UA127745C2 - КОМПОЗИЦІЇ, ЩО МІСТЯТЬ ЗАСІБ НА ОСНОВІ dsRNA ВІРУСУ ГЕПАТИТУ В (HBV), ТА СПОСОБИ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ - Google Patents

КОМПОЗИЦІЇ, ЩО МІСТЯТЬ ЗАСІБ НА ОСНОВІ dsRNA ВІРУСУ ГЕПАТИТУ В (HBV), ТА СПОСОБИ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ Download PDF

Info

Publication number
UA127745C2
UA127745C2 UAA202100688A UAA202100688A UA127745C2 UA 127745 C2 UA127745 C2 UA 127745C2 UA A202100688 A UAA202100688 A UA A202100688A UA A202100688 A UAA202100688 A UA A202100688A UA 127745 C2 UA127745 C2 UA 127745C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
subject
hepatitis
agent
nvm
hbv
Prior art date
Application number
UAA202100688A
Other languages
English (en)
Inventor
Васант Р. ДЖАДХАВ
Мартін А. Майер
Мартин А. Майер
Стюарт Мільштейн
Стюарт Мильштейн
Марк К. Шлегель
Original Assignee
Альнілам Фармасьютікалз, Інк.
Альнилам Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Альнілам Фармасьютікалз, Інк., Альнилам Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Альнілам Фармасьютікалз, Інк.
Publication of UA127745C2 publication Critical patent/UA127745C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Винахід стосується засобів на основі двониткової РНК, що націлюються на геном вірусу гепатиту В (HBV), і способів використання таких засобів для інгібування експресії одного або більше генів HBV, і способів лікування суб'єктів, що мають інфекцію, спричинену HBV, або асоційоване з HBV порушення, наприклад інфекцію, що являє собою хронічний гепатит В.

Description

Перелік послідовностей, асоційованих з даною заявкою, наданий у форматі текстового документа замість паперової копії і включений у даний документ в опис за допомогою посилання. Назва текстового файлу, що містить перелік послідовностей являє собою 930385 4100 ЗЕОШЕМСЕ | ІЗТІМОХЇ. Розмір текстового файлу становить 83,1 Кб, дата створення 4 серпня 2019 року, і він подається в електронному вигляді через ЕЕ5-М/ер.
ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ
По всьому світу понад 400 мільйонів людей хронічно заражені НВУ і, таким чином, мають підвищений ризик розвитку серйозних захворювань печінки, таких як хронічний гепатит, цироз, печінкова недостатність і гепатоцелюлярна карцинома (НСС), що призводить до 600000 смертей щороку.
Природний розвиток хронічної інфекції, спричиненої НВМУ, передбачає чотири послідовні фази: (1) рання фаза «імунотолерантності», високі рівні реплікації вірусу і мінімальне запалення печінки; (2) імунореактивна фаза, значне запалення печінки і підвищений вміст амінотрансфераз у сироватці крові; у деяких пацієнтів прогресує до (3) «нереплікативної» фази, сероконверсія до антитіл до НВе, невизначуваний або низький рівень віремії (нижче 2000 МО/мл за аналізами на основі ПЛР) та усунення запалення печінки; і (4) НВеАд-негативний хронічний гепатит В, спричинений появою специфічних вірусних мутацій, які перешкоджають виробленню НВедАд, але не перешкоджають реплікації вірусу. Ця форма хронічного гепатиту В (СНВ) характеризується коливанням рівня ДНК НВУ у сироватці крові та амінотрансфераз (АТ та А5Т) у сироватці крові та прогресуючим захворюванням печінки. Важливо зазначити, що СНВ може бути як НВедд-позитивним, так і НВеАд-негативним СНВ. Довготривалі дослідження пацієнтів з СНВ свідчать, що сукупна 5-річна частота розвитку цирозу становить від 8 до 20 Об.
Б-річна сукупна частота декомпенсації печінки становить приблизно 20 95. Світовий рівень захворюваності на НСС зріс, і в даний час вона є п'ятим за поширеністю видом раку. Щорічна захворюваність на пов'язаний з НВМ НСС є високою, коливається в межах 2-5595 при встановленні цирозу.
Основною метою лікування інфекції, спричиненої НВМ, є постійне пригнічення реплікації
НВМ ї полегшування захворювання печінки. Клінічно важливими короткотривалими цілями є досягнення сероконверсії НВеАд, нормалізації рівня АГТ та А5Т у сироватці крові, усунення
Зо запалення печінки та попередження декомпенсації печінки. Кінцевою метою лікування є досягнення довготривалої відповіді для запобігання розвитку цирозу та раку печінки для продовження виживання. Інфекцію, спричинену НВМ, неможливо повністю усунути через збереження певної форми вірусної ковалентно замкнутої циркулярної ДНК (сссНВМ-ДНК) в ядрах інфікованих гепатоцитів. Однак індуковане лікуванням виведення НВ5Ад в сироватці крові є маркером завершення хронічної інфекції, спричиненої НВУ, і асоціюється з найкращими довготривалими результатами.
Сучасні стандартні способи лікування інфекції, спричиненої НВМУ, включають види імунотерапії на основі інтерферону або тимозину-4і та пригнічення продукування вірусів шляхом інгібування полімерази НВМ. Інгібітори полімерази НВМ ефективні у зниженні продукування вірусів, але практично не впливають на швидке зниження рівня НВЗАд або можуть повільно знижувати рівень НВ5Ад за довготривалого лікування в обмеженої кількості пацієнтів (як це відбувається у випадку використання тенофовіру динопроксилу фумарату). За допомогою імунотерапії на основі інтерферону можна досягнути зниження як продукування вірусу, так і раннього виведення НВз5Ад з крові, але лише у невеликого відсотка суб'єктів, що проходять лікування. Загальновизнана роль НВзАд у крові полягає у відокремленні антитіл до
НВ5ЗАЯ та наданні можливості інфекційним вірусним частинкам уникнути виявлення імунною системою, що, імовірно, є однією з причин, чому інфекція, спричинена НВУ, залишається хронічним станом. Окрім того, усі з НВ5Ад, НВеАд та НВсАд мають |імуноінгібувальні властивості, і персистенція цих вірусних білків у крові пацієнтів після введення будь-якого з доступних на сьогодні засобів лікування інфекції, спричиненої НВУ, імовірно, має значний вплив на запобігання досягнення імунологічного контролю щодо інфекції, спричиненої НВУ, в організмі пацієнтів.
Хоча всі три головних білюа НВМ (НВзАд, НВеАд та НВсАд) мають імуноінгібувальні властивості, НВ5Ад становить переважну більшість білка НВМ у кровотоці суб'єктів, інфікованих
НВУ. Крім того, хоча видалення (шляхом сероконверсії) НВеАд або зменшення сироваткової віремії не корелює з розвитком стійкого контролю щодо інфекції, спричиненої НВУ, без лікування, видалення сироваткового НВ5ЗАд з крові (і сероконверсія) за інфекції, спричиненої
НВУ, є загальновизнаним прогностичним показником противірусної відповіді на лікування, що приведе до контролю щодо інфекції, спричиненої НВУ, без лікування (хоча це відбувається бо лише у невеликої частини пацієнтів, які отримують імунотерапію). Таким чином, хоча зниження всіх трьох основних білків НВМ (НВ5ЗАд, НВелйу та НВсАд) може привести до найкращого усунення інгібувального ефекту, видалення тільки НВ5ЗАд, імовірно, само по собі є достатнім для усунення основного ступеня вірусного інгібування імунної функції у суб'єктів з інфекцією, спричиненою НВУ.
Отже, за відсутності будь-якої поточної схеми лікування, яка може відновити імунологічний контроль щодо інфекції, спричиненої НВМ, у значної частини пацієнтів, існує потреба в ефективному лікуванні проти інфекції, спричиненої НВУ, яке може інгібувати реплікацію вірусів, а також відновити імунологічний контроль у більшості пацієнтів. Відповідно, в даній галузі техніки існує потреба в альтернативних засобах терапії та засобах комбінованої терапії для суб'єктів, інфікованих НВУ або які мають асоційоване з НВМ захворювання.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
У деяких варіантах здійснення даний винахід передбачає композиції, що містять засіб на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (а5Е2МА), які впливають на розщеплення РНК- транскриптів гену вірусу гепатиту В (НВМ), опосередковане РНК-індукованим комплексом сайленсингу (КІЗС). Ген НВМ може перебувати всередині клітини, наприклад клітини всередині суб'єкта, такого як людина.
Даний винахід також передбачає способи і засоби терапії для лікування суб'єкта, що має порушення, при якому інгібування експресії гена НВМ принесе користь, наприклад інфекцію, спричинену НВУ, або асоційоване з НВМ захворювання, таке як інфекція, що являю собою хронічний гепатит В (СНВ), з використанням композицій, що містять засіб на основі азЕМА, які впливають на розщеплення РНК-транскриптів гену НВМ, опосередковане РНК-індукованим комплексом сайленсингу (КІЗС), для інгібування експресії гена НВУМ.
В одному аспекті даний винахід передбачає засоби на основі а5КМА для інгібування експресії НВМ. Наприклад, даний винахід передбачає засіб на основі а5КМА, що містить сенсову нитку та антисенсову нитку, які утворюють двониткову ділянку, при цьому антисенсова нитка включає модифіковану нуклеотидну послідовність, наведену під: 5-ивсївида(Аап)а Ст таадистсАїсасвиви-3' (ЗЕО ІЮО МО:16), 5-ивсївида(Аап)асдааадистасАїсасвиви-3' (ЗЕО ІО МО':18), 5-иваївцаса(Аап)сСтстаадистсАїсасвиви-3 (ЗЕО ІЮ МО:20), 5-ивсївцасааАдЧасСстаадистсАтсасзиви-3 (ЗЕО ІЮ МО:23), 5-ивсаївида(Аап а астстаадистсАтсасзиви-3 (ЗЕО ІЮ МО:24), 5-ивсаївцасааАЧасСстаадистсАтасСасзиви-3' (ЗЕО ІЮ МО:25) або 5-ивсаївида(Аап) Ста таааи тасСАїсасзиви-3 (ЗЕО ІЮ МО:28), де а, с, д та и являють собою 2'-О-метиладенозин-3'-фосфат, 2'-О-метилцитидин-3'-фосфат, 2"-ЮО-метилгуанозин-3'-фосфат та 2'-О-метилуридин-3'-фосфат відповідно;
АЇ, СІ, СОЇ та ЦГ являють собою 2'-фтораденозин-3'-фосфат, 2'-фторцитидин-3'-фосфат, 2'- фторгуанозин-3'-фосфат та 2'і-фторуридин-3'-фосфат відповідно; ад, аС, аб та ат являють собою 2'-дезоксиаденозин-3-фосфат, 2'-дезоксицитидин-3'- фосфат, 2'--дезоксигуанозин-3'-фосфат та 2'-дезокситимідин-3'-фосфат відповідно; (Адп) являє собою аденозин-гліколь-нуклеїнову кислоту (ОМА); і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок.
У деяких варіантах здійснення сенсова нитка включає модифіковану нуклеотидну послідовність 5'-дзиздисисАгтОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29), де а, с, д та и являють собою 2'-О-метиладенозин-3'-фосфат, 2'-О-метилцитидин-3'-фосфат, 2"-ЮО-метилгуанозин-3'-фосфат та 2'-О-метилуридин-3'-фосфат відповідно;
АЇ, СІ, СОЇ та ЦГ являють собою 2'-фтораденозин-3'-фосфат, 2'-фторцитидин-3'-фосфат, 2'- фторгуанозин-3'-фосфат та 2'і-фторуридин-3'-фосфат відповідно; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок.
У деяких варіантах здійснення антисенсова нитка та сенсова нитка включають модифіковані нуклеотидні послідовності, наведені під: (а) 5-ивсївида(Адп)дстСстаадистсАїсасвиви-3" (ЗЕО ІО МО:16) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29); (в) 5Б-изствида(Адп)дсдаадистасСАтсасзиви-3" (ЗЕО ІО МО:18) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29); (с) 5-ивсаївцаса(Аап)сСтстаадистсАїсасзиви-3" (ЗЕО ІО МО:20) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29); (а) 5-ивсїзцасааАдасСстаадистсАїсасзиви-3" (ЗЕО ІО МО:23) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29); (є) Б-изствида(Адп а асСтстаадисисАїсасвиви-3" (ЗЕО ІО МО:24) та 5- 60 авизаиСстсАгТШТисасиисаса-3' (5ЕО І МО:29);
(5 5-изствцасадАдасСстаадистсАтасСасзвиви-3" (ЗЕО ІО МО:25) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3" (ЗЕО ІЮ МО:29); або (9) Б'-изствида(Адп)дстстаадис ас А тсасвиви-3" (ЗЕО ІО МО:28) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29); де а, с, д та и являють собою 2'-О-метиладенозин-3'-фосфат, 2'-О-метилцитидин-3'-фосфат, 2"-ЮО-метилгуанозин-3'-фосфат та 2'-О-метилуридин-3'-фосфат відповідно;
АЇ, СІ, СОЇ та ЦГ являють собою 2'-фтораденозин-3'-фосфат, 2'-фторцитидин-3'-фосфат, 2'- фторгуанозин-3'-фосфат та 2'і-фторуридин-3'-фосфат відповідно; аА, аС, аб та ат являють собою 2'-дезоксиаденозин-3-фосфат, 2'-дезоксицитидин-3'- фосфат, 2'--дезоксигуанозин-3'-фосфат та 2'-дезокситимідин-3'-фосфат відповідно; (Адп) являє собою аденозин-гліколь-нуклеїнову кислоту (ОМА); і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок.
У деяких варіантах здійснення щонайменше одна нитка засобу на основі а5ЕМА включає 3'- липкий кінець зі щонайменше 1 нуклеотиду. У деяких варіантах здійснення щонайменше одна нитка засобу на основі Д5ЕМА включає 3'-липкий кінець з 2 нуклеотидів.
У деяких варіантах здійснення довжина двониткової ділянки засобу на основі а5КМА становить 19-21 пару нуклеотидів.
У деяких варіантах здійснення кожна нитка засобу на основі ахеЕМА незалежно містить 19-23 нуклеотиди. У деяких варіантах здійснення кожна нитка засобу на основі 5КМА незалежно містить 19-21 нуклеотид.
У деяких варіантах здійснення засіб на основі а5КМА додатково містить ліганд. У деяких варіантах здійснення ліганд кон'югований з 3'-кінцем сенсової нитки засобу на основі 45ЕМА. У деяких варіантах здійснення ліганд являє собою похідну М-ацетилгалактозаміну (саіМАс). У певних варіантах здійснення ліганд являє собою он но о Н Н но о пора о а г о он но о о Н Н но о Ми и о а г ша о о о он но о но о нь о
АСНМ Н Н о
У деяких варіантах здійснення засіб на основі азКМА кон'югований з лігандом, як показано на наступній схемі:
Зо е
Як до ОХ і о ані у он Ї
Н ноя яти чини с но ЯН ною и мини .к 5 7 м, с о о би
Но снн в Що де Х являє собою О або 5. У деяких варіантах здійснення Х являє собою 0.
У деяких варіантах здійснення антисенсова нитка складається з модифікованої нуклеотидної послідовності, наведеної під: 5-ивсївида(Аап)а Ст таадистсАїсасвиви-3' (ЗЕО ІЮО МО:16), 5-ивсївида(Аап)дсдаадистасАїсасвиви-3' (5ЕО ІО МО':18), 5-иваївцаса(Аап)сСтстаадистсАтсасзиви-3 (ЗЕО ІЮ МО:20), 5-ивсївцасааАдЧасСстаадистсАтсасзиви-3 (ЗЕО ІЮ МО:23), 5-ивсаївида(Аап а астстаадистсАтсасзиви-3 (ЗЕО ІЮ МО:24), 5-ивсаївцасааАЧасСстаадистсАтасСасзиви-3' (ЗЕО ІЮ МО:25) або 5-ивсаївида(Аап) Ста таааи тасСАїсасзиви-3 (ЗЕО ІЮ МО:28), де а, с, д та и являють собою 2'-О-метиладенозин-3'-фосфат, 2'-О-метилцитидин-3'-фосфат, 2"-ЮО-метилгуанозин-3'-фосфат та 2'-О-метилуридин-3'-фосфат відповідно;
АЇ, СІ, ОЇ та ШГ являють собою 2'-фтораденозин-3'-фосфат, 2'--фторцитидин-3'-фосфат, 2'- фторгуанозин-3'-фосфат та 2'і-фторуридин-3'-фосфат відповідно; ад, аС, аб та ат являють собою 2'-дезоксиаденозин-3-фосфат, 2'-дезоксицитидин-3'- фосфат, 2'--дезоксигуанозин-3'-фосфат та 2'-дезокситимідин-3'-фосфат відповідно; (Адп) являє собою аденозин-гліколь-нуклеїнову кислоту (ОМА); і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок.
У деяких варіантах здійснення даний винахід передбачає засіб на основі а5КМА, при цьому сенсова нитка та оантисенсова нитка складаються з модифікованих нуклеотидних послідовностей, наведених під: (а) 5-ивсївида(Адп)дстСстаадистсАїсасвиви-3" (ЗЕО ІО МО:16) та 5- дзиздисИисАгТОтИисдсиисаса-3' (З5ЕО ІЮ МО 29); (в) 5Б-изствида(Адп)дсдаадистасСАтсасзиви-3" (ЗЕО ІО МО:18) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29); (с) 5-ивсаївцаса(Аап)сСтстаадистсАїсасзиви-3" (ЗЕО ІО МО:20) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29); (а) 5Б-изствцасадАдасСстаадистсАїсасзиви-3" (ЗЕО ІО МО:23) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29); (є) Б-изствида(Адп а асСтстаадисисАїсасвиви-3" (ЗЕО ІО МО:24) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29); (5 5-изствцасадАдасСстаадистсАтасСасзиви-3" (ЗЕО ІО МО:25) та 5- дзиздистсАТОТисодсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО:29); або (9) Б'-изствида(Адп)дстстаадистасСАтсасзиви-3" (ЗЕО ІО МО:28) та 5- дзиздисИисАгТОтисдсиисаса-3' (ЗЕО ІЮ МО 29); де а, с, д та и являють собою 2'-О-метиладенозин-3'-фосфат, 2'-О-метилцитидин-3'-фосфат, 2"-ЮО-метилгуанозин-3'-фосфат та 2'-О-метилуридин-3'-фосфат відповідно;
АЇ, СІ, СОЇ та ЦГ являють собою 2'-фтораденозин-3'-фосфат, 2'-фторцитидин-3'-фосфат, 2'- фторгуанозин-3'-фосфат та 2'і-фторуридин-3'-фосфат відповідно; ад, аС, аб та ат являють собою 2'-дезоксиаденозин-3-фосфат, 2'-дезоксицитидин-3'- фосфат, 2'--дезоксигуанозин-3'-фосфат та 2'-дезокситимідин-3'-фосфат відповідно; (Адп) являє собою аденозин-гліколь-нуклеїнову кислоту (ОМА);
являє собою фосфотіоатний зв'язок; і
З3'-кінець сенсової нитки кон'юЮгований з лігандом, що являє собою М-Ігрис(ЗаїІМАс-алкіл)- амідодеканоїл)|-4-гідроксипролінол (І 96).
В іншому аспекті даний винахід також передбачає клітину, що містить засіб на основі 5 азКМА, розкритий у даному документі.
Даний винахід також передбачає фармацевтичну композицію, що містить засіб на основі а5КМА, описаний у даному документі, і фармацевтичний наповнювач.
Даний винахід також передбачає спосіб інгібування експресії гена вірусу гепатиту В (НВМ) в клітині, при цьому спосіб передбачає приведення клітини в контакт із засобом на основі а5ЕМА або фармацевтичною композицією, розкритими в даному документі, з інгібуванням таким чином експресії гена НВМ в клітині. У деяких варіантах здійснення клітина перебуває в організмі суб'єкта. У деяких варіантах здійснення суб'єктом є людина. У деяких варіантах здійснення суб'єкт страждає від асоційованого з НВМ захворювання. У деяких варіантах здійснення клітина перебуває іп мійго. У деяких варіантах здійснення експресія гена НВМ інгібується на щонайменше 80 95, 90 95, 95 95 або 98 95 або до рівня, нижчого ніж той, який можна виявити конкретним способом аналізу.
