-nucleótido; nucleótido acíclico 3',4'-seco; nucleótido acíclico de 3,4-dihidroxibutilo; nucleótido acíclico de 3,5-dihidroxipentilo, porción de nucleótido 3'-3'-invertida; porción abásica 3 -3'-invertida; porción de nucleótido 3'-2'-invertido; porción abásica 3'-2'-¡nvertida; 1 ,4-butanodiol fosfato; 3'-fosforamidato; hexilfosfato; aminohexilfosfato; 3'-fosfato; 3'-fosforotioato; fosforoditioato; o porción de metilfosfonato de puente o sin puente. Los ejemplos no limitativos del casquete 3' incluyen, sin limitación, glicerilo, residuo (porción) desoxi abásico invertido, 4',5'-metilen-nucleótido; 1-(beta-D-eritrofuranosil)-nucleótido; 4'-tio-nucleótido, nucleótido carbocíclico; 5'-amino-alquil-fosfato; 1 ,3-diamino-2-propil-fosfato; 3-aminopropil-fosfato; 6-aminohexil-fosfato; 1 ,2-aminododecil-fosfato; hidroxipropil-fosfato; 1 ,5-anhidrohexitol-nucleótido; L-nucleótido; alfa- nucleótido; nucleótido de base modificada; fosforoditioato; freo-pentofuranosil-nucleótido; nucleótido acíclico 3',4 -seco; 3,4-dihidroxibutil-nucleótido; 3,5-dihidroxipentil-nucleótido, porción de nucleótido 5'-5'-invertido; porción abásica 5'-5'-invertida; 5'-fosforamidato; 5'-fosforotioato; 1 ,4-butanodiolfosfato; 5'-amino; 5'-fosforamidato de puente y sin puente, fosforotioato o fosforoditioato, metilfosfonato de puente y sin puente, y porciones 5'-mercapto (para más detalles véase Beaucage e lyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925; que se incorpora aquí como referencia). La figura 5 muestra algunos ejemplos no limitativos de varios casquetes.

El término "célula" se usa en su sentido biológico usual, y no se refiere a un organismo multicelular completo, por ejemplo no se refiere específicamente a un ser humano. La célula puede estar presente en un organismo, por ejemplo aves, plantas y mamíferos tales como humanos, vacas, ovejas, simios, monos, cerdos, perros y gatos. La célula puede ser procariótica (por ejemplo una célula bacteriana) o eucariótica (por ejemplo una célula de mamífero o de planta). La célula puede ser de origen somático o de línea germinal, totipotente o pluripotente, divisoria o no divisoria. La célula también se puede derivar de, o puede comprender, un gameto o embrión, una célula madre, o una célula completamente diferenciada.

La frase "modificación química" se refiere a cualquier modificación de la estructura química de los nucleótidos que difiere de los nucleótidos del ARNci o ARN nativo. El término "modificación química" abarca la adición, sustitución o modificación del ARNci o ARN nativo en el azúcar, base o enlace internucleotidico, como se describe aquí o como se conoce de otra manera en la técnica. Véase por ejemplo USSN 12/064,015 para ejemplos no limitativos de modificaciones químicas que son compatibles con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención.

El término "complementariedad" se refiere a la formación de enlaces de hidrógeno entre una secuencia de ácido nucleico y otra secuencia de ácido nucleico, ya sea por medio de tipos de enlace tradicionales de Watson-Crick u otros tipos no tradicionales como se describe en la presente. Con respecto a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, la energía libre de unión para una molécula de ácido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para permitir la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo la actividad de i-ARN. La determinación de las energías libres de unión para moléculas de ácido nucleico es muy conocida (véase por ejemplo Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. Lll p.123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785). Complementariedad perfecta significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico se unirán por medio de hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico. La complementariedad parcial puede incluir varias discordancias o nucleótidos con bases no apareadas (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más discordancias o nucleótidos con bases no apareadas) dentro de la molécula de ácido nucleico, lo que puede resultar en protuberancias, asas o tramos salientes que resultan entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ácido nucleico, o entre la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ácido nucleico y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente.

El término "gen" o la frase "gen objetivo" se refieren a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que comprende las secuencias codificadoras de longitud parcial o longitud completa necesarias para la producción de un polipéptido. Un gen o gen objetivo también puede codificar un ARN funcional (ARNf) o ARN no codificador (ARNnc), tal como ARN pequeño temporal (ARNpt), micro ARN (miARN), ARN nuclear pequeño (ARNnp), ARN corto de interferencia (ARNci), ARN nucleolar pequeño (ARNnp), ARN ribosomal (ARNr), ARN de transferencia (ARNt) y ARN precursores de los mismos. Tales ARN no codificadores pueden servir como moléculas objetivo de ácido nucleico para interferencia de ARN mediada por ANci para modular la actividad del ARNf o ARNnc implicado en procesos celulares funcionales o reguladores. Por lo tanto, la actividad aberrante de ARNf o ARNnc que produce enfermedad puede ser modulada por las moléculas de ANci de la invención. Las moléculas de ANci dirigidas a ARNf y ARNnc también se pueden usar para manipular o alterar el genotipo o fenotipo de un sujeto, organismo o célula, afectando los procesos celulares tales como impresión genética, transcripción, traducción o procesamiento de ácido nucleico (por ejemplo transaminación, metilación, etc.). El gen objetivo puede ser un gen derivado de una célula, un gen endógeno, un transgen, o genes exógenos tales como los genes de un patógeno, por ejemplo un virus, que están presentes en la célula después de de la infección de la misma. La célula que contiene el gen objetivo puede derivarse o estar contenida en cualquier organismo, por ejemplo, una planta, animal, protozoario, virus, bacteria u hongo. Los ejemplos no limitativos de plantas incluyen monocotiledóneas, dicotiledóneas o gimnospermas. Los ejemplos no limitativos de animales incluyen vertebrados o invertebrados. Los ejemplos no limitativos de hongos incluyen mohos o levaduras. Para una revisión véase por ejemplo Snyder y Gerstein, 2003, Science, 300, 258-260.

La frase "secuencia homologa" se refiere a una secuencia de nucleótidos que es compartida por una o más secuencias de polinucleótido, tales como genes, transcritos de genes, o polinucleótidos no codificadores. Por ejemplo, una secuencia homologa puede ser una secuencia de nucleótidos que es compartida por dos o más genes que codifican proteínas relacionadas pero diferentes, tales como miembros diferentes de una familia de genes, epítopes de proteína diferentes, isoformas de proteína diferentes o genes completamente divergentes, tales como una citocina y sus receptores correspondientes. Una secuencia homologa puede ser una secuencia de nucleótidos que es compartida por dos o más polinucleótidos no codificadores, tales como ADN o ARN no codificador, secuencias reguladoras, intrones y sitios de control o regulación de transcripción. Las secuencias homologas también pueden incluir regiones de secuencia compartidas por más de una secuencia de polinucleótido. No es necesario que la homología sea una identidad perfecta (100%), ya que la presente invención también contempla dentro de su alcance las secuencias parcialmente homologas (por ejemplo, por lo menos 95%, 94%, 93%, 92%, 91 %, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81 %, 80%, etc.). El porcentaje de homología es el número de nucleótidos concordantes entre dos secuencias, dividido entre la longitud total que se compara, multiplicado por 100.

La frase "actividad de i-ARN mejorada" se refiere a un aumento de la actividad de i-ARN medida in vitro o in vivo, en donde la actividad de i-ARN es un reflejo tanto de la capacidad del ANci para mediar la i-ARN como de la estabilidad de los ANci de la invención. En esta invención, el producto de estas actividades se puede incrementar in vitro o in vivo en comparación con un ARNci todo ARN o un ANci que contiene una pluralidad de ribonucleótidos. En algunos casos, la actividad o estabilidad de la molécula de ANci se puede reducir (es decir, menos de 10 veces), pero la actividad general de la molécula de ANci se incrementa in vitro o in vivo.

Los términos "inhibir", "regular negativamente" o "reducir" se refieren a la reducción de la expresión del gen, o de la concentración de moléculas de ARN o moléculas equivalentes de ARN que codifican una o más proteínas o subunidades de proteína, o de la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteína, por debajo de lo observado en ausencia de las moléculas de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, ANci). La regulación negativa también puede estar asociada con silenciamiento postranscripcional, tal como el corte mediado por i-ARN o la alteración de los patrones de metilación del ADN o la estructura del ADN de la cromatina. La inhibición, regulación negativa o reducción con una molécula de ANci puede ser con respecto a una molécula inactiva, una molécula atenuada, una molécula de ANci con una secuencia revuelta, o una molécula de ANci con discordancias, o alternativamente puede ser con respecto al sistema en ausencia del ácido nucleico.

El término "mamífero" se refiere a cualquier especie de vertebrado de sangre caliente, tal como un humano, ratón, rata, perro, gato, hámster, conejillo de indias, conejo, ganado, etcétera.

La frase "inhalador dosificador" o MDI se refiere a una unidad que comprende un bote, una tapa asegurada que cubre el bote y una válvula dosificadora de formulación situada en la tapa. Los sistemas MDI incluyen un dispositivo de canalización adecuado. Los dispositivos de canalización adecuados comprenden por ejemplo un accionador de válvula y un pasaje cilindrico o cónico, a través del cual el medicamento puede ser suministrado del bote lleno a través de la válvula dosificadora a la nariz o boca de un paciente, por ejemplo un accionador de pieza bucal.

El término "microARN" o "miARN" se refiere a un ARN pequeño de doble cadena que regula la expresión de ARN mensajeros objetivo, por corte del ARNm, represión/inhibición de la traducción o silenciamiento heterocromático (véase por ejemplo Ambros, 2004, Nature, 431 , 350-355; Bartel, 2004, Cell, 1 16, 281-297; Cuiten, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He er a/., 2004, Nat. Rev. Genet, 5, 522-531 ; Ying er a/., 2004, Gene, 342, 25-28; y Setupathy et al., 2006, RNA, 12:192-197).

El término "modular" significa que la expresión del gen, o la concentración de una molécula de ARN o moléculas equivalentes de ARN que codifican una o más proteínas o subunidades de proteína, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteína, son reguladas positiva o negativamente, de tal manera que la expresión, concentración o actividad es mayor o menor que la observada en ausencia del modulador. Por ejemplo, el término "modular" puede significar "inhibir", pero el uso de la palabra "modular" no se limita a esta definición.

La frase "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que contiene una modificación de la estructura química de la base, azúcar o fosfato del nucleótido no modificado (o natural). Ejemplos no limitativos de nucleótidos modificados se describen en la presente y en USSN 12/064,015.

La frase "de bases no apareadas" se refiere a los nucleótidos cuyas bases no están apareadas entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de una molécula de ANci de doble cadena, y pueden incluir por ejemplo, sin limitación, discordancias, tramos salientes, asas de una cadena, etc.

El término "no nucleótido" o "no nucleotídíco" se refiere a cualquier grupo o compuesto que se puede incorporar en una cadena de ácido nucleico en lugar de una o más unidades de nucleótido, tal como por ejemplo porciones abásicas. El grupo o compuesto es "abásico" porque no contiene una base de nucleótido reconocida comúnmente, tal como adenosina, guanina, citosina, uracilo o timina, y por lo tanto carece de una nucleobase en la posición 1 '.

El término "nucleótido" se usa como se reconoce en la técnica. Los nucleótidos generalmente comprenden una base, un azúcar y una porción de fosfato. La base puede ser una base natural (estándar) o una base modificada como es muy conocido. Tales bases generalmente están localizadas en la posición Y de una porción de azúcar de nucleótido. Adicionalmente, los nucleótidos pueden ser no modificados o modificados en la porción de azúcar, fosfato o base (también denominados intercambiablemente análogos de nucleótido, nucleótidos modificados, nucleótidos no naturales, nucleótidos no estándares y de otras formas; véase por ejemplo USSN 12/064,015.

El término "tramo saliente" se refiere a la porción terminal de la secuencia de nucleótidos que tiene bases no apareadas entre las dos cadenas de una molécula de ácido nucleico de doble cadena (véase por ejemplo las figuras 4A-4C).

El término "parenteral" se refiere a la administración diferente de la administración a través del aparato digestivo, e incluye inyección epicutánea, subcutánea, intravascular (por ejemplo intravenosa), intramuscular o intratecal, o técnicas de infusión y similares.

La frase "objetivo de ruta" se refiere a cualquier objetivo implicado en las rutas de la expresión o actividad del gen. Por ejemplo, cualquier objetivo dado puede tener objetivos de ruta relacionados que pueden incluir genes iniciales, finales, o modificadores de una ruta biológica. Estos genes objetivo de ruta pueden proveer efectos aditivos o sinérgicos en el tratamiento de las enfermedades, condiciones y rasgos que se indican en la presente.

Una "composición farmacéutica" o "formulación farmacéutica" se refiere a una composición o formulación en una forma adecuada para su administración a una célula o sujeto que incluye por ejemplo un humano, por ejemplo administración sistémica o local. Las formas adecuadas dependen en parte del uso o la vía de entrada, por ejemplo oral, transdérmica, por inhalación o por inyección. Tales formas no deben impedir que la composición o formulación alcance la célula objetivo (es decir, una célula en la cual se busca el suministro del ácido nucleico cargado negativamente). Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que se inyectan en la corriente sanguínea deben ser solubles. Otros factores son conocidos e incluyen consideraciones tales como la toxicidad y las formas que impiden que la composición o formulación ejerza su efecto. Como se usa aquí, las formulaciones farmacéuticas incluyen formulaciones para uso humano y veterinario. Los ejemplos no limitativos de agentes adecuados para formulación con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen: inhibidores de P-glicoproteína (tales como Pluronic P85); polímeros biodegradables tales como microesferas de poli(DL-láctido-co-glicólido) para suministro de liberación sostenida (Emerich, DF et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58); y nanopartículas cargadas como las hechas de polibutilcianoacrilato. Otros ejemplos no limitativos de estrategias de suministro para las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen el material descrito por Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett, 421 , 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; y Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058. Una "composición farmacéuticamente aceptable" o "formulación farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición o formulación que permite la distribución eficiente de las moléculas de la presente invención en el sitio físico más adecuado para ejercer la actividad deseada.

El término "fosforotioato" se refiere a un enlace internucleotídico de fosfato que comprende uno o más átomos de azufre en lugar de un átomo de oxígeno. Por lo tanto, el término fosforotioato se refiere a enlaces internucleotídicos tanto de fosforotioato como de fosforoditioato.

El término "ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de una porción de ß-D-ribofuranosa.

El término "ARN" se refiere a una molécula que comprende por lo menos una porción de ribofuranósido. El término incluye ARN de doble cadena, ARN de una sola cadena, ARN aislado tal como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido por vía recombinante, y también ARN alterado que difiere del ARN natural por la adición, supresión, sustitución o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, por ejemplo, a los extremos del ANci o internamente, por ejemplo, en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos de las moléculas de ARN de la presente invención también pueden comprender nucleótidos no estándares, tales como nucleótidos no naturales o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados se pueden denominar análogos o análogos de ARN natural.

La frase "interferencia de ARN" o el término "i-ARN" se refieren al proceso biológico de inhibición o regulación negativa de la expresión de genes en una célula como se conoce generalmente en la técnica, y que es mediada por moléculas de ácido nucleico corto de interferencia; véase por ejemplo Zamore y Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524, Vaughn y Martienssen, 2005, Science, 309, 1525-1526; Zamore et al., 2000, Cell, 101 , 25-33; Bass, 2001 , Nature, 41 1 , 428-429; Elbashir et al., 2001 , Nature, 41 1 , 494-498; y Kreutzer et al., publicación internacional PCT No. WO 00/44895; Zernicka-Goetz et al., publicación internacional PCT No. WO 01/36646; Fire, publicación internacional PCT No. WO 99/32619; Plaetinck et al., publicación internacional PCT No. WO 00/01846; Mello y Fire, publicación internacional PCT No. WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, publicación internacional PCT No. WO 99/07409; y Li et al., publicación internacional PCT No. WO 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner y Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626; y Reinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831). Además, el término i-ARN se considera equivalente a otros términos usados para describir la interferencia de ARN específica de secuencia, tal como silenciamiento de gen postranscripcional, inhibición de traducción, inhibición de transcripción, o epigenética. Por ejemplo, las moléculas de ANci de la invención se pueden usar para silenciar genes epigenéticamente después de la transcripción o antes de la transcripción. En un ejemplo no limitativo, la modulación epigenética de la expresión de genes con las moléculas de ANci de la invención puede resultar de la modificación mediada por el ANci de la estructura de la cromatina o los patrones de metilación, para alterar la expresión de los genes (véase por ejemplo Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237). En otro ejemplo no limitativo, la modulación de la expresión de genes con las moléculas de ANci de la invención puede resultar del corte de ARN (ARN codificador o no codificador) mediado por ANci por medio de RISC, o por medio de inhibición de la traducción, como es conocido en la técnica; o la modulación puede resultar de la inhibición transcripcional (véase por ejemplo Janowski et al., 2005, Nature Chemical Biology, 1 , 216-222).

La frase "inhibidor de i-ARN" se refiere a cualquier molécula que puede regular negativamente, reducir o inhibir la función o actividad de interferencia de ARN en una célula u organismo. Un inhibidor de i-ARN puede regular negativamente, reducir o inhibir la i-ARN (por ejemplo, el corte mediado por i-ARN de un polinucleótido objetivo, inhibición de traducción, o silenciamiento transcripcional), por interacción o alteración de la función de cualquier componente de la ruta de i-ARN, que incluye componentes de proteína tales como RISC, o componentes de ácido nucleico como miARN o ARNci. Un inhibidor de i-ARN puede ser una molécula de ANci, una molécula de antisentido, un aptámero, o una molécula pequeña que interacciona con, o interfiere en, la función del RISC, un miARN, o un ARNci, o cualquier otro componente de la ruta de i-ARN en una célula u organismo. Como un inhibidor de i-ARN de la invención puede inhibir la i-ARN (por ejemplo, el corte mediado por i-ARN de un polinucleótido objetivo, la inhibición de traducción, o el silenciamiento transcripcional), se puede usar para modular (por ejemplo, regular positivamente o regular negativamente) la expresión de un gen objetivo.

La frase "región de sentido" se refiere a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ANci que tiene complementariedad con una región de antisentido de la molécula de ANci. Además, la región de sentido de una molécula de ANci puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con una secuencia de ácido nucleico objetivo. La región de sentido de la molécula de ANci también se puede denominar la cadena de sentido o cadena de pasajero.

Las frases "ácido nucleico corto de interferencia", "ANci", "ARN corto de interferencia", "ARNci", "molécula de ácido nucleico corto de interferencia", "molécula de oligonucleótido corto de interferencia", o "molécula de ácido nucleico corto de interferencia químicamente modificado", como se usan aquí, se refieren a cualquier molécula de ácido nucleico capaz de inhibir o regular negativamente la expresión de genes o la duplicación viral por medio de interferencia de ARN, "i-ARN", o silenciamiento de genes, de una manera específica de secuencia. Estos términos se pueden referir a moléculas de ácido nucleico individuales, a una pluralidad de dichas moléculas de ácido nucleico, o a conjuntos de dichas moléculas de ácido nucleico. El ANci puede ser una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende cadenas de sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la cadena de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y la cadena de sentido comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. El ANci puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria de dúplex, dúplex asimétrico, horquilla u horquilla asimétrica que tiene regiones de sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo separada o una porción de la misma, y la región de sentido comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. El ANci puede ser un polinucleótido circular de una sola cadena que tiene dos o más estructuras de asa y un tallo, que comprende regiones de sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y la región de sentido comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y en donde el polinucleótido circular puede ser procesado ¡n vivo o in vitro para generar una molécula de ANci activa capaz de mediar la i-ARN. El ANci también puede comprender un polinucleótido de una sola cadena que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, en donde dicha molécula de ANci no requiere la presencia dentro de la molécula de ANci de una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma), en donde el polinucleótido de una sola cadena puede comprender también un grupo fosfato terminal, tal como 5'-fosfato (véase por ejemplo Martínez et al., 2002, Cell, 1 10, 563-574, y Schwarz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568), o 5',3'-difosfato.

El término "sujeto" se refiere a un organismo al cual se le pueden administrar las moléculas de ácido nucleico de la invención. Un sujeto puede ser un mamífero o células de mamífero, que incluye un humano o células de humano. El término también se refiere a un organismo que es un donador o aceptor de células explantadas o las células mismas.

La frase "administración sistémica" se refiere a la absorción o acumulación sistémica in vivo de los fármacos en la corriente sanguínea, seguido por su distribución en todo el cuerpo.

El término "objetivo", con respecto a Bachl , se refiere a cualquier proteina, péptido o polipéptido objetivo de Bachl , como los que son codificados por los Nos. de Registro de Genbank mostrados en el cuadro 10. El término también se refiere a secuencias de ácido nucleico o secuencias de polinucleótido objetivo que codifican cualquier proteína, péptido, polipéptido objetivo, como las proteínas, péptidos o polipéptidos codificados por las secuencias que tienen los Nos. de Registro de Genbank mostrados en el cuadro 10. El objetivo de interés puede incluir secuencias de polinucleótido objetivo tales como ADN objetivo o ARN objetivo. El término "objetivo" también incluye otras secuencias tales como isoformas diferentes, genes objetivo mutantes, variantes de empalme o polinucleótidos objetivo, polimorfismos objetivo y secuencias no codificadoras (por ejemplo, ARNnc, miARN, ARNpt, ARNs) u otras secuencias de polinucleótido reguladoras que se describen en la presente.

La frase "sitio objetivo" se refiere a una secuencia dentro de un ARN objetivo que es "el blanco" del corte mediado por una construcción de ANci, que contiene secuencias dentro de su región de antisentido que son complementarias a la secuencia objetivo.

La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto o composición farmacéutica que provoca la respuesta biológica o médica en una célula, tejido, sistema, animal o humano que es buscada por el investigador, veterinario o médico.

La frase "base universal" se refiere a análogos de base de nucleótido que forman pares de bases con cada una de las bases naturales de ADN/ARN, con poca discriminación entre ellas. Los ejemplos no limitativos de las bases universales incluyen C-fenilo, C-naftilo y otros derivados aromáticos, inosina, azolcarboxamidas, y derivados de nitroazol tales como 3-nitropirrol, 4-nitroindol, 5-nitroindol y 6-nitroindol, como se conoce en la técnica (véase por ejemplo Loakes, 2001 , Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447).

La frase "nucleósido no modificado" se refiere a una de las bases adenina, citosina, guanina, timina, o uracilo, unidas al carbono 1' de ß-D-ribo-furanosa.

El término "regular positivamente" se refiere a un incremento de la expresión de un gen, o la concentración de moléculas de ARN o moléculas equivalentes de ARN que codifican una o más proteínas o subunidades de proteína, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteína, mayor que el observado en ausencia de las moléculas de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, ANci). En algunos casos, la regulación positiva o promoción de la expresión de genes con una molécula de ANci, es mayor que la observada en presencia de una molécula inactiva o atenuada. En otros casos, la regulación positiva o promoción de la expresión de genes con moléculas de ANci es mayor que la observada en presencia de, por ejemplo, una molécula de ANci con secuencia embrollada o con discordancias. En otros casos, la regulación positiva o promoción de la expresión de genes con una molécula de ácido nucleico de la presente invención, es mayor en presencia de la molécula de ácido nucleico que en su ausencia. En algunos casos, la regulación positiva o promoción de la expresión de genes está asociada con la inhibición del silenciamiento de genes mediado por ARN, tal como el corte mediado por i-ARN o el silenciamiento de un ARN objetivo codificador o no codificador que regula negativamente, inhibe o silencia la expresión del gen de interés que se quiere regular positivamente. La regulación negativa de la expresión de genes puede ser inducida, por ejemplo, por un ARN codificador o su proteína codificada, por ejemplo mediante retroalimentación negativa o efectos antagónicos. La regulación negativa de la expresión de genes puede ser inducida, por ejemplo, por un ARN no codificador que tiene control regulatorio sobre un gen de interés, por ejemplo por silenciamiento de la expresión del gen mediante inhibición de la traducción, estructura de la cromatina, metilación, corte de ARN mediado por RISC, o inhibición de la traducción. Por lo tanto, se puede usar la inhibición o regulación negativa de objetivos que regulan negativamente, suprimen o silencian un gen de interés, para regular positivamente o promover la expresión del gen de interés para uso terapéutico.

El término "vectores" se refiere a cualquier técnica basada en ácido nucleico o virus para suministrar un ácido nucleico deseado.

B. Moléculas de ANci de la invención La presente invención provee composiciones y métodos que comprenden ANci que hacen blanco en Bachl , que se pueden usar para tratar enfermedades, por ejemplo, respiratorias o inflamatorias, asociadas con Bachl En aspectos y modalidades particulares de la invención, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden las secuencias mostradas en los cuadros 1A-1 B o las figuras 2A-2F y 3A-3F. Los ANci se pueden proveer de varias maneras. Por ejemplo, el ANci se puede aislar como uno o más compuestos de ANci, o puede estar en forma de un cásete de transcripción en un plásmido de ADN. El ANci también se puede sintetizar químicamente y puede incluir modificaciones. Los ANci se pueden administrar solos o se pueden coadministrar con otras moléculas de ANci o con agentes convencionales que tratan una enfermedad o afección relacionada con Bachl .

Las moléculas de ANci de la invención se pueden usar para mediar el silenciamiento de genes, específicamente Bachl , mediante interacción con transcritos de ARN o alternativamente mediante interacción con secuencias de genes particulares, en donde dicha interacción resulta en el silenciamiento del gen, ya sea en la transcripción o después de la transcripción, por ejemplo, sin limitación, la i-ARN o por medio de procesos celulares que modulan la estructura de la cromatina o los patrones de metilación del objetivo, e impiden la transcripción del gen objetivo con la secuencia de nucleótidos del objetivo, mediando así el silenciamiento. Más específicamente, el objetivo es cualquiera de ARN, ADN, ARNm, miARN o ARNci de Bachl , o una porción de los mismos.

