KR20210043647A - B형 간염 바이러스 (HBV) dsRNA 제제 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본원 개시내용은 B형 간염 바이러스 (HBV) 게놈을 표적화하는 이중 가닥 RNA 제제 및 하나 이상의 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위해 이러한 제제를 사용하는 방법, 및 HBV 감염 또는 HBV-관련 장애, 예를 들면, 만성 B형 간염 감염을 갖는 대상자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 페이퍼 카피를 대신하여 텍스트 형식으로 제공되고, 이에 의해 명세서에 참조로서 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 화일의 명칭은 930385_410WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 화일은 83.1 KB이고, 2019년 8월 4일에 만들어졌고, EFS-Web을 통해 전자 제출된다.
전세계 4억명 초과의 사람들이 만성적으로 HBV로 감염되고, 따라서, 매년 600,000건 사망으로 추정되는 만성 간염, 경화, 간 기능상실, 및 간세포 암종 (HCC)과 같은 심각한 간 질환이 발병될 증가된 위험에 처한다.
만성 HBV 감염의 자연 진화는 하기 4개의 연속 상을 포함한다: (1) 조기 '면역관용(immunotolerant)' 상, 높은 수준의 바이러스 복제 및 최소 간 염증; (2) 면역 반응성 상, 유의한 간 염증 및 상승된 혈청 아미노트랜스퍼라제; 일부 환자에서 (3) '비-복제' 상으로 진행, 항-HBe로의 혈청전환(seroconversion), 검출가능하지 않거나 낮은 수준의 바이러스혈증 (PCR-기반 검정에 의해 2000 IU/ml 미만), 및 간 염증의 해소(resolution); 및 (4) HBeAg의 생산을 방지하지만 바이러스 복제를 방해하지 않는 특이적 바이러스 돌연변이의 발생으로 인한 HBeAg-음성 만성 B형 간염. 이러한 형태의 만성 B형 간염 (CHB)은 혈청 HBV DNA 및 혈청 아미노트랜스퍼라제 (ALT 및 AST) 수준을 변동시킴 및 진행성 간 질환을 특징으로 한다. CHB는 HBeAg-양성 또는 HBeAg-음성 CHB 중 어느 하나로 존재할 수 있다는 것을 주목하는 것이 중요한다. CHB를 갖는 환자의 종적(Longitudinal) 연구는 경화 발병의 5-년 누적 발생률이 8 내지 20%의 범위임을 나타낸다. 간 보상기전상실(decompensation)의 5-년 누적 발생은 대략적으로 20%이다. HCC의 전세계적 발생 정도는 증가되었고, 현재 5번째 가장 흔한 암이 되었다. HBV-관련 HCC의 연간 발생 정도는 높고, 경화가 확립되는 경우는 2-5%의 범위이다.
HBV를 위한 주요 치료 목적은 HBV 복제를 영구적으로 억압하고 간 질환을 개선시키는 것이다. 임상적으로 중요한 단기간 목적은 HBeAg- 혈청전환, 혈청 ALT 및 AST의 정상화, 간 염증의 해소, 및 간 보상기전상실의 예방을 성취하는 것이다. 치료의 궁극적 목적은 경화 및 간 암의 발병을 예방하여 생존을 연장하는 지속적 반응을 성취하는 것이다. HBV 감염은 감염된 간세포의 핵에서 특정한 형태의 바이러스 공유결합 폐환형 DNA (cccHBV DNA)의 지속 때문에 완전히 퇴치할 수 없다. 그러나, 혈청 HBsAg의 치료-유도된 청소율(clearance)은 만성 HBV 감염의 종료 마커이고, 가장 좋은 장기간 결과와 관련되었다.
HBV 치료의 현재 표준 방법은 인터페론- 또는 티모신 α1 -기반 면역요법 및 HBV 폴리머라제의 억제에 의한 바이러스 생산의 억압을 포함한다. HBV 폴리머라제 억제제는 바이러스 생산을 감소시키는데 효과적이지만, HBsAg를 신속하게 감소시키는데 효과가 거의 없거나 없고, 또는 제한된 수의 환자에서 장기간 치료로 HBsAg를 서서히 감소시킬 수 있다 (테노포비르 디소프록실 푸마레이트를 사용한 경우에서 처럼). 인터페론-기반 면역요법은 바이러스 생산 및 혈액으로부터 HBsAg의 조기 제거 둘 다의 감소를 성취할 수 있지만, 단지 적은 비율의 치료된 대상자에서만 그렇다. 혈액 중 HBsAg의 일반적으로 허용되는 역할은 항-HBsAg 항체를 격리하는 것이고, 감염성 바이러스 입자가 면역 검출을 도피하게 하고, 이는 HBV 감염이 만성 상태로 유지되는 이유 중 하나일 것 같다. 추가로 HBsAg, HBeAg, 및 HBcAg 모두는 면역-억제 성질을 갖고, HBV를 위한 현재 이용가능한 치료 중 어느 것의 투여 후, 환자의 혈액 중 이들 바이러스 단백질의 지속은 환자가 이들의 HBV 감염의 면역학적 조절을 달성하는 것을 막는데 상당한 영향을 줄 수 있을 것 같다.
3개의 주요 HBV 단백질 (HBsAg, HBeAg, 및 HBcAg) 모두가 면역억제 성질을 갖지만, HBsAg는 HBV 감염된 대상자의 순환에서 압도적인 대부분의 HBV 단백질을 포함한다. 추가로, HBeAg의 (혈청전환을 통한) 제거 또는 혈청 바이러스혈증의 감소는 HBV 감염 오프 치료(infection off treatment)의 지속된 제어 발생과 상관관계가 없는 반면, HBV 감염에서 혈액으로부터 혈청 HBsAg의 제거 (및 혈청전환)는 HBV 감염 오프 치료 (그러나 이는 단지 면역요법을 받고 있는 환자에서 적은 비율로 발생함)의 제어를 야기할 치료에 대한 항바이러스 반응의 잘-인식된 예후 지시자이다. 따라서, 3개의 주요 HBV 단백질 모두 (HBsAg, HBeAg, 및 HBcAg)의 감소는 억제 효과의 최적 제거를 야기할 수 있는 반면, HBsAg 단독 제거는 HBV 감염을 갖는 대상자에서 면역 기능의 대부분의 바이러스 억제를 제거하는데 자체로 그리고 자연히 충분할 것이다.
따라서, 많은 비율의 환자에서 HBV의 면역학적 조절을 회복시킬 수 있는 임의의 현재 치료 용법의 부재하에, 바이러스 복제를 억제할 뿐만 아니라 대부분의 환자에서 면역학적 조절을 회복할 수 있는 HBV 감염에 대한 효과적인 치료가 필요하다. 따라서, HBV로 감염되거나 HBV-연관 질환을 갖는 대상자를 위한 대안적인 요법 및 병용 요법이 당해 기술분야에 필요하다.
발명의 요지
일부 실시형태에서, 본원 개시내용은, B형 간염 바이러스 (HBV) 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도된 사일런싱 복합물 (RISC)-중재된 절단(cleavage)에 영향을 주는 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 제제를 제공한다. HBV 유전자는 세포 내에서, 예를 들면, 사람과 같은 대상자 내 세포 내에서 존재할 수 있다.
본원 개시내용은 또한 HBV 유전자의 발현을 억제하여 이득을 얻을 수 있는 장애, 예를 들면, HBV 감염 또는 HBV-연관 질환, 예를 들면, 만성 B형 간염 감염 (CHB)을 갖는 대상자를 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위해 HBV 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도된 사일런싱 복합물 (RISC)-중재된 절단에 영향을 주는 dsRNA 제제 조성물을 사용하여 치료하는 방법 및 요법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본원 개시내용은 HBV의 발현을 억제하는 dsRNA 제제를 제공한다. 예를 들면, 본원 개시내용은 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 dsRNA 제제를 제공하고, 여기서, 안티센스 가닥은 하기 열거된 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:16),
5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:18),
5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:20),
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:23),
5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:24),
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3' (서열 번호:25), 또는
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:28),
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
dA, dC, dG, 및 dT는 각각 2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트, 2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트이고;
(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)이고;
s는 포스포로티오에이트 링크(linkage)이다.
일부 실시형태에서, 센스 가닥은 변형된 뉴클레오티드 서열 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29)를 포함하고,
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
s는 포스포로티오에이트 링크이다.
일부 실시형태에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 하기 열거된 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
(a) 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:16) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(b) 5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:18) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(c) 5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:20) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(d) 5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:23) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(e) 5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:24) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(f) 5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3' (서열 번호:25) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29); 또는
(g) 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:28) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
dA, dC, dG, 및 dT는 각각 2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트, 2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트이고;
(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)이고;
s는 포스포로티오에이트 링크이다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제의 적어도 하나의 가닥은 2개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제의 이중 가닥 영역은 19-21개의 뉴클레오티드 쌍 길이이다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제의 각각의 가닥은 독립적으로 19-23개의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제의 각각의 가닥은 독립적으로 19-21개의 뉴클레오티드를 갖는다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 추가로 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 리간드는 dsRNA 제제의 센스 가닥의 3' 말단에 접합된다. 일부 실시형태에서, 리간드는 N-아세틸갈락토스아민 (GalNAc) 유도체이다. 특정 실시형태에서, 리간드는
이다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 하기 도식에 나타난 바와 같이 리간드에 접합된다:
여기서, X는 O 또는 S이다. 일부 실시형태에서, X는 O이다.
일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 하기 열거된 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고:
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:16),
5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:18),
5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:20),
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:23),
5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:24),
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3' (서열 번호:25), 또는
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:28),
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
dA, dC, dG, 및 dT는 각각 2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트, 2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트이고;
(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)이고;
s는 포스포로티오에이트 링크이다.
일부 실시형태에서, 본원 개시내용은 dsRNA 제제를 제공하고, 여기서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 하기 열거된 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고:
(a) 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:16) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(b) 5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:18) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(c) 5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:20) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(d) 5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:23) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(e) 5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:24) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(f) 5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3' (서열 번호:25) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29); 또는
(g) 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:28) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
dA, dC, dG, 및 dT는 각각 2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트, 2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트이고;
(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)이고;
s는 포스포로티오에이트 링크이고;
센스 가닥의 3' 말단은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤린올 (L96) 리간드에 접합된다.
또다른 측면에서, 본원 개시내용은 또한 본원에 개시된 dsRNA 제제를 포함하는 세포를 제공한다.
본원 개시내용은 또한 본원에 개시된 dsRNA 제제 및 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본원 개시내용은 또한 세포에서 B형 간염 바이러스 (HBV) 유전자 발현을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 본원에 개시된 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물과 접촉시켜, 세포에서 HBV 유전자의 발현을 억제시킴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 대상자 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 대상자는 사람이다. 일부 실시형태에서, 대상자는 HBV-연관 질환을 앓고 있다. 일부 실시형태에서 세포는 시험관내에 존재한다. 일부 실시형태에서, HBV 유전자 발현은 적어도 80%, 90%, 95%, 또는 98%, 또는 상기 검정 방법의 검출 수준 미만으로 억제된다.
본원 개시내용은 또한 세포에서 B형 간염 바이러스 (HBV)의 복제를 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 본원에 개시된 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물과 접촉시켜, 세포에서 HBV의 복제를 억제함을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 대상자 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 대상자는 사람이다. 특정 실시형태에서, 대상자는 HBV-연관 질환을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 시험관내에 존재한다. 특정 실시형태에서, 세포에서 HBV의 복제는 적어도 80%, 90%, 95%, 또는 98%, 또는 상기 검정 방법의 검출 수준 미만으로 억제된다.
본원은 또한, 대상자에게 치료학적 유효량의 본원에 개시된 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물을 투여하여, 대상자에서 HBV 항원의 수준을 감소시킴을 포함하는, HBV에 감염된 대상자에서 B형 간염 바이러스 (HBV) 항원의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, HBV 항원은 HBsAg이다. 일부 실시형태에서, HBV 항원은 HBeAg이다. 일부 실시형태에서, HBV 항원은 대상자로부터 혈청에서 측정한다. 일부 실시형태에서, 대상자는 HBeAg 양성이다. 일부 실시형태에서, 대상자는 HBeAg 음성이다. 일부 실시형태에서, HBV 항원 수준은 혈청에서 적어도 1 log10, 적어도 2 log10, 적어도 3 log10, 또는 적어도 4 log10; 또는 상기 검정의 검출 수준 미만으로 감소한다.
본원 개시내용은 또한, 대상자에게 치료학적 유효량의 본원에 개시된 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물을 투여하여, 대상자에서 HBV의 바이러스 로드(viral load)를 감소시킴을 포함하는, HBV에 감염된 대상자에서 B형 간염 바이러스 (HBV)의 바이러스 로드를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, HBV 바이러스 로드는 대상자로부터 혈청에서 측정한다. 일부 실시형태에서, 대상자는 HBeAg 양성이다. 일부 실시형태에서, 대상자는 HBeAg 음성이다. 일부 실시형태에서, HBV 바이러스 로드는 혈청에서 적어도 1 log10, 적어도 2 log10, 적어도 3 log10, 또는 적어도 4 log10; 또는 상기 검정의 검출 수준 미만으로 감소된다.
본원은 또한, 대상자에게 치료학적 유효량의 dsRNA 제제, 본원에 개시된 약제학적 조성물을 투여하여 대상자를 치료함을 포함하는, B형 간염 바이러스 (HBV) 감염 또는 HBV-관련 장애를 갖는 대상자의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상자는 HBeAg 양성이다. 일부 실시형태에서, 대상자는 HBeAg 음성이다. 일부 실시형태에서, HBV-관련 장애는 만성 간염이고, 대상자는 HBeAg 양성이다. 일부 실시형태에서, HBV-관련 장애는 만성 간염이고, 대상자는 HBeAg 음성이다.
상기한 방법의 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 대상자에게 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg, 또는 3 mg/kg 내지 10 mg/kg의 용량(dose)으로 투여된다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 대상자에게 3 mg/kg 내지 10 mg/kg의 용량으로 투여된다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 대상자에게 50 mg 내지 200 mg의 고정 용량으로 투여된다.
상기한 방법의 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 대상자에게 피하 투여된다.
상기한 방법의 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 대상자에게 2회 이상의 용량으로 투여된다.
상기한 방법의 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 대상자에게 1개월에 1회, 2개월에 1회, 또는 3개월에 1회 투여된다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 대상자에게 1개월에 1회 이하로 투여된다.
상기한 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 대상자에게 추가 치료제, 예를 들면, 하나 이상의 추가 치료제를 투여함을 포함한다. 추가 치료제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 항바이러스제, 역전사 효소 억제제, 면역 자극제, 치료 백신, 바이러스 진입 억제제, HbsAg의 분비 또는 방출을 억제하는 올리고뉴클레오티드, 캡시드 억제제, 및 공유결합 폐환형 (ccc) HBV DNA 억제제, 및 상기한 것들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 역전사 효소 억제제이다.
일부 실시형태에서, 하나 초과의 추가 치료제가 투여되고, 추가 치료제는 역전사 효소 억제제 및 면역 자극제이다. 역전사 효소 억제제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 (TDF), 테노포비르 알라펜아미드, 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르 (ETV), 텔비부딘, 및 AGX-1009를 포함할 수 있다. 면역 자극제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 페길화 인터페론 알파 2a (PEG-IFN-α2a), 인터페론 알파-2b, 재조합 사람 인터류킨-7, 및 Toll-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제를 포함할 수 있다.
본원은 또한 본원에 개시된 방법 중 어느 것을 실행하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 개시내용은 대상자에서 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염의 치료에서 사용하기 위한 본원에 개시된 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용은 대상자에서 B형 간염 바이러스 (HBV)-관련 장애의 치료에서 사용하기 위한 본원에 개시된 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, HBV-관련 장애는 만성 간염이고, 대상자는 HBeAg 양성이다. 일부 실시형태에서, HBV-관련 장애는 만성 간염이고, 대상자는 HBeAg 음성이다. 일부 실시형태에서, 대상자는 추가 치료제, 예를 들면, 항바이러스제, 역전사 효소 억제제, 면역 자극제, 치료 백신, 바이러스 진입 억제제, HbsAg의 분비 또는 방출을 억제하는 올리고뉴클레오티드, 캡시드 억제제, 또는 공유결합 폐환형 (ccc) HBV DNA 억제제, 또는 상기한 것들의 조합을 투여받고 있거나 투여받은 적이 있다. 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 역전사 효소 억제제, 예를 들면, 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 (TDF), 테노포비르 알라펜아미드, 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르 (ETV), 텔비부딘, 또는 AGX-1009이다. 일부 실시형태에서, 투여되는 추가 치료제는 역전사 효소 억제제 (예를 들면, 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 (TDF), 테노포비르 알라펜아미드, 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르 (ETV), 텔비부딘, 또는 AGX-1009) 및 면역 자극제 (예를 들면, 페길화 인터페론 알파 2a (PEG-IFN-α2a), 인터페론 알파-2b, 재조합 사람 인터류킨-7, 또는 Toll-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제)이다.
본원 개시내용은 상기 언급된 방법 중 어느 것을 실행하기 위한 본원에 개시된 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본원 개시내용은 또한 상기 언급된 방법 중 어느 것을 실행하기 위한 약제의 제제 또는 제조를 위한 본원에 개시된 dsRNA 제제의 용도를 제공한다.
본원 개시내용은 또한 임의로 본원에 기재된 방법을 실행하는 지시서와 함께본원에 개시된 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
도 1은 대략적으로 3.2 kb 이중 가닥 HBV 게놈의 구조를 도식적으로 나타낸다. HBV 게놈의 복제는 RNA 중간체를 통해 일어나고, 3개의 판독 프레임을 통해 해석되는 7개의 바이러스 단백질 (pre-S1, pre-S2, S, P, X, pre-C, 및 C)을 암호화하는 4개의 중첩 바이러스 전사체 (약 3.5 kb 전사, 약 2.4 kb 전사, 약 2.1 kb 전사, 및 약 0.7 kb 전사)를 생산한다.
도 2a-2b는 AAV-HBV 마우스 모델에서 투약-전(pre-dose)에 비하여 (A) 혈청 HBsAg 농도 (ng/mL) 및 (B) 혈청 HBsAg 수준을 나타낸다. 도 2a는 HBV-AAV 마우스 투약-전 (-24, -2, 0일째) 또는 0.3, 1, 또는 3mg/kg의 AD-81890의 단일 용량 후 (14, 21, 33, 47, 59, 74일째) HBsAg의 혈청 수준을 나타낸다. 각각의 포인트는 n=6-9 동물의 평균을 나타내고, 막대는 SD를 나타낸다. 도 2b는 투약-전 (-24, -2, 0일째), 또는 0.3, 1, 또는 3mg/kg의 AD-81890의 단일 용량 후 (14, 21, 33, 47, 59, 74일째)에 대한 HBV-AAV 마우스의 HBsAg의 혈청 수준을 나타낸다. 각각의 포인트는 n = 6-9 동물의 평균을 나타내고, 막대는 SD를 나타낸다.
도 3은 AAV-HBV 마우스 모델에서 투약-전에 비하여 -55, -27, -13, 0, 14, 28, 42, 56, 84, 112, 및 140일째에 혈청 HBsAg 수준을 나타낸다. 투약 용법(Dosing regimens)은 대조군 (PBS) Q2W x 6; AD-66810 (1 mg/kg; Q2W x 6); AD-81890 (1 mg/kg; Q2W x 6); AD-81890 (1 mg/kg; QM x 3); AD-81890 (3 mg/kg; Q2W x 6); AD-81890 (3 mg/kg; QM x 3); 및 AD-81890 (9 mg/kg; QM x 1)을 포함하였다. 첫번째 용량을 0일째에 투여하였다. 각각의 포인트는 n = 4-6 동물의 평균을 나타내고, 막대는 SD를 나타낸다.
도 4는 AD-66810 또는 AD-81890에서 유의하게 하향조절된 (조절된 p-값 < 0.05, log2 배수 변화 < 0) 모든 유전자에 대한 log2 배수 변화 (처리/대조군)를 나타내는 박스 플롯(boxplots)을 나타낸다. 두꺼운 수평선은 중앙값(median) log2 배수 변화를 나타내고, 각 박스의 수직 범위는 사분위간 범위 (IQR)를 나타내고, 위스커(whiskers)는 +/-1.58 IQR/sqrt(N)로 확장되고, 여기서, N은 각 그룹에서 유전자의 수이다. 통계학적 유의성을 웰치 2-측, 2-샘플 t-테스트를 사용하여 평가하였다.
도 5a-5b는 PBS 투여된 마우스에 비하여 AD-66810 (도 5a) 또는 AD-81890 (도 5b) 투여 후 PXB-마우스에서 경시적으로 ALT 수준을 나타낸다. 마우스에게 0, 21, 28, 35, 및 42일째에 12, 36, 또는 100 mg/kg의 AD-66810, AD-81890, 또는 PBS (대조군)를 피하 주사 (그룹당 n=4)로 투약하였다. 혈액을 안구뒤(retro-orbital) 출혈을 1주일에 2회 수집하고, 혈청을 통상의 방법을 사용하여 준비하였다.
도 2a-2b는 AAV-HBV 마우스 모델에서 투약-전(pre-dose)에 비하여 (A) 혈청 HBsAg 농도 (ng/mL) 및 (B) 혈청 HBsAg 수준을 나타낸다. 도 2a는 HBV-AAV 마우스 투약-전 (-24, -2, 0일째) 또는 0.3, 1, 또는 3mg/kg의 AD-81890의 단일 용량 후 (14, 21, 33, 47, 59, 74일째) HBsAg의 혈청 수준을 나타낸다. 각각의 포인트는 n=6-9 동물의 평균을 나타내고, 막대는 SD를 나타낸다. 도 2b는 투약-전 (-24, -2, 0일째), 또는 0.3, 1, 또는 3mg/kg의 AD-81890의 단일 용량 후 (14, 21, 33, 47, 59, 74일째)에 대한 HBV-AAV 마우스의 HBsAg의 혈청 수준을 나타낸다. 각각의 포인트는 n = 6-9 동물의 평균을 나타내고, 막대는 SD를 나타낸다.
도 3은 AAV-HBV 마우스 모델에서 투약-전에 비하여 -55, -27, -13, 0, 14, 28, 42, 56, 84, 112, 및 140일째에 혈청 HBsAg 수준을 나타낸다. 투약 용법(Dosing regimens)은 대조군 (PBS) Q2W x 6; AD-66810 (1 mg/kg; Q2W x 6); AD-81890 (1 mg/kg; Q2W x 6); AD-81890 (1 mg/kg; QM x 3); AD-81890 (3 mg/kg; Q2W x 6); AD-81890 (3 mg/kg; QM x 3); 및 AD-81890 (9 mg/kg; QM x 1)을 포함하였다. 첫번째 용량을 0일째에 투여하였다. 각각의 포인트는 n = 4-6 동물의 평균을 나타내고, 막대는 SD를 나타낸다.
도 4는 AD-66810 또는 AD-81890에서 유의하게 하향조절된 (조절된 p-값 < 0.05, log2 배수 변화 < 0) 모든 유전자에 대한 log2 배수 변화 (처리/대조군)를 나타내는 박스 플롯(boxplots)을 나타낸다. 두꺼운 수평선은 중앙값(median) log2 배수 변화를 나타내고, 각 박스의 수직 범위는 사분위간 범위 (IQR)를 나타내고, 위스커(whiskers)는 +/-1.58 IQR/sqrt(N)로 확장되고, 여기서, N은 각 그룹에서 유전자의 수이다. 통계학적 유의성을 웰치 2-측, 2-샘플 t-테스트를 사용하여 평가하였다.
도 5a-5b는 PBS 투여된 마우스에 비하여 AD-66810 (도 5a) 또는 AD-81890 (도 5b) 투여 후 PXB-마우스에서 경시적으로 ALT 수준을 나타낸다. 마우스에게 0, 21, 28, 35, 및 42일째에 12, 36, 또는 100 mg/kg의 AD-66810, AD-81890, 또는 PBS (대조군)를 피하 주사 (그룹당 n=4)로 투약하였다. 혈액을 안구뒤(retro-orbital) 출혈을 1주일에 2회 수집하고, 혈청을 통상의 방법을 사용하여 준비하였다.
상세한 설명
본원 개시내용은 B형 간염 바이러스 (HBV) 유전자의 RNA 전사체에 RNA-유도된 사일런싱 복합물 (RISC)-중재된 절단에 영향을 주는 dsRNA 제제 조성물을 제공한다. 유전자는 세포, 예를 들면, 사람과 같은 대상자 내에 세포 내에 존재할 수 있다. 이들 dsRNA 제제의 용도는 포유동물에서 상응하는 유전자 (HBV 유전자)의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다.
본원에 기재된 dsRNA 제제는 HBV의 적어도 8개의 공지된 유전자형에 걸쳐서 보존된 HBV 게놈에서 영역을 표적화하기 위해 설계되었다. 추가로, 본원 개시내용의 dsRNA 제제는 하나 초과의 HBV 유전자의 발현을 억제하여 HBV 수명 주기(life cycle), 예를 들면, 바이러스의 복제, 조립, 분비, 및 서브-바이러스 항원의 분비의 모든 단계를 억제하기 위해 설계되었다. 특히, HBV 게놈의 전사가 다시스트론(polycistronic), 중첩 RNA를 야기하기 때문에, 일부 실시형태에서 단일 HBV 유전자를 표적화하는 dsRNA 제제는 대부분 또는 모든 HBV 전사체의 발현의 유의한 억제를 야기한다. 예를 들면, HBV 게놈이 단일 mRNA로 전사되기 때문에, 본원 개시내용의 S 유전자를 표적화하는 dsRNA 제제는 S 유전자 발현 뿐만 아니라 "다운스트림" 폴리머라제 유전자의 발현의 억제를 야기할 것이다. 추가로, 본원 개시내용의 dsRNA 제제는 HBV 구조적 유전자를 표적화하여 HBV 바이러스 복제를 억제하기 위해 설계되고, 이에 의해 HBV X 유전자는 대상자의 면역 체계가 HBsAg의 존재를 검출하고 이에 반응할 수 있도록 항-HBV 항체를 생성하여 HBV 감염을 제거한다. 이론에 제한하려고 의도하지 않지만, 이들 dsRNA 제제에서 상기한 성질의 조합 또는 하위-조합 및 특이적 표적 부위 또는 특이적 변형이 본원 개시내용의 dsRNA 제제에 개선된 효능, 안정성, 안전성, 잠재력, 및 내구성을 부여하는 것으로 고려된다.
시험관내 및 생체내 검정을 사용하여, 본 발명의 발명자들은 HBV 유전자를 표적화하는 dsRNA 제제가 강력하게 RNAi를 중재하여, 하나 초과의 HBV 유전자의 발현의 유의한 억제를 야기할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 이들 dsRNA 제제를 포함하는 상기 방법 및 조성물은 HBV 감염 또는 HBV-연관 질환, 예를 들면, 만성 B형 간염 (CHB)을 갖는 대상자를 치료하는데 유용하다.
따라서, 본원 개시내용은 또한, HBV 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도된 사일런싱 복합물 (RISC)-중재된 절단에 영향을 미치는 dsRNA 제제 조성물을 사용하여, HBV 유전자의 발현의 억제 또는 감소로부터 이득을 얻는 장애, 예를 들면, 만성 B형 간염 바이러스 감염 (CHB)과 같은 HBV-연관 질환을 갖는 대상자를 치료하는 방법을 제공한다.
본원 개시내용의 dsRNA 제제는 약 19-21개의 뉴클레오티드 길이인 상보성(complementarity) 영역을 갖는 RNA 가닥 (안티센스 가닥)을 포함하고, 예를 들면, 적어도 하나의 HBV 유전자형의 HBV 유전자의 mRNA 전사의 적어도 부분에 대해 실질적으로 상보적(complementary)인 약 19개의 뉴클레오티드 길이이다. 본원 개시내용의 dsRNA 제제는 상이한 HBV 유전자형에 대한 이의 상보성 정도가 다양할 수 있는 다중 HBV 유전자형이 존재하는 것이 이해된다.
일부 실시형태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 19-21 인접한 뉴클레오티드를 형성한다.
하기 상세한 설명은 HBV 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 제조하고 이용하는 방법 뿐만 아니라 HBV 유전자의 발현의 억제 또는 감소로 이득을 얻을 수 있는 질환 및 장애를 갖는 대상자를 치료하기 위한 조성물, 용도, 및 방법을 개시한다.
I. 정의
본원 개시내용을 더욱 용이하게 이해할 수 있게 하기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가로, 파라미터의 값 또는 값의 범위가 나열될 때마다, 나열된 값에 대한 중간 값 및 범위가 또한 이러한 특성의 부분이 되는 것으로 의도된다는 것을 주의하여야 한다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 걸쳐서, 단어 "포함하다(comprise)" 및 이의 변형, 예를 들면, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 개방적이고 포괄적인 의미에서 해석되어야 하고, 즉, "이에 제한되는 것은 아니지만 포함하는(including, but not limited to)"로 이해되어야 한다. "로 이루어진(Consisting of)"은 본원에 개시된 다른 성분 또는 실질적인 방법 단계의 보다 많은 미미한 요소(trace elements) 이상을 배제하는 것을 의미하여야 한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는, 임의의 추가의 뉴클레오티드를 포함하지 않는 경우, 뉴클레오티드의 서열로 이루어지지만, 리간드, 예를 들면, 표적화 리간드, 또는 변형물의 포함이 제외되지 않는다. 용어 "로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 청구범위를 명시된 물질 또는 단계로 한정하거나 청구된 발명의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 것으로 한정한다. 예를 들면, 본원에 정의된 요소로 본질적으로 이루어진 약제학적 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물질 및 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 포스페이트 완충된 염수, 보존제 등을 배제하지 않을 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 길이의 최대 20%에 기여하고 폴리뉴클레오티드의 활성에 실질적으로 영향을 주지 않는 (예를 들면, 폴리뉴클레오티드의 활성을 50% 이하까지 변경시키는) 추가의 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어진다. 과도기적 용어 (transitional terms) 각각에 의해 한정되는 실시형태는 본 발명의 범위 내에 있다.
관사 하나 ("a" 및 "an")는 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)를 언급하기 위해 본원에 사용된다. 예의 방식으로, "하나의 요소(an element)"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소, 예를 들면, 다수의 요소를 의미한다.
용어 "포함하는(including)"은 구절 "이에 제한되는 것은 아니지만 포함하는(including but not limited to)"을 의미하기 위해 본원에 사용되고 이와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "또는"은, 정황상 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하기 위해 본원에 사용되고 이와 상호교환적으로 사용된다. 예를 들면, "센스 가닥 또는 안티센스 가닥"은 "센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥"으로서 이해된다.
용어 "약"은 당해 기술분야에서 허용되는 전형적인 범위 내를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들면, "약"은 평균으로부터 2 표준 편차 내로서 이해될 수 있다. "약"이 일련의 수 또는 범위 앞에 있는 경우, "약"은 일련의 수 각각 또는 범위를 변경할 수 있는 것으로 이해된다.
수 또는 일련의 수 앞에 용어 "적어도"는 정황상 명백한 논리적으로 포함될 수 있는 일련의 수 각각 및 모든 연속적인 수 또는 정수로서 이해된다. 예를 들면, 핵산 분자 중 뉴클레오티드의 수는 정수이어야 한다. 예를 들면, "21개의 뉴클레오티드 핵산 분자 중 적어도 18개의 뉴클레오티드"는, 18, 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오티드가 지시된 성질을 갖는다는 것을 의미한다. 적어도가 일련의 수 또는 범위 앞에 있는 경우, "적어도"는 일련의 수 각각 또는 범위를 변경할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 "이하(no more than)" 또는 "미만(less than)"은 구절에 인접한 값으로서 이해되고, 논리적인 더 낮은 값 또는 정수로 이해되고, 문맥에서 논리적인 값으로서 0까지로 이해된다. 예를 들면, "2개 이하의 뉴클레오티드"의 오버행을 갖는 듀플렉스는 2, 1, 또는 0개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. "이하(no more than)"가 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "이하"는 연속 또는 범위 내의 수 각각을 조정할 수 있다는 것이 이해된다.
본원에 사용된 범위는 상한 및 하한 둘 다를 포함한다.