Даний винахід також передбачає спосіб інгібування реплікації вірусу гепатиту В (НВМ) в клітині, при цьому спосіб передбачає приведення клітини в контакт із засобом на основі а5ЕМА або фармацевтичною композицією, розкритими в даному документі, з інгібуванням таким чином реплікації НВУ в клітині. У деяких варіантах здійснення клітина перебуває в організмі суб'єкта. У деяких варіантах здійснення суб'єктом є людина. У певних варіантах здійснення суб'єкт страждає від асоційованого з НВМ захворювання. У деяких варіантах здійснення клітина перебуває іп міго. У певних варіантах здійснення реплікація НВМ в клітині інгібується на щонайменше 80 95, 90 95, 95 95 або 98 95 або до рівня, нижчого ніж той, який можна виявити конкретним способом аналізу.
У даному документі також передбачається спосіб зниження рівня антигена вірусу гепатиту В (НВУМ) у суб'єкта, інфікованого НВУ, що включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості засобу на основі а5ЕЕМА або фармацевтичної композиції, розкритих у даному документі, зі зниженням таким чином рівня антигена НВМ в організмі суб'єкта. У деяких варіантах здійснення антиген НВМ являє собою НВ5Ад. У деяких варіантах здійснення антиген
НВМ являє собою НВедАод. У деяких варіантах здійснення антиген НВМ вимірюють в сироватці крові, одержаній від суб'єкта. У деяких варіантах здійснення суб'єкт є НВедАд-позитивним. У деяких варіантах здійснення суб'єкт є НВеАд-негативним. У деяких варіантах здійснення рівень антигена НВМ в сироватці крові знижується на щонайменше 1 Іосд10, щонайменше 2 1Іод910, щонайменше З 0910 або щонайменше 4 Іод10 або до рівня, нижчого ніж той, який можна виявити конкретним аналізом.
Даний винахід також передбачає спосіб зниження вірусного навантаження вірусу гепатиту В (НВУМ) у суб'єкта, інфікованого НВМУМ, що включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості засобу на основі а5ЕМА або фармацевтичної композиції, розкритих у даному документі, зі зниженням таким чином вірусного навантаження НВМ щодо організму суб'єкта. У деяких варіантах здійснення вірусне навантаження НВМ вимірюють в сироватці крові, одержаній від суб'єкта. У деяких варіантах здійснення суб'єкт є НВелод-позитивним. У деяких варіантах здійснення суб'єкт є НВедАд-негативним. У деяких варіантах здійснення вірусне навантаження
НВУ в сироватці крові знижується на щонайменше 1 Іод10, щонайменше 2 Іосд10, щонайменше З 0910 або щонайменше 4 Іод10 або до рівня, нижчого ніж той, який можна виявити конкретним аналізом.
У даному документі також передбачається спосіб лікування суб'єкта, який має інфекцію, спричинену вірусом гепатиту В (НВУ), або асоційоване з НВМ порушення, що включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості засобу на основі 45КМА або фармацевтичної композиції, розкритих у даному документі, завдяки чому здійснюється лікування суб'єкта. У деяких варіантах здійснення суб'єкт є НВедод-позитивним. У деяких варіантах здійснення суб'єкт є НВедАод-негативним. У деяких варіантах здійснення асоційоване з НВМ порушення являє собою хронічний гепатит, і суб'єкт є НВеАд-позитивним. У деяких варіантах здійснення асоційоване з
НВМ порушення являє собою хронічний гепатит, і суб'єкт є НВеАд-негативним.
У деяких варіантах здійснення вищенаведених способів засіб на основі а5ЕМА вводять суб'єкту в дозі, що становить від 0,01 мг/кг до 10 мг/кг, від 0,5 мг/кг до 50 мг/кг або від З мг/кг до 10 мг/кг. У деяких варіантах здійснення способів засіб на основі 45ЕМА вводять суб'єкту в дозі, що становить від З мг/кг до 10 мг/кг. У деяких варіантах здійснення способів засіб на основі а5зКМА вводять суб'єкту у фіксованій дозі, що становить від 50 мг до 200 мг. 60
У деяких варіантах здійснення вищенаведених способів засіб на основі а5ЕМА вводять суб'єкту підшкірно.
У деяких варіантах здійснення вищенаведених способів засіб на основі а5ЕМА вводять суб'єкту в кількості двох або більше доз.
У деяких варіантах здійснення вищенаведених способів засіб на основі а5ЕМА вводять суб'єкту один раз на місяць, один раз на два місяці або один раз на три місяці. У деяких варіантах здійснення способів засіб на основі О5КМА вводять суб'єкту не частіше, ніж один раз на місяць.
У деяких варіантах здійснення вищенаведених способів спосіб додатково передбачає введення суб'єкту додаткового терапевтичного засобу, наприклад одного або більше додаткових терапевтичних засобів. Додатковий терапевтичний засіб може включати без обмеження противірусний засіб, інгібітор зворотної транскриптази, імуностимулятор, терапевтичну вакцину, інгібітор вірусного проникнення, олігонуклеотид, що інгібує секрецію або вивільнення НЬзАО, інгібітор збирання капсиду та інгібітор утворення ковалентно замкненої кільцевої (ссс) ДНК НВМ та комбінацію будь-яких з вищенаведених. У деяких варіантах здійснення додатковий терапевтичний засіб являє собою інгібітор зворотної транскриптази.
У деяких варіантах здійснення вводять більше ніж один додатковий терапевтичний засіб, і при цьому додатковими терапевтичними засобами є інгібітор зворотної транскриптази та імуностимулятор. Інгібітор зворотної транскриптази може включати без обмеження тенофовіру дизопроксилу фумарат (ТОР), тенофовіру алафенамід, ламівудин, адефовіру дипівоксил, ентекавір (ЕТМ), телбівудин та АСХ-1009. Імуностимулятор може включати без обмеження пегільований інтерферон альфа-га (РЕС-ІЕМ-аг2а), інтерферон альфа-2р, рекомбінантний людський інтерлейкін-7 та агоніст ТоЇІ-подібного рецептора 7 (ТІ 7).
Також у даному документі передбачаються композиції для практичного здійснення будь- якого зі способів, розкритих у даному документі. У деяких варіантах здійснення винахід передбачає засіб на основі а5ЕМА або фармацевтичну композицію, розкриті в даному документі, для використання в лікуванні інфекції, спричиненої вірусом гепатиту В (НВУМ), у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення даний винахід передбачає засіб на основі а5ЕМА або фармацевтичну композицію, розкриті в даному документі, для використання в лікуванні
Зо асоційованого з вірусом гепатиту В (НВУ) порушення у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення асоційоване з НВМ порушення являє собою хронічний гепатит, і суб'єкт є НВедАд-позитивним. У деяких варіантах здійснення асоційоване з НВМ порушення являє собою хронічний гепатит, і суб'єкт є НВеАд-негативним. У деяких варіантах здійснення суб'єкту вводять або вводили додатковий терапевтичний засіб, наприклад противірусний засіб, інгібітор зворотної транскриптази, імуностимулятор, терапевтичну вакцину, інгібітор вірусного проникнення, олігонуклеотид, що інгібує секрецію або вивільнення НбрзАд, інгібітор збирання капсиду або інгібітор утворення ковалентно замкненої кільцевої (ссс) ДНК НВУ або комбінацію будь-яких з вищенаведених. У деяких варіантах здійснення додатковий терапевтичний засіб являє собою інгібітор зворотної транскриптази, наприклад тенофовіру дизопроксилу фумарат (ТОБ), тенофовіру алафенамід, ламівудин, адефовіру дипівоксил, ентекавір (ЕТМ), телбівудин або
АСХ-1009. У деяких варіантах здійснення додаткові терапевтичні засоби, що підлягають введенню, являють собою інгібітор зворотної транскриптази (наприклад, тенофовіру дизопроксилу фумарат (ТОР), тенофовіру алафенамід, ламівудин, адефовіру дипівоксил, ентекавір (ЕТМ), телбівудин або АсХ-1009) та імуностимулятор (наприклад, пегільований інтерферон альфа-га (РЕС-ІЕМ-сй2а), інтерферон альфа-25, рекомбінантний людський інтерлейкін-7 або агоніст ТоЇІ- подібного рецептора 7 (ТІ К7)).
Даний винахід передбачає використання засобу на основі а5КМА або фармацевтичної композиції, розкритих у даному документі, для практичного здійснення будь-якого з вищенаведених способів.
Даний винахід також передбачає використання засобу на основі азЕМА, розкритого у даному документі, для одержання або виготовлення лікарського препарату для практичного здійснення будь-якого з вищенаведених способів.
Даний винахід також передбачає набори, що включають засіб на основі а5КМА або фармацевтичну композицію, розкриті в даному документі, необов'язково з інструкціями для практичного здійснення способу, описаного в даному документі.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
На фігурі 1 схематично зображена структура двониткового геному НВМ розміром близько 3,2 т. п. о. Реплікація геному НВМ відбувається через РНК-посередник і під час неї утворюються 4 вірусні транскрипти, що перекриваються (транскрипт довжиною приблизно 3,5 т. н., транскрипт бо довжиною приблизно 2,4 т. н., транскрипт довжиною приблизно 2,1 т.н. та транскрипт б довжиною приблизно 0,7 т. н.), які кодують сім вірусних білків (пре-51, пре-52, 5, Р, Х, пре-С та
С), що транслюються у трьох рамках зчитування.
На фігурах 2А-28 продемонстровано концентрації НВзЗАа (А) в сироватці крові (нг/мл) та (В) рівні НВ5Ад в сироватці крові щодо попередньої дози на мишачій моделі ААМ-НВУ. На фігурі 2А продемонстровано рівні НВ5зАд у сироватці крові мишей НВМУ-ААМ, яким попередньо вводили дозу (дні -24, -2, 0), або з наступною одноразовою дозою АЮ-81890, що становила 0,3, 1 або
З мг/кг (дні 14, 21, 33, 47, 59, 74). Кожна точка демонструє середнє значення, одержане для п-6- 9 тварин, та планки демонструють 50. На фігурі 28 продемонстровано рівні НВ5ЗАд у сироватці крові мишей НВМ-ААМ щодо попередньої дози (дні -24, -2, 0) або наступної одноразової дози
АО-81890, що становила 0,3, 1 або З мг/кг (дні 14, 21, 33, 47, 59, 74). Кожна точка демонструє середнє значення, одержане для п, що становило 6-9 тварин, та планки демонструють 50.
На фігурі З продемонстровано рівні НВ5ЗАд у сироватці крові щодо попередньої дози на мишачій моделі ААМ-НВМ в дні: -55, -27, -13, 0, 14, 28, 42, 56, 84, 112 та 140. Режими введення доз включали контроль (РВ5) О2ММ х 6; АО-66810 (1 мг/кг; О2ММ х 6); АО-81890 (1 мг/кг; О2УМ х 6);
АО-81890 (1 мг/кг; ОМ х 3); АО-81890 (З мг/кг; О2МУ х 6); АО-81890 (З мг/кг; ОМ х 3); та АЮ-81890 (9 мг/кг; ОМ х 1). Першу дозу вводили в день 0. Кожна точка демонструє середнє значення, одержане для п, що становило 4-6 тварин, та планки демонструють 50.
На фігурі 4 продемонстровано коробкові діаграми, на яких показана Іод2-кратна зміна (оброблені/контроль) для всіх генів, що істотно пригнічувались (кореговане р-значення « 0,05,
Іод2-кратна зміна «х 0) з АЮ-66810 або АО-81890. Товсті горизонтальні лінії демонструють медіанне значення Іод2-кратної зміни, вертикальний діапазон кожного блока демонструє міжквартильний діапазон (ОК) та вуса доходять до ч/-1,58 ІОК/5аг(М), де М являє собою кількість генів в кожній групі. Статистичну значимість оцінювали, використовуючи двосторонній двозразковий І-критерій Велча.
На фігурах 5А-58 продемонстровано рівні АТ в РХВ-мишах протягом часу після введення
АО-66810 (фігура 5А) або АЮ-81890 (фігура 58) щодо мишей, яким вводили РВ5. Мишам вводили дози в дні: 0, 21, 28, 35 та 42 з використанням 12, 36 або 100 мг/кг АЮ-66810, АО-81890 або РВЗ (контроль) за допомогою підшкірної ін'єкції (п-:4 на групу). Кров збирали за допомогою способу забору крові через ретроорбітальний синус двічі на тиждень і сироватку крові готували
Зо із використанням стандартних способів.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід передбачає композиції, що містять засіб на основі а5ЕМА, які впливають на розщеплення РНК-транскриптів гену вірусу гепатиту В (НВУ), опосередковане РНК-індукованим комплексом сайленсингу (КІЗС). Ген може перебувати всередині клітини, наприклад клітини всередині суб'єкта, такого як людина. Використання цих засобів на основі 45ЕМА сприяє націленому руйнуванню ткеМА відповідного гена (гена НВУ) у ссавців.
Засоби на основі а5ЕМА, описані в даному документі, розробили для націлювання на ділянки в геномі НВУ, які є консервативними серед щонайменше восьми відомих генотипів НВМ.
Крім того, засоби на основі 45КЕМА за даним винаходом розробили для інгібування всіх стадій життєвого циклу НВУ, наприклад реплікації, збирання, секреції вірусу та секреції субвірусних антигенів, шляхом інгібування експресії більше, ніж одного гена НВМ. Зокрема, оскільки в результаті транскрипції геному НВМ утворюються поліцистронні РНК, що перекриваються, у деяких варіантах здійснення засіб на основі а5ЕМА, спрямований на один ген НВУ, приводить до значного інгібування експресії більшості або всіх транскриптів НВУ. Наприклад, через те, що геном НВМ транскрибується в одну тЕКМА, засіб на основі Й5КМА за даним винаходом, спрямований на ген 5, приведе до інгібування експресії не тільки гена 5, а також експресії генів нижче на шляху полімерази. Також засоби на основі Д5ЕМА за даним винаходом розробили для інгібування вірусної реплікації НВМ за допомогою націлювання на структурні гени НВМ та ген Х
НВМУ, дозволяючи таким чином імунній системі суб'єкта виявляти й надавати відповідь на наявність НВ5ЗАд з виробленням антитіл до НВМ для усунення інфекції, спричиненої НВМУ. Не обмежуючись будь-якою теорією, вважають, що комбінація або підкомбінація вищезгаданих властивостей та специфічних цільових сайтів або специфічних модифікацій в цих засобах на основі а5ЕМА надають засобам на основі а5КМА за даним винаходом поліпшену ефективність, стабільність, безпечність, потужність та тривалість дії.
Використовуючи аналізи іп міїго та іп мімо, винахідники даного винаходу продемонстрували, що засоби на основі 85ЕМА, що спрямовані на ген НВУ, можуть дієво опосередковувати ЕМАЇ, що приводить до значного інгібування експресії більше, ніж одного гена НВМ. Таким чином, способи та композиції що включають такі засоби на основі а5ЕМА, є застосовними для лікування суб'єкта, що має інфекцію, спричинену НВУ, або асоційоване з НВМ захворювання, бо таке як хронічний гепатит В (СНВ).
Відповідно, даний винахід також передбачає способи для лікування суб'єкта, що має порушення, за якого інгібування або зниження експресії гена НВМ принесе користь, наприклад асоційоване з НВМ захворювання, таке як хронічну інфекцію, спричинену вірусом гепатиту В (СНВ), з використанням композицій, що містять засіб на основі а5КМА, які впливають на розщеплення РНК-транскриптів гену НВМ, опосередковане РНК-індукованим комплексом сайленсингу (КІЗС).
Засоби на основі Д5КМА за даним винаходом включають нитку РНК (антисенсову нитку), що містить ділянку комплементарності, довжиною приблизно 19-21 нуклеотид, наприклад довжиною приблизно 19 нуклеотидів, яка по суті є комплементарною щонайменше частині транскрипту ТЕМА гена НВУ зі щонайменше одного генотипу НВУ. Зрозуміло, що існує декілька генотипів НВУ, саме тому засіб на основі Д5КМА за даним винаходом можна змінювати за його ступенем комплементарності до різних генотипів НВУ.
У деяких варіантах здійснення сенсова й антисенсова нитки утворюють дуплекс із 19-21 суміжного нуклеотиду.
У подальшому детальному описі розкриваються принципи одержання та використання композицій, що містять засоби на основі а5хЕМА, для інгібування експресії гена НВУ, а також композиції, шляхи використання та способи лікування суб'єктів, які мають захворювання та порушення, за яких інгібування або зниження експресії гена НВМ принесе користь.
І. Визначення
Для того, щоб даний винахід можна було легше зрозуміти, спочатку наведені визначення певних термінів. Крім того, слід зазначити, що у всіх випадках, коли згадуються значення або діапазон значень параметра, мається на увазі, що значення та діапазони, проміжні щодо згаданих значень, також передбачаються як частина цього опису.
Якщо контекст не вимагає іншого, у всьому даному описі та формулі винаходу слово «передбачають» та його варіації, такі як «передбачає» і «що передбачає», мають тлумачитися у відкритому, всеохоплювальному значенні, тобто як «включає без обмеження». «Складається 3» означає виключення більше ніж слідової кількості елементів інших інгредієнтів або суттєвих стадій способів, розкритих у даному документі. Наприклад, полінуклеотид складається з послідовності нуклеотидів, якщо він не включає будь-які додаткові нуклеотиди, але не виключає включення ліганду, наприклад націлювального ліганду, або модифікацій. Термін «складається по суті 3» обмежує обсяг пункту формули описаними матеріалами або стадіями або тим, що не матеріально впливає на базові характеристики винаходу, що заявляється. Наприклад, фармацевтична композиція, яка складається по суті з елементів, визначених в даному документі, не виключає слідові кількості забруднювачів, що залишилися від способу виділення та очищення, і фармацевтично прийнятні носії, такі як фосфат-буферний сольовий розчин, консерванти тощо. Подібним чином, полінуклеотид складається по суті з послідовності нуклеотидів, якщо полінуклеотид включає додаткові нуклеотиди, які становлять не більше, ніж 20 96 довжини полінуклеотиду і суттєво не впливають на активність полінуклеотиду (наприклад, змінюють активність полінуклеотиду на не більше, ніж 50 95). Варіанти здійснення, описані кожним з перехідних термінів знаходяться в межах об'єму даного винаходу.
Форма однини використовується в даному документі для позначення одного або більше, ніж одного (тобто щонайменше одного) граматичного об'єкта продукту. Як приклад, «елемент» означає один елемент або більше, ніж один елемент, наприклад багато елементів.
Термін «що включає» використовується в даному документі для позначення фрази «що включає без обмеження» і використовується взаємозамінно з нею.
Термін «або» використовується в даному документі для позначення терміна «та/або», якщо контекст явно не вказує інше, і використовується взаємозамінно з ним. Наприклад, «сенсова нитка або антисенсова нитка» слід розуміти, як «сенсова нитка або антисенсова нитка або сенсова нитка й антисенсова нитка».
Термін «приблизно» використовується в даному документі для позначення перебування в межах типових у даній галузі техніки діапазонів припустимих значень. Наприклад, «приблизно» можна розуміти як перебування в межах 2 середньоквадратичних відхилень від середнього значення. Якщо «приблизно» розташоване перед послідовністю або діапазоном числових значень, слід розуміти, що «приблизно» може модифікувати кожне з числових значень в послідовності або діапазоні.
Термін «щонайменше» перед числовим значенням або послідовністю числових значень слід розуміти, як кожне число в послідовності та всі наступні числові значення або цілі числа, які логічно можуть бути включені, як зрозуміло з контексту. Наприклад, кількість нуклеотидів в молекулі нуклеїнової кислоти має бути цілим числом. Наприклад, «щонайменше 18 нуклеотидів бо молекули нуклеїнової кислоти з 21 нуклеотиду» означає, що 18, 19, 20 або 21 нуклеотид мають зазначену властивість. Якщо «щонайменше» розташоване перед послідовністю або діапазоном числових значень, слід розуміти, що «щонайменше» може модифікувати кожне з числових значень в послідовності або діапазоні.
Використовувані в даному документі «не більше ніж» або «менше ніж» розуміють як значення, сусіднє з фразою, та логічно менші значення або цілі числа, як логічно витікає з контексту, аж до нуля. Наприклад, дуплекс з «липким» кінцем «не більше ніж із 2 нуклеотидів» має «липкий» кінець із 2, 1 або 0 нуклеотидів. Якщо «не більше ніж» розташоване перед послідовністю або діапазоном числових значень, слід розуміти, що «не більше ніж» може модифікувати кожне з числових значень в послідовності або діапазоні.
Використовувані в даному документі діапазони включають у себе як верхню, так і нижню межу.
У разі суперечності між послідовністю та її зазначеним сайтом у транскрипті чи іншій послідовності нуклеотидна послідовність, згадана в даному описі, має переважне значення.
Різні варіанти здійснення даного винаходу можуть застосовуватися в комбінації так, як визначено фахівцем у даній галузі.