En un aspecto, la presente invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que comprende una primera cadena y una segunda cadena que tienen complementariedad entre sí, en donde por lo menos una cadena comprende por lo menos 15 nucleótidos de: 5'-GGAAUCCUGCUUUCAGUUU-3' (SEQ ID NO: 1); 5'-AAACUGAAAGCAGGAUUCC-3' (SEQ ID NO: 143 ); 5'-GUCUGAGUGUCCGUGGUUA-3' (SEQ ID NO: 10); 5'-UAACCACGGACACUCAGAC-3' (SEQ ID NO: 144); 5'-GCAGUUACUUCCACUCAAG-3' (SEQ ID NO: 1 1 ); 5'-CUUGAGUGGAAGUAACUGC-3' (SEQ ID NO: 145); 5'-CUACACUGCUAAACUGAUU-3' (SEQ ID NO: 15); 5'-AAUCAGUUUAGCAGUGUAG-3' (SEQ ID NO: 146); 5'-GAUUUGCAGGUGAUGUUAA-3' (SEQ ID NO: 18); 5'-UUAACAUCACCUGCAAAUC-3' (SEQ ID NO: 147); 5'-AUUUGAACCUUUAAUUCAG-3" (SEQ ID NO: 42); S'-CUGAAUUAAAGGUUCAAAU-S' (SEQ ID NO: 148); 5'-GUUAAAGGAUUUGAACCUU-3' (SEQ ID NO: 38); o 5'-AAGGUUCAAAUCCUUUAAC-3' (SEQ ID NO: 150); y en donde opcionalmente uno o más de los nucleótidos están químicamente modificados.

En algunas modalidades, los 15 nucleótidos forman un tramo contiguo de nucleótidos.

En otras modalidades, la molécula de ANci puede contener una o más supresiones, sustituciones, discordancias o adiciones de nucleótido con respecto al SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; sin embargo, con la condición de que la molécula de ANci mantenga su actividad, por ejemplo, para mediar la i-ARN. En un ejemplo no limitativo, la supresión, sustitución, discordancia o adición pueden resultar en un asa o comba, o alternativamente en un bamboleo u otro par de bases alternativo (diferente de Watson-Crick).

Estas moléculas de ANci pueden comprender regiones cortas de doble cadena de ARN. Las moléculas de ARN de doble cadena de la invención pueden comprender dos cadenas distintas y separadas que pueden ser simétricas o asimétricas y son complementarias, es decir, dos moléculas de ARN de una sola cadena, o pueden comprender una molécula de una sola cadena en la que dos porciones complementarias, por ejemplo una región de sentido y una región de antisentido, tienen sus bases apareadas, y están enlazadas covalentemente por una o más zonas de "horquilla" de una sola cadena (es decir, asas), dando como resultado, por ejemplo, un polinucleótido corto de horquilla de una sola cadena o un polinucleótido circular de una sola cadena.

El enlazador puede ser un enlazador de polinucleótido o un enlazador no nucleotídico. En algunas modalidades el enlazador es un enlazador no nucleotídico. En algunas modalidades, una molécula de ANci de horquilla o circular de la invención contiene uno o más motivos de asa, en donde por lo menos una porción de asa de la molécula de ANci es biodegradable. Por ejemplo, una molécula de ANci de horquilla de una sola cadena de la invención se diseña de tal manera que la degradación in vivo de la porción de asa de la molécula de ANci puede generar una molécula de ANci de doble cadena con tramos salientes 3'-terminales, tales como tramos salientes de nucleótido 3'-terminales que comprenden 1 , 2, 3 o 4 nucleótidos. O alternativamente, una molécula de ANci circular de la invención se diseña de tal manera que la degradación in vivo de las porciones de asa de la molécula de ANci puede generar una molécula de ANci de doble cadena con tramos salientes 3'-terminales, tales como tramos salientes de nucleótido 3'-terminales que comprenden aproximadamente 2 nucleótidos.

En las moléculas simétricas de ANci de la invención, cada cadena, la cadena de sentido (pasajero) y la cadena de antisentido (guía), son independientemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31 ,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40).

En moléculas asimétricas de ANci, la región o cadena de antisentido de la molécula es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en donde la región de sentido es de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 0 25).

En otras modalidades, las moléculas de ANci de la invención comprenden moléculas de horquilla de ANci de una sola cadena, en donde las moléculas de ANci son de aproximadamente 25 a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70).

En otras modalidades, las moléculas de ANci de la invención comprenden moléculas circulares de ANci de una sola cadena, en donde las moléculas de ANci son de aproximadamente 38 a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70).

En varias modalidades simétricas, los dúplex de ANci de la invención comprenden, independientemente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40).

En otras modalidades en donde las moléculas de ANci de la invención son asimétricas, las moléculas de ANci comprenden aproximadamente de 3 a 25 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25).

En otras modalidades en donde las moléculas de ANci de la invención son estructuras de horquilla o circulares, las moléculas de ANci comprenden de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30).

La cadena de sentido y las cadenas de antisentido, o la región de sentido y las regiones de antisentido de las moléculas de ANci de la invención, pueden ser complementarias. También, la cadena de antisentido o región de antisentido puede ser complementaria a una secuencia de nucleótidos o una porción de la misma del ARN objetivo de Bachl . La cadena de sentido o región de sentido del ANci puede comprender una secuencia de nucleótidos de un gen Bachl o una porción de la misma. En algunas modalidades la región de sentido o la cadena de sentido de una molécula de ANci de la invención es complementaria a aquella porción de la región de antisentido o cadena de antisentido de la molécula de ANci que es complementaria a una secuencia de polinucleótido objetivo de Bachl , tal como por ejemplo, sin limitación, las secuencias representadas por los Nos. de Registro de GENBANK mostrados en el cuadro 10.

En algunas modalidades, las moléculas de ANci de la invención tienen complementariedad perfecta entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ANci. En otras modalidades o en las mismas, las moléculas de ANci de la invención son perfectamente complementarias a una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente.

En otras modalidades, las moléculas de ANci de la invención tienen complementariedad parcial (es decir, menos de 100% de complementariedad) entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ANci, o entre la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ANci y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. Así, en algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico de doble cadena de la invención tienen entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40) en una cadena que son complementarios a los nucleótidos de la otra cadena. En otras modalidades, las moléculas tienen entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40) en la región de sentido, que son complementarios a los nucleótidos de la región de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena. En otras modalidades, las moléculas de ácido nucleico de doble cadena de la invención tienen entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40) en la cadena de antisentido, que son complementarios a una secuencia de nucleótidos de su molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente.

En otras modalidades, las moléculas de ácido nucleico de doble cadena de la invención tienen uno o más nucleótidos (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5 o 6) en una cadena o región que son discordantes o tienen bases no apareadas con la otra cadena o región. En otras modalidades, las moléculas de ácido nucleico de doble cadena de la invención tienen uno o más nucleótidos (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5 o 6) en cada cadena o región que son discordantes o tienen bases no apareadas con la otra cadena o región.

La invención también comprende las moléculas de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que se describen arriba en donde la primera cadena y la segunda cadena son complementarias entre sí y en donde por lo menos una cadena es hibridable con la secuencia de polinucleótido del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150, bajo condiciones de alta severidad, y en donde cualquiera de los nucleótidos no está modificado o está modificado químicamente.

Las técnicas de hibridación son muy conocidas para el experto en la materia (véase por ejemplo Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)). Las condiciones preferidas de hibridación severa incluyen incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende 50% de formamida, SSC5x (150mM de NaCI, 15mM de citrato de trisodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), solución de Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado; seguido por lavado de los filtros en SSC 0.1 x a aproximadamente 65°C.

En una modalidad específica, la primera cadena tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la otra cadena, y por lo menos una cadena es hibridable con la secuencia de polinucleótido del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150, bajo condiciones de alta severidad, y en donde cualquiera de los nucleótidos no está modificado o está modificado químicamente.

En algunas modalidades, las moléculas de ANci de la invención comprenden tramos salientes de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3 o 4). Los nucleótidos de los tramos salientes pueden ser iguales o diferentes. En algunas modalidades los tramos salientes ocurren en el extremo 3' en una o las dos cadenas de la molécula de ácido nucleico de doble cadena. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención puede comprender un tramo saliente de nucleótidos, o no nucleotídico, en el extremo 3' de la cadena guía o la cadena/región de antisentido, en el extremo 3' de la cadena de pasajero o cadena/región de sentido, o tanto en la cadena guía o cadena/región de antisentido como en la cadena de pasajero o cadena/región de sentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena.

En algunas modalidades, los nucleótidos que comprenden la porción saliente de una molécula de ANci de la invención comprenden secuencias basadas en la secuencia del polinucleótido Bachl objetivo, en donde los nucleótidos que comprenden la porción saliente de la cadena guía o cadena/región de antisentido de una molécula de ANci de la invención pueden ser complementarios a los nucleótidos de la secuencia del polinucleótido Bachl objetivo, o los nucleótidos que comprenden la porción saliente de la cadena de pasajero o cadena/región de sentido de una molécula de ANci de la invención pueden comprender los nucleótidos de la secuencia del polinucleótido Bachl objetivo. De esta manera, en algunas modalidades, la porción saliente comprende un tramo saliente de dos nucleótidos que es complementario a una porción de la secuencia del polinucleótido Bachl objetivo. Sin embargo, en otras modalidades, la porción saliente comprende un tramo saliente de dos nucleótidos que no es complementario a una porción de la secuencia del polinucleótido Bachl objetivo. En algunas modalidades, la porción saliente comprende un tramo saliente 3'-UU que no es complementario a una porción de la secuencia del polinucleótido Bachl objetivo. En otras modalidades, la porción saliente comprende un tramo saliente UU en el extremo 3' de la cadena de antisentido y un tramo saliente TT en el extremo 3' de la cadena de sentido.

En cualquiera de las modalidades de las moléculas de ANci descritas en la presente que tienen tramos salientes de nucleótidos 3'- terminales, opcionalmente los tramos salientes están modificados químicamente en una o más posiciones del azúcar, base o esqueleto del ácido nucleico. Ejemplos representativos, pero no limitativos, de los nucleótidos modificados de la porción saliente de una molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la invención, incluyen nucleótidos de 2'-0-alquilo (por ejemplo, 2'-0-metilo), 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi-2 -fluoroarabino (FANA), 4'-tio, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, base universal, acíclicos, o 5-C-metilo. En modalidades muy preferidas, los nucleótidos salientes son, cada uno independientemente, un 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-0-metil-nucleótido, 2'-desoxi-2-fluoro-nucleótido, o 2'-desoxirribonucleótido.

En otras modalidades, las moléculas de ANci de la invención comprenden moléculas de ácido nucleico dúplex con extremos rasurados (es decir, no tienen ningún tramo saliente de nucleótido), en donde los dos extremos son rasurados, o alternativamente en donde uno de los extremos es rasurado. En algunas modalidades, las moléculas de ANci de la invención pueden comprender un extremo rasurado, por ejemplo en donde el extremo 5' de la cadena de antisentido y el extremo 3' de la cadena de sentido no tienen ningún nucleótido saliente. En otro ejemplo, la molécula de ANci comprende un extremo rasurado, por ejemplo en donde el extremo 3' de la cadena de antisentido y el extremo 5' de la cadena de sentido no tienen ningún nucleótido saliente. En otras modalidades, las moléculas de ANci de la invención comprenden dos extremos rasurados, por ejemplo en donde el extremo 3' de la cadena de antisentido y el extremo 5' de la cadena de sentido, así como también el extremo 5' de la cadena de antisentido y el extremo 3' de la cadena de sentido, no tienen ningún nucleótido saliente.

En cualquiera de las modalidades o aspectos de las moléculas de ANci de la invención, la cadena de sentido o la cadena de antisentido pueden tener también un casquete, como se describe en la presente o como se conoce en la técnica, en el extremo 3', el extremo 5', o tanto en el extremo 3' como 5' de la cadena de sentido o la cadena de antisentido. O como en el caso de una molécula de ANci de horquilla, el casquete puede estar en uno o los dos extremos de los nucleótidos terminales del polinucleótido. En algunas modalidades el casquete está en uno de los dos extremos de la cadena de sentido de una molécula de ANci de doble cadena. En otras modalidades el casquete está en el extremo 5' y el extremo 3' de la cadena de antisentido (guía). En modalidades preferidas, los casquetes están en el extremo 3' de la cadena de sentido y el extremo 5' de la cadena de sentido.

Ejemplos representativos pero no limitativos de estos casquetes terminales incluyen un nucleótido abásico invertido, un desoxinucleótido abásico invertido, una porción de nucleótido invertido, un grupo mostrado en la figura 5, una modificación de glicerilo, un grupo alquilo o cicloalquilo, un heterociclo, o cualquier otro grupo que impida la actividad de i-ARN.

En cualquiera de las modalidades, las moléculas de ANci de la invención pueden tener un extremo 5'-fosfato. En algunas modalidades las moléculas de ANci carecen de fosfatos terminales.

Cualquier molécula o construcción de ANci de la invención puede comprender una o más modificaciones químicas. Las modificaciones se pueden usar para mejorar las características in vitro o in vivo tales como estabilidad, actividad, toxicidad, respuesta inmune (por ejemplo para impedir la estimulación de una respuesta de interferón, una respuesta de citocina inflamatoria o proinflamatoria, o una respuesta de receptor de tipo Toll (TIF)), o la biodisponibilidad.

El solicitante describe aquí moléculas de ANci químicamente modificadas con una actividad de i-ARN mejorada en comparación con las moléculas correspondientes de ARNci no modificadas o modificadas mínimamente. Los motivos de ANci químicamente modificados descritos en la presente proveen la capacidad de mantener una actividad de i-ARN que es sustancialmente similar al ARNci activo no modificado o modificado mínimamente (véase por ejemplo Elbashir et ai, 2001 , EMBO J., 20:6877-6888), suministrando al mismo tiempo resistencia a la nucleasa y propiedades farmacocinéticas adecuadas para usarse en aplicaciones terapéuticas.

En varias modalidades, las moléculas de ANci de la invención comprenden modificaciones en las que cualquier nucleótido presente en la cadena de sentido o antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos) son nucleótidos modificados (por ejemplo, en donde un nucleótido está modificado o todos los nucleótidos son nucleótidos modificados, o alternativamente una pluralidad de los nucleótidos (es decir, más de uno) son nucleótidos modificados. En algunas modalidades, las moléculas de ANci de la invención están modificadas parcialmente (por ejemplo, están modificados aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 nucleótidos) con modificaciones químicas. En otras modalidades, las moléculas de ANci de la invención están completamente modificadas (por ejemplo 100% modificadas) con modificaciones químicas, es decir, la molécula de ANci no contiene ningún ribonucleótido. En otras modalidades, una molécula de ANci de la invención comprende por lo menos aproximadamente 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 nucleótidos que son nucleótidos modificados. En algunas modalidades, están modificados uno o más de los nucleótidos de la cadena de sentido de las moléculas de ANci de la invención. En las mismas modalidades o en otras, están modificados uno o más de los nucleótidos de la cadena de antisentido de las moléculas de ANci de la invención.

La modificación química dentro de una sola molécula de ANci puede ser igual o diferente. En algunas modalidades por lo menos una cadena tiene por lo menos una modificación química. En otras modalidades, cada cadena tiene por lo menos una modificación química que puede ser igual o diferente, tal como modificaciones de azúcar, base o esqueleto (es decir, en el enlace internucleotídico). En otras modalidades, las moléculas de ANci de la invención contienen por lo menos 2, 3, 4, 5 o más modificaciones químicas diferentes.

Los ejemplos no limitativos de las modificaciones químicas que son adecuadas para usarse en la presente invención se describen en USSN 10/444,853, USSN 10/981 ,966, USSN 12/064,015, y las referencias ahí citadas, e incluyen modificaciones del azúcar, la base y el fosfato, modificaciones no nucleotídicas, o cualquier combinación de las mismas.

En varias modalidades, la mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprenden una modificación del azúcar. En otras modalidades, la mayoría de los nucleótidos de purina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprenden una modificación del azúcar. En algunos casos las purinas y las pirimidinas están modificadas diferencialmente en la posición del azúcar 2' (es decir, por lo menos una purina tiene una modificación diferente de por lo menos una pirimidina en la misma cadena o en una cadena diferente en la posición 2'-azúcar).

En algunas modalidades específicas de este aspecto de la invención, por lo menos un nucleótido modificado es un 2'-desoxi-2-fluoro-nucleótido, un 2'-desoxinucleótido, o un 2'-0-alquil- (por ejemplo, 2'-0-metil-) nucleótido.

En otras modalidades de la invención, por lo menos un nucleótido tiene una configuración de ribo, de Northern o de hélice de forma A (véase por ejemplo Saenger, "Principies of Nucleic Acid Structure", Springer-Verlag ed., 1984). Los ejemplos no limitativos de nucleótidos que tienen una configuración de Northern incluyen nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA) (por ejemplo, 2'-0-, 4'-C-metilen-(D-ribofuranos¡l)-nucleótidos); 2'-metoxietoxi-nucleótidos (MOE); 2'-metil-t¡o-etil-nucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-desoxi-2'-cloro-nucleótidos, 2'-azido-nucleótidos, 2'-0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-0-etil-tr¡fluorometoxi-nucleótidos, 2'-0-difluorometoxi-etoxi-nucleótidos, 4'-tio-nucleótidos y 2'-O-metil-nucleótidos.

En algunas modalidades de la invención, todos los nucleótidos de pirimidina de la región complementaria de la cadena de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina. En algunas modalidades, todos los nucleótidos de pirimidina de la región complementaria de la cadena de antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina. En algunas modalidades, todos los nucleótidos de purina de la región complementaria de la cadena de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-purina. En algunas modalidades, todas las purinas de la región complementaria de la cadena de antisentido son nucleótidos de 2'-0-metil-purina. En algunas modalidades, todos los nucleótidos de pirimidina de las regiones complementarias de la cadena de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina; todos los nucleótidos de pirimidina de la región complementaria de la cadena de antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina; todos los nucleótidos de purina de la región complementaria de la cadena de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-purina, y todas las purinas de la región complementaria de la cadena de antisentido son nucleótidos de 2'-0-metil-purina.

Cualquiera de las modificaciones arriba descritas, o combinaciones de las mismas, incluyendo las de las referencias citadas, se pueden aplicar a cualquiera de las moléculas de ANci de la invención.

Las moléculas de ANci modificadas de la invención pueden comprender modificaciones en varios sitios dentro de la molécula de ANci. En algunas modalidades, la molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende nucleótidos modificados en posiciones internas de bases apareadas dentro del dúplex de ANci. En otras modalidades, una molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende nucleótidos modificados en regiones salientes o de bases no apareadas de la molécula de ANci. En otras modalidades, una molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende nucleótidos modificados en posiciones terminales de la molécula de ANci. Por ejemplo, tales regiones terminales incluyen la posición 3' o la posición 5' de la cadena o región de sentido o antisentido de la molécula de ANci. Adicionalmente, cualquiera de las moléculas de ANci modificadas de la invención puede tener una modificación en una o las dos cadenas de oligonucleótido del dúplex de ANci, por ejemplo en la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o ambas cadenas. Además, con respecto a las modificaciones químicas de las moléculas de ANci de la invención, cada cadena de las moléculas de ANci de doble cadena de la invención puede tener una o más modificaciones químicas, de tal manera que cada cadena comprende un patrón diferente de modificaciones químicas.

En algunas modalidades, cada cadena de una molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende un patrón diferente de modificaciones químicas, tales como cualquier patrón de modificación "Stab 00"-"Stab 36" o "Stab 3F"-"Stab 36F" (cuadro 1 1 ) de la presente, o cualquier combinación de las mismas. Además, en el cuadro 1 1 se muestran ejemplos no limitativos de los esquemas de modificación que podrían producir diferentes patrones de modificaciones. Las químicas de estabilización indicadas en el cuadro 1 1 , tales como Stab, se pueden combinar con cualquier combinación de químicas de sentido/antisentido, tales como Stab 7/8, Stab 7/1 1 , Stab 8/8, Stab 18/8, Stab 18/1 1 , Stab 12/13, Stab 7/13, Stab 18/13, Stab 7/19, Stab 8/19, Stab 18/19, Stab 7/20, Stab 8/20, Stab 18/20, Stab 7/32, Stab 8/32, o Stab 18/32 (por ejemplo, cualquier ANci que tiene cadenas de sentido o antisentido Stab 7, 8, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, o 32, o cualquier combinación de las mismas). Aquí, las químicas Stab numéricas pueden incluir versiones tanto 2'-fluoro como 2'-OCF3 de las químicas mostradas en el cuadro 1 1 . Por ejemplo, "Stab 7/8" se refiere a Stab 7/8 y Stab7F/8F, etc.

En otras modalidades, uno o más nucleótidos (por ejemplo 1 , 2, 3, 4 o 5) del extremo 5' de la cadena guía o región de guia (conocida también como la cadena de antisentido o región de antisentido) de la molécula de ANci, son ribonucleótidos.

En algunas modalidades, los nucleótidos de pirimidina de la cadena de antisentido son nucleótidos de 2'-0-metil- o 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, los nucleótidos de purina presentes en la cadena de antisentido son 2'-0-metil-nucleótidos o 2'-desoxinucleótidos. En otras modalidades, los nucleótidos de pirimidina de la cadena de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, y los nucleótidos de purina presentes en la cadena de sentido con nucleótidos de 2'-O-metil- o 2'-desoxi-purina.

En las figuras 2A-2F y 3A-3F se muestran ejemplos no limitativos adicionales de las cadenas de sentido y antisentido de tales moléculas de ANci que tienen varios patrones de modificación.

En algunas modalidades de la invención, se proveen moléculas de ANci de doble cadena en donde la molécula tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido y comprenden la siguiente fórmula (A): B NX3 (?)?2 B -3' B (N)X J NX4 [N]X5 -5' (A) en donde la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; en donde la cadena de antisentido comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, o SEQ ID NO: 150; y la cadena de sentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la cadena de antisentido; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es un casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o está modificado químicamente; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 17 a 36; X4 es un entero de 11 a 35; y X5 es un entero de 1 a 6, con la condición de que la suma de X4 + X5 es 17-36.

En algunas modalidades por lo menos 15 nucleótidos forman un tramo saliente de nucleótidos contiguos.

En otras modalidades, la molécula de ANci puede contener una o más supresiones, sustituciones, discordancias o adiciones de nucleótido en el SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, o SEQ ID NO: 150; sin embargo, con la condición de que la molécula de ANci mantenga su actividad, por ejemplo, para mediar la i-ARN. En un ejemplo no limitativo, la supresión, sustitución, discordancia o adición puede dar como resultado un asa o protuberancia, o alternativamente un bamboleo u otro par de bases alternativo (diferente del tipo de Watson-Crick).

En una modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de fórmula (A); en donde: (a) uno o más nucleótidos de pirimidina en las posiciones NX4 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-O-alquil-nucleótidos, 2'-desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos; (b) uno o más nucleótidos de purina en las posiciones ??4 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-0-alquil-nucleótidos, 2'-desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos; (c) uno o más nucleótidos de pirimidina en las posiciones NX3 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-0-alquil-nucleótidos, 2'-desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos; y (d) uno o más nucleótidos de purina en las posiciones ??3 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-0-alquil-nucleótidos, 2 -desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de fórmula (A); en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones ??4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido; (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido; y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de fórmula (A); en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones ??4 es independientemente un 2'-0-alquil-nucleótido¡ (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxinucleótido.

En una modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de fórmula (A); en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones ??4 es independientemente un 2'-0-alquil-nucleótido¡ (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es independientemente un ribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de fórmula (A); en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones ??4 es independientemente un ribonucleótido; (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones ??3 es independientemente un ribonucleótido.

En algunas modalidades, las moléculas de ANci que tienen la fórmula A comprenden un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la cadena de antisentido o la región de antisentido de la molécula de ácido nucleico.

En varias modalidades, las moléculas de ANci que tienen la fórmula A comprenden X5 = 1 , 2, o 3; cada X1 y X2 = 1 o 2; X3 = 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30, y X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30.

En una modalidad específica, una molécula de ANci que tiene la fórmula A comprende X5 = 1 ; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 18.

En otra modalidad especifica, una molécula de ANci que tiene la fórmula A comprende X5 = 2; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 17.

En otra modalidad, una molécula de ANci que tiene la fórmula A comprende X5 = 3; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 16.

En algunas modalidades, las moléculas de ANci que tienen la fórmula A comprenden casquetes (B) en los extremos 3' y 5' de la cadena de sentido o región de sentido.

En algunas modalidades, las moléculas de ANci que tienen la fórmula A comprenden casquetes (B) en el extremo 3' de la cadena de antisentido o región de antisentido.

En varias modalidades, las moléculas de ANci que tienen la fórmula A comprenden casquetes (B) en los extremos 3' y 5' de la cadena de sentido o región de sentido, y casquetes (B) en el extremo 3' de la cadena de antisentido o región de antisentido.

En otras modalidades, las moléculas de ANci que tienen la fórmula A comprenden casquetes (B) solo en el extremo 5' de la cadena de sentido (superior) de la molécula de ácido nucleico de doble cadena.

En algunas modalidades, las moléculas de ANci que tienen la fórmula A también comprenden uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre el primer (N) terminal y el nucleótido adyacente en el extremo 3' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o en ambas cadenas, de sentido y antisentido, de la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de doble cadena puede comprender X1 o X2 = 2 que tienen posiciones de nucleótidos salientes con un enlace internucleotídico de fosforotioato, por ejemplo, (NsN), en donde "s" indica fosforotioato.

En algunas modalidades, las moléculas de ANci que tienen la fórmula A comprenden (N) nucleótidos en la cadena de antisentido (cadena inferior) que son complementarios a los nucleótidos de una secuencia de polinucleótido Bachl objetivo, que también tienen complementariedad con los nucleótidos N y [N] de la cadena de antisentido (inferior).