전사 또는 다른 서열 상 서열 및 이의 지시된 위치 사이에 상충이 있는 경우에, 명세서에 인용된 뉴클레오티드 서열이 우선한다.
본원 개시내용의 다양한 실시형태는 당해 기술분야의 숙련가에 의해 적합하게 결정된 바와 같이 조합될 수 있다.
용어 "HBV"와 상호교환적으로 사용되는 본원에 사용된 "B형 간염 바이러스"는, 헤파드나비리대(Hepadnaviridae) 부류에 속하는 잘 공지된 비-세포병변, 간-지향성(tropic) DNA 바이러스를 언급한다.
HBV 게놈은 중첩 판독 프레임을 갖는 부분적으로 이중-가닥, 원형 DNA이다 (예를 들면, 도 1을 참조함).
크기를 기준으로 하여 HBV 게놈에 의해 암호화된 4개의 전사체 (이는 본원에 "유전자" 또는 "개방 판독 프레임"으로서 언급될 수 있음)이 존재한다. 이들은 C, X, P, 및 S로 칭명되는 개방 판독 프레임을 포함한다. 코어 단백질은 유전자 C에 의해 코딩된다 (HBcAg). B형 간염 e 항원 (HBeAg)은 프리-코어(pre-core) (pre-C) 단백질의 단백질분해 프로세싱으로 생산된다. DNA 폴리머라제는 유전자 P에 의해 암호화된다. 유전자 S는 표면 항원을 코딩하는 유전자이다 (HBsAg). HBsAg 유전자는, 대, 중, 및 소 S 항원, pre-S1 + pre-S2 + S, pre-S2 + S, 또는 S로 칭명되는 3개의 상이한 크기의 폴리펩티드를 야기하는, 3개의 인 프레임(in frame) "스타트(start)" (ATG) 코돈을 포함하는 하나의 긴 개방 판독 프레임이다. 표면 항원은 HBV의 외피를 데코레이팅(decorating)하는 이외에, 또한 서브바이러스 입자의 일부이고, 이는 비리온 입자와 비교하여 대량 초과로 생산되고, 면역 관용(immune tolerance) 및 항-HBsAg 항체 포획에서 역할을 하여, 이로서 감염성 입자가 면역 검출을 도피하도록 한다. 유전자 X에 의해 코딩되는 비-구조적 단백질의 기능은 완전히 이해되지 않지만, 전사 전이활성화 및 복제에서 역할을 하고, 간 암의 발병과 연관된다.
HBV는, 바이러스 게놈의 핵으로의 진입, 외피제거, 및 수송을 포함하는 다중 단계를 수반하는 복제 프로세스에서 역전사 효소를 이용하는, 수개의 DNA 바이러스 중 하나이다. 초기에, HBV 게놈의 복제는, 이어서 역 전사되어 DNA 바이러스 게놈을 생산하는, RNA 중간체의 생산을 포함한다.
HBV로의 세포 감염시, 바이러스 게놈 이완 원형 DNA (rcDNA)는 세포 핵 내로 수송되고, 에피솜 공유결합 폐환형 DNA (cccDNA)로 전환되고, 이는 바이러스 mRNAs를 위한 전사 템플레이트로서 역할을 한다. 전사 및 핵 외수송(export) 후, 세포질 바이러스 프리게놈(pregenomic) RNA (pgRNA)를 HBV 폴리머라제 및 캡시드 단백질로 어셈블리하여 뉴클레오캡시드를 형성하고, 이 안에서 폴리머라제-촉매화 역 전사는 마이너스-가닥 DNA를 생산하고, 후속적으로 플러스-가닥 DNA로 카피하여 자손 rcDNA 게놈을 형성한다. 이에, 성숙 뉴클레오캡시드는 바이러스 외피 단백질과 패키징되어 비리온 입자로서 나가거나, 핵으로 왕래하여 세포내 cccDNA 증폭 경로를 통해 cccDNA 저장소를 증폭시킨다. cccDNA는 HBV 복제 주기의 필수 성분이고, 감염의 확립 및 바이러스 지속에 원인이 된다.
HBV 감염은 하기 2개의 상이한 입자의 생산을 야기한다: 1) 감염성 HBV 바이러스 자체 (또는 Dane 입자), 이는 HBcAg로부터 어셈블리되는 바이러스 캡시드를 포함하고, HBV 표면 항원과 함께 지질 막으로 이루어진 외피로 씌워짐, 및 2) 비-감염성인, 소 및 중간 형태의 B형 간염 표면 항원 HBsAg을 포함하는 서브바이러스 입자 (또는 SVPs). 생산된 각각의 바이러스 입자의 경우, 10,000 초과의 SVPs가 혈액 내로 방출된다. 이와 같이, SVPs (및 이들이 운반하는 HBsAg 단백질)는 혈액에서 압도적인 대부분의 바이러스 단백질을 나타낸다. HBV 감염된 세포는 또한 HBV e-항원 (HBeAg)으로 칭명되는 프리-코어 단백질의 가용성 단백질분해 생산물을 분비한다.
A 내지 H로 설계되는, HBV의 8개의 유전자형을, 결정하고, 2개의 추가의 유전자형 I 및 J가 제안되고, 각각 별개의 기하학적 분포를 갖는다. 바이러스는 비-세포병변이고, 바이러스-특이적 세포 면역은 6 개월 동안 간 질환이 해소된 HBV-급성 감염, 또는 진행성 간 손상에 자주 연관되는 만성 HBV 감염으로의 노출 결과에 대한 주요 결정요인이다.
용어 "HBV"는 HBV의 유전자형 중 어느 것 (A 내지 J)을 포함한다. HBV 게놈의 참조 서열의 완전한 코딩 서열은, 예를 들면, GenBank 등록번호 GI:21326584 (서열 번호:1) 및 GI:3582357 (서열 번호:3)에서 발견할 수 있다. 안티센스 서열은 각각 서열 번호:2 및 서열 번호:4에 제공된다. C, X, P, 및 S 단백질에 대한 아미노 산 서열은, 예를 들면 NCBI 등록번호 YP_009173857.1 (C 단백질) (서열 번호:37); YP_009173867.1 및 BAA32912.1 (X 단백질) (서열 번호: 36 및 40); YP_009173866.1 및 BAA32913.1 (P 단백질) (서열 번호:32 및 38); 및 YP_009173869.1, YP_009173870.1, YP_009173871.1, 및 BAA32914.1 (S 단백질) (서열 번호: 33, 34, 35, 39)에서 발견할 수 있다. HBV 유전자형 D, 균주 ayw로부터의 단백질 및 DNA 서열은 서열 번호: 36-37에 제공된다. HBV 유전자형 C로부터 단백질 및 DNA 서열은 서열 번호: 38-39에 제공된다. HBV 단백질 또는 DNA 서열의 추가의 예, 또는 이들의 역 보체는, 서열 번호: 41-49에 제공된다.
HBV mRNA 서열의 추가의 예는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스, 예를 들면, GenBank, UniProt, 및 OMIM을 사용하여 용이하게 이용가능하다. B형 간염 바이러스 균주 데이터에 대한 국제 보고는 http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/HepSEQ/main.php에서 접근할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "HBV"는 또한 HBV 게놈의 자연 발생 DNA 서열 변형, 예를 들면, 유전자형 A-J 및 이의 변종을 언급한다.
용어 "HDV"와 상호교환적으로 사용되는 본원에 사용된 "D형 간염 바이러스"는, 헤파드나비리대 부류에 속하는 잘 공지된 비-세포병변, 간-지향성 DNA 바이러스를 언급한다. 예를 들면, 문헌을 참조하고 [참조: Ciancio and Rizzetto, Nat. Rev. 11:68-71, 2014; Le Gal et al., Emerg. Infect. Dis. 12:1447-1450, 2006; 및 Abbas and Afzal, World J. Hep., 5:666-675, 2013], 이의 전문이 참조로서 포함된다. 달리 나타내지 않는 한, HDV는 HDV의 모든 분기군 및 변종을 언급한다.
HDV는 하나의 단백질, 다시 말해 HDAg를 생성한다. 이는 2개의 형태이다; 27kDa 거대-HDAg (또한 lHD, L-HDAg, 및 거대 HDV 항원으로서 언급됨), 및 24kDa의 소-HDAg (또한 sHD, S-HDAg, 및 소 HDV 항원로서 언급됨). 2개의 형태의 N-말단은 동일하고; 이들은 거대 HDAg의 C-말단에서 19개의 아미노 산에서 상이하다. 둘 다의 이소형은 동일한 판독 프레임으로부터 생산되고, 이는 코돈 196에서 UAG 정지 코돈을 포함하고, 단지 소-HDAg를 정상적으로 생성한다. 그러나, 세포 효소 아데노신 데아미나제-1에 의한 편집은 정지 코돈을 UCG로 변환시키고, 이는 거대-HDAg를 생산할 수 있다. 90% 동일한 서열을 갖지만, 이들 2개의 단백질은 감염 과정 동안 확산(diverging) 역할을 한다. HDAg-S는 감염 조기에 생산되고, 핵으로 진입하고, 바이러스 복제를 뒷받침한다. HDAg-L은, 대조적으로, 감염 후기 동안 생산되고, 바이러스의 복제 억제제로서 작용하고, 바이러스 입자의 조립을 요구한다.
HDV mRNA 서열의 추가의 예는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스, 예를 들면, GenBank, UniProt, 및 OMIM를 사용하여 용이하게 이용가능하다.
본원에 사용된 용어 "HDV"는 또한 HDV 게놈의 자연 발생 DNA 서열 변형을 언급한다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드(뉴클레오시드)(nucelot(s)ide) 유사체" 또는 "역전사 효소 억제제"는 DNA 복제의 억제제이고, 이는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드와 구조적으로 유사하고, HBV cccDNA의 복제를 특이적으로 억제하고, 숙주 (예를 들면, 사람) DNA의 복제를 유의하게 억제하지 않는다. 이러한 억제제는 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 (TDF), 테노포비르 알라펜아미드 (TAF), 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르 (ETV), 텔비부딘, AGX-1009, 엠트리시타빈, 클레부딘, 리토나비르, 디피복실, 로부카비르, 팜비르, FTC, N-아세틸-시스테인 (NAC), PC1323, theradigm-HBV, 티모신-알파, 간시클로비르, 베시포비르 (ANA-380/LB-80380), 및 테노프비르-엑살리이드 (TLX/CMX157)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오티드(뉴클레오시드) 유사체는 엔테카비르 (ETV)이다. 뉴클레오티드(뉴클레오시드) 유사체는 수개의 공급원에서 시판되고, 이들의 표지 지시 (예를 들면, 특이적 용량으로 전형적으로 경구 투여됨)에 따라서 또는 HBV의 치료에서 숙련된 전문가에 의해 결정된 바와 같이 본원에 제공된 방법에서 사용된다.
본원에 사용된 "표적 서열"은 주요 전사 생산물의 RNA 프로세싱의 생산물인 mRNA를 포함하는 HBV 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 인접한 부분을 언급한다. 일부 실시형태에서, 서열의 표적 부분은 HBV 유전자의 전사 동안 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 부분에서 또는 근처에서 dsRNA 제제-지시된 절단을 위해 기질로서 역할을 하기 위해 적어도 충분히 길 것이다.
표적 서열은 약 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들면, 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 언급되는 서열로 기재되는 뉴클레오티드의 쇄를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 언급한다.
"G", "C", "A", "T" 및 "U"는 각각 일반적으로 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘, 및 우라실을 염기로서 각각 포함하는 뉴클레오티드를 의미한다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"가 또한 하기 추가로 상세하게 기재된 변형된 뉴클레오티드, 또는 대리 대체 모이어티(surrogate replacement moiety) (예를 들면, 표 1 참조)를 언급할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당해 기술분야의 숙련가는, 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실이 이러한 대체 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기 쌍형성 성질을 실질적으로 변경시키지 않고 다른 모이어티로 대체될 수 있음을 잘 알고 있다. 예를 들면, 제한 없이, 이의 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신, 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오티드를 갖는 염기 쌍일 수 있다. 이로 인해, 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 포함하는 뉴클레오티드는 본원 개시내용에서 특징으로 하는 바와 같이 dsRNA의 뉴클레오티드 서열에서 예를 들면, 이노신을 포함하는 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 또다른 예에서, 올리고뉴클레오티드 내에 어느 곳에 아데닌 및 시토신은 각각 구아닌 및 우라실으로 대체되어 표적 mRNA를 갖는 G-U Wobble 염기 쌍형성할 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 포함하는 서열은 본원 개시내용에서 특징으로 하는 조성물 및 방법에 적합하다.
용어 "dsRNA 제제", "RNAi 제제", "iRNA 제제", "iRNA", 및 "RNA 간섭제"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 용어가 본원에 정의되고 RNA 전사의 표적화된 절단을 RNA-유도된 사일런싱 복합물 (RISC) 경로를 통해 중재하는 RNA를 포함하는 제제를 언급한다. dsRNA 제제는 RNA 간섭 (RNAi)으로 공지된 프로세스를 통한 mRNA의 서열-특이적 분해를 지시한다. dsRNA 제제는 HBV 유전자의 발현 (예를 들면, 하나 이상의 HBV 유전자)을 세포, 예를 들면, 포유동물 대상자와 같은 대상자 내 세포에서 조절하고, 예를 들면, 억제한다.
본원에서 개시된 조성물, 용도, 및 방법에 사용하기 위한 "dsRNA 제제"는 이중 가닥 RNA이고, 본원에 "dsRNA 제제", "이중 가닥 RNA 제제", "이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자", "dsRNA", "iRNA", "iRNA 제제", "dsRNAi 제제", "RNAi 제제", 또는 "siRNA"로서 언급된다. 용어 "dsRNA"는 2개의 항-평행 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는 리보핵산 분자의 복합물을 언급하고, 표적 RNA, 즉, HBV 유전자에 대해 "센스" 및 "안티센스" 배향을 갖는 것으로 언급된다. 본원 개시내용의 일부 실시형태에서, dsRNA는, RNA 간섭 또는 RNAi로서 본원에 언급된 전사-후 유전자-사일런싱 기전을 통해, 표적 RNA, 예를 들면, mRNA의 분해를 촉발한다.
일반적으로, dsRNA 분자의 각각의 가닥은 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 그러나 본원에 상세하게 기재된 바와 같이, 각각의 또는 둘 다의 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 추가로, 명세서에 사용된 "dsRNA 제제"는 화학적 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고; dsRNA 제제는 다중 뉴클레오티드에서 실질적인 변형을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오티드"는, 독립적으로, 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오티드간(internucleotide) 링크, 또는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 언급한다. 따라서, 용어 변형된 뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 링크, 당 모이어티, 또는 핵염기에 대한, 예를 들면, 기능성 그룹 또는 원자의 치환, 추가, 또는 제거를 포함한다. 본원 개시내용의 제제에서 사용하기 위해 적합한 변형은 본원에 개시되거나 당해 기술분야에 공지된 모든 타입의 변형을 포함한다. dsRNA 제제-유형 분자로서 사용되는, 임의의 이러한 변형은, 본원 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 "dsRNA 제제"에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "억제"는, "감소", "사일런싱", "하향조절", "억압", 및 다른 유사한 용어와 상호교환적으로 사용되고, 임의의 수준의 억제를 포함한다. 바람직하게는 억제는 통계학적으로 유의한 또는 임상적으로 유의한 억제를 포함한다.
본원에 사용된 구절 "HBV의 발현을 억제함" 또는 "HBV 유전자의 발현을 억제함"은 임의의 HBV 유전자 (예를 들면, HBV 바이러스 감염에서 HBV로부터 발현된 HBV 유전자, 세포에서 발현 작제물로부터 발현된 HBV 유전자) 뿐만 아니라 HBV 단백질을 암호화하는 HBV 유전자의 변종 또는 돌연변이의 발현의 억제를 포함한다. 상기 용어는 하나 이상의 HBV 바이러스 단백질 (예를 들면, preS1/2-S, preS, S, P, X, preC, 및 C)을 암호화하는 임의의 HBV 전사 (예를 들면, 3.5 kb, 2.4 kb, 2.1 kb, 또는 0.7 kb 전사)의 녹아웃(knockdown), 뿐만 아니라 HBV 유전자의 변종 또는 돌연변이를 포함한다.
"HBV 유전자의 발현을 억제함"은 임의의 수준의 HBV 유전자 또는 전사의 억제, 예를 들면, HBV 유전자, 예를 들면, HBV 유전자 S, P, X, 또는 C, 또는 임의의 이의 조합, 예를 들면, S, P, 및 C의 발현의 적어도 부분 억압을 포함한다. HBV 유전자의 발현을 HBV 유전자 발현에 연관되는 임의의 변수의 수준, 또는 수준의 변화, 예를 들면, HBV mRNA 수준 또는 HBV 단백질 수준, 또는 HBV cccDNA 수준을 기초로 하여 평가할 수 있다. 이러한 수준을, 예를 들면, 대상자로부터 유래된 샘플을 포함하는, 개인 세포에서 또는 세포의 그룹에서 평가할 수 있고, 예를 들면, 수준을 혈청에서 모니터링할 수 있다. 억제를 대조군 수준과 비교하여 하나 이상의 이들 변수의 절대적 또는 상대적 수준의 감소에 의해 평가할 수 있다. 대조군 수준은 당해 기술분야에서 이용되는 임의의 유형의 대조군 수준일 수 있고, 예를 들면, 투약-전 기준선 수준, 또는 유사한 대상자로부터 결정된 수준, 또는 대조군 (예를 들면, 완충액 단독 대조군 또는 비활성 제제 대조군)으로 처리되지 않거나 처리된 적합한 대조군 대상자, 세포 또는 샘플로부터의 집단 평균일 수 있다.
상기 방법의 본원 개시내용의 일부 실시형태에서, HBV 유전자의 발현은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%까지, 예를 들면, 대상자에서 적어도 1 log 10, 2 log 10, 3 log 10, 또는 4 log 10까지, 또는 상기 검정의 검출 수준 미만으로 억제된다. 바람직한 실시형태에서, 대상자에서 HBV 유전자의 발현의 억제는, 단독으로 면역 반응을 촉진하거나 강력하게 하는 다른 제제와 병용하여 투여하는 경우, 예를 들면, HBV 단백질에 대항하는 효과적인 면역 반응을 허용하기 위해 충분히 억제된, 유전자 발현의 수준의 임상 관련 억제를 야기한다.
시험관내 세포-기반 검정 또는 생체내 모델, 예를 들면, 본원에 제공된 마우스 AAV-hHBV 모델에서 이종 유전자의 발현에서, 적어도 90%까지의 총 HBV 발현의 억제가 바람직하고, 예를 들면, 적어도 1 log 10, 2 log10, 또는 3 log10이다. HBV 감염을 갖는 대상자의 치료에서, HBV 유전자 또는 단백질 수준의 적어도 90%의 감소, 즉, 치료 전후의 HBV 유전자 또는 단백질 수준의 차이가 바람직하다. 하나 초과의 용량은 억제의 바람직한 수준을 성취하기 위해 요구될 수 있다.
HBV 유전자의 발현의 억제는 첫번째 세포 또는 세포의 그룹 (이러한 세포는, 예를 들면, 대상자로부터 유래된 샘플에 존재할 수 있다)에 의해 발현된 RNA의 양의 감소에 의해 분명히 나타날 수 있고 (여기서, HBV 유전자가 전사된다), 상기 세포는 처리되고 (예를 들면, 세포 또는 세포들을 본원 개시내용의 dsRNA 제제와 접촉시킴에 의해, 또는 본원 개시내용의 dsRNA 제제를 상기 세포가 존재하거나 존재했던 대상자에게 투여함에 의해), 이에 따라, HBV 유전자의 발현은, 첫번째 세포 또는 세포의 그룹과 실질적으로 동일하지만 처리되지 않은 두번째 세포 또는 세포의 그룹(대조군 세포(들))과 비교하여, 억제된다. 바람직한 실시형태에서, 억제를 WO2016/077321의 실시예 2의 rtPCR 방법(이러한 방법은 본원에 참조로서 포함된다)으로 평가하고, 시험관내 검정은 적합하게 매칭된 세포주에서 10 nM 농도에서 듀플렉스로 수행되고, 하기 식을 사용하여 대조군 세포에서 mRNA의 수준의 백분율로서 처리된 세포에서 mRNA의 수준을 표현한다:
대안적으로, HBV 유전자의 발현 억제는 HBV 유전자 발현과 기능적으로 연관된 파라미터의 감소의 면에서 평가될 수 있다. HBV 유전자 사일런싱은, 구성적으로(constitutively) 또는 게놈 공학에 의해, 및 당해 기술분야에 공지된 임의의 검정에 의해, HBV 유전자를 발현하는 임의의 세포에서 측정될 수 있다.
HBV 단백질의 발현의 억제는 세포 또는 세포의 그룹에 의해 발현된 HBV 단백질의 수준 (예를 들면, 대상자로부터 유래된 샘플에서 발현된 단백질의 수준)의 감소로 분명히 나타날 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, mRNA 억압의 평가를 위해, 처리된 세포 또는 세포의 그룹에서 단백질 발현 수준의 억제는 유사하게는 대조군 세포 또는 세포의 그룹에서 또는 혈청에서 단백질의 수준의 백분율로서 표현될 수 있다.
HBV 유전자의 발현의 억제를 평가하기 위해 사용될 수 있는 대조군 세포 또는 세포의 그룹은 본원 개시내용의 dsRNA 제제와 아직 접촉한 적이 없는 세포 또는 세포의 그룹을 포함한다. 예를 들면, 대조군 세포 또는 세포의 그룹은 대상자를 dsRNA 제제로 처리하기 전 개인 대상자 (예를 들면, 사람 또는 동물 대상자)로부터 유래될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 수준은 적합한 대조군 샘플, 예를 들면, 공지된 집단 대조군 샘플과 비교할 수 있다.
세포 또는 세포의 그룹에 의해 발현되는 HBV RNA의 수준, 또는 순환하는 HBV RNA의 수준은, 바람직하게는 WO2016/077321의 실시예 2에 제공된 rtPCR 방법을 사용하는 mRNA 발현을 평가하기 위한 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플에서 HBV 유전자의 발현 (예를 들면, 총 HBV RNA, HBV 전사, 예를 들면, HBV 3.5 kb 전사)의 수준은 전사된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 부분, 예를 들면, HBV 유전자의 RNA를 검출하여 측정한다. RNA는, 예를 들면, 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출 (RNAzol B; Biogenesis), RNeasy RNA 제제 키트 (Qiagen®) 또는 PAXgene (PreAnalytix, Switzerland)를 사용함을 포함하는 RNA 추출 기술을 사용하여 세포로부터 추출할 수 있다. 리보핵산 하이브리드화를 이용하는 전형적인 검정 포맷은 핵 런-온(nuclear run-on) 검정, RT-PCR, RNase 보호 검정 [참조: Melton et al., Nuc. 산 Res. 12:7035], 노던 블롯팅, 현장 하이브리드화(in situ hybridization), 및 마이크로어레이 분석을 포함한다. 순환하는 HBV mRNA는 WO 2012/177906에 기재된 방법을 사용하여 검출될 수 있고, 상기 방법은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 실시형태에서, HBV 유전자의 발현의 수준은 핵산 프로브를 사용하여 측정한다. 본원에 사용된 용어 "프로브"는 특이적 HBV 유전자에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 언급한다. 프로브는 당해 기술분야의 숙련가에 의해 합성될 수 있거나, 적합한 생물학적 제제로부터 유도될 수 있다. 프로브는 특이적으로 설계되어 표지화될 수 있다. 프로브로서 이용할 수 있는 분자의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, RNA, DNA, 단백질, 항체, 및 유기 분자를 포함한다.
단리된 RNA는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석, 및 프로브 어레이를 포함하는 하이브리드화 또는 증폭 검정에서 사용될 수 있다. mRNA 수준의 측정을 위한 하나의 방법은 단리된 mRNA를 HBV mRNA에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시킴을 수반한다. 일부 실시형태에서, mRNA를 고체 표면 상 고정시키고, 예를 들면, 아가로스 겔 상 단리된 mRNA을 적용하고 겔로부터 mRNA를 막, 예를 들면, 니트로셀룰로스로 옮겨서 프로브와 접촉시킨다. 일부 다른 실시형태에서, 프로브(들)를 고체 표면 상에 고정시키고, mRNA를 프로브(들)와, 예를 들면, Affymetrix® 유전자 칩 어레이 상에서 접촉시킨다. 숙련가들은 HBV mRNA의 수준의 측정시 사용하기 위한 공지된 mRNA 검출 방법을 용이하게 개조시킬 수 있다.
샘플에서 HBV 유전자의 발현의 수준을 측정하는 대안적인 방법은, 예를 들면, RT-PCR (다음 문서에 기재된 실험 실시형태: Mullis, 1987, 미국 특허 제4,683,202호), 리가제 연쇄 반응 (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), 자가-지속되는 서열 복제 [참조: Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878], 전사 증폭 시스템 [참조: Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177], Q-베타 리플리카제 [참조: Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197], 롤링 서클 복제 [참조: Lizardi et al., 미국 특허 제5,854,033호], 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한 예를 들면 샘플 중 mRNA의 핵산 증폭 또는 역전사 효소의 과정 (cDNA를 제조함), 이어서, 당해 기술분야의 숙련가에게 잘 공지된 기술을 사용하여 증폭된 분자의 검출을 수반한다. 이들 검출 계획은, 이러한 분자가 매우 낮은 수로 존재하는 경우, 핵산 분자의 검출을 위해 특히 유용하다. 본원 개시내용의 특정한 측면에서, HBV 유전자의 발현의 수준을, 예를 들면, 본원에 제공된 방법을 사용하여 정량적 형광원성 RT-PCR (즉, TaqMan™ 시스템)으로 결정한다.
HBV RNA의 발현 수준은 멤브레인 블롯 (예를 들면, 하이브리드화 분석에 사용되는 것, 예를 들면, 노던, 도트 등), 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드, 또는 섬유 (또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 미국 특허 번호 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195, 및 5,445,934를 참조하고, 이는 상기 방법에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다. HBV 발현 수준의 측정은 또한 용액 중 핵산 프로브를 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, RNA 발현의 수준을 실시간 PCR (qPCR)을 사용하여 평가한다. 이들 방법의 사용은 WO2016/077321의 실시예 2에 기재되고 예시되어 있다.
HBV 단백질 발현의 수준을 단백질 수준의 측정을 위한 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들면, 전기영동법, 모세관 전기영동법, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 과확산(hyperdiffusion) 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광법, 비색 검정, 분광광도측정 검정, 유세포 분석, 면역확산 (단일 또는 이중), 면역전기영동법, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역검정 (RIA), 효소-링크된 면역흡착 검정 (ELISAs), 면역형광 검정, 전기화학발광 검정 등을 포함한다.
dsRNA 제제
듀플렉스 영역은 목적하는 표적 RNA를 RISC 경로를 통해 특이적 분해하는 임의의 길이일 수 있고, 약 19-21 염기 쌍 길이 범위, 예를 들면, 약 19, 20, 또는 21 염기 쌍 길이일 수 있다. 본원에 제공된 예시적인 dsRNA 제제는 19-21 염기 쌍의 듀플렉스 길이를 포함한다.
여기서, dsRNA의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥은 개별적인 RNA 분자에 의해 포함되고, 이들 분자는 필요하지 않지만, 공유적으로 연결될 수 있다. 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단 및 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 뉴클레오티드의 간섭되지 않은 쇄 이외의 수단으로 공유적으로 연결되어 듀플렉스 구조를 형성하는 경우, 상기 연결 구조는 "링커"로서 언급된다. RNA 가닥은 동일한 또는 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 염기 쌍의 최대 수는, 듀플렉스에 존재하는 임의의 오버행을 마이너스한 dsRNA의 최단 가닥에서 뉴클레오티드의 수이다. 듀플렉스 구조에 추가하여, dsRNA 제제는 하나 이상의 뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드 오버행"은 이중 가닥 dsRNA 제제의 듀플렉스 구조로부터 돌출된 적어도 하나의 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드를 언급한다. 예를 들면, dsRNA의 하나의 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어서서 연장되는 경우, 또는 그 반대인 경우, 뉴클레오티드 오버행이 존재한다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 오버행을 포함할 수 있고; 대안적으로 오버행은 2개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 이로서 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 임의의 이의 조합 상에 존재할 수 있다. 추가로, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단, 또는 둘 다의 말단 상에 존재할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오티드 오버행은 안티센스 가닥의 3' 말단 상에 존재할 수 있다.
"둔화(Blunt)" 또는 "둔단(blunt end)"은 이중 가닥 dsRNA 제제의 말단에 어떠한 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드도 존재하지 않고, 즉, 뉴클레오티드 오버행도 없다는 것을 의미한다. "둔단(blunt ended)" dsRNA 제제는 이의 전체 길이에 걸쳐서 이중 가닥인 dsRNA이고, 즉, 분자의 어떠한 말단에도 뉴클레오티드 오버행을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 제제는 뉴클레오티드 오버행을 하나의 말단에 갖는 dsRNA 제제 (즉, 하나의 오버행 및 하나의 둔단을 갖는 제제) 또는 뉴클레오티드 오버행을 갖는 제제를 둘 다의 말단에 갖는 dsRNA 제제를 포함한다.
용어 "안티센스 가닥(antisense strand)" 또는 "가이드 가닥(guide strand)"은 표적 서열, 예를 들면, HBV mRNA에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA 제제의 가닥을 언급한다. 본원에 사용된 용어 "상보성 영역(region of complementarity)"은 본원에 정의된 바와 같이 서열, 예를 들면 표적 서열, 예를 들면, HBV 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상 영역을 언급한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않는 경우, 미스매치는 분자의 내부 또는 말단 영역에 존재할 수 있다. 일반적으로, 가장 많이 허용되는(tolerated) 미스매치는 말단 영역 내에 존재하고, 예를 들면, dsRNA 제제의 5'- 또는 3'-말단의 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 뉴클레오티드 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 제제는 안티센스 가닥에서 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 제제는 센스 가닥에서 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드 미스매치는, dsRNA 제제의 3'-말단으로부터, 예를 들면, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 뉴클레오티드 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드 미스매치는, 예를 들면, dsRNA 제제의 3'-말단 뉴클레오티드 내에 존재한다.
본원에 사용된 용어 "센스 가닥(sense strand)" 또는 "패신저(passenger) 가닥"은 당해 용어가 본원에 정의된 바와 같이 안티센스 가닥의 영역에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA 제제의 가닥을 언급한다.
본원에 사용되고 달리 나타내지 않는 한, 용어 "상보적(complementary)"은, 두번째 뉴클레오티드 서열과 관련하여 첫번째 뉴클레오티드 서열을 기재하기 위해 사용되는 경우, 당해 기술분야의 숙련가가 이해할 수 있는 바와 같이, 두번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 갖는 특정 상태하에서 첫번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 하이브리드화되고 듀플렉스 구조를 형성할 가능성을 언급한다. 이러한 상태는, 예를 들면, 엄격한(stringent) 상태일 수 있고, 여기서, 엄격한 상태는 다음을 포함할 수 있다: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃ 12-16 시간 동안 이어서 세척 [참조: 예를 들면, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]. 유기체 내에서 접할 수 있는 생리학적으로 관련된 상태와 같은 다른 상태는, 적용할 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 하이브리드화된 뉴클레오티드의 궁극적 적용에 따라서 2개 서열의 상보성 시험을 위해 가장 적합한 상태의 세트를 결정할 수 있을 것이다.
dsRNA 제제 내의, 예를 들면, 본원에 기재된 dsRNA 제제 내의 상보적 서열은, 하나 또는 둘 다의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐서 두번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한, 첫번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기-쌍형성을 포함한다. 이러한 서열은 본원에서 서로에 대해 "완전히 상보적"인 것으로 언급될 수 있다. 그러나, 첫번째 서열이 본원에서 두번째 서열에 대해 "실질적으로 상보적"인 것으로 언급되는 경우, 상기 2개의 서열은 완전히 상보적일 수 있거나, 21개 이하의 염기 쌍 듀플렉스를 위해 하이브리드화 경우에, 하나 이상의, 그러나 일반적으로 4, 3, 또는 2개 이하의 미스매치된 염기 쌍을 형성할 수 있고, 동시에 이들의 궁극적 적용, 예를 들면, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 억제에 관련된 최고의 상태하에 하이브리드화할 수 있는 능력을 유지한다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오티드가 하이브리드화될 때, 하나 이상의 단일가닥 오버행을 형성하도록 설계되는 경우, 이러한 오버행은 상보성의 결정에 관하여 미스매치로 간주되어서는 안된다. 예를 들면, 하나의 올리고뉴클레오티드 21개의 뉴클레오티드 길이 및 또다른 올리고뉴클레오티드 23개의 뉴클레오티드 길이를 포함하는 dsRNA 제제(여기서, 더 긴 올리고뉴클레오티드는 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적인 21개의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다)는, 본원에 기재된 목적을 위해 "완전히 상보적"인 것으로 여전히 언급될 수 있다.