Використовуваний у даному документі «вірус гепатиту В», що застосовується взаємозамінно з терміном «НВУ», стосується добре відомого нецитопатичного тропного до печінки ДНК-вірусу, що належить до родини Нерайдпамігідає.
Геном НВМ являє собою частково двониткову кільцеву ДНК з рамками зчитування, що перекриваються (див., наприклад, фігуру 1).
За розміром існує чотири транскрипти (які в даному документі можуть називатися «генами» або «відкритими рамками зчитування»), які кодуються геномом НВУ. Вони містять відкриті рамки зчитування за назвою С, Х, Р та 5. Коровий білок кодується геном С (НВсАд). Антиген е вірусу гепатиту В (НВело) продукується шляхом протеолітичного процесингу прекорового білка (пре-С). ДНК-полімераза кодується геном Р. Ген 5 являє собою ген, який кодує поверхневі антигени (НВ5ЗАд). Ген НВ5ЗАд являє собою одну довгу відкриту рамку зчитування, яка містить три внутрішньорамкові «стартові» (АТО) кодони, що зумовлюють утворення поліпептидів трьох різних розмірів, які називаються великим, середнім та малим антигенами 5: пре-51 ж пре-52 5, пре-52 ж 5 або 5. Поверхневі антигени, крім того, що вони декорують оболонку НВУ, також є
Зо частиною субвірусних частинок, які продукуються з великим надлишком порівняно з віріонними частинками і відіграють роль в імунній толерантності та у відокремленні антитіл до НВзЗАд, завдяки чому забезпечується можливість уникнення виявлення інфекційних частинок імунною системою. Функція неструктурного білка, кодованого геном Х, є не повністю зрозумілою, але він відіграє роль у трансактивації транскрипції та реплікації і асоційований з розвитком раку печінки.
НВУ є одним з небагатьох ДНК-вірусів, які використовують зворотну транскриптазу в процесі реплікації, яка передбачає декілька стадій, у тому числі проникнення до клітини, скидання оболонки та транспортування вірусного геному до ядра. Спочатку реплікація геному НВМУ передбачає утворення проміжної РНК, яка потім піддається зворотній транскрипції з продукуванням вірусного ДНК-геному.
Після інфікування клітини НВМ вірусна геномна розслаблена кільцева ДНК (гОМА) транспортується в ядро клітини і перетворюється на епісомну ковалентно замкнену кільцеву
ДНК (сссрМА), яка служить матрицею транскрипції для вірусних ткМА. Після транскрипції та ядерного експорту цитоплазматична вірусна прегеномна РНК (рокМА) збирається за допомогою полімерази НВМ та капсидних білків з утворенням нуклеокапсиду, всередині якого в ході зворотної транскрипції, каталізованої полімеразою, утворюється мінус-ниткова ДНК, яка згодом копіюється у вигляді плюс-ниткової ДНК з утворенням гсОМА-геному потомства. Потім зрілі нуклеокапсиди або упаковуються з вірусними білками оболонки з виходом у вигляді віріонних частинок, або переносяться до ядра для ампліфікації резервуару сссОМА через шлях ампліфікації внутрішньоклітинної сссОМА. сссОМА являє собою важливу складову циклу реплікації НВМУ і відповідає за впровадження інфекції та персистенцію вірусу.
Інфекція, спричинена НВУ, приводить до утворення двох різних типів частинок: 1) самого інфекційного вірусу НВМ (або частинки Дейна), який включає в себе вірусний капсид, зібраний з
НВсАд та вкритий оболонкою, що складається з ліпідної мембрани з поверхневими антигенами
НВУ, та 2) субвірусних частинок (або ЗМР), які містять малу та середню форми поверхневого антигена НВ5ЗАд вірусу гепатиту В, які не є інфекційними. На кожну продуковану вірусну частинку в кров вивільняється понад 10000 5УР. Таким чином, ЗУР (та білок НВ5АЯд, який вони несуть) складають переважну більшість вірусного білка в крові. Клітини, інфіковані НВУМУ, також секретують розчинний продукт протеолізу прекорового білка, який називається антигеном е
НВМ (НВедо). 60 Визначено вісім генотипів НВМ, позначених від А до Н, та запропоновано два додаткові генотипи | та у), кожен з яких має чітко визначене географічне поширення. Цей вірус є нецитопатичним, при цьому вірусоспецифічний клітинний імунітет є головним визначним чинником результату впливу гострої інфекції, спричиненої НВМУ, з усуненням захворювань печінки протягом 6 місяців або хронічної інфекції, спричиненої НВУ, яка часто асоційована з прогресуючим ураженням печінки.
Термін «НВМ» включає в себе будь-який з генотипів НВМ (від А до .)). Повну кодувальну послідовність еталонної послідовності геному НВМ можна знайти, наприклад, під номерами доступу в СепВапк с1І:21326584 (5БО ІЮ МО:1) та б1І:3582357 (5БО ІЮО МО:3). Антисенсові послідовності представлені під ЗЕО І МО:2 та 5ЕБО ІЮО МО:4 відповідно. Амінокислотні послідовності для білків С, Х, Р та 5 можна знайти, наприклад, в МСВІ під номерами доступу
УР 009173857.1 (білок С) (ЗЕО ІО МО:37); МР 009173867.1 та ВААЗ2912.1 (білок Х) (ЗЕО ІЮ
МО: 36 та 40); МР 009173866.1 та ВААЗ2913.1 (білок Р) (ЗЕБЕО І МО:32 та 38) та
УР 009173869.1, УР 009173870.1, МР. 009173871.1 та ВААЗ32914.1 (білок 5) (ЗЕО ІЮ МО: 33, 34, 35, 39). Послідовності білків та ДНК з генотипу ОЮО НВМ штаму аум представлені під ЗЕО ІЮ МО: 36-37. Послідовності білків та ДНК з генотипу С НВМ представлені під ЗЕО ІЮ МО: 38-39.
Додаткові приклади послідовностей білків та ДНК НВМ або їх зворотні комплементарні послідовності представлені під ЗЕО ІЮ МО: 41-49.
Додаткові приклади послідовностей тЕкМА НВМ є легкодоступними в загальнодоступних базах даних, наприклад, сепВапк, ОпіРгої та ОМІМ. Міжнародний репозиторій даних про штами вірусу гепатиту В доступний на пЕр:/Лумли.пра-ріоіпгогтаїісв.огу икК/НерозЕб/таїп.ргр.
Термін «НВМ», використовуваний у даному документі, також стосується варіантів послідовності ДНК геному НВМ, що зустрічаються в природі, наприклад генотипів А-У та їх варіантів.
Використовуваний в даному документі «вірус гепатиту Ю», що застосовується взаємозамінно з терміном «НОМ», стосується добре відомого нецитопатичного тропного до печінки ДНК-вірусу, що належить до родини Нераапамігідаеє. Див., наприклад, Сіапсіо апа Кі77ено, Маї. Кем. 11:68- 71, 2014; Ге Саї єї аІ., Етега. Іп'есі. Сів. 12:1447-1450, 2006; та Арбах апа Агїзаї, Умопа .. Нер., 5:666-675, 2013, кожне з яких включене за допомогою посилання. Якщо не вказано інше, НОМ стосується всіх клад і варіантів НОМ.
Зо НОМ продукує один білок, названий НОАд. Він з'являється у двох формах; 27 кДа великий-
НОАЗ (також позначається як ІНО, Г-НОАд та великий НОМ-антиген) та малий-НОАЯ, 24 кДа (також позначається як 5НО, 5-НОАд та малий НОМ-антиген). М-кінці двох форм є ідентичними; вони відрізняються 19 амінокислотами на С-кінці великого НОАд. Обидві ізоформи одержуються з тієї самої рамки зчитування, яка містить стоп-кодон ШШАС в 196 кодоні, та зазвичай з неї продукується тільки малий-НОАЯ. Однак, редагування за допомогою клітинного ферменту аденозин-дезамінази-1 змінює стоп-кодон на СО, дозволяючи продукуватися великому-НОАа.
Незважаючи на те, що вони характеризуються на 90 95 ідентичними послідовностями, ці два білки відіграють протилежну роль під час протікання інфекції. НОАд-5 продукується на ранніх стадіях інфекції, та потрапляє до ядра, та підтримує реплікацію вірусу. НОАО-Ї, навпаки, продукується на пізніх стадіях інфекції, діє як інгібітор реплікації вірусу, та він потрібен для складання вірусних частинок.
Додаткові приклади послідовностей тЕеЕМА НОМ є легкодоступними в загальнодоступних базах даних, наприклад сСепВапк, ОпіРгої та ОМІМ.
Термін «НОМ», використовуваний у даному документі, також стосується варіантів послідовності ДНК геному НОМ, що зустрічаються в природі.
Використовуваний у даному документі термін «аналог нуклеотиду(нуклеозиду)» або «інгібітор зворотної транскриптази» означає інгібітор реплікації ДНК, який є структурно подібним до нуклеотиду або нуклеозиду та специфічно інгібує реплікацію СССОМА НВУ і не суттєво інгібує реплікацію ДНК хазяїна (наприклад, людини). Такі інгібітори включають тенофовіру дизопроксилу фумарат (ТОР), тенофовіру алафенамід (ТАК), ламівудин, адефовіру дипівоксил, ентекавір, (ЕТМ), телбівудин, АСХ-1009, емтрицитабін, клевудин, ритонавір, дипівоксил, лобукавір, фамвір, ЕТС, М-ацетилцистеїн (МАС), РС1323, терадигм-НВУ, тимозин-альфа, ганцикловір, безифовір (АМА-380/ 8-80380) та тенофовір-ексалідекс (ТІ Х/СМХ157). У певних варіантах здійснення аналог нуклеотиду(нуклеозиду) являє собою ентекавір (ЕТМ). Аналоги нуклеотидів(нуклеозидів) є комерційно доступними з низки джерел та застосовуються у способах, представлених у даному документі, за показаннями згідно з їх інструкцією із використання (наприклад, зазвичай вводяться перорально у певній дозі) або як визначено кваліфікованим фахівцем у галузі лікування НВУ.
Використовувана в даному документі «цільова послідовність» стосується неперервної бо частини нуклеотидної послідовності молекули ткМА, яка утворюється в процесі транскрипції гена НВУ, зокрема ткМА, яка є продуктом процесингу РНК первинного продукту транскрипції. У деяких варіантах здійснення цільова частина послідовності буде щонайменше достатньо довгою, щоб служити субстратом для спрямовуваного засобом на основі а5КМА розщеплення в цій частині або поряд з цією частиною нуклеотидної послідовності молекули тКМА, яка утворюється в процесі транскрипції гена НВУ.
Цільова послідовність може мати довжину приблизно від 19 до 21 нуклеотиду, наприклад довжину 19, 20 або 21 нуклеотид.
Використовуваний у даному документі термін «нитка, що містить послідовність» стосується олігонуклеотиду, що містить ланцюг з нуклеотидів, який описується послідовністю, згадуваною із використанням стандартної номенклатури нуклеотидів.
Кожен з «ОС», «С», «А», «Т» і «ОО», зазвичай, означає нуклеотид, який як основу містить відповідно гуанін, цитозин, аденін, тимідин і урацил. Однак, буде зрозуміло, що термін «рибонуклеотид» або «нуклеотид» також може стосуватися модифікованого нуклеотиду, який більш детально описаний нижче, або імітувального замінного фрагмента (див., наприклад, таблицю 1). Фахівцю в даній галузі добре відомо, що гуанін, цитозин, аденін і урацил можуть бути замінені іншими фрагментами без суттєвої зміни властивостей спарювання основ олігонуклеотиду, який містить нуклеотид, що несе такий замінний фрагмент. Наприклад, без обмеження, нуклеотид, що містить інозин як основу, може утворювати пару основ з нуклеотидами, які містять аденін, цитозин або урацил. Отже, нуклеотиди, що містять урацил, гуанін або аденін, можуть бути замінені в нуклеотидних послідовностях 5КМА, описаних у даному винаході, нуклеотидами, які містять, наприклад, інозин. В іншому прикладі аденін і цитозин в будь-якому місці в олігонуклеотиді можуть бути замінені відповідно гуаніном і урацилом з утворенням неоднозначних пар основ 5-) з цільовою тЕМА. Послідовності, що містять такі замінні фрагменти, є придатними для композицій і способів, описаних у даному винаході.
Терміни «засіб на основі а5КМА», «засіб для КМАЇ», «засіб на основі ІКМА» та «засіб для
РНК-інтерференції», що використовуються в даному документі взаємозамінно, стосуються засобу, котрий містить РНК у тому значенні, в якому даний термін визначено в даному документі, і який опосередковує цілеспрямоване розщеплення РНК-транскрипту через шлях за
Зо участю РНК-індукованого комплексу сайленсингу (КІЗС). Засіб на основі а5ЕМА направляє специфічне щодо послідовності руйнування тЕкКМА за допомогою процесу, відомого як РНК- інтерференція (ЕМАЇї). Засіб на основі О5КМА модулює, наприклад інгібує, експресію гена НВМ (наприклад, одного або більше генів НВМ) в клітині, наприклад клітині в організмі суб'єкта, такого як суб'єкта-ссавця. «Засіб на основі а5КМА» для використання в композиціях, шляхах використання та способах, розкритих у даному документі являє собою двониткову РНК, і в даному документі її називають «засіб на основі а5ЕМА», «засіб на основі двониткової РНК», «молекула двониткової
РНК (азЕМА)», «а5КМА», «ІКМА», «засіб на основі ікМА», «засіб на основі а5ЕМАЇ», «засіб для
ЕМАЇї» або «5ікМА». Термін «А85еЕМА» стосується комплексу молекул рибонуклеїнової кислоти з дуплексною структурою, що містить дві антипаралельні та по суті комплементарні нитки нуклеїнової кислоти, котрі розглядаються як такі що мають «сенсову» і «антисенсову» орієнтації щодо цільової РНК, тобто гена НВУ. У деяких варіантах здійснення даного винаходу а5хКМА запускає руйнування цільової РНК, наприклад тКМА, через пост-транскрипційний механізм сайленсингу генів, що називається у даному документі РНК-інтерференцією або ЕМАЇ.
Зазвичай, кожна нитка молекули а5КМА може містити рибонуклеотиди, але, як докладно описано в даному документі, кожна нитка або обидві нитки також можуть містити один або більше нуклеотидів, відмінних від рибонуклеотидів, наприклад дезоксирибонуклеотид або модифікований нуклеотид. Крім того, використовуваний у даному описі «засіб на основі аБЗКМА» може включати рибонуклеотиди з хімічними модифікаціями; засіб на основі Д5ЕМА може включати суттєві модифікації багатьох нуклеотидів. Використовуваний у даному документі термін «модифікований нуклеотид» стосується нуклеотиду, який незалежно має модифікований цукровий фрагмент, модифікований міжнуклеотидний зв'язок або модифіковану нуклеїнову основу. Таким чином, термін «модифікований нуклеотид» охоплює заміни, додавання або видалення, наприклад функціональної групи або атома, в міжнуклеозидних зв'язках, цукрових фрагментах або нуклеїнових основах. Модифікації, придатні для використання в засобах за даним винаходом включають усі типи модифікацій, розкритих у даному документі або відомих з рівня техніки. Будь-які такі модифікації, які використовуються в молекулі типу засобу на основі а5зКМА, охоплені терміном «засіб на основі а5КМА» в контексті даних опису та формули винаходу. бо Термін «інгібування», використовуваний у даному документі, використовують взаємозамінно зі «зниженням», «сайленсингом», «знижувальною регуляцією», «пригніченням» та іншими подібними термінами, і він включає будь-який рівень інгібування. Інгібування переважно включає статистично значуще або клінічно значуще інгібування.
Фраза «інгібування експресії НВУ» або «інгібування експресії гена НВУ», використовувана в даному документі, включає інгібування експресії будь-якого гена НВМ (наприклад, гена НВМ, що експресується з НВМ під час інфікування вірусом НВУ, гена НВМ, що експресується з експресійної конструкції в клітині), а також варіантів або мутантних форм гена НВУ, що кодують білок НВУ. Терміни включають нокдаун будь-якого транскрипту НВМ (наприклад, транскрипту, довжиною 3,5т.н., 2,4 т. н., 2,1 т. н. або 0,7 т. н.), що кодує один або більше вірусних білків НВМ (таких як, наприклад, рге51/2-5, ргеб, 5, Р, Х, ргес та С), а також варіантів або мутантних форм гена НВУ. «Інгібування експресії гена НВМ» включає будь-який рівень інгібування гена НВМ або транскрипту, наприклад щонайменше часткове пригнічення експресії гена НВУ, наприклад гена 5, Р, Х або С НВМУ або будь-якої їх комбінації, наприклад 5, Р та С. Експресію гена НВМ можна оцінювати, виходячи з рівня або зміни рівня будь-якої змінної, асоційованої з експресією гена
НВУ, наприклад рівня ткМА НВУ, або рівня білка НВМ або рівня сссОМА НВУ. Цей рівень можна оцінювати в окремій клітині або в групі клітин, зокрема, наприклад, у зразку, одержаному від суб'єкта, наприклад, рівні можна відстежувати у сироватці крові. Інгібування можна оцінювати за зниженням абсолютного або відносного рівня однієї або більше з цих змінних порівняно з контрольним рівнем. Контрольний рівень може являти собою будь-який тип контрольного рівня, який використовують у даній галузі, наприклад рівень у початковий момент часу до введення дози або рівень, визначений у подібного суб'єкта, або середній по популяції з придатного контрольного суб'єкта, клітини або зразка, які є необробленими або обробленими контролем (наприклад, контроль тільки з буфером або контроль з неактивним засобом).
У деяких варіантах здійснення способів за даним винаходом, експресія гена НВМУ інгібується на щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, наприклад, у суб'єкта на щонайменше 1 од 10, 2 Ід 10, З Іюд 10 або 4 од 10 або до рівня, нижчого ніж той, який можна виявити конкретним аналізом. У переважних варіантах здійснення інгібування експресії гена НВМ у суб'єкта приводить до клінічно значущого інгібування рівня експресії гена, наприклад інгібування, достатнього для надання можливості розвитку ефективної імунної відповіді щодо білка НВМ, або якщо його вводять окремо або в комбінації з іншими засобами з метою викликати імунну відповідь або посилити її.
В аналізі на основі клітин іп мійго або в моделі експресії гетерологічних генів іп мімо, наприклад мишачій моделі ААМ-ПНВУ, описаній у даному документі, переважним є інгібування загальної експресії НВМ на щонайменше 90 95, наприклад щонайменше 1 од 10, 2 Іод10 або З 0910. Під час лікування суб'єкта з інфекцією, спричиненою НВУ, переважним є зменшення на щонайменше 90 95 рівня гена або білка НВУ, тобто різниця рівня гена або білка НВМ перед і після лікування. Може бути потрібною більше, ніж одна доза для досягнення необхідного рівня інгібування.
Інгібування експресії гена НВМ може проявлятися як зниження кількості РНК, що експресується першою клітиною або групою клітин (такі клітини можуть бути присутніми, наприклад, у зразку, одержаному від суб'єкта), в яких транскрибується ген НВУ і яку або які обробляли (наприклад, шляхом приведення клітини або клітин у контакт із засобом на основі а5зКМА за даним винаходом або шляхом уведення засобу на основі ахЕМА за даним винаходом суб'єкту, в організмі якого клітини є чи були присутніми) таким чином, щоб експресія гена НВМ інгібувалася, порівняно з другою клітиною або групою клітин, по суті ідентичних першій клітині або групі клітин, але яку або які не обробляли (контрольною(ими) клітиною(ами)). У переважних варіантах здійснення інгібування оцінюють за допомогою способу КТ-РСК, представленого в прикладі 2 з УМО 2016/077321 (спосіб з якої включений у даний документ за допомогою посилання), при цьому аналізи іп міго проводять у відповідним чином підібраній лінії клітин з дуплексом у концентрації 10 нМ, і рівень тЕМА в оброблених клітинах виражають у вигляді відсоткової частки від рівня ТЕМА в контрольних клітинах із використанням наступної формули: (птАМАвконтрольних клітинах) - (пАМАоброблених клітинах) 40095 (пАМАвконтрольних клітинах)
Як альтернатива, інгібування експресії гена НВМ можна оцінювати за зниженням параметра, який функціонально пов'язаний з експресією гена НВУ. Сайленсинг гена НВМ можна виявити в будь-якій клітині, що експресує ген НВМ конститутивно або за допомогою генної інженерії, і за допомогою будь-якого аналізу, відомого з рівня техніки.