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5'- BGGAauc cu Gcuuu cAGuuuTTB -3' (Sentido) (SHQ ID NO: 43) I I I I I I I I I I I I I I ! I I I 3'- U U c c u u AG G A c G A A A G u c AA A -5' (Antisentido) (SHQ lü NO: 44) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina¡ T es timidina; A es adenosina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5'- BGucuGAGuGuccGuGGuuATTB -3' (Sentido) (SliQ ID N():61) I I I I I I I I I M I I I I I I I I 3' UUcAGAcucAcAGGcAccAAU -5' (Antisentido) (SliQ ID NO:62) en donde: cada B es un casquete abásico invertido como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; A es adenosina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'-0-metil-uridina¡ y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5' BGcAGuuAcuuccAcucAflGTTB 3 ' (Sentido) (SEQ lü NO:63) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3' UUcGucAAuGAAGGuGAGUUC 5 ' (Antisentido) (SI'Q II) NO:64) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina¡ u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; C es citidina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; L) es 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' - BcuAcAcuGcuAAScu GAuuTTB -3 ' (Sentido) (SEQ ID NO:71) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' UUGAuGuGAcGA iuuGAcUAA -5 ' (Antisentido) (SEQ ID NO:72) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluoroc¡tidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desox¡adenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; A es adenosina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-met¡l-guanosina; U es 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' - BG.4uuuGcAGGu G.¾uGuuA4TTB -3 ' (Sentido) (Sl iQ I I) N( ):77) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' UUcuAAAcGuccAcuAcAAUU - 5 ' (Antisentido) (SHQ I I) NO:78) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; A es adenosina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina¡ G es 2'-0-metil-guanos¡na; U es 2'-0-met¡l-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5'- BAuuuG AccuuuA4uuc¿GTTB -3' (Sentido) (SHQ ID NO: 125) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3' UUuAAAcuuGGAAAuuAAGUC -5' (Antisentido) (ÍS I iQ ID NO: 126) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina¡ A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; G es guanosina; U es uridina; C es citidina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2,-0-metil-guanosina; LJ es 2'-0-metil-ur¡dina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: - B Gu AAA GGA u CAAccuuTTB -3' (Sentido) (SEQ ID NO:117) I M I I I I I I I I I I I M I I I UUcAAuuuccuAAAcuuGGAA -5' (Antisentido) (SEQ ID NO: 118) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida como se muestra en la figura 10; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina¡ G es 2'-desoxiguanosina¡ T es timidina; G es guanosina; A es adenosina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'-0-met¡l-ur¡dina¡ y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

C. Generación/Síntesis de las moléculas de ANci Los ANci de la invención se pueden obtener usando varias técnicas conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo, el ANci se puede sintetizar químicamente, o puede ser codificado por un plásmido (por ejemplo transcrito como secuencias que se pliegan automáticamente en dúplex con asas de horquilla). El ANci también se puede generar por corte de un ARNdc más grande (por ejemplo ARNdc de longitud mayor de 25 nucleótidos aproximadamente) por medio de la RNasa II de E. coli o Dicer. Estas enzimas procesan el ARNdc transformándolo en ARNci biológicamente activo (véase por ejemplo Yang et al., PNAS USA 99:9942-9947 (2002); Calegari et al. PNAS USA 99:14236 (2002), Byron et al. Ambíon Tech Notes; 10 (l):4-6 (2009); Kawaski et al., Nucleic Acids Res., 31 :981-987 (2003), Knight y Bass, Science, 293:2269-2271 (2001 ), y Roberston et al., J. Biol. Chem 243:82 (1969). 1. Síntesis química Preferiblemente, el ANci de la invención se sintetiza químicamente. Los oligonucleótidos (por ejemplo algunos olígonucleótidos modificados o porciones de oligonucleótidos que carecen de ribonucleótidos) se sintetizan usando los protocolos conocidos, por ejemplo como lo describen Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 21 1 , 3-19, Thompson et al., publicación internacional de PCT No. WO 99/54459, Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61 , 33-45, y Brennan, patente de EE. UU. No. 6,001 ,311. La síntesis de los oligonucleótidos utiliza grupos comunes de protección y acoplamiento de ácido nucleico, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y fosforamiditas en el extremo 3'.

Las moléculas de ANci sin modificaciones se sintetizan usando procedimientos como los que describen Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc, 109, 7845; Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433. Estos, que usan grupos protectores y de acoplamiento de ácido nucleico comunes, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y fosforamiditas en el extremo 3', se pueden usar para algunas moléculas de ANci de la invención.

En algunas modalidades, las moléculas de ANci de la invención se sintetizan, desprotegen y analizan de acuerdo con los métodos descritos en las patentes de EE. UU. Nos. 6,995,259, 6,686,463, 6,673,918, 6,649,751 , 6,989,442, y USSN 10/190,359.

En un ejemplo de síntesis no limitativo se hacen síntesis a pequeña escala en un sintetizador 394 de Applied Biosystems Inc., usando un protocolo de escala de 0.2 pmol, con un paso de acoplamiento de 2.5 min para nucleótidos 2'-0-metilados y un paso de acoplamiento de 45 segundos para los 2'-desoxi-nucleótidos o 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos. El cuadro 12 esboza las cantidades y los tiempos de contacto de los reactivos usados en el ciclo de síntesis.

Alternativamente, las moléculas de ANci de la presente invención se pueden sintetizar separadamente y unirse entre sí después la síntesis, por ejemplo, por ligación (Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., publicación internacional de PCT No. WO 93/23569; Shabarova et al., 1991 , Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951 ; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204), o por hibridación después de la síntesis o desprotección.

Varias moléculas de ANci de la invención también se pueden sintetizar usando las enseñanzas de Scaringe et al, patentes de EE. UU. Nos. 5,889,136; 6,008,400; y 6,11 1 ,086. 2. Expresión del vector Alternativamente, las moléculas de ANci de la invención que interaccionan y regulan negativamente el gen que codifica las moléculas de Bachl objetivo pueden ser expresadas y suministradas partiendo de unidades de transcripción (véase por ejemplo Couture et al., 1996, TIC, 12, 510), insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Se pueden construir vectores virales que expresan ANci basándose, por ejemplo y sin limitación, en virus adeno-asociados, retrovirus, adenovirus, o alfavirus.

En algunas modalidades se usan construcciones basadas en pol III para expresar las moléculas de ácido nucleico de la invención. La transcripción de las secuencias de la molécula de ANci puede ser manejada desde un promotor para ARN polimerasa I (pol I), ARN polimerasa II (pol II), o ARN polimerasa III (pol III) eucarióticas (véase por ejemplo Thompson, patentes de EE. UU. Nos. 5,902,880 y 6,146,886) (véase también Izant y Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry y Lindquist, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 83, 399; Scanlon et al., 1991 , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic et al., 1992, J. Virol., 66, 1432-41 ; Weerasinghe et al., 1991 , J. Virol., 65, 5531-4; Ojwang et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver et al., 1990 Science, 247, 1222-1225; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good et al., 1997, Gene Therapy, 4, 45). Los transcritos de los promotores pol II o pol III son expresados en altas cantidades en todas las células; la concentración de un promotor pol II dado en un tipo de célula dada depende de la naturaleza de las secuencias reguladoras del gen presentes en la cercanía (incrementadores, silenciadores, etc.). También se usan promotores de ARN polimerasa procarióticos, siempre que la enzima ARN polimerasa procariótica sea expresada en las células adecuadas (Elroy-Stein y Moss, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 87, 6743-7; Gao y Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21 , 2867-72; Lieber et al., 1993, Methods Enzymol, 217, 47-66; Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37). Varios investigadores han demostrado que las moléculas de ácido nucleico expresadas de dichos promotores pueden funcionar en células de mamífero (por ejemplo Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Ojwang et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 89, 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 90, 6340-4; L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 1 1 , 441 1-8; Lisziewicz et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 90, 8000-4; Thompson et ai, 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566). Más específicamente, las unidades de transcripción tales como las derivadas de los genes que codifican ARN nuclear pequeño U6 (ARNnp) U6, ARN. de transferencia (ARNt) y ARN de adenovirus VA, son útiles para generar en las células altas concentraciones de las moléculas deseadas de ARN, tales como el ANci (Thompson et al., supra; Couture y Stinchcomb, 1996, supra; Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830; Noonberg et al., patente de EE. UU. No. 5,624,803; Good et al., 1997, Gene Ther., 4, 45; Beigelman et al., publicación internacional de PCT No. WO 96/18736. Las unidades de transcripción de ANci arriba mencionadas se pueden incorporar en una variedad de vectores para su introducción en células de mamífero, que incluyen sin limitación vectores de ADN plasmídico, vectores de ADN viral (tales como vectores de adenovirus o virus adeno-asociados), o vectores de ARN virales (tales como vectores retrovirales o alfavirus) (para una revisión véase Couture y Stinchcomb, 1996, supra).

Los vectores usados para expresar las moléculas de ANci de la invención pueden codificar una o las dos cadenas de un dúplex de ANci, o una sola cadena autocomplementaria que se autohibrida en un dúplex de ANci. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas de ANci de la presente invención se pueden enlazar operativamente de una manera que permita la expresión de la molécula de ANci (véase por ejemplo Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi y Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee et al, 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; y Novina et al., 2002, Nature Medicine, publicación adelantada en línea doi: 10.1038/nm725).

D. Vehículo/sistemas de suministro Las moléculas de ANci de la invención se añaden directamente, o se pueden unir en complejo con lípidos catiónicos, se pueden empacar dentro de liposomas, o como un plásmido recombinante o vectores virales que expresan las moléculas de ANci, o se pueden suministrar de otra manera a las células o tejidos objetivo. Los métodos para el suministro de moléculas de ácido nucleico se describen en Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; "Delivery Strategies for Antisense Oligonucleitide Therapeutics", ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Bioi, 16, 129-140; Hofland y Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; y Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192. Beigelman et al., patente de EE. UU. No. 6,395,713 y Sullivan et al., PCT WO 94/02595, describen además los métodos generales para suministrar moléculas de ácido nucleico. Estos protocolos se pueden utilizar para el suministro de virtualmente cualquier molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico se pueden administrar a las células mediante una variedad de métodos conocidos para el experto en la materia, que incluyen sin limitación encapsulación en liposomas, por iontoforesis, o por incorporación en otros vehículos tales como polímeros biodegradables, hidrogeles, ciclodextrinas (véase por ejemplo González et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang et al., publicaciones internacionales de PCT Nos. WO 03/47518 y WO 03/46185), como ácido poli-(láctico-co-glicólico) (PLGA) y microesferas de PLCA (véase por ejemplo la patente de EE. UU. 6,447,796, y la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. US 2002130430), nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, o mediante vectores proteináceos (O'Hare y Normand, publicación internacional de PCT No. WO 00/53722).

En un aspecto, la presente invención provee sistemas de vehículo que contienen las moléculas de ANci descritas en la presente. En algunas modalidades, el sistema de vehículo es un sistema de vehículo basado en lípido, lípido catiónico, o complejos de ácido nucleico de liposoma, un liposoma, micela, virosoma, una nanoparticula de lípido, o una mezcla de los mismos. En otras modalidades, el sistema de vehículo es un sistema de vehículo basado en polímero, tal como un complejo de polímero catiónico-ácido nucleico. En modalidades adicionales, el sistema de vehículo es un sistema de vehículo basado en ciclodextrina, tal como un complejo de polímero de ciclodextrina-ácido nucleico. En modalidades adicionales, el sistema de vehículo es un sistema de vehículo basado en proteína, tal como un complejo de péptido catiónico-ácido nucleico. Preferiblemente, el sistema de vehículo es una formulación de nanopartícula de lípido. Las formulaciones de nanopartícula de lípido ("LNP") se describen en el cuadro 13 y se pueden aplicar a cualquier molécula de ANci o combinación de moléculas de ANci de la presente.

En alguna modalidad, las moléculas de ANci de la invención se formulan como una composición de nanopartícula de lípido como se describe en USSN 11/353,630 y USSN 11/586,102.

En algunas modalidades, la invención presenta una composición que comprende una molécula de ANci formulada como cualquier formulación LNP-051 ; LNP-053; LNP-054; LNP-069; LNP- 073; LNP-077; LNP-080; LNP-082; LNP-083; LNP-060; LNP-061 ; LNP-086; LNP-097; LNP-098; LNP-099; LNP-100; LNP-101 ; LNP-102; LNP-103; o LNP-104 (véase el cuadro 13).

En otras modalidades la invención presenta conjugados o complejos de moléculas de ANci de la invención. Tales conjugados o complejos se pueden usar para facilitar el suministro de las moléculas de ANci a un sistema biológico tal como una célula. Los conjugados y complejos provistos por la presente invención pueden impartir actividad terapéutica transfiriendo los compuestos terapéuticos a través de las membranas celulares, alterando la farmacocinética, o modulando la localización de las moléculas de ácido nucleico de la invención. Ejemplos no limitativos de dichos conjugados se describen en USSN 10/427,160 y USSN 10/201 ,394; y en las patentes de EE. UU. Nos. 6,528,631 ; 6,335,434; 6, 235,886; 6,153,737; 5,214,136; 5,138,045.

En varias modalidades se puede unir covalentemente polietilenglicol (PEG) a los compuestos de ANci de la presente invención. El PEG añadido puede ser de cualquier peso molecular, de preferencia de aproximadamente 100 a aproximadamente 50,000 daltons (Da).

En otras modalidades, la invención presenta composiciones o formulaciones que comprenden liposomas modificados en superficie que contienen lipidos de poli(etilenglicol) (liposomas modificados con PEG, o liposomas de circulación prolongada, o liposomas escondidos) y moléculas de ANci de la invención, como se describe por ejemplo en la publicación internacional de PCT No. WO 96/10391 ; Ansell et al, la publicación internacional de PTC No. WO 96/10390; Holland et al, publicación internacional de PTC No. WO 96/10392).

En algunas modalidades, las moléculas de ANci de la invención también se pueden formular o unir en complejo con polietilenimina y sus derivados, tales como derivados de polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL), o polietilenimina-polietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-triGAL). En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención se formulan como se describe en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 20030077829.

En otras modalidades, las moléculas de ANci de la invención se unen en complejo con agentes de rompimiento de membrana como los que se describen en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 20010007666. En otras modalidades, el agente o agentes de rompimiento de membrana y la molécula de ANci también están unidos en complejo con un lípido catiónico o una molécula de lípido ayudadora, como los lípidos descritos en la patente de EE. UU. No. 6,235,310.

En algunas modalidades, las moléculas de ANci de la invención se unen en complejo con sistemas de suministro como los que se describen en las publicaciones de las solicitudes de patente de EE. UU. Nos. 2003077829; 20050287551 ; 20050164220; 20050191627; 200501 18594; 20050153919; 20050085486; y 20030158133; y las publicaciones internacionales de PCT Nos. WO 00/03683 y WO 02/087541.

En algunas modalidades, una formulación liposómica de la invención puede comprender una molécula de ANci de la invención (por ejemplo, ANci) formulada o en complejo con los compuestos y composiciones descritos en las patentes de EE. UU. Nos 6,858,224; 6,534,484; 6,287,591 ; 6,835,395; 6,586,410; 6,858,225; 6,815,432; 6,586,001 ; 6,120,798; 6,977,223; 6,998,115; 5,981 ,501 ; 5,976,567; 5,705,385; y las publicaciones de las solicitudes de patente de EE. UU. Nos. 2006/0019912; 2006/0019258; 2006/0008909; 2005/0255153; 2005/0079212; 2005/0008689; 2003/0077829, 2005/0064595, 2005/0175682, 2005/01 18253; 2004/0071654; 2005/0244504; 2005/0265961 y 2003/0077829.

Alternativamente, se pueden usar plásmidos recombinantes y vectores virales, como se expone arriba, que expresan el ARNci de la invención, para suministrar las moléculas de la invención. El suministro de vectores que expresan la molécula de ANci puede ser sistémico, por ejemplo por medio de administración intravenosa o intramuscular, por administración a las células objetivo explantadas de un sujeto, seguido por su reintroducción al sujeto, o por medio de cualquier otro método que permita la introducción en la célula objetivo deseada (para una revisión véase Couture er al, 1996, 77G., 12, 510). Tales plásmidos recombinantes también se pueden administrar directamente o en conjunto con reactivos de suministro adecuados que incluyen por ejemplo el reactivo lipofílico Mirus Transit LT1 ; lipofectina; lipofectamina; celfectina; policationes (por ejemplo polilisina), o sistemas de vehículo basados en lípido de liposoma, lípido catiónico, o complejos de ácido nucleico y liposoma, una micela, un virosoma, una nanopartícula de lípido.

E. kits La presente invención también provee ácidos nucleicos en forma de un kít. El kit puede comprender un recipiente. El kit normalmente contiene un ácido nucleico de la invención con instrucciones para su administración. En algunos casos los ácidos nucleicos pueden tener añadida una porción de direccionamiento. Los métodos para añadir porciones de direccionamiento (por ejemplo, anticuerpos, proteínas) son conocidos para los expertos en la materia. En algunos casos los ácidos nucleicos están químicamente modificados. En otras modalidades, el kít contiene más de una molécula de ANci de la invención. Los kits pueden comprender una molécula de ANci de la invención con un vehículo o díluente farmacéuticamente aceptable.

Además, los kits pueden comprender excipientes.

F. Usos terapéuticos/composiciones farmacéuticas El presente cuerpo de conocimiento en la investigación de Bachl indica la necesidad de métodos para probar la actividad de Bachl , y de compuestos que puedan regular la expresión de Bachl para su uso en investigación, diagnóstico y terapia. Como se describe más abajo, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden usar en pruebas para diagnosticar el estatus de una enfermedad relacionada con los niveles de Bachl . Además, las moléculas de ácido nucleico y las composiciones farmacéuticas se pueden usar para tratar enfermedades relacionadas con los niveles de Bachl . 1. Enfermedades asociadas con Bachl Las enfermedades particulares que se pueden asociar con la modulación de la expresión de Bachl incluyen, sin limitación, enfermedades, rasgos, afecciones y fenotipos respiratorios, inflamatorios y autoinmunes. Los ejemplos no limitativos de dichas enfermedades o indicaciones incluyen la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma, tos eosinofílica, bronquitis, rechazo agudo y crónico de aloinjerto de pulmón, sarcoidosls, fibrosis pulmonar, rinitis y sinusitis. Cada una de las enfermedades respiratorias inflamatorias está caracterizada por la presencia de mediadores que recluían y activan diferentes células inflamatorias, que liberan enzimas o radicales de oxigeno que causan síntomas, persistencia de inflamación y, cuando son crónicas, la destrucción o rompimiento del tejido normal.

Se entiende que las moléculas de ANci de la invención pueden degradar el ARNm de Bachl objetivo (y así inhibir las enfermedades arriba indicadas). La inhibición de una enfermedad se puede evaluar midiendo directamente el avance de la enfermedad en un sujeto. También se puede inferir observando un cambio o reversión de una condición asociada con la enfermedad. Adicionalmente, las moléculas de ANci de la invención se pueden usar como una profilaxis. De esta manera, el uso de las moléculas de ácido nucleico y las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden usar para mejorar, tratar, prevenir o curar estas enfermedades y otras asociadas con la regulación de Bachl . 2. Composiciones farmacéuticas Las moléculas de ANci de la presente invención proveen útiles reactivos y métodos para una variedad de aplicaciones terapéuticas, profilácticas, cosméticas, veterinarias, diagnósticas, de validación de objetivo, descubrimiento genómico, ingeniería genética y farmacogenómica. a. Formulaciones Así, la presente invención, en un aspecto, también provee composiciones farmacéuticas de las moléculas de ANci descritas. Estas composiciones farmacéuticas incluyen sales de los compuestos anteriores, por ejemplo sales de adición de ácido, por ejemplo sales de ácido clorhídrico, bromhídrico, acético y bencenosulfóníco. Estas formulaciones farmacéuticas o composiciones farmacéuticas pueden comprender un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 143. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 10. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 144. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 1. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 145. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 15. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 146. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 18. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 147. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 42. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 148. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 38. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 150. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende los SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende los SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende los SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende los SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende los SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende los SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende los SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 118. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ANci que comprende la fórmula (A).

Las moléculas de ANci de la invención se formulan preferiblemente como composiciones farmacéuticas antes de su administración a un sujeto, de acuerdo con las técnicas conocidas. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se caracterizan por ser por lo menos parcialmente estériles y libres de pirógenos. Los métodos para preparar una composición farmacéutica de la invención son del dominio del experto en la materia, por ejemplo como se describe en "Remington's Pharmaceutical Science", 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985).

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo) también comprenden excipientes o aditivos farmacéuticos convencionales. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen conservadores, saborizantes, estabilizadores, antioxidantes, agentes ajustadores de osmolalidad, amortiguadores y agentes ajustadores de pH. Los aditivos adecuados incluyen amortiguadores fisiológicamente compatibles (por ejemplo clorhidrato de trimetilamina), adición de quelantes (tales como por ejemplo DTPA o DTPA-bisamida), o complejos de quelato de calcio (tales como por ejemplo DTPA de calcio, CaNaDTPA-bisamida), u opcionalmente adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo, cloruro de calcio, ascorbato de calcio, gluconato de calcio o lactato de calcio). Además se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.

Los ejemplos no limitativos de varios tipos de formulaciones para administración local incluyen ungüentos, lociones, cremas, geles, espumas, preparados para suministro por medio de parches transdérmicos, polvos, preparados para atomizar, aerosoles, cápsulas o cartuchos para usarse en un inhalador o insuflador, o gotas (por ejemplo gotas oftálmicas o nasales), soluciones/suspensiones para nebulización, supositorios, pesarios, enemas de retención y tabletas o pildoras masticables o chupables (por ejemplo para el tratamiento de úlceras aftosas), o preparados de liposoma o de microencapsulación.

Ungüentos, cremas y geles se pueden formular, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adición de un agente espesante o gelificante, o disolventes. Los ejemplos no limitativos de dichas bases pueden incluir, por ejemplo, agua o un aceite tal como parafina líquida o un aceite vegetal como el aceite de cacahuate o aceite de ricino, o un disolvente tal como polietilenglicol. Los agentes espesantes y los agentes gelificantes se pueden usar de acuerdo con la naturaleza de la base. Los ejemplos no limitativos de dichos agentes incluyen parafina blanda, estearato de aluminio, alcohol cetoestearílico, polietilenglicoles, grasa de lana, cera de abejas, carboxipolimetileno y derivados de celulosa, o monoestearato de glicerilo, o agentes emulsionantes no iónicos.

En una modalidad se pueden formular lociones con una base acuosa u oleosa y en general también contendrán uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizadores, agentes dispersantes, agentes de suspensión o agentes espesantes.

En una modalidad se pueden formar polvos para aplicación externa con la ayuda de cualquier base de polvo adecuada, por ejemplo talco, lactosa o almidón. Las gotas se pueden formular con una base acuosa o no acuosa que también comprende uno o más agentes dispersantes, agentes solubilizantes, agentes de suspensión o conservadores.

Las composiciones destinadas a uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y dichas composiciones pueden contener uno o más de dichos agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes o conservadores, para proveer preparaciones farmacéuticamente elegantes y aceptables. Las tabletas contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes inocuos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la fabricación de tabletas. Estos excipientes pueden ser por ejemplo diluentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes de granulación y desintegración, por ejemplo almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o acacia; y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden ser descubiertas o se pueden recubrir mediante las técnicas conocidas. En algunos casos dichos recubrimientos se pueden preparar mediante las técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal, y así proveer una acción sostenida durante un periodo prolongado. Por ejemplo, se puede usar un material de retraso tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura, en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluente sólido inerte, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda, en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina liquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirolidona, goma de tragacanto y goma acacia; los agentes dispersantes o de mojado pueden ser un fosfátido natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo polioxietilen estearato, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena grande, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, tal como un monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservadores, por ejemplo p-hidroxibenzoato de etilo, o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Se pueden formular suspensiones oleosas suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de ajonjolí o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Los agentes edulcorantes y los agentes saborizantes se pueden añadir para proveer preparaciones orales aceptables. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral, o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo goma acacia o goma tragacanto, fosfátidos naturales, por ejemplo soya, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y saborizantes.

Los jarabes y elíxires se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol, sorbitol, glucosa o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un emoliente, un conservador y agentes saborizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes dispersantes o de mojado y los agentes de suspensión adecuados que se mencionaron ya anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluente o disolvente inocuo aceptable para uso parenteral, por ejemplo una solución en 1 ,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden usar están el agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se usan aceites fijos estériles como medio disolvente o de suspensión. Para este propósito se puede usar cualquier aceite fijo blando que incluye mono- o diglicéridos sintéticos.

Además en la preparación de inyectables se pueden usar ácidos grasos tales como ácido oleico.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención también se pueden administrar en forma de supositorios, por ejemplo para administración rectal del fármaco. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a la temperatura ordinaria pero líquido a la temperatura rectal, y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao y polietilenglicoles.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden administrar por vía parenteral en un medio estéril. El fármaco, dependiendo del vehículo y la concentración usada, se puede suspender o disolver en el vehículo. Ventajosamente se pueden disolver en el vehículo adyuvantes tales como anestésicos locales, conservadores, y agentes amortiguadores.

En otras modalidades, las composiciones y formulaciones de ANci y LNP provistas en la presente para usarse en el suministro pulmonar comprenden también uno o más agentes tensoactivos. Los agentes tensoactivos o componentes tensoactivos adecuados para mejorar la incorporación de las composiciones de la invención, incluyen formas sintéticas y naturales, completas y truncadas, de proteina A tensoactiva, proteina B tensoactiva, proteína C tensoactiva, proteína D tensoactiva y proteína E tensoactiva, fosfatidilcolina di-saturada (diferente de dipalmitoilo), dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina; ácido fosfatídico, ubiquinonas, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilcolina, palmitoil-lisofosfatidilcolina, deshidroepiandrosterona, dolicoles, ácido sulfatídico, glicerol-3-fosfato, dihidroxiacetona fosfato, glicerol, glicero-3-fosfocolina, dihidroxiacetona, palmitato, difosfato de citidina (CDP), diacilglicerol, CDP colina, colina, fosfato de colina; así como también cuerpos laminares naturales o artificiales que son los vehículos portadores naturales de los componentes tensoactivos, ácidos grasos omega 3, ácido poliénico, ácido polienoico, lecitina, ácido palmitínico, copolímeros de bloque no iónicos de óxidos de etileno o propileno, polioxipropileno, monomérico y polimérico, polioxietileno, monomérico y polimérico, poli(vinilamina) con cadenas laterales de dextrano o alcanoilo, Brij 35, Tritón X-100, y los tensoactivos sintéticos ALEC, Exosurf, Survan y Atovaquone, entre otros. Estos agentes tensoactivos se pueden usar solos o como parte de un componente tensoactivo múltiple en una formulación, o como adiciones unidas covalentemente a los extremos 5' o 3' del componente de ácido nucleico de una composición farmacéutica de la presente. b. Combinaciones El compuesto o las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden administrar solos a un sujeto, o se pueden usar en combinación con, o incluir uno o más de, otros agentes terapéuticos, por ejemplo seleccionados de agentes antiinflamatorios, agentes anticolinérgicos (particularmente un antagonista del receptor agonistas del adrenorreceptor ß2, agentes antiinfecciosos tales como antibióticos, antivirales, o antihistamínicos. Así, la invención provee, en una modalidad adicional, una combinación que comprende una molécula de ANci de la invención, por ejemplo y sin limitación, una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con uno o más de otros agentes terapéuticos, por ejemplo seleccionados de un agente antiinflamatorio como un corticosteroide o un AINE, un agente anticolinérgico, un agonista del adrenorreceptor ß2, un agente antiinfeccioso tal como un antibiótico o un antiviral, o un antihistamínico. Otras modalidades de la invención abarcan combinaciones que comprenden una molécula de ANci de la invención que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional de los mismos, junto con un agonista del adrenorreceptor ß2, o un anticolinérgico, o un inhibidor de Bachl , o un antihistamínico.