본원에 사용된 "상보적" 서열은 또한, 요구사항이 이들의 하이브리드화할 수 있는 능력에 대해 충족되는 한, 비-왓슨-크릭 염기 쌍(non-Watson-Crick base pairs) 또는 비-천연 및 변형된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기 쌍을 포함하거나 이로부터 전적으로 형성될 수 있다. 이러한 비-왓슨-크릭 염기 쌍은, 이에 제한되는 것은 아니지만, G:U Wobble 또는 Hoogstein 염기 쌍형성을 포함한다.
본원의 용어 "상보적(complementary)", "완전히 상보적인(fully complementary)", 및 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은, 이들의 사용의 맥락에서 이해할 수 있는 바와 같이, dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이, 또는 dsRNA 제제의 안티센스 가닥 및 표적 서열 사이 염기 매칭에 대해 사용할 수 있다. 다중 HBV 유전자형은 공지되어 있는 것으로 이해된다. 따라서, 하나의 HBV 유전자형에 완전히 상보적인 것으로 설계된 dsRNA 제제는 모든 HBV 유전자형에 대해 완전히 상보적이지 않을 수 있다. 특이적 부위에 표적화된 dsRNA 제제는 모든 유전자형에 대해 완전히 상보적이지 않고 다중 유전자형에 걸쳐 표적 녹아웃에 효과적이다.
본원에 사용된, 메신저 RNA (mRNA)의 "적어도 일부가 실질적으로 상보적인" 폴리뉴클레오티드는, 관심 대상 mRNA의 인접한 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 언급한다 (예를 들면, HBV 유전자를 암호화하는 mRNA). 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는, 서열이 HBV 유전자를 암호화하는 mRNA의 비-간섭 부분에 실질적으로 상보적인 경우, 적어도 일부의 HBV mRNA에 대해 상보적이다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 표적 HBV 서열에 대해 완전히 상보적이다. 일부 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 표적 HBV 서열에 대해 실질적으로 상보적이고, 서열 번호:1, 또는 서열 번호:1의 단편의 뉴클레오티드 서열의 등가 영역에 대해 이의 전체 길이에 걸쳐서 적어도 80% 상보적인, 예를 들면, 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상보적인, 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 제제는 안티센스 폴리뉴클레오티드에 대해 실질적으로 상보적이고 차례로(in turn) 표적 HBV 서열에 대해 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서, 센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:2의 뉴클레오티드 서열의 등가 영역에 대해 이의 전체 길이에 걸쳐서 적어도 80% 상보적인, 예를 들면, 적어도 85%, 90%, 또는 95% 상보적인 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 표적 HBV 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥을 포함하고, 표 2에서 센스 뉴클레오티드 서열 중 어느 것의 뉴클레오티드 서열의 등가 영역에 대해 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 80% 상보적인 인접한 뉴클레오티드 서열, 또는 적어도 85%, 90%, 또는 95% 상보적인 표 2에서 센스 뉴클레오티드 서열 중 어느 것의 단편을 포함한다.
본원에 상세하게 기재된 바와 같이, 각각 또는 둘 다의 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 추가로, dsRNA 제제는 화학적 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 본원에 개시되거나 당해 기술분야에 공지된 모든 타입의 변형을 포함할 수 있다. dsRNA 제제에서 사용되는, 임의의 이러한 변형은, 이러한 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 "dsRNA 제제"에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 가닥의 대부분의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이지만, 본원에 상세하게 기재된 바와 같이, 각각의 또는 둘 다의 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 추가로, dsRNA 제제는 화학적 변형의 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 본원에 개시되거나 당해 기술분야에 공지된 모든 타입의 변형을 포함할 수 있다. dsRNA 제제에서 사용되는 임의의 이러한 변형은, 이러한 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 "dsRNA 제제" 및 "dsRNA 제제"에 포함된다.
대상자에서 HBV 유전자 발현 또는 HBV 단백질 생산의 수준, 또는 질환 마커 또는 증상의 맥락에서 용어 "저하시키다(lower)"는 이러한 수준의 통계학적으로 유의한 감소를 언급한다. 감소는, 예를 들면, 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 검출 방법의 경우 검출의 수준 아래까지, 또는 정상 수준 (이는 0일 수 있거나 0이 아닐 수 있다)을 향하여 또는 정상 수준 이상까지일 수 있다. HBV 감염의 모니터링에서, log10 스케일이 전형적으로 항원혈증의 수준 (예를 들면, 혈청 중 HBsAg 수준) 또는 바이러스혈증 (혈청 중 HBV DNA 수준)을 기술하기 위해 사용된다. 1 log10 감소는 90% 감소 (10% 잔류)이고, 2 log10 감소는 99% 감소 (1% 잔류) 등인 것으로 이해된다. 특정 실시형태에서, 질환 마커는 검출 수준 미만으로 감소된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들면, 대상자를 제제제로 치료한 후 HBV의 발현이 감소되는 임상 관련 결과에 의해 입증된 바와 같이, HBV의 발현의 임상 관련 억제를 포함한다. 일부 실시형태에서, HBV 유전자의 발현의 적어도 부분 억압을, HBV 유전자가 전사된 첫번째 세포 또는 세포의 그룹에서 단리될 수 있거나 검출될 수 있는 HBV mRNA 양의 감소에 의해 평가하고, 상기 첫번째 세포 또는 세포의 그룹을 처리하고, 이에 따라, HBV 유전자의 발현은, 처리되지 않은 것을 제외하고는 첫번째 세포 또는 세포의 그룹과 실질적으로 동일한 두번째 세포 또는 세포의 그룹 (대조군 세포)과 비교하여, 억제된다.
특정 실시형태에서, "저하시키다(lower)" 또는 "감소시키다(reduce)"는 정상 수준을 향해 또는 이에 대해 수준을 저하 또는 감소시키는 것으로 이해되고, 즉, 수준을 정규화하는 것으로 이해된다. 특정 실시형태에서, 표적의 발현은 이러한 장애가 없는 개인에 대한 정상 범위 내에 허용되는 수준으로 정규화되고, 예를 들면, ALT 또는 AST의 수준과 같은 질환 마커가, 이러한 장애가 없는 개인에 대한 정상 범위 내에 허용되는 수준으로 감소된다. 질환 관련 수준이 정상 수준으로부터 상승되는 경우, 변화는 정상의 상위 수준 (ULN)으로부터 계산된다. 질환 관련 수준이 정상 수준에서 감소되는 경우, 변화는 정상의 하위 수준 (LLN)으로부터 계산된다. 감소(lowering)는 대상자 값 및 정상 값 사이의 변화의 차이 백분율이다. 예를 들면, 정상 AST 수준은 리터당 10 내지 40 단위로서 보고될 수 있다. 치료 전 리터당 200 단위의 AST 수준를 갖는, 즉, 5배의 ULN, 정상의 상위 수준 위로 리터당 160 단위의 AST 수준을 갖는 대상자가, 치료 후 리터당 120 단위의 AST 수준을 갖는, 즉, 3배의 ULN, 정상의 상위 수준 위로 리터당 80 단위의 AST 수준을 갖는 경우, 상승된 AST는 50% (80/160)만큼 정상을 향해 감소될 것이다.
또다른 예로서, 정상 ALT 수준은 전형적으로 리터당 7 내지 55 단위 (U/L)로 고려되고, 정상의 상위 수준은 55 U/L가 된다. 치료 전 100 U/L의 ALT 수준 (정상의 상위 수준 위로 45 U/L) 및 치료 후 75 U/L (25 U/L까지 감소됨)을 갖는 대상자, 상기 대상자의 ALT는 55% (25/45 x 100%)로 정상 수준을 향해서 감소된다. 본원에 사용된 바와 같이, 질환이 증상에 대해 상승된 값에 연관되는 경우, "정상"은 정상의 상위 수준인 것으로 고려된다. 질환이 증상에 대해 감소된 값에 연관되는 경우, "정상"은 정상의 하위 수준인 것으로 고려된다.
본원에 사용된 구절 dsRNA와 같은 "dsRNA 제제와 세포를 접촉시킴"은, 세포를 임의의 가능한 수단으로 접촉시킴을 포함한다. 세포를 dsRNA 제제와 접촉시킴은 세포를 시험관내 dsRNA 제제와 접촉시킴 또는 세포를 생체내 dsRNA 제제와 접촉시킴을 포함한다. 상기 접촉은 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, dsRNA 제제는 방법을 시행하는 개인에 의해 세포와 물리적으로 접촉할 수 있거나, 대안적으로, dsRNA 제제는 후속적으로 세포와 접촉을 허용하거나 야기하는 상황에 처할 수 있다.
세포를 시험관내 접촉시키는 것은, 예를 들면, 세포를 dsRNA 제제로 인큐베이팅하여 수행할 수 있다. 세포를 생체내 접촉시키는 것은, 예를 들면, dsRNA 제제를 세포가 위치한 조직 내로 또는 조직 근처에 주사하여 수행할 수 있거나, dsRNA 제제를 또다른 영역, 예를 들면, 혈류 또는 피하 공간 내로 주사하여 제제가 후속적으로 접촉될 세포가 위치하는 조직에 도달하도록 수행할 수 있다. 예를 들면, dsRNA 제제는, dsRNA 제제를 관심 대상 부위, 예를 들면, 간에 지시하는 리간드, 예를 들면, GalNAc3을 포함하거나 이에 커플링될 수 있다. 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합이 또한 가능하다. 예를 들면, 세포는 또한 시험관내 dsRNA 제제와 접촉될 수 있고, 후속적으로 대상자 내로 이식될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포를 dsRNA 제제와 접촉시키는 것은 세포 내로 흡수 또는 흡착을 촉진하거나 수행하여 "dsRNA 제제를 세포로 도입함" 또는 "전달함"을 포함한다. dsRNA 제제의 흡착 또는 흡수는 도움을 받지 않는(unaided) 확산성(diffusive) 또는 활성 세포 프로세스를 통해, 또는 보조제 또는 장치에 의해 일어날 수 있다. dsRNA 제제를 세포 내로 도입함은 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 예를 들면, 생체내 도입에 대해, dsRNA 제제는 조직 부위 내로 주사될 수 있거나 전신 투여될 수 있다. 세포 내로 시험관내 도입은 전기천공 및 리포펙션와 같은 당해 기술분야에 공지된 방법을 포함한다. 추가 접근법은 하기 본원에 기재되거나 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 "대상자"는 포유동물과 같은 동물이고, HBV로 감염될 수 있는 임의의 포유동물, 예를 들면, 영장류 (예를 들면, 사람, 비-사람 영장류, 예를 들면, 원숭이, 또는 침팬지), 또는 HBV 감염의 허용되는 임상 모델, HBV-AAV 마우스 모델 [참조: 예를 들면, Yang et al. (2014) Cell and Mol Immunol 11:71] 또는 HBV 1.3xfs 유전자삽입 마우스 모델 [참조: Guidotti et al. (1995) J. Virol. 69:6158]로 고려되는 동물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상자는 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상자는 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염 및 D형 간염 바이러스 (HDV) 감염 둘 다를 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상자는 HBV 감염, 특히 만성 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 갖고 있는 사람과 같은 사람이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료"는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하기를 포함하는 원치않는 HBV 유전자 발현 또는 HBV 복제에 관련된 하나 이상의 징후 또는 증상의 경감 또는 개선을 포함하는 유리하거나 목적하는 결과를 언급한다: 예를 들면, 혈청 또는 간 HBV cccDNA의 존재; 혈청 HBV DNA의 존재; 혈청 또는 간 HBV 항원, 예를 들면, HBsAg 또는 HBeAg의 존재; 상승된 ALT; 상승된 AST (정상 범위는 전형적으로 약 10 내지 34 U/L로 고려된다); 부재하거나 낮은 항-HBV 항체의 수준, 간 손상; 경화; 델타 간염, 급성 B형 간염; 급성 전격 B형 간염; 만성 B형 간염; 간 섬유증; 말기 간 질환; 간세포 암종; 혈청 질병-유사 증후군; 식욕부진; 구역; 구토, 미열(low-grade fever); 근육통; 피로; 미각 명료도 (gustatory acuity) 및 후각 장애 (식품 및 담배 혐오); 우상상한 및 상복부 통증 (간헐적, 경증 내지 중등도); 간 뇌병증; 기면; 수면 패턴 장애; 정신적 착란; 혼수상태; 복수; 위장관 출혈; 응고병증; 황달; 간비대 (약간 비대해진, 연성 간); 비장비대; 수장홍반; 거미상모반(spider nevi); 근육 쇠약; 거미 혈관종; 혈관염; 정맥류 출혈; 말초 부종; 여성유방증; 고환 위축; 복부 측부(collateral) 정맥 (메두사 머리); AST 수준보다 높은 ALT 수준; 상승된 감마-글루타밀 트랜스펩티다제 (GGT) (정상 범위는 전형적으로 약 8 내지 65 U/L로 고려된다) 및 알칼리성 포스파타제 (ALP) 수준 (정상 범위는 전형적으로 약 44 내지 147 IU/L로 고려된다 (리터당 국제 단위), 3배 이하 ULN); 약간 낮은 알부민 수준; 상승된 혈청 철 수준; 백혈구감소증 (즉, 과립백혈구감소증); 림프구증가증; 증가된 적혈구 침강 속도 (ESR); 단축된 적혈구 생존; 용혈; 저혈소판증; 국제 정규화 비 (INR)의 연장; 혈청 또는 간 HBsAg, HBeAg, 또는 B형 간염 코어 항체 (항-HBc) 면역글로불린 M (IgM)의 존재; B형 간염 표면 항체 (항-HBs), B형 간염 e 항체 (항-HBe), 또는 HBV DNA의 존재; 증가된 빌리루빈 수준; 고글로불린혈증; 조직-비특이 항체, 예를 들면, 항-평활근 항체 (ASMAs) 또는 항핵 항체 (ANAs) (10-20%)의 존재; 조직-특이적 항체, 예를 들면, 갑상샘에 대항하는 항체 (10-20%)의 존재; 상승된 수준의 류마티스 인자 (RF); 저 혈소판 및 백혈구 계수; 소엽, 퇴행성 및 재생 간세포 변화, 및 동반되는 염증을 가짐; 및 검출가능하지 또는 검출가능하지 않은지에 상관없이 대부분 중심소엽 괴사. 예를 들면, 간 섬유증, 예를 들면, 만성 B형 간염 감염에 대한 하나 이상의 위험 인자를 갖는 개인이, 간 섬유증을 발병하지 않거나, 동일한 위험 인자를 갖지만 본원에 기재된 치료를 받지 않은 집단에 비하여 더 낮은 중증도로 간 섬유증을 발병하는 경우, 간 섬유증을 발병할 가능성은 감소된다. 질환, 장애, 또는 상태를 발병하지 않는 것 또는 (예를 들면, 임상 관련 양에 의해) 질환, 장애, 또는 상태에 관련된 징후 또는 증상 발병이 감소되는 것, 또는 지연된 징후 또는 지연된 증상을 나타내는 것(예를 들면, 수일, 수주, 수개월, 또는 수년까지)은 효과적인 예방으로 고려된다. "치료"는 또한 치료 부재하에 예상되는 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다. 예방은 하나 초과의 용량의 투여를 요구할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, HBV 감염 치료는 B형 간염의 "기능적 치유"를 야기한다. 본원에 사용된 기능적 치유는 순환하는 HBsAg의 청소율로서 이해되고, 바람직하게는 임상 관련 검정을 사용하여 HBsAg 항체가 검출가능한 상태로의 전환을 동반한다. 예를 들면, 검출가능한 항체는 화학발광 미세입자 면역검정 (CMIA) 또는 항-HBs 혈청전환으로 칭명되는 임의의 다른 면역검정으로 측정하여 10 mIU/ml보다 더 높은 신호를 포함할 수 있다. 기능적 치유는 HBV의 모든 복제 형태 (예를 들면, 간으로부터 cccDNA)의 청소율을 요구하지 않는다. 항-HBs 혈청전환은 매년 자발적으로 약 0.2-1%의 만성적 감염 환자에서 발생한다. 그러나, 심지어 항-HBs 혈청전환 후에도, HBV의 낮은 수준의 지속은 수십년간 관찰되고, 이는 완벽한 치유보다는 기능적 치유가 일어난다는 것을 나타낸다. 기전에 결부시키지 않고, 면역 체계가 검사에서 HBV를 억제할 수 있다고 제안된다. 기능적 치유는 HBV 감염에 대한 임의의 치료를 중단할 수 있게 한다. 그러나, HBV 감염에 대한 "기능적 치유"는 HBV 감염로부터 야기되는 질환 또는 상태, 예를 들면, 간 섬유증, HCC, 경화를 예방 또는 치료하는데 충분하지 않을 수 있다는 것이 이해된다.
본원에 사용된 용어 "B형 간염 바이러스-연관 질환" 또는 "HBV-연관 질환"은, HBV 감염 또는 복제에 의해 야기되거나 이와 관련되는 질환 또는 장애이다. 용어 "HBV-연관 질환"은 HBV 유전자 발현 또는 복제의 감소로 이득을 얻을 수 있는 질환, 장애, 또는 상태를 포함한다. HBV-연관 질환의 비-제한적인 예는, 예를 들면, D형 간염 바이러스 감염, 델타 간염, 급성 B형 간염; 급성 전격 B형 간염; 만성 B형 간염; 간 섬유증; 말기 간 질환; 및 간세포 암종을 포함한다.
일부 실시형태에서, HBV-연관 질환은 D형 간염 바이러스 감염이다. D형 간염 바이러스 또는 간염 델타 바이러스 (HDV)는 사람 병원체이다. 그러나, 바이러스는 결손성(defective)이고, 전달을 위한 B형 간염 바이러스 (HBV)에 의해 제공되는 의무적인 조력자(obligatory helper) 기능에 좌우되고; 사실상, HDV는 감염성 또는 번성(thrive)되기 위해 관련된 또는 이미-존재하는 HBV 감염, 특히, B형 간염의 표면 항원을 포함하는 바이러스 외피가 필요하다. HDV는 HBV와 관련하여 심각한 급성 및 만성 형태의 간 질환을 야기할 수 있다. D형 간염 감염 또는 델타 간염은 몇몇 아프리카 국가, 아마존 지역, 및 중동에서 고도의 풍토병(endemic)인 반면, 이의 유병률은 지중해를 제외한 선진국에서는 낮다.
HDV의 전달은 HBV과 동시적 감염 (동시감염)을 통해 발생할 수 있거나, 만성 B형 간염 또는 B형 간염 보인자 상태 (중복감염)에 중첩된다. HDV를 갖는 중복감염 및 동시감염 둘 다는, HBV 단독을 갖는 감염과 비교하여, 보다 심각한 합병증을 야기한다. 이들 합병증은 급성 감염에서 간 기능상실을 경험할 더 높은 가능성 및 간 경화로의 신속한 진행을 포함하고, 만성 감염에서 간 암을 발병할 기회가 증가된다. B형 간염 바이러스와 함께, D형 간염은 모든 간염 감염 중 최고 치명률을 갖고, 20%이다.
일부 실시형태에서, HBV-연관 질환은 급성 B형 간염이다. 급성 B형 간염은 6개월 미만 지속되는 간의 염증을 포함한다. 급성 B형 간염의 전형적인 증상은 피로, 식욕부진, 구역, 및 구토이다. 매우 높은 아미노트랜스퍼라제 값 (>1000 U/L) 및 고빌리루빈혈증이 자주 관찰된다. 심각한 경우의 급성 B형 간염은 불량한 간 합성 기능으로 나타나는 급성 간 기능상실로 신속하게 진행할 수 있고, 이는 자주 이전 간 질환의 부재하에 16 초의 프로트롬빈 시간 (PT; prothrombin time) 또는 1.5의 국제 정규화 비 (INR; international normalized ratio)로서 한정된다. 급성 B형 간염은 만성 B형 간염으로 진행할 수 있다.
일부 실시형태에서, HBV-연관 질환은 만성 간염이다. 만성 B형 간염 (CHB)은 6개월 초과 동안 지속되는 간의 염증을 포함한다. CHB를 갖는 대상자는 HBsAg 양성이고, 고 바이러스혈증 (≥104 HBV-DNA 카피/ml 혈액) 또는 저 바이러스혈증 (<103 HBV-DNA 카피/ml 혈액)이다. 일부 실시형태에서, 대상자는 적어도 5년 동안 HBV로 감염되었다. 일부 실시형태에서, 대상자는 적어도 10년 동안 HBV로 감염되었다. 일부 실시형태에서, 대상자는 출생시 HBV로 감염되었다. 만성 B형 간염 질환을 갖는 대상자는 면역 내성(tolerant)이거나 활성 질환의 증거 없이 비활성 만성 감염을 가질 수 있고, 또한 무증상이다. 만성 활성 간염을 갖는 환자는, 특히 복제 상태 동안, 급성 간염과 유사한 증상을 가질 수 있다. 만성 B형 간염 질환을 갖는 대상자는 괴사염증(necroinflammatory) 간 질환이 동반된 활성 만성 감염을 갖고, 검출가능한 괴사염증(necroinflammation)의 부재하에 증가된 간세포 턴-오버(turn-over)를 갖거나, 활성 질환의 증거 없이 비활성 만성 감염을 가질 수 있고, 또한 무증상이다. CHB 대상자에서 HBV 감염 지속은 cccHBV DNA의 결과이다. 일부 실시형태에서, CHB를 갖는 대상자는 HBeAg 양성이다. 또다른 실시형태에서, CHB를 갖는 대상자는 HBeAg 음성이다. CHB를 갖는 대상자는 105 미만의 혈청 HBV DNA의 수준 및 트랜스아미나제, 예를 들면, ALT, AST, 및 감마-글루타밀 트랜스퍼라제의 지속적인 상승을 갖는다. CHB를 갖는 대상자는 4 미만의 간 생검 스코어 (예를 들면, 괴사염증 스코어)를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, HBV-연관 질환은 급성 전격 B형 간염이다. 급성 전격 B형 간염을 갖는 대상자는 급성 간염의 증상 및 착란 또는 혼수상태의 추가 증상 (화학물질을 해독하는 간의 기능상실에 기인함) 및 타박상 또는 출혈 (혈액 응고 인자의 결핍에 기인함)을 갖는다.
HBV 감염, 예를 들면, CHB를 갖는 대상자는, 간 섬유증이 발병할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, HBV-연관 질환은 간 섬유증이다. 간 섬유증, 또는 경화는, 섬유증 (과도한 섬유성 결합 조직) 및 정상 간 구조의 구조적으로 비정상 결절로의 전환을 특징으로 하는 확산성 간 프로세스로서 조직학적으로 정의된다.
HBV 감염, 예를 들면, CHB을 갖는 대상자는, 말기 간 질환이 발병할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, HBV-연관 질환은 말기 간 질환이다. 예를 들면, 간 섬유증은, 신체가 간 섬유증 (즉, 보상기전상실된 간)의 결과로서, 예를 들면, 감소된 간 기능을 보상할 수 없는 지점까지 진행할 수 있고, 예를 들면, 정신적 및 신경학적 증상 및 간 기능상실을 야기할 수 있다.
HBV 감염, 예를 들면, CHB를 갖는 대상자는, 또한 악성 간암(hepatoma)으로 언급되는, 간세포 암종 (HCC)이 발병할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, HBV-연관 질환은 HCC이다. HCC는 보통 CHB를 갖는 대상자에서 발병하고, 섬유층판, 거짓 샘 (아데노이드), 다형성 (거대 세포), 또는 투명 세포일 수 있다.
"HDV-관련 장애" 또는 "D형 간염-바이러스-관련 장애"는 HDV의 발현에 연관된 질환 또는 장애이다. 예시적인 HDV-관련 장애는 B형 간염 바이러스 감염, 급성 B형 간염, 급성 D형 간염; 급성 전격 D형 간염; 만성 D형 간염; 간 섬유증; 말기 간 질환; 및 간세포 암종을 포함한다.
본원에 사용된 "치료학적 유효량"은, HBV 감염 또는 HBV-연관 질환을 갖는 대상자를 치료하기 위해 환자에게 투여하는 경우, (예를 들면, 존재하는 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 감소 또는 유지하여) 질환의 치료를 가져오는데 충분한 dsRNA 제제의 양을 포함하는 것을 의도한다. "치료학적 유효량"은 dsRNA 제제, 제제가 투여되는 방법, 질환 및 이의 중증도, 및 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, HBV 유전자 발현에 의해 중재된 병리학적 과정의 단계, 선행되는 또는 수반되는 치료 유형, 경우에 따라, 및 치료될 환자의 다른 개별 특성에 좌우되어 다양할 수 있다. 치료학적 유효량은 하나 초과의 용량의 투여를 필요로 할 수 있다.
"치료학적으로-효과적인 양"은 또한 임의의 치료에 이용가능한 합리적인 이득/위험 비에서 일부 목적하는 효과를 생성하는 dsRNA 제제의 양을 포함한다. 본원 개시내용의 방법에서 이용되는 dsRNA 제제는 이러한 치료에 이용가능한 합리적인 이득/위험 비를 생성하는 충분한 양으로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 대상자로부터 단리된 유사한 유체, 세포, 또는 조직, 뿐만 아니라 대상자 내에 존재하는 유체, 세포, 또는 조직의 수거를 포함한다. 생물학적 유체의 예는 혈액, 혈청, 및 장막 유체, 혈장, 림프, 소변, 타액 등을 포함한다. 조직 샘플은 조직, 기관, 또는 국소 영역으로부터의 샘플을 포함할 수 있다. 예를 들면, 샘플은 특정한 기관, 기관의 부분, 또는 이들 기관 내의 유체 또는 세포로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플은 간 (예를 들면, 전체 간 또는 간의 특정 세그먼트 또는 특정 유형의 간 내 세포, 예를 들면, 간세포(hepatocytes))으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, "대상자로부터 유래된 샘플"은 혈액, 또는 대상자로부터 뽑아낸 혈액으로부터 수득한 혈장 또는 혈청을 언급한다. 추가 실시형태에서, "대상자로부터 유래된 샘플"은 대상자로부터 유래된 간 조직 (또는 이의 하위성분) 또는 혈액 조직 (또는 이의 하위성분, 예를 들면, 혈청)을 언급한다.
II. dsRNA 제제
본원 개시내용은 하나 이상의 HBV 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 제제를 제공한다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 HBV-연관 질환, 예를 들면, 만성 B형 간염을 갖는 대상자, 예를 들면, 사람과 같은 포유동물 내의 세포와 같은 세포에서 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 분자를 포함한다. dsRNA 제제는 HBV 유전자의 발현에서 형성된 적어도 일부의 mRNA에 상보적인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 상보성 영역은 약 19-21개의 뉴클레오티드 길이이다. HBV 유전자를 발현하는 세포와 접촉시, dsRNA 제제는, 예를 들면, PCR 또는 분지형 DNA (bDNA)-기반 방법에 의해, 또는 단백질-기반 방법에 의해, 예를 들면, 웨스턴 블롯팅 또는 유세포분석 기술을 사용하는 면역형광 분석에 의해 검정되는 바와 같이, HBV 유전자의 발현을 적어도 80%까지 억제한다. 바람직한 실시형태에서, 억제 백분율을 본원에 제공된 세포주를 형질감염에서 10 nM 농도에서 사용된 dsRNA 제제와 사용하여 실시예 2에 제공된 실시간 PCR 방법을 사용하여 측정한다.
dsRNA는, 상보적이고 하이브리드화하여 dsRNA가 사용될 상태하에 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 하나의 가닥 (안티센스 가닥)은 표적 서열에 실질적으로 상보적이고, 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 그러나, HBV 유전자형 중에 서열 변형으로 인해, dsRNA는 전체는 아니지만 일부 HBV 유전자형에 완전히 상보적일 수 있다. 표적 서열은 HBV 유전자의 발현 동안 형성된 mRNA의 서열로부터 유도될 수 있다. 다른 가닥 (센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하고, 이에 따라 2개의 가닥은 하이브리드화되거나 적합한 상태하에 조합되는 경우 듀플렉스 구조를 형성한다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 그리고 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, dsRNA의 상보적 서열은 또한, 개별적인 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 것과는 대조적으로, 단일 핵산 분자의 자가-상보적 영역으로서 포함될 수 있다.
일반적으로, 듀플렉스 구조는 19-21 염기 쌍 길이, 예를 들면, 19, 20, 또는 21 염기 쌍 길이이다.
유사하게, 표적 서열에 상보성인 영역은 19-23개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들면, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-23, 20-22, 20-21, 21-22, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 상보성 영역은 21개의 뉴클레오티드 길이이다. 당해 기술 분야의 숙련가가 또한 인지할 수 있는 바와 같이, 절단을 위해 표적화된 RNA의 영역은 가장 자주, 더 큰 RNA 분자, 보통 mRNA 분자의 부분일 것이다. 관련 되는 경우, mRNA 표적의 "부분"은 RNAi-지시된 절단 (즉, RISC 경로를 통한 절단)을 위한 기질이 되는 충분한 길이의 mRNA 표적의 인접한 서열이다.
당해 기술분야의 숙련가는 또한, 듀플렉스 영역이 dsRNA의 주요 기능성 부분, 예를 들면, 약 19-21 염기 쌍, 예를 들면, 19-21, 19-20, 20-21, 19, 20, 또는 21 염기 쌍의 듀플렉스 영역인 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 이중 영역은 19 염기 쌍이다.
본원에 기재된 dsRNA는 추가로 하나 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드 오버행, 예를 들면, 1 또는 2 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 이로서 이루어 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 임의의 이의 조합 상에 존재할 수 있다. 추가로, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥 중 하나 또는 둘 다의 5'-말단, 3'-말단, 또는 둘 다의 말단 상에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, dsRNA는 안티센스 가닥의 3' 말단 상 2-뉴클레오티드 오버행을 포함한다.
dsRNA는 하기 추가로 논의된 당해 기술분야에 공지된 표준 방법으로 예를 들면, Biosearch, Applied Biosystems™, Inc에서 시판되는 자동화 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 약제학적 조성물에서 사용하기 위한 dsRNA의 합성 방법은 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본원 개시내용의 dsRNA 제제 화합물은 2-단계 절차를 사용하여 제조할 수 있다. 첫번째, 이중 가닥 RNA 분자의 개별 가닥을 개별적으로 제조한다. 이어서, 성분 가닥을 어닐링한다(annealed). dsRNA 제제 화합물의 개별 가닥을 용액-상 또는 고체-상 유기 합성 또는 이들 둘 다를 사용하여 제조할 수 있다. 유기 합성은 비천연 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 가닥이 용이하게 제조될 수 있는 이점을 제공한다. 본원 개시내용의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드는 용액-상 또는 고체-상 유기 합성 또는 이들 둘 다를 사용하여 제조할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 제제는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열, 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 포함한다. 센스 가닥은 표 2에서 듀플렉스 중 어느 하나의 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 가닥은 표 2에서 듀플렉스 중 어느 하나의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 AD-66810이 아니다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 dsRNA 제제는, 표 2에 나타낸 바와 같이 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하거나 이로서 본질적으로 이루어지거나 이로서 이루어진다.
III. 변형된 dsRNA 제제
특정 실시형태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 제제의 RNA는 비-변형되고, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지되고 본원에 기재된 화학적 변형 또는 접합을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 제제의 RNA는 화학적으로 변형되어 안정성 또는 다른 유익한 특성이 향상된다. 본원 개시내용의 일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 제제의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부가 변형된다. 본원 개시내용의 일부 실시형태에서, dsRNA 제제의 뉴클레오티드 전부 또는 dsRNA 제제의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 변형되고, 즉, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 비변형된 뉴클레오티드가 dsRNA 제제의 가닥에 존재한다.