Інгібування експресії білла НВМ може проявлятися як зниження рівня білка НВУ, який експресується клітиною або групою клітин (наприклад, рівня білка, експресованого у зразку, одержаному від суб'єкта). Як пояснюється вище стосовно оцінки пригнічення експресії теМА, інгібування рівнів експресії білка в обробленій клітині або групі клітин може аналогічним чином бути виражене у вигляді відсоткової частки від рівня білка в контрольних клітині або групі клітин або у сироватці крові.
Контрольні клітина або група клітин, які можна застосовувати для оцінки інгібування експресії гена НВУ, включають клітину або групу клітин, які ще не були приведені в контакт із засобом на основі Д5КМА за даним винаходом. Наприклад, контрольні клітина або група клітин можуть бути одержані від окремого суб'єкта (наприклад, суб'єкта-людини або суб'єкта-тварини) перед лікуванням суб'єкта за допомогою засобу на основі 45ЕМА. В альтернативних варіантах здійснення рівень можна порівнювати з відповідним контрольним зразком, наприклад контрольним зразком з відомої популяції.
Рівень РНК НВУ, яка експресується клітиною або групою клітин, або рівень РНК НВУ, що циркулює, можна визначати за допомогою будь-якого відомого з рівня техніки способу оцінки експресії те МА, переважно за допомогою способу КТ-РСЕ, представленого в прикладі 2 з
МО 2016/077321. У деяких варіантах здійснення рівень експресії гена НВМ (наприклад, загальної РНК НВУ, транскрипту НВУ, наприклад транскрипту НВМ розміром 3,5 т. н.) у зразку визначають шляхом виявлення транскрибованого полінуклеотиду або його частини, наприклад
РНК гена НВУ. РНК можна екстрагувати з клітин за допомогою методик екстракції РНК, зокрема, наприклад, екстракції за допомогою кислого фенолу/гуанідинізотіоці«анату (КМА7о! В;
Віодепевзі5), наборів для одержання РНК КМеазу (ОіадепФ) або РАХдепе (РгеАпаїуїїх,
Швейцарія). Типові формати аналізів, в яких використовують гібридизацію рибонуклеїнових кислот, включають ядерні кінетичні аналізи, КТ-РСЕ, аналізи із захистом від дії РНКаз (Меїюп єї а!І., Мис. Асід5 Ке5. 12:7035), нозерн-блотинг, гібридизацію іп 5йи і мікроматричні аналізи. пЕМА
НВМУ, що циркулює, можна виявляти із використанням способів, описаних у УУО 2012/177906, способи з якої включені в даний документ за допомогою посилання.
У деяких варіантах здійснення рівень експресії гена НВМ визначають із використанням зонда на основі нуклеїнової кислоти. Термін «зонд», використовуваний у даному документі, стосується
Зо будь-якої молекули, здатної селективно зв'язуватися з конкретним геном НВУ. Зонди можуть бути синтезовані фахівцем у даній галузі або одержані з відповідних біологічних препаратів.
Зонди можуть бути спеціально сконструйовані таким чином, щоб вони були міченими. Приклади молекул, які можна використовувати як зонди, включають без обмеження РНК, ДНК, білки, антитіла та органічні молекули.
Виділену РНК можна використовувати для аналізів з гібридизацією або ампліфікацією, що включають без обмеження нозерн-блот-аналізи, аналізи шляхом полімеразної ланцюгової реакції (РСК) та аналізи із використанням матриць із зондами. Один спосіб визначення рівнів тЕМА передбачає приведення виділеної ТЕМА у контакт з молекулою нуклеїнової кислоти (зондом), яка може гібридизуватися з тЕеЕМА НВМ. У деяких варіантах здійснення ткекМА іммобілізують на твердій поверхні та приводять у контакт із зондом, наприклад, шляхом пропускання виділеної тРЕМА через агарозний гель і перенесення теМА з гелю на мембрану, таку як нітроцелюлозна. У деяких інших варіантах здійснення зонд(и) іммобілізують на твердій поверхні, і тЕеМА приводять у контакт із зондом(ами), наприклад, на матриці СепесСпВірФ від
АпПутеїгіх. Фахівець у даній галузі може легко адаптувати відомі способи виявлення ткКМА для використання у визначенні рівня тЕМА НВМУ.
Альтернативний спосіб визначення рівня експресії гена НВМ у зразку передбачає процес ампліфікації або зворотної транскрипції (з одержанням СсОМА) нуклеїнової кислоти, наприклад тТЕМА, у зразку, наприклад, за допомогою КТ-РСК (експериментальний варіант здійснення викладено у Миїїї5, 1987, патент США Мо 4683202), лігазної ланцюгової реакції (Вагапу (1991)
Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 88:189-193), самопідтримувальної реплікації послідовностей (спагеїЇ еї аї. (1990) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 87:1874-1878), транскрипційної ампліфікаційної системи (Кун еї а. (1989) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 86:1173-1177), О-бета-реплікази (І ігагаї еї аї. (1988)
Віо/ТесппоЇоду 6:1197), реплікації за механізмом «кільця, що котиться» (і ігагаї еї аї., патент
США Мо 5854033) або будь-якого іншого способу ампліфікації нуклеїнової кислоти з наступним виявленням ампліфікованих молекул за допомогою методик, добре відомих фахівцям у даній галузі. Ці схеми виявлення є особливо застосовними для виявлення молекул нуклеїнової кислоти, якщо такі молекули присутні в дуже малих кількостях. У конкретних аспектах даного винаходу рівень експресії гена НВМ визначають за допомогою кількісної КТ-РСК з флуорогенними зондами (тобто системи ТадМап'"М), наприклад із використанням способу, 60 представленого в даному документі.
Рівні експресії РНК НВМ можна відстежувати за допомогою мембранного блоту (як, наприклад, застосовуваний в аналізі за методом гібридизації, такого як нозерн-, дот-блот тощо) або мікролунок, пробірок для зразків, гелів, гранул або волокон (або будь-якої твердої основи, що містить зв'язані нуклеїнові кислоти). Див. патенти США МоМео 5770722, 5874219, 5744305, 5677195 та 5445934, які включені в даний документ за допомогою посилання щодо ідей, що мають відношення до таких способів. Визначення рівня експресії НВМ може також включати використання зондів на основі нуклеїнових кислот у розчині.
У переважних варіантах здійснення рівень експресії РНК оцінюють із використанням ПЛР у режимі реального часу (ДАРСК). Використання таких способів описане та проілюстроване в прикладі 2 з ММО2016/077321.
Рівень експресії білка НВМ можна визначити за допомогою будь-якого способу вимірювання рівнів білка, відомого з рівня техніки. Такі способи включають, наприклад, електрофорез, капілярний електрофорез, високоефективну рідинну хроматографію (НРІС), тонкошарову хроматографію (ТІ С), гіпердифузійну хроматографію, реакції преципітації в рідині або гелі, абсорбційну спектроскопію, колориметричні аналізи, спектрофотометричні аналізи, проточну цитометрію, імунодифузію (одиночну або подвійну), імуноелектрофорез, вестерн-блотинг, радіоїмунологічний аналіз (КІА), твердофазні імуноферментні аналізи (ЕГІЗА), імунофлуоресцентні аналізи, електрохемілюмінесцентні аналізи тощо.
Засоби на основі О5КМА
Дуплексна ділянка може бути будь-якої довжини, яка сприяє специфічному руйнуванню необхідної цільової РНК через КІЗС-шлях, та її довжина може знаходитись в діапазоні від приблизно 19-21 пари основ, наприклад довжина може становити приблизно 19, 20 або 21 пару основ. Ілюстративні засоби на основі а5КМА, описані в даному документі, включають довжини дуплексів, що становлять 19-21 пару основ.
Якщо дві по суті комплементарні нитки 45КЕМА утворені з окремих молекул РНК, то ці молекули не обов'язково повинні, але можуть бути з'єднані ковалентно. Якщо дві нитки з'єднані ковалентно іншим чином, ніж непереривним ланцюгом з нуклеотидів від 3'-кінця однієї нитки до 5-кінця відповідної іншої нитки, які утворюють дуплексну структуру, то з'єднувальну структуру називають «лінкером». Нитки РНК можуть мати однакову або різну кількість нуклеотидів.
Зо Максимальна кількість пар основ являє собою кількість нуклеотидів у найкоротшій нитці О5КМА за винятком будь-яких липких кінців, присутніх у дуплексі. Крім дуплексної структури засіб на основі а5ЕМА може передбачати один або більше нуклеотидних липких кінців.
Використовуваний у даному документі термін «нуклеотидний липкий кінець» стосується щонайменше одного неспареного нуклеотиду, який виступає з дуплексної структури двониткового засобу на основі а5ЕМА. Наприклад, якщо 3'-кінець однієї нитки 45ЕМА виходить за межі 5"-кінця іншої нитки або навпаки, то утворюється нуклеотидний липкий кінець. 45ЕМА може містити липкий кінець щонайменше з одного нуклеотиду; як альтернатива, липкий кінець може містити два нуклеотиди. Нуклеотидний липкий кінець може містити аналог нуклеотиду/нуклеозиду, зокрема дезоксинуклеотиду/нуклеозиду, або складатися 3 нього.
Липкиййі) кінець(кінці) може(можуть) розташовуватися у сенсовій нитці, антисенсовій нитці або будь-якій їх комбінації. Крім того, нуклеотид(и) липкого кінця може(можуть) бути присутнім(и) на
Б'-кінці, 3"-кінці або обох кінцях антисенсової або сенсової нитки а5ЕМА. У переважному варіанті здійснення липкий кінець наявний на 3'-кінці антисенсової нитки. «Затуплений кінець» або «тупий кінець» означає, що на кінці двониткового засобу на основі азЕМА немає неспарених нуклеотидів, тобто немає нуклеотидного липкого кінця. Засіб на основі а5ЕМА з «тупими кінцями» являє собою азкМА, яка є двонитковою по всій довжині, тобто не має нуклеотидного липкого кінця на будь-якому кінці молекули. У деяких варіантах здійснення засоби на основі а5ЕМА за даним винаходом включають засоби на основі а5ЕМА з нуклеотидним липким кінцем на одному кінці (тобто засоби з одним липким кінцем і одним тупим кінцем) або з нуклеотидними липкими кінцями на обох кінцях.
Термін «антисенсова нитка» або «спрямовувальна нитка» стосується нитки засобу на основі а5КМА, яка містить ділянку, по суті комплементарну цільовій послідовності, наприклад текМА
НВУ. Використовуваний в даному документі термін «ділянка комплементарності» стосується ділянки антисенсової нитки, яка є по суті комплементарною послідовності, наприклад цільовій послідовності, наприклад нуклеотидній послідовності НВМ, визначеній в даному документі.
Якщо ділянка комплементарності не повністю комплементарна цільовій послідовності, то помилкові спарювання можуть розташовуватися у внутрішніх або кінцевих ділянках молекули.
Зазвичай, найбільш допустимі помилкові спарювання знаходяться в кінцевих ділянках, наприклад в межах 5, 4, 3, 2 або 1 нуклеотиду 5'- або 3-кінця засобу на основі Д5ЕКМА. У деяких 60 варіантах здійснення засіб на основі 45ЕМА за даним винаходом передбачає помилкове спарювання нуклеотидів в антисенсовій нитці. У деяких варіантах здійснення засіб на основі а5зКМА за даним винаходом передбачає помилкове спарювання нуклеотидів в сенсовій нитці. У деяких варіантах здійснення помилкове спарювання нуклеотидів знаходиться, наприклад, в межах 5, 4, 3, 2 або 1 нуклеотиду від 3'-кінця засобу на основі Д5ЕМА. У деяких варіантах здійснення помилкове спарювання нуклеотидів знаходиться, наприклад, в межах 3'-кінцевого нуклеотиду засобу на основі а5ЕКМА.
Термін «сенсова нитка» або «супровідна нитка», використовуваний у даному документі, стосується нитки засобу на основі а5КМА, що включає ділянку, яка є по суті комплементарною ділянці антисенсової нитки, як цей термін визначений у даному документі.
Використовуваний у даному документі, і якщо не вказане інше, термін «комплементарний» при використанні для опису першої нуклеотидної послідовності щодо другої нуклеотидної послідовності означає здатність олігонуклеотиду або полінуклеотиду, що містить першу нуклеотидну послідовність, гібридизуватися й утворювати дуплексну структуру за певних умов з олігонуклеотидом або полінуклеотидом, що містить другу нуклеотидну послідовність, як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі. Наприклад, такі умови можуть являти собою жорсткі умови, де жорсткі умови можуть включати 400 мМ Масі, 40 мМ РІРЕЗ5, рН 6,4, 1 мМ ЕОТА, 509С або 7090 протягом 12-16 годин з наступним промиванням (див., наприклад, "МоІесшіаг Сіопіпд: А
ІГарогаїогу Мапиа!І, ЗатргооК, еї аїЇ. (1989) Соїй Зргіпд Нагрог Іарогаогу Рге55). Можна застосовувати інші умови, такі як фізіологічно відповідні умови, характерні для організму.
Фахівець у даній галузі зможе визначити набір умов, найбільш придатних для тестування комплементарності двох послідовностей відповідно до кінцевого використання гібридизованих нуклеотидів.
Комплементарні послідовності в межах засобу на основі а5КМА, наприклад в межах засобу на основі азКМА, описаного в даному документі, включають утворення пар основ олігонуклеотиду або полінуклеотиду, що містить першу нуклеотидну послідовність, з олігонуклеотидом або полінуклеотидом, який містить другу нуклеотидну послідовність, по всій довжині однієї або обох нуклеотидних послідовностей. Такі послідовності можуть бути вказані в даному документі як «повністю комплементарні»х щодо одна одної. Однак, якщо в даному документі перша послідовність зазначена як «по суті комплементарна» щодо другої послідовності, дві послідовності можуть бути повністю комплементарними, або вони можуть утворювати одну або більше, але, як правило, не більше 4, 3, або 2 помилково спарених пар основ під час гібридизації з утворенням дуплексу, довжиною до 21 пари основ, із збереженням при цьому здатності гібридизуватися за умов, найбільш відповідних їх кінцевому використанню, наприклад інгібуванню експресії гена за допомогою КіЗС-шляху. Однак, якщо два олігонуклеотиди призначені для утворення в разі гібридизації одного або більше однониткових липких кінців, такі липкі кінці не будуть вважатися помилковими спарюваннями щодо визначення комплементарності. Наприклад, засіб на основі а5зКМА, що містить один олігонуклеотид довжиною 21 нуклеотид та інший олігонуклеотид довжиною 23 нуклеотиди, де довший олігонуклеотид містить послідовність із 21 нуклеотиду, яка повністю комплементарна коротшому олігонуклеотиду, може бути названий як «повністю комплементарний» для цілей, описаних у даному документі. «Комплементарні» послідовності, використовувані у даному документі, можуть також включати або можуть бути утворені повністю з пар основ, утворених не за моделлю Уотсона-
Кріка, або пар основ, утворених із нуклеотидів, що не існують у природі, і модифікованих нуклеотидів, у такій мірі, за якої виконуються вищевказані вимоги щодо їх здатності гібридизуватися. Такі пари основ, утворені не за моделлю Уотсона-Кріка, включають без обмеження неоднозначні 5: або Хугстинівські пари основ.
Терміни «комплементарний», «повністю комплементарний» і «по суті комплементарний» у даному документі можна використовувати щодо збігу основ між сенсовою ниткою й антисенсовою ниткою а5КМА, або між антисенсовою ниткою засобу на основі а5ЕМА і цільовою послідовністю, як буде зрозуміло з контексту їх використання. Зрозуміло, що відомі декілька генотипів НВУ. Таким чином, засіб на основі азхКМА, сконструйований таким чином, щоб він був повністю комплементарним до одного з генотипів НВМ, може бути не повністю комплементарним до всіх генотипів НВУ. Засіб на основі 45ЕМА, що націлений на специфічний сайт, є ефективним щодо цільового нокдауну серед декількох генотипів без того, щоб бути повністю комплементарним серед усіх генотипів.
Використовуваний у даному документі полінуклеотид, що є «по суті комплементарним щонайменше частині» матричної РНК (птКМА), стосується полінуклеотиду, який є по суті комплементарним неперервній частині ткМА, що становить інтерес (наприклад, ткМА, яка бо кодує ген НВМ). Наприклад, полінуклеотид є комплементарним щонайменше частині ткиМА
НВУ, якщо послідовність є по суті комплементарною безперервній частині ТЕМА, що кодує ген
НВУ.
Відповідно, у деяких варіантах здійснення полінуклеотиди антисенсової нитки, розкриті в даному документі, є повністю комплементарними цільовій послідовності НВМ. У деяких інших варіантах здійснення полінуклеотиди антисенсової нитки, розкриті в даному документі, є по суті комплементарними цільовій послідовності НВМ та включають неперервну нуклеотидну послідовність, яка характеризується щонайменше 80 95 комплементарністю по всій своїй довжині з еквівалентною ділянкою нуклеотидної послідовності під 5ЕО ІЮ МО:1 або фрагментом
ЗЕО ІЮ МО:1, такою як щонайменше 80 95, 85 95, 90 95 або 95 95 комплементарність.
У деяких варіантах здійснення засіб на основі ахКМА за даним винаходом включає сенсову нитку, яка є по суті комплементарною антисенсовому полінуклеотиду, який, в свою чергу, є комплементарним цільовій послідовності НВУ, та де полінуклеотиди сенсової нитки включають неперервну нуклеотидну послідовність, яка характеризується щонайменше 80 95 комплементарністю по всій своїй довжині з еквівалентною ділянкою послідовності нуклеотидів під ЗЕО ІЮ МО:2, як, наприклад, щонайменше 85 95, 90 95 або 95 95 комплементарністю.
У деяких варіантах здійснення засіб на основі аБКМА включає антисенсову нитку, яка є по суті комплементарною цільовій послідовності НВМ та включає неперервну нуклеотидну послідовність, яка характеризується щонайменше 80 95 комплементарністю по всій своїй довжині з еквівалентною ділянкою нуклеотидної послідовності будь-якої із сенсових нуклеотидних послідовностей в таблиці 2 або фрагмента будь-якої із сенсових нуклеотидних послідовностей в таблиці2, як, наприклад, щонайменше 8595, 9095 або 9595 комплементарністю.
Як докладно описано в даному документі, кожна нитка або обидві нитки також можуть містити один або більше нуклеотидів, відмінних від рибонуклеотидів, наприклад дезоксирибонуклеотид або модифікований нуклеотид. Крім того, засіб на основі аБКМА може включати рибонуклеотиди з хімічними модифікаціями. Такі модифікації можуть включати всі типи модифікацій, розкритих у даному документі або відомих з рівня техніки. Будь-які такі модифікації, які використовуються в засобі на основі О5ЕМА, можна охоплювати терміном «засіб на основі О5КМА» у контексті даних опису та формули винаходу.
У деяких варіантах здійснення більшість нуклеотидів кожної нитки є рибонуклеотидами, але, як детально описано в даному документі, кожна нитка або обидві нитки можуть також включати один або більше нуклеотидів, відмінних від рибонуклеотидів, наприклад дезоксирибонуклеотид або модифікований нуклеотид. Крім того, засіб на основі О5ЕМА може включати рибонуклеотиди з хімічними модифікаціями. Такі модифікації можуть включати всі типи модифікацій, розкритих у даному документі або відомих з рівня техніки. Будь-які такі модифікації, які використовуються в засобі на основі ОБКМА, охоплюються терміном «засіб на основі 45КМА» і «засіб на основі а5КМА» у контексті даних опису та формули винаходу.
Термін «нижчий» у контексті щодо рівня експресії гена НВМ або продукування білка НВМ у суб'єкта або маркера або симптому захворювання стосується статистично значущого зменшення такого рівня. Зниження може бути, наприклад, на щонайменше 80 95, 85 бо, 90 95 або 95 95 або до рівня, нижчого ніж той, який можна виявити конкретним способом виявлення, або у більшій мірі у напрямку до нормального рівня або до нормального рівня (який може становити або не становити нуль). Для відстежування інфекції, спричиненої НВУ, зазвичай використовують шкалу 0910 для опису рівня антигенемії (наприклад, рівня НВ5Ад у сироватці крові) або віремії (рівня ДНК НВУ у сироватці крові). Зрозуміло, що зменшення, позначене у 1
І0910, являє собою зменшення на 90 95 (залишається 10 95), зменшення, позначене у 2 І0д910, являє собою зменшення на 99 95 (залишається 195) тощо. У певних варіантах здійснення маркер захворювання знижується до рівня, нижчого ніж той, який можна виявити. У певних варіантах здійснення способи включають клінічно значуще інгібування експресії НВМ, наприклад, як продемонстровано за допомогою клінічно значущого результату після лікування суб'єкта засобом зі зниженням експресії НВМ. У деяких варіантах здійснення щонайменше часткове пригнічення експресії гена НВМ оцінюють за зниженням кількості тЕкМА НВУ, яку можна виділити або виявити в перших клітині або групі клітин, в яких транскрибується ген НВМ та яка була оброблена або які були оброблені так, що експресія гена НВМУ інгібується, порівняно з другими клітиною або групою клітин, по суті ідентичних першим клітині або групі клітин, але яка не була оброблена або які не були оброблені подібним способом (контрольні клітини).