En una modalidad, la invención abarca una combinación que comprende una molécula de ANci de la invención junto con un agonista del adrenorreceptor ß2. Los ejemplos no limitativos de los agonistas del adrenorreceptor ß2 incluyen salmeterol (que puede ser un racemato o un solo enantiómero tal como el enantiómero R), salbutamol (que puede ser un racemato o un solo enantiómero, tal como el enantiómero R), formoterol (que puede ser un racemato o un solo diasterómero tal como el diasterómero R,R), salmefamol, fenoterol, carmoterol, etanterol, naminterol, clenbuterol, pirbuterol, flerbuterol, reproterol, bambuterol, indacaterol, terbutalina y sus sales, por ejemplo la sal de xinafoato (1-hidroxi-2-naftalenocarbox¡lato) del salmeterol, la sal de sulfato o la base libre de salbutamol, o la sal fumarato de formoterol. En una modalidad, los agonistas del adrenorreceptor ß2 son agonistas del adrenorreceptor ß2 de acción prolongada, por ejemplo compuestos que proveen una broncodilatación eficaz durante aproximadamente 12 horas o más.

Otros agonistas del adrenorreceptor ß2 incluyen los que se describen en WO 02/066422, WO 02/070490, WO 02/076933, WO 03/024439, WO 03/072539, WO 03/091204, WO 04/016578, WO 2004/022547, WO 2004/037807, WO 2004/037773, WO 2004/037768, WO 2004/039762, WO 2004/039766, WO01/42193 y WO03/042160.

Los ejemplos adicionales de agonistas del adrenorreceptor ß2 incluyen 3-(4-{[6-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}amino)-hexil]oxi}butil)bencenosulfonamida; 3-(3-{[7-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-hidroximetil)fenil]etil}-amino)heptil]oxi}propil)bencenosulfonamida; 4-{(1 R)-2-[(6-{2-[(2,6-diclorobencil)oxi]etoxi}hexil)amino]-1-hidroxietil}-2-(hidroximetil)fenol; 4-{(1 R)-2-[(6-{4-[3-(ciclopentilsulfonil)fenil]butoxi}-hexil)amino]-1-hidroxietil}-2-(hidroximetil)fenol; N-[2-hidroxil-5-[(1 R)-1-hidroxi-2-[[2-4-[[(2R)-2-hidroxi-2-feniletil]amino]fenil]etil]amino]etil]fenil]formamida; N-2{2-[4-(3-fenil-4-metoxifenil)aminofenil]etil}-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2(1 H)-quinolinon-5-il)etilamina; y 5-[(R)-2-(2-{4-[4-(2-amino-2-metil-propoxi)-fenilamino]-fenil}-etilamino)-1-hidroxi-etil]-8-hidroxi-1 H-quinolin-2-ona.

En una modalidad, el agonista del adrenorreceptor ß2 puede estar en forma de una sal formada con un ácido farmacéuticamente aceptable seleccionado de ácido sulfúrico, clorhídrico, fumárico, hidroxinaftoico (por ejemplo 1- o 3-hidroxi-2-naftoico), cinámico, cinámico sustituido, trifenilacético, sulfámico, naftalenoacrílico, benzoico, 4-metoxibenzoico, 2- o 4-hidroxibenzoico, 4-clorobenzoico y 4-fenilbenzoico.

Los agentes antiinflamatorios adecuados también incluyen los corticosteroides. Los ejemplos de corticosteroides que se pueden usar en combinación con los compuestos de la invención son los corticosteroides orales e inhalados y sus profármacos que tienen actividad antiinflamatoria. Los ejemplos no limitativos incluyen metilprednisolona, prednisolona, dexametasona, propionato de fluticasona, éster S-fluorometilo del ácido 6a,9a-difluoro-1 i -hidroxi-16a-metil-17a-[(4-metil-1 ,3-tiazol-5-carbonil)oxi]-3-oxo-androsta-1,4-dieno-17 -carbotioico, éster S-fluorometilo del ácido 6a, 9a-difluoro-17a-[(2-furanilcarbonil)oxi]-1 i p-hidroxi-16a-metil-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-17P-carbotioico (furoato de fluticasona), éster de S-(2-oxo-tetrahidrofuran-3S-il) del ácido 6a,9a-difluoro-11 p-hidroxi-16a-metil-3-oxo-17a-propioniloxi-androsta-1 ,4-dieno-17P-carbotioico, éster S-cianometilo del ácido 6a,9a-difluoro-11p-hidroxi-16a-metil-3-oxo-17a-(2,2,3,3-tetrametil-ciclopropilcarbonil)oxi-androsta-1 ,4-dieno-17 -carbotioico y éster S-fluorometilo del ácido 6a,9a-difluoro-1 i -hidroxi-16a-metil-17a-(1-metilciclopropilcarbonil)oxi-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-17 -carbotioico, ésteres de beclometasona (por ejemplo el éster 17-propionato o el éster 17,21-dipropionato), budesonida, flunisolida, ésteres de mometasona (por ejemplo, furoato de mometasona), triamcinolona acetonida, rofleponida, ciclesonida ( 6a,17-[[(R)-ciclohexilmetilen]bis(oxi)]-1 i p,21-dihidroxi-pregna-1 ,4-dieno-3,20-diona), propionato de butixocort, RPR-106541 , y ST-126. En una modalidad, los corticosteroides incluyen propionato de fluticasona, éster S-fluorometilo de ácido 6a,9a-difluoro- ip-hidroxi-16a-metil-17a-[(4-metil-1 ,3-tiazol-5-carbon¡l)oxi]-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno- 7p-carbotioico, éster S-fluorometilo del ácido 6a,9a-difluoro-17a-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11 ß-hidroxi-16a-metil-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-17P-carbotioico, éster S-cianometilo del ácido 6a,9a-difluoro-1 1 ß-hidroxi-l 6a-metil-3-oxo-17a-(2,2,3,3-tetrametilciclopropilcarbonil)oxi-androsta-1 ,4-dieno-17p-carbotioico, y éster S-fluorometilo del ácido 6a,9a-difluoro-1 i p-hidroxi-16a-metil-17a-(1-metilciclopropilcarbonil)oxi-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-17p-carbotioico. En una modalidad, el corticosteroide es el éster S-fluorometilo del ácido 6a, 9a-difluoro-17a-[(2-furanilcarbonil)oxi]-1 1 -hidroxi-16a-metil-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-17 -carbotioico. Los ejemplos no limitativos de los corticosteroides incluyen los descritos en las siguientes solicitudes de patente y patentes publicadas: WO02/088167, WO02/ 00879, WO02/12265, WO02/12266, WO05/005451 , WO05/005452, WO06/072599 y WO06/072600.

En una modalidad, son combinaciones que comprenden moléculas de ANci de la invención y compuestos no esteroideos que tienen agonismo de glucocorticoide que pueden tener selectividad por la transrepresión sobre la transactivación, tales como los compuestos no esteroideos descritos en las siguientes solicitudes de patente y patentes publicadas: WO03/082827, W098/54159, WO04/005229, WO04/009017, WO04/018429, WO03/104195, WO03/082787, WO03/082280, WO03/059899, WO03/101932, WO02/02565, WO01/16128, WO00/66590, WO03/086294, WO04/026248, WO03/06 651 , WO03/08277, WO06/000401 , WO06/000398 y WO06/015870.

Los ejemplos no limitativos de otros agentes antünflamatorios que se pueden usar en combinación con las moléculas de ANci de la invención incluyen los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINES).

Los ejemplos no limitativos de AINES incluyen cromoglicato de sodio, nedocromil de sodio, inhibidores de fosfodiesterasa (PDE) (por ejemplo teofilina, inhibidores de PDE4 o inhibidores mixtos de PDE3/PDE4), antagonistas de leucotrieno, inhibidores de la síntesis de leucotrieno (por ejemplo montelukast), inhibidores de ¡NOS, inhibidores de triptasa y elastasa, antagonistas de integrina beta 2 y agonistas o antagonistas del receptor de adenosina (por ejemplo agonistas de adenosina 2a), antagonistas de citocina (por ejemplo antagonistas de quimocina tales como un antagonista de CCR3), o inhibidores de la síntesis de citocina, o inhibidores de 5-lipooxigenasa. En una modalidad, la invención abarca inhibidores de ¡NOS (óxido nítrico sintasa ¡nducible) para administración oral. Los ejemplos de los inhibidores de ¡NOS incluyen los que se describen en las siguientes patentes y solicitudes de patente internacionales publicadas: WO93/13055, WO98/30537, WO02/50021 , W095/34534 y W099/62875. Los ejemplos de inhibidores de CCR3 incluyen los que se describen en WO02/26722.

Los compuestos incluyen ácido cis-4-ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan-1-carboxílíco, 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1 -ona y cis-[4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-d¡fluorometoxifen¡l)ciclohexan-1-ol]. También el ácido cis-4-ciano-4-[3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil]ciclohexano-1-carboxílico (conocido también como cilomilast), y sus sales, ésteres, profármacos o formas físicas que se describen en la patente de EE. UU. 5,552,438.

Otros compuestos incluyen AWD-12-281 de Elbion (Hofgen, N. et al. 15° EFMC Int Symp Med Chem (6-10 septiembre, Edinburgh) 1998, Resumen p. 98; referencia CAS No. 247584020-9); un derivado de 9-benciladenina denominado NCS-613 (INSERM); D-4418 de Chiroscience y Schering-Plough; un inhibidor de PDE4 de benzodiazepina identificado como CI-1018 (PD- 168787) y atribuido a Pfizer; un derivado de benzodioxol descrito por Kyowa Hakko en W099/16766; K-34 de Kyowa Hakko; V-1 1294A de Napp (Landells, LJ. et al. Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (19-23 septiembre, Génova) 1998] 1998, 12 (Supl. 28): Resumen p. 2393); roflumilast (referencia CAS No 162401-32-3) y una ptalazinona (WO99/47505, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia) de Byk-Gulden; Pumafentrine, (-)-p-[(4aR*,10bS*)-9-etoxi-1 ,2, 3,4,4a, 10b-hexahidro-8-metoxi-2-metilbenzo[c][1 ,6]naftiridin-6-il]-N,N-diisopropilbenzamida, que es un inhibidor mixto de PDE4/PDE3 que ha sido preparado y revelado por Byk-Gulden, ahora Altana; arofilina bajo desarrollo por Almirall-Prodesfarma; VM554/UM565 de Vernalis; o T-440 (Tanabe Seiyaku; Fuji, K. et al. J Pharmacol Exp Ther, 1998, 284(1 ): 162), y T2585. Compuestos adicionales se describen en las solicitudes de patente internacional publicadas WO04/024728 (Glaxo Group Ltd), WO04/056823 (Glaxo Group Ltd) y WO04/103998 (Glaxo Group Ltd).

Ejemplos de agentes contra la fibrosis quística que se pueden usar en combinación con los compuestos de la invención incluyen, sin limitación, compuestos tales como Tobi® y Pulmozyme®.

Los ejemplos de agentes anticolinérgicos que se pueden usar en combinación con los compuestos de la invención son los compuestos que actúan como antagonistas en los receptores muscarínicos, en particular los compuestos que son antagonistas de los receptores M1 o M3, antagonistas dobles de los receptores M1/M3 o M2/M3, o pan-antagonistas de los receptores M1/M2/M3. Los compuestos ejemplares para su administración mediante inhalación incluyen ipratropio (por ejemplo como el bromuro, CAS 22254-24-6, vendido con el nombre Atrovent), oxitropio (por ejemplo como el bromuro, CAS 30286-75-0) y tiotropio (por ejemplo como el bromuro, CAS 136310-93-5, vendido con el nombre Spiriva). También son de interés el revatropato (por ejemplo como el bromhidrato, CAS 262586-79-8) y LAS-34273 que se describe en WO 01/041 18. Los compuestos ejemplares para administración oral incluyen pirenzepina (CAS 28797-61-7), darifenacina (CAS 133099-04-4, o CAS 133099-07-7 para el bromhidrato, vendido con el nombre Enablex), oxibutinina (CAS 5633-20-5, vendido con el nombre Ditropan), terodilina (CAS 15793-40-5), tolterodina (CAS 124937-51-5 o CAS 124937-52-6 para el tartrato, vendido con el nombre Detrol), otilonio (por ejemplo como el bromuro, CAS 26095-59-0, vendido con el nombre Spasmomen), cloruro de trospio (CAS 10405-02-4) y solifenacina (CAS 242478-37-1 , o CAS 242478-38-2 para el succinato, conocido también como YM-905 y vendido con el nombre Vesicare).

Otros agentes anticolinérgicos incluyen los compuestos de la fórmula (XXI) que se describen en la solicitud de patente de EE. UU. 60/487981 : en la cual la orientación preferida de la cadena de alquilo unida al anillo de tropano es endo; R31 y R32 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo inferior de cadena recta o ramificada que tienen preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono, grupos cicloalquilo que tienen 5 o 6 átomos de carbono, cicloalquil-alquilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, 2-tienilo, 2-piridilo, fenilo, fenilo sustituido con un grupo alquilo que no tiene más de 4 átomos de carbono, y fenilo sustituido con un grupo alcoxi que no tiene más de 4 átomos de carbono; X" representa un anión asociado con la carga positiva del átomo de N. X" puede ser, sin limitación, cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bencenosulfonato y toluenosulfonato. Los ejemplos de la fórmula XXI incluyen, sin limitación, bromuro de (3-endo)-3-(2,2-di-2-tieniletenil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.2.1 ]octano; bromuro de (3-endo)-3-(2,2-difeniletenil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.2.1]octano; 4-metilbencenosulfonato de (3-enc/o)-3-(2,2-difeniletenil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.21]octano; bromuro de (3-endo)-8,8-dimet¡l-3-[2-fen¡l-2-(2-tienil)etenil]-8-azoniabiciclo[3.2.1]octano; o bromuro de (3-enc/o)-8,8-dimetil-3-[2-fenil-2-(2-piridinil)etenil]-8-azoniabiciclo[3.21]octano.

Agentes anticolinérgicos adicionales incluyen los compuestos de las fórmulas (XXII) o (XXIII) que se describen en la solicitud de patente de EE.

UU. 60/51 1009: (XXIII) en donde: el átomo de H indicado está en la posición exo; R' 41 representa un anión asociado con la carga positiva del átomo de N. R41 puede ser, sin limitación, cloro, bromo, yodo, sulfato, bencenosulfonato y toluenosulfonato; R42 y R43 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo inferior de cadena recta o ramificada (que tienen preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono), grupos cicloalquilo (que tienen de 5 a 6 átomos de carbono), cicloalquil-alquilo (que tiene de 6 a 10 átomos de carbono), heterocicloalquilo (que tiene 5 o 6 átomos de carbono) y N u O como el heteroátomo, heterocicloalquil-alquilo (que tiene de 6 a 10 átomos de carbono) y N u O como el heteroátomo, arilo, arilo sustituido opcionalmente, heteroarilo y heteroarilo sustituido opcionalmente; R44 se selecciona del grupo que consiste en: alquilo de CrC6, cicloalquilo de C3-C12, heterocicloalquilo de C3-C7, alqui Ci-CeJ-cicloalquilo de C3-C12, alqui d-CeJ-heterocicloalquilo de C3-C7, arilo, heteroarilo, alquil(Ci-C6)-ar¡lo, alquil(Ci-C6)-heteroarilo, -OR45 CH2OR45, -CH2OH, -CN, -CF3, -CH20(CO)R46, -C02R47, -CH2NH2, CH2N(R47)S02R45, -S02N(R47)(R48), -CON(R47)(R48), -CH2N(R 8)CO(R46), CH2N(R48)S02(R46), -CH2N(R48)C02(R45), -CH2N(R48)CONH(R47); R45 selecciona del grupo que consiste en alquilo de C C6, alquilo(C C6)-cicloalquilo de C3-C12, alquil(C-i-C6)-heterocicloalqu¡lo de C3-C7, alquil(Ci-C6)-arilo, alquil(C-i-C6)-heteroarilo; R46 se selecciona del grupo que consiste en alquilo de C-i-C6, cicloalquilo de C3-C12, heterocicloalquilo de C3-C7, alquil(C Ce)-cicloalquilo de C3-C12, alquil(C C6)- eterocicloalquilo de C3-C7, arilo, heteroarilo, alquil(CrC6)-arilo, alquil(CrC6)-heteroarilo¡ R47 y R48 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo de C Ce, cicloalquilo de C3-C12, heterocicloalquilo de C3-C7, alquil(CrC6)-cicloalquilo de C3-C12, alquil(C C6)-heterocicloalquilo de C3-C7, alquil(C C6)-arilo y alquil(CrC6)-heteroarilo; ejemplos representativos pero no limitativos incluyen: yoduro de (endo)-3-(2-metoxi-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; 3-((eA7do)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propionitrilo; (endo)-8-metil-3-(2,2,2-trifenil-etil)-8-azabiciclo[3.2.1]octano; 3-((endo)-8-metil-8-azab¡c¡clo[3.2.1 ]oct-3-il)-2,2-difenil-propionamida; ácido 3-((er7do)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propiónico; yoduro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; bromuro de (eA7do)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; 3-((endo)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propan-1-ol; A/-bencil-3-((endo)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propionamida; yoduro de (endo)-3-(2-carbamoil-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1 joctano; 1 -bencil-3-[3-((endo)-8-met¡l-8-azabiciclo[3.2.1 ]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-urea; 1-etil-3-[3-((endo)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-urea; A/-[3-((endo)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2- difenil-propil]-acetamida; /\/-[3-((endo)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-benzamida; 3-((endo)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-di-tiofen-2-il-propionitrilo; yoduro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1 ]octano; /v"-[3-((eA7do)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-bencenosulfonamida; [3-((endo)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1 ]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-urea; A/-[3-((endo)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-metanosulfonamida; o bromuro de (endo)-3-{2,2-difenil-3-[(1-fenil-metanoil)-amino]-propil]-8,8-dimetil-8-azonia-b¡ciclo[3.2.1]octano.

Compuestos adicionales incluyen: yoduro de (endo)-3-(2-metox¡- 2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1 ]octano; yoduro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; bromuro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano¡ yoduro de (endo)-3-(2-carbamoil-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; yoduro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano¡ o bromuro de (endo)-3-{2,2-difenil-3-[(1-fenil-metanoil)-amino]propil]-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano.

En algunas modalidades, la invención provee una combinación que comprende una molécula de ANci de la invención que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 8, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, junto con un antagonista de H1. Los ejemplos de antagonistas H1 incluyen, sin limitación, amelexanox, astemizol, azatadina, azelastina, acrivastina, bromofeniramina, cetirizina, levocetirizina, efletirizina, clorfeniramina, clemastina, ciclizina, carebastina, ciproheptadina, carbinoxamina, descarboetoxiloratadina, doxilamina, dimetindeno, ebastina, epinastina, efletirizina, fexofenadina, hidroxizina, ketotifeno, loratadina, levocabastina, mizolastina, mequitazina, mianserina, noberastina, meclizina, norastemizol, olopatadina, picumast, pirilamina, prometazina, terfenadina, tripelenamina, temelastina, trimeprazina y triprolidina, particularmente cetirizina, levocetirizina, efletirizina y fexofenadina.

En otras modalidades, la invención provee una combinación que comprende una molécula de ANci de la invención que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, junto con un antagonista (o agonista inverso) de H3. Los ejemplos de antagonistas H3 incluyen, por ejemplo, los compuestos descritos en WO2004/035556 y en WO2006/045416. Otros antagonistas del receptor de histamina que se pueden usar en combinación con los compuestos de la presente invención incluyen antagonistas (o agonistas inversos) del receptor H4, por ejemplo los compuestos descritos por Jablonowski et al., J. Med. Chem. 46:3957-3960 (2003).

Así, la invención provee una combinación que comprende una molécula de ANci de la invención que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional de los mismos, junto con un inhibidor de Bachl La invención también provee, en modalidades adicionales, combinaciones que comprenden una molécula de ANci de la invención que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional de los mismos, junto con un agonista del adrenorreceptor ß2.

La invención también provee, en modalidades adicionales, combinaciones que comprenden una molécula de ANci de la invención que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional de los mismos, junto con un corticosteroide.

La invención también provee, en modalidades adicionales, combinaciones que comprenden una molécula de ANci de la invención que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: .147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional de los mismos, junto con un anticolinérgico.

La invención provee, en un aspecto adicional, combinaciones que comprenden una molécula de ANci de la invención que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional de los mismos, junto con un antihistamínico.

La invención provee, en un aspecto adicional, combinaciones que comprenden una molécula de ANci de la invención que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO. 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional de los mismos, junto con un inhibidor de Bachl y un agonista del adrenorreceptor ß2.

Así, en un aspecto adicional, la presente invención provee combinaciones que comprenden una molécula de ANci de la invención que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional de los mismos, junto con un anticolinérgico y un inhibidor de Bachl .

Las combinaciones referidas anteriormente se pueden presentar convenientemente para usarse en forma de una formulación farmacéutica y por lo tanto las formulaciones farmacéuticas que comprenden una combinación como la que se define arriba, junto con un diluente o vehículo farmacéuticamente aceptable, representan un aspecto adicional de la invención.

Los compuestos individuales de dichas combinaciones se pueden administrar de forma secuencial o simultánea en formulaciones farmacéuticas separadas o combinadas. En una modalidad, los compuestos individuales se administrarán simultáneamente en una formulación farmacéutica combinada.

En una modalidad adicional, las moléculas de ANci se pueden usar en combinación con otros tratamientos conocidos para prevenir o tratar enfermedades, trastornos o afecciones respiratorias en un sujeto u organismo. Por ejemplo, las moléculas de ANci de la invención se pueden usar con terapias adicionales de hidratación de las vías respiratorias, tales como solución salina hipertónica, denufosol, bronquitol; terapia génica de CFTR; asistencia/reparación de proteína como los correctores de CFTR, por ejemplo VX-809 (Vértex), potenciadores de CFTR, por ejemplo, VX-770 (Vértex); tratamientos para el moco tales como pulmozyme; tratamientos antiinflamatorios tales como N-acetil-cicteína, sildenafil, glutatíón inhalado, pioglitazona, hidroxicloroquina, simvastatina; terapias antiinfecciosas como azitromicina, arikace; fármacos para transplante como ciclosporina inhalada; y complementos nutritivos como aquADEKs, productos de pancrelipasa, trizytek. Así, las moléculas descritas se pueden usar en combinación con uno más compuestos, tratamientos, o procedimientos conocidos para prevenir o tratar las enfermedades, trastornos, condiciones y rasgos descritos en la presente en un sujeto u organismo, como es conocido en la técnica, tal como otros inhibidores de Bachl . 3. Aplicaciones terapéuticas El presente cuerpo de conocimiento en la investigación de Bachl indica la necesidad de métodos que puedan regular la expresión de Bachl para uso terapéutico.

De esta manera, un aspecto de la invención comprende un método de tratamiento de un sujeto que incluye, sin limitación, un humano, que padece una condición que es mediada por la acción o pérdida de la acción de Bachl , dicho método comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de una molécula de ANci de doble cadena de la invención. En una modalidad de este aspecto, las moléculas de ANci comprenden por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o comprenden el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A). En otra modalidad de este aspecto, la condición es una enfermedad respiratoria o es causada por la misma. Las enfermedades respiratorias tratables de acuerdo con este aspecto de la invención incluyen COPD, asma, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis, sinusitis. En una modalidad particular, el uso es para el tratamiento de una enfermedad respiratoria seleccionada del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística y asma. En algunas modalidades, la administración de la molécula de ANci es por medio de administración local o administración sistémica. En otras modalidades, la invención propone poner en contacto al sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención por medio de administración local a los tejidos o células relevantes, tales como las células y tejidos del pulmón, por ejemplo mediante suministro pulmonar. En otras modalidades, la invención propone poner en contacto al sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención por medio de administración sistémica (por ejemplo administración intravenosa o subcutánea del ANci) a los tejidos o células relevantes, como los tejidos o células implicadas en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, rasgo o condición inflamatoria en un sujeto u organismo.

Las moléculas de ANci de la invención también se usan como reactivos en aplicaciones ex vivo. Por ejemplo, los reactivos de ANci se introducen en tejido o células que son transplantados a un sujeto para fines terapéuticos. Las células o tejido se pueden derivar de un organismo o sujeto que después recibe el explante, o se pueden derivar de otro organismo o sujeto antes del transplante. Las moléculas de ANci se pueden usar para modular la expresión de uno o más genes en las células o tejido, de tal manera que las células o tejido obtienen un fenotipo deseado o son capaces de realizar una función cuando se transplantan in vivo. En una modalidad se extraen ciertas células objetivo de BacM de un paciente. Estas células extraídas se ponen en contacto con los ANci de de Bachl que hacen blanco en una secuencia de nucleótidos específica dentro de las células, bajo condiciones adecuadas para que las células incorporen estos ANci (por ejemplo, usando reactivos de suministro tales como lípidos catiónicos, liposomas, etcétera, o usando técnicas como electroporación para facilitar el suministro de los ANci a las células). Las células se reintroducen entonces en el mismo paciente o en otro paciente.

Para aplicaciones terapéuticas, se administra al sujeto una dosis farmacéuticamente eficaz de las moléculas de ANci o las composiciones farmacéuticas de la invención. Una dosis farmacéuticamente efectiva es aquella dosis requerida para prevenir, inhibir la ocurrencia, o tratar un estado patológico (aliviar un síntoma a cierto grado, preferiblemente todos los síntomas). El experto en la materia puede determinar fácilmente una dosis terapéuticamente eficaz del ANci de la invención para administrarla a un sujeto dado, tomando en cuenta factores tales como la talla y peso del sujeto, la magnitud del avance o penetración de la enfermedad, la edad, salud y sexo del sujeto, la vía de administración, y si la administración es regional o sistémica. En general se administra una cantidad de entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal/día de ingredientes activos, dependiendo de la potencia del polímero cargado negativamente. Las moléculas de ANci de la invención se pueden administrar en dosis únicas o en dosis múltiples.

G. Administración Las composiciones o formulaciones se pueden administrar de varias formas. Los ejemplos no limitativos de métodos de administración para la invención incluyen administración oral, bucal, sublingual, parenteral (por ejemplo, intraarticular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular), local rectal u otra administración local. En una modalidad, la composición de la invención se puede administrar por insulflación e inhalación. La administración se puede efectuar por medio de dosis únicas o divididas. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa o intraperitoneal por medio de una inyección de bolo (véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 5,286,634). Las partículas de ácido nucleico lipídicas se pueden administrar por inyección directa en el sitio de la enfermedad o por inyección en un sitio distante del sitio de la enfermedad (véase por ejemplo Culver, "HUMAN GENE THERAPY", MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, Nueva York, p. 70-71 (1994)). En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones y composiciones de las mismas se administran a una célula, sujeto u organismo como se describe en la presente y se conoce generalmente en la técnica. 1. Administración in vivo En cualquiera de los métodos de tratamiento de la invención, el ANci se puede administrar al sujeto sistémicamente como se describe en la presente o de otra manera conocida, solo como una monoterapia o en combinación con las terapias adicionales descritas en la presente o conocidas. La administración sistémica puede incluir, por ejemplo, administración pulmonar (inhalación, nebulización, etc.), intravenosa, subcutánea, intramuscular, cateterización, nasofaríngea, transdérmica, u oral/gastrointestinal, como se conoce generalmente.