본원 개시내용에서 특징으로 하는 핵산은 문헌에 기재된 것과 같은 당해 기술분야에 잘 확립된 방법에 의해 합성 또는 변형될 수 있고 [참조: "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA], 당해 방법은 본원에 참조로서 포함된다. 변형은, 예를 들면, 다음을 포함한다: 말단 변형, 예를 들면, 5'-말단 변형 (인산화, 접합, 역전된(inverted) 링크) 또는 3'-말단 변형 (접합, DNA 뉴클레오티드, 역전된 링크 등.); 염기 변형, 예를 들면, 안정한 염기, 불안정한 염기, 또는 염기가 파트너의 확장된 레퍼토리와 쌍을 이루는 염기들로의 대체, 염기의 제거 (비염기(abasic) 뉴클레오티드), 또는 접합된 염기; 당 변형 (예를 들면, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 또는 당의 대체; 또는 주쇄 변형, 포스포디에스테르 링크의 변형 또는 대체를 포함함. 본원에 기재된 실시형태에 유용한 dsRNA 제제 화합물의 특정 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 변형된 주쇄 또는 비천연 뉴클레오시드간 링크를 포함하는 RNA를 포함한다. 변형된 주쇄를 갖는 RNA는, 그 중에서도, 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해, 및 때때로 당해 기술분야에 참조되는 바와 같이, 이들의 뉴클레오시드간 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA는 또한 올리고뉴클레오시드인 것으로 고려될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 dsRNA 제제는 이의 뉴클레오시드간 주쇄에 인 원자를 가질 것이다.
변형된 RNA 주쇄는, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 링크를 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5'-링크된 유사체, 및 반대의 극성을 갖는 것들(뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍은 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 링크됨)을 포함한다. 다양한 염, 혼합된 염, 및 유리 산 형태가 또한 포함된다.
상기 인-함유 링크의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; 및 미국 특허 RE39464을 포함하고, 이들 각각은 상기 제조 방법에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
인 원자를 포함하지 않는 변형된 RNA 주쇄는, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 링크, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 링크, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 링크에 의해 형성되는 주쇄를 갖는다. 이들은 모르폴리노 링크를 갖는 것들 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 주쇄; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 주쇄; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 알켄 함유 주쇄; 설파메이트 주쇄; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 주쇄; 설포네이트 및 설폰아미드 주쇄; 아미드 주쇄; 및 혼합된 N, O, S, 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것들.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및 5,677,439를 포함하고, 이들 각각은 상기 방법에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
적합한 RNA 미메틱은 본원에 제공된 dsRNA 제제에서 사용하기 위해 고려되고, 여기서, 당 및 뉴클레오시드간 링크 둘 다, 즉, 뉴클레오티드 단위의 주쇄는 신규한 그룹으로 교체된다. 염기 단위는 적합한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. RNA 미메틱이 우수한 하이브리드화 성질을 갖는 것으로 나타나는 이러한 올리고머성 화합물은 펩티드 핵산 (PNA)로서 언급된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 주쇄는 아미드 함유 주쇄, 특히 아미노에틸글리신 주쇄로 교체된다. 핵염기는 유지되고, 주쇄의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262를 포함하고, 이들 각각은 상기 방법에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다. 본원 개시내용의 dsRNA 제제에서 사용하기 위해 적합한 추가의 PNA 화합물은, 예를 들면, 문헌[참조: Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에 기재되어 있다.
본원 개시내용에서 특징으로 하는 일부 실시형태는 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 RNA 및 헤테로원자 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오시드, 및 특히 상기-참조된 미국 특허 번호 5,489,677의 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 주쇄로서 공지됨], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--[여기서, 네이티브(native) 포스포디에스테르 주쇄는 --O--P--O--CH2--로서 표현된다], 및 상기-참조된 미국 특허 번호 5,602,240의 아미드 주쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 특징으로 하는 RNA는 상기-참조된 미국 특허 번호 5,034,506의 모르폴리노 주쇄 구조를 갖는다.
변형된 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 본원에서 특징으로 하는 dsRNA 제제는 2'-위치에서 하기 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 예시적인 적합한 변형은 O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하고, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 실시형태에서, dsRNA는 2' 위치에서 하기 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 그룹, 리포터 그룹, 삽입제, dsRNA 제제의 약동학 성질을 개선시키기 위한 그룹, 또는 dsRNA 제제의 약동학적 성질을 개선시키기 위한 그룹, 및 유사한 성질을 갖는 다른 치환체. 일부 실시형태에서, 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O--CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로서 공지됨) [참조: Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504], 즉, 알콕시-알콕시 그룹을 포함한다. 또다른 예시적인 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2 그룹, 하기 본원 실시예에 기재된 바와 같이 또한 2'-DMAOE로서 공지됨, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (또한 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로서 당해 기술분야에 공지됨), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다. 추가로 예시적인 변형은 다음을 포함한다: 5'-Me-2'-F 뉴클레오티드, 5'-Me-2'-OMe 뉴클레오티드, 5'-Me-2'-데옥시뉴클레오티드, (이들 3개의 부류에서 R 및 S 이성질체 둘 다); 2'-알콕시알킬; 및 2'-NMA (N-메틸아세트아미드).
다른 변형은 2'-메톡시 (2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 dsRNA 제제의 RNA 상 다른 위치에서, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상 당의 3' 위치에서 또는 2'-5' 링크된 dsRNAs에서 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 수행될 수 있다. dsRNA 제제는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 당 미메틱, 예를 들면, 사이클로부틸 모이어티를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 및 5,700,920을 포함하고; 이의 일부는 일반적으로 당해 출원과 함께 소유된다. 상기한 특허 공보 각각의 내용은 이러한 방법에 관련된 교시를 본원에 참조로서 포함된다.
dsRNA 제제는 또한 핵염기 (보통 당해 기술분야에 간단히 "염기"로서 언급됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "비변형된" 또는 "천연" 핵염기는 푸린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예를 들면, 데옥시-티민 (dT), 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌, 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가 핵염기는 미국 특허 번호 3,687,808에 개시된 것들, 문헌에 개시된 것들 [참조: Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008]; 문헌에 개시된 것들 [참조: The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990], 문헌에 개시된 것들 [참조: Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613], 및 문헌에 개시된 것들 [참조: Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]을 포함한다. 이들 핵염기의 일부는 본원 개시내용에서 특징으로 하는 올리고머성 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 푸린을 포함하고, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃까지 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 나타나고 [참조: Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278] 보다 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형으로 조합되는 경우 예시적인 염기 치환이다.
상기 언급된 변형된 핵염기 뿐만 아니라 다른 변형된 핵염기의 일부의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기 언급된 미국 특허 번호 3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; 및 7,495,088을 포함하고, 이들 각각은 상기 방법에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제의 RNA는 또한 하나 이상의 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. "바이사이클릭 당"은 2개의 원자의 브릿징에 의해 변형된 푸라노실 환이다. "바이사이클릭 뉴클레오시드" ("BNA")는 당 환의 2개의 탄소 원자를 연결하는 브릿지를 포함하여 바이사이클릭 환 시스템을 형성하는 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드이다. 특정 실시형태에서, 브릿지는 당 환의 4'-탄소 및 2'-탄소를 연결한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 제제는 하나 이상의 잠금 핵산 (locked nucleic acids; LNA)을 포함할 수 있다. 잠금 핵산은 변형된 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드이고, 여기서, 리보스 모이어티는 2' 및 4' 탄소를 연결하는 추가(extra) 브릿지를 포함한다. 다시 말해, LNA는 4'-CH2-O-2' 브릿지를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드이다. 이러한 구조는 3'-엔도 구조적 형태(endo structural conformation)에서 리보스를 효과적으로 "잠근다(locks)". 잠금 핵산을 dsRNA 제제에 첨가하는 것은 혈청에서 dsRNA 제제 안정성을 증가시키고, 오프-타겟(off-target) 효과를 감소시키는 것으로 나타났다 [참조: Elmen, J. et al., (2005) nucleic acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) nucleic acids Research 31(12):3185-3193]. 본원 개시내용의 폴리뉴클레오티드에서 사용하기 위한 바이사이클릭 뉴클레오시드의 예는 제한 없이 4' 및 2' 리보실 환 원자 사이에 브릿지를 포함하는 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원 개시내용의 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 4' 내지 2' 브릿지를 포함하는 하나 이상의 바이사이클릭 뉴클레오시드를 포함한다. 이러한 4' 내지 2' 브릿지된 바이사이클릭 뉴클레오시드의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 4'-(CH2)―O-2' (LNA); 4'-(CH2)―S-2'; 4'-(CH2)2―O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)―O-2' (또한 "한정된 에틸" 또는 "cEt"로서 언급됨) 및 4'-CH(CH2OCH3)―O-2' (및 이의 유사체; 예를 들면, 미국 특허 번호 7,399,845 참조); 4'-C(CH3)(CH3)―O-2' (및 이의 유사체; 예를 들면, 미국 특허 번호 8,278,283 참조); 4'-CH2―N(OCH3)-2' (및 이의 유사체; 예를 들면, 미국 특허 번호 8,278,425 참조); 4'-CH2―O―N(CH3)-2' (예를 들면, 미국 특허 공보 번호 2004/0171570 참조); 4'-CH2―N(R)―O-2', 여기서, R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호 그룹이다 (예를 들면, 미국 특허 번호 7,427,672 참조); 4'-CH2―C(H)(CH3)-2' (예를 들면, 문헌[참조: Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134]); 및 4'-CH2―C(―CH2)-2' (및 이의 유사체; 예를 들면, 미국 특허 번호 8,278,426 참조)를 포함한다. 변형된 핵산에 관련된 상기한 각각의 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
잠금 핵산 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 추가의 대표적인 미국 특허 및 미국 특허 공보는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하기: 미국 특허 번호 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133;7,084,125; 7,399,845; 7,427,672; 7,569,686; 7,741,457; 8,022,193; 8,030,467; 8,278,425; 8,278,426; 8,278,283; US 2008/0039618; 및 US 2009/0012281을 포함하고, 이는 상기 방법에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
상기한 바이사이클릭 뉴클레오시드 중 어느 것은 하나 이상의 입체화학적 당 배치를 갖도록 제조될 수 있고, 예를 들면 α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함한다 (참조: WO99/14226).
dsRNA 제제의 RNA는 또한 하나 이상의 한정된 에틸 뉴클레오티드를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에 사용된 "한정된 에틸 뉴클레오티드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-O-2' 브릿지를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 잠금 핵산이다. 일부 실시형태에서, 한정된 에틸 뉴클레오티드는 "S-cEt"로서 본원에 언급되는 S 형태로 존재한다.
본원 개시내용의 dsRNA 제제는 또한 하나 이상의 "입체형태적으로 한정된 뉴클레오티드" ("CRN")를 포함할 수 있다. CRN은 리보스의 C2' 및 C4' 탄소 또는 리보스의 C3 및 C5' 탄소를 연결하는 링커를 갖는 뉴클레오티드 유사체이다. CRN은 리보스 환을 안정한 형태로 잠그고(lock), mRNA에 대한 하이브리드화 친화도를 증가시킨다. 링커는, 더 적은 리보스 환 퍼커링(puckering)을 초래하는, 안정성 및 친화도를 위해 최적 위치에서 산소를 위치시키는데 충분한 길이이다.
상기 언급된 CRN의 일부의 제조를 교시하는 대표적인 공보는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 미국 특허 공보 번호 2013/0190383; 및 PCT 공보 WO2013/036868를 포함하고, 상기 방법에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 제제는 UNA (비-잠금 핵산(unlocked nucleic acid)) 뉴클레오티드인 하나 이상의 단량체를 포함한다. UNA는 비-잠금 아사이클릭 핵산이고, 여기서, 당의 결합 중 어느 것은 제거되어, 비-잠금 "당" 잔기를 형성한다. 하나의 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합이 제거된 단량체를 포함한다 (즉, C1' 및 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합). 또다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합 (즉, C2' 및 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거되었다 (문헌[참조: Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) and Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039]을 참조하고, 이는 비-잠금 핵산 뉴클레오티드에 관련된 교시를 위해 참조로서 본원에 포함된다).
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 공보는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 미국 특허 번호 8,314,227; 및 미국 특허 공보 번호 2013/0096289; 2013/0011922; 및 2011/0313020을 포함하고, 이는 상기 방법에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
RNA 분자의 말단에 대한 잠재적으로 안정한 변형은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-하이드록시프롤린올 (Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-하이드록시프롤린올 (Hyp-C6), N-(아세틸-4-하이드록시프롤린올 (Hyp-NHAc), 티미딘-2'-O-데옥시티미딘 (에테르), N-(아미노카프로일)-4-하이드록시프롤린올 (Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3'-포스페이트, 역전된 염기 dT(idT) 및 다른 것들을 포함할 수 있다. 이들 변형의 개시 내용은 PCT 공보 번호 WO2011/005861에서 발견할 수 있다.
특정 실시형태에서, dsRNA 제제는 하나 이상의 아데노신-글리콜 핵산 ("GNA")을 포함하도록 변형된다. 용어 "GNA"는 DNA 또는 RNA와 유사하지만 포스포디에스테르 결합에 의해 링크된 반복되는 글리세롤 단위로 구성되는 이의 "주쇄"의 조성이 상이한 중합체인 글리콜 핵산을 언급한다:
(R)-GXA
아데노신-GNA의 기재는, 예를 들면, 문헌[참조: Zhang, et al. (JACS 127(12):4174-75 (2005))]에서 발견할 수 있다.
본원에 개시된 dsRNA 제제의 뉴클레오티드의 다른 변형은 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 미믹(mimic), 예를 들면, 5'-말단 포스페이트 또는 포스페이트 미믹을 dsRNA 제제의 안티센스 가닥 상에 포함한다. 적합한 포스페이트 미믹은, 예를 들면 미국 특허 공보 번호 2012/0157511에 개시되어 있고, 이는 이러한 변형에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
HBV를 표적화하는 추가의 변형된 dsRNA 제제는, 예를 들면, WO2016/077321에 제공되고, 이는 변형에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 표 2에 열거된 변형된 센스 가닥 및 변형된 안티센스 가닥을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.
IV. 리간드에 접합된 dsRNA 제제
본원 개시내용의 dsRNA 제제는 리간드에 접합될 수 있다. 리간드는 이를 도입하는 dsRNA 제제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서 리간드는, 예를 들면, 이러한 리간드가 부재한 종과 비교하여, 선택된 표적, 예를 들면, 분자, 세포 또는 세포들 유형, 구획, 예를 들면, 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 향상된 친화도를 제공한다. 바람직한 리간드는 듀플렉스 핵산에서 듀플렉스 쌍형성에 참여하지 않을 것이다.
본원 개시내용의 리간드-접합된 올리고뉴클레오티드는, (하기에 기술되는) 링크 분자의 올리고뉴클레오티드 상 부착으로부터 유도되는 펜던트 반응성 기능을 갖는 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해 합성될 수 있다. 이러한 반응성 올리고뉴클레오티드는 시판되는 리간드, 다양한 보호 그룹 중 어느 것을 갖도록 합성된 리간드, 또는 이에 부착된 링크 모이어티를 갖는 리간드와 직접적으로 반응할 수 있다.
본원 개시내용의 리간드-접합된 올리고뉴클레오티드 및 서열-특이적 링크된 뉴클레오시드를 갖는 리간드-분자에서, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드는 적합한 DNA 합성기 상에서 표준 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 전구체, 또는 링크 모이어티를 이미 가지고 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 접합 전구체, 리간드 분자를 이미 가지고 있는 리간드-뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드-접합 전구체, 또는 비-뉴클레오시드 리간드-함유 빌딩 블록을 이용하여 어셈블리될 수 있다.
링크 모이어티를 이미 포함하는 뉴클레오티드-접합 전구체를 사용하여, 서열-특이적 링크된 뉴클레오시드의 합성이 전형적으로 완료된 경우, 이어서, 리간드 분자를 링크 모이어티와 반응시켜 리간드-접합된 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 올리고뉴클레오티드 또는 링크된 뉴클레오시드는, 시판되고, 올리고뉴클레오티드 합성에서 통상 사용되는, 표준 포스포르아미다이트 및 비-표준 포스포르아미다이트 이외에 리간드-뉴클레오시드 접합체로부터 유도된 포스포르아미다이트를 사용하는 자동화 합성기로 합성된다.
RNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 미국 특허 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 8,106,022를 포함하고, 이는 상기 제조 방법에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
A. 탄수화물 접합체
본원에 개시된 조성물 및 방법의 바람직한 실시형태에서, dsRNA 제제 올리고뉴클레오티드는 탄수화물을 추가로 포함한다. 탄수화물-접합된 dsRNA 제제는 핵산, 뿐만 아니라 본원에 기재된 생체내 치료학적 용도에 적합한 조성물의 생체내 전달에 유리하다. 본원에 사용된 "탄수화물"은, 각 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자를 갖는 적어도 6개의 탄소 원자 (이는 선형, 분지형, 또는 사이클릭일 수 있음)를 갖는 하나 이상의 모노삭카라이드 단위로 자체 구성된 탄수화물; 또는 각 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자를 갖는 각각 적어도 6개의 탄소 원자 (이는 선형, 분지형 또는 사이클릭일 수 있음)를 갖는 하나 이상의 모노삭카라이드 단위로 이루어진 탄수화물 모이어티를 이의 부분으로서 갖는 화합물인 화합물이다. 대표적인 탄수화물은 당 (약 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 모노삭카라이드 단위를 포함하는 모노-, 디-, 트리-, 및 올리고삭카라이드), 및 폴리삭카라이드, 예를 들면, 전분, 글리코겐, 셀룰로스, 및 폴리삭카라이드 검을 포함한다. 특정한 모노삭카라이드는 C5 및 그 이상의 (예를 들면, C5, C6, C7, 또는 C8) 당을 포함하고; 디- 및 트리삭카라이드는 2 또는 3개의 모노삭카라이드 단위 (예를 들면, C5, C6, C7, 또는 C8)를 갖는 당을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 모노삭카라이드이다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 하기 화학식으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
화학식 I
화학식 II
화학식 III
화학식 IV
화학식 V
화학식 VI
화학식 VII
화학식 VIII
화학식 IX
화학식 X
화학식 XI
화학식 XII
화학식 XIII
화학식 XIV
화학식 XV
화학식 XVI
화학식 XVII
화학식 XVIII
화학식 XIX
화학식 XX 및
화학식 XXI
일부 실시형태에서, 모노삭카라이드는 N-아세틸갈락토스아민 (GalNAc)이다. 일부 실시형태에서, 탄수화물은 화학식 I과 같은 다중 N-아세틸갈락토스아민 단위를 포함한다:
화학식 I
본원에 기재된 실시형태에 사용될 수 있는 또다른 대표적인 탄수화물 접합체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 화학식 XXII를 포함한다.
화학식 XXII
상기 화학식 XXII에서,
X 또는 Y 중 하나는 올리고뉴클레오티드이고, 나머지 하나는 수소이다.
본원 개시내용의 일부 실시형태에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 본원 개시내용의 dsRNA 제제에 1가 링커를 통해 부착된다. 일부 실시형태에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 본원 개시내용의 dsRNA 제제에 2가 링커를 통해 부착된다. 본원 개시내용의 일부 실시형태에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 본원 개시내용의 dsRNA 제제에 3가 링커를 통해 부착된다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 리간드는 3가 링커를 통해 부착된 3개의 N-아세틸갈락토스아민 단위를 포함한다 ("GalNAc3").
일부 실시형태에서, 이중 가닥 dsRNA 제제는 dsRNA 제제에 부착된 하나의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중 가닥 dsRNA 제제는, 각각 독립적으로 이중 가닥 dsRNA 제제의 다수의 뉴클레오티드에 다수의 1가 링커를 통해 부착된, 다수의 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의) GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다.
본원 개시내용에 사용하기 위해 적합한 추가의 탄수화물 접합체는 PCT 공보 번호 WO2014/179620 및 WO2014/179627에 기재된 것들을 포함하고, 이는 이러한 접합체에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다.
본원에 개시된 조성물 및 방법에서 사용할 수 있는 링커를 갖는 dsRNA 제제 탄수화물 접합체의 비-제한적인 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하기 화학식을 포함한다:
화학식 XXIII
화학식 XXIV
화학식 XXV
화학식 XXVI
화학식 XXVII
화학식 XXVIII
화학식 XXIX 및
화학식 XXX
상기 화학식들에서, X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오티드인 경우, 나머지 하나는 수소이다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에서, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 "GalNAc" (N-아세틸갈락토스아민) 유도체이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 dsRNA 제제는 화학식 XXXI 내지 XXXIV 중 어느 것에 나타낸 구조의 그룹으로부터 선택된 2가 또는 3가 분지형 링커에 접합된다:
화학식 XXXI
화학식 XXXII
화학식 XXXIII 또는
화학식 XXXIV
상기 화학식들에서,
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 독립적으로 각 발생(occurrence)에서 0-20을 나타내고, 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있고;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 각각 독립적으로 각 발생에서 부재하거나, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 독립적으로 각 발생에서 부재하거나, 알킬렌, 치환된 알킬렌이고, 여기서, 하나 이상의 메틸렌은 하나 이상의 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C≡C 또는 C(O)에 의해 간섭되거나 말단화될 수 있고;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 각각 독립적으로 각 발생에서 부재하거나, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O, 또는 헤테로사이클릴이고;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 하기 리간드를 나타내고; 즉, 각각 독립적으로 각 발생에서 모노삭카라이드 (예를 들면, GalNAc), 디삭카라이드, 트리삭카라이드, 테트라삭카라이드, 올리고삭카라이드, 또는 폴리삭카라이드이고; Ra는 H 또는 아미노 산 측쇄이다. 3가 접합 GalNAc 유도체는 특히 화학식 XXXIV과 같은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 dsRNA 제제로 사용하기 위해 유용하다:
화학식 XXXIV
상기 화학식 XXXIV에서,
L5A, L5B 및 L5C는 모노삭카라이드, 예를 들면, GalNAc 유도체를 나타낸다.
GalNAc 유도체를 접합하는 적합한 2가 및 3가 분지형 링커 그룹의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 화학식 I, VI, X, IX, 및 XII으로서 상기 인용된 구조를 포함한다.
B. 링커
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 접합체 또는 리간드는 dsRNA 제제 올리고뉴클레오티드에 절단가능하거나 또는 비-절단가능할 수 있는 다양한 링커를 사용하여 부착될 수 있다.
용어 "링커" 또는 "링크 그룹"은 화합물의 2부분을 연결하는, 예를 들면, 화합물의 2부분을 공유 부착하는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 전형적으로 직접 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자, NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH 또는 원자의 쇄와 같은 단위, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 치환되지 않거나 비치환된 알킬, 치환되지 않거나 비치환된 알케닐, 치환되지 않거나 비치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 알케닐헤테로사이클릴알키닐, 알키닐헤테로사이클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되지 않거나 비치환된 아릴, 치환되지 않거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되지 않거나 비치환된 헤테로사이클릭로 간섭 또는 말단화될 수 있고; 여기서, R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 일부 실시형태에서, 링커는 약 1-24, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16, 또는 8-16개의 원자이다.
절단가능한 링크 그룹은 세포 밖에서 충분히 안정한 그룹이지만, 표적 세포 내로 진입시 절단되어 상기 링커를 함께 유지하고 있는 2개의 부분을 방출한다. 일부 실시형태에서, 절단가능한 링크 그룹은, 대상자의 혈액에서, 또는 두번째 참조 상태 (이는, 예를 들면, 혈액 또는 혈청에서 발견되는 상태를 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있다)하에서 보다, 표적 세포에서 또는 첫번째 참조 상태 (이는, 예를 들면, 세포내 상태를 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있다)하에서 적어도 약 10배, 20,배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 그 이상, 또는 적어도 약 100배 더 신속하게 절단된다.
절단가능한 링크 그룹은 절단 제제, 예를 들면, pH, 산화환원 가능성, 또는 분해(degradative) 분자의 존재에 민감성이다. 일반적으로, 절단 제제는 혈청 또는 혈액에서보다 세포 내에서 더 높은 수준 또는 활성인 것이 더 일반적이거나 발견된다. 이러한 분해 제제의 예는 하기를 포함한다: 산화환원 제제, 특정한 기질에 대해 선택되는 것 또는 기질 특이성이 없는 것, 예를 들면, 산화환원 절단가능한 링크 그룹을 환원에 의해 분해할 수 있는, 세포 내에 존재하는 산화 또는 환원 효소 또는 환원 제제, 머캅탄을 포함함; 에스테라제; 엔도솜 또는 산성 환경을 생성할 수 있는 제제, 예를 들면, 5 이하의 pH를 야기하는 것들; 및 일반적인 산으로 작용하여 산 절단가능한 링크 그룹을 가수분해 또는 분해할 수 있는 효소, 펩티다제 (이는 기질 특이적일 수 있다), 및 포스파타제.
절단가능한 링크 그룹, 예를 들면, 디설파이드 결합은 pH에 민감성일 수 있다. 사람 혈청의 pH는 7.4인 반면, 평균 세포내 pH는 약간 더 낮고, 약 7.1-7.3의 범위이다. 엔도솜은 5.5-6.0의 범위의 더 큰 산성 pH를 갖고, 리소좀은 약 5.0의 보다 더 큰 산성 pH를 갖는다. 일부 링커는 절단가능한 링크 그룹을 가질 것이고, 이는 바람직한 pH에서 절단되고, 이에 의해 세포 내에서, 또는 세포의 바람직한 구획 내로 양이온성 지질을 리간드로부터 방출한다.
링커는 특정한 효소에 의해 절단가능한 절단가능한 링크 그룹을 포함할 수 있다. 링커로 도입되는 절단가능한 링크 그룹의 유형은 표적화되는 세포에 좌우될 수 있다. 예를 들면, 간-표적화 리간드는 에스테르 그룹을 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 링크될 수 있다. 간 세포는 에스테라제 풍부이고, 따라서 링커는 에스테라제-풍부가 아닌 세포 유형에서보다 간 세포에서 더 효율적으로 절단될 것이다. 다른 에스테라제 풍부 세포-유형은 폐, 신장 피질, 및 고환의 세포를 포함한다.
펩티드 결합을 포함하는 링커는 간 세포 및 윤활막세포와 같은 펩티다제 풍부 세포 유형을 표적화하는 경우 사용할 수 있다.
일반적으로, 후보 절단가능한 링크 그룹의 적합성은 후보 링크 그룹을 절단하는 분해 제제 (또는 상태)의 가능성을 시험하여 평가할 수 있다. 또한 혈액 중에서 또는 다른 비-표적 조직과 접촉하는 경우, 절단에 저항하는 능력에 대해 후보 절단가능한 링크 그룹을 시험하는 것이 또한 바람직할 것이다. 따라서, 첫번째 및 두번째 상태 사이의 절단에 대한 상대적 감수성을 측정할 수 있고, 여기서, 첫번째는 표적 세포에서 절단을 나타내는 것으로 선택되고, 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들면, 혈액 또는 혈청에서 절단을 나타내는 것으로 선택된다. 평가는 세포 비함유 시스템에서, 세포에서, 세포 배양물에서, 기관 또는 조직 배양물에서, 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 세포-비함유 또는 배양 상태에서 초기 평가를 수행하고, 전체 동물에서 추가 평가로 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 유용한 후보 화합물은, 혈액 또는 혈청 (또는 세포외 상태를 모방하기 위해 선택된 시험관내 상태하)과 비교하여, 세포 (또는 세포내 상태를 모방하기 위해 선택된 시험관내 상태하)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 신속하게 절단된다.
i. 산화환원 절단가능한 링크 그룹
일부 실시형태에서, 절단가능한 링크 그룹은 환원 또는 산화시 절단되는 산화환원 절단가능한 링크 그룹이다. 환원적으로 절단가능한 링크 그룹의 예는 디설파이드 링크 그룹 (-S-S-)이다. 후보 절단가능한 링크 그룹이 적합한 "환원적으로 절단가능한 링크 그룹"인지, 또는 예를 들면 특정한 dsRNA 제제 모이어티 및 특정한 표적화 제제로 사용하기 위해 적합한지 결정하기 위해, 본원에 기재된 방법을 살펴 볼 수 있다. 예를 들면, 후보는 디티오트레이톨 (DTT), 또는 세포, 예를 들면, 표적 세포에서 관찰될 절단 속도를 모방하는 당해 기술분야에 공지된 시약을 사용하는 다른 환원제를 사용한 인큐베이션으로 평가할 수 있다. 후보는 또한 혈액 또는 혈청 상태를 모방하기 위해 선택되는 상태하에 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 후보 화합물은 혈액 중 최대 약 10%로 절단된다. 일부 실시형태에서, 유용한 후보 화합물은, 혈액 (또는 세포외 상태를 모방하기 위해 선택된 시험관내 상태하)과 비교하여, 세포 (또는 세포내 상태를 모방하기 위해 선택된 시험관내 상태하)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 더 신속하게 분해된다. 후보 화합물의 절단 속도는, 세포외 매질을 모방하기 위해 선택된 상태와 비교하여, 세포내 매질을 모방하기 위해 선택된 상태하에 표준 효소 운동학 검정을 사용하여 측정할 수 있다.
ii. 포스페이트-기반 절단가능한 링크 그룹
일부 실시형태에서, 절단가능한 링커는 포스페이트-기반 절단가능한 링크 그룹을 포함한다. 포스페이트-기반 절단가능한 링크 그룹은 포스페이트 그룹을 분해 또는 가수분해하는 제제에 의해 절단된다. 세포에서 포스페이트 그룹을 절단하는 제제의 예는 세포 중 포스파타제와 같은 효소이다. 포스페이트-기반 링크 그룹의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-이다. 일부 실시형태에서, 포스페이트-기반 링크 그룹은 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, 또는 -O-P(S)(H)-S-이다. 일부 실시형태에서, 포스페이트-기반 링크 그룹은 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보는 상기 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iii. 산 절단가능한 링크 그룹
일부 실시형태에서, 절단가능한 링커는 산 절단가능한 링크 그룹을 포함한다. 산 절단가능한 링크 그룹은 산성 상태하에 절단되는 링크 그룹이다. 일부 실시형태에서, 산 절단가능한 링크 그룹은 약 6.5 이하의 pH (예를 들면, 약 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0, 또는 그 이하)를 갖는 산성 환경에서 절단되거나, 일반적인 산으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 제제에 의해 절단된다. 세포에서, 엔도솜 및 리소좀과 같은 특정의 낮은 pH 세포기관은, 산 절단가능한 링크 그룹을 위한 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단가능한 링크 그룹의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만 하이드라존, 에스테르, 및 아미노 산의 에스테르를 포함한다. 산 절단가능한 그룹은 일반식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 에스테르의 산소(알콕시 그룹)에 부착된 탄소는 아릴 그룹, 치환된 알킬 그룹, 또는 3급 알킬 그룹, 예를 들면, 디메틸 펜틸 또는 t-부틸이다. 이들 후보는 상기한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iv. 에스테르-기반 링크 그룹
일부 실시형태에서, 절단가능한 링커는 에스테르-기반 절단가능한 링크 그룹을 포함한다. 에스테르-기반 절단가능한 링크 그룹은 세포에서 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 절단된다. 에스테르-기반 절단가능한 링크 그룹의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만 알킬렌, 알케닐렌, 및 알키닐렌 그룹의 에스테르를 포함한다. 에스테르 절단가능한 링크 그룹은 일반식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-를 갖는다. 이들 후보는 상기한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
v. 펩티드-기반 절단 그룹
일부 실시형태에서, 절단가능한 링커는 펩티드-기반 절단가능한 링크 그룹을 포함한다. 펩티드-기반 절단가능한 링크 그룹은 세포에서 펩티다제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 절단된다. 펩티드-기반 절단가능한 링크 그룹은 올리고펩티드 (예를 들면, 디펩티드, 트리펩티드 등.) 및 폴리펩티드를 형성하기 위해 아미노 산 사이에 형성된 펩티드 결합이다. 펩티드-기반 절단가능한 그룹은 아미드 그룹 (-C(O)NH-)을 포함하지 않는다. 아미드 그룹은 임의의 알킬렌, 알케닐렌, 또는 알키닐렌 사이에 형성될 수 있다. 펩티드 결합은 펩티드 및 단백질을 수득하기 위해 아미노 산 사이에 형성된 특정한 유형의 아미드 결합이다. 펩티드-기반 절단 그룹은 일반적으로 펩티드 및 단백질을 수득하기 위해 아미노 산 사이에 형성되는 펩티드 결합 (즉, 아미드 결합)에 한정되고, 전체 아미드 기능성 그룹을 포함하지 않는다. 펩티드-기반 절단가능한 링크 그룹은 일반식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-를 갖고, 여기서, RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노 산의 R 그룹이다. 이들 후보는 상기한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
V. dsRNA 제제의 전달
본원 개시내용의 dsRNA 제제를 세포, 예를 들면, 사람 대상자와 같은 대상자 내에 세포로 전달하는 것은, 다수의 상이한 방식으로 성취할 수 있다. 예를 들면, 전달을 시험관내 또는 생체내에서 세포를 본원 개시내용의 dsRNA 제제와 접촉시켜 수행할 수 있다. 생체내 전달은 또한 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 대상자에게 투여하여 직접적으로 성취할 수 있다. 대안적으로, 생체내 전달을 dsRNA 제제의 발현을 암호화하거나 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여하여 간접적으로 수행할 수 있다. 이들 대안은 하기에 추가로 논의된다.