У певних варіантах здійснення «нижчий» або «знижувати» слід розуміти, як пониження або зниження рівня у напрямку до нормального рівня або до нормального рівня, тобто нормалізацію рівня. У певних варіантах здійснення експресія мішені нормалізується до рівня, прийнятого як бо такий, що перебуває в межах норми для індивідуума без такого порушення, наприклад рівень маркера захворювання, такого як АЇ Т або А5Т, зменшується до рівня, прийнятого як такий, що перебуває в межах норми для індивідуума без такого порушення. Якщо рівень, асоційований із захворюванням, є підвищеним щодо нормального рівня, то зміну обчислюють від верхнього рівня норми (ШІ М). Якщо рівень, асоційований із захворюванням, є зменшеним щодо нормального рівня, то зміну обчислюють від нижчого рівня норми (І ІМ). Зниження являє собою відсоткову різницю зміни між значенням у суб'єкта та нормальним значенням. Наприклад, нормальний рівень А5Т може бути наведений як 10-40 одиниць на літр. Якщо суб'єкт з рівнем
А5Т, що становить 200 одиниць на літр, тобто 5-кратним щодо ЦІМ, на 160 одиниць на літр вищим за вищий рівень, визначений для норми, до лікування має рівень А5Т, що становить 120 одиниць на літр, тобто З-кратний щодо ЦІМ, на 80 одиниць на літр вищий за вищий рівень, визначений для норми, після лікування, то підвищений рівень А5Т буде знижений у напрямку до норми на 50 95 (80/160).
Як інший приклад, вважають, що нормальний рівень АЇТ, зазвичай, становить від 7 до 55 одиниць на літр (од./л), що встановлює верхній рівень за норми, що становить 55 од./л. Суб'єкт з рівнем АГТ, що становить 100 од./л, до лікування (на 45 од./л вище верхнього рівня, визначеного для норми,) та 75 од./л після лікування (зниженим на 25 од./л), то рівень АЇТ суб'єкта є пониженим в напрямку до нормального рівня на 5595 (25/45х100 95). Як використовується в даному документі, якщо захворювання асоційоване з підвищеним показником щодо симптому, то вважають, що «нормальний» являє собою верхній рівень, встановлений для норми. Якщо захворювання асоційоване зі зниженим показником щодо симптому, то вважають, що «нормальний» являє собою нижній рівень, встановлений для норми.
Фраза «приведення клітини в контакт із засобом на основі а5КМА», таким як азкМА, використовувана в даному документі, включає приведення клітини в контакт за допомогою будь-яких можливих способів. Приведення клітини в контакт із засобом на основі а5ЕМА передбачає приведення клітини в контакт із засобом на основі 85ЕМА іп міго або приведення клітини в контакт із засобом на основі а85ЕМА іп мімо. Приведення в контакт можна здійснювати безпосередньо або опосередковано. Таким чином, наприклад, засіб на основі 45ЕМА можна приводити у фізичний контакт з клітиною індивідуумом, що здійснює спосіб, або, як
Зо альтернатива, засіб на основі О5ЕМА можна розмістити в умовах, які дозволять засобу потім прийти в контакт з клітиною або стануть причиною цього.
Приведення клітини в контакт іп міго можна виконувати, наприклад, шляхом інкубування клітини із засобом на основі 45Е2ЕМА. Приведення клітини в контакт іп мімо можна виконувати, наприклад, шляхом введення ін'єкції засобу на основі Д5КМА у тканину, в якій розташована клітина, або поруч з нею, або шляхом введення ін'єкції засобу на основі 85ЕМА в іншу ділянку, наприклад кровотік або підшкірний простір, так, що засіб буде згодом досягати тканини, в якій розташована клітина, котру необхідно привести в контакт із засобом. Наприклад, засіб на основі а5зКМА може містити ліганд, наприклад саіІМАсз, котрий спрямовує засіб на основі Д5ЕМА до місця, що становить інтерес, наприклад до печінки, або може бути пов'язаний з ним. Також можливі комбінації способів приведення в контакт іп міїго та іп мімо. Наприклад, клітину можна приводити в контакт іп міїго із засобом на основі а5КМА та потім пересаджувати суб'єкту.
У деяких варіантах здійснення приведення клітини в контакт із засобом на основі а5ЕМА включає «введення» або «доставку засобу на основі 45ЕМА в клітину» шляхом сприяння поглинанню або абсорбції в клітину або покращення їх ступеню. Абсорбція або поглинання засобу на основі а5ЕМА може відбуватися шляхом спонтанних дифузійних або активних клітинних процесів, або за допомогою допоміжних засобів або пристроїв. Введення засобу на основі а5КМА в клітину можна проводити іп міїго або іп мімо. Наприклад, у випадку введення іп мімо, засіб на основі Д5КМА можна вводити за допомогою ін'єкції в ділянку тканини або вводити системно. Введення в клітину іп мійго передбачає відомі з рівня техніки способи, такі як електропорація й ліпофекція. Додаткові підходи описані нижче в даному документі або відомі з рівня техніки.
Використовуваний у даному документі «суб'єкт» являє собою тварину, таку як ссавець, зокрема будь-якого ссавця, який може бути інфікований НВУ, наприклад примата (такого як людина, примата, відмінний від людини, наприклад мавпу або шимпанзе) або тварину, яка вважається прийнятною клінічною моделлю інфекції, спричиненої НВУ, мишачу модель НВУ-
ААМ (див., наприклад, Мапод еї аї. (2014) СеїЇ апа Мої Іттипої 11:71) або трансгенну мишачу модель НВМУ 1.3хі5 (спцідоні еї а. (1995) 9. Мігої. 69:6158). У деяких варіантах здійснення суб'єкт має інфекцію, спричинену вірусом гепатиту В (НВМ). У деяких варіантах здійснення суб'єкт має як інфекцію, спричинену вірусом гепатиту В (НВУ), так й інфекцію, спричинену вірусом гепатиту бо Ор (НОМ). У деяких варіантах здійснення суб'єкт являє собою людину, таку як людина, що має інфекцію, спричинену НВУ, особливо хронічну, інфекцію, спричинену вірусом гепатиту В (НВМ).
Використовувані в даному документі терміни «здійснення лікування» або «лікування» стосуються корисного або необхідного результату, що включає без обмеження полегшення або нормалізація щодо однієї або більше ознак або симптомів, асоційованих з небажаною експресією гена НВУ або реплікацією НВУ, наприклад наявності СсСсОМА НВМУ в сироватці крові або печінці; наявності ДНК НВУ в сироватці крові; наявності антигена НВМУ в сироватці крові або печінці, наприклад НВ5Ад або НВедод; підвищеного рівня АЇТ; підвищеного рівня А5Т (вважається, що нормальний діапазон, зазвичай, знаходиться в межах від приблизно 10 до 34 од./л); відсутності або низького рівня антитіл до НВМУ, враження печінки; цирозу; гепатиту дельта, гострого гепатиту В; гострого фульмінантного гепатиту В; хронічного гепатиту В; фіброзу печінки; захворювання печінки на термінальній стадії; гепатоцелюлярної карциноми; подібного сироватковій хворобі синдрому; анорексії; нудоти; блювання, слабкої гарячки; міалгії; втомлюваності; порушених відчуттів смакової гостроти та запаху (відраза до їжі та сигарет); болю у правому верхньому квадранті та епігастрального болю (періодичний, від легкого до помірного); енцефалопатії печінки; сонливості; порушення режиму сну; сплутаності свідомості; коми; асциту; шлунково-кишкової кровотечі; коагулопатії; розлиття жовчі; гепатомегалії (злегка збільшена, м'яка печінка); спленомегалії; еритеми долонь; павукоподібної гемангіоми; м'язової атрофії; павукоподібної ангіоми; запалення кровоносних судин; варикозної кровотечі; периферійного набряку; гінекомастії; атрофії тестикул; порушення з боку черевних колатеральних вен (голова медузи); рівнів АГТ вищих, ніж рівні А5Т; підвищених рівнів гама- глутаміл-транспептидази (ОСТ) (вважається, що нормальний діапазон, зазвичай, знаходиться в межах від приблизно 8 до 65 од./л) та лужної фосфатази (АГ Р) (вважається, що нормальний діапазон, зазвичай, знаходиться в межах від приблизно 44 до 147 МО/л (міжнародних одиниць на літр), є не більшим, ніж З3-кратне значення ШІ М); злегка низьких рівнів альбуміну; підвищених рівнів заліза в сироватці крові; лейкопенії (тобто гранулоцитопенії); лімфоцитозу; підвищеної швидкості осадження еритроцитів (Е5БК); скороченого виживання червоних клітин крові; гемолізу; тромбоцитопенії; пролонгації міжнародного коефіцієнта нормалізації (ІМК); наявності в сироватці крові або печінці НВ5Ад, НВелйо або антитіла класу імуноглобуліна М (І9М) до корового білка гепатиту В (антитіло до НВс); наявності антитіла до поверхневого білка гепатиту
В (антитіла до НВ»), антитіла до е білка гепатиту В (антитіла до НВе) або ДНК НВУ; підвищених рівнів білірубіну; гіперглобулінемії; наявності тканино-неспецифічних антитіл, таких як антитіла до гладеньких м'язів (АЗМА) або антитіла до ядер (АМА) (10-20 95); наявності тканино- специфічних антитіл, таких як антитіла до щитовидної залози (10-20 95); підвищених рівнів ревматоїдного фактору (КЕ); низького рівня тромбоцитів і лейкоцитів; лобулярного некрозу з дегенеративними та регенеративними гепатоцелюлярними змінами та супутніми запаленнями і переважно центрилобулярного некрозу, що виявляється чи не виявляється. Імовірність розвитку фіброзу печінки знижують, наприклад, якщо індивідуум має один або більше факторів ризику розвитку фіброзу печінки, наприклад інфекція, що являє собою хронічний гепатит В, у нього або не розвивається фіброз печінки, або розвивається фіброз печінки з меншою тяжкістю щодо популяції, що має ті самі фактори ризику і не отримує засіб лікування, описаний у даному документі. Ефективним попередженням вважають відсутність розвитку захворювання, порушення або стану або зниження ступеня розвитку ознаки або симптому, асоційованих з таким захворюванням, порушенням або станом (наприклад, на клінічно значущу величину) або призупинення прояву відкладених ознак або симптомів (наприклад, на дні, тижні, місяці або роки). «Лікування» також може означати подовження виживання порівняно з очікуваним виживанням за відсутності лікування. Для попередження може вимагатися введення більше, ніж однієї дози.
У переважних варіантах здійснення лікування інфекції, спричиненої НВМ, приводить до «Функціонального виліковування» гепатиту В. Використовуване в даному документі «Функціональне виліковування» слід розуміти, як виведення НВ5ЗАд, котрий циркулює, і яке переважно супроводжується переходом до стану, в якому антитіла до НВ5Ад стають виявлюваними із використанням клінічно релевантного аналізу. Наприклад, виявлювані антитіла можуть передбачати сигнал, вищий, ніж 10 мМО/мл, виміряний за допомогою хемілюмінесцентного імуноаналізу на мікрочастинках (СМІА) або будь-якого іншого імуноаналізу, названий сероконверсією антитіл до НВ». Функціональне виліковування не вимагає виведення усіх реплікативних форм НВМ (наприклад, сссОМА з печінки). Сероконверсія антитіл до НВ» відбувається спонтанно у приблизно 0,2-1 95 хронічно інфікованих пацієнтів на рік. Однак, навіть після сероконверсії антитіл до НВ5 протягом декількох десятиліть спостерігається низький рівень персистенції НВМ, що свідчить про те, що відбувається бо функціональне, а не повне виліковування. Без обмеження конкретним механізмом передбачається, що імунна система може тримати НВМ під контролем. Функціональне виліковування надає можливість припинити будь-яке лікування інфекції, спричиненої НВУ.
Однак, слід розуміти, що «функціональне виліковування» інфекції, спричиненої НВУ, може бути недостатнім для запобігання або лікування захворювань або станів, які є наслідком інфекції, спричиненої НВУ, наприклад фіброз печінки, НСС, цироз.
Використовуваний у даному документі термін «захворювання, асоційоване з вірусом гепатиту В» або «асоційоване з НВМ захворювання» являє собою захворювання або порушення, спричинене інфекцією, спричиненою НВУ, або реплікацією НВМ або асоційоване з ними. Термін «асоційоване з НВМ захворювання» включає захворювання, порушення або стан, щодо яких було б сприятливим зниження експресії або реплікації гена НВУМ. Необмежувальні приклади асоційованих з НВМ захворювань включають, наприклад, інфекцію, спричинену вірусом гепатиту О, гепатит дельта, гострий гепатит В; гострий фульмінантний гепатит В; хронічний гепатит В; фіброз печінки; захворювання печінки на термінальній стадії та гепатоцелюлярну карциному.
У деяких варіантах здійснення асоційоване з НВМ захворювання являє собою інфекцію, спричинену вірусом гепатиту 0. Вірус гепатиту О або вірус гепатиту дельта (НОМ) являє собою патоген людини. Однак, вірус є дефектним та розраховує на обов'язкові допоміжні функції, що надаються вірусом гепатиту В (НВУМ), для перенесення; і справді, НОМ потребує асоційованого або попередньо існуючої інфекції, спричиненої НВМ, для того, щоб стати інфекційним та розмножитись, зокрема, вірусну оболонку, що містить поверхневий антиген гепатиту В. НОМ може призвести до тяжкої гострої та хронічної форми захворювання печінки, асоційованого з
НВУ. Інфекція, що являє собою гепатит О або гепатит дельта, є високо ендемічною в декількох країнах Африки, регіоні Амазонки та на середньому сході, в той час як його поширеність є низькою в промислово розвинутих країнах, за винятком Середземномор'я.
Передача НОМ може відбуватися або через одночасне інфікування НВМ (спільне інфікування) або вона накладається на хронічний гепатит В або стан переносника гепатиту В (суперінфекція). Як суперінфекція, так і спільне інфікування НОМ призводить до більш тяжких ускладнень, порівняно з інфекцією, спричиненою лише НВУ. Такі ускладнення включають вищу ймовірність зазнати печінкової недостатності за гострих інфекцій та швидке прогресування у бік
Зо цирозу печінки з підвищеним шансом розвитку раку печінки за хронічних інфекцій. В комбінації з вірусом гепатиту В, гепатит О характеризується найвищим рівнем смертності зі всіх інфекцій, що являють собою гепатит, і він становить 20 95.
У деяких варіантах здійснення асоційоване з НВМ захворювання являє собою гострий гепатит В. Гострий гепатит В передбачає запалення печінки, що триває менше, ніж шість місяців. Типові симптоми гострого гепатиту В являють собою втомлюваність, анорексію, нудоту та блювання. Часто спостерігають дуже високі значення амінотрансферази (21000 од./л) та гіпербілірубінемію. Тяжкі випадки гострого гепатиту В можуть швидко прогресувати у бік гострої печінкової недостатності, що позначається низькою синтетичною функцією печінки. Це також позначають як протромбіновий час (РТ), що становить 16 секунд, або міжнародний коефіцієнт нормалізації (ІМК), що становить 1,5, за відсутності попереднього захворювання печінки.
Гострий гепатит В може розвинутись у хронічний гепатит В.
У деяких варіантах здійснення асоційоване з НВМ захворювання являє собою хронічний гепатит. Хронічний гепатит В (СНВ) передбачає запалення печінки, що триває більше, ніж шість місяців. Суб'єкти, що мають СНВ є НВ5зАд-позитивними та мають або високу віремію (2102 копій
ДНК НВУ/мл крові), або низьку віремію («103 копій ДНК НВмМ/мл крові). У деяких варіантах здійснення суб'єкти були інфіковані НВМ протягом щонайменше п'яти років. У деяких варіантах здійснення суб'єкти були інфіковані НВМ протягом щонайменше десяти років. У деяких варіантах здійснення суб'єкти одержали інфекцію, спричинену НВУ, при народженні. Суб'єкти, що мають захворювання, що являє собою хронічний гепатит В, можуть бути імунотолерантними або мати неактивну хронічну інфекцію без будь-яких ознак активного захворювання, та вони також не мають симптомів. Пацієнти з хронічним активним гепатитом, особливо під час реплікативної фази, можуть мати симптоми подібні до таких за гострого гепатиту. Суб'єкти, що мають захворювання, що являє собою хронічний гепатит В, можуть мати активну хронічну інфекцію, що супроводжується некрозапальним захворюванням печінки, мають збільшену інтенсивність метаболізму гепатоцитів за відсутності виявлюваного некрозапалення або мають неактивну хронічну інфекцію без будь-яких ознак активного захворювання, і вони також не мають симптомів. Персистенція інфекції, спричиненої НВУ, у суб'єктів з СНВ зумовлена сссо МА
НВУ. У деяких варіантах здійснення суб'єкт, що має СНВ, є НВедод-позитивним. В іншому варіанті здійснення суб'єкт, що має СНВ, є НВеАд-негативним. Суб'єкти, що мають СНВ, бо характеризуються рівнем ДНК НВУ в сироватці крові, що становить менше, ніж 105, та стійким підвищенням рівнів трансаміназ, наприклад АЇТ, А5Т та гама-глутаміл-трансферази. Суб'єкт, що має СНВ, може мати бал біопсії печінки, що становить менше, ніж 4 (наприклад, бал некрозапалення).
У деяких варіантах здійснення асоційоване з НВМ захворювання являє собою гострий фульмінантний гепатит В. Суб'єкт, що має гострий фульмінантний гепатит В, має симптоми гострого гепатиту і додаткові симптоми, сплутаність свідомості або кому (через печінкову недостатність щодо детоксикації хімічних речовин) та синці або крововиливи (через недостатню кількість факторів згортання крові).
У суб'єктів, що мають інфекцію, спричинену НВУ, наприклад СНВ, може розвинутися фіброз печінки. Відповідно, у деяких варіантах здійснення асоційоване з НВМ захворювання являє собою фіброз печінки. Фіброз печінки або цироз визначають гістологічно, як дифузний процес у печінці, що характеризується фіброзом (надлишком волокнистої сполучної тканини) та переходом нормальної структури печінки в структурно ненормальні вузли.
У суб'єктів, що мають інфекцію, спричинену НВМ, наприклад СНВ, може розвинутись захворювання печінки на термінальній стадії. Відповідно, у деяких варіантах здійснення асоційоване з НВМ захворювання являє собою захворювання печінки на термінальній стадії.
Наприклад, фіброз печінки може прогресувати до точки, коли організм більше не здатен компенсувати, наприклад знижену функцію печінки, спричинену фіброзом печінки (тобто декомпенсованою печінкою), та спричинювати, наприклад, психічні та нейрологічні симптоми та печінкову недостатність.
У суб'єктів, що мають інфекцію, спричинену НВМ, наприклад СНВ, може розвинутись гепатоцелюлярна карцинома (НСС), яка також позначається як злоякісна гепатома. Відповідно, у деяких варіантах здійснення асоційоване з НВМ захворювання являє собою НСС. НСС зазвичай розвивається у суб'єктів, що мають СНВ, та вона може бути фіброламелярною, псевдогландулярною (аденоїдною), плеоморфною (гігантоклітинною) або прозороклітинною. «Асоційоване з НОМ порушення» або «порушення, асоційоване з вірусом гепатиту ЮО» являє собою захворювання або порушення, асоційоване з експресією НОМ. Ілюстративні асоційовані з
НОМ порушення включають інфекцію, спричинену вірусом гепатиту В, гострий гепатит В, гострий гепатит Ю; гострий фульмінантний гепатит Ю; хронічний гепатит Ю; фіброз печінки;
Зо захворювання печінки на термінальній стадії та гепатоцелюлярну карциному.