En una modalidad, en cualquiera de los métodos de tratamiento o prevención de la invención, el ANci se puede administrar al sujeto localmente o a tejidos locales como se describe en la presente o como se conoce en la técnica, solo como una monoterapia o en combinación con terapias adicionales conocidas. La administración local puede incluir, por ejemplo, inhalación, nebulización, cateterización, implantación, inyección directa, aplicación dérmica/transdérmica, parches, por medio de stent, gotas óticas/oftálmicas, o administración en la vena porta hacia los tejidos relevantes, o cualquier otra técnica, método o procedimiento de administración local, como se conoce generalmente.

En general, los compuestos de la invención se pueden dar por administración interna cuando se indica una terapia sistémica de un agonista del receptor glucocorticoide.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones o composiciones de las mismas se administran al hígado como se conoce generalmente en la técnica (véase por ejemplo Wen et al., 2004, World J Gastroenterol., 10, 244-9; Murao et al., 2002, Pharm Res., 19, 1808-14; Liu et al., 2003, Gene Ther., 10, 180-7; Hong et al., 2003, J Pharm Pharmacol., 54, 51-8; Herrmann et al., 2004, Arch Virol., 149, 1611-7; y Matsuno er a/., 2003, Gene Ther., 10, 1559-66).

En una modalidad, la invención presenta el uso de métodos para suministrar las moléculas de ANci de la presente invención a células hematopoyéticas, que incluyen monocitos y linfocitos. Estos métodos se describen en detalle en Hartmann et al., 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther, 285(2), 920-928; Kronenwett et al., 1998, Blood, 91(3), 852-862; Filion y Phillips, 1997, Biochim. Biophys. Acta., 1329(2), 345-356; Ma y Wei, 1996, Leuk. Res., 20(1 1/12), 925-930; y Bongartz et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22(22), 4681-8.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones o composiciones de las mismas se administran directamente o tópicamente (por ejemplo localmente) a la dermis o los folículos como se conoce generalmente (véase por ejemplo Brand, 2001 , Curr. Opin. Mol. Ther, 3, 244-8; Regnier et al., 1998, J. Drug Target, 5, 275-89; Kanikkannan, 2002, BioDrugs, 16, 339-47; Wraight et al., 2001 , Pharmacol. Ther, 90, 89-104; y Preat y Dujardin, 2001 , STP PharmaSciences, 1 1 , 57-68). En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones o composiciones de las mismas se administran directamente o tópicamente usando una formulación de gel hidroalcohólico que comprende un alcohol (por ejemplo etanol o isopropanol), agua e incluyendo opcionalmente agentes adicionales tales como miristato de isopropilo y carbomer 980. En otras modalidades, el ANci se formula para ser administrado tópicamente en la cavidad nasal. Los preparados tópicos se pueden administrar en una o más aplicaciones al día en el área afectada; sobre áreas de la piel se pueden usar convenientemente vendajes oclusivos. Se puede dar un suministro continuo o prolongado por medio de un depósito adhesivo.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención se administra por iontoforesis, por ejemplo a un órgano o compartimiento particular (por ejemplo, el ojo, parte posterior del ojo, el corazón, hígado, riñon, vejiga, próstata, tumor, SNC, etc.). Los ejemplos no limitativos del suministro iontoforético se describen por ejemplo en WO 03/043689 y WO 03/030989, que se incorporan aquí en su totalidad como referencia.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones o composiciones de las mismas se administran al pulmón como se describe aquí y se conoce en la técnica. En otra modalidad las moléculas de ANci de la invención y sus formulaciones o composiciones se administran a los tejidos y células del pulmón como se describe en las publicaciones de patente de EE. UU. Nos. 2006/0062758; 2006/0014289; y 2004/0077540. 2. Aerosoles y sistemas de suministro a) Formulaciones de aerosol Las composiciones de la presente invención, solas o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden hacer como formulaciones de aerosol (es decir, para que se puedan "nebulizar"), para ser administradas por inhalación (por ejemplo por vía intranasal o intratraqueal) (véase Brigham ef al., Am. J. Sci., 298:278 (1989)). Las formulaciones de aerosol se pueden poner en propulsores presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, etcétera.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones de las mismas se administran mediante suministro pulmonar, por ejemplo por inhalación de una formulación de aerosol o secada por aspersión, administrada mediante un dispositivo de inhalación o nebulizador, que suministra una rápida incorporación local de las moléculas de ácido nucleico en los tejidos pulmonares relevantes. Se pueden preparar composiciones sólidas de partículas que contienen partículas secas respirables de composiciones de ácido nucleico micronizadas, moliendo las composiciones de ácido nucleico seco o liofilizado y después pasando la composición micronizada, por ejemplo, a través de un tamiz de malla 400, para romper o separar los aglomerados grandes. Opcionalmente, una composición sólida de partículas que comprende las composiciones de ANci de la invención puede contener un dispersante que facilita la formación de un aerosol, y también otros compuestos terapéuticos. Un dispersante adecuado es la lactosa, que se puede mezclar con el compuesto de ácido nucleico en cualquier proporción adecuada, tal como una proporción de 1 a 1 en peso.

Las composiciones para atomizar que comprenden moléculas o composiciones de ANci de la invención se pueden formular por ejemplo como soluciones o suspensiones acuosas o como aerosoles suministrados desde envases presurizados, tal como un inhalador dosificador, con el uso de un propulsor licuado adecuado. En una modalidad, las composiciones de aerosol de la invención adecuadas para inhalación pueden ser una suspensión o una solución, y generalmente contienen una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 118, o la fórmula (A), y un propulsor adecuado tal como un fluorocarburo o clorofluorocarburo que contiene hidrógeno, o mezclas de los mismos, particularmente hidrofluoroalcanos, especialmente 1 , 1 ,1 ,2-tetrafluoroetano, 1 ,1 ,1 ,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano, o una mezcla de los mismos. Opcionalmente la composición de aerosol puede contener excipientes de formulación adicionales muy conocidos, tales como los agentes tensoactivos.

Los ejemplos no limitativos incluyen ácido oleico, lecitina o un derivado de ácido oligoláctico, o un derivado como los que se describen en W094/21229 y W098/34596, y codisolventes, por ejemplo etanol. En una modalidad, una formulación farmacéutica de aerosol de la invención comprende un compuesto de la invención y como propulsor un fluorocarburo o clorofluorocarburo que contiene hidrógeno, o mezclas de los mismos, opcionalmente en combinación con un agente tensoactivo o un codisolvente.

Las formulaciones de aerosol de la invención se pueden hacer amortiguadoras agregando agentes amortiguadores adecuados.

Las formulaciones de aerosol pueden incluir aditivos opcionales que incluyen conservadores si la formulación no se prepara de forma estéril. Los ejemplos no limitativos incluyen hidroxibenzoato de metilo, antioxidantes, saborizantes, aceites volátiles, agentes amortiguadores y emulsionantes y otros agentes tensoactivos de formulación. En una modalidad se usan vehículos de fluorocarburo o perfluorocarburo para reducir la degradación y proveer composiciones no liquidas de suspensión de partículas, biocompatibles y más seguras, de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo). En otra modalidad, un dispositivo que comprende un nebulizador suministra una composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo) que comprende compuestos químicos fluorados que son bacteriostáticos, disminuyendo así el potencial de crecimiento bacteriano en dispositivos compatibles.

Se pueden formular cápsulas y cartuchos que comprenden la composición de la invención para usarse en un inhalador o insuflador, por ejemplo de gelatina, conteniendo una mezcla de polvo para inhalación de un compuesto de la invención y una base de polvo adecuado, tal como lactosa o almidón. En una modalidad, cada cápsula o cartucho contiene una molécula de ANci que comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 150; o que comprende el SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, o SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 1 18, o la fórmula (A), y uno o más excipientes. En otra modalidad, el compuesto de la invención se puede presentar sin excipientes como lactosa.

Las composiciones de aerosol de la presente invención se pueden administrar al sistema respiratorio como una formulación que incluye partículas de tamaño respirable, por ejemplo partículas de un tamaño suficientemente pequeño para pasar a través de la nariz, boca y laringe por inhalación y a través de los bronquios y alvéolos de los pulmones. En general, las partículas respirables varían en tamaño de aproximadamente 0.5 a 10 mieras. En una modalidad la escala de partículas puede ser de 1 a 5 mieras. En otra modalidad la escala de partículas puede ser de 2 a 3 mieras. Las partículas de tamaño no respirable que se incluyen en el aerosol tienden a depositarse en la garganta y a ser tragadas, y por lo tanto se minimiza la cantidad de partículas no respirables en el aerosol. Para administración nasal se prefiere un tamaño de partícula en la escala de 10-500 um para asegurar la retención en la cavidad nasal.

En algunas modalidades, una composición de ANci de la invención se administra tópicamente en la nariz, por ejemplo para el tratamiento de la rinitis, por medio de formulaciones de aerosol presurizadas, formulaciones acuosas administradas en la nariz por medio de una bomba presurizada, o por nebulización. Para este propósito las formulaciones adecuadas contienen agua como diluente o vehículo. En algunas modalidades, las formulaciones acuosas para administrar la composición de la invención en el pulmón o la nariz se puede proveer con los excipientes convencionales tales como agentes amortiguadores, agentes modificadores de tonicidad, etcétera. b. Dispositivos Las moléculas de ANci de la invención se pueden formular y suministrar como partículas o aerosoles como se menciona arriba, y se despachan desde varios dispositivos de aerosol conocidos para los expertos en la materia.

Los aerosoles de partículas líquidas o no líquidas que comprenden una molécula de ANci o formulación de la invención se pueden producir mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo con un dispositivo que comprende un nebulizador (véase por ejemplo US 4,501 ,729), por ejemplo un nebulizador ultrasónico o de chorro de aire. En una modalidad, el nebulizador para administrar una molécula de ANci de la invención se basa en señales de oscilación para impulsar un oscilador piezoeléctrico de cerámica, para producir ondas ultrasónicas de alta energía que agitan mecánicamente una composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo), generando una nube de aerosol de medicamento (véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 7,129, 619 B2 y 7,131 ,439 B2). En otra modalidad, el nebulizador se basa en el mezclado de chorro de aire comprimido con una composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo), para formar gotitas en una nube de aerosol.

Los dispositivos nebulizadores usados con las moléculas o formulaciones de ANci de la invención pueden usar vehículos, normalmente agua o soluciones acuosas o no acuosas diluidas que comprenden las moléculas de ANci de la invención. En una modalidad, un dispositivo que comprende un nebulizador utiliza una solución alcohólica, preferiblemente isotónica con los fluidos corporales agregando, por ejemplo, cloruro de sodio u otras sales adecuadas que comprenden una molécula o formulación de ANci de la invención. En otra modalidad, los dispositivos nebulizadores comprenden uno o más vehículos no acuosos fluoroquímicos que comprenden una molécula o formulación de ANci de la invención.

Los aerosoles de partículas sólidas que comprenden una molécula o formulación de ANci de la invención y un agente tensoactivo se pueden producir con cualquier generador de aerosol de partículas sólidas. En una modalidad, se usan generadores de aerosol para administrarle a un sujeto agentes sólidos en partículas. Estos generadores producen partículas que son respirables, como se explica abajo, como una dosis medida predeterminada de una composición. Algunas modalidades de la invención comprenden un aerosol que comprende una combinación de partículas que tienen por lo menos una molécula o formulación de ANci de la invención, con un volumen predeterminado de medio de suspensión o agente tensoactivo para proveer una mezcla respiratoria. Otras modalidades de la invención comprenden un generador de aerosol que comprende una molécula o formulación de ANci de la invención.

Un tipo de generador de aerosol de partículas sólidas usado con las moléculas de ANci de la invención es un insuflador. Las formulaciones adecuadas para administración por insuflación incluyen polvos finamente divididos que pueden ser suministrados por medio de un insuflador. En el insuflador, el polvo, por ejemplo una dosis medida del mismo, efectiva para realizar los tratamientos que aquí se describen, es contenido en cápsulas o cartuchos, hechos normalmente de gelatina o plástico, que se perforan o abren in situ y el polvo es suministrado por aire extraído a través del dispositivo por inhalación o por medio de una bomba operada manualmente. El polvo usado en el insuflador consiste únicamente del ingrediente activo o de una mezcla de polvos que comprende el ingrediente activo, un excipiente en polvo adecuado como lactosa, y un agente tensoactivo opcional. Un segundo tipo de generador de aerosol ilustrativo comprende un inhalador dosificador ("MDI").

Los MDI son dispensadores de aerosol presurizados que contienen normalmente una formulación en suspensión o solución del ingrediente activo en un propulsor licuado. Durante el uso, estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para suministrar un volumen medido y atomizar partículas finas que contienen el ingrediente activo. Los propulsores adecuados incluyen algunos compuestos de clorofluorocarburo, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, y mezclas de los mismos. Adicionalmente, la formulación puede contener uno o mas codisolventes, por ejemplo etanol, emulsionantes y otros agentes tensoactivos de formulación, tales como ácido oleico o trioleato de sorbitán, antioxidantes y agentes saborizantes adecuados. Otros métodos de suministro pulmonar se describen por ejemplo en la solicitud de patente de EE. UU. No. 20040037780, y las patentes de EE. UU. Nos. 6,592,904; 6,582,728; 6,565,885.

Normalmente los botes de un MDI comprenden un recipiente capaz de resistir la presión de vapor del propulsor usado, tal como una botella de plástico o de vidrio revestido con plástico, o preferiblemente un bote de metal, por ejemplo aluminio o una aleación del mismo, que opcionalmente puede estar anodizado, revestido de laca o revestido de plástico (por ejemplo, WO96/32099, incorporada aquí como referencia, en donde una parte o todas las superficies internas se revisten con uno o más polímeros de fluorocarburo, opcionalmente en combinación con uno o más polímeros que no son fluorocarburo, por ejemplo y sin limitación una mezcla de polímeros de politetrafluoroetileno (PTFE) y polietersulfona (PES)), dicho recipiente se cierra con una válvula dosificadora. Las válvulas dosificadoras se diseñan para suministrar una cantidad medida de la formulación por accionamiento, e incorporan un empaque para impedir la fuga del propulsor a través de la válvula. El empaque puede comprender cualquier material elastomérico adecuado, tal como por ejemplo polietileno de baja densidad, clorobutilo, bromobutilo, EPDM, hules de butadieno-acrilonitrilo negros y blancos, hule de butilo y neopreno. Las válvulas adecuadas están disponibles comercialmente de fabricantes muy conocidos en la industria del aerosol, por ejemplo de Valois, Francia (por ejemplo, DF10, DF30, DF60), Bespak pie, Reino Unido (por ejemplo, BK300, BK357) y 3M-Neotechnic Ltd, Reino Unido (por ejemplo, SpraymiserTM).

Los MDI que contienen las moléculas o formulaciones enseñadas en la presente se pueden preparar mediante los métodos conocidos (véase por ejemplo Byron, arriba citado, y WO96/32099).

Los MDI usados con las moléculas de ANci de la invención también se pueden usar en conjunto con otras estructuras tales como por ejemplo, sin limitación, empaques de envoltura para guardar y contener los MDI, incluso los que se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 6,1 19,853; 6, 179,1 18; 6,315,112; 6,352, 152; 6,390,291 ; y 6,679,374; y también unidades contadoras de dosis tales como por ejemplo, sin limitación, los que se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 6,360,739 y 6,431 ,168.

Las moléculas de ANci también se pueden formular como una formulación de fluido para el suministro desde un despachador de fluido, por ejemplo un despachador de fluido que tiene una boquilla despachadora u orificio despachador, a través del cual se despacha una dosis medida de la formulación fluida por medio de la fuerza aplicada por el usuario a un mecanismo de bomba del despachador de fluido. En una modalidad de la invención se proveen despachadores de fluido que utilizan depósitos de múltiples dosis medidas de la formulación fluida, las dosis siendo despachables por el accionamiento secuencial de la bomba, y las cuales comprenden las moléculas o formulaciones de ANci de la invención. En algunas modalidades, la boquilla u orifico de despacho se puede configurar para su inserción en las fosas nasales del usuario para el despacho de la atomización de la formulación fluida que comprende las moléculas o formulaciones de ANci en la cavidad nasal. Un despachador de fluido del tipo anteriormente mencionado se describe e ilustra en WO05/044354. El despachador tiene un alojamiento que aloja un dispositivo de descarga de fluido, que tiene una bomba de compresión montada en un recipiente para contener una formulación de fluido. En varias modalidades, el alojamiento del despachador tiene por lo menos una palanca lateral operable con el dedo, que es movible hacia dentro con respecto al alojamiento para elevar el recipiente ascendentemente en el alojamiento y hacer que la bomba comprima y bombee una dosis medida de la formulación fuera del vástago de bomba, a través de una boquilla nasal del alojamiento. En otra modalidad, el despachador de fluido es del tipo general ilustrado en las figuras 30-40 de WO05/044354.

En algunas modalidades de la invención se usan dispositivos nebulizadores en aplicaciones para sujetos conscientes que respiran espontáneamente, y para sujetos con ventilación controlada de todas las edades. Los dispositivos nebulizadores se pueden usar para el suministro dirigido tópico y sistémico del fármaco al pulmón. En una modalidad se usa un dispositivo que comprende un nebulizador para suministrar una molécula o formulación de ANci de la invención localmente al pulmón o los tejidos pulmonares. En otra modalidad se usa un dispositivo que comprende un nebulizador para suministrar sistémicamente una molécula o formulación de ANci de la invención.

En otras modalidades, los dispositivos nebulizadores se usan para suministrar dispersiones respiratorias que comprenden emulsiones, microemulsiones o suspensiones submicrónicas y de nanopartículas de por lo menos un agente activo (véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 7128,897 y 7,090,830 B2).

Los dispositivos nebulizadores se pueden usar para administrar aerosoles que comprenden una molécula de ANci o formulación de la invención, de forma continua o periódica, y se pueden regular manualmente, automáticamente, o en coordinación con la respiración del paciente (véase la patente de EE. UU. No. 3,812,854, WO 92/1 1050). Por ejemplo, la administración periódica de una molécula de ANci de la invención se puede hacer como un solo bolo mediante una cámara de extrusión de microcanal o mediante presurización cíclica. La administración puede ser una vez al día o varias veces al día, por ejemplo 2, 3, 4 u 8 veces, dando por ejemplo 1 , 2 o 3 dosis cada vez. La dosis diaria general y la dosis medida suministrada por cápsulas y cartuchos en un inhalador o insuflador, generalmente será el doble que la suministrada con formulaciones de aerosol.

H. Otras aplicaciones/usos de las moléculas de ANci de la invención Las moléculas de ANci de la invención también se pueden usar para aplicaciones diagnósticas, aplicaciones de investigación, o fabricación de medicamentos.

En un aspecto, la invención presenta un método para diagnosticar una enfermedad, rasgo o condición en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición de la invención bajo condiciones adecuadas para el diagnóstico de la enfermedad, rasgo o condición en el sujeto.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención se usan para regular negativamente o inhibir la expresión de proteínas Bachl , que surge de polimorfismos de haplotipo que se asocian con un rasgo, enfermedad o afección en un sujeto u organismo. El análisis de los genes Bachl , o las concentraciones de proteína o ARN de Bachl , se pueden usar para identificar a los sujetos con dichos polimorfismos, o a los sujetos que están en riesgo de desarrollar los rasgos, afecciones o enfermedades aquí descritas. Estos sujetos son susceptibles de tratamiento, por ejemplo tratamiento con moléculas de ANci de la invención, o cualquier otra composición útil en el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la expresión del gen objetivo. Por lo tanto, el análisis de las concentraciones de proteína o ARN de Bachl se puede usar directa o indirectamente para determinar el tipo de tratamiento y el curso de terapia para tratar a un sujeto. El monitoreo de las cantidades de proteína o ARN de Bachl se puede usar para predecir el resultado del tratamiento y para determinar la eficacia de los compuestos y composiciones que modulan la concentración o actividad de algunas proteínas Bachl asociadas con u rasgo, trastorno, afección o enfermedad.

En otra modalidad, la invención comprende el uso de un ácido nucleico de doble cadena de acuerdo con la invención para usarse en la fabricación de un medicamento. En una modalidad, el medicamento es para usarse en el tratamiento de una afección que es mediada por la acción, o la pérdida de la acción, de Bachl . En una modalidad, el medicamento es para usarse en el tratamiento de una enfermedad respiratoria. En una modalidad, el medicamento es para usarse en el tratamiento de una enfermedad respiratoria seleccionada del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística, asma, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis y sinusitis. En una modalidad particular, el uso es para el tratamiento de una enfermedad respiratoria seleccionada del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística y asma.

En algunas modalidades, los ANci 29961 -DC, 29964-DC, 29947-DC, 29988-DC, 29984-DC, 29956-DC y 29957-DC, y los ANci en donde por lo menos una cadena comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, o SEQ ID NO: 150, y los ANci que comprenden la fórmula A, son para usarse en un método de tratamiento de una enfermedad respiratoria, tal como por ejemplo, sin limitación, COPD, fibrosis quística, asma, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis y sinusitis.

I. EJEMPLOS La invención se ilustrará ahora con los siguientes ejemplos no limitativos. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que se pueden cambiar o modificar para producir esencialmente los mismos resultados.

EJEMPLO 1 Diseño, síntesis e identificación de ANci activos contra Bachl Síntesis del ANci de Bachl Se diseñó y se sintetizó una serie de 42 moléculas de ANci y se evaluó su eficacia contra Bachl . Los criterios primarios para el diseño de Bachl para los ANci humanos fueron: (i) homología entre dos especies (humano y ratón), y (¡i) puntuaciones de eficacia alta determinadas por medio de un algoritmo patentado. Las secuencias de ratón también se consideraron para usarse en modelos de animal. También se examinaron los efectos de los ANci sobre las concentraciones de ARN de Bachl y su efecto sobre la concentración de ARNm de hemooxigenasa 1 (HMOX-1 ). Las secuencias de los ANci que fueron diseñados, sintetizados y evaluados para determinar su eficacia contra Bachl se describen en el cuadro 1A (secuencias objetivo) y el cuadro 1 B (secuencias modificadas).

CUADRO 1A Secuencias obietivo de Bac , indicando los sitios objetivo ID Secuencia objetivo Sitio Homología SEQ ID Dúplex objetivo NO: 29947- DC (¡CAA UCCDGC l¡ I X'AG HUI! 472 1) 11)11)1111 1 29948- DC GCGAGAAGUGGCAGAACAC 1285 2mm m 2 29949- IX: GUGIJAAACUCCGCAGGUAIJ 664 h 3 29950-DC GAGGAAI JCCUGCUUUCAGU 470 h 1 muí ni 4 2995 l-DC GCClllillGUCAGGlJACAGAC 11 2 h 5 29952- IX" CA LIA UGAGUC AUG UGC U U 732 1) 6 29953- IX" CACAUAUGACCAAUAUGGl) 1096 h 7 29954- DC C A G A A CA G A l i C l JCA C A ( ? ? A 1 89 h 8 29955- DC G A G l i CCA 1 I G l ¡GC lili AG AG A 737 h 9 29956- DC Gl ICl ¡GAGl I IJCCGl ¡GGl !l ¡A 1411 h 10 29957- DC GCAGUl 1ACI II KX'ACl JCAAG 282 2mm m 11 29958- DC GUCAAAGACAUUCAIJGCUIJ 8 1 h 12 29959-DC GAGIK¡UCCGUGGUUAGGUA 1415 h 2mm ni 1 29960- DC CCAAAGAUGGCUCAGAACA 1377 lí 2 nuil ni 14 2996 l-DC CUACACUGCUAAACUGACU 388 li 2nini ni 1 29962- IX' CAGGGAAGA l JAG l) AG l ¡til ¡ 1240 16 29963- C G C. A U l .11 ! G ? A CC l ¡ 111 ! A A 1 J 11 C 362 h 17 29964 DC (¡A III ¡1 JGCAGGl ¡GAUGIIUAA 929 h 18 29965- IX" (¡A( "A(;A(¡GGAIÍCIÍA(ÍAAA 596 19 29966- DC (¡(¡("CAA A GA l i G GC U CA GA A 1375 li 2mm ni 20 29967- DC G A G l J l H J C l ¡ A A G 0 G l ! A C A C A 494 m 21 29968-DC G( ' A ( i A U G A A U l i (" U U G G A A A 671 m 22 29969-DC GAT IT Jl "CAAI X ? JI JGU1 IGA 1790 ni 23 29970- DC GAGUGl )CCC l IGG l J U GG G U A 1472 m 2mm h 24 29971- IX : GUA( ."IJUUCUGIJU(;A(;(;(;A 2488 111 25 29972- IX GAUlil!AUA UC UG A A G l ) C 1 ! A 1262 m 26 29973- IX' C l ICAC"GA A A IJGAl ! 1 ! l!( ?'.? A 1780 m 27 29974- DC (ÍAGGl 1GAAGCI ¡CíCCAl MICA 1739 ni 2mm h 28 29975-DC G l JCGCA ? G ? GG ? ? AC l M !G ? 1893 ni 1 mm h 29 29976- DC C l J G C U C A A G C ? A C U l J G G A A 1 85 ni 2nini h 30 29977-DC GAGCCUUC¡CC(XHIAIKX i!U 1 40 ni 2mm 31 29978-DC G G l II j AAAG ( ¡Al ) U l K ¡AAC( " l J 403 m nim li 32 29979- DC CGGAC Ll V UCACAACUCUCA 1523 m 33 29980-DC ("GA(;AA(¡("UGCAAAGU(¡AA 1939 ni nim li 34 2998 l-DC CA<¡( " l IAC IMi ( 'AC l K ¡ AG A 3 1 ni 2 m m 35 299 2-IX" ('?G? ( ?? 1752 1111 lililí ll 36 29983- IX' CTA U l i 1 IGAACCl MiDAAlil JCA 363 uí 37 29984- C Gl M lAAAGGAl H ¡i IGAACCl : 356 huí 38 29985-DC AGGCUl ICUGGAGl JGACA l J 11 1312 hni 39 29986- IX" (¡( "l II X"l IGGAGI IGACAl M II i(i 1 14 lim 40 29987-DC GGCUUCtKiGAGUGACAUUU 1313 Jim 41 29988- IX" A 11111 i G A A ( : l ; l M i A A l J l í C A G 364 hm 42 En este cuadro la columna de homología indica homología perfecta del ARNci con el transcrito humano (h), solo con el transcrito de ratón (m), o tanto el transcrito humano como de ratón (hm), o con el número de discordancias (1 o 2 mm m) de un transcrito específico (por ejemplo, h 1 mm m significa homología perfecta con el transcrito humano y una discordancia con el ratón).