일반적으로, 핵산 분자의 임이의 전달 방법 (시험관내 또는 생체내)은 본원 개시내용의 dsRNA 제제를 사용하기 위해 개조될 수 있다 (예를 들면, 문헌[참조: Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 and WO94/02595]을 참조하고, 상기 전달 방법에 관련된 교시를 위해 본원에 참조로서 포함된다). 생체내 전달을 위해, dsRNA 제제 분자를 전달하기 위해 고려되는 인자는, 예를 들면, 전달된 분자의 생물학적 안정성, 비-특이적 효과의 예방, 및 표적 조직에서 전달된 분자의 축적을 포함한다.
질환의 치료를 위해 dsRNA 제제를 전신 투여하기 위해, RNA는 변형되지 않거나 대안적으로 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다; 둘 다의 방법은 생체내 엔도- 및 엑소-뉴클레아제에 의한 dsRNA의 신속한 분해를 예방하도록 작용한다. RNA 또는 약제학적 담체 또는 약제학적 부형제의 변형은 또한 dsRNA 제제 조성물을 표적 조직으로 표적화하는 것을 가능하게 하고, 바람직하지 않은 오프-타겟 효과를 방지할 수 있다. dsRNA 제제 분자는 화학적 접합, 예를 들면, 상기한 탄수화물 접합체에 의해 변형될 수 있다.
VI. 약제학적 조성물
본원 개시내용은 또한 본원 개시내용의 dsRNA 제제를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 dsRNA 제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. dsRNA 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 HBV 유전자의 발현 또는 활성에 관련된 질환 또는 장애를 치료하는데 유용한다. 이러한 약제학적 조성물은 전달 방식을 기준으로 하여 제형화된다. 하나의 예는 비경구 전달을 통한, 예를 들면, 피하 (SC), 근육내 (IM), 또는 정맥내 (IV) 전달에 의한 전신 투여를 위해 제형화되는 조성물이다. 특정 실시형태에서, 본원 개시내용은 기관-특이적 (예를 들면, 간) 동맥내, 종양내, 피내, 유리체내 주사, 안구 국소, 눈 (점안제), 분무, 안구 국소 또는 다른 국소 경로, 좌제, 또는 경구 투여를 위해 제형화된 조성물을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 조성물은 피하 투여된다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물은 HBV 유전자의 발현을 억제하는데 충분한 투여량(dosages)으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 약 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg의 용량, 또는 용량당 0.3 mg/kg 내지 20 mg/kg, 또는 3 mg/kg 내지 10 mg/kg, 또는 바람직하게는 용량당 3 mg/kg 내지 10 mg/kg으로 투여될 것이다. 예를 들면, dsRNA는 단일 용량당 약 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 50 mg/kg으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 50 mg 내지 900 mg의 용량으로 투여된다.
조성물은 또한 체중에 독립적으로 대상자에게 고정 용량으로 제조되거나 패키징될 수 있다. 예시적인 투여량 수준은 체중 킬로그램당 평균 대상자에 대한 체중을 곱하여 계산할 수 있다. 예를 들면, 평균 성인 사람은 전형적으로 약 70 kg인 것으로 고려된다.
반복-용량 용법은 치료학적 양의 dsRNA 제제를 주기적으로, 예를 들면, 1개월 1회, 2개월 1회, 또는 3개월 1회 투여함을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, dsRNA 제제는 빈번하게 1개월에 1회 이하로 투여된다. 초기 치료 용법 후, 치료제를 더 적은 빈도 기준으로 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 무기한의 기간 동안, 예를 들면, 검출가능한 HBV 항원 또는 HBV cccDNA를 포함하는 HBV DNA와 같은 HBV 감염의 하나 이상의 징후 또는 증상을 갖는 대상자에서 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제로의 치료는 별개의 또는 한정된 시간 기간 동안 수행되고, 기능적 치유를 제공한다.
당해 기술분야의 숙련가는 특정 인자가 대상자를 효과적으로 치료하기 위해 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인지할 수 있고, 상기 인자는, 이에 제한되는 것은 아니지만 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료제, 대상자의 일반적인 건강 또는 연령, 및 다른 존재하는 질환을 포함한다. 더욱이, 치료학적 유효량의 조성물로 대상자룰 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본원 개시내용에 포함된 개별적인 dsRNA 제제에 대한 효과적인 투여량 및 생체내 반감기의 추정치는 종래의 방법론를 사용하여 또는 본원의 다른 곳에서 기재된 생체내 시험을 기준으로 적합한 동물 모델을 사용하여 수행될 수 있다.
A. 부형제
"약제학적 담체" 또는 "약제학적 부형제"는 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁제, 또는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 임의의 다른 약리학적 불활성 비히클이다. 이러한 제제는 당해 기술분야에 잘 공지되어 있다.
B. 다른 성분
본원 개시내용의 조성물은 추가로 약제학적 조성물에서, 이들의 기술-확립된 용법 수준으로 종래 발견되는 다른 부가 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 조성물은 추가의, 양립할 수 있는, 약제학적으로-활성 물질, 예를 들면, 항가려움제, 수렴제, 국소 마취제, 또는 소염제를 포함할 수 있거나, 본원 개시내용의 조성물의 다양한 투여량 형태의 물리적 제형화시 유용한 추가 물질, 예를 들면, 보존제, 항산화제, 및 안정화제를 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 물질은, 첨가되는 경우, 본원 개시내용의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 간섭하지 않아야 한다. 제형은 멸균될 수 있고, 목적하는 경우, 보조 제제, 예를 들면, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 또는 완충액 등과 혼합되고, 이는 제형의 핵산(들)과 유해하게 상호작용하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본원 개시내용에서 특징으로 하는 약제학적 조성물은 (a) 하나 이상의 dsRNA 제제 화합물 및 (b) 비-RNAi 기전에 의해 기능하고 장애 HBV 관련 장애의 치료시 유용한 하나 이상의 제제를 포함한다. 이러한 제제의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 소염제, 항-지방증 제제, 항-바이러스, 및 항-섬유증 제제를 포함한다.
추가로, 보통 간을 보호하기 위해 사용되는 또다른 물질, 예를 들면, 실리마린은, 또한 본원에 기재된 dsRNA 제제와 함께 사용할 수 있다. 간 질환을 치료하는데 유용한 다른 제제는 텔비부딘, 엔테카비르, 및 프로테아제 억제제, 예를 들면, 텔라프레비르 및 예를 들면, US2005/0148548, US2004/0167116, US2003/0144217, 및 US2004/0127488에 개시된 것들을 포함한다.
이러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은, 예를 들면, LD50 (집단의 50% 치사 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)을 측정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 용량 비는 치료학적 지수이고, 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 높은 치료학적 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 입수된 데이터는 사람에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는데 사용할 수 있다. 본원 개시내용에서 특징으로 하는 조성물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 없는 ED50를 포함하는 순환하는 농도 범위 내에 있다. 투여량은 투여량 형태 및 이용되는 투여 경로에 좌우되어 이러한 범위 내에서 가변적일 수 있다. 본원 개시내용에서 특징으로 하는 방법에서 사용되는 임의의 화합물의 경우, 치료학적으로 효과적인 용량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 평가될 수 있다. 용량은 동물 모델에서 제형화되어, 세포 배양에서 결정된 IC50 (즉, 증상의 최대 억제 절반을 성취하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는, 순환하는 혈장 농도 범위의 화합물 또는, 적합한 경우, 표적 서열의 폴리펩티드 생산물 (예를 들면, 감소된 농도의 폴리펩티드를 성취함)을 성취할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 사람에서 더욱 정확하게 유용한 용량을 결정할 수 있다. 혈장에서 수준을, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다.
이들의 투여에 추가하여, 상기 논의한 바와 같이, 본원에서 특징으로 하는 dsRNA 제제는 HBV 감염의 치료에 효과적인 다른 공지된 제제와 병용하여 투여할 수 있다. 임의의 경우, 투여하는 의사는 당해 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 효능의 표준 측정치를 사용하여 관찰된 결과를 기준으로 dsRNA 제제 투여의 양 및 시기 조정할 수 있다.
VII. 방법
본원 개시내용은 또한 세포에서 HBV의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 dsRNA 제제, 예를 들면, 이중 가닥 dsRNA 제제와, 세포에서 HBV의 발현을 억제하기 위해 효과적인 양으로 접촉시켜, 이에 의해 세포에서 HBV의 발현을 억제함을 포함한다.
세포를 dsRNA 제제, 예를 들면, 이중 가닥 dsRNA 제제와 접촉시키는 것은, 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 생체내 세포를 dsRNA 제제와 접촉시키는 것은 대상자, 예를 들면, 사람 대상자 내에서 세포 또는 세포의 그룹을 dsRNA 제제와 접촉시킴을 포함한다. 세포를 접촉시키는 시험관내 및 생체내 방법의 조합이 또한 가능하다. 세포를 접촉하는 것을 상기 논의한 바와 같이 직접적이거나 간접적일 수 있다. 추가로, 세포를 접촉시키는 것은 본원에 기재된 또는 당해 기술분야에 공지된 임의의 리간드를 포함하는 표적화 리간드를 통해 수행될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 표적화 리간드는 탄수화물 모이어티, 예를 들면, GalNAc3 리간드, 또는 dsRNA 제제를 관심 대상 위치로 지시하는 임의의 다른 리간드이다.
상기 방법의 본원 개시내용의 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 대상자 내 특이적 위치에 전달되는 대상자에게 투여된다. HBV 유전자의 발현의 억제는 대상자 내 특이적 위치에서 유체 또는 조직으로부터 유래된 샘플에서 HBV mRNA의 수준 또는 변화 또는 HBV 단백질의 수준의 측정치를 사용하여 평가할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 위치는 간 및 혈액으로부터 선택된다. 위치는 또한 상기 언급한 위치 중 어느 하나에서 생산된 세포 또는 유체의 세부항목 또는 하위그룹일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 HBV 감염을 갖는 대상자, 예를 들면, HBV 유전자 발현 또는 HBV 복제의 감소로 이득을 얻을 수 있는 대상자를 치료하는데 유용하다. 하나의 측면에서, 본원 개시내용은 HBV에 감염된 대상자에서 B형 간염 바이러스 cccDNA의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 또다른 측면에서, 본원 개시내용은 HBV에 감염된 대상자에서 HBV 항원, 예를 들면, HBsAg 또는 HBeAg의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 또다른 측면에서, 본원 개시내용은 HBV에 감염된 대상자에서 HBV의 바이러스 로드를 감소시키는 방법을 제공한다. 본원 개시내용은 또한 (ALT 또는 AST의 일과성 상승이 바이러스 청소율에 연관될 수 있지만) HBV에 감염된 대상자에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 본원 개시내용은 HBV에 감염된 대상자에서 항-HBV 항체의 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 또다른 측면에서, 본원 개시내용은 HBV 감염을 갖는 대상자를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 본원 개시내용은 HBV-연관 질환, 예를 들면, D형 간염 바이러스 감염, 델타 간염, 급성 B형 간염; 급성 전격 B형 간염; 만성 B형 간염; 간 섬유증; 말기 간 질환; 또는 간세포 암종을 갖는 대상자를 치료하는 방법을 제공한다. 추가로, HDV 감염이 전달을 위해 HBV에 의해 제공된 의무적인 조력자 기능에 좌우되고, HBV 감염을 갖는 대상자가 또한 HDV 감염을 가질 수 있기 때문에, 일부 실시형태에서 본원에 기재된 치료 방법은 또한 HDV 감염 또는 HDV-관련 장애, 예를 들면, B형 간염 바이러스 감염, 만성 B형 간염 감염 (CHB), 만성 B형 간염 감염 (CHB), 경화, 간 기능상실, 및 간세포 암종 (HCC)을 갖는 대상자를 치료하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 치료 방법 (및 용도)은 대상자, 예를 들면, 사람에게, 치료학적 유효량의 본원 개시내용의 HBV 유전자를 표적화하는 dsRNA 제제 또는 HBV 유전자를 표적화하는 본원 개시내용의 dsRNA 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
하나의 측면에서, 본원 개시내용은 HBV 감염을 갖는, 예를 들면, 하기한 것을 갖는 대상자에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 방법을 제공한다: 혈청 또는 간 HBV cccDNA의 존재; 혈청 HBV DNA의 존재; 혈청 또는 간 HBV 항원의 존재, 예를 들면, HBsAg 또는 HBeAg; 상승된 ALT; 상승된 AST; 부재하거나 낮은 항-HBV 항체의 수준; 간 손상; 경화; 델타 간염, 급성 B형 간염; 급성 전격 B형 간염; 만성 B형 간염; 간 섬유증; 말기 간 질환; 간세포 암종; 혈청 질병-유사 증후군; 식욕부진; 구역; 구토, 미열; 근육통; 피로; 미각 명료도 및 후각 장애 (식품 및 담배 혐오); 우상상한 및 상복부 통증 (간헐적, 경증 내지 중등도); 간 뇌병증; 기면; 수면 패턴 장애; 정신적 착란; 혼수상태; 복수; 위장관 출혈; 응고병증; 황달; 간비대 (약간 비대해진, 연성 간); 비장비대; 수장홍반; 거미상모반; 근육 쇠약; 거미 혈관종; 혈관염; 정맥류 출혈; 말초 부종; 여성유방증; 고환 위축; 복부 측부 정맥 (메두사 머리); AST 수준보다 높은 ALT 수준; 상승된 감마-글루타밀 트랜스펩티다제 (GGT) 및 알칼리성 포스파타제 (ALP) 수준, ULN 3배 이하); 약간 낮은 알부민 수준; 상승된 혈청 철 수준; 백혈구감소증 (즉, 과립백혈구감소증); 림프구증가증; 증가된 적혈구 침강 속도 (ESR); 단축된 적혈구 생존; 용혈; 저혈소판증; 국제 정규화 비 (INR)의 연장; 혈청 또는 간 HBsAg, HBeAg, B형 간염 코어 항체 (항-HBc) 면역글로불린 M (IgM)의 존재; B형 간염 표면 항체 (항-HBs), 또는 B형 간염 e 항체 (항-HBe), 또는 HBV DNA; 증가된 빌리루빈 수준; 고글로불린혈증; 조직-비특이 항체, 예를 들면, 항-평활근 항체 (ASMAs) 또는 항핵 항체 (ANAs) (10-20%)의 존재; 조직-특이적 항체, 예를 들면, 갑상샘에 대항하는 항체 (10-20%)의 존재; 류마티스 인자 (RF)의 상승된 수준; 저 혈소판 및 백혈구 계수; 퇴행성 및 재생 간세포 변화를 갖는 소엽, 및 동반되는 염증; 또는 검출가능하지 또는 검출가능하지 않은지에 상관없이 대부분 중심소엽 괴사. 상기 방법은 치료학적 유효량의 dsRNA 제제, 예를 들면, dsRNA, 또는 dsRNA 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 대상자에게 투여하여, HBV 유전자 발현의 감소로 이득을 얻을 수 있는 장애를 갖는 대상자, 예를 들면, HBV 감염을 갖는 대상자 또는 HBV 및 HDV 감염 둘 다를 갖는 대상자에서 적어도 하나의 증상을 예방함을 포함한다.
또다른 측면에서, 본원 개시내용은 대상자, 예를 들면, HBV 유전자 발현의 감소 또는 억제로 이득을 얻을 수 있는 대상자, 예를 들면, HBV 감염을 갖는 대상자 또는 HBV 및 HDV 감염 둘 다를 갖는 대상자를 치료하기 위한 치료학적 유효량의 본원 개시내용의 dsRNA 제제의 용도를 제공한다.
추가 측면에서, 본원 개시내용은 대상자, 예를 들면, HBV 유전자 발현 또는 HBV 복제의 감소로 이득을 얻을 수 있는 대상자, 예를 들면, HBV 감염을 갖는 대상자 또는 HBV 및 HDV 감염 둘 다를 갖는 대상자, 및 HBV 유전자 발현의 감소로 이득을 얻을 수 있는 장애, 예를 들면, HBV-연관 질환를 갖는 대상자를 치료하기 위한 약제의 제조에서 dsRNA 제제, 예를 들면, HBV 유전자를 표적화하는 본원 개시내용의 dsRNA 또는 HBV 유전자를 표적화하는 dsRNA 제제를 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
또다른 측면에서, 본원 개시내용은 HBV 유전자 발현 또는 HBV 복제의 감소 또는 억제로 이득을 얻을 수 있는 장애를 앓고 있는 대상자에서 적어도 하나의 증상을 예방하기 위한 본원에 기재된 dsRNA 제제의 용도를 제공한다.
추가 측면에서, 본원 개시내용은 HBV 유전자 발현 또는 HBV 복제의 감소 또는 억제로 이득을 얻을 수 있는 장애, 예를 들면, HBV-연관 질환을 앓고 있는 대상자에서 적어도 하나의 증상을 예방하기 위한 약제의 제조에서 본원에 기재된 dsRNA 제제의 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, HBV를 표적화하는 dsRNA 제제를 HBV 감염 또는 HBV 및 HDV 감염 둘 다, 또는 HBV-연관 질환을 갖는 대상자에게 투여하여, 하나 이상의 HBV 유전자의 발현, HBV ccc DNA 수준, HBV 항원 수준, HBV 바이러스 로드 수준, ALT, 또는 AST를, 예를 들면, 대상자의 세포, 조직, 혈액 또는 다른 조직 또는 유체에서 dsRNA 제제가 대상자에게 투여되는 경우, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상까지 정상을 향하여 감소시키거나 정상화시킨다.
본원 개시내용의 방법 및 용도는, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물을 투여하여 표적의 발현 HBV 유전자가, 예를 들면, 약 1 개월 동안 감소됨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적의 발현 HBV 유전자는 연장된 기간 동안, 예를 들면, 적어도 2개월, 3개월, 또는 그 이상 동안 감소된다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 방법 및 용도는 본원에 기재된 조성물을 투여하여 기능적 치유를 야기함을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 용도에 따른 dsRNA의 투여는 HBV 감염 또는 HBV 및 HDV 감염 둘 다, 또는 HBV-연관 질환을 갖는 환자에서 이러한 질환 또는 장애의 중증도, 징후, 증상, 또는 마커의 감소를 야기할 수 있다. 이러한 맥락에서 "감소"는 이러한 수준의 임상적으로 유의한 감소를 의미한다. 감소는, 예를 들면, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%까지, 또는 검출 수준 미만으로일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 방법의 효능은 HBV-연관 질환의 증상의 감소를 검출 또는 모니터링하여 모니터링할 수 있다. 이들 증상을 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 시험관내 또는 생체내 평가할 수 있다.
질환의 치료 효능은, 예를 들면, 질환 진행, 질환 완화, 증상 중증도, 통증의 감소, 삶의 질, 치료 효과를 지속하는데 필요한 약물의 용량, 질환 마커의 수준, 또는 제공되는 치료될 질환에 적합한 임의의 다른 측정가능한 파라미터를 측정하여 평가할 수 있다. 이러한 파라미터 중 어느 하나, 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정하여 치료의 효능을 모니터링하는 것은 당해 기술분야의 숙련가의 능력 내에서 충분한다. 예를 들면, CHB의 치료 효능은, 예를 들면, 바이러스 로드 및 트랜스아미나제 수준의 주기적인 모니터링에 의해 평가될 수 있다. 후기 판독과 초기 판독의 비교는 의사에게 치료가 효과적인지 아닌지의 지시를 제공한다. 이러한 파라미터 중 어느 하나, 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정하여 치료의 효능을 모니터링하는 것은 당해 기술분야의 숙련가의 능력 내에서 충분한다. HBV를 표적화하는 dsRNA 제제 또는 이의 약제학적 조성물의 투여와 연관되어, HBV-연관 질환에 "대항하여 효과적인"은, 임상적으로 적합한 방식으로의 투여가 환자의 적어도 통계학적으로 유의한 부분에 대해 유익한 효과, 예를 들면, 증상의 개선, 치유, 질환의 감소, 수명 연장, 삶의 질 개선, 또는 HBV 감염 또는 HBV-연관 질환 및 관련 원인을 치료하는데 익숙한 의사에 의해 일반적으로 양성으로 인식되는 다른 효과를 야기함을 지시힌다.
질환 상태의 하나 이상의 파라미터의 임상적으로 유의한 개선이 있는 경우 또는, 그렇지 않으면 예상될 수 있는 증상을 악화 또는 발병시키는 것의 실패에 의해 치료 효과가 명백하다. 예로서, 질환의 측정가능한 파라미터의 적어도 50%, 및 바람직하게는 적어도 70% 이상의 바람직한 변화는 효과적인 치료를 나타낼 수 있다. 제공된 dsRNA 제제 약물 또는 상기 약물의 제형의 효능은 또한 당해 기술분야에 공지된 제공된 질환을 위한 실험 동물 모델을 사용하여 판단할 수 있다. 실험 동물 모델를 사용하는 경우, 치료의 효능은 징후 또는 증상의 통계학적으로 유의한 감소가 관찰되는 경우 증명된다.
dsRNA 제제의 투여는 혈청 또는 간 HBV cccDNA의 존재, 혈청 또는 간 HBV 항원의 존재, 예를 들면, HBsAg 또는 HBeAg를 감소시킬 수 있거나; 또는 ALT 수준, 또는 AST 수준을, 예를 들면, 세포, 조직, 혈액, 소변, 또는 환자의 다른 구획에서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%까지, 또는 상기 검정의 검출 수준 미만으로, 실험실 값에 대한 정상의 상위 수준을 향하여 또는 상기 수준으로 정상화시킬 수 있다.
dsRNA 제제의 투여는 혈청 또는 간 항-HBV 항체, 예를 들면, 항- HBsAg 항체의 존재를, 예를 들면, 세포, 조직, 혈액, 또는 환자의 다른 구획에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상까지 검출가능하게 하거나 증가시킬 수 있거나; 치료 전 검출가능하지 않는 경우 항체를 검출가능하게 할 수 있다.
HBV 발현에 미치는 억제 효과 때문에, 일부 실시형태에서, 본원 개시내용에 따른 조성물 또는 이로부터 제조된 약제학적 조성물은 삶의 질을 향상시킬 수 있다.
HBV 유전자 발현의 감소 또는 억제로 이득을 얻을 수 있는 대상자는 본원에 기재된 HBV 감염 또는 HBV-연관 질환 또는 장애를 갖는 대상자이다.
HBV 유전자 발현의 감소 또는 억제로 이득을 얻을 수 있는 대상자의 치료는 치료학적 및 예방적 치료를 포함한다.
본원 개시내용은 추가로, 다른 제제 또는 다른 치료 방법, 예를 들면, 공지된 제제 또는 공지된 치료 방법, 예를 들면, 이들 장애를 치료하기 위해 현재 이용되는 것들과 병용한, HBV 유전자 발현의 감소 또는 억제로 이득을 얻을 수 있는 대상자, 예를 들면, HBV-연관 질환을 갖는 대상자를 치료하기 위한 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물의 방법 및 용도를 제공한다.
예를 들면, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 HBV 유전자를 표적화하는 dsRNA 제제는, 예를 들면, 본원에 기재된 HBV-연관 질환을 치료하는데 유용한 제제를 병용하여 투여된다. 예를 들면, HBV 발현 감소로 이득을 얻을 수 있는 대상자, 예를 들면, HBV-연관 질환을 갖는 대상자를 치료하기 위한 적합한 추가 치료제 및 치료 방법은, HBV 게놈의 상이한 부분을 표적화하는 dsRNA 제제, 항바이러스제, 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오시드 유사체, 역전사 효소 억제제 (예를 들면, 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 (TDF), 테노포비르 알라펜아미드, 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르 (ETV), 텔비부딘, AGX-1009, 엠트리시타빈, 클레부딘, 리토나비르, 디피복실, 로부카비르, 팜비르, FTC, N-아세틸-시스테인 (NAC), PC1323, theradigm-HBV, 티모신-알파, 및 간시클로비르), 면역 자극제 (예를 들면, 페길화 인터페론 알파 2a (PEG-IFN-α2a), 인터페론 알파-2b, 재조합 사람 인터류킨-7, 및 Toll-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제), 치료 백신 (예를 들면, GS-4774, DV-601, 및 TG1050), 바이러스 진입 억제제 (예를 들면, Myrcludex), HbsAg의 분비 또는 방출을 억제하는 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, REP 9AC), 캡시드 억제제 (예를 들면, Bay41-4109 및 NVR-1221), cccDNA 억제제 (예를 들면, IHVR-25), 또는 다른 치료제 또는 시술, 예를 들면, 간 이식 및 HBV-연관 질환을 치료하기 위한 화학요법, 또는 상기한 것들의 조합을 포함한다.
본원 개시내용의 dsRNA 제제를 투여받는 대상자에게 추가로, 비-RNAi 기전에 의해 기능하고 HBV 감염을 치료하는데 유용한 하나 이상의 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다. 본원 개시내용의 병용 요법에 사용할 수 있는 예시적인 치료제는, 예를 들면, T-세포 헬퍼 활성의 향상, B 림프구의 성숙, T-세포 억압제의 억제, HLA I형 발현의 향상에 의해, 면역 체계를 자극하는 면역 조절제를 포함한다. 적합한 면역 조절제는 항바이러스성, 면역조절, 및 항증식성 효과를 포함하는 다양한 성질을 갖는 인터페론을 포함한다.
예를 들면, 만성 B형 간염을 위한 현행 치료는 인터페론 요법이고, 이는 상승된 간 효소 (AST 및 ALT), 및 이들의 혈액 중 활발하게 분열하는 바이러스 (HBeAg, 또는 HBV DNA 양성 시험)와 같이, 적어도 6개월 동안 문서기록된 HBV 감염을 갖는 대상자에게 투여된다. 인터페론-α 요법은 만성 B형 간염을 갖는 사람들 중 약 35%에서 질환의 장기간, 지속된 완화를 가져오고, 간 효소의 정상화 및 활성 감염(active infection)에 대한 3개의 마커의 손실 (HBeAg, HBV DNA, 및 HBsAg)를 가져온다. 급성 HBV 감염, 말기 경화, 또는 다른 주요 의학적 문제를 갖는 대상자는 전형적으로 인터페론으로 치료되지 않는다.
추가로, HBV-관련 경화를 갖는 환자에 대한 인터페론 요법은, 특히 대량의 혈청 HBV DNA를 사용한 환자에서, 간세포 암종 (HCC) 비율을 유의하게 감소시킨다. HBeAg-양성 보상(compensated) 경화를 갖는 환자에서, 인터페론 요법 후 바이러스학적, 및 생화학적 완화는 개선된 생존에 연관된다. 만성 HBV 감염을 갖는 환자에서, 인터페론-α로 치료 후 HBeAg의 청소율은 개선된 임상적 결과와 연관된다. 요법의 표준 기간은 16 주로 고려된다. 표준 용법의 말기에 낮은 수준의 바이러스 복제를 나타내는 환자는 장기간의 치료로부터 가장 이점을 얻는다.
일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 방법은 HBV 감염 또는 HBV-관련 질환을 갖는 대상자에게 역전사 효소 억제제를 투여함을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용의 방법은 HBV 감염 또는 HBV-관련 질환을 갖는 대상자에게 역전사 효소 억제제 및 면역 자극제를 투여함을 포함한다.
dsRNA 제제 및 추가 치료제 또는 치료는 동일한 시간에 또는 동일한 병용물로, 예를 들면, 비경구로 투여될 수 있거나, 추가 치료제는 개별적인 조성물의 부분으로서 또는 별도의 횟수로 또는 당해 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 또다른 방법으로 투여될 수 있다.
본원 개시내용은 또한 세포에서 HBV 발현을 감소 또는 억제시키기 위한 본원에 기재된 dsRNA 제제 또는 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 또한 다른 측면에서, 세포에서 HBV 유전자 발현을 감소 또는 억제하기 위한 약제를 제조하기 위한 본원에 기재된 dsRNA 제제 또는 dsRNA 제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 또한 다른 측면에서, 본원 개시내용은 세포에서 HBV 복제를 감소 또는 억제시키는 용도를 위한 본원에 개시된 dsRNA 제제 또는 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 다른 측면에서, 세포에서 HBV 복제를 감소 또는 억제시키기 위한 약제를 제조하기 위한 본원에 개시된 dsRNA 제제 또는 dsRNA 제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기 방법 및 용도는 본원에 개시된 바와 같이 세포를 dsRNA 제제와 접촉시키고, 세포를 HBV 유전자의 mRNA 전사의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 유지하여, 세포에서 HBV 유전자의 발현을 억제하거나 HBV 복제를 억제하는 것을 포함한다.
상기 언급한 방법 및 용도에서, 세포를 시험관내 또는 생체내 접촉시킬 수 있고, 즉, 세포는 대상자 내에 존재할 수 있다.
본원에 개시된 방법을 사용하는 치료에 적합한 세포는 HBV 유전자를 발현하는 임의의 세포, 예를 들면, HBV로 감염된 세포, HBV 게놈 또는 HBV 유전자의 부분을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포, 또는 HBV 유전자를 발현하는 유전자삽입 마우스일 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 용도에서 사용하기 위해 적합한 세포는 포유동물 세포, 예를 들면, 영장류 세포 (예를 들면, 사람 세포 또는 비-사람 영장류 세포, 예를 들면, 원숭이 세포 또는 침팬지 세포) 또는 비-영장류 세포 (예를 들면, 마우스 세포, 래트 세포, 또는 다른 포유동물 세포)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 HBV에 의해 감염될 수 있는 세포이다. 특정 실시형태에서, 세포는 사람 세포, 예를 들면, 사람 간 세포이다.
HBV 유전자 발현은 세포에서 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 그 이상까지, 예를 들면, 상기 검정의 검출 수준 미만으로 억제될 수 있다.
HBV 복제는 세포에서 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 그 이상까지, 예를 들면, 상기 검정의 검출 수준 미만으로 억제될 수 있다.
본원에 개시된 생체내 방법 및 용도는 대상자에게 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 투여함을 포함할 수 있고, 여기서, dsRNA 제제는 치료될 포유동물의 HBV 유전자의 RNA 전사의 적어도 일부와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 치료될 유기체가 사람인 경우, 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만 피하, 정맥내, 또는 근육내 투여를 포함하는 당해 기술분야에 공지된 임의의 수단으로 투여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 피하 주사로 투여된다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 단일 주사처럼 전체 용량을 투여하기 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 본원 개시내용은 기관-특이적 (예를 들면, 간) 동맥내, 종양내, 피내, 유리체내 주사, 안구 국소, 눈 (점안제), 분무, 안구 국소 또는 다른 국소 경로, 좌제, 또는 경구 투여를 위해 제형화되는 조성물을 제공한다.
하나의 측면에서, 본원 개시내용은 또한 포유동물, 예를 들면, 사람에서 HBV 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본원 개시내용은 또한 포유동물에서 HBV 유전자의 발현을 억제하는데 사용하기 위한 포유동물의 세포에서 HBV 유전자를 표적화하는 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 또다른 측면에서, 본원 개시내용은 포유동물에서 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제의 제조에서 포유동물의 세포에서 HBV 유전자를 표적화하는 dsRNA 제제의 용도를 제공한다.