Передбачається, що «терапевтично ефективна кількість», використовувана в даному документі, включає кількість засобу на основі а5КМА, яка, в разі введення пацієнту для лікування суб'єкта, що має інфекцію, спричинену НВУ, або асоційоване з НВМ захворювання, є достатньою для ефективного лікування захворювання (наприклад, шляхом зниження ступеню прояву або підтримання наявного захворювання або одного або більше симптомів захворювання). «Терапевтично ефективна кількість» може варіюватися залежно від засобу на основі ахКМА, шляху введення засобу, захворювання та його тяжкості, а також анамнезу, віку, ваги, родинного анамнезу, генетичної характеристики, стадії патологічних процесів, опосередкованих експресією гену НВМ, типів попередніх або супутніх видів лікування, за наявності таких, та інших індивідуальних особливостей пацієнта, який підлягає лікуванню. Для терапевтично ефективної кількості може вимагатися введення більше, ніж однієї дози. «Терапевтично ефективна кількість» також передбачає кількість засобу на основі азКМА, яка викликає деякий необхідний ефект за прийнятного співвідношення користь/ризик, прийнятого щодо будь-якого лікування. Засоби на основі азКМА, використовувані у способах за даним винаходом, можна вводити у кількості, достатній для досягнення прийнятного співвідношення користь/ризик, прийнятого щодо такого лікування.
Термін «зразок», використовуваний у даному документі, передбачає сукупність подібних рідин, клітин або тканин, виділених з організму суб'єкта, а також рідин, клітин або тканин, наявних в організмі суб'єкта. Приклади біологічних рідин включають кров, сироватку крові й серозні рідини, плазму крові, лімфу, сечу, слину тощо. Зразки тканин можуть включати в себе зразки з тканин, органів або локальних ділянок. Наприклад, зразки можуть бути одержані з конкретних органів, частин органів або рідин або клітин з цих органів. У певних варіантах здійснення зразки можна одержати з печінки (наприклад, усієї печінки, або певних сегментів печінки, або певних типів клітин у печінці, таких як, наприклад, гепатоцити). У переважних варіантах здійснення «зразок, одержаний від суб'єкта» стосується крові або плазми крові, або сироватки крові, одержаної з крові, узятої в суб'єкта. У додаткових варіантах здійснення «зразок, одержаний від суб'єкта» стосується тканини печінки (або її складових компонентів) або тканини крові (або її складових компонентів, наприклад сироватки крові), одержаних від суб'єкта. 60
ЇЇ. Засоби на основі азЗеЕМА
Даний винахід передбачає засоби на основі а5КМА, які інгібують експресію одного або більше генів НВМ. У деяких варіантах здійснення засіб на основі Й5КМА включає молекули двониткової рибонуклеїнової кислоти (а05ЕМА) для інгібування експресії гена НВМ в клітині, такій як клітина в організмі суб'єкта, наприклад ссавця, такого як людина, що має асоційоване з НВМ захворювання, наприклад хронічний гепатит В. Засоби на основі а5ЕМА включають антисенсову нитку, що має ділянку комплементарності, яка є комплементарною щонайменше частині тЕеМА, утвореній під час експресії гена НВУ. Довжина ділянки комплементарності становить приблизно 19-21 нуклеотид. У випадку контакту з клітиною, що експресує ген НВУ, засіб на основі азЗеЕМА інгібує експресію гена НВМ на щонайменше 80 95, що встановлено шляхом аналізу, наприклад, за допомогою ПЛР або способу з використанням розгалуженої ДНК (БОМА), або способу на основі аналізу білків, як, наприклад, за допомогою імунофлуоресцентного аналізу із використанням, наприклад, методик вестерн-блотингу або проточної цитометрії. У переважних варіантах здійснення відсоток інгібування засобом на основі а5КМА, що використовували в концентрації 10 НМ в процесі трансфекції, визначають із використанням способу ПЛР в реальному часі, який наведено в прикладі 2, з використанням лінії клітин, описаної там же. а5зКМА включає дві нитки РНК, які є комплементарними та гібридизуються з утворенням дуплексної структури в умовах, за яких буде застосовуватися а5КЕМА. Одна нитка а5зКМА (антисенсова нитка) передбачає ділянку комплементарності, яка є по суті комплементарною, і, зазвичай, повністю комплементарною, цільовій послідовності. Однак, через варіації послідовностей серед генотипів НВМ, Д52ЕМА може бути повністю комплементарною деяким, але не всім, генотипам НВУ. Цільова послідовність може бути одержана з послідовності ТЕМА, утворюваної під час експресії гена НВУ. Інша нитка (сенсова нитка) передбачає ділянку, яка є комплементарною антисенсовій нитці, так що дві нитки гібридизуються та утворюють дуплексну структуру у разі об'єднання за придатних умов. Описані в іншому місці в даному документі та відомі з рівня техніки комплементарні послідовності а5КМА також можуть міститися у вигляді самокомплементарних ділянок однієї молекули нуклеїнової кислоти, на відміну від перебування в складі окремих олігонуклеотидів.
Зазвичай, довжина дуплексної структура становить 19-21 пару основ, наприклад довжина
Зо становить 19, 20 або 21 пару основ.
Подібним чином, довжина ділянки комплементарності цільовій послідовності становить 19- 23 нуклеотиди, наприклад довжина становить 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-23, 20-22, 20-21, 21- 22, 19, 20, 21, 22 або 23 нуклеотиди. У деяких варіантах здійснення ділянка комплементарності має довжину 21 нуклеотид. Середньому фахівцю в даній галузі також буде зрозуміло, що ділянка РНК, на яку здійснюється націлювання для розщеплення, найчастіше буде являти собою частину більшої молекули РНК, часто молекули тЕМА. У відповідних випадках «частина» цільової тЕМА являє собою неперервну послідовність цільової ткМА, яка має довжину, достатню для того, щоб дозволити їй бути субстратом для КМАїі-спрямовуваного розщеплення (тобто розщеплення за допомогою КІЗС-шляху).
Фахівцю в даній галузі також буде зрозуміло, що дуплексна ділянка являє собою основну функціональну частину 85ЕМА, наприклад дуплексна ділянка довжиною приблизно 19-21 пару основ, наприклад 19-21, 19-20, 20-21, 19, 20 або 21 пару основ. У деяких варіантах здійснення дуплексна ділянка становить 19 пар основ. а5КМА, описана в даному документі, може додатково включати один або більше однониткових нуклеотидних липких кінців, наприклад 1 або 2 нуклеотиди. Нуклеотидний липкий кінець може містити аналог нуклеотиду/нуклеозиду, зокрема дезоксинуклеотиду/нуклеозиду, або складатися з нього. Липкий(і) кінець(кінці) може(можуть) розташовуватися у сенсовій нитці, антисенсовій нитці або будь-якій їх комбінації. Крім того, нуклеотид(и) липкого кінця може(можуть) знаходитись на 5'-кінці, 3'-кінці або обох кінцях однієї або обох з антисенсової або сенсової ниток а5КМА. У деяких варіантах здійснення 45КМА включає 2-нуклеотидний липкий кінець на 3'-кінці антисенсової нитки. азКМА можна синтезувати за допомогою стандартних способів, відомих з рівня техніки, які додатково описані нижче, наприклад з використанням автоматичного синтезатора ДНК, такого як комерційно доступні від, наприклад, Віозеагсп, Арріїєй Віозузіет5 "М, Іпс. Способи синтезу азКМА для використання у фармацевтичній композиції є також відомими з рівня техніки.
Сполуки, що являють собою засіб на основі а5КМА, за даним винаходом можна одержувати з використанням двостадійної процедури. Спочатку окремі нитки молекули двониткової РНК одержують окремо. Потім нитки-складові відпалюють. Окремі нитки сполуки, що являє собою засіб на основі О5КМА, можна одержувати із використанням рідкофазного або твердофазного бо органічного синтезу або їх обох. Органічний синтез дає перевагу в тому, що можна легко одержувати олігонуклеотидні нитки, що містять неприродні або модифіковані нуклеотиди.
Однониткові олігонуклеотиди за даним винаходом можна одержувати із використанням рідкофазного або твердофазного органічного синтезу, або їх обох.
У деяких варіантах здійснення засіб на основі 45ЕМА за даним винаходом включає щонайменше дві нуклеотидні послідовності, послідовність сенсової нитки і послідовність антисенсової нитки. Сенсова нитка може містити нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, що складається з будь-якої з нуклеотидних послідовностей сенсової нитки будь-якого з дуплексів, що наведені в таблиці 2. Антисенсова нитка може містити нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, що складається з будь-якої з нуклеотидних послідовностей антисенсової нитки будь-якого з дуплексів, що наведені в таблиці 2. У деяких варіантах здійснення засіб на основі а5еМА не являє собою АЮ-66810.
У деяких варіантах здійснення засіб на основі а5КМА за даним винаходом містить сенсову нитку та антисенсову нитку, які наведені в таблиці 2, складається по суті з них або складається з них.
І. Засоби на основі модифікованої а5ЕМА
У певних варіантах здійснення РНК засобу на основі 45ЕМА за даним винаходом є немодифікованою та не передбачає, наприклад хімічних модифікацій або кон'югуваннь, відомих з рівня техніки та описаних в даному документі. В інших варіантах здійснення РНК засобу на основі ОБКМА за даним винаходом є хімічно модифікованою для посилення стабільності або інших корисних характеристик. У деяких варіантах здійснення за даним винаходом по суті всі з нуклеотидів засобу на основі а5КМА за даним винаходом є модифікованими. У деяких варіантах здійснення за даним винаходом всі з нуклеотидів засобу на основі а5ЕМА або по суті всі з нуклеотидів засобу на основі 5КМА є модифікованими, тобто в нитці засобу на основі О5КМА наявними є не більше, ніж 5, 4, 3, 2 або 1 немодифікований нуклеотид.
Нуклеїнові кислоти, описані в даному винаході, можна синтезувати або модифікувати за допомогою способів загальноприйнятих в даній галузі, таких як ті, що описані в "Сшитепі ргоїосої5 іп писієїс асіа спетівігу," Веаисаде, 5.Г.. еї аї. (Еагв.), хопп Уміеу 5 5оп5, Іпс., Мем/ МОгК,
МУ, ОСОБА, способи з якого включені в даний документ за допомогою посилання. Модифікації включають, наприклад, кінцеві модифікації, наприклад 5'-кінцеві модифікації (фосфорилювання,
Зо кон'югування, інвертовані зв'язки) або 3'-кінцеві модифікації (кон'югування, ДНК-нуклеотиди, інвертовані зв'язки тощо); модифікації основ, наприклад заміну стабілізувальними основами, дестабілізувальними основами або основами, які утворюю пару основ з розширеним спектром партнерів, видалення основи (нуклеотиди, позбавлені основ) або кон'юговані основи; модифікації цукрів (наприклад, в 2'-положенні або 4"-положенні) або заміну цукру або модифікації остову, зокрема модифікацію або заміну фосфодіестерних зв'язків. Конкретні приклади сполук, що являють собою засіб на основі а5ЕМА, застосовних у варіантах здійснення, описаних в даному документі, включають без обмеження РНК, що містять модифіковані остови або неприродні міжнуклеозидні зв'язки. Серед іншого, РНК, які мають модифіковані остови, включають такі, які не мають атома фосфору в остові. У контексті даного опису, а також як іноді згадується в рівні техніки, модифіковані РНК, які не мають атома фосфору в своєму міжнуклеозидному остові, також можуть вважатися олігонуклеозидами. У деяких варіантах здійснення засіб на основі модифікованої а5ЕМА буде мати атом фосфору в його міжнуклеозидному остові.
Модифіковані РНК-остови включають, наприклад, фосфотіоати, хіральні фосфотіосати, фосфодитіоати, фосфотриестери, аміноалкілфосфотриестери, метил- та інші алкілфосфонати, зокрема 3'-алкіленфосфонати та хіральні фосфонати, фосфінати, фосфорамідати, зокрема 3'- амінофосфорамідат та аміноалкілфосфорамідати, тіонофосфорамідати, тіоноалкілфосфонати, тіоноалкілфосфотриестери та боранофосфати, що характеризуються нормальними 3'-5- зв'язками, їх 2'-5'-зв'язані аналоги та ті, що характеризуються інвертованою полярністю, де суміжні пари нуклеозидних одиниць зв'язані наступним чином: 3-5' до 5-3 або 2-5'до 5-2.
Також включені різноманітні солі, змішані солі та форми вільних кислот.
Ілюстративні патенти США, в яких викладена ідея одержання згаданих вище зв'язків, які містять фосфор, включають без обмеження патенти США МоМо 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177195; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541316; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; 5625050; 6028188; 6124445; 6160109; 6169170; 6172209; 6239265; 6277603; 6326199; 6346614; 6444423; 6531590; 6534639; 6608035; 6683167; 6858715; 6867294; 6878805; 7015315; 7041816; 7273933; 7321029 і патентний документ США КЕЗ39464, кожен з яких включений в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких способів одержання. бо Модифіковані РНК-остови, які не включають атом фосфору, передбачають остови, утворені коротколанцюговими алкільними або циклоалкільними міжнуклеозидними зв'язками, змішаними гетероатомними й алкільними або циклоалкільними міжнуклеозидними зв'язками або одним або більше коротколзанцюговими гетероатомними або гетероциклічними міжнуклеозидними зв'язками. Вони включають остови з морфоліновими зв'язками (частково утвореними з цукрової частини нуклеозиду); силоксанові остови; сульфідні, сульфоксидні та сульфонові остови; формацетильні та тіоформацетильні остови; метиленформацетильні та тіоформацетильні остови; алкенвмісні остови; сульфаматні остови; метиленімінові та метиленгідразинові остови; сульфонатні та сульфонамідні остови; амідні остови та інші, які містять суміш складових частин
М, О, 5 і СН».
Ілюстративні патенти США, в яких викладена ідея одержання згаданих вище олігонуклеозидів, включають без обмеження патенти США МоМо 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 і 5677439, кожен з яких включений в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких способів.
Розглядаються придатні РНК-міметики для використання в засобах на основі а5зЕКМА, представлених в даному документі, в яких як цукровий, так і міжнуклеозидний зв'язок, тобто остов нуклеотидних одиниць, замінені новими групами. Структурні одиниці у вигляді основ зберігаються для гібридизації з відповідною цільовою сполукою нуклеїнової кислоти. Одна така олігомерна сполука, в якій РНК-міметик, який, як було показано, має виняткові властивості гібридизації, називається пептидо-нуклеїновою кислотою (РМА). У сполуках РМА цукровий остов
РНК замінений на амідовмісний остов, зокрема на аміноетилгліциновий остов. Нуклеїнові основи зберігаються і зв'язуються безпосередньо або опосередковано з атомами азоту азагрупи в амідній частині остова. Ілюстративні патенти США, в яких викладена ідея одержання сполук РМА, включають без обмеження патенти США МоМо 5539082; 5714331 і 5719262, кожен з яких включений в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких способів.
Додаткові сполуки РМА, придатні для використання в засобах на основі а5КМА за даним винаходом, описані, наприклад, у Міеїзеп еї аї!., Зсіепсе, 1991, 254, 1497-1500.
Деякі варіанти здійснення, описані в даному винаході, включають РНК з фосфотіоатними
Зо остовами й олігонуклеозиди з остовами з гетероатомами та, зокрема, --СН2--МН--СНе-, --СНе--
М(СНз)--0--Сне--(відомий як метилен(метиленіміно)- або ММІ-остові,. --СН»--0О--МЩ(СНз)--СНе--, --
Сно--М(СНз)--М(СНз)-СНе- її 0 -М(СНз)-СНе2-СНо-|де нативний фосфодіестерний остов наведений як --0--Р--0--С2Н2-- вказаного вище патенту США Мо 5489677 та амідні остови вказаного вище патенту США Мо 5602240. У деяких варіантах здійснення РНК, описані в даному документі, мають морфолінові структури остова відповідно до вищезгаданого патенту США
Мо 5034506.
Модифіковані РНК також можуть містити один або більше заміщених цукрових фрагментів.
Засоби на основі а5КМА, описані в даному документі, можуть включати в 2'- положенні одне з наступного: ОН; Е; О-, 5- або М-алкіл; О-, 5- або М-алкеніл; О-, 5- або М-алкініл або О-алкіл-О- алкіл, де алкіл, алкеніл і алкініл можуть являти собою заміщений або незаміщений С1-С:о-алкіл або С2-Сіо-алкеніл і -алкініл. Ілюстративні придатні модифікації включають О(СНег)пО|тСНз,
О(СНа Осн», О(СНе)аМН, О(СНа)СНз, О(СНаОМН:г і (НМ СН»)СНаз)|г, де пої т дорівнюють від 1 до приблизно 10. В інших варіантах здійснення а5КМА в 2'-положенні містять одне з наступного: нижчий С1-С:іо-алкіл, заміщений нижчий алкіл, алкарил, аралкіл, О-алкарил або О-аралкіл, 5Н, 5СНз, ОСМ, СІ, Ві, СМ, СЕз, ОСЕз, БОСН»з, 502СНз, ОМО», МО», Мз, МН», гетероциклоалкіл, гетероциклоалкарил, аміноалкіламіно, поліалкіламіно, заміщений силіл, групу, що розщеплює РНК, репортерну групу, інтеркалятор, групу для поліпшення фармакокінетичних властивостей засобу на основі а5КЕМА або групу для поліпшення фармакодинамічних властивостей засобу на основі а5ЕМА та інші замісники, які мають аналогічні властивості. У деяких варіантах здійснення модифікація включає 2'-метоксиетокси (2-0--СН.СНоОСН», також відомий як 2'-0-(2-метоксиетил) або 2'-МОЕ) (Мапітп евї а!., Нем. Спіт.
Асіа, 1995, 78:486-504), тобто алкокси-алкоксигрупу. Іншою ілюстративною модифікацією є 2'- диметиламінооксиетокси, тобто група О(СН2г25ОМ(СнНвз)»г, також відома як 2'- ОМАСЕ, описана в прикладах у даному документі нижче, і 2'-диметиламіноетоксиетокси (також відома з рівня техніки як 2'-О-диметиламіноетоксиетил або 2'-ОМАЕОЕ), тобто 2'-0--СН2--0--СНо--М(СНг)».
Додаткові ілюстративні модифікації включають: 5'-Ме-2-Е-нуклеотиди, 5'-Ме-2-ОМе- нуклеотиди, 5'-Ме-2'і--дезоксинуклеотиди (як К-, так і 5-їзомери в цих трьох родинах); 2- алкоксиалкіл і 2'-ММА (М-метилацетамід).
Інші модифікації включають 2'-метокси (2'-ОСН»з), 2'-амінопропокси (2-ОСН».СНСНМН») і 2"- 60 фтор (2-Е). Подібні модифікації також можуть бути здійснені в інших положеннях у РНК засобу на основі Д5ЕМА, зокрема в 3'-положенні цукрового фрагмента в 3'-кінцевому нуклеотиді або в азеМА із 2'-5'-зв'язками і в 5'-положенні 5'-кінцевого нуклеотиду. Засоби на основі Д5ЕМА також можуть мати міметики цукрів, як, наприклад, циклобутилові фрагменти замість пентафуранозильного цукрового фрагменту. Ілюстративні патенти США, в яких викладена ідея одержання таких модифікованих цукрових структур, включають без обмеження патенти США
МоМо 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 та 5700920, деякі з яких належать заявникам даної заявки. Вміст кожної з вищевказаних публікацій патентів включений в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких способів.
Засіб на основі аБКМА може також включати модифікації або заміщення нуклеїнової основи (яку часто в даній галузі називають просто як «основа»). Використовувані в даному документі «немодифіковані» або «природні» нуклеїнові основи включають у себе пуринові основи аденін (А) і гуанін (С), а також піримідинові основи тимін (Т), цитозин (С) і урацил (Ш). Модифіковані нуклеїнові основи включають у себе інші синтетичні та природні нуклеїнові основи, такі як дезокситимін (ат), 5-метилцитозин (5-те-С), 5-гідроксиметилцитозин, ксантин, гіпоксантин, 2- аміноаденін, б-метильні та інші алкільні похідні аденіну та гуаніну, 2-пропільні та інші алкільні похідні аденіну та гуаніну, 2-тіоурацил, 2-тіотимін і 2-тіоцитозин, 5-галогенурацил і -цитозин, 5- пропінілурацил і -цитозин, б-азоурацил, -цитозин і -тимін, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тіоурацил, 8-галоген-, 8-аміно-, 8-тіол-, 8-тіоалкіл-, 8-гідроксил- та інші 8-заміщені аденіни та гуаніни, 5- галоген-, зокрема 5-бром-, 5-трифторметил та інші 5-заміщені урацили та цитозини, 7- метилгуанін і 7-метиладенін, 8-азагуанін і 8-азааденін, 7-дезазагуанін і 7-дезазааденін, а також
З-дезазагуанін і З-дезазааденін. Додаткові нуклеїнові основи включають у себе ті, що розкриті в патенті США Мо 3687808, ті, що розкриті в Модійеа Мисіеовзідез іп Віоспетівігу, ВійтесппоЇоду апа
Меадісіпе, Негаємі|п, Р. ей. МПеу-МСН, 2008; ті, що розкриті в Те Сопсізе Епсусіоредіа ОЇ
Роїутег Зсієпсе Апа Епдіпеегіпа, раде5 858-859, КтозспУлйя, у. І, ей. допп Уміеу 5 5опв, 1990, ті, що розкриті в Еподіїзсй еї аїЇ.,, Апдежапае Спетіеє, Іпіегпайопа! Еайіоп, 1991, 30, 613, а також ті, що розкриті в Запупмі, М 5., Спаріег 15, а5КМА Кезеагсп апа Арріїсайоп5, радез 289-302,
СтооКе, 5. Т. апа І ерієм, В., Еа., СЕС Ргевз5, 1993. Певні з цих нуклеїнових основ є особливо
Зо застосовними для збільшення афінності зв'язування олігомерних сполук, описаних у даному винаході. Вони включають 5-заміщені піримідини, б-азапіримідини та М-2, М-6 і О-6-заміщені пурини, зокрема 2-амінопропіладенін, 5-пропінілурацил і 5-пропінілцитозин. Було показано, що заміщення на 5-метилцитозин збільшують стабільність дуплексу нуклеїнових кислот на 0,6- 1,2 С (бапопмі, У. 5., СтоокКе, 5. Т. апа І еріеи, В., Ед5., а5КМА Кезеагсі! апа Арріїсайопв5, САС
Ргезв5, Воса Нашюп, 1993, рр. 276-278), і вони являють собою ілюстративні заміщення основ, ще більш конкретно в комбінації з 2'-О-метоксиетильними модифікаціями цукрових фрагментів.