Para cada oligonucleótido de una secuencia objetivo, las dos cadenas individuales complementarias del ARNci se sintetizaron separadamente usando síntesis en fase sólida, luego se purificaron separadamente por extracción en fase sólida (SPE) invertida. Las cadenas complementarias se aparearon para formar la doble cadena (dúplex) y se suministraron a la concentración deseada y en el amortiguador de elección.

Brevemente, los oligonucleótidos de una sola cadena se sintetizaron usando química de fosforamidita en un sintetizador automático de fase sólida, como se conoce generalmente (véase por ejemplo USSN 12/064,015). Una columna de síntesis se empacó con un soporte sólido modificado con el primer residuo de nucleósido. La síntesis se inició mediante des-tritilación del grupo 5'-0-dimetoxitritilo lábil al ácido para liberar el 5'-hidroxilo. Se suministraron simultáneamente a la columna de síntesis fosforamidita y un activador adecuado en acetonitrilo, dando como resultado el acoplamiento de la amidíta con el 5'-hidroxilo. Después, la columna se lavó con acetonitrilo. Se bombeó yodo a través de la columna para oxidar el enlace de triéster de fosfito P(lll) a su análogo de fosfotriéster P(V). Los grupos 5'-h¡droxilo sin reaccionar se bloquearon usando reactivos tales como anhídrido acético, en presencia de 2,6-lutidina y N-metilimidazol. El ciclo de alargamiento se reasume con el paso de des-tritilación para la siguiente incorporación de fosfora m id ita. Este procedimiento se repitió hasta que se sintetizó la secuencia deseada. La síntesis concluye con el grupo protector del extremo 5' final (tritilo o 5'-0-dimetoxitritilo).

Al terminarse la síntesis, el soporte sólido y el oligonucleótido asociado se secaron bajo presión de argón o al vacío. Se agregó una base acuosa y la mezcla se calentó para romper el enlace de succinilo, remover el grupo protector cianoetilfosfato y desproteger la amina exocíclica.

Se realiza el siguiente procedimiento sobre cadenas individuales que no contienen ribonucleótidos: Después de tratar el soporte sólido con la base acuosa, la mezcla se filtra para separar el soporte sólido del material de síntesis crudo desprotegido. Después, el soporte sólido se enjuaga con agua que se combina con el filtrado. La solución básica resultante permite la retención del grupo 5'-0-dimetoxitritilo sobre la posición 5'-terminal (solución tritilada).

Para cadenas individuales que contienen ribonucleótidos se realizó el siguiente procedimiento: Después de tratar el soporte sólido con la base acuosa, la mezcla se filtró para separar el soporte sólido del material de síntesis crudo desprotegido. Después, el soporte sólido se enjuagó con sulfóxido de dimetilo (DMSO) que se combinó con el filtrado. A la mezcla se le agregó reactivo de fluoruro tal como tríhidrofluoruro de trietilamina, y la solución se calentó. La reacción se desactivó con un amortiguador adecuado para proveer una solución de la cadena individual cruda con el grupo 5'-0-dimetoxitritilo sobre la posición 5'-terminal final.

La solución tritilada de cada cadena individual cruda se purificó usando purificación cromatográfica, tal como purificación SPE RPC. La naturaleza hidrofóbica del grupo trifilo permite una retención del oligonucleótido deseado de longitud completa más fuerte que las secuencias de falla truncadas, no tritiladas. Las secuencias de falla se lavaron selectivamente de la resina con un disolvente adecuado, tal como un bajo porcentaje de acetonitrilo. Los oligonucleótidos retenidos se sometieron entonces a des-tritilación en una columna con ácido trifluoroacético para quitar el grupo trifilo, lábil al ácido. El ácido residual se lavó de la columna, se hizo un intercambio de sal y se empezó a hacer una desalación final del material. El oligonucleótido de longitud completa se recuperó en forma purificada con un disolvente acuoso-orgánico. Después se analizó la pureza del producto final (HPLC), su identidad (Maldi-TOF-MS), y rendimiento (A26o UV). Los oligonucleótidos se secaron por liofilización o condensación al vacio.

Apareamiento: Basándose en el análisis del producto, los oligonucleótidos secos se disolvieron en soluciones amortiguadoras adecuadas mezclando cantidades equimolares (calculadas usando el coeficiente de extinción teórico) de las cadenas de sentido y antisentido del oligonucleótido. Después se analizó la pureza del dúplex en la solución por medio de métodos cromatográficos y la concentración final deseada. Si el análisis indicaba un exceso de cualquier cadena, entonces se titulaba la cadena adicional no en exceso hasta completar la formación del dúplex. Cuando el análisis indicó que se había obtenido la pureza del producto objetivo, el material se entregó listo para usarse.

El siguiente cuadro muestra varios ANci sintetizados usando este protocolo.

CUADRO 1 B Cadenas de ANci de Bachl sintetizadas ID Sitio SEQ SEQ ID Secuencia objetivo Dúplex obj. Secuencia modificada ID NO: NO: 29947-DC 472 1 GGAAUCCUOCUUUCAGUUU B GGAAuc uGcumcAGuuu TTB 43 29947- DC 472 1 GGAAUCCUGCUUUCAGUUU AAAcuGAAAGcAGGAuuccUU 44 29948- DC 1285 2 GCGAQAAGUGGCAGAACAC B GcGAGAAG GGcAGAAcAc TTB 45 29948-DC 1285 2 GCGAGAAGUGGCAGAACAC GUGiiucuGccACuuCuCGcUU 46 29949-DC 664 3 GUGUAAACUCCGCAGGUAU B GUGUAAACM CGCAGGVAU TTB 47 29949-DC 664 3 GUGUAAACUCCGCAGGUAU AUAccuGcGGAGuuuAcAcUU 48 29950- DC 470 4 GAGGAAUCCUGCUUUCAGU B GAGGAAUCCVGCMWCAGV TTB 49 29950- DC 470 4 GAGGAAUCCUGCIJUUCAGU ACUGAAAGcAGGAuuc ucUU 50 29951-DC 1162 5 GCCUUUGUCAGOUACAGAC B GcQvmxGucAGGvAcAGAc TTB 51 29951-DC 1162 5 GCCUUUGUCAGGUACAGAC GUCuGuAccuGAcAAAGGcUU 52 29952-DC 732 6 CAUAUGAGUCCAUGUGCUU B cA 4uG/4GuccA_GuGcuu I J ti 53 29952-DC 732 6 CAUAUGAGUCCAUGUGCUU AAGc Ac AuGG cuc An AuGUU 54 29953- DC 1096 7 CACAUAUOACCAAUAUGGU B ACAOA GACQAAUAUGGU TTB 55 29953-DC 1096 7 CACAUAUGACCAAUAUGGU ACCAuAuuGGucAuAuGuGUU 56 29954- DC 1389 8 CAGAACAGAUCUCACAGAA B cAGAA AGAucucAcAGAA TTB 57 29954- DC 1389 8 CAGAACAGAUCUCACAGAA UCCuGuGAGAucuGuucuGUU 58 29955-DC 737 9 GAGUCCAUGUGCUUAGAGA B GAGuccAuGuGcuu G/lC i 7TB 59 29955-DC 737 9 GAGUCCAUGUGCUUAGAGA UCUcu A AGcAc AuGGAcucUU 60 29956- DC 141 1 10 GUCUGAGUGUCCGUGGUUA B TTB 61 29956- DC 141 1 10 GUCUGAGUGUCCGUGGUUA UAAccAcGGAcAciicAGAcUU 62 29957-DC 282 11 GCAGUUACUUCCACUCAAG B G&4Guu/iciiucc lcuc G 7TB 63 29957-DC 282 1 1 GCAGUUACUUCCACUCAAG CUUGAGuGGAAGuAAcuGcUU 64 29958-DC 851 12 GUCAAAGACAUUCAUGCUU B GucAAAG icAuucduG iu 7TB 65 29958- DC 851 12 GUCA A AG AC AUUC AUGCU U AAGcAuGAAuGuc uuuGAcUU 66 29959- DC 1415 13 GAGUGUCCGUGGUUAGGUA B GAGuGuccGuGGuu iGGii l 7TB 67 29959-DC 1415 13 GAGUGUCCGUGGUUAGGUA UACcuAAccAcGQAcAcuCUU 68 29960- DC 1377 14 CCAAAGAUGGCUCAGAACA B CCAAAGAMGGCVCAGAACA TTB 69 29960- DC 1377 14 CCAAAGAUGGCUCAGAACA UGUucuGAGccAucimuGGUU 70 29961 -DC 388 15 CUACACUGCUAAACUGAUU B MACACMGCUAAACVGAVV TTB 71 29961-DC 388 15 CUACACUGCUAAACUGAUU AAUcAGuuuAGcAGuGuAGUU 72 29962-DC 1240 16 CAGGGAAGAUAGUAGUGUU B CAGOGAAGAMAGMAGUGW TTB 73 29962-DC 1240 16 CAGGGAAGAUAGUAGUGUU AACAcuAcuAucuucccuGUU 74 29963-DC 362 17 GGAUUUGAACCUUUAAUUC B GGAmuGAAccouuAAuuc TTB 75 29963-DC 362 17 GGAUUUGAACCUUUAAUUC. GAAuuAAAGGuucAAAuccUU 76 29964- DC 929 18 OAUUUGCAGGUGAUOUUAA B GAxmuGcAGGuGAvGvuAA TTB 77 29964- DC 929 18 GAUUUGCAGGUGAUGUUAA UUAAcAucAccuGcAAAucUU 78 29965-DC 596 19 GACCAGAGGGAUCUAGAAA B GAccAGAGGGAucuAGAAA TTB 79 29965-DC 596 19 GACC AGAGGGAUCU AGA A A UUUcuAGAucccucuGGucUU 80 29966- DC 1375 20 GGCCAAAGAUGGCUCAGAA B GGcc lA4.CAuGGcucAGA/l 7TB 81 CUADRO 1B (Continuación) m Sitio SEQ SEQ cuencia modificada Dúplex obj. ID Secuencia objetivo Se ID ISO: NO: 29966-DC 1375 20 GGCC AA AG AUGGCUCAGA A UUCuGAGccAucuuuGGccUU 82 29967-DC 494 21 GAGUUUCUAAGCOUACACA B CAGimuaiAAGcGuAcAcA 7TB 83 29967-DC 494 21 G AGUUUCU AAGCGU ACAC A UGUG.uAcücuuA£AAAcueLLU 84 29968-DC 671 22 GC AG AUGA AUUC UUGG A A A B GcAGAuGAAu cuuGGAAA TTB 85 29968-DC 671 22 GCAGAUGAAUUCUUGGAAA UUUccA AGAAuucAucuGcU U 86 29969-DC 1790 23 OAUUUCCAAUCCUUGUUGA B GAuuuc<-4 luccuuGuuG/4 7TB 87 29969-DC 1790 23 QAUUUCCAAUCCUUGUUOA UCAAcAAGGAuuGGAAAucUU 88 29970-DC 1472 24 GAGUGUCCCUGGUUGGGUA B G4GuGucccuGGuuGCGi-4 7TB 89 29970-DC 1472 24 GAGUGUCCCUGGUUGGGUA UACccAAccAGGGAcAcucUU 90 29971-DC 2488 25 GUAGCUUUCUGUUGAGGGA B GuAGcuuucuCuuG/lGGG l 7TB 91 29971-DC 2488 25 GUAGCUUUCUGUUGAGGGA UCCcuc cAGAAAGcuAcLiü 92 29972-DC 1262 26 GAUUUAUAUCUGAAGUCUA B GAvuvAuAvcuGAAGvcuA TTB 93 29972-DC 1262 26 GAUUUAUAUCUGAAGUCUA UAGAcuucAGAuAuAAAucUU 94 29973-DC 1780 27 CUCACGAAAUGAUUUCCAA B cvcAcGAAAuGAuuuccAA TTB 95 29973-DC 1780 27 CUCACGAA A (JGA UUUCCAA UUOOAAAucAuuucGuGAOUU 96 29974-DC 1739 28 GAGGUGAAGCUGCCAUUCA B GAGGuGAAGcuGccAuvoA TTB 97 29974-DC 1739 28 GAGGUGAAGCUGCCAUUCA UGAAuOOcAOcuucAccucUU 98 29975-DC 1893 29 GUCGCAAGAGGAAACUUGA B GucGcAAGAGGAAAcuvGA TTB 99 29975-DC 1893 29 OUCGCAAGAGGAAACUUGA UCAAGiuiucc icuuGcGAcUU 100 29976-DC 1585 30 CUGCUCAAGCAACUUGGAA B cwGcuoAAGcAAcuuGGAA TTB 101 29976-DC 1585 30 CUGCUC A AGC A ACUUGG A A UUCcAACniuOaraGAGcAGUU 102 29977-DC 1640 31 GAGCCUUGCCCGUAUGCUU B GAGccuuGcccGuAuGcuu 7TB 103 29 77-DC 1640 31 GAGCCUUGCCCGUAUGCUU AAGcAuAcGGGcAAGGcucUU 104 29978-DC 403 32 GGUUAAAGGAUUUGAACCU B GGÜUAAA GGAUÜUGAACCU TTB 105 29978-DC 403 32 GGUUAAAGGAUUUGAACCU AGGuucAAAuccuuuAAccUU 106 29979-DC 1523 33 CGGACUUUCAC.AACUCUCA B cGGAcuuucAcAAcucucA 7TB 107 29979-DC 1523 33 CGGACUUUCACAACUCUCA UGAGAGuuGuGAAAGuccGUU 108 29980- DC 1939 34 CGAGAAGCUGCAAAGUGAA B cGAGAAGcaGcAAAGuGAA 7TB 109 29980-DC 1939 34 CG AG A AGCUGC AAAGUG A A UUCAcuuuGcAGcuucucGUU 1 10 29981-DC 331 35 CAGCUACUUCCACUCGAGA B CAGCU4CIIIICCÍ CUCGAG/1 7TB 1 1 1 29981-DC 331 35 CAGCÜACUUCCACUCGAGA UCLÍCGAGUGGAAGUAGCUGUU 112 29982-DC 1752 36 CAUUCAAUGCCCAACGGAU B cAuxicAAvGcccAAcGGAu TTB 1 13 29982-DC 1752 36 CAUUCAAUGCCCAACGGAU AUCCGUUGGGCAUUGAAUGUU 1 14 29 83-DC 363 37 GAUUUGAACCUUUAAUUCA B G uuuGA4ccuuuA4uucA TTB 1 15 29983-DC 363 37 GAUUUGAACCUUUAAUUCA UGAAUUAAAGGUUCAAAUCUU 116 29984-DC 356 38 GUUAAAGGAUUUGAACCUU B Guu LMGG luuuGAAccuii 7TB 1 17 29 84-DC 356 38 GUUAAAGGAUUUGAACCUU A AGGuucA uccu uuAAcUU 1 18 29 85-DC 1312 39 AGGCUUCUGGAGUGACAUU B AGGCVVCUGGAGUGACAVV TTB 1 19 29985-DC 1312 39 AGGCUUCUGGAGUGACAUU AAUGucAcuccAGAAGccuUU 120 29986-DC 1314 40 GCUUCUGGAGUGACAUUUG B GcuucuGGAGuG/4cAuuu 7TB 121 29986-DC 1314 40 GCUUCUGGAGUGACAUUUG CAAAUGUCACHCCAGAAGCUU 122 29987-DC 1313 41 GGCUUCUGGAGUGACAUUU B GGCUIJCUGCAGUG 1C 1UUU 7TB 123 29987-DC 1313 41 GGCUUCUGGAGUGACAUUU A AAuGuc Acucc AGAAGcc UU 124 29988-DC 364 42 AUUUGAACCUUUAAUUCAG B AvOvGAAccmmAAwcAG TTB 125 29988-DC 364 42 AUUUGAACCUUUAAUUCAG CUGAAuuAAAGGuucAAAuUU 126 en donde: A, C, G, y U = ribosa A, C, G o U c y u = 2'-desox¡-2'-fluoro- C o U A, U y G = 2'-0-met¡l- (2'-Ome-) A, U A y G = desoxi- A o G B = abásico invertido 7 = timidita Pasos adicionales de síntesis para la preparación comercial Una vez que el análisis indica que se ha obtenido la pureza deseada del producto después del paso de apareamiento, el material se transfiere al sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) para concentración y desalación, en vez de hacer esto antes del paso de apareamiento.

Ultrafiltración: La solución de producto apareado se concentra usando un sistema TFF que contiene una membrana de corte de peso molecular adecuado. Después de concentrar, la solución de producto se desala por medio de diafiltración utilizando agua Milli-Q hasta que la conductividad del filtrado sea la del agua.

Liofilización: La solución concentrada se transfiere a una botella, se congela instantáneamente y se pone en un liofilizador. Entonces se liofiliza el producto hasta obtener un polvo. La botella se retira del liofilizador y queda lista para usarse.

Protocolo de selección inicial (transfecciones en placa de 96 pocilios) Preparación del cultivo celular: Todas las células se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA), a menos que se indique de otra manera. Las células se desarrollaron y se transfectaron bajo condiciones estándares, que se detallan más abajo para cada línea celular.

A549 (de humano; ATCC No. cat. CCL-185): Las células se cultivaron a 37°C en presencia de 5% de CO2 y se desarrollaron en medio F12K de Ham con 2 mM de L-glutamina ajustada para contener 1.5 g/l de bicarbonato de sodio, y suplementado con suero bovino fetal a una concentración final de 10%, 100 pg/ml de estreptomicina, y 100 U/ml de penicilina.

NIH 3T3 (de ratón; ATCC No. cat. CRL-1658): Las células se cultivaron a 37°C en presencia de 5% de C02 y se desarrollaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 4 mM de L-glutam¡na ajustada para contener 1.5 g/l de bicarbonato de sodio y 4.5 g/l de glucosa, y suplementado con suero bovino fetal a una concentración final de 10%, 100 pg/ml de estreptomicina, y 100 U/ml de penicilina.

Transfección y selección Las células se depositaron en todos los pocilios de una placa de 96 pocilios tratados con cultivo de tejido, a un conteo final de 5000 células/pocilio en 100 µ? del medio de cultivo adecuado. Las células de cultivaron durante 24 horas después de sembrar, a 37 °C y en presencia de 5% de C02.

Después de 24 horas se crearon complejos que contenían ANci y RNAiMax, de la siguiente manera: se preparó una solución de RNAiMax diluida 33 veces en OPTI-MEM. En paralelo se prepararon soluciones de los ANci para análisis a una concentración final de 120 nM en OPTI-MEM. Después de la incubación de la solución de RNAiMax/OPTI-MEM a temperatura ambiente durante 5 min, se agregaron juntos un volumen igual de la solución del ANci y de la solución de RNAiMax a cada ANci.

El mezclado produjo una solución de ANci/RNAiMax en donde la concentración del ANci era de 60 nM. Esta solución se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la incubación se agregaron 20 µ? de la solución a cada pocilio relevante. La concentración final del ANci de cada pocilio era de 10 nM y el volumen final de RNAiMax en cada pocilio era de 0.3 µ?.

El tiempo de incubación con los complejos RNAiMax-ANci fue de 48 horas y no hubo cambio de medio entre la transfección y la cosecha, a menos que se indique de otra manera.

Aislamiento del ARN y transcripción inversa (placa de 96 pocilios) El ARN se extrajo de una placa de 96 pocilios usando el kit TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT™ (No. cat. 4399002) con un protocolo modificado. Brevemente, en cada pocilio de la placa de amortiguador de lisis (placa twin.tec de reborde completo) se despacharon 60 µ? (1 placa) o 110 µ? (2 placas) de la solución de lisis con DNasa I. Las placas de amortiguador de lisis y detención se guardaron a 4 °C hasta que se lavaron las células.

La placa se centrifugó a 1 100 rpm durante 5 minutos. El medio de cultivo se aspiró y se desechó de los pocilios de la placa de cultivo. La lisis se hizo automáticamente usando un instrumento FX de BioMek con su método. Después de terminar el método de Biomek, la placa de lisis se incubó 2 min a temperatura ambiente. La placa de lisis se puede guardar durante 2 horas a 4 °C, o a -20 °C o -80 °C durante dos meses.

Cada pocilio de la placa de transcripción inversa requirió 10 µ? de amortiguador de transcriptasa inversa 2X, 1 µ? de enzima transcriptasa inversa 20X y 2 µ? de agua libre de nucleasa. La mezcla maestra de transcripción inversa se preparó mezclando amortiguador de transcripción inversa 2X, mezcla de enzima de transcripción inversa 20X, y agua libre de nucleasa. En cada pocilio de la placa de transcripción inversa (de medio reborde) de despacharon 13 µ? de la mezcla maestra de transcripción inversa. Se preparó una placa de transcripción inversa separada para cada placa de células. La placa se cargó en un Biomek NX o Biomek FX Dual-96 y se siguió el método o de Biomek. El instrumento se programa para añadir automáticamente 7 µ? del lisado del procedimiento de lisis celular arriba descrito en cada pocilio de la placa de transcripción inversa. La placa se sella y se centrifuga en una centrífuga (1000 rpm por 30 segundos) para asentar el contenido en el fondo de la placa de transcripción inversa. La placa se pone en un termociclador a 37 °C por 60 min, a 95 °C por 5 min, y a 4 °C hasta que se retira la placa del termociclador. Después de retirar la placa, si no se usa inmediatamente, se congela a -20 °C.

RT-PCR cuantitativa (Taqman) Se usaron una serie de sondas e iniciadores para detectar los diversos transcritos de ARNm de los genes de Bach , HMOX-1 y GAPDH en líneas de células de ratón y de humano. Las pruebas se hicieron en un instrumento ABI 7900 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una mezcla maestra de expresión génica TaqMan (provista en el Cells-to-CT™, Applied Biosystems, No. cat, 4399002). Las reacciones de PCR se hicieron a 50 °C por 2 min, 95 °C por 20 min, seguido por 40 ciclos a 95 °C por 15 s y 60 °C por 1 min.

Dentro de cada experimento la línea de base se puso en la fase exponencial de la curva de amplificación, y se basó en el punto de intersección de las líneas de base con la curva de amplificación; un valor de Ct fue asignado por el instrumento.

Cálculos El grado de expresión del gen de interés y el % de knockdown se calcularon usando el método de Ct comparativo: ACt = Ctobjetivo - CtcAPDH AACt = ACt(ARNc¡ objetivo) ~ ACt(NTC) Grado de expresión relativa = 2"??a % KD = 100 x (1 - 2- Ct) Para evaluar el grado de expresión y el % de knockdown de GAPDH, se usó el gen STAT4 como un control endógeno para calcular ACt en las muestras tratadas con ANci y el control universal: ACt = CtQAPDH - CtsTAT4 El gen STAT4 se seleccionó como un normalizador interno basándose en su expresión relativamente consistente en 49 muestras de prueba en tres experimentos independientes. El valor AACt, el grado de expresión relativa y el % KD se calcularon como se describe arriba.

A menos que se indique de otra manera, el ANci de control, no dirigido, se escogió como el valor contra el cual se calcula el % de knockdown, porque es el control más relevante.

Adicionalmente solo se examinaron los datos normalizados, que reflejan la salud general de la célula y la calidad de la extracción del ARN. Esto se hizo considerando la concentración de dos ARNm diferentes en las células tratadas, el primero siendo el ARNm objetivo y el segundo siendo el ARNm normalizador. Esto permitió la eliminación de ANci que podrían ser potencialmente tóxicos para las células, en vez de únicamente destruir (knockdown) el gen de interés. Esto se hizo comparando el Ct de GAPDH en cada pocilio con respecto al Ct de toda la placa.

Todos los cálculos de Cl50 se hicieron usando el software SigmaPlot 10.0. Los datos se analizaron usando la ecuación sigmoidea de dosis-respuesta (pendiente variable) para unión simple de ligando. En todos los cálculos del % de knockdown, el cálculo se hizo con respecto al grado de expresión normalizado del gen de interés en las muestras tratadas con el control no dirigido (ANci de control) a menos que se indique de otra manera.

Para encontrar las medidas estadísticas de significancia del aumento de ARNm de HMOX-1 en respuesta al tratamiento con el ANci de Bachl , se hizo una prueba t de Student bilateral sobre los valores de dCt de los pocilios tratados con el ANci de control no dirigido, en comparación con los valores de dCt de los pocilios tratados con la concentración más alta de cada ANci activo respectivo.

Resultados Los ANci de Bachl se diseñaron y sintetizaron como se describió previamente. Los ANci se examinaron y seleccionaron en dos líneas de células, células A549 humanas y células NIH 3T3 de ratón. En los cuadros 2 y 3 se muestran los datos del examen de los ANci de Bachl en estas especies. Cada examen se hizo 24 h después de la transfección.

CUADRO 2 Resumen de datos del examen (10 nM) en células A549 humanas (n=2) ID Dúplex Sitio Objetivo Homología % KD 29947-DC 472 h 1 mm m 83.4±6.9 29948-DC 1285 h 2mm m 51.9±3 29949-DC 664 h 25±1.4 29950-DC 470 h 1 mm m 90.6±1.7 29951 -DC 1 162 h 39±11.2 29952-DC 732 h 75±0.9 29953-DC 1096 h 24+14.1 29954-DC 1389 h 63.4±0.9 29955-DC 737 h 14.6±0.2 29956-DC 1411 h 75.8±7.7 29957-DC 282 h 2mm m 84.615.4 29958-DC 851 h 75.718.6 29959-DC 1415 h 2mm m 68114.9 29960-DC 1377 h 2mm m 3413 29961 -DC 388 h 2mm m 9011.3 29962-DC 1240 h 8810.7 29963-DC 362 h 32.913.4 29964-DC 929 h 90.110.8 29965-DC 596 h 34.413.6 29966-DC 1375 h 2mm m 57.315.9 29967-DC 494 m 34.616.7 29968-DC 671 m 28.213.7 29969-DC 1790 m 3617.3 29970-DC 1472 m 2mm h 46.81.5.1 29971 -DC 2488 m 23.913.8 29972-DC 1262 m -3.3127.4 CUADRO 2 (Continuación) Se usó RT-PCR cuantitativa para determinar la concentración de ARNm de Bachl y los datos se normalizaron con respecto al grado de expresión de GAPDH (un gen "de mantenimiento" expresado ubicuamente), y cada tratamiento se normalizó contra el control no dirigido. El % KD se representa como media ± S.D.