상기 방법 및 용도는 포유동물, 예를 들면, 사람에게, 포유동물의 세포에서 HBV 유전자를 표적화하는 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 투여하고, 포유동물을 HBV 유전자의 mRNA 전사의 분해를 수득하기 위해 충분한 시간 동안 유지하여 포유동물에서 HBV 유전자의 발현을 억제함을 포함한다.
특정 실시형태에서, 유전자 발현의 감소를 dsRNA 제제-투여된 대상자의 말초 혈액 샘플에서 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 본원에 기재된 qRT-PCR에 의해 평가할 수 있다. 단백질 생산의 감소를 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 및 본원에 기재된 방법, 예를 들면, ELISA 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 평가할 수 있다. 유전자 및 단백질 발현 수준을 결정하기 위한 임상적으로 허용되는 방법이 적합하게 사용된다. 특정 실시형태에서, 천자 간 생검 샘플은 HBV 유전자 또는 단백질 발현의 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로서 역할을 한다. 일부 다른 실시형태에서, 혈액 샘플은 HBV 유전자 또는 단백질 발현의 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로서 역할을 한다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제의 투여 후 생체내 표적의 RISC 약물 처리 절단의 검증은 당해 기술분야에 공지된 프로토콜의 5'-RACE 또는 변형을 수행하기 위해 시행된다 [참조: Lasham A et al., (2010) Nucleic Acid Res., 38 (3) p-e19 (Zimmermann et al. (2006) Nature 441: 111-4)].
본 발명은 추가로 하기 실시예에 의해 예시되고, 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1
DSRNA 제제 합성
시약의 공급원
시약의 공급원이 특정하게 본원에 제공되지 않는 경우, 이러한 시약은 분자 생물학에서 적용하기 위한 품질/순도 표준에서 분자 생물학을 위한 시약의 임의의 공급자로부터 입수할 수 있다.
dsRNA 제제 설계
WO/2016/077321에 기재된 바와 같이, HBV를 표적화하는 dsRNA 설계의 선택은 2개의 주요 인자로 유도되었다: a) 잠재력, 및 b) 거의 완벽한 매칭을 갖고 모든 공지된 유전자형 (A 내지 H)의 상당수의 공공의 HBV 서열 중 90% 초과의 분획 범위를 갖는 제제 사용 희망. RNA 제제 선택에 대한 조직(coordinates)은 NCBI HBV 참조 게놈 서열 NC_003977.1 (GenBank 등록 번호 GI:21326584 (서열 번호:1))에 대하여 측정하였다. 표면 항원 (HbSAg) 및 HBV 폴리머라제를 코딩하는 HBV 게놈의 2개의 인접한 영역이 중심이 되는 다양한 2'-O-메틸 및 2'-플루오로 치환 패턴을 포함하는 구조-활성 변형을 포함하는 첫번째 세트의 RNA 제제를, 설계하고, 합성하고, 시험관내 선별하였다. HbSAg, 폴리머라제, 및 X 유전자를 코딩하는 영역인 HBV 게놈에서, 특히 서열 번호:1의 위치 1581-1599에서 추가의 영역을 표적화하는 두번째 세트의 제제를, 또한 설계하고, 합성하고, 시험관내 선별하였다. 선택된 서열에 추가로 화학적 변형 및 시험에 적용하였다. 이들 듀플렉스 설계는 WO2016/077321 (이의 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다)에 제공된다; 비변형된 HBV 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 상세한 열거는 WO2016/077321의 표 3, 6, 12, 22, 및 25에 제공되고, 변형된 HBV 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열은 WO2016/077321의 표 4, 7, 13, 23, 및 26에서 제공된다. 이들 제제로 수행된 선별 검정으로부터 결과를 또한 본원에 제공한다.
이러한 연구는 변형된 뉴클레오티드 서열 5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:13)을 갖는 안티센스 가닥 및 변형된 뉴클레오티드 서열 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29)을 갖는 센스 가닥을 갖는 듀플렉스 AD-66810를 확인하고, 여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고; 및 s는 포스포로티오에이트 링크이고; 여기서, N-아세틸갈락토스아민 모이어티 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤린올 (또한 (Hyp-(GalNAc-알킬)3)으로서 공지되거나 본원에 L96으로 언급됨)은 센스 가닥의 3' 말단에 공유결합으로 링크된다.
본원에 제공된 추가 연구를 사람 B형 간염 바이러스 (HBV; U95551)의 X 전사를 표적화하는 이전에 확인된 서열 AD-66810을 기초로 하여 잠재적 및 특이적 dsRNA 제제 분자를 확인하기 위해 수행하였다. 이러한 목적을 성취하기 위해, 일련의 화학적으로 변형된 dsRNA 제제를 설계하고, 합성하고, Dual-Luc 리포터 기반 검정 및 HepG2.2.15 세포주를 사용하여 시험관내 활성에 대해 시험하였다. 모든 화합물을 센스 가닥의 3' 말단에 공유 링크된 트리안테너리(triantennary) N-아세틸갈락토스아민 (GalNAc) 리간드 (L96)에 접합하였다.
dsRNA 제제 합성
HBV 센스 및 안티센스 가닥 서열을 1 μmol 스케일로 Mermade 192 합성기 (BioAutomation) 상에서 고체 지지체 매개된 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 합성하였다. 고체 지지체는 맞춤형(custom) GalNAc 리간드로 적재된 제어된 다공 유리 (500 A) 또는 다목적 고체 지지체 (AM biochemical)였다. 보조 합성 시약, 2'-F 및 2'-O-메틸 RNA, 및 데옥시 포스포르아미다이트를 Thermo-Fisher™ (Milwaukee, WI) 및 Hongene (China)으로부터 입수하였다. 2'F 2'-O-메틸, GNA (글리콜 핵산), 5'-포스페이트, 및 비염기 변형을 상응하는 포스포르아미다이트를 이용하여 도입하였다. 3' GalNAc 접합된 단일 가닥의 합성을 GalNAc 변형된 CPG 지지체에서 수행하였다. 맞춤형 CPG 다목적 고체 지지체를 안티센스 단일 가닥의 합성을 위해 사용하였다. 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT)을 활성제 (아세토니트릴 중 0.6 M)로서 이용하는 모든 포스포르아미다이트 (아세토니트릴 중 100 mM)에 대한 커플링 시간은 5분이었다. 포스포로티오에이트 링크를 3-((디메틸아미노-메틸리덴) 아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온 (DDTT, 제조원: Chemgenes (Wilmington, MA, USA))의 무수 아세토니트릴/피리딘 (1:1 v/v) 중 50 mM 용액을 사용하여 생성하였다. 산화 시간은 3분이었다. 모든 서열을 DMT 그룹을 최종 제거하여 합성하였다 ("DMT 오프").
고체 상 합성 완료시, 올리고리보뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 절단하고, 밀봉된 96 딥 웰 플레이트에서 200 μL 수성 메틸아민 시약을 사용하여 60℃에서 20분 동안 탈보호하였다. 절단 및 탈보호 단계의 말기에, 합성 플레이트를 실온으로 되게 하고, 1mL의 아세토니트릴: 에탄올 혼합물 (9:1)을 첨가하여 침전시켰다. 플레이트를 -80℃에서 2 시간 동안 냉각하고, 상청액을 멀티-채널 피펫의 도움을 받아서 완전히 디켄팅하였다. 올리고뉴클레오티드 피펫을 20mM NaOAc 완충액에 재현탁시키고, 5 mL HiTrap™ 크기 배제 컬럼 (GE Healthcare™)을 사용하여 A905 오토샘플러 및 Frac 950 분획 수집기가 장착된 AKTA 정화기 시스템 상에서 탈염시켰다. 탈염된 샘플을 96-웰 플레이트에 수집하였다. 각 서열로부터의 샘플을 LC-MS로 분석하여 정량화를 위한 UV (260 nm), 및 순도 측정을 위한 IEX 크로마토그래피에 의한 선택된 세트의 샘플로 신원을 확인하였다.
HBV 단일 가닥의 어닐링을 Tecan 액체 취급 로보트에서 수행하였다. 센스 및 안티센스 단일 가닥의 등몰 혼합물을 합하고, 96-웰 플레이트에서 어닐링하였다. 상보적 단일 가닥을 합한 후, 96-웰 플레이트를 완전히 밀봉하고, 오븐에서 100℃에서 10분 동안 가열하고, 서서히 2-3 시간 기간 동안 실온으로 되게 하였다. 각 듀플렉스의 농도를 1X PBS 중 10μM로 정규화하였다.
본원에 개시된 변형된 뉴클레오티드 단량체에 대한 약어를 표 1에 나타낸다. 표 2는 AD-66810 및 상기 방법으로 합성된 HBV dsRNA 제제를 나타낸다.
표 1. 변형된 핵산 서열 표현에 사용된 뉴클레오티드 단량체의 약어.
달리 나타내지 않는 한, 이들 단량체는, 올리고뉴클레오티드에 존재하는 경우, 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 링크되는 것으로 이해할 수 있다.
표 2. GalNAc-접합된 HBV dsRNA 제제의 변형된 뉴클레오티드 서열
실시예 2
DSRNA 제제 듀플렉스의 시험관내 선별
Dual-Glo® 루시퍼라제 검정:
Cos7 세포 (ATCC®, Manassas, VA)를, 트립신처리에 의해 플레이트에서 방출시키기 전에, 거의(near) 컨플루언스(confluence)로 37℃에서 5% CO2의 분위기하에 10% FBS로 공급된 DMEM (ATCC)에서 성장시켰다. 이중 가닥 제제 및 psiCHECK2-HBV (공통 야생-형 HBV 서열의 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터; 서열 번호:5), 또는 이중 가닥 제제 및 HBV 유전자형 A, C, E, 또는 F (각각 서열 번호:6, 7, 8, 또는 9)의 뉴클레오티드 서열을 발현하는 psiCHECK2 벡터로의 Cos7 세포의 형질감염을, 웰당 5μl의 RNA 듀플렉스 및 5μl의 psiCHECK2-HBV (또는 psiCHECK2-HBV 유전자형 A, C, E, 또는 F) 플라스미드를 웰당 5μl의 Opti-MEM® 플러스 0.1μl의 Lipofectamine™ RNAiMax (Invitrogen™, Carlsbad CA. cat # 13778-150)와 함께 첨가하여 수행하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 혼합물을 세포에 첨가하고, 35μl의 신선한 완전 배지에 재-현탁시켰다. 형질감염된 세포를 37℃에서 5% CO2의 분위기하에 인큐베이팅시켰다.
dsRNA 제제 및 psiCHECK2 플라스미드를 형질감염시킨 후 48시간에; 반딧불 (형질감염 대조군) 및 Rinella (HBV 표적 서열에 융합) 루시퍼라제를 측정하였다. 첫번째, 배지를 세포로부터 제거하였다. 이어서, 반딧불 루시퍼라제 활성을 배양 배지 용적과 동일한 20ul의 Dual-Glo® 루시퍼라제 시약을 각 웰 첨가하여 측정하고, 혼합하였다. 발광 (500nm)을 Spectramax® (Molecular Devices)에서 측정하여 반딧불 루시퍼라제 신호를 검출하기 전에, 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. Renilla 루시퍼라제 활성을 20μl의 실온의 Dual-Glo®을 첨가하여 측정하고, Stop & Glo® 시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 10-15분 동안 인큐베이팅하고, 이후에 발광을 다시 측정하여 Renilla 루시퍼라제 신호를 결정하였다. Dual-Glo® Stop & Glo® 시약은, 반딧불 루시퍼라제 신호를 켄칭하고, Renilla 루시퍼라제 반응에 대한 발광을 지속시킨다. dsRNA 제제 활성을 각 웰 내에 Renilla (HBV) 신호를 반딧불 (대조군) 신호로 정규화하여 측정하였다. 이어서, dsRNA 제제 활성의 크기를, 동일한 벡터로 형질감염되지만 dsRNA 제제로 처리되지 않거나 비-표적화 dsRNA 제제로 처리된 세포에 대해 평가하였다. 모든 형질감염을 n=2 이상에서 수행하였다.
표 2에 나열된 제제를 사용하는 이들 검정의 결과를 표 3에 제공한다.
HepG2.2.15 및 PLC 시험관내 선별:
HepG2.2.15 및 PLC (사람 간암 세포; ATCC® CRL-8024) 세포를, 트립신처리로 플레이트로부터 방출시키기 전에, 37℃에서 5% CO2의 분위기에서 각각 10% FBS (ATCC)로 공급된 DMEM 또는 EMEM 배지 (ATCC)에서 거의 컨플루언스까지 성장시켰다. 역 형질감염을 96-웰 플레이트에 웰당 5μl의 dsRNA 제제 듀플렉스를 웰당 14.8μl의 Opti-MEM® 플러스 0.2μl의 Lipofectamine™ RNAiMax (Invitrogen™, Carlsbad CA. cat # 13778-150)와 함께 첨가하여 수행하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 2 x104 HepG2.2.15 또는 PLC 세포를 포함하는 항생물질 없는 80 마이크로리터의 완전 성장 매질을 첨가하였다. 세포를 RNA 정제 전에 24, 48, 및 72 시간 동안 인큐베이팅하였다.
표 2에 열거된 제제를 사용하는 이들 검정의 결과를 표 4에 제공한다.
MagMAX-96 토탈 RNA 단리 키트 (Applied Biosystem, Forer City CA, part #: AM1830)를 사용하는 전체 RNA 단리:
세포를 수확하고, 140μl의 용해/바인딩(Lysis/Binding) 용액에 용해시키고, 이어서, 1분 동안 850rpm에서 Eppendorf ™Thermomixer (혼합 속도는 프로세스에 걸쳐서 동일하다)를 사용하여 혼합하였다. 20 마이크로리터의 자석 비드 및 용해/바인딩 인핸서 혼합물을 세포-용해물에 첨가하고, 5분 동안 혼합하였다. 자석 비드를 자석 스탠드를 사용하여 포획하고, 상청액을 비드를 분포시키지 않고 제거하였다. 상청액 제거 후, 자석 비드를 세척 용액 1 (이소프로판올 첨가)로 세척하고, 1분 동안 혼합하였다. 비드를 포획하고, 다시 상청액을 제거하였다. 이어서, 비드를 150μl 세척 용액 2 (에탄올 첨가)로 세척하고, 포획하고, 상청액을 제거하였다. 이어서, 50 μl의 DNase 혼합물 (MagMax turbo DNase 완충액 및 Turbo DNase)을 비드에 첨가하고, 10 내지 15분 동안 혼합하였다. 혼합 후, 100μl의 RNA 리바인딩(Rebinding) 용액을 첨가하고, 3분 동안 혼합하였다. 상청액을 제거하고, 자석 비드를 150μl 세척 용액 2로 다시 세척하고, 1분 동안 혼합하고, 상청액을 완전하게 제거하였다. 자석 비드를 2분 동안 혼합하여 RNA를 50μl의 물로 용리하기 전에 건조시켰다.
ABI 고 용량 cDNA 역 전사 키트 (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)를 사용하는 cDNA 합성:
반응당 2μl 10X 완충액, 0.8μl 25X dNTPs, 2μl 랜덤 프라이머, 1μl 역전사 효소, 1μl RNase 억제제 및 3.2μl의 H2O의 마스터 혼합물을 10μl 총 RNA로 첨가하였다. cDNA를 Bio-Rad® C-1000 또는 S-1000 열 순환기 (Hercules, CA)를 사용하여 하기 단계를 통해 생성하였다: 25℃ 10 min, 37℃ 120 min, 85℃ 5 sec, 4℃ 유지.
실시간 PCR:
2 μl의 cDNA를 384 웰 플레이트 (Roche cat # 04887301001)에서 웰당 0.5μl의 사람 GAPDH TaqMan 프로브 (Applied Biosystems Cat # 4319413E), 1μl SORF2 특이적 TaqMan® 프로브 및 5μl Lightcycler 480 프로브 마스터 혼합물 (Roche Cat # 04887301001)을 포함하는 마스터 혼합물에 첨가하였다. 실시간 PCR을 DDCt(RQ) 검정을 사용하여 LightCycler480 실시간 PCR 시스템 (Roche)에서 수행하였다. 상대적 배수 변화를 계산하기 위해, 실시간 데이터를 DDCt 방법을 사용하여 분석하고, AD-1955로 형질감염된 세포, 또는 가짜 형질감염 세포로 수행된 검정으로 정규화하였다.
상대적 배수 변화를 계산하기 위해, 실시간 데이터를 DDCt 방법을 사용하여 분석하고, 비-표적화 대조군 dsRNA 제제로 형질감염된 세포로 수행된 검정으로 정규화하였다.
실시예 3
DUAL-LUC 시스템에서 GALNAC 접합된 HBV-표적화 dsRNA 제제의 형질감염
접합된 dsRNA 제제 각각으로 형질감염 후 HBV mRNA의 사일런싱을 표 3에 나타낸다. 각각의 dsRNA 제제를 50nM, 10nM, 및 0.1nM의 dsRNA 제제 농도에서 Cos7 세포에서 형질감염에 의해 시험하였다. 선별 결과를 기초로 하여, 20개 dsRNA 제제 중 7개는 모(parent) AD-66810에 필적하는 잠재력을 나타내었다.
표 3. 50nM, 10nM, 또는 1nM에서 형질감염된 접합된 HBV dsRNA 제제의 Dual-Luc 검정를 사용하는 선별 결과
약어: ID=식별; SD=표준 편차
a선별 세트의 HBV dsRNA 제제의 형질감염 48 시간 후 잔류하는 상대적 HBV 발현 (대조군 형질감염된 세포에 대한)의 분획.
실시예 4
HEPG2.2.15 세포에서 GALNAC 접합된 HBV-표적화 dsRNA 제제의 형질감염
접합된 dsRNA 제제 각각으로 형질감염 후 HepG2.2.15 세포에서 HBV mRNA (정방향 및 역방향 프라이머 및 TaqMan 프로브를 사용하여 측정된 PORF1 및 SORF2 mRNA)의 사일런싱을 표 4에 나타낸다. 전반적으로, PORF1 및 SORF2 바이러스 전사체의 보다 강건한(robust) 사일런싱이, Dual-Luc 과발현 시스템에서 관찰된 사일런싱과 비교하여, HepG2.2.15 세포에서 관찰되고, 10개의 dsRNA 제제는 모(parent) AD-66810에 필적하는 잠재력을 가졌다. 유사한 dsRNA 제제 활성을 PORF1 및 SORF2 mRNAs에 대해 관찰하고, 이는 dsRNA 제제 표적 부위가 전사체 둘 다에세 존재하기 때문에 예상되었다.
표 4. 50nM, 10nM, 또는 1nM에서 형질감염된 접합된 HBV dsRNA 제제의 HepG2.2.15를 사용하는 선별 결과
약어: SD=표준 편차
a선별 세트의 HBV dsRNA 제제의 형질감염 24 시간 후 잔류하는 상대적 HBV 발현 (대조군 형질감염된 세포에 대한)의 분획.
상기 연구를 기초로 하여, 듀플렉스 AD-81890를 추가 분석을 위해 선택하였다.
실시예 5
단일 피하 주사 후 아데노-관련 HBV 마우스 모델에서 AD-81890 약리학의 평가
AD-81890의 약리학을 아데노-관련 HBV (HBV-AAV) 마우스 모델에서 검정하였다. AAV8-HBV (SignaGen Laboratories)를 1 × PBS 중에 2 × 1012 GC/mL의 최종 농도로 희석시켰다. 수컷 C57BL/6 마우스 6-8주령을 측면 꼬리 정맥을 통해 2 × 1011 GC/마우스로 100 μL의 고정 용적으로 정맥내 주사하였다.
AD-81890을 멸균 1 × PBS로 희석하고, 다양한 용적의 10μl/g로 투여하였다. 동물은 AD-81890의 단일 SC 용량을 0.3, 1, 또는 3 mg/kg에서 투여받고, 혈액을 용량 후 -24, -2, 0, 14, 21, 33, 47, 59, 및 74일째에 안와후방굴을 통해 표 5에 기재된 바 같이 수집하였다.
표 5. AD-81890 단일 용량 AAV-HBV 연구 설계
약어: No.=수; PBS=포스페이트 완충된 염수
a 47일째 n=8 동물; 59일째 n=6; 72일째 n=5, 싸움 상처 때문에 안락사된 동물
수집 후, 혈액을 30분 동안 응고되게 하고, 이어서, 마이크로원심분리기에서 10 min 동안 13,000 rpm 및 4℃에서 회전시켰다. 혈청을 흡입하고, -20℃에서 저장하였다.
B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질 수준을 ELISA (BioTang, Waltham, MA)를 통해 평가하였다. US Biologics (Memphis, TN) HBsAg 단백질을 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 혈청 샘플을 1 × PBS (Gibco, Gaithersburg, MD)에서 1:2000 또는 1:500으로 희석하고, 약간 변형된 ELISA 프로토콜을 사용하여 평가하였다. 간단히, 50 μL/웰의 희석된 혈청 또는 표준을 플레이트에 로딩하고, 1 h 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 이러한 인큐베이션 후, 50 μL /웰 효소 접합체를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30 min 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 300 μL/웰 1 × 세척 완충액으로 3회 세척하고, 이어서, 모든 액체가 웰로부터 제거될 때까지 블롯팅하고, 100 μL/웰 기질을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30 min 동안 인큐베이팅하였다. 최종적으로, 추가의 100 μL/웰의 정지 용액을 첨가하고, 흡광도를 450 nm의 파장에서 측정하였다. 계산된 HBsAg 수준이 검정의 정량 하한 (LLOQ) 아래인 경우, 값을 LLOQ로서 기록하였다 (즉, 313 ng/mL).
AD-81890의 단일 피하 (SC) 용량 후 HBV-AAV 마우스에서 평균 ± SD 혈청 HBsAg 농도를 도 2a에 나타낸다. HBV-AAV 마우스에서 기준선에 대한 평균 ± SD 혈청 HBsAg 수준을 도 2b에 나타낸다. 0.3, 1, 또는 3 mg/kg에서의 AD-81890의 단일 SC 주사는 HBV-AAV 마우스에서 혈청 HBsAg 농도의 강력하고 지속된 감소를 야기하고, 최고 (3mg/kg) AD-81890 용량 그룹에서 7일째에 92%의 최대 감소를 관찰하였다. 감소의 최대 수준은, HBsAg 수준이 기준선을 향해 돌아오기 시작한 후 33일째까지 최고 용량 그룹에서 유지되었다 (도 2b). 혈청 HBsAg 농도의 중간 감소는 0.3mg/kg 및 1mg/kg AD081890 용량 그룹에서 7일째에 각각 23% 및 72%의 최대 감소로 관찰되었다. 0.3mg/kg 및 1mg/kg AD-81890 용량 그룹 둘 다에서 HBsAg 수준은 연구 완료까지 기준선 수준으로 돌아왔다 (74일째).
실시예 6
다중 피하 주사 후 아데노-관련 HBV 마우스 모델에서 AD-81890 약리학의 평가
AD-81890의 약리학을 아데노-관련 HBV (HBV-AAV) 마우스 모델에서 검정하였다. AAV8-HBV (SignaGen Laboratories)를 1 × PBS에서 2 × 1012 GC/mL의 최종 농도까지 희석하였다. 6-8 주령 수컷 C57BL/6 마우스에게 측면 꼬리 정맥을 통해 2 × 1011 GC/마우스로 100 μL의 고정 용적으로 정맥내 주사하였다.
각각의 AD-66810 및 AD-81890을 멸균 1X DPBS로 희석하고, 다양한 용적의 10ul/g로 투여하였다. 동물은 1 mg/kg 제공된 Q2Wx6에서 AD-66810, 또는 9mg/kg에서 AD-81890의 단일 용량, 또는 1 또는 3mg/kg 제공된 Q2Wx6 또는 QMx3에서 AD-81890의 다중 용량을 투여받았다. 혈청을 표 6에 기재된 바와 같이 다중 시점에서 동물로부터 수집하였다. 혈액을 표 6에 기재된 바와 같이 안와후방굴을 통해 수집하였다.
표 6. AD-81890 다중 용량 AAV-HBV 연구 설계
혈액 샘플을 처리하고, ELISA 검정을 이전 실시예에서 기재한 바와 같이 수행하였다. 결과를 하기 표 7에 나타낸다. 표준 편차와 함께 결과를 도 3에 나타낸다.
표 7. 평균 Log-배수 변화로서 표현된 AD-81890 다중 용량 AAV-HBV 결과
용량 반응 혈청 HBsAg 수준을 AD-81890 투여 후 AAV8-HBV 마우스 모델에서 관찰하였다. 약 2.7 log 10의 최대 HBsAg 감소를 단일 9mg/kg 용량 또는 AD-81890의 3mg/kg q2w x 6 후 관찰하였다. 3mg/kg q2w x 6을 투여받은 동물은 대략적으로 총 8 주 동안 2 log10 초과의 지속적 HBsAg 감소를 나타내었다.
이들 생체내 연구는 HBV-AAV 마우스 모델에서 AD-81890이 혈청 중 HBsAg 감소에 효과적임을 입증한다.
실시예 7
AD-81890의 특이적 오프-타겟 분석
실리코 바이오인포맥스(silico bioinformatics) 방법 및 시험관내 방법의 조합을 사용하여 AD-81890의 안티센스 가닥의 잠재적 오프-타겟(potential off-target) 활성을 평가하였다.
바이오인포맥스
B형 간염 바이러스 (HBV) 하위유형 ayw (GenBank 뉴클레오티드 ID U95551; NCBI GeneID: 7276; 서열 번호:49)의 'X' 유전자를 표적화하는 dsRNA 제제의 세트를 맞춤형 R 및 Python 스크립트(scripts)를 사용하여 설계하였다. 원형 U95551 HBV 게놈은 3182 염기의 길이를 갖고, 'X' 유전자 CDS 영역은 위치 1376-1840에서 NCBI 기록에서 코딩된다. dsRNA 제제 설계 및 선별 방법의 상세한 설명은 상기 및 WO2016/077321에 제공된다.
HepG2.2.15 세포에서 오프-타겟 검출을 위한 GalNAc-접합된 dsRNA 제제의 형질감염 선별
오프-타겟 억제를 측정하기 위해, qPCR에 의한 내인성 발현된 전사체의 반응을 간세포 세포주 HepG2.2.15에서 시험하였다. 세포를 96-웰 플레이트 (웰당 2 x 104 세포)에서 AD-81890으로 50nM 내지 5 fM의 농도로 Lipofectamine RNAiMax (ThermoFisher)를 사용하여 형질감염시켰다. 24 시간 후, RNA를 세포로부터 MagMAX™-96 토탈 RNA 단리 키트 (ThermoFisher)를 사용하여 추출하고; cDNA를 ABI 고 용량 cDNA 역 형질감염 키트 (ThermoFisher)를 사용하여 생성하였다. 샘플을 HBV mRNA의 억제 및 잠재적 오프-타겟 사일런싱에 대해 검정하였다. qPCR에 의한 정량화를 위해, HBV 발현을 2개의 상이한 맞춤형 TaqMan 검정, PORF-1 및 SORF-2를 사용하여 평가하고, 이는 상이한 영역의 HBV 바이러스 전사체를 인지한다.
오프-타겟 사일런싱을 평가하기 위해, 각각의 잠재적 오프-타겟 (표 8)에 대해 특이적인 TaqMan 프로브를 정량화를 위해 사용하였다. qPCR을 LightCycler 480 실시간 PCR 기계 (Roche)로 수행하였다.
표 8. AD-81890의 잠재적 오프-타겟 서열
a 미스매치 위치는 5'-3' 방향에서 안티센스 가닥에 대해 한정되고, 따라서, 위치 1은 AD-81890의 안티센스 가닥의 5'-최대 뉴클레오티드에 상보적인 염기에 상응한다.
b 다중 RefSeq IDs가 동일한 표적 유전자 및 오프-타겟 프로파일과 연관된 경우, 둘 다의 IDs가 나열된다.
온-타겟 (HBV) 및 잠재적 오프-타겟 유전자 억제의 범위를 측정하기 위해, 상대적 RNA 수준을 동일한 샘플로부터 사람 GAPDH RNA 발현에 대한 정상화에 의해 측정하였다. 결과를 형질감염된 비특이 dsRNA 제제 대조군과 비교하고, 오차를 표준 편차로서 표현하였다. AD-81890의 IC50은 PORF1 전사 표적에 대해 0.803 nM이고, SORF2 전사 표적에 대해 0.766 nM였다. 어떠한 유의한 표적 녹아웃도 AD-81890의 최고 농도에서 조차 SIDT2 및 ZBTB2 전사체에 대해 관찰되지 않았다.
AD-81890에 의한 오프-타겟 억제의 범위를 HepG2.2.15에서 내인성 발현된 전사체로부터 2 잠재적 오프-타겟에 대한 용량 반응 선별에서 평가하였다. AD-81890은 시험된 용량 중 어느 것에서도 SIDT2 또는 ZBTB2에 대한 발현을 억제하지 않았지만, HBV 억제는 용량 반응이었다. 4-파라미터 피트 모델 (XLfit)을 사용하여 용량-반응 데이터를 피팃하여 PORF-1 또는 SORF-2 각각에 대한 803 pM 및 766 pM의 IC50을 수득하였다.
실시예 8
HEPG2.2.15 세포에서 RNA-SEQ를 사용하는 AD-81890 특이성의 시험관내 분석
HBV-발현 HepG2.2.15 세포주에서 AD-66810 및 AD-81890를 비교함에 의해 dsRNA 제제 화학 변형의 영향을 RNA-Seq를 사용한 발현 수준의 전사체-와이드(transcriptome-wide) 변화를 사용하여 측정하였다. AD-66810 및 AD-81890 분자는 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖지만, 안티센스 가닥의 분자의 5' 말단으로부터 위치 6에서 단일 글리콜 핵산 (GNA)의 치환과 상이하다 (표 2 참조).
HepG2.2.15 세포, 완전 게놈 HBV로 안정하게 형질감염된 HepG2 유래된 세포주를, 배양 매질로 187,500 세포/mL의 최종 농도까지 희석하고, 80 μL를 96-웰 콜라겐 코팅된 플레이트 (BD Biocoat, Cat#356407)로 피펫팅하여 15,000 세포/웰의 최종 농도를 수득하였다.
dsRNA 제제 스톡을 1X DPBS에서 하기 농도까지 희석하였다: 1,000 nM 또는 100 nM. RNAiMAX (ThermoFisher, Cat#13778150)를 Opti-MEM (ThermoFisher Cat#31985062)로 0.3 μL RNAiMAX/10 μL Opti-MEM의 농도에서 희석하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, 10 μL/웰을 96-웰 콜라겐 코팅된 플레이트 (BD Biocoat, Cat#356407)의 각 웰에, 10 μL/웰의 적합한 dsRNA 제제 희석물과 함께 첨가하고, 온화하게 혼합하고, 20분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 80 μl의 제조된 세포 현탁액을 각 웰에 첨가하여 15,000 세포/웰의 최종 세포 밀도를 및 100 nM 및 10 nM의 최종 dsRNA 제제 농도를 수득하였다. 세포를 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2로 16-22 시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 플레이팅하여 각각의 실험 조건이 16 웰을 갖도록 하고, 실험을 2회 수행하였다.
ThermoFisher RNAqueous-96 토탈 RNA 단리 키트를 사용하여 RNA를 프로토콜에 따라서 단리하였다. 간단히, 16-22 시간 후, 상청액을 각 웰로부터 흡입하고, 100 μL/웰 1X DPBS를 첨가하여 잔류 매질로부터 세정하고, 이어서, 흡입하였다. 200 μl의 용해/바인딩 용액을 각 플레이트의 1열 및 5열의 각 웰에 첨가하고, 수회 아래 위로 피펫팅하고, 다음 열로 옮겨서 4 웰/조건을 풀링하여 적당한 RNA 회수를 보장하였다. 이는 조건마다 4개의 복제물을 야기하였다. 100 μL 100% 에탄올을 용해물을 포함하는 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 수회 혼합하고, 필터 플레이트의 웰에 옮겼다. 일련의 원심분리 단계 (1,900xg, 1분)를 통해 샘플을 제공된 세척 용액으로 세척하고, DNase 시약으로 처리하고, 100 μL 뉴클레아제-비함유 물에 용리하였다. RNA 농도를 NanoDrop 8000 분광광도계 (ThermoFisher)로 측정하였다.