Ілюстративні патенти США, в яких викладено одержання певних зі згаданих вище модифікованих нуклеотидних основ, а також інших модифікованих нуклеотидних основ, включають без обмеження згадані вище патенти США МоМо 3687808, 4845205; 513030; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121, 5596091; 5614617; 5681941; 5750692; 6015886; 6147200; 6166197; 6222025; 6235887; 6380368; 6528640; 6639062; 6617438; 7045610; 7427672 і 7495088, кожен з яких включений в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких способів.
У деяких варіантах здійснення РНК засобу на основі д5КМА також може бути модифікована таким чином, щоб вона включала один або більше біциклічних цукрових фрагментів. «Біциклічний цукровий фрагмент» являє собою фуранозильне кільце, модифіковане шляхом формування містка між двома атомами. «Біциклічний нуклеозид» («ВМА») являє собою нуклеозид, який має цукровий фрагмент, містить місток, що з'єднує два атоми вуглецю цукрового кільця, унаслідок чого утворюється біциклічна кільцева система. У певних варіантах здійснення місток з'єднує 4"-атом вуглецю і 2'-атом вуглецю в цукровому кільці. Таким чином, у деяких варіантах здійснення засіб за даним винаходом може містити одну або більше замкнених нуклеїнових кислот (МА). Замкнена нуклеїнова кислота являє собою нуклеотид, який має модифікований рибозний фрагмент, де рибозний фрагмент містить додатковий місток, що з'єднує 2'- і 4--атоми вуглецю. Інакше кажучи, МА являє собою нуклеотид, що містить біциклічний цукровий фрагмент, що містить місток 4-СНо-0О-2. Ця структура ефективно «замикає» рибозу в структурній конформації 3'-ендо. Було показано, що додавання замкнених нуклеїнових кислот в засоби на основі а5Е2ЕМА збільшує стабільність засобів на основі Д5КМА в сироватці крові та знижує нецільові ефекти (ЕІтеп, «). еї аї., (2005) Мисівіс Асіа5 Незеагсп 33(1):439-447; Моок, ОН. еї аї., (2007) Мої Сапс ТНег 6(3):833-843; СтипуеїІег, А. еї аї., (2003) 60 Мисієїс Асіаз Везвагсі 31(12):3185-3193). Приклади біциклічних нуклеозидів для використання в полінуклеотидах за даним винаходом включають без обмеження нуклеозиди, які містять місток між 4- і 2'-атомами рибозильного кільця. У певних варіантах здійснення засоби на основі антисенсових полінуклеотидів за даним винаходом містять один або більше біциклічних нуклеозидів, які містять місток 4-2". Приклади таких біциклічних нуклеозидів з містком 4-2! включають без обмеження 4"-(СНг)-0О-2' (І МА); 4-(СНг)-5-27 4-(СНг)2-0-2" (ЕМА); 4-СН(СНз)-0О-2 (який також називається «конформаційно утруднений етилом» або «СЕ) та 42-СН(СНгОСН»з)-О- 2" (та його аналоги, див., наприклад, патент США Мо 7399845); 4-С(СНзу(СНз)-О-2' (та його аналоги, див., наприклад, патент США Мо 8278283); 4-СНо-М(ОСНЗз)-2' (та його аналоги, див., наприклад, патент США Мо 8278425); 4-СН»-О-М(СНз)-2' (див., наприклад, публікацію патенту
США Мо 2004/0171570); 4-СН2-М(Н)-0-2", де К являє собою Н, С1-С12-алкіл або захисну групу (див., наприклад, патент США Мо 7427672); 4-СН»-С(НуСНЗ)-2" (див., наприклад, Спайораднпуауа еї аї., У. Ога. Спет., 2009, 74, 118-134); та 4-СНо-С(-СНг)-2' (і його аналоги, див., наприклад, патент США Мо 8278426). Вміст кожного з вищенаведеного має відношення до модифікованих нуклеїнових кислот і включений в даний документ за допомогою посилання.
Додаткові ілюстративні патенти США і публікації патентів США, в яких викладені ідеї одержання нуклеотидів замкнених нуклеїнових кислот, включають без обмеження наступні: патенти США МеМо 6268490; 6525191; 6670461; 6770748; 6794499; 6998484; 7053207; 7034133; 7084125; 7399845; 7427672; 7569686; 7741457; 8022193; 8030467; 8278425; 8278426; 8278283; о 2008/0039618 ії 05 2009/0012281, які включені в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких способів.
Будь-який із вищезгаданих біциклічних нуклеозидів можна одержувати з однією або більше стереохімічними конфігураціями цукрових фрагментів, зокрема, наприклад, с-І -ргибофуранозою та В-Ю-рибофуранозою (див. М/О99/14226).
РНК засобу на основі а5КМА також може бути модифікована таким чином, щоб вона містила один або більше конформаційно утруднених етилом нуклеотидів. Використовуваний в даному документі «конформаційно утруднений етилом нуклеотид» або «СЕЇ» являє собою замкнену нуклеїнову кислоту, яка містить біциклічний цукровий фрагмент, що містить місток 4-СН(СНз)-О- 2". У деяких варіантах здійснення конформаційно утруднений етилом нуклеотид перебуває в 5- конформації, яка в даному документі називається «5-СЕ».
Зо Засіб на основі ай52МА за даним винаходом також може містити один або більше «конформаційно обмежених нуклеотидів» («СЕМ»). СКМ являють собою аналоги нуклеотидів з лінкером, який з'єднує С2"- і С4атоми вуглецю рибози або С3'- і С5-атоми вуглецю рибози.
СКМ замикає рибозне кільце в стабільну конформацію і збільшує афінність гібридизації з
ТЕМА. Довжина лінкера є достатньою, щоб помістити атом кисню в положення, оптимальне для стабільності й афінності, що приводить до меншого «зморщування» рибозного кільця.
Ілюстративні публікації в яких викладені ідеї одержання певних вищезгаданих СЕМ, включають без обмеження публікацію патенту США Мо 201 3/0190383; і публікацію згідно з РСТ
УМО2013/036868, які включені в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких способів.
У деяких варіантах здійснення засіб на основі Д5КМА за даним винаходом містить один або більше мономерів, які являють собою нуклеотиди за типом ОМА (незамкнених нуклеїнових кислот). ОМА являє собою незамкнену ациклічну нуклеїнову кислоту, в якій будь-який зі зв'язків у цукровому фрагменті був видалений з утворенням незамкненого «цукрового» залишку. В одному прикладі ЮОМА також охоплює мономер, у якого були видалені зв'язки С1"-С4" (тобто ковалентний вуглець-кисень-вуглецевий зв'язок між атомами вуглецю Ст ї С4). В іншому прикладі був видалений зв'язок С2"-С3' (тобто ковалентний вуглець-вуглецевий зв'язок між атомами вуглецю С2' їі С3) у цукровому фрагменті (див. Мис. Асід5 Зутр. зегіе5, 52, 133-134 (2008), та РіІшйег еї аї!., Мої. Віозуві., 2009, 10, 1039, які включені в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно нуклеотидів за типом незамкненої нуклеїнової кислоти).
Ілюстративні публікації патентних документів США, в яких викладені ідеї одержання МА, включають без обмеження патент США Мо 8314227 і публікації заявок на патент США
МоМо 2013/0096289; 2013/0011922 і 2011/0313020, які включені в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких способів.
Потенційно стабілізувальні модифікації на кінцях молекул РНК можуть включати в себе М- (ацетиламінокапроїл)-4-гідроксипролінол.: (Нур-С6-МНАс), М-(капроїл-4-гідроксипролінол (Нур-
Сб), М-(ацетил-4-гідроксипролінол о (Нур-МНАс), тимідин-2-О-дезокситимідин (етер), М- (амінокапроїл)-4-гідроксипролінол (Нур-Сб-аміно), 2-докозаноїл-уридин-3'-фосфат, інвертовану основу ат(іат) й інші. Розкриття цієї модифікації можна знайти в публікації згідно з РСТ
Мо М/О2011/005861. 60 У певних варіантах здійснення засіб на основі 45ЕМА модифікований таким чином, щоб він включав один або більше аденозин-гліколь-нуклетнових кислот («ОМА»). Термін «ОМА» стосується гліколевої нуклеїнової кислоти, що являє собою полімер, подібний ДНК або РНК, але відмінний від них складом свого «остова», оскільки він складається з повторюваних ланок гліцерину, з'єднаних фосфодіестерними зв'язками: а о / 7о в о що ()-СХА
Опис аденозин-СМА можна знайти, наприклад, в 2папо, еї аім. ЦАС5 127(12):4174-75 (2005)).
Інші модифікації нуклеотидів засобу на основі а5Е2ЕМА, розкритого в даному документі, включають 5-фосфат або міметик 5'і-фосфату, наприклад 5'-кінцевий фосфат або міметик фосфату в антисенсовій нитці засобу на основі Д5КМА. Придатні міметики фосфатів розкриті, наприклад, у публікації патенту США Мо 2012/0157511, яка включена в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких модифікацій.
Додаткові засоби на основі модифікованої 452МА, що націлюються на НВУ, наведені, наприклад, в М/О2016/077321, яка включена в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно модифікацій.
У деяких варіантах здійснення засіб на основі 5КМА містить модифіковану сенсову нитку та модифіковану антисенсову нитку, які наведені в таблиці 2, складається по суті з них або складається з них.
ЇМ. Засоби на основі а52МА, кон'юговані з лігандами
Засоби на основі аБКМА за даним винаходом можуть бути кон'юговані з лігандом. Ліганд може змінювати розподілення, націлювання або час життя засобу на основі а5КМА, в який вони включені. У переважних варіантах здійснення ліганд забезпечує посилену афінність щодо вибраної мішені, наприклад молекули, клітини або типу клітин, компартменту, наприклад компартменту клітини або органа, тканини, органа або ділянки тіла, наприклад, порівняно з молекулою, у якої такий ліганд відсутній. Переважні ліганди не будуть брати участь у спарюванні основ дуплексу в дуплексній нуклеїновій кислоті.
Олігонуклеотиди, кон'юговані з лігандами, за даним винаходом можуть бути синтезовані із використанням олігонуклеотиду, який несе підвішену реакційноздатну функціональну групу, як,
Зо наприклад, одержану в результаті приєднання зв'язувальної молекули до олігонуклеотиду (як описано нижче). Можна здійснювати реакцію цього реакційноздатного олігонуклеотиду безпосередньо з комерційно доступними лігандами, лігандами, які синтезуються такими, що несуть будь-яку з різноманітних захисних груп, або лігандами, які мають зв'язувальний фрагмент, приєднаний до них.
Стосовно олігонуклеотидів, кон'югованих з лігандами, і нуклеозидів, зв'язаних з конкретними послідовностями, що несуть молекули лігандів, за даним винаходом, олігонуклеотиди та олігонуклеозиди можуть бути зібрані на придатному синтезаторі ДНК з використанням стандартних попередників нуклеотидів або нуклеозидів або попередників кон'югатів нуклеотидів або нуклеозидів, які вже несуть зв'язувальний фрагмент, попередників кон'югатів нуклеотидів або нуклеозидів з лігандами, які вже несуть молекулу ліганду, або ненуклеозидних структурних елементів, що несуть ліганд.
У разі використання попередників кон'югатів нуклеотидів, які вже несуть зв'язувальний фрагмент, синтез нуклеозидів, зв'язаних з конкретними послідовностями, зазвичай, завершується, а потім здійснюють реакцію молекули ліганду зі зв'язувальним фрагментом з утворенням олігонуклеотиду, кон'югованого з лігандом. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотиди або зв'язані нуклеозиди за даним винаходом синтезується за допомогою автоматичного синтезатора із використанням фосфорамідитів, одержаних з кон'югатів нуклеозидів з лігандами, на додаток до стандартних фосфорамідитів і нестандартних фосфорамідитів, які є комерційно доступними і звичайним способом застосовуються в синтезі олігонуклеотидів.
Ілюстративні патенти США, в яких викладена ідея одержання кон'югатів РНК, включають без обмеження патенти США МеМо 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 та 5688941; 6294664; 6320017; 6576752; 6783931; 6900297; 7037646; 8106022, які включені в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких способів одержання.
А. Вуглеводневі кон'югати
У переважних варіантах здійснення композицій і способів, розкритих у даному документі, олігонуклеотид засобу на основі а5ЕМА додатково містить вуглевод. Засіб на основі а5ЕКМА, кон'югований з вуглеводом, є переважним для доставки нуклеїнових кислот іп мімо, а також композицій, придатних для терапевтичного використання іп мімо, описаного в даному документі.
Використовуваний у даному документі термін «вуглевод» стосується сполуки, яка являє собою вуглевод рег 5е, утворений з однієї або більше моносахаридних ланок, що мають щонайменше 6 атомів вуглецю (і які можуть бути лінійними, розгалуженими або циклічними), при цьому з кожним атомом вуглецю зв'язаний атом кисню, азоту або сірки; або сполуки, яка має як свою частину вуглеводний фрагмент, утворений з однієї або більше моносахаридних ланок, кожна з яких має щонайменше шість атомів вуглецю (і які можуть бути лінійними, розгалуженими або циклічними), при цьому з кожним атомом вуглецю зв'язаний атом кисню, азоту або сірки.
Ілюстративні вуглеводи включають цукри (моно-, ди-, три- та олігосахариди, що містять приблизно 4, 5, 6, 7, 8 або 9 моносахаридних ланок) і полісахариди, такі як види крохмалю, глікоген, целюлоза та види полісахаридної камеді. Конкретні моносахариди включають цукри С5 і вище (наприклад, С5, Сб, С7 або С8); ди- і трисахариди включають цукри, які мають дві або три моносахаридні ланки (наприклад, С5, Сб, С7 або С8).
У деяких варіантах здійснення вуглеводний кон'югат для використання в композиціях і способах за даним винаходом являє собою моносахарид. У деяких варіантах здійснення вуглеводний кон'югат для використання в композиціях і способах за даним винаходом вибраний із групи, що складається з он но но о Мити о
АснНМ тр о он но о но о Ми о ат тр ша За о о о он но но о нь о
АСНМ дя Н о формули І,
но но но о но о о о иа тт
Н но но но о но о личить
Н но Но о о но о но ит ит То
Н формули ІЇ, он но о но ота
МНАс У он Ми но : Ї о о но -илалттм
МНАс формули ІІ, он но о но ото
МНАс о он -- но о о о ек, Ач
МНАс формули ІМ,
но Йон о Н но т
МНАс но 0/0, 9Н о о но ТА
МНАс о формули У, но 0 ОН о но ТИ о
Не ЙО Мн о но ТТ о
МНАс но 0/0 ОН о о но о
МНАс формули МІ,
ВА Ов:
Ва о во
В ОВ: о Одс
Ва О /АсО 9 во о у формули МІЇ, он но о о Н но о УТ р о
М
АСНМ Н з о он но о о Н но о Тир о
М
АсНМ Н з он но о о о о Н но о и дики, АХ
М о
АСНМ Н формули МІ,
но он с ; о о но ит Ше
АСНМ Н но що о іже о о о но -иТатттм мана
АСНМ Н о о он но но Та т о
АсНМ Н формули ІХ, го, о он но о но - о и тт о о» о мо
Н о он но о х но о протея
Н
9 он о о но о но ит тьми то
Н формули Х, зо
"о, о он но о но
Н Н
- о Мити о о» тр о о он но о но о
Н Н о итиЙ о о о о о он но о но
ТАТА о
Н Н о формули ХІ, но он о о Н но си. УТ о
М
АснНМ н з он о но о о н
АснМ Н З с но он о 9; о о н но 5 и А АЖ
АснНнМ М о формули ХІЇ, он но о но он є, о о АСНМ АД но о о МН
АСНМ АД :
М ша о формули ХІП,
но он о но що но о о о АСНМ АД но 6) о МН вснк АЖ лети
М
Н о формули ХІМ, он но о но он є, о о АСНМ чук но 6) о МН
АеНм А ЖД шана
М
Н о формули ХУ, он но о що о о но о но чок но о о МН по АД
М ша о формули ХМІ, он но о що о о но о но час но о о МН но А ЖД ання
М
Н
О формули ХМІ, он но о ой о о но о о МН но А ЖД лу
М
Н
О формули ХМІЇ,
но он но о но но он о о по 5 АЖ но о МН
Н о формули ХІХ, но он но о но но ОН о о но 5 АЖ но о МН
Н о формули ХХ та но он но о но но он о о но З АД но о МН
Н о формули ХХІ.
У деяких варіантах здійснення моносахаридом є М-ацетилгалактозамін (заіМАс). У деяких варіантах здійснення вуглевод містить декілька М-ацетилгалактозамінних ланок, таких як он но о Н Н но о Ми о о он но о о Н Н но о Мити о о о о он но о но о МТК о
АСНМ Н Н о формула І.
Інший ілюстративний вуглеводний кон'югат, який можна використовувати у варіантах здійснення, описаних у даному документі, включає без обмеження но он о пили
АснМ н о о о о. о. о но я кита тю зо ето о о хо но ОН с Й - о. ! СХ о воло, о у Н т пн й ша гул
М Ге о о о о сосо
М формулу ХХІЇ, де якщо один із Х або У являє собою олігонуклеотид, то інший являє собою водень.
У деяких варіантах здійснення за даним винаходом СсаїЇМАс або похідну сСаіМАс приєднані до засобу на основі 45КМА за даним винаходом через одновалентний лінкер. У деяких варіантах здійснення бСаіМАс або похідну баіМмАс приєднані до засобу на основі а5КМА за даним винаходом через бівалентний лінкер. У деяких варіантах здійснення за даним винаходом саіМмАс або похідну СаіМАс приєднане до засобу на основі Д5КМА за даним винаходом через тривалентний лінкер. У деяких варіантах здійснення вуглеводний ліганд містить три М- ацетилгалактозамінні ланки, приєднані через тривалентний лінкер («заіМАсз»).
У деяких варіантах здійснення двонитковий засіб на основі а5КМА містить один саїІМАс або похідну саіМАс, приєднані до засобу на основі а5КМА. У деяких варіантах здійснення двонитковий засіб на основі 85КМА містить багато (наприклад, 2, 3, 4, 5 або б) саіМАс або похідних саМАс, кожне з яких незалежно приєднане до багатьох нуклеотидів двониткового засобу на основі а5КМА через багато одновалентних лінкерів.
Додаткові вуглеводневі кон'югати, придатні для використання в даному винаході, включають ті, що описані в публікаціях згідно з РСТ МоМо ММО2014/179620 та УМО2014/179627, які включені в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких кон'югатів.