CUADRO 3 Resumen de datos del examen en células NIH3T3 de ratón (n=2) ID Dúplex Sitio Objetivo Homología % KD 29947-DC 472 h 1 mm m 46±5.8 29948-DC 1285 h 2mm m -16.3H2.6 29949-DC 664 h -7.115.2 29950-DC 470 h 1 mm m 42.5±6.4 29951 -DC 1162 h -22H 3.2 29952-DC 732 h -15.711.8 29953-DC 1096 h -1 1±3.3 29954-DC 1389 h -10.2±10.1 29955-DC 737 h -12.2±4.3 29956-DC 141 1 h -14.518.4 29957-DC 282 h 2mm m 42.411.2 29958-DC 851 h -50.416.8 29959-DC 1415 h 2mm m -9.913.8 29960-DC 1377 h 2mm m 5.916.4 29961 -DC 388 h 2mm m -23.514.6 29962-DC 1240 h 21.312.2 29963-DC 362 h 18.512.2 29964-DC 929 h 19.613.9 29965-DC 596 h 4.816.3 29966-DC 1375 h 2mm m -12.717.4 29967-DC 494 m 34.718.4 29968-DC 671 m 7 8.7 29969-DC 1790 m 72.714.5 29970-DC 1472 m 2mm h 69.414.8 29971-DC 2488 m 7514.7 29972-DC 1262 m 71.715.5 CUADRO 3 (Continuación) En el cuadro 4 se presentan los datos del resumen de la potencia y eficacia del knockdown de ARNm de Bachl en células humanas para algunas moléculas de ANci. Las células para los experimentos se trataron con 12 concentraciones de ANci que variaban de 0.083 fM a 30 nM. Todos los datos se presentan como % de knockdown de Bachl normalizado contra el grado de expresión ARNm de GAPDH. Entonces los datos se determinaron como un % de knockdown relativo al ANci de control no dirigido.

CUADRO 4 Resumen de la eficacia (% KD) y potencia (Clsg) del knockdown del ARNm de Bachl por guías de ARNci en células A549 humanas Los datos de este cuadro son de tres experimentos separados. Los valores son la media ± desviación estándar.

También se evaluó la especificidad de estos ANci. Estos ANci se probaron a una concentración más baja (1 nM contra la concentración del examen original de 10 nM) para determinar el efecto de los ANci de Bachl sobre el transcrito de ARNm de GAPDH humano. No se observó reducción significativa de GAPDH en respuesta a ninguno de los ANci guías de Bachl con respecto a los cambios observados en las células tratadas con ANci de control universal. Los datos se muestran en el cuadro 5.

CUADRO 5 Resumen de los datos del examen de ARNm de Bachl y el examen de especificidad de GAPDH Los datos de este cuadro son de tres experimentos.

También se evaluó el potencial de varios ANci para destruir (knockdown) la proteína Bachl . Como no se tuvieron disponibles reactivos validados para rastrear directamente los cambios en la expresión de la proteína, esto se hizo evaluando el aumento del ARNm de HMOX-1 en respuesta a dosis crecientes de los ANci de Bachl activos.

Los ANci se probaron en un solo punto de tiempo después de la transfección (24 h). Este fue el punto de tiempo en el que se habían determinado previamente las concentraciones de ARNm de Bachl . También se probó el ANci de control no dirigido en cada placa de muestras y se encontró que las seis placas muestran un máximo de 29 ± 12% de aumento de la concentración de HMOX-1.

En el cuadro 6 se muestra la comparación del porcentaje de aumento máximo en HMOX-1 y CE50> y el porcentaje de disminución máximo de Bachl y CI50. El cuadro 6 también incluye la medición de la significancia estadística para el aumento de las concentraciones de ARNm de HMOX-1 en respuesta al tratamiento con el ANci de Bachl respectivo.

CUADRO 6 Comparación entre la reducción máxima de ARNm de Bachl y Cls0, y el aumento máximo de ARNm de HMOX-1 y CE 50 Los valores son la media ± SD.

EJEMPLO 2 Evaluación in vitro de los ANci en células epiteliales bronquiales humanas Los ANci con los números de ID de dúplex que corresponden a 29961 -DC, 29964-DC, 29984-DC, 29988-DC, 29957-DC, 29947-DC y 29956- DC, se probaron para determinar el knockdown máximo del ARNm de Bachl y su potencia en células epiteliales bronquiales humanas, de la siguiente manera.

Preparación del cultivo de células Células epiteliales bronquiales humanas (células NHBE) obtenidas de Lonza (No. cat. CC-2540) se desarrollaron a 37°C en presencia de 5% de C02 y se cultivaron en medio basal BEBM (Lonza No. cat. CC-3171) en matraces revestidos con Biocoat Collagen 1 (Becton Dickinson).

Transfección Las células NHBE se sembraron en placas revestidas con colágeno 1 y se cultivaron en medios de cultivos apropiados. Las células se cultivaron 24 horas después de sembrar, a 37° en presencia de 5% de C02. Los ANci se diluyeron en OptiMEM 1 a 1 uM y el agente de transfección a 25 pg/ml. Para la formulación de los ANci se combinaron volúmenes iguales del ANci diluido y el lípido de suministro, y se incubaron 20 minutos a temperatura ambiente. Entretanto, las células se sometieron a tripsinación y se resuspendieron en medio BEBM libre de antibiótico a 150,000 células/ml. Se agregaron 20 µ? del ANci formulado y 80 µ? de medio BEBM por pocilio en una placa de 96 pocilios (6 duplicados/punto dato/concentración de ANci), a fin de dar una escala de dosis de nueve puntos de los ANci (100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.03 nM, 0.01 nM). El tiempo de incubación con los complejos de transfección-ANci fue de 48 horas, con un cambio de medio a las 24 horas.

Aislamiento del ARN de la placa de 96 pocilios Se aisló ARN total de las células en el formato de placa de 96 pocilios usando el sistema automático de aislamiento de ARN total SV96 (Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó la estación de trabajo automático Biomek 2000 Laboratory Automation Workstation (Beckman Coulter) para aplicar los lisados celulares transfectados a una membrana de sílice. Después se aplicó DNasa I libre de RNasa directamente a la membrana de sílice para digerir el ADN genómico contaminante. El ARN total unido se purificó adicionalmente de las sales, proteínas e impurezas celulares contaminantes mediante pasos de lavado simples. Finalmente el ARN total se eluyó de la membrana agregando agua libre de nucleasa.

RT-PCR cuantitativa (TaqMan) Se usó una serie de sondas e iniciadores para detectar transcritos de ARNm de Bachl , OAS1 , IL8 y GAPDH (como control/normalización) en las líneas de células humanas. Las pruebas se hicieron en un instrumento ABI 7900HT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las series de sondas e iniciador usadas son: CUADRO 7 Seríes de sondas e iniciadores TAMRA (Tetrametil-6-carboxirrodamina) es un colorante desactivador FAM (carboxifluoresceína) es un colorante reportero Cálculos Con los datos de Taqman los valores de umbral críticos (Ct) se convirtieron en números de copias que corresponden al gen particular analizado en cada pocilio de la placa de 384 pocilios. Se prepararon seis pocilios idénticos en cada placa para un tratamiento dado. Por lo tanto, se calculó el número promedio de copias de gen y la desviación estándar. La determinación del porcentaje del coeficiente de variación (CV) (% C.V.= [desviación estándar/promedio]* 100) permitió la omisión de pocilios cuyo valor era un valor atípico (de tal manera que % C.V. <25). La abundancia relativa (conocida también como expresión relativa) de un gen se determinó dividiendo el número medio de copias de este gen con su contraparte de GAPDH en esa muestra particular.

Análisis estadístico de los datos Los valores de CE50 se calcularon de los datos usando una gráfica sigma. Todos los cálculos de la eficacia y la potencia se los ANci se hicieron con respecto al ANci de control no dirigido. El porcentaje de knockdown se comparó entre los cuatro ANci guías. Los datos se analizaron usando una prueba de ANOVA y después los valores p se corrigieron por comparaciones múltiples usando la corrección de tasa de descubrimiento falso (FDR). También se hizo una gráfica de 95% de intervalo de confianza para mostrar gráficamente en dónde fueron significativamente diferentes entre sí las guías.

Resultados Los ANci 29961 -DC, 29964-DC, 29984-DC, 29988-DC, 29957-DC, 29947-DC y 29956-DC (sitios objetivo 388, 929, 356, 364, 282, 472 y 1411 , respectivamente) mostraron un knockdown (KD) máximo y también dependiente de la dosis del ARNm de Bachl en células epiteliales bronquiales normales (NHBE), poniendo de manifiesto una eficacia y una potencia elevadas. Los mismos ANci se usaron para demostrar una regulación positiva del ARNm de hemooxigenasa (HO-1 ) con respecto al knockdown de ARNm de Bachl . El cuadro 8 muestra los datos medios de tres donadores individuales de NHBE, con los ANci haciendo blanco en Bachl 48 horas después de la transfección.

CUADRO 8 Knockdown y potencia de los ANci de Bachl en células epiteliales bronquiales humanas ID ANci Sitio CE50 Knockdown CE50 Máximo de objetivo máximo de regulación regulación ARNm positiva de positiva de HMOX1 HMOX1 29961-DC 388 7.87nM 80% 50.43nM 10266% 29964-DC 929 9.52n 72% 30.27nM 4800% 29984-DC 356 23.16nM 65% 388nM 153% 29988-DC 364 3.84nM 70% 34.4nM 550% 29957-DC 282 0.95n 70% 29.82nM 290% 29947-DC 472 4.31 n 65% 575nM 1566% 29956-DC 141 1 2.16nM 68% 33.09nM 2416% Los datos de CE50, datos de knockdown máximo de ARNm, datos de CE50 de HMOX1 y datos de máximo de HMOX1 , son una media de 3 donadores.

EJEMPLO 3 Pruebas de los ANci para inmunoestimulación mediada por TLR3, TLR7 y TLR8 Células NHBE se trataron como se describe arriba en el ejemplo 2 y se usaron para medir la inmunoestimulación mediada por TLR3 endosómico, con la inclusión de Poli-l:C como control positivo para la regulación positiva del ARNm de OAS1. Para medir la inmunoestimulación mediada por TLR3 unido a membrana, las células NHBE se cultivaron a 1200 células/por 96 pocilios y los ANci se administraron en PBS en ausencia de un vehículo de suministro a (100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.03 nM, 0.01 nM).

Las respuestas de inmunoestimulación mediada por TLR3 de superficie celular se midieron registrando el % de aumento de la concentración de ARNm de OAS1 cuando las células NHBE se trataron con los ANci en ausencia de un vehículo de suministro (% de aumento de la concentración de ARNm de OAS1 con respecto al diluente de PBS).

Para determinar el % de aumento de la concentración de ARNm de OAS1 (biomarcador de inmunoestimulación) de la inmunoestimulación mediada por TLR3, se determinaron nueve puntos de dosis-respuesta usando una concentración de 0.01-100 nM de siete ANci, 29961-DC, 29964-DC, 29947-DC, 29988-DC, 29984-DC, 29956-DC y 29957-DC.

La inmunoestimulación mediada por TLR3 endosómico se midió registrando el % de aumento de la concentración de ARNm de OAS1 cuando las células NHBE se transfectaron con los ANci (% de aumento de la concentración de ARNm de OAS1 con respecto al control de agente de transfección). El agonista de TLR3 Poli-l:C se usó como un control positivo para la inducción de ARNm de OAS1.

Células U20S-TLR7 humanas y U20S-TLR8 humanas se desarrollaron a 37 grados en presencia de 5% de C02 y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbeco (DMEM), 1 % de aminoácidos no esenciales, suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 pg/ml de estreptomicina y 100 g/ml de penicilina. Se mantuvo una expresión estable de TLR7 y TLR8 agregando 300 pg/ml de gentamicina.

Células de osteosarcoma U2OS que expresan TLR7 y TLR8 se sembraron en un formato de placa de 96 pocilios a una concentración de 2x104 células/pocilio, 24 horas antes de la transfección. Las células se transfectaron con los ANci usando el reactivo de transfección de lípido DharmaFECTI , usando como controles Resiquimod (R848) y el oligonucleótido ssRNA40 rico en GU, en complejo con LyoVec, respectivamente, (100 µ?/pocillo) (DharmaFECTI se usó como el agente de suministro para los ANci pues combina bajos efectos inmunoestimuladores con alta eficiencia de suministro). El medio de tratamiento se reemplazó después de 6 horas con DMEM que contenía antibiótico. Las células se cosecharon 24 horas después de la transfección. El R848 y ssRNA40 son agonistas caracterizados de los dos receptores por estimulación; las células de osteosarcoma transformadas mostraron un aumento en la expresión de IL8 de la manera de dosis-respuesta. Se estableció una escala de concentración de agonista de 4-10 pg/ml puesto que esta causó un grado óptimo de expresión de ARNm de IL8 para la prueba. En la línea de células U20S nativas que carecen de TLR no se observó expresión significativa de IL8 después del tratamiento con los dos agonistas, R848 y ssRNA40.

La inmunoestimulación mediada por TLR7 y TLR8 se midió por el aumento de la concentración de ARNm de IL8 cuando los ANci se formularon con DharmaFECTI (Gibco BRL) y se suministraron a las células U20S, que fueron modificadas por ingeniería para expresar establemente TLR7 o TLR8. Las células se trataron con los agonistas de TLR7 y TLR8, Resiquimod (R848) y ssRNA40/LyoVec, respectivamente, para actuar como controles positivos para la inducción de ARNm de IL8. La concentración de ARNm de IL8 se usó como un biomarcador de la inmunoestimulación mediada por TLR7 y TLR8.

Resultados Como se muestra en la figura 11 , cinco de los siete ANci probados, específicamente 29961-DC, 29964-DC, 29947-DC, 29988-DC, 29984-DC (sitios objetivo 388, 929, 472, 364 y 356, respectivamente), no mostraron actividad inmunoestimuladora mediada por TLR8 como lo demostró la ausencia de inducción de ARNm de IL8 48 horas después del suministro, con respecto al agonista de control ssRNA40.

Similarmente, estos mismos cinco ANci, 29961 -DC, 29964-DC, 29947-DC, 29988-DC, 29984-DC (sitios objetivo 388, 929, 472, 364 y 356, respectivamente) mostraron poca o ninguna actividad inmunoestimuladora mediada por TLR7, como lo demuestra la ausencia de inducción de ARNm de IL8 48 horas después del suministro, con respecto al agonista de control R484 (véase la figura 12).

Los datos de la actividad inmunoestimuladora de los ANci de Bachl probados se resumen en el cuadro 9 a continuación.

CUADRO 9 Resumen de la actividad inmunoestimuladora de TLR3, TLR7 y TLR8 de los ANci de Bachl EJEMPLO 4 Evidencia de la función de Bachl en la COPD Se obtuvieron células epiteliales humanas de vías respiratorias por medio de bronquioscopía de un sujeto masculino de 62 años con COPD (35 cajetillas-años). Las células se sembraron a una densidad de 1 x105 células en una placa de 24 pocilios y se incubaron a 37 °C y 5% de CO2 durante la noche. Las células se transfectaron con SmartPool de ANci de BACH1 de Dharmacon durante 72 horas en medio basal epitelial bronquial con suplementos (Lonza). Se crearon lisados de células completas para detectar la expresión de la proteína hemooxigenasa 1 (HO-1) por medio de Western blot.

Los lisados de células completas se cuantificaron y en un gel de Tris-Hcl 12.5% se cargaron 5 g de proteína por carril. Se usó una dilución de 1:5000 de anticuerpo policlonal anti-hemooxigenasa 1 humana (Assay Designs) para detectar la concentración de la proteína HO- . El blot se raspó y se volvió a sondear con un anticuerpo de beta-actina para confirmar una carga igual.

Como se muestra en la figura 13, el ANci obtenido del SmartPool de BACH1 de Dharmacon aumentó la expresión de la proteína HO-1 de manera dependiente de la concentración en las células epiteliales de pulmón obtenidas del sujeto con diagnóstico de COPD. Los controles positivos Sulforafane (un inhibidor de KEAP1 conocido) y hemina (un desactivador de BACH1 común) también aumentaron la expresión de proteína HO-1 después de un periodo de tratamiento de 18 horas. Se usaron como controles negativos ANci no dirigido, GAPDH, o SmartPools de ANci de HO-1 de Dharmacon.

EJEMPLO 5 Pruebas de inmunoestimulación in vivo en las vías respiratorias de ratas CP machos Ratas CD machos se anestesiaron y se les administró por vía intratecal una dosis de 200 µ? de vehículo, Poli-l:C (1 mg/kg) o ANci (10 mg/kg). Veinticuatro horas después, las ratas se sometieron a eutanasia y los pulmones se lavaron 3 veces con 5 mi de PBS heparinizada. Se hicieron conteos totales y diferenciales de células y también análisis de citocina en el fluido de lavado de pulmón.

Como se muestra en la figura 14, no se observaron aumentos significativos de la afluencia de células inflamatorias (neutrófilos y macrófagos) ni producción de citocina después de la administración intratraqueal de los ANci 29961 -DC, 29964-DC, 29947-DC y 29988-DC.

EJEMPLO 6 Determinación in vivo de las acciones de los ANci administrados por vía tópica a las vías respiratorias Después de la identificación de las construcciones de ANci activos in vitro, se puede evaluar la actividad de los ANci tras su administración tópica a las vías respiratorias en una variedad de especies de laboratorio -un ejemplo típico es la rata, usando el método que se resume abajo. Mientras los animales están ligeramente anestesiados con isoflurano (4.5% en oxígeno) y óxido nitroso (anestésicos suministrados en una proporción de 1 :3), se les inyecta en la tráquea un ANci, un control adecuado de secuencia revuelta, o vehículo, en un volumen de 200 µ?, por medio de una cánula colocada trans-oral mente. Para facilitar la administración del material los animales se ponen boca arriba y se colocan sobre una mesa de dosificación a un ángulo de aproximadamente 45°, para facilitar la visualización de las vías respiratorias por medio de una fuente de luz fría colocada sobre la garganta. Alternativamente, la administración se puede hacer por vía intranasal a los animales anestesiados por medio de una pipeta (volumen de la dosis de 25 µ? por orificio nasal). En otros estudios, unos roedores conscientes se ponen en una cámara circular Perspex y se exponen a un aerosol de material de prueba nebulizado durante por lo menos 20 min. Cuando se termina cada procedimiento de dosificación, los animales se regresan a jaulas de alojamiento normales y se les permite acceso libre a agua y alimento. Después, grupos de animales (normalmente n=4-6) se someten a una eutanasia humanitaria por inyección i.p. de pentobarbital, a intervalos establecidos posteriores a la dosificación. Inmediatamente se extraen muestras de células y tejidos de las vías respiratorias y se colocan en Trizol o RNAIater para la extracción y análisis subsiguientes de ARNm. En algunos estudios el tejido de las vías respiratorias se fija en 4% de paraformaldehído para análisis histológico subsiguiente. En otros experimentos las vías respiratorias se lavan para análisis de poblaciones de leucocitos infiltrantes o contenido de citocina/mediador. La extracción del ARN se hace usando los métodos estándares y se usa QRT-PCR para cuantificar la expresión del ARNm objetivo de interés entre los animales tratados con ARNci activo y de control, y para determinar si se ha logrado el knockdown objetivo. En algunos casos, el grado de expresión del ARNm se normaliza con respecto al gen de mantenimiento, GAPDH, o el marcador epitelial específico, E-cadherina.

Preparación de materiales Se preparan soluciones de ANci no formulados y controles de secuencia revuelta en solución salina amortiguadora de fosfato. También se puede usar una gama de materiales formulados -en cada caso los efectos de un ANci se comparan con los del volumen equivalente del control de secuencia revuelta.

EJEMPLO 7 Preparación de formulaciones de ANci/vehículo encapsulados en nanopartículas Preparación general de LNP Se prepararon soluciones de nanopartículas de ANci disolviendo moléculas de ANci o vehículo en solución amortiguadora de citrato 25 mM (pH 4.0) a una concentración de 0.9 mg/ml. Se prepararon soluciones de lípido disolviendo una mezcla de lipido catiónico (por ejemplo CLinDMA o DOBMA, véanse las estructuras y proporciones de las formulaciones en el cuadro 13), DSPC, colesterol y PEG-DMG (proporciones mostradas en el cuadro 13), en etanol absoluto, a una concentración de aproximadamente 15 mg/ml. La proporción de nitrógeno a fosfato fue de aproximadamente 3:1.

Se suministró un volumen igual de soluciones de ANci/vehículo y lipido con dos bombas de FPLC a las mismas velocidades de flujo, a un conector T de mezclado. Se usó una válvula de contrapresión para ajustar al tamaño de partícula deseado. La mezcla lechosa resultante se recogió en una botella de vidrio estéril. Después, esta mezcla se diluyó lentamente con un volumen igual de la solución amortiguadora de citrato, y se filtró a través de una membrana de intercambio iónico para remover cualquier ANci /vehículo libre en la mezcla. Se utilizó ultrafiltración contra la solución amortiguadora de citrato (pH 4.0) para remover el etanol (tira de prueba de ALCO-screen), y contra PBS (pH 7.4) para intercambiar el amortiguador. El LNP final se obtuvo concentrando a un volumen deseado y se filtró en estéril a través de un filtro de 0.2 pm. Los LNP obtenidos se caracterizaron en función del tamaño de partícula, el potencial zeta, contenido de alcohol, contenido total de lipido, ácido nucleico encapsulado y concentración total de ácido nucleico.

Procedimiento de fabricación de LNP En un ejemplo no limitativo se preparó una formulación a granel de LNP-086 - ANci/vehículo de la siguiente manera. El procedimiento consiste en (1) preparar una solución de lípido; (2) preparar una solución de ANci/vehículo; (3) mezclado/formación de partícula; (4) incubación; (5) dilución; (6) ultrafiltración y concentración. 1. Preparación de la solución de lípido Se sometieron a despirogenación un matraz de fondo redondo de 2 I de 3 cuellos, un condensador, probetas y dos recipientes cónicos de vidrio de 10 I. Los lípidos se calentaron a temperatura ambiente. En el matraz de fondo redondo de 3 cuellos se pusieron con una pipeta 50.44 g de CLinDMA y se le agregaron 43.32 g de DSPC, 5.32 g de colesterol, 6.96 g de PEG-DMG, y 2.64 g de alcohol linoleílico. A la mezcla se la agregó 1 I de etanol. El matraz de fondo redondo se puso en una mantilla de calentamiento que se conectó a un controlador de proceso J-CHEM. La suspensión de lípido se agitó bajo argón con una barra agitadora y un condensador arriba. Se puso una sonda de termopar en la suspensión a través de uno de los cuellos del matraz de fondo redondo con un adaptador sellado. La suspensión se calentó a 30 °C hasta que se hizo transparente. La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente, se transfirió a un recipiente cónico de vidrio y se selló con una tapa. 2. Preparación de la solución de ANci/vehículo En un recipiente estéril, como la botella de almacenamiento Corning, se pesaron 3.6 g por el factor de corrección de agua (aproximadamente 1.2) de polvo del ANci-1. El ANci se transfirió a un recipiente de vidrio de 5 I despirogenado. El recipiente tarado se enjuagó 3x con solución amortiguadora de citrato (25 mM, pH 4.0, y 100 mM NaCI) y los enjuagues se pusieron en el recipiente de 5 I con la cantidad suficiente de solución amortiguadora de citrato para dar 4 I. La concentración de la solución de ANci se determinó con un espectrómetro de UV usando el siguiente procedimiento. Se retiran 20 µ? de la solución, se diluyen 50 veces hasta 1000 µ?, y la lectura de UV se registra a A260 nm usando la solución amortiguadora de citrato como blanco. Esto se repite. Si las lecturas de las dos muestras son consistentes, se toma el promedio y se calcula la concentración basándose en los coeficientes de extinción de los ANci. Si la concentración final sale de la escala de 0.90 ± 0.01 mg/ml, la concentración se ajusta agregando más polvo de ANci/vehículo, o agregando más solución amortiguadora de citrato. Este proceso se repitió para el segundo ANci, ANci-2. Se transfieren 4 I de cada solución de ANci de 0.9 mg/ml a un matraz de 10 I despirogenado.

Alternativamente, si la solución del ANci/vehículo comprendía un solo dúplex de ANci o vehículo, en lugar de un coctel de dos o más dúplex de ANci o vehículos, entonces el ANci/vehículo se disolvió en solución amortiguadora de citrato 25 mM (pH 4.0, 100 mM de NaCI) para obtener una concentración final de 0.9 mg/ml.

Después, la solución de lípido/etanol se esteriliza por filtración a través de un filtro estéril Pall Acropak 20 0.8/0.2 µ?t? PN 12203, recibiéndola en un recipiente de vidrio despirogenado usando una bomba peristáltica Master Flex Modelo 7520-40, para producir un material inicial estéril para el proceso de encapsulación. El proceso de filtración se hace a una escala de 80 mi con un área de membrana de 20 cm2. La velocidad de flujo es de 280 ml/min. Este proceso es escalable aumentando el diámetro de la tubería y el área de filtración. 3. Formación de la partícula -Paso de mezclado Se enciende una bomba AKTA P900 y se sanitiza poniendo 1000 mi de NaOH 1 N en un recipiente de vidrio de 1 I y 1000 mi de etanol al 70% en un recipiente de vidrio de 1 I, y acoplando la bomba con una tapa de presión para cada recipiente. Debajo de la salida de la bomba se pone un recipiente de vidrio de 2000 mi y la velocidad de flujo se ajusta a 40 ml/min durante un periodo de 40 minutos, llenando el sistema con argón a 0.07 MPa. Cuando se termina la sanitización, el gas se cierra y la bomba se guarda en las soluciones hasta que esté lista para usarse. Antes de usarse se verifica el flujo de la bomba usando 200 mi de etanol y 200 mi de solución amortiguadora de citrato estéril.

A la bomba AKTA se le acopla la solución estéril de lípido/etanol, la solución estéril de ANci/vehículo o el coctel de ANci/vehículo/solución amortiguadora de citrato, y un recipiente receptor despirogenado (2x el tamaño del lote) con tapa. El gas se abre y la presión se mantiene entre 0.03 y 0.07 MPa durante el mezclado. 4. Incubación La solución se mantuvo después de mezclar durante una incubación de 22 ±2 horas. La incubación se hizo a temperatura ambiente (20-25 °C) y la solución se protegió de la luz durante el proceso. 5. Dilución La solución de ANci-lípido se diluyó con un volumen igual de solución amortiguadora de citrato usando una bomba peristáltica de doble cabeza Modelo 7520-40 Master Flex, que se prepara con longitudes iguales de tubería y una conexión de T a una velocidad de flujo de 360 ml/min. 6. Ultrafiltración y concentración El procedimiento de ultrafiltración es un procedimiento cronometrado y las velocidades de flujo se deben monitorear cuidadosamente. Este es un procedimiento de dos pasos: el primer es un paso de concentración en donde se toma el material diluido de 32 litros a 3600 mi y a una concentración de aproximadamente 2 mg/ml.