RNA를 TURBO DNase (Ambion)로 추가로 처리하였다. 각각의 RNA 샘플 (≤10 μg RNA/샘플)을 2 μL DNase, 10 μL 10X 완충액, 및 뉴클레아제 비함유 물과 100 μL의 총 용적까지 혼합하고, 이어서, 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. DNase 처리 후, RNA를 RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen)로 프로토콜에 따라서 추가로 정제하였다. RNA를 30 μL 뉴클레아제 비함유 물로 용리하고, RNA 농도를 NanoDrop 8000 분광광도계로 측정하였다. RNA를 -80℃에서 저장하였다. 이러한 RNA를 후속적으로 TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit (Illumina)와 함께 cDNA 라이브러리 제조에 사용하고, NextSeq500 데스크탑 서열분석기 (Illumina)로 서열분석하고, 모두 제조자의 지시에 따른다. 2개의 실험 반복을 수행하였다.
HepG2.2.15 세포를 10 또는 100 nM의 AD-66810 또는 AD-81890로 4중(quadruplicate)으로 형질감염시키고, 비처리 대조군과 동시에 24 h 동안 배양하였다. Purelink RNA 키트 (ThermoFisher)로 추출된 RNA를 rRNA 고갈을 위한 Ribo-Zero 사람/마우스/래트를 갖는 TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit (Illumina)와 함께 cDNA 라이브러리 제조에 사용하고, NextSeq500 데스크탑 서열분석기 (Illumina)에서 서열분석하고, 이들 모두 제조자의 지시에 따른다. 총 40 샘플을 NextSeq 500/550 High Output v2 (75 주기) 유세포 (Illumina)마다 풀링하였다(pooled). 2가지 실험 반복을 수행하였다.
미가공(Raw) RNA-Seq 판독을 fastq-mcf를 사용하여 25의 최소 평균 품질 스코어 및 36의 최소 잔류 길이로 필터링하였다. 필터링된 판독을 동시에 사람 (hg19/GRCH37) 및 HBV (GenBank 뉴클레오티드 ID U95551; NCBI GeneID: 7276) 게놈으로 STAR (버젼 2.4.2a)를 사용하여 정렬하였다. HBV 게놈의 원형 구조 때문에, 46 염기 쌍을 HBV 서열의 선형화 버젼의 말단에서 반복하여 판독을 중단점(break point)에서 맵핑하였다. 엑손에 대해 고유하게 정렬된 판독 맵핑을 featureCounts (버젼 1.5.0)로 계수하였다. 모든 샘플은 >5M 맵핑된 판독을 가졌다. 차등 유전자 발현 분석을 패키지 DESeq2 (버젼 1.16.1)을 사용하여 R (버젼 3.4.1)에서 수행하였다. 조절된 p-값을 수득하기 위한 다중 시험 보정을 Benjamini & Hochberg, 1995의 방법을 사용하여 DESeq2로 수행하였다.
MA 플롯을 사용하여 온-타겟(on-target) HBV 녹아웃 및 오프-타겟 효과 둘 다를 가시화하였다. 전반적인 오프-타겟 효과 완화시 GNA 화학의 분석은 하향조절된 유전자 (log2 배수 변화 < 0)로 한정된다. 상향조절된 유전자 (log2 배수 변화 > 0)를 이차적인 효과로 고려하였다. 오프-타겟 효과의 평가를 거의 최대 HBV 녹아웃에 이르렀기 때문에 최저 (10 nM) 용량으로 한정하였다. 전사적 노이즈와 비교하여, 유의하게 하향조절된 유전자 (조절된 p-값 < 0.05)를 AD-66810 및/또는 AD-81890에서 확인하였다. 하향조절의 범위를 log2 배수 변화의 박스 플롯으로 가시화하고 (도 4), AD-66810 및 AD-81890 사이의 통계학적 차이를 웰치 2-측, 2-샘플 t-테스트를 사용하여 평가하였다 (표 9).
표 9. 유의하게 하향조절된 유전자의 통계학적 시험
exp: 실험 반복; Mean.AD-66810.IFC: AD-66810 및/또는 AD-81890에서 유의하게 하향조절된 유전자의 평균 log2 배수 변화; 평균.AD-81890.IFC: AD-81890 및/또는 AD-66810에서 유의하게 하향조절된 유전자의 평균 log2 배수 변화; t.통계적: 웰치 2-측, 2-샘플 t-테스트로부터 t-통계치; p.값: 웰치 2-측, 2-샘플 t-테스트로부터 p-값; d.o.f.: 자유도; N: AD-66810 및/또는 AD-81890에서 유의하게 하향조절된 유전자의 수 (p<0.05)
AD-66810와 비교하여 AD-81890에 대한 오프-타겟 효과의 일관된 감소는 둘 다의 실험 반복에 걸쳐서 관찰되었다 (도 4, 표 9). 10nM에서, AD-81890은 AD-66810과 비교하여 유의하게 하향조절된 유전자의 평균 log2 배수 변화의 52% (반복 1) 또는 54% 감소 (반복 2)를 나타내었다 (표 9). 100nM에서, AD-81890는 AD-66810과 비교하여 평균 log2 배수 변화의 71% (반복 1) 또는 43% 감소 (반복 2)를 나타내었다 (표 9). 모든 경우에서, log2 배수 변화의 관찰된 감소는 매우 통계학적으로 유의하였다. 따라서, AD-81890은 전사적 노이즈의 실질적으로 더 낮은 수준을 가졌다.
실시예 9
PXB-마우스에서 사람-특이적 간독성의 평가
PXB-마우스는 사람 간세포 (PhoenixBio)로 고도로 다시 채워진 (highly repopulated) 사람화 간을 사용한 키메라 마우스이다. 상기 마우스는 사람 간세포로 이식된 우로키나제-유형 플라스미노겐 활성제 (uPA)/중증 복합 면역결핍 (SCID) 마우스이다 (사람화 간 uPA/SCID 마우스) [참조: Mercer et al., Nat. Med. 7:927-933, 2001]. 보고된 사람화 간 uPA/SCID 마우스는 70% 초과의 대체 지수 (RI), 간에서 사람 간세포의 백분율을 갖는다. 마우스를 사람 약물 대사, 약동학, 및 간독성의 예측을 위한 모델로서 시용할 수 있다 [참조: Naritomi et al., Drug Metab Pharmacokinet. 33:31-39, 2018].
연구를 PBX-마우스에서 수행하여 AD-66810 및 AD-81890의 간독성을 비교하였다. 마우스에게 0, 21, 28, 35, 및 42일째에 12, 36, 또는 100 mg/kg의 AD-66810, AD-81890, 또는 PBS (대조군)를 피하 주사로 투약하였다 (그룹당 n=4). 일반적인 상태 관찰 및 체중 측정을 49일 동안 1주일에 2회 수행하였다. 혈액을 안구뒤 출혈을 1주일에 2회 수집하고, 혈청을 통상의 방법을 사용하여 준비하였다. 말단 출혈을 수행하고, 동물을 심장 천자 및 실혈로 희생시켰다. 부검을 실혈 후 수행하였다. 간을 수거하고 칭량하였다. 간을 저장을 위해 파라핀 포매, 및 급속 냉동 전에 포르말린 중 RNAlater 용액 (Ambion)에 분할하였다.
모든 동물은 연구 기간 동안 초기 수준의 80% 초과의 체중을 유지하였다. 추가로, 화합물-처리된 그룹에서 체중의 최저 산술 평균 값은 대조군 PBS-처리된 그룹보다 높았다.
혈액에서 사람 혈청 알부민 수준을 연구 과정 동안 모니터링하였다. 모든 살아남은 동물은 연구의 생전 상(in-life phase) 동안 7.0 mg/ml 초과의 혈액 h-Alb 농도를 유지하였다.
간 효소를 연구 과정 동안 모니터링하였다. 특이적으로 ALT, AST, ALP, GGT, TBIL, 및 TG를 연구 동안 모니터링하였다. AD-66810, AD-81890, 또는 PBS를 투약받는 마우스의 경우 49일째에 측정된 효소 수준을 하기 표 10에 나타낸다. 도 5a 및 5b는, PBS의 투여에 비해, AD-66810 (도 5a) 또는 AD-81890 (도 5b)의 투여 후 경시적으로 ALT 수준을 나타낸다.
표 10. 간 효소 수준.
둘 다의 시험 화합물-처리된 그룹의 경우, ALT, AST, ALP, 및 GGT는 대조군 그룹과 비교하는 경우 증가를 나타내었다. 추가로, 용량-의존성 변화는 AD-66810-처리된 그룹에서 ALT, AST, 및 GGT에서 입증되었다.
부검에서, 그룹 중 어느 하나에서도 시험 화합물-특이적 결과가 없다. 대조군 그룹과 비교하는 경우 화합물-처리된 그룹에서 동물의 상대 (간/체중) 간 중량의 변화가 명백하지 않다.
등가물
당해 기술분야의 숙련가는 단지 통상의 실험, 본원에 기재된 특정 실시형태 및 방법의 다중 등가물을 사용하여 인식하거나 알아낼 수 있다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함됨을 의도한다.
특정 실시형태를 예시하고 기술하면서 상기한 다양한 실시형태를 조합하여 추가 실시형태를 제공할 수 있고, 다양한 변화가 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 본원에서 수행될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
2018년 8월 13일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/718,314를 포함하는 본 명세서에 언급되거나 출원 데이터 시트에 기재된 모든 도면, 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원, 및 비-특허 공보는 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 실시형태의 양상을 변형하여 필요한 경우 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 이용하여 여전히 추가 실시형태를 제공할 수 있다.
상기 상세한 설명의 측면에서 실시형태에 이들 및 다른 변화를 수행할 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용되는 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 실시형태로 한정하는 것으로 해석하는 것이 아니라, 이러한 청구범위가 표제된 등가의 전체 범위와 함께 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석하여야 한다. 따라서 청구항은 개시내용에 의해 한정되지 않는다.
SEQUENCE LISTING
<110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC.
<120> HEPATITIS B VIRUS (HBV) dsRNA AGENT COMPOSITIONS AND
METHODS OF USE THEREOF
<130> 930385.410WO
<140> PCT/US2019/046142
<141> 2019-08-12
<150> US 62/718,314
<151> 2018-08-13
<160> 49
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 3215
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> NC_003977.1, Hepatitis B virus, complete genome
<400> 1
ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggcctat attttcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctcac ccatatcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag agcacaacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaacttg 360
tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
acttccagga acatcaacta ccagcacggg accatgcaga acctgcacga ttcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600
tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt ttacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840
aataaaacca aacgttgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900
ggtactttac cgcaggaaca tattgtacaa aaactcaagc aatgttttcg aaaattgcct 960
gtaaatagac ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg ctatcctgcc ttgatgcctt tatatgcatg tatacaatct 1080
aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtaaaca atatctaaac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acggtcaggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
acgggttggg gcttggccat aggccatcgg cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320
cttatcggaa ccgacaactc agttgtcctc tctcggaaat acacctcctt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggc cgtttgggcc tctaccgtcc ccttcttcat 1500
ctgccgttcc ggccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtagcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccaggtcttg cccaaggtct tacacaagag gactcttgga ctctcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgttt gtttaaagac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcccct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat tagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
ccttactttt ggaagagaaa ctgtccttga gtatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520
ctgattggaa aactccctcc tttcctcaca ttcatttaca ggaggacatt attaatagat 2580
gtcaacaata tgtgggccct ctgacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ctatcctaac cttaccaaat atttgccctt ggacaaaggc attaaaccgt 2700
attatcctga atatgcagtt aatcattact tcaaaactag gcattattta catactctgt 2760
ggaaggctgg cattctatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgacaaggc 2880
atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940
cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac 3000
tggccagagg caaatcaggt aggagcggga gcatttggtc cagggttcac cccaccacac 3060
ggaggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacact gccagcagca 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 3180
ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 2
<211> 3215
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Complement of SEQ ID NO:1
<400> 2
ttccactgca tggcctgagg atgactgtct cttagaggtg gagagatggg agtaggctgt 60
cttcctgact gccgattggt ggaggcagga ggaggtgctg ctggcagtgt tgtcaatatg 120
ccctgagcct gagggctcca ccccaaaagg cctccgtgtg gtggggtgaa ccctggacca 180
aatgctcccg ctcctacctg atttgcctct ggccagtgat ccttgttggg gttgaagtcc 240
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cccagaggat tgggaacaga aagattcgtc cccatgcctt gtcgaggttt ggaagaccaa 360
cctcccatgc tgtagctctt gttcccaaga atatggtgac ccacaaaatg aggcgctgcg 420
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caaatatttg gtaaggttag gatagaacct agcaggcata attaatttta atctcctttt 600
ttcattaact gtcagagggc ccacatattg ttgacatcta ttaataatgt cctcctgtaa 660
atgaatgtga ggaaaggagg gagttttcca atcaggatta aagacaggta cagtagaaga 720
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ttcttctagg ggacctgcct cgtcgtctaa caacagtagt ttccggaagt gttgataaga 900
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aaagccaccc aaggcacagc ttggaggctt gaacagtagg acatgaacat gagatgatta 1380
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<210> 3
<211> 3215
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> AB014381.1, Hepatitis B virus genomic DNA,
complete sequence, isolate 22Y04HCC
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(3215)
<223> n = A,T,C or G
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<223> Reverse Complement of SEQ ID NO:3
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gatacagagc agaggcggtg tcgaggagat ctcgaataga aggaaaaaag tcagaaggca 1260
aaaaagagag taactccaca gaagctccaa attctttata tgggtcaatg tccatgtcct 1320
aaagccaccc aaggcacagc ttggaggctt gaacagtagg acatgaacat gagatgatta 1380
ggcagaggtg aaaaagttgc atggtgctgg tgaacagacc aatttatgcc tacagcctcc 1440
tagtacaaag atcattaacc taatctcctc ccccaactcc tcccagtcct taaacaaaca 1500
gtctttgaag tatgcctcaa ggtcggtcgt tgacattgct gagagtccaa gagtcctctt 1560
atataagacc ttgggcaaga cctggtgggc gttcacggtg gtctccatgc gacgtgcaga 1620
ggtgaagcga agtgcacacg gtccggcaga tgagaaggca cagacgggga gaccgcgtaa 1680
agagaggtgc gccccgtggt cggccggaac ggcagatgaa gaaggggacg gtagagaccc 1740
aaacggcccc gagatgggtc gtccgcggga ttcagcgccg acgggacgta aacaaaggac 1800
gtcccgcgca ggatccagtt ggcagcacac cctagcagcc atggaaagga ggtgtatttc 1860
cgagagagaa caacagagtt gtccgttccg atcagtttcg ctccagaccg gctgcgagca 1920
aaacaagctg ctaggagttc cgcagtatgg atcggcagag gagccacaaa ggttccacgc 1980
atgcggcgat ggccaatagc caagccccat ccagtggggg ttgcgtcagc aaacacttgg 2040
cagagacctg accgttgccg ggcaacgggg taaaggttca gatattgttt acacagaaag 2100
gccttgtaag ttggcgagaa agtgaaagcc tgcttagatt gtatacatgc atataaaggc 2160
attaaggcag gatagccaca ttgtgtaaaa ggggcagcaa agcccaaaag acccacaatt 2220
ctctgacata ctttccaatc aataggtcta tttacaggca gttttcgaaa acattgcttg 2280
atttttagta caatatggtc ttgcggtaaa gtaccccaac ttccaattac atatcccatg 2340
aagttaaggg agtaacccca acgtttggtt ttattagggt tcaaatgtat acccaaagac 2400
aaaagaaaat tggtaacagc ggtaaaaagg gactcaagat gttgtacaga cttggccccc 2460
aataccacat catccatata actgaaagcc aaacagtggg ggaaagccct acgaaccact 2520
gaacaaatgg cactagtaaa ctgagccagg agaaacggac tgaggcccac tcccatagga 2580
atcttgcgaa agcccaggat gatgggatgg gaatacaagt gcagtttccg tccgaaggtt 2640
ttgtacagca acaagaggga aacatagagg tgccttgagc aggaatcgtg caggtcttgc 2700
atggtcccgt gctggtagtt gatgttcctg gaagtagagg acaaacgggc aacatacctt 2760
ggtagtccag aagaaccaac aagaagatga ggcatagcag caggatgaag aggaatatga 2820
taaaacgccg cagacacatc cagcgatagc caggacaaat tggaggacaa gaggttggtg 2880
agtgattgga ggttggggac tgcgaatttt ggccaggaca cgtgggtgct ccccctagaa 2940
aattgagaga agtccaccac gagtctagac tctgtggtat tgtgaggatt cttgtcaaca 3000
agaaaaaccc cgcctgtaac acgagcaggg gtcctaggaa tcctgatgtt gtgttctcca 3060
tgttcggtgc agggtcccca gtcctcgaga agattgacga tatgggagag gcagtagtcg 3120
gaacagggtt tactgttccg gaactggagc caccagcagg aaagtatagg ccccttactc 3180
tggggtgtag cagagcttgg tggaatgtgg tggag 3215
<210> 5
<211> 1200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> psiCHECK2-HBV plasmid
<400> 5
ctccacaaca ttccaccaag ctctgcaaga tcccagagtc aggggcctgt attttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtgaaccc tgttccgact attgcctctc ccatatcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag aacatcacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccgtgtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcctgtc ctccaacttg 360
tcctggctat cgttggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcatcaacca ccagcacggg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct tcggacggaa attgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acagcatctt 780
gagtcccttt ataccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
aacaaaacaa aaagatgggg ttattcccta aacttcatgg gttatgtaat tggaagttgg 900
gggacattgc cacaggaaca tattgtacaa aaaatcaaac aatgttttag aaaacttcct 960
gttaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caacgaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg ttatcctgct ttaatgcctt tgtatgcatg tatacaagct 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc tctgtaaaca atacatgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggccaggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
<210> 6
<211> 681
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV, genotype A
<400> 6
atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60
ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120
tttctagggg gatcacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180
tcaccaacct cctgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240
atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tattggttct tctggattat 300
caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcaa caacaaccag tacgggacca 360
tgcaaaacct gcacgactcc tgctcaaggc aactctatgt ttccctcatg ttgctgtaca 420
aaacctacgg atggaaattg cacctgtatt cccatcccat cgtcctgggc tttcgcaaaa 480
tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 540
cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ctatatggat gatgtggtat 600
tgggggccaa gtctgtacag catcgtgagt ccctttatac cgctgttacc aattttcttt 660
tgtctctggg tatacattta a 681
<210> 7
<211> 681
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV, genotype C
<400> 7
atggagaaca caacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60
ttgttgacaa gaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120
tttctagggg gagcacccac gtgtcctggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180
tcaccaacct cttgtcctcc aatttgtcct ggctatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240
atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactac 300
caaggtatgt tgcccgtttg tcctctactt ccaggaacat caactaccag cacgggacca 360
tgcaagacct gcacgattcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcttg ttgctgtaca 420
aaaccttcgg acggaaactg cacttgtatt cccatcccat catcctgggc tttcgcaaga 480
ttcctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt 540
cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600
tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttttac ctctattacc aattttcttt 660
tgtctttggg tatacatttg a 681
<210> 8
<211> 681
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV, genotype E
<400> 8
atggaaagca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60
ttgttgacaa aaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120
tttctagggg gagctcccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180
tcaccaacct cttgtcctcc aatttgtcct ggctatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240
atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 300
caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcat caaccaccag tacgggaccc 360
tgccgaacct gcacgactct tgctcaagga acctctatgt ttccctcatg ttgctgttca 420
aaaccttcgg acggaaattg cacttgtatt cccatcccat catcatgggc tttcggaaaa 480
ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt 540
cagtggttcg ccgggctttc ccccactgtc tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600
tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttatac ctctgttacc aattttcttt 660
tgtctttggg tatacattta a 681
<210> 9
<211> 681
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV, genotype F
<400> 9
atggacaaca tcacatcagg actcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggtgtgtttc 60
ttgttgacaa aaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120
tttctagggg gactacccgg gtgtcctggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180
ttaccaacct cctgtcctcc aacttgtcct ggctatcgtt ggatgtgtct gcggcgtttt 240
atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 300
caaggtatgt tgcccgtttg tcctctactt ccaggatcca cgaccaccag cacgggacca 360
tgcaaaacct gcacaactct tgctcaagga acctctatgt ttccctcctg ttgctgttcc 420
aaaccctcgg acggaaactg cacctgtatt cccatcccat catcttgggc tttaggaaaa 480
tacctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcctggctca gtttactagt gcaatttgtt 540
cagtggtgcg tagggctttc ccccactgtc tggcttttag ttatatggat gatctggtat 600
tgggggccaa atctgtgcag catcttgagt ccctttatac cgctgttacc aattttctgt 660
tatctgtggg tatccattta a 681
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide (sense)
<400> 10
gugugcacuu cgcuucaca 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide (sense)
<400> 11
gugugcactu cgcuucaca 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide (sense)
<400> 12
gugugcactu cgcuucaca 19
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-66810 Antisense
<400> 13
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192282 Antisense
<400> 14
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192289 Antisense
<400> 15
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-81890 Antisense
<400> 16
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-81892 Antisense
<400> 17
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192283 Antisense
<400> 18
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192291 Antisense
<400> 19
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192277 Antisense
<400> 20
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192284 Antisense
<400> 21
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192285 Antisense
<400> 22
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192293 Antisense
<400> 23
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192279 Antisense
<400> 24
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192294 Antisense
<400> 25
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192280 Antisense
<400> 26
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192287 Antisense
<400> 27
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AD-192281 Antisense
<400> 28
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide (sense)
<400> 29
gugugcacuu cgcuucaca 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide (sense)
<400> 30
gugugcactu cgcuucaca 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide (sense)
<400> 31
gugugcactu cgcuucaca 19
<210> 32
<211> 832
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV P protein (YP_009173866)
<400> 32
Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Arg Leu Leu Leu Leu Asp Asp
1 5 10 15
Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly
20 25 30
Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val
35 40 45
Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro His Trp Lys Thr Pro Ser Phe Pro
65 70 75 80
Asn Ile His Leu His Gln Asp Ile Ile Lys Lys Cys Glu Gln Phe Val
85 90 95
Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Gln Leu Ile Met Pro
100 105 110
Ala Arg Phe Tyr Pro Lys Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly
115 120 125
Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His Tyr Phe Gln Thr
130 135 140
Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg
145 150 155 160
Glu Thr Thr His Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu
165 170 175
Gln Asp Leu Gln His Gly Ala Glu Ser Phe His Gln Gln Ser Ser Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Arg Pro Pro Val Gly Ser Ser Leu Gln Ser Lys His Arg
195 200 205
Lys Ser Arg Leu Gly Leu Gln Ser Gln Gln Gly His Leu Ala Arg Arg
210 215 220
Gln Gln Gly Arg Ser Trp Ser Ile Arg Ala Gly Phe His Pro Thr Ala
225 230 235 240
Arg Arg Pro Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Thr Thr Asn
245 250 255
Phe Ala Ser Lys Ser Ala Ser Cys Leu His Gln Ser Pro Val Arg Lys
260 265 270
Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe Glu Lys His Ser Ser Ser Gly
275 280 285
His Ala Val Glu Phe His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln
290 295 300
Ser Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser
305 310 315 320
Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser Leu Ile Val Asn Leu Leu Glu
325 330 335
Asp Trp Gly Pro Cys Ala Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro
340 345 350
Arg Thr Pro Ser Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn
355 360 365
Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe
370 375 380
Ser Arg Gly Asn Tyr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn
385 390 395 400
Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser
405 410 415
Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala
420 425 430
Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala
435 440 445
Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Leu Asn Asn Gln His Gly Thr Met
450 455 460
Pro Asp Leu His Asp Tyr Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu
465 470 475 480
Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro
485 490 495
Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro
500 505 510
Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg
515 520 525
Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu
530 535 540
Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr
545 550 555 560
Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys
565 570 575
Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr
580 585 590
Gly Ser Leu Pro Gln Glu His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe
595 600 605
Arg Lys Leu Pro Ile Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg
610 615 620
Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr
625 630 635 640
Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe
645 650 655
Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn
660 665 670
Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala
675 680 685
Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Val Met Gly His Gln Arg Met
690 695 700
Arg Gly Thr Phe Ser Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu
705 710 715 720
Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn Ile Ile Gly Thr
725 730 735
Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu
740 745 750
Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr
755 760 765
Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu
770 775 780
Gly Leu Ser Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly
785 790 795 800
Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro
805 810 815
Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
820 825 830
<210> 33
<211> 389
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV S protein (YP_009173869)
<400> 33
Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro
85 90 95
Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn
100 105 110
Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu
115 120 125
Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Leu
130 135 140
Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro
145 150 155 160
Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu
165 170 175
Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro
180 185 190
Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr
195 200 205
Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser
210 215 220
Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu
225 230 235 240
Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe
245 250 255
Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu
260 265 270
Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met
275 280 285
Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys
290 295 300
Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala
305 310 315 320
Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu
325 330 335
Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr
340 345 350
Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu
355 360 365
Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys
370 375 380
Leu Trp Val Tyr Ile
385
<210> 34
<211> 281
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV PreS2 protein (YP_009173870.1)
<400> 34
Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg
1 5 10 15
Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val
20 25 30
Asn Pro Val Leu Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg
35 40 45
Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu
50 55 60
Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile
65 70 75 80
Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe
85 90 95
Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr
100 105 110
Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg
115 120 125
Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu
130 135 140
Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro
145 150 155 160
Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys
165 170 175
Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys
180 185 190
Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro
195 200 205
Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg
210 215 220
Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly
225 230 235 240
Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp
245 250 255
Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro
260 265 270
Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
275 280
<210> 35
<211> 226
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV S protein (YP_009173871.1)
<400> 35
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys
35 40 45
Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60
Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
100 105 110
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp
130 135 140
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys
145 150 155 160
Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190
Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile
195 200 205
Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220
Tyr Ile
225
<210> 36
<211> 154
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV X protein (YP_009173867.1)
<400> 36
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Thr Leu Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Val Pro Thr Asp
35 40 45
His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met Glu
65 70 75 80
Thr Thr Val Asn Ala His Gln Ile Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg
85 90 95
Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe
100 105 110
Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg
115 120 125
Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ala
130 135 140
Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala
145 150
<210> 37
<211> 212
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV PreC protein (YP_009173857.1)
<400> 37
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1 5 10 15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
20 25 30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
35 40 45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
50 55 60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65 70 75 80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
85 90 95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
100 105 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
115 120 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130 135 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145 150 155 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
165 170 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
180 185 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
195 200 205
Glu Ser Gln Cys
210
<210> 38
<211> 843
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV pol protein (BAA32913.1)
<400> 38
Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp
1 5 10 15
Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly
20 25 30
Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val
35 40 45
Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro
65 70 75 80
His Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys Gln Gln Tyr Val
85 90 95
Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro
100 105 110
Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Leu Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly
115 120 125
Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Ala Val Asn His Tyr Phe Lys Thr
130 135 140
Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg
145 150 155 160
Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu
165 170 175
Gln Glu Leu Gln His Gly Arg Leu Val Phe Gln Thr Ser Thr Arg His
180 185 190
Gly Asp Lys Ser Phe Cys Ser Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Ser
195 200 205
Pro Val Gly Pro Cys Val Arg Ser Gln Leu Lys Gln Ser Arg Leu Gly
210 215 220
Leu Gln Pro Gln Gln Gly Ser Leu Ala Arg Gly Lys Ser Gly Arg Ser
225 230 235 240
Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val His Pro Thr Thr Arg Arg Ser Phe Gly
245 250 255
Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Ile Asp Asn Ser Ala Ser Ser Thr
260 265 270
Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Thr Ala Tyr Ser His
275 280 285
Leu Ser Thr Ser Lys Arg Gln Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu
290 295 300
His His Ile Pro Pro Ser Ser Ala Thr Pro Gln Ser Lys Gly Pro Ile
305 310 315 320
Leu Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp
325 330 335
Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys
340 345 350
Thr Glu His Gly Glu His Asn Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg
355 360 365
Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Thr
370 375 380
Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Ser Thr
385 390 395 400
His Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr
405 410 415
Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala
420 425 430
Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu
435 440 445
Val Gly Ser Ser Gly Leu Pro Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Thr
450 455 460
Ser Arg Asn Ile Asn Tyr Gln His Gly Thr Met Gln Asp Leu His Asp
465 470 475 480
Ser Cys Ser Arg His Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr
485 490 495
Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe
500 505 510
Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln
515 520 525
Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys
530 535 540
Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val
545 550 555 560
Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser
565 570 575
Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser
580 585 590
Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln
595 600 605
Asp His Ile Val Leu Lys Ile Lys Gln Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val
610 615 620
Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu
625 630 635 640
Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro
645 650 655
Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr
660 665 670
Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala
675 680 685
Arg Gln Arg Ser Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr
690 695 700
Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Arg Arg Met Arg Gly Thr Phe Val
705 710 715 720
Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala
725 730 735
Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser Val Val
740 745 750
Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala
755 760 765
Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu
770 775 780
Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Tyr Arg Pro
785 790 795 800
Leu Leu His Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr
805 810 815
Ala Val Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe
820 825 830
Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
835 840
<210> 39
<211> 400
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV envelope protein (BAA32914.1)
<400> 39
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Thr Leu Thr Thr Val Pro Val Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His
115 120 125
Gln Ala Leu Leu His Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly
130 135 140
Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro
145 150 155 160
Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu
165 170 175
Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly
180 185 190
Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser
195 200 205
Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly
210 215 220
Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro
225 230 235 240
Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile
245 250 255
Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu
260 265 270
Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser
275 280 285
Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly
290 295 300
Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn
305 310 315 320
Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu
325 330 335
Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro
340 345 350
Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val
355 360 365
Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser
370 375 380
Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
385 390 395 400
<210> 40
<211> 210
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV X protein (BAA32912.1)
<400> 40
Met Gly Leu Gly Tyr Trp Pro Ser Pro His Ala Trp Asn Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ser Ala Asp Pro Tyr Cys Gly Thr Pro Ser Ser Leu Phe Cys Ser
20 25 30
Gln Pro Val Trp Ser Glu Thr Asp Arg Asn Gly Gln Leu Cys Cys Ser
35 40 45
Leu Ser Glu Ile His Leu Leu Ser Met Ala Ala Arg Val Cys Cys Gln
50 55 60
Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu
65 70 75 80
Ser Arg Gly Arg Pro Ile Ser Gly Pro Phe Gly Ser Leu Pro Ser Pro
85 90 95
Ser Ser Ser Ala Val Pro Ala Asp His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg
100 105 110
Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg
115 120 125
Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met Glu Thr Thr Val Asn Ala His Gln Val
130 135 140
Leu Pro Lys Val Leu Tyr Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser
145 150 155 160
Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp
165 170 175
Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg Leu Met Ile Phe Val Leu Gly Gly
180 185 190
Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ser Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr
195 200 205
Ser Ala
210
<210> 41
<211> 389
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV Large S protein (P03138.3)
<400> 41
Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro
85 90 95
Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn
100 105 110
Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu
115 120 125
Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Leu
130 135 140
Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro
145 150 155 160
Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu
165 170 175
Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro
180 185 190
Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr
195 200 205
Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser
210 215 220
Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu
225 230 235 240
Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe
245 250 255
Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu
260 265 270
Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met
275 280 285
Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys
290 295 300
Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala
305 310 315 320
Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu
325 330 335
Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr
340 345 350
Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu
355 360 365
Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys
370 375 380
Leu Trp Val Tyr Ile
385
<210> 42
<211> 183
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV Core protein (P03146.1)
<400> 42
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145 150 155 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
165 170 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180
<210> 43
<211> 3182
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> Hepatitis B virus (strain ayw) genome
<400> 43
aattccactg catggcctga ggatgagtgt ttctcaaagg tggagacagc ggggtaggct 60
gccttcctga ctggcgattg gtggaggcag gaggcggatt tgctggcaaa gtttgtagta 120
tgccctgagc ctgagggctc caccccaaaa ggcctccgtg cggtggggtg aaacccagcc 180
cgaatgctcc agctcctacc ttgttggcgt ctggccaggt gtccttgttg ggattgaagt 240
cccaatctgg atttgcggtg tttgctctga aggctggatc caactggtgg tcgggaaaga 300
atcccagagg attgctggtg gaaagattct gccccatgct gtagatcttg ttcccaagaa 360
tatggtgacc cacaaaatga ggcgctatgt gttgtttctc tcttatataa tatacccgcc 420
ttccatagag tgtgtaaata gtgtctagtt tggaagtaat gattaactag atgttctgga 480
taataaggtt taataccctt atccaatggt aaatatttgg taacctttgg ataaaacctg 540
gcaggcataa tcaattgcaa tcttcttttc tcattaactg tgagtgggcc tacaaactgt 600
tcacattttt tgataatgtc ttggtgtaaa tgtatattag gaaaagatgg tgttttccaa 660
tgaggattaa agacaggtac agtagaagaa taaagcccag taaagttccc caccttatga 720
gtccaaggaa tactaacatt gagattcccg agattgagat cttctgcgac gcggcgattg 780
agaccttcgt ctgcgaggcg agggagttct tcttctaggg gacctgcctc gtcgtctaac 840
aacagtagtc tccggaagtg ttgataggat aggggcattt ggtggtctat aagctggagg 900
agtgcgaatc cacactccga aagacaccaa atactctata actgtttctc ttccaaaagt 960
gagacaagaa atgtgaaacc acaagagttg cctgaacttt aggcccatat tagtgttgac 1020
ataactgact actaggtctc tagacgctgg atcttccaaa ttaacaccca cccaggtagc 1080
tagagtcatt agttcccccc agcaaagaat tgcttgcctg agtgcagtat ggtgaggtga 1140
acaatgctca ggagactcta aggcttcccg atacagagct gaggcggtat ctagaagatc 1200
tcgtactgaa ggaaagaagt cagaaggcaa aaacgagagt aactccacag tagctccaaa 1260
ttctttataa gggtcgatgt ccatgcccca aagccaccca aggcacagct tggaggcttg 1320
aacagtagga catgaacaag agatgattag gcagaggtga aaaagttgca tggtgctggt 1380
gcgcagacca atttatgcct acagcctcct agtacaaaga cctttaacct aatctcctcc 1440
cccaactcct cccagtcttt aaacaaacag tctttgaagt atgcctcaag gtcggtcgtt 1500
gacattgctg agagtccaag agtcctctta tgtaagacct tgggcaatat ttggtgggcg 1560
ttcacggtgg tctccatgcg acgtgcagag gtgaagcgaa gtgcacacgg tccggcagat 1620
gagaaggcac agacggggag tccgcgtaaa gagaggtgcg ccccgtggtc ggtcggaacg 1680
gcagacggag aaggggacga gagagtccca agcgaccccg agaagggtcg tccgcaggat 1740
tcagcgccga cgggacgtaa acaaaggacg tcccgcgcag gatccagttg gcagcacagc 1800
ctagcagcca tggaaacgat gtatatttgc gggataggac aacagagtta tcagtcccga 1860
taatgtttgc tccagacctg ctgcgagcaa aacaagcggc taggagttcc gcagtatgga 1920
tcggcagagg agccgaaaag gttccacgca tgcgctgatg gcccatgacc aagccccagc 1980
cagtgggggt tgcgtcagca aacacttggc acagacctgg ccgttgccgg gcaacggggt 2040
aaaggttcag gtattgttta cacagaaagg ccttgtaagt tggcgagaaa gtgaaagcct 2100
gcttagattg aatacatgca tacaaaggca tcaacgcagg ataaccacat tgtgtaaaag 2160
gggcagcaaa acccaaaaga cccacaattc gttgacatac tttccaatca ataggcctgt 2220
taataggaag ttttctaaaa cattctttga ttttttgtat gatgtgttct tgtggcaagg 2280
acccataaca tccaatgaca taacccataa aatttagaga gtaaccccat ctctttgttt 2340
tgttagggtt taaatgtata cccaaagaca aaagaaaatt ggtaacagcg gtaaaaaggg 2400
actcaagatg ctgtacagac ttggccccca ataccacatc atccatataa ctgaaagcca 2460
aacagtgggg gaaagcccta cgaaccactg aacaaatggc actagtaaac tgagccagga 2520
gaaacgggct gaggcccact cccataggaa ttttccgaaa gcccaggatg atgggatggg 2580
aatacaggtg caatttccgt ccgaaggttt ggtacagcaa caggagggat acatagaggt 2640
tccttgagca gtagtcatgc aggtccggca tggtcccgtg ctggttgttg aggatcctgg 2700
aattagagga caaacgggca acataccttg atagtccaga agaaccaaca agaagatgag 2760
gcatagcagc aggatgaaga ggaagatgat aaaacgccgc agacacatcc agcgataacc 2820
aggacaagtt ggaggacaag aggttggtga gtgattggag gttggggact gcgaattttg 2880
gccaagacac acggtagttc cccctagaaa attgagagaa gtccaccacg agtctagact 2940
ctgcggtatt gtgaggattc ttgtcaacaa gaaaaacccc gcctgtaaca cgagaagggg 3000
tcctaggaat cctgatgtga tgttctccat gttcagcgca gggtccccaa tcctcgagaa 3060
gattgacgat aagggagagg cagtagtcag aacagggttt actgttcctg aactggagcc 3120
accagcaggg aaatacaggc ctctcactct gggatcttgc agagtttggt ggaaggttgt 3180
gg 3182
<210> 44
<211> 3182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of SEQ ID NO: 16
<400> 44
ccacaacctt ccaccaaact ctgcaagatc ccagagtgag aggcctgtat ttccctgctg 60
gtggctccag ttcaggaaca gtaaaccctg ttctgactac tgcctctccc ttatcgtcaa 120
tcttctcgag gattggggac cctgcgctga acatggagaa catcacatca ggattcctag 180
gaccccttct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc acaataccgc 240
agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggaactacc gtgtgtcttg 300
gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct ccaacttgtc 360
ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc ctgctgctat 420
gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt tgtcctctaa 480
ttccaggatc ctcaacaacc agcacgggac catgccggac ctgcatgact actgctcaag 540
gaacctctat gtatccctcc tgttgctgta ccaaaccttc ggacggaaat tgcacctgta 600
ttcccatccc atcatcctgg gctttcggaa aattcctatg ggagtgggcc tcagcccgtt 660
tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt tcccccactg 720
tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac agcatcttga 780
gtcccttttt accgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt taaaccctaa 840
caaaacaaag agatggggtt actctctaaa ttttatgggt tatgtcattg gatgttatgg 900
gtccttgcca caagaacaca tcatacaaaa aatcaaagaa tgttttagaa aacttcctat 960
taacaggcct attgattgga aagtatgtca acgaattgtg ggtcttttgg gttttgctgc 1020
cccttttaca caatgtggtt atcctgcgtt gatgcctttg tatgcatgta ttcaatctaa 1080
gcaggctttc actttctcgc caacttacaa ggcctttctg tgtaaacaat acctgaacct 1140
ttaccccgtt gcccggcaac ggccaggtct gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac 1200
tggctggggc ttggtcatgg gccatcagcg catgcgtgga accttttcgg ctcctctgcc 1260
gatccatact gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc agcaggtctg gagcaaacat 1320
tatcgggact gataactctg ttgtcctatc ccgcaaatat acatcgtttc catggctgct 1380
aggctgtgct gccaactgga tcctgcgcgg gacgtccttt gtttacgtcc cgtcggcgct 1440
gaatcctgcg gacgaccctt ctcggggtcg cttgggactc tctcgtcccc ttctccgtct 1500
gccgttccga ccgaccacgg ggcgcacctc tctttacgcg gactccccgt ctgtgccttc 1560
tcatctgccg gaccgtgtgc acttcgcttc acctctgcac gtcgcatgga gaccaccgtg 1620
aacgcccacc aaatattgcc caaggtctta cataagagga ctcttggact ctcagcaatg 1680
tcaacgaccg accttgaggc atacttcaaa gactgtttgt ttaaagactg ggaggagttg 1740
ggggaggaga ttaggttaaa ggtctttgta ctaggaggct gtaggcataa attggtctgc 1800
gcaccagcac catgcaactt tttcacctct gcctaatcat ctcttgttca tgtcctactg 1860
ttcaagcctc caagctgtgc cttgggtggc tttggggcat ggacatcgac ccttataaag 1920
aatttggagc tactgtggag ttactctcgt ttttgccttc tgacttcttt ccttcagtac 1980
gagatcttct agataccgcc tcagctctgt atcgggaagc cttagagtct cctgagcatt 2040
gttcacctca ccatactgca ctcaggcaag caattctttg ctggggggaa ctaatgactc 2100
tagctacctg ggtgggtgtt aatttggaag atccagcgtc tagagaccta gtagtcagtt 2160
atgtcaacac taatatgggc ctaaagttca ggcaactctt gtggtttcac atttcttgtc 2220
tcacttttgg aagagaaaca gttatagagt atttggtgtc tttcggagtg tggattcgca 2280
ctcctccagc ttatagacca ccaaatgccc ctatcctatc aacacttccg gagactactg 2340
ttgttagacg acgaggcagg tcccctagaa gaagaactcc ctcgcctcgc agacgaaggt 2400
ctcaatcgcc gcgtcgcaga agatctcaat ctcgggaatc tcaatgttag tattccttgg 2460
actcataagg tggggaactt tactgggctt tattcttcta ctgtacctgt ctttaatcct 2520
cattggaaaa caccatcttt tcctaatata catttacacc aagacattat caaaaaatgt 2580
gaacagtttg taggcccact cacagttaat gagaaaagaa gattgcaatt gattatgcct 2640
gccaggtttt atccaaaggt taccaaatat ttaccattgg ataagggtat taaaccttat 2700
tatccagaac atctagttaa tcattacttc caaactagac actatttaca cactctatgg 2760
aaggcgggta tattatataa gagagaaaca acacatagcg cctcattttg tgggtcacca 2820
tattcttggg aacaagatct acagcatggg gcagaatctt tccaccagca atcctctggg 2880
attctttccc gaccaccagt tggatccagc cttcagagca aacaccgcaa atccagattg 2940
ggacttcaat cccaacaagg acacctggcc agacgccaac aaggtaggag ctggagcatt 3000
cgggctgggt ttcaccccac cgcacggagg ccttttgggg tggagccctc aggctcaggg 3060
catactacaa actttgccag caaatccgcc tcctgcctcc accaatcgcc agtcaggaag 3120
gcagcctacc ccgctgtctc cacctttgag aaacactcat cctcaggcca tgcagtggaa 3180
tt 3182
<210> 45
<211> 389
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV S protein (P03142.4)
<400> 45
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Thr Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly
35 40 45
Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu
50 55 60
Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro
85 90 95
Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn
100 105 110
Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu
115 120 125
Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro
130 135 140
Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro
145 150 155 160
Val Thr Ile Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu
165 170 175
Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro
180 185 190
Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser
195 200 205
Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser
210 215 220
Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu
225 230 235 240
Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe
245 250 255
Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu
260 265 270
Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr
275 280 285
Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Lys Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys
290 295 300
Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala
305 310 315 320
Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu
325 330 335
Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr
340 345 350
Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu
355 360 365
Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys
370 375 380
Leu Trp Val Tyr Ile
385
<210> 46
<211> 185
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> HBV Core protein (P03149.1)
<400> 46
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145 150 155 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
165 170 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180 185
<210> 47
<211> 3200
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> Hepatitis B virus complete DNA sequence (subtype
adw)
<400> 47
ttccactgcc ttgcaccaag ctctgcagga tcccagagtc aggggtctgt atcttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc 120
aatctccgcg aggactgggg accctgtgac gatcatggag aacatcacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggatcac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcctgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttattgg ttcttctgga ttatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcaacaacaa ccagtacggg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca 540
aggcaactct aagtttccct catgttgctg tacaaaacct acggatggaa attgcacctg 600
tattcccatc ccatcgtcct gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acagcatcgt 780
gagtcccttt ataccgctgt taccaatttt cttttgtctc tgggtataca tttaaaccct 840
aacaaaacaa aaagatgggg ttattcccta aacttcatgg gctacataat tggaagttgg 900
ggaactttgc cacaggatca tattgtacaa aagatcaaac actgttttag aaaacttcct 960
gttaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gctccattta cacaatgtgg atatcctgcc ttaatgcctt tgtatgcatg tatacaagct 1080
aaacaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtacatgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttagccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagccggtc tggagcaaag 1320
ctcatcggaa ctgacaattc tgtcgtcctc tcgcggaaat atacatcatt tccatggctg 1380
ctaggctgta ctgccaactg gatccttcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctctcggggc cgcttgggac tctctcgtcc ccttctccgt 1500
ctgccgttcc agccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggtccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgttgcatg gcgaccaccg 1620
tgaacgccca tcagatcctg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctcccagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcctacttca aagactgtgt gtttaaggac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta atgatctttg tattaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gcgcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgta catgtcccac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct tctgacttct ttccttccgt 1980
acgagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa gccttagagt ctcctgagca 2040
ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc tgctgggggg aattgatgac 2100
tctagctacc tgggtgggta ataatttgca agatccagca tccagagatc tagtagtcaa 2160
ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta ttgtggtttc atatatcttg 2220
ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc tctttcggag tgtggattcg 2280
cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag 2400
acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct cgggaatctc aatgttagta 2460
ttccttggac tcataaggtc ggaaacttta cggggcttta ttcctctaca gtacctatct 2520
ttaatcctga atggcaaact ccttcctttc ctaagattca tttacaagag gacattatta 2580
ataggtgtca acaatttgtg ggccctctca ctgtaaatga aaagagaaga ttgaaattaa 2640
ttatgcctgc tagattctat cctacccaca ctaaatattt gcccttagac aaaggaatta 2700
aaccttatta tccagatcag gtagttaatc attacttcca aaccagacat tatttacata 2760
ctctttggaa ggctggtatt ctatataaga gggaaaccac acgtagcgca tcattttgcg 2820
ggtcaccata ttcttgggaa caagagctac agcattcgca aaggcatggg gacgaatctt 2880
tctgttccca accctctggg attccttccc gatcatcagt tggaccctgc attcggagcc 2940
aactcaacaa atccagattg ggacttcaac cccatcaagg accactggcc agcagccaac 3000
caggtaggag tgggagcatt cgggccaggg ctcacccctc cacacggcgg tattttgggg 3060
tggagccctc aggctcaggg catattgacc acagtgtcaa caattcctcc tcctgcctcc 3120
accaatcggc agtcaggaag gcagcctact cccatctctc cacctctaag agacagtcat 3180
cctcaggcca tgcagtggaa 3200
<210> 48
<211> 3200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of SEQ ID NO: 47
<400> 48
ttccactgca tggcctgagg atgactgtct cttagaggtg gagagatggg agtaggctgc 60
cttcctgact gccgattggt ggaggcagga ggaggaattg ttgacactgt ggtcaatatg 120
ccctgagcct gagggctcca ccccaaaata ccgccgtgtg gaggggtgag ccctggcccg 180
aatgctccca ctcctacctg gttggctgct ggccagtggt ccttgatggg gttgaagtcc 240
caatctggat ttgttgagtt ggctccgaat gcagggtcca actgatgatc gggaaggaat 300
cccagagggt tgggaacaga aagattcgtc cccatgcctt tgcgaatgct gtagctcttg 360
ttcccaagaa tatggtgacc cgcaaaatga tgcgctacgt gtggtttccc tcttatatag 420
aataccagcc ttccaaagag tatgtaaata atgtctggtt tggaagtaat gattaactac 480
ctgatctgga taataaggtt taattccttt gtctaagggc aaatatttag tgtgggtagg 540
atagaatcta gcaggcataa ttaatttcaa tcttctcttt tcatttacag tgagagggcc 600
cacaaattgt tgacacctat taataatgtc ctcttgtaaa tgaatcttag gaaaggaagg 660
agtttgccat tcaggattaa agataggtac tgtagaggaa taaagccccg taaagtttcc 720
gaccttatga gtccaaggaa tactaacatt gagattcccg agattgagat cttctgcgac 780
gcggcgattg agatctgcgt ctgcgaggcg agggagttct tcttctaggg gacctgcctc 840
ggtcccgtcg tctaacaaca gtagtttccg gaagtgttga taagataggg gcatttggtg 900
gtctataggc tggaggagtg cgaatccaca ctccgaaaga gaccaaatat tcaagtacag 960
tctctcttcc aaaagtaagg caagatatat gaaaccacaa tagttgcctg atctttaaac 1020
ccatgttagt attaacataa ttgactacta gatctctgga tgctggatct tgcaaattat 1080
tacccaccca ggtagctaga gtcatcaatt ccccccagca gagaatggct tgcctgagtg 1140
cagtatggtg aggtgagcaa tgctcaggag actctaaggc ttctcgatac agagctgagg 1200
cggtgtctag gagatctcgt acggaaggaa agaagtcaga aggcaaaaac gagagtaact 1260
ccacagtagc tccaaattct ttataagggt caatgtccat gccccaaagc cacccaaggc 1320
acagcttgga ggcttgaaca gtgggacatg tacaagagat gattaggcag aggtgaaaaa 1380
gttgcatggt gctggtgcgc agaccaattt atgcctacag cctcctaata caaagatcat 1440
taacctaatc tcctccccca actcctccca gtccttaaac acacagtctt tgaagtaggc 1500
ctcaaggtcg gtcgttgaca ttgctgggag tccaagagtc ctcttatgta agaccttggg 1560
caggatctga tgggcgttca cggtggtcgc catgcaacgt gcagaggtga agcgaagtgc 1620
acacggaccg gcagatgaga aggcacagac ggggagaccg cgtaaagaga ggtgcgcccc 1680
gtggtcggct ggaacggcag acggagaagg ggacgagaga gtcccaagcg gccccgagag 1740
gggtcgtccg cgggattcag cgccgacggg acgtaaacaa aggacgtccc gcgaaggatc 1800
cagttggcag tacagcctag cagccatgga aatgatgtat atttccgcga gaggacgaca 1860
gaattgtcag ttccgatgag ctttgctcca gaccggctgc gagcaaaaca agcggctagg 1920
agttccgcag tatggatcgg cagaggagcc acaaaggttc cacgcatgcg ctgatggcct 1980
atggctaagc cccagccagt gggggttgcg tcagcaaaca cttggcacag accaggccgt 2040
tgccgagcaa cggggtaaag gttcatgtac tgtttactta gaaaggcctt gtaagttggc 2100
gagaaagtga aagcctgttt agcttgtata catgcataca aaggcattaa ggcaggatat 2160
ccacattgtg taaatggagc agcaaagccc aaaagaccca caattctttg acatactttc 2220
caatcaatag gcctgttaac aggaagtttt ctaaaacagt gtttgatctt ttgtacaata 2280
tgatcctgtg gcaaagttcc ccaacttcca attatgtagc ccatgaagtt tagggaataa 2340
ccccatcttt ttgttttgtt agggtttaaa tgtataccca gagacaaaag aaaattggta 2400
acagcggtat aaagggactc acgatgctgt acagacttgg cccccaatac cacatcatcc 2460
atatagctga aagccaaaca gtgggggaaa gccctacgaa ccactgaaca aatggcacta 2520
gtaaactgag ccaagagaaa cggactgagg cccactccca taggtatttt gcgaaagccc 2580
aggacgatgg gatgggaata caggtgcaat ttccatccgt aggttttgta cagcaacatg 2640
agggaaactt agagttgcct tgagcaggag tcgtgcaggt tttgcatggt cccgtactgg 2700
ttgttgttga tcctggaatt agaggacaaa cgggcaacat accttgataa tccagaagaa 2760
ccaataagaa gatgaggcat agcagcagga tgaagaggaa tatgataaaa cgccgcagac 2820
acatccagcg ataaccagga caaattggag gacaggaggt tggtgagtga ttggaggttg 2880
gggactgcga attttggcca agacacacgg gtgatccccc tagaaaattg agagaagtcc 2940
accacgagtc tagactctgc ggtattgtga ggattcttgt caacaagaaa aaccccgcct 3000
gtaacacgag caggggtcct aggaatcctg atgtgatgtt ctccatgatc gtcacagggt 3060
ccccagtcct cgcggagatt gacgagatgt gagaggcaat attcggagca gggtttactg 3120
ttcctgaact ggagccacca gcaggaagat acagacccct gactctggga tcctgcagag 3180
cttggtgcaa ggcagtggaa 3200
<210> 49
<211> 3182
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<223> Hepatitis B virus subtype ayw, complete genome
<400> 49
aattccacaa cctttcacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct 60
gctggtggct ccagttcagg agcagtaaac cctgttccga ctactgcctc tcccttatcg 120
tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc 180
ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 240
ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt 300
cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcctg tcctccaact 360
tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg 420
ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480
ctaattccag gatcctcaac caccagcacg ggaccatgcc gaacctgcat gactactgct 540
caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc 600
tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc 660
cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 720
actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 780
ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 840
ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc tgaattttat gggttatgtc attggaagtt 900
atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 960
ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 1020
ctgccccatt tacacaatgt ggttatcctg cgttaatgcc cttgtatgca tgtattcaat 1080
ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 1140
acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 1200
ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcgtgcg tggaaccttt tcggctcctc 1260
tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 1320
acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tctcccgcaa atatacatcg tatccatggc 1380
tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 1440
cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 1500
gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 1560
cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 1620
cgtgaacgcc caccgaatgt tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctctgc 1680
aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 1740
gttgggggag gagattagat taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 1800
ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct 1860
actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat cgacccttat 1920
aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca 1980
gtacgagatc ttctagatac cgcctcagct ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag 2040
cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg caagcaattc tttgctgggg ggaactaatg 2100
actctagcta cctgggtggg tgttaatttg gaagatccag catctagaga cctagtagtc 2160
agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttcaggcaac tcttgtggtt tcacatttct 2220
tgtctcactt ttggaagaga aaccgttata gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt 2280
cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatcc tatcaacact tccggaaact 2340
actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2400
aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aacctcaatg ttagtattcc 2460
ttggactcat aaggtgggga actttactgg tctttattct tctactgtac ctgtctttaa 2520
tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa 2580
atgtgaacag tttgtaggcc cacttacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat 2640
gcctgctagg ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc 2700
ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt tacacactct 2760
atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat agcgcctcat tttgtgggtc 2820
accatattct tgggaacaag atctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc 2880
tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacaca gcaaatccag 2940
attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag 3000
cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc 3060
agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctccaccaat cgccagacag 3120
gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt 3180
gg 3182
Claims (70)
- 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA; double stranded ribonucleic acid) 제제로서, 여기서, 상기 안티센스 가닥은 하기 열거된 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:16),
5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:18),
5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:20),
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:23),
5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:24),
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3' (서열 번호:25), 또는
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:28),
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
dA, dC, dG, 및 dT는 각각 2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트, 2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트이고;
(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)이고;
s는 포스포로티오에이트 링크(linkage)인, 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 제제. - 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥이 상기 변형된 뉴클레오티드 서열 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29)를 포함하고,
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
s는 포스포로티오에이트 링크인, dsRNA 제제. - 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥이 하기 열거된 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
(a) 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:16) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(b) 5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:18) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(c) 5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:20) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(d) 5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:23) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(e) 5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:24) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
(f) 5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3' (서열 번호:25) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29); 또는
(g) 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:28) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (서열 번호:29);
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
dA, dC, dG, 및 dT는 각각 2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트, 2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트이고;
(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)이고;
s는 포스포로티오에이트 링크인, dsRNA 제제. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥이 적어도 1개의 뉴클레오티드의 3' 오버행(overhang)을 포함하는, dsRNA 제제.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥이 2개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는, dsRNA 제제.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 19-21개의 뉴클레오티드 쌍 길이인, dsRNA 제제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥이 독립적으로 19-23개의 뉴클레오티드를 갖는, dsRNA 제제.
- 제7항에 있어서, 각각의 가닥이 독립적으로 19-21개의 뉴클레오티드를 갖는, dsRNA 제제.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
- 제9항에 있어서, 상기 리간드가 상기 dsRNA 제제의 상기 센스 가닥의 3' 말단에 접합되는, dsRNA 제제.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 리간드가 N-아세틸갈락토스아민 (GalNAc) 유도체인, dsRNA 제제.
- 제13항에 있어서, X가 O인, dsRNA 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 하기 열거된 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고:
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:16),
5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:18),
5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:20),
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:23),
5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:24),
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3' (서열 번호:25), 또는
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:28),
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
dA, dC, dG, 및 dT는 각각 2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트, 2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트이고;
(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)이고;
s는 포스포로티오에이트 링크인, dsRNA 제제. - 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥이 하기 열거된 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고:
(a) 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:16) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (서열 번호:10);
(b) 5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:18) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (서열 번호:10);
(c) 5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:20) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (서열 번호:10);
(d) 5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:23) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (서열 번호:10);
(e) 5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:24) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (서열 번호:10);
(f) 5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3' (서열 번호:25) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (서열 번호:10); 또는
(g) 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3' (서열 번호:28) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (서열 번호:10);
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
dA, dC, dG, 및 dT는 각각 2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트, 2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트이고;
(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)이고;
s는 포스포로티오에이트 링크이고;
L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤린올인, dsRNA 제제. - 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥이 하기 열거된 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고:
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (서열 번호:16) 및 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (서열 번호:10);
여기서, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고;
Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고;
dA, dC, dG, 및 dT는 각각 2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트, 2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트이고;
(Agn)은 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)이고;
s는 포스포로티오에이트 링크이고;
L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤린올인, dsRNA 제제. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 세포에서 B형 간염 바이러스 (HBV)의 발현을 억제하는, dsRNA 제제.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 포함하는 세포.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 및 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 세포에서 B형 간염 바이러스 (HBV) 유전자 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제20항의 약제학적 조성물과 접촉시켜, 상기 세포에서 상기 HBV 유전자 발현을 억제함을 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 HBV 유전자 발현을 적어도 80%, 90%, 95%, 또는 98%, 또는 상기 검정 방법의 검출 수준 미만으로 억제하는, 방법.
- 세포에서 B형 간염 바이러스 (HBV)의 복제를 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제20항의 약제학적 조성물과 접촉시켜, 상기 세포에서 상기 HBV의 복제를 억제함을 포함하는, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 세포에서 HBV의 복제를 적어도 80%, 90%, 95%, 또는 98%, 또는 상기 검정 방법의 검출 수준 미만으로 억제하는, 방법.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 대상자 내에 존재하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 대상자가 사람인, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 대상자가 HBV-연관 질환을 앓고 있는, 방법.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 시험관내에 존재하는, 방법.
- B형 간염 바이러스 (HBV)에 감염된 대상자에게 치료학적 유효량의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제20항의 약제학적 조성물을 투여하여, 상기 대상자에서 HBV 항원 수준을 감소시킴을 포함하는, HBV에 감염된 대상자에서 HBV 항원 수준을 감소시키는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 HBV 항원이 HBsAg인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 HBV 항원이 HBeAg인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 항원이 상기 대상자로부터의 혈청에서 측정되는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 대상자가 HBeAg 양성인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 대상자가 HBeAg 음성인, 방법.
- 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HBV 항원 수준이 혈청에서 적어도 1 log10, 적어도 2 log10, 적어도 3 log10, 또는 적어도 4 log10; 또는 상기 검정의 검출 수준 미만으로 감소되는, 방법.
- B형 간염 바이러스 (HBV)에 감염된 대상자에게 치료학적 유효량의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제20항의 약제학적 조성물을 투여하여, 상기 대상자에서 HBV의 바이러스 로드(viral load)를 감소시킴을 포함하는, HBV에 감염된 대상자에서 HBV의 바이러스 로드를 감소시키는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 HBV 바이러스 로드를 상기 대상자로부터의 혈청에서 측정하는, 방법.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 대상자가 HBeAg 양성인, 방법.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 대상자가 HBeAg 음성인, 방법.
- 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HBV 바이러스 로드가 혈청에서 적어도 1 log10, 적어도 2 log10, 적어도 3 log10, 또는 적어도 4 log10; 또는 상기 검정의 검출 수준 미만으로 감소되는, 방법.
- B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 갖는 대상자에게 치료학적 유효량의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제20항의 약제학적 조성물을 투여하여, 상기 대상자를 치료함을 포함하는, HBV 감염을 갖는 대상자를 치료하는 방법.
- B형 간염 바이러스 (HBV)-관련 장애를 갖는 대상자에게 치료학적 유효량의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제20항의 약제학적 조성물을 투여하여, 상기 대상자를 치료함을 포함하는, HBV-관련 장애를 갖는 대상자의 치료 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 HBV-관련 장애가 만성 간염이고, 상기 대상자가 HBeAg 양성인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 HBV-관련 장애가 만성 간염이고, 상기 대상자가 HBeAg 음성인, 방법.
- 제21항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 상기 대상자에게 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg, 또는 3 mg/kg 내지 10 mg/kg의 용량(dose)으로 투여되는, 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 상기 대상자에게 3 mg/kg 내지 10 mg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
- 제21항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 상기 대상자에게 50 mg 내지 200 mg 또는 50 mg 내지 900 mg의 고정 용량으로 투여되는, 방법.
- 제21항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 상기 대상자에게 피하 투여되는, 방법.
- 제21항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 상기 대상자에게 2회 이상의 용량으로 투여되는, 방법.
- 제21항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 상기 대상자에게 1개월에 1회, 2개월에 1회, 또는 3개월에 1회 투여되는, 방법.
- 제21항 내지 제49항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 상기 대상자에게 1개월에 1회 이하 투여되는, 방법.
- 제21항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자에게 하나 이상의 추가 치료제를 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 추가 치료제가 항바이러스제, 역전사 효소 억제제, 면역 자극제, 치료 백신, 바이러스 진입 억제제, HbsAg의 분비 또는 방출을 억제하는 올리고뉴클레오티드, 캡시드 억제제, 또는 공유결합 폐환형 (ccc; covalently closed circular) HBV DNA 억제제, 또는 상기한 것들의 조합인, 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 추가 치료제가 역전사 효소 억제제인, 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 추가 치료제가 역전사 효소 억제제 및 면역 자극제인, 방법.
- 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 역전사 효소 억제제가 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 (TDF), 테노포비르 알라펜아미드, 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르 (ETV), 텔비부딘, 또는 AGX-1009인, 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 면역 자극제가 페길화 인터페론 알파 2a (PEG-IFN-α2a), 인터페론 알파-2b, 재조합 사람 인터류킨-7, 또는 Toll-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제인, 방법.
- 제1항 내지 제18중 어느 한 항의 dsRNA 제제 및 약제학적 부형제를 포함하는, 제21항 내지 제57항 중 어느 한 항의 방법을 실행하기 위한 약제학적 조성물.
- 대상자에서 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제20항의 약제학적 조성물.
- 대상자에서 B형 간염 바이러스 (HBV)-관련 장애의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제20항의 약제학적 조성물.
- 제60항에 있어서, 상기 HBV-관련 장애가 만성 간염이고, 상기 대상자가 HBeAg 양성인, dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물.
- 제60항에 있어서, 상기 HBV-관련 장애가 만성 간염이고, 상기 대상자가 HBeAg 음성인, dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물.
- 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자가 하나 이상의 추가 치료제를 투여받고 있거나 투여받은 적이 있는, dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물.
- 제63항에 있어서, 상기 추가 치료제가 항바이러스제, 역전사 효소 억제제, 면역 자극제, 치료 백신, 바이러스 진입 억제제, HbsAg의 분비 또는 방출을 억제하는 올리고뉴클레오티드, 캡시드 억제제, 또는 공유결합 폐환형 (ccc) HBV DNA 억제제, 또는 상기한 것들의 조합인, dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물.
- 제63항에 있어서, 상기 추가 치료제가 역전사 효소 억제제인, dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물.
- 제63항에 있어서, 상기 추가 치료제가 역전사 효소 억제제 및 면역 자극제인, dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물.
- 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 역전사 효소 억제제가 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 (TDF), 테노포비르 알라펜아미드, 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르 (ETV), 텔비부딘, 또는 AGX-1009인, dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물.
- 제66항에 있어서, 상기 면역 자극제가 페길화 인터페론 알파 2a (PEG-IFN-α2a), 인터페론 알파-2b, 재조합 사람 인터류킨-7, 또는 Toll-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제인, dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물.
- 제21항 내지 제57항 중 어느 한 항의 방법을 실행하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제20항의 약제학적 조성물의 용도.
- 제21항 내지 제57항 중 어느 한 항의 방법을 실행하기 위한 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제20항의 약제학적 조성물의 용도.
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