En el primer paso, un Flexstand con una membrana de ultrafiltración GE PN UFP- 00-C-35A instalada se acopla con la bomba Quatroflow. Se agregan 200 mi de WFI al depósito, seguido por 3 litros de hidróxido de sodio 0.5 N que entonces se lavaron a través del producto retenido al desecho. Este procedimiento se repite tres veces. Después se lava el sistema con 3 I de WFI, seguido por 3 I de amortiguador de citrato.

Después se drena la bomba.

La solución de LNP diluida se pone en el depósito a la marca de 4 litros. La bomba se enciende y la velocidad de la bomba se ajusta de modo que la velocidad de flujo del producto permeado sea 300 ml/min, y el nivel de líquido sea constante de 4 I en el depósito. La bomba se detiene cuando toda la solución de LNP diluida ha sido transferida al depósito. La solución de LNP diluida se concentra a 3600 mi en 240 minutos ajustando la velocidad de la bomba conforme sea necesario.

El segundo paso es un paso de diafiltración que intercambia la solución amortiguadora de citrato en etanol a solución salina amortiguadora de fosfato. El paso de diafiltración tarda 3 horas y, nuevamente, la velocidad de flujo se debe monitorear cuidadosamente. Durante este paso, la concentración de etanol se monitorea por medio de GC del espacio superior. Después de 3 horas (20 volúmenes de diafiltración) se hace una segunda concentración para concentrar la solución a aproximadamente 6 mg/ml, o un volumen de 1.2 litros. Este material se recoge en un recipiente de vidrio despirogenado. El sistema se enjuaga con 400 mi de PBS a la velocidad de flujo alta, y la línea de producto permeado se cierra. Este material se recoge y se agrega a la primera recolección. La concentración esperada en este punto es de 4.5 mg/ml. Se determina la concentración y el volumen.

La tubería de alimentación de la bomba peristáltica se pone en un recipiente que contiene 72 I de PBS (filtrado a través de 0.05 pm), y la velocidad de flujo se ajusta inicialmente para mantener un volumen constante de 3600 mi en el depósito, y después se aumenta a 400 ml/min. La solución de LNP se somete a diafiltración con PBS (20 volúmenes) durante 180 minutos.

La solución de LNP se concentra hasta la marca de 1.2 litros y se recoge en una probeta de 2 I despirogenada. Se agregan 400 mi de PBS al depósito y se recicla la bomba durante 2 minutos. El enjuague se recoge y se añade a la solución de LNP recogida en la probeta.

Los LNP obtenidos se caracterizan en función del tamaño de partícula, el potencial Zeta, contenido de alcohol, contenido total de lípido, ácido nucleico encapsulado y concentración total de ácido nucleico.

El experto en la materia apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para lograr los objetivos y ventajas mencionadas, así como las inherentes a las mismas. Los métodos y composiciones aquí descritas actualmente son representativas de las modalidades preferidas, y son ejemplares y no se consideran limitaciones del alcance de la invención. A los expertos en la materia se les ocurrirán cambios y otros usos que están abarcados dentro del espíritu de la invención, definida por el alcance de las reivindicaciones.

CUADRO 10 Números de registro de Bachl NM_001186- SEQ ID NO: 149 ARNm del factor de transcripción básico de cierre de leucina 1 de homología de BTB y CNC 1 (BACH1) de Homo sapiens, variante de transcrito 2, gil45827688lreflNM_001 186.2I[45827688] NM_206866 ARNm del factor de transcripción básico de cierre de leucina 1 de homología de BTB y CNC 1 (BACH1) de Homo sapiens, variante de transcrito 1 , gil45827689lreflNM_206866.11[45827689] NM_00101 1545 ARNm del factor de transcripción básico de cierre de leucina 1 de homología de BTB y CNC 1 (BACH1) de Homo sapiens, variante de transcrito 3, gil59559716lreflNM_001011545.11Í59559716] AF124731 Cromosoma 21q22.1 PAC A20292 de Homo sapiens que contiene el gen BACH-1 , secuencia completa gil5306199lgblAF124731.2IAF124731 [5306199] NM_007520 ARNm de homología de BTB y CNC 1 (Bachl ) de Mus musculus, gil826591 13lreflNM_0075201 CUADRO 11 Ejemplos no limitativos de químicas de estabilización para construcciones de ANci químicamente modificado Química Pirimidina Purina casquete p=S Cadena "Stab 00" Ribo Ribo TT en extremos 3' S/AS "Stab 1 " Ribo Ribo - 5 en extremo 5' S/AS 1 en extremo 3' "Stab 2" Ribo Ribo - todos los enlaces Usualmente AS "Stab 3" 2'-fluoro Ribo - 4 en extremo 5' Usualmente S 4 en extremo 3' "Stab 4" 2'-fluoro Ribo extremos 5' y 3' - Usualmente S "Stab 5" 2'-fluoro Ribo - 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 6" 2'-0-Metil Ribo extremos 5' y 3' - Usualmente S "Stab 7" 2'-fluoro 2'-desox¡ extremos 5' y 3' - Usualmente S "Stab 8" 2'-fluoro 2'-0-Metil - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 9" Ribo Ribo extremos 5' y 3' - Usualmente S "Stab 10" Ribo Ribo - 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 11 " 2'-fluoro 2'-desox¡ - 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 12" 2'-fluoro LNA extremos 5' y 3' Usualmente S "Stab 13" 2'-fluoro LNA 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 14" 2'-fluoro 2'-desoxi 2 en extremo 5' Usualmente AS 1 en extremo 3' "Stab 15" 2'-desox¡ 2'-desoxi 2 en extremo 5' Usualmente AS "Stab 16" Ribo 2'-0-Metil extremos 5' y 3' Usualmente S "Stab 17" 2 -O-Metil 2'-0- etil extremos 5' y 3' Usualmente S "Stab 18" 2'-fluoro 2'-0-Metl extremos 5' y 3' Usualmente S "Stab 19" 2'-fluoro 2'-0-Metil extremo 3' S/AS "Stab 20" 2'-fluoro 2'-desoxi extremo 3' Usualmente AS "Stab 21 " 2'-fluoro Ribo extremo 3' Usualmente AS "Stab 22" Ribo Ribo extremo 3' Usualmente AS "Stab 23" 2'-fluoro* 2'-desoxi* extremos 5' y 3' Usualmente S "Stab 24" 2'-f)uoro* 2'-0- etil* - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 25" 2'-fluoro* 2'-0-Metil* - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 26" 2'-fluoro* 2'-0-Metil" - S/AS "Stab 27" 2'-fluoro* 2'-0- etil* extremo 3' S/AS "Stab 28" 2'-fluoro* 2'-0-Metil* extremo 3' S/AS "Stab 29" 2'-fluoro* 2'-0-Metil* 1 en extremo 3' S/AS "Stab 30" 2'-fluoro* 2'-0-Metil* S/AS "Stab 31 " 2'-fluoro* 2'-0-Metil* extremo 3' S/AS "Stab 32" 2'-fluoro 2'-0-Metil S/AS "Stab 33" 2'-fluoro 2'-desoxi* exiremos 5' y 3' - Usualmente S "Stab 34" 2'-fluoro 2'-0-Metil* extremos 5' y 3' Usualmente S "Stab 35" 2 -fluoro*1 2'-0- et¡rT Usualmente AS "Stab 36" 2'-fluoro*T 2'-0-Metil*T Usualmente AS CUADRO 11 (Continuación) Química Pirimidina Purina casquete p=S Cadena "Stab 3F" 2 -OCF3 Ribo - 4 en extremo 5' Usualmente S 4 en extremo 3' "Stab 4F" 2'-OCF3 Ribo extremos 5' y 3' - Usualmente S "Stab 5F" 2 -OCF3 Ribo - 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 7F" 2'-OCF3 2 -desoxi extremos 5' y 3' - Usualmente S "Stab 8F" 2 -OCF3 2'-0- etil - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 11 F" 2'-OCF3 2'-desoxi - 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 12F" 2'-OCF3 LNA extremos 5' y 3' Usualmente S "Stab 13F" 2'-OCF3 LNA 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 14F" 2'-OCF3 2 -desoxi 2 en extremo 5' Usualmente AS 1 en extremo 3' "Stab 15F" 2'-OCF3 2'-desoxi 2 en extremo 5' Usualmente AS 1 en extremo 3' "Stab 18F" 2'-OCF3 2'-0- etil extremos 5' y 3' Usualmente S "Stab 19F" 2'-OCF3 2'-0-Metil extremo 3' S/AS "Stab 20F" 2'-OCF3 2'-desoxi extremo 3' Usualmente AS "Stab 21 F" 2'-OCF3 Ribo extremo 3' Usualmente AS "Stab 23F" 2'-OCF3* 2'-desoxi* extremos 5' y 3' Usualmente S "Stab 24F" 2 -OCF3* 2'-0- etil* - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 25F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 26F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* - S/AS "Stab 27F" 2 -OCF3* 2'-0- etil* extremo 3' S/AS "Stab 28F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* extremo 3' S/AS "Stab 29F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* 1 en extremo 3' S/AS "Stab 30F" 2 -OCF3* 2'-0-Metil* S/AS "Stab 31 F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* extremo 3' S/AS "Stab 32F" 2'-OCF3 2'-0-Metil S/AS "Stab 33F" 2'-OCF3 2'-desoxi* extremos 5' y 3' - Usualmente S "Stab 34F" 2'-OCF3 2'-0-Metil* extremos 5' y 3' Usualmente S "Stab 35F" 2'-OCF3*T 2'-0-Metil*T Usualmente AS "Stab 36F" 2'-OCF3*T 2'-0-Metil*T Usualmente AS Notas: CAP = cualquier casquete terminal, véase por ejemplo la figura 5.

Todas las químicas Stab 00-34 pueden comprender residuos de timidina 3'-terminales (TT) Todas las químicas Stab 00-34 normalmente comprenden aproximadamente 21 nucleótidos, pero pueden variar como se describe en la presente.

Todas las químicas Stab 00-36 también pueden incluir un solo ribonucleótido en la cadena de sentido o pasajero en la posición de 11a base apareada del dúplex de ácido nucleico de doble cadena, determinado desde el extremo 5' de la cadena de antisentido o guia (véase la figura 4C) S = cadena de sentido AS = cadena de antísentido *Stab 23 tiene un solo ribonucleótido adyacente a 3'-CAP *Stab 24 y Stab 28 tienen un solo ribonucleótido en el extremo 5' *Stab 25, Stab 26, Stab 27, Stab 35 y Stab 36 tienen tres ribonucleótidos en el extremo 5' *Stab 29, Stab 30, Stab 31 , Stab 33, y Stab 34 cualquier purina en las primeras tres posiciones de nucleótido desde el extremo 5' son ribonucleótidos p = enlace de fosforotioato †Stab 35 tiene 2'-0-metil-U en tramos salientes 3' y tres ribonucleótidos en el extremo 5' †Stab 36 tiene tramos salientes 2'-0-metilo que son complementarías a la secuencia objelivo (tramos salientes naturales) y tres ribonucleótidos en el extremo 5'.

CUADRO 12 A- Ciclo de síntesis de 2.5 urnol, instrumento ABI 394 B- Ciclo de síntesis de 0.2 umol, instrumento ABI 394 Reactivo Equivalentes Cantidad Tiempo Tiempo Tiempo espera* espera * 2'-0- espera *ARN ADN metil Fosforamiditas 15 31 µ? 45 s 233 s 465 s S-Etil-tetrazol 38.7 31 µ? 45 s 233 min 465 s Anhídrido acético 655 124 µ? 5 s 5 s 5 s N-Metil-imidazol 1245 124 µ?. 5 s 5 s 5 s TCA 700 732 µ?_ 10 s 10 s 10 s Yodo 20.6 244 µ? 15 s 15 s 15 s Beaucage 7.7 232 µ?. 100 s 300 s 300 s Acetonitrilo NA 2.64 mL NA NA NA CUADRO 12 (Continuación) C- Ciclo de síntesis de 0.2 umol, instrumento de 96 pocilios * El tiempo de espera no incluye el tiempo de contacto durante el suministro * La síntesis en tándem utiliza acoplamiento doble de la molécula enlazadora CUADRO 13 Formulaciones de nanoparticula de lípido (LNP) Formulación Composición Proporción molar No.

L051 CLinDMA / DSPC / Col / PEG-n-DMG 48/40/10/2 L053 DMOBA / DSPC / Col / PEG-n-DMG 30/20/48/2 L054 DMOBA / DSPC / Col / PEG-n-DMG 50/20/28/2 L069 CLinDMA / DSPC / Colesterol / PEG- 48/40/10/2 Colesterol L073 pCLinDMA o CLin DMA/ DMOBA / DSPC 25/25/20/28/2 / Col / PEG-n-DMG L077 eCLinDMA / DSPC / Colesterol / 2KPEG- 48/40/ 10/2 Col L080 eCLinDMA / DSPC / Colesterol / 2KPEG- 48/40/10/2 DMG L082 pCLinDMA / DSPC / Colesterol / 2KPEG- 48/40/10/2 DMG L083 pCLinDMA / DSPC / Colesterol / 2KPEG- 48/40/10/2 Col L086 CLinDMA/DSPC/Colesterol/2KPEG- 43/38/10/2/7 DMG/alcohol linoleilico L061 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG 52/45/3 L060 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG 52/45/3 proporción N/P de 5 L097 DMLBA/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG 50/20/28/2 L098 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, 52/45/3 proporción N/P de 3 L099 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, 52/45/3 proporción N/P de 4 L100 DMOBA/DOBA/3% PEG-DMG, 52/45/3 proporción N/P de 3 L101 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Colesterol 52/45/3 L102 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Colesterol, 52/45/3 proporción N/P de 5 L103 DMLBA/Colesterol/2KPEG-Colesterol 52/45/3 L104 CLinDMA/DSPC/Colesterol/2KPEG- 43/38/10/2/7 colesterol/ alcohol linoleilico L105 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Col, 52/45/3 proporción N/P de 2 L106 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Col, 67/30/3 proporción N/P de 3 L107 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Col, 52/45/3 proporción N/P de 1.5 L108 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Col, 67/30/3 proporción N/P de 2 L109 DMOBA/DSPC/Colesterol/2KPEG-Col, 50 / 20/28 / 2 proporción N/P de 2 CUADRO 13 (Continuación) Formulación Composición Proporción molar No.

L110 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52 /45/3 N/P de 1.5 L111 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 67/30/3 N/P de 1.5 L112 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52 /45/3 N/P de 1.5 L113 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 67 /30 / 3 N/P de 1.5 L114 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 2 L115 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 67 /30/3 N/P de 2 L116 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 2 L117 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 2 L118 LinCDMA/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/38/ 10/2/7 alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.85 L121 2-CLIM/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG/, 48/40/10/2 proporción N/P de 3 L122 2-CLIM/ Colesterol/2KPEG-DMG/, proporción 68/30/2 N/P de 3 L123 CLinDMA/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/38/ 10/3/7 alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.85 L124 CLinDMA/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/36/10/4/7 alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.85 L130 CLinDMA / DOPC / Col / PEG-n-DMG, 48/39/ 10/3 proporción N/P de 3 L131 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/43/5 N/P de 3 L132 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/43/5 N/P de 3 L133 CLinDMA / DOPC / Col / PEG-n-DMG, 48/40/ 10/2 proporción N/P de 3 L134 CLinDMA / DOPC / Col / PEG-n-DMG, 48/37/10/5 proporción N/P de 3 L149 COIM/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG/, 48/40/10/2 proporción N/P de 3 L155 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG- 43/38/10/2/7 DMG/Linoleil alcohol, proporción N/P de 2.85 L156 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 45/43/10/2 proporción N/P de 2.85 CUADRO 13 (Continuación) Formulación Composición Proporción molar No.

L162 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 45/43/10/2 proporción N/P de 2.5 L163 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 45/43/10/2 proporción N/P de 2 L164 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 45/43/10/2 proporción N/P de 2.25 L165 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 40/43/15/2 proporción N/P de 2.25 L166 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 40/43/15/2 proporción N/P de 2.5 L167 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 40/43/15/2 proporción N/P de 2 L174 CünDMA/DSPC/DOPC/Colesterol/2KPEG- 43/9/27/ 10/4/7 DMG/ alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.85 L175 CLinDMA/DSPC/DOPC/Colesterol/2KPEG- 43/27/9/ 10/4/7 DMG/ alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.85 L176 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/38/ 10/4/7 alcohol linoleilico, proporción N/P de 2.85 L180 CLinD A/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/38/10/4/7 alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.25 L181 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/38/ 10/4/7 alcohol linoleílico, proporción N/P de 2 L182 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 45/41 / 10/4 proporción N/P de 2.25 L197 CODMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 43/36/ 10/4/7 proporción N/P de 2.85 L198 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG- 43/34/ 10/4/2/7 DMG/2KPEG-DSG/alcohol linoleilico, proporción N/P de 2.85 L199 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG- 43/34/ 10/6/7 DMG/alcohol linoleilico, proporción N/P de 2.85 L200 CLinDMA/Colesterol/2KPEG-DMG, 50/46/4 proporción N/P de 3.0 L201 CLinDMA/Colesterol/2KPEG-DMG, 50/44/6 proporción N/P de 3.0 L206 CLinDMA/Colesterol/2KPEG-DMG, 40/56/4 proporción N/P de 3.0 CUADRO 13 (Continuación) Proporción N/P = proporción de Nitrógeno/Fósforo entre el lipido catiónico y el ácido nucleico El 2KPEG utilizado es PEG2000, una polidispersión que normalmente puede variar de -1500 a -3000 Da (es decir, en donde PEG(n) es de aproximadamente 33 a aproximadamente 67, o en promedio ~45).

CUADRO 14 Estructura de CLinDMA Estructura de pCLinDMA Estructura de eCLinDMA Estructura de DEGCLinDMA Estructura de PEG-n-DMG n = aproximadamente 33 a 67, promedio = 45 para 2KPEG/PEG2000 Estructura de DMOBA Estructura de DMLBA Estructura de DOBA Estructura de DSPC Estructura del colesterol Estructura de 2KPEG-Colesterol n = aproximadamente 33 a 67, promedio = 45 para 2KPEG/PEG2000 Estructura de 2KPEG-D G n = aproximadamente 33 a 67, promedio = 45 para 2KPEG/PEG2000 Estructura de COIM Estructura de 5-CLIM y 2-CLIM

Claims (41)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 .- Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que comprende una primera cadena y una segunda cadena que tienen complementariedad entre sí, en donde por lo menos una cadena comprende por lo menos 15 nucleótidos de: 5 -GGAAUCCUGCUUUCAGUUU-3' (SEQ ID NO: D; 5 - AAACUGAAAGCAGGAUUCC-3' (SEQ ID NO: 143); 5'- GUCUGAGUGUCCGUGGUUA-3' (SEQ ID NO: 10); 5'- UAACCACGGACACUCAGAC-3' (SEQ ID NO: 144); 5'- GCAGUUACUUCCACUCAAG-3' (SEQ ID NO: 1 1); 5'- CUUGAGUGGAAGUAACUGC-3' (SEQ ID NO: 145); 5'- CUACACUGCUAAACUGAUU-3' (SEQ ID NO: 15); 5'- AAUCAGUUUAGCAGUGUAG-3' (SEQ ID NO: 146); 5'- GAUUUGCAGGUGAUGUUAA-3' (SEQ ID NO: 18); 5'- UUAACAUCACCUGCAAAUC-3' (SEQ ID NO: 147); 5'- AUUUGAACCUUUAAUUCAG-3' (SEQ ID NO: 42); 5'- CUGAAUUAAAGGUUCAAAU-3' (SEQ ID NO: 148); 5'- GUUAAAGGAUUUGAACCUU-3' (SEQ ID NO: 38) ; o 5'- AAGGUUCAAAUCCUUUAAC-3' (SEQ ID NO: 150); y en donde opcionalmente uno o más de los nucleótidos están modificados químicamente.

2 - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque ninguno de los nucleótidos está modificado.

3. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos un nucleótido es un nucleótido químicamente modificado.

4. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el nucleótido químicamente modificado es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido.

5. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el nucleótido químicamente modificado es un 2'-desoxinucleótido.

6. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el nucleótido químicamente modificado es un 2'-0-alquil-nucleótido.

7. - Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que comprende la fórmula (A), que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)x l NX4 [N]X5 -5' (A) en donde la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; en donde la cadena de antisentido comprende por lo menos 15 nucleótidos del SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, o SEQ ID NO: 150, y la cadena de sentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la cadena de antisentido; cada N es, independientemente, un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es un casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o está modificado químicamente; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótídos; X1 y X2 son, independientemente, enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 17 a 36; X4 es un entero de 1 1 a 35; y X5 es un entero de 1 a 6, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36.

8.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANcí) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque: (a) uno o más nucleótidos de pirimidina en las posiciones Nx4 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-O-alquil-nucleótidos, 2'-desoxinucleótidos, ribonucleótídos, o cualquier combinación de los mismos; (b) uno o más nucleótidos de purina en las posiciones Nx4 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-O-alquil-nucleótidos, 2'-desoxinucleótidos, ribonucleótídos, o cualquier combinación de los mismos; (c) uno o más nucleótidos de pirimidina en las posiciones NX3 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-0-alquil-nucleótidos, 2'- desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos; (d) uno o más nucleótidos de purina en las posiciones NX3 son independientemente 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-0-alquil-nucleótidos, 2'-desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o cualquier combinación de los mismos.

9 - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido; (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido; y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-0-alquil-nucleótido, 2'-desoxinucleótido, o ribonucleótido.

10.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-0-alquil-nucleótido; (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones ??3 es independientemente un 2'-desoxinucleótido.

1 1.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-0-alquil-nucleótido; (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido¡ y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es independientemente un ribonucleótido.

12.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; (b) cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es independientemente un ribonucleótido; (c) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido¡ y (d) cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es independientemente un ribonucleótido.

13. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque X5 es 3.

14. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque X1 es 2 y X2 es 2.

15. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque X5 es 3, X1 es 2 y X2 es 2.

16. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque X5 = 1 , 2, ó 3; cada X1 y X2 = 1 ó 2; X3 = 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ó 30; y X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ó 30.

17. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque X5 = 1 ; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 18.

18. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque X5 = 2; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 17.

19.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque X5 es 3; X1 es 2, X2 es 2, X3 es 19, y X4 es 16.

20.- Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5'- BGGAAuccuGcuuuc.AGuuuTTB -3' (Sentido) (SRQ ID NO: 43) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3'- UU c cuu AGGAcGAAAGu c AAA -5' (Antisentido) (SEQ ID NO: 44) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida; c es 2'- desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'- desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanos¡na; T es timidina; A es adenosina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U_ es 2'-0-metil-urid¡na; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

21- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

22. - Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' - BGucuGAGuGuccGuGGuuATTB -3 ' (Sentido) (SHQ II) N():61 ) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' UUcAGAcucAcAGGcAccAAU -5 ' (Antisentido) (Sl 'Q II) NO:62) en donde: cada B es un casquete abásico invertido; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitídina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouhdina; A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'- desoxiguanosina; T es timidina; A es adenosina; U es uridina; A es 2'-0-metil- adenosina; G es 2'-0-metil-guanos¡na; U es 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

23. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

24. - Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' BGcAGuuAcuuccAcucAAGTTB 3 ' (Sentido) (SEQ ID NO:63) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' UUcGucAAuGAAGGuGAGUUC 5 ' (Antisentido) (SEQ ID NO:64) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina; 6 es 2'-desoxiguanosina¡ T es timidina; C es citidina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

25.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

26.- Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' - BcuAcAcuGcuAAAcuGAuuTTB -3 ' (Sentido) (SEQ ID NO:71) I I I I I I I I I I M I I I I I I I 3 ' UUGAuGuGAcGAuuuGAcUAA -5 ' (Antisentido) (SEQ ID NO:72) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina; G es 2 -desoxiguanosina; T es timidina; A es adenosina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2 -O-metil-guanosina; U es 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

27. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

28. - Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' - BGAuuuGcAGGuGAuGuuAATTB -3 ' (Sentido) (SKQ I I) NO:77) I I I l I I I ! I I I I l I I I I I I 3 ' UUcuAAAcGuccAcuAcAAUU -5 ' (Antisentido) (SGQ II) NO:78) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida; c es 2'-desoxi-2'-fluorocitid¡na; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'-desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; A es adenosina; U es uridina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'-0-metll-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

29.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

30.- Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' - BAuuuGAAccuuuAAuucAGTTB -3 ' (Sentido) (SEQ TD NO: I 25) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' UüuAAAcuuGGAAAuuAAGUC -5 ' (Antisentido) (SBQ II) N0: I 26) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida; c es 2'- desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'- desoxiadenosina; G es 2'-desox¡guanosina; T es timidina; G es guanosina; U es uridina; C es citidina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'-0-met¡l-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

31. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

32. - Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5'- BGuuAAAGGAuuuGAAccuuTTB -3' (Sentido) (SEQ ID NO: 117) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3' UUcAA uuccuAAAcuuGGAA -5' (Antisentido) (SEQ ID NO: 118) en donde: cada B es una porción de casquete abásica invertida; c es 2 -desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es 2'- desoxiadenosina; G es 2'-desoxiguanosina; T es timidina; G es guanosina; A es adenosina; A es 2'-0-metil-adenosina; G es 2'-0-metil-guanosina; U es 2'- O-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

33.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

34.- Una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 7, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ó 32, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

35. - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 7, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ó 32, en una formulación de aerosol.

36. - El uso de la molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que de la reivindicación 7, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano que padece una afección que es mediada por la acción, o la pérdida de la acción, de Bachl .

37. - El uso de la molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de la reivindicación 20, 22, 24, 26, 28, 30 ó 32, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano que padece una afección que es mediada por la acción, o la pérdida de la acción, de Bachl .

38. - El uso que se reclama en la reivindicación 36, en donde la afección es una enfermedad respiratoria.

39.- El uso que se reclama en la reivindicación 37, en donde la afección es una enfermedad respiratoria.

40.- El uso que se reclama en la reivindicación 38, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística, asma, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis y sinusitis.

41.- El uso que se reclama en la reivindicación 39, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística, asma, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis y sinusitis.