Необмежувальні приклади вуглеводневих кон'югатів засобу на основі азхеЕМА з лінкерами, які можна використовувати в композиціях та способах, розкритих у даному документі, включають без обмеження он но о Н Н но о Ми ди о
АснМ тр но о - он но о
М
З о М М о но МН тр зи ша о
АснМ о о о о он но я, М с но тр за о
АснМ о формулу ХХІЇ, он но 9 н н но о М ит о ик тр но, о 7 но о. М 5 Н н М но о Мити о о ат тр ж Ї о о о он с но о є, ша о ик тр о формулу ХХІМ, но он о о Н я АХ У о кто
АснМ Й й о і у. о-У но он о о м зай
Кк. АД М о М доль но сь М Х У о
АснМ он н о но о о о х-1-30
З си я р т но о Мити
М о
АснМ н формулу ХХУ,
но он із Ї і ув М но о. УТ о, -
АСНМ Й МІЙ кт о он - но о о З по 9 си М о М дл До М АХ но Ул сх т лу в но (й о о о о о о ек я АЛ А АХ, ж-1-30
АСНМ Н у-115 формулу ХХМІ, но (ОН о но З о. и. М о х-о
МИТИ З
АСНМ Н он о зи у но о М т н КАХ М. ло М 8 ол і о У - о
АСНМ й З Зх Іі 7 но он о о о о о
М -0-30 я АЛ А АХ, ув
АСНМ Н формулу ХХМІЇ, но он о но. 5 си тн о х-о
АснМ Й З он о з ут но о М 7»
КАХ М. ло М вВ-в8 З но ля тегр о
АСНМ й п з Ї о " но он о о о о 9 н 55 АЛ А А АХ тав
АснМ н 272- 1-20 формулу ХХМІЇЇ, но он о о н шк
КА о х-о
АсНнМ н і , М но о о 7 М п н 5 Н н АХ
Ка АА ля ер те й о
АснМ н х о но он о о о ЇЇ Н Х Ус но о кричу о 7-1-20
АСНМ Н формулу ХХІХ та но он о о Н
КА о х У
АсНнМ н о . о но он о мн 5 М М АХ
Ка ол чел вс й о
АсНМ н х о но он о о 9 Ї у Х ув но оч о те 1-20
АсНнМ н формулу ХХХ, де якщо один із Х або У являє собою олігонуклеотид, то інший являє собою водень.
Зб
У деяких варіантах здійснення композицій та способів, розкритих у даному документі, ліганд являє собою одне або більше похідних «заіМАс» (М-ацетилгалактозаміну), приєднаних через бівалентний або тривалентний розгалужений лінкер.
У деяких варіантах здійснення засіб на основі а5КМА, розкритий у даному документі, кон'югований з бівалентним або тривалентним розгалуженим лінкером, вибраним із групи структур, продемонстрованих під будь-якою з формул (ХХХІ) - (ХХХІМ): ргА--20О2А--Я «А ІТ-т- | гА де рев--05---вв1 Тв. | 28 я формула ХХХІ,
А рак--о- 1 ти І ЗА теле " рж-о»--я» - 138 | зв я формула ХХХІЇ, рА-ЩТЗОКА- - АХ і -те- | А дА рее-ое--ве1--Те.. | 48 я формула ХХХІ! або ретов вет | ЗА де ров-ЯоО58--- рт 8 Я те І 5В дв рее---О0- Ве т І 5С " формула ХХХІМ; де д2А, д28В, азА, азв, д44А, д48, д45А, 4958 і 4д5С у кожному випадку незалежно становлять 0-20, і де повторювана ланка може бути однаковою або відмінною; кожен ІЗ РА, рев, РА, Рв, РА, рев, РА, Рв, Рос, ТРА, Т2В, ТА, тв. ТА, ТВ, ТА, Т5В, те у кожному випадку незалежно є відсутнім, являє собою СО, МН, 0, 5, ОС(О), МНС(О), СН»,
СНоМН або СНО;
ОСА, О2В, ОЗА, СВ, СУМА, ОВ, (р, СВ, 0рс, незалежно в кожному випадку відсутні, являють собою алкілен, заміщений алкілен, де одна або більше метиленових груп можуть перериватися або закінчуватися одним або кількома з 0, 5, (0), 502, М(В"У), С(В)-С(В"), СЕС або С(О); кожен з К2А, ВгВ, ВЗА, ЗВ, ЛА, ДВ, ДА, ДАЗВ, дос у кожному випадку незалежно є відсутнім, являє собою МН, 0, 5, СН, С(О)О, С(О)МН, МНОН(НгУ)С(О), -С(0)-СН(Вг)-МН-, СО, СН-М-О, о но о 5-98
Нн | - ДЖ бунт др М
ЗВ, як у пе и чи ; або гетероцикліл;
І га Ів ЗА, |в |А, |в |5А,|58 і |5Є являють собою ліганд; тобто кожен з них у кожному випадку незалежно являє собою моносахарид (такий як СаЇМАс), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олігосахарид або полісахарид; і Ка являє собою Н або бічний ланцюг амінокислоти. У разі засобів на основі Д5ЕМА, що служать для інгібування експресії цільового гена, особливо застосовними є тривалентні лінкери, за допомогою яких кон'югують похідні саїІМАс, такі як лінкери формули (ХХХІМ): ре-Тои Свв от | БА де ров-2058---25в тв. І 5В дв рес--ою- ВІТ І 5с до формула ХХХІМ, де 1 5А, 158 ї15С являють собою моносахарид, такий як похідну СаїІМАс.
Приклади придатних двовалентних і тривалентних розгалужених лінкерних груп, що кон'югують похідні аМАс, включають без обмеження структури, наведені вище у вигляді формул І, МІ, Х, ІХ і ХІІ.
В. Лінкери
У деяких варіантах здійснення кон'югат або ліганд, описані в даному документі, можуть бути приєднані до олігонуклеотиду засобу на основі ахзКМА за допомогою різних лінкерів, які можуть бути розщеплюваними або нерозщеплюваними.
Термін «лінкер» або «лінкерна група» означає органічний фрагмент, який з'єднує дві частини сполуки, наприклад ковалентно зв'язує дві частини сполуки. Лінкери, зазвичай, містять прямий зв'язок або атом, такий як атом кисню або сірки, ланку, таку як МАК8, С(О), С(О)МН, 50,
ЗО», 50О2МН, або ланцюг з атомів, такий як без обмеження заміщений або незаміщений алкіл, заміщений або незаміщений алкеніл, заміщений або незаміщений алкініл, арилалкіл, арилалкеніл, арилалкініл, гетероарилалкіл, гетероарилалкеніл, гетероарилалкініл, гетероциклілалкіл, гетероциклілалкеніл, гетероциклілалкініл, арил, гетероарил, гетероцикліл, циклоалкіл, циклоалкеніл, алкіларилалкіл, алкіларилалкеніл, алкіларилалкініл, алкеніларилалкіл, алкеніларилалкеніл, алкеніларилалкініл, алкініларилалкіл, алкініларилалкеніл, алкініларилалкініл, алкілгетероарилалкіл, алкілгетероарилалкеніл, алкілгетероарилалкініл, алкенілгетероарилалкіл, алкенілгетероарилалкеніл,
Зо алкенілгетероарилалкініл, алкінілгетероарилалкіл, алкінілгетероарилалкеніл, алкінілгетероарилалкініл, алкілгетероциклілалкіл, алкілгетероциклілалкеніл, алкілгетероциклілалкініл, алкенілгетероциклілалкіл, алкенілгетероциклілалкеніл, алкенілгетероциклілалкініл, алкінілгетероциклілалкіл, алкінілгетероциклілалкеніл, алкінілгетероциклілалкініл, алкіларил, алкеніларил, алкініларил, алкілгетероарил, алкенілгетероарил, алкініллетероарил, в якому один або більше метиленів можуть перериватися або закінчуватися О, 5, 5(0), 50», М(К8), С(О), заміщеним або незаміщеним арилом, заміщеним або незаміщеним гетероарилом, заміщеним або незаміщеним гетероциклічним радикалом; де К8 являє собою водень, ацил, аліфатичний або заміщений аліфатичний радикал. У деяких варіантах здійснення лінкер містить приблизно 1-24, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 або 8-16 атомів.
Розщеплювана лінкерна група являє собою групу, яка є достатньо стабільною поза клітиною, але яка після проникнення до цільової клітини розщеплюється з вивільненням двох частин, які утримуються лінкером разом. У деяких варіантах здійснення розщеплювана лінкерна група розщеплюється у щонайменше приблизно 10 разів, 20 разів, 30 разів, 40 разів, 50 разів, 60 разів, 70 разів, 80 разів, 90 разів або більше або у щонайменше приблизно 100 разів швидше у цільовій клітині або за першої еталонної умови (яка може, наприклад, бути вибрана для імітації або моделювання внутрішньоклітинних умов), ніж у крові суб'єкта або за другої еталонної умови (яка може, наприклад, бути вибрана для імітації або моделювання умов, наявних у крові або сироватці крові).
Розщеплювані лінкерні групи чутливі до засобів розщеплення, наприклад рН, окисно- відновлювального потенціалу або наявності руйнувальних молекул. Зазвичай, засоби для розщеплення є більш поширеними або виявляються на вищих рівнях або мають вищі значення активності всередині клітин, ніж у сироватці крові або крові. Приклади таких руйнувальних засобів включають: окисно-відновні засоби, які вибирають для конкретних субстратів або які не мають специфічності до субстратів, зокрема, наприклад, окисні або відновні ферменти або відновні засоби, такі як меркаптани, присутні в клітинах, які можуть руйнувати лінкерну групу, розщеплювану в результаті зміни окисно-відновного потенціалу, шляхом відновлення; естерази; ендосоми або засоби, які можуть створювати кисле середовище, наприклад такі, що приводять до рН, який становить п'ять або нижче; і ферменти, які можуть гідролізувати або руйнувати лінкерну групу, розщеплювану кислотами, діючи як універсальна кислота, пептидази (які можуть бути субстрат-специфічними) і фосфатази.
Розщеплювана лінкерна група, така як дисульфідний зв'язок, може бути сприйнятливою до рН. рН сироватки крові людини становить 7,4, у той час як середній внутрішньоклітинний рН є трохи нижчим і перебуває в діапазоні приблизно 7,1-7,3. Ендосоми характеризуються більш кислим рН в діапазоні 5,5-6,0, а лізосоми характеризуються ще більш кислим рН, який становить близько 5,0. Деякі лінкери будуть містити розщеплювану лінкерну групу, яка розщеплюється за переважного значення рН, завдяки чому катіонний ліпід вивільняється з ліганду всередину клітини або у бажаний компартмент клітини.
Лінкер може містити розщеплювану лінкерну групу, яка розщеплюється конкретним ферментом. Тип розщеплюваної лінкерної групи, включеної до складу лінкера, може залежати від клітини, яка підлягає націлюванню. Наприклад, ліганд, що націлюється на печінку, може бути зв'язаний з катіонним ліпідом за допомогою лінкера, який містить естерну групу. Клітини печінки
Є багатими на естерази, і, таким чином, лінкер може розщеплюватися більш ефективно в клітинах печінки, ніж у типах клітинах, які не є багатими на естерази. Інші типи клітин, багаті на естерази, включають клітини легені, кіркової речовини нирки і сім'яника.
Лінкери, які містять пептидні зв'язки, можна застосовувати у разі націлювання на інші типи клітин, багаті на пептидази, такі як клітини печінки та синовіоцити.
Зазвичай, придатність кандидатної розщеплюваної лінкерної групи можна оцінити за допомогою тестування здатності руйнівного засобу (або умови) розщеплювати кандидатну лінкерну групу. Крім того, бажаним також є тестування здатності кандидатної розщеплюваної
Зо лінкерної групи витримувати розщеплення в крові або у разі контакту з іншою тканиною, що не є мішенню. Таким чином, можна визначити відносну сприйнятливість до розщеплення між першою та другою умовою, де першу вибирають як показник розщеплення в цільовій клітині, а другу вибирають як показник розщеплення в інших тканинах або біологічних рідинах, наприклад у крові або сироватці крові. Оцінювання можна проводити в безклітинних системах, в клітинах, в культурі клітин, в культурі органу або тканин або у цілих тварин. Може бути корисним виконувати початкові оцінювання в умовах безклітинної системи або культури і підтверджувати їх шляхом додаткових оцінювань у цілих тварин. У переважних варіантах здійснення застосовні кандидатні сполуки розщеплюються щонайменше в приблизно 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 разів швидше в клітині (або в умовах іп мйго, вибраних для імітації внутрішньоклітинних умов) порівняно з кров'ю або сироваткою крові (або умовами іп міїго, вибраними для імітації позаклітинних умов). і. Лінкерні групи, розщеплювані в результаті зміни окисно-відновного потенціалу
У деяких варіантах здійснення розщеплювана лінкерна група являє собою лінкерну групу, розщеплювану в результаті зміни окисно-відновного потенціалу, яка розщеплюється в результаті відновлення або окиснення. Прикладом лінкерної групи, розщеплюваної в результаті відновлення, є дисульфідна лінкерна група (-5-5-). Для визначення того, чи є кандидатна розщеплювана лінкерна група придатною «лінксерною групою, розщеплюваною в результаті відновлення» або, наприклад, придатною для використання з конкретним фрагментом засобу на основі а5КМА і конкретним націлювальним засобом, можна звернутися до способів, описаних у даному документі. Наприклад, кандидата можна оцінювати шляхом інкубування з дитіотреїтолом (ОТТ) або іншим відновлювальним засобом із використанням реагентів, відомих з рівня техніки, які імітують швидкість розщеплення, яка спостерігалася б у клітині, наприклад цільовій клітині. Кандидати також можна оцінювати в умовах, які вибирають для імітації умов у крові або сироватці крові. У деяких варіантах здійснення кандидатні сполуки розщеплюються не більше, ніж на приблизно 10 95 у крові. У деяких варіантах здійснення застосовні кандидатні сполуки руйнуються у щонайменше приблизно 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або у приблизно 100 разів швидше в клітині (або в умовах іп мійго, вибраних для імітації внутрішньоклітинних умов) порівняно з кров'ю (або умовами іп міго, вибраних для імітації позаклітинних умов). Швидкість розщеплення кандидатних сполук можна визначити за бо допомогою стандартних аналізів ферментативної кінетики в умовах, вибраних для імітації внутрішньоклітинного середовища, і порівняно з умовами, вибраними для імітації позаклітинного середовища. і. Фосфатні розщеплювані лінкерні групи
У деяких варіантах здійснення розщеплюваний лінкер містить фосфатну розщеплювану лінкерну групу. Фосфатна розщеплювана лінкерна група розщеплюється засобами, які руйнують або гідролізують фосфатну групу. Прикладом засобу, який розщеплює фосфатні групи в клітинах, є ферменти, такі як клітинні фосфатази. Прикладами фосфатних лінкерних груп є -О-
РІОХОНК)-О-, -О-Р(ІБХОВК)-О-, -О-Р(ІЗ3УЗАКЮ)-О-, -5-Р(ІОХОВАК)-О-, -О-Р(ОХОВК)-5-, -5-
Р(ІОХОНК)-5-, -О-Р(БХО ВК)-5-, -5-Р(ЗХОВК)-О-, -0О-Р(О)(АК)-О-, -О-Р(Б)(АК)-О-, -5-Р(ОХАК)-О-, - 10. 5-Р(ІБХАК)-О-, -5-Р(0ХХАКЮ)-5-, -О-Р(З)(ВК)-5-. У деяких варіантах здійснення фосфатна лінкерна група являє собою -О-Р(ФОХОН)-О-, -О-Р(ІБХОН)-О-, -О-Р(Б)У5ЗН)-О-, -5-Р(ОХОН)-О-, -0-
Р(ІОХОН)-5-,. -5-Р(ОХОН)-5-,. -0О-Р(ЗХОН)-5-,. -5-Р(5ХОН)-О-, -0О-Р(ОХ(Н)-О-, -О-Р(ЗХН)-О-, -5-
Р(ІФОХН)-О, -5-Р(ЗХН)-О-, -5-Р(О)(Н)-5- або -О-Р(Б)(Н)-5-. У деяких варіантах здійснення фосфатна лінкерна група являє собою -О-Р(ФОХОН)-О-. Цих кандидатів можна оцінювати за допомогою способів, аналогічних описаним вище. ії. Розщеплювані кислотою лінкерні групи
У деяких варіантах здійснення розщеплюваний лінкер містить розщеплювану кислотою лінкерну групу. Розщеплювана кислотою лінкерна група являє собою лінкерну групу, яка розщеплюється в кислих умовах. У деяких варіантах здійснення лінкерні групи, розщеплювані кислотами, розщеплюються в кислому середовищі з рН приблизно 6,5 або нижче (наприклад, приблизно 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 або нижче) або за допомогою засобів, таких як ферменти, які можуть діяти як універсальна кислота. У клітині специфічні органели з низьким рнН, такі як ендосоми та лізосоми, можуть забезпечувати середовище для розщеплення лінкерних груп, розщеплюваних кислотами. Приклади лінкерних груп, розщеплюваних кислотами, включають без обмеження гідразони, естери та естери амінокислот. Групи, розщеплювані кислотами, можуть мати загальну формулу -С-ММ-, С(О)О або -ОС(О). У деяких варіантах здійснення атом вуглецю, приєднаний до атому кисню естерної групи (алкоксигрупи), являє собою арильну групу, заміщену алкільну групу або третинну алкільну групу, таку як диметилпентил або трет- бутил. Цих кандидатів можна оцінювати за допомогою способів, аналогічних описаним вище.
Зо їм. стерні лінкерні групи
У деяких варіантах здійснення розщеплюваний лінкер містить розщеплювану естерну лінкерну групу. Розщеплювана естерна лінкерна група розщеплюється в клітинах під дією ферментів, таких як естерази й амідази. Приклади естерних розщеплюваних лінкерних груп включають без обмеження естерні похідні алкіленових, алкеніленових та алкініленових груп.
Естерні розщеплювані лінкерні групи мають загальну формулу -С(0)0- або -0ОС(0)-. Цих кандидатів можна оцінювати за допомогою способів, аналогічних описаним вище. м. Пептидні розщеплювані групи
У деяких варіантах здійснення розщеплюваний лінкер містить пептидну розщеплювану лінкерну групу. Пептидна розщеплювана лінкерна група розщеплюється в клітинах під дією ферментів, таких як пептидази та протеази. Пептидні розщеплювані лінкерні групи являють собою пептидні зв'язки, утворювані між амінокислотами з одержанням олігопептидів (наприклад, дипептидів, трипептидів тощо) і поліпептидів. Пептидні розщеплювані групи не включають амідну групу (-С(О)МН-). Амідна група може бути утворена між будь-якими алкіленами, алкеніленами або алкінеленами. Пептидний зв'язок являє собою особливий тип амідного зв'язку, утворюваний між амінокислотами з одержанням пептидів і білків. Пептидна розщеплювана група, зазвичай, обмежена пептидним зв'язком (тобто амідним зв'язком), утворюваним між амінокислотами з одержанням пептидів і білків, і не включає всю амідну функціональну групу. Пептидні розщеплювані лінкерні групи мають загальну формулу -
МНОНААС(О)МНОНАВС(О)-, де РА і КВ являють собою Е-групи двох сусідніх амінокислот. Цих кандидатів можна оцінювати за допомогою способів, аналогічних описаним вище.
М. Доставка засобу на основі О5КМА
Доставку засобу на основі 5ЕМА за даним винаходом в клітину, наприклад у клітину в організмі суб'єкта, такого як суб'єкт-людина, можна здійснювати за допомогою різних способів.
Наприклад, доставку можна здійснювати шляхом приведення клітини в контакт із засобом на основі Д5ЕМА за даним винаходом або іп мійго, або іп мімо. їпй мімо доставку також можна здійснювати безпосередньо шляхом уведення суб'єкту композиції, що містить засіб на основі а5КМА. Як альтернатива, доставку іп мімо можна проводити опосередковано шляхом уведення одного або більше векторів, які кодують засіб на основі азхеЕМА і керують його експресією. Такі альтернативні варіанти додатково описані нижче. бо Загалом будь-який спосіб доставки молекули нуклеїнової кислоти (іп міго або іп мімо) може бути пристосований для використання з засобом на основі а5Е2ЕМА за даним винаходом (див., наприклад, АКпїаг 5. апа УОшіап КІ. (1992) Ттепаз СеїІ. ВіоІ. 2(5):139-144 та М/О94/02595, які включені в даний документ за допомогою посилання щодо ідей стосовно таких способів доставки). Що стосується доставки іп мімо, то чинники, які враховують в контексті доставки молекули засобу на основі ахеЕМА, включають, наприклад, біологічну стабільність молекули, що доставляється, запобігання неспецифічним ефектам і накопичення молекули, що доставляється, у цільовій тканині.
Що стосується системного введення засобу на основі а5КМА для лікування захворювання, то РНК може бути модифікована або, як альтернатива, доставлена за допомогою системи доставки лікарського засобу; обидва способи служать для запобігання швидкому руйнуванню а5зКМА ендо- та екзонуклеазами іп мімо. Модифікація РНК або фармацевтичний носій або фармацевтичний наповнювач також може сприяти націлюванню композиції, що містить засіб на основі 5КМА, на цільову тканину та уникненню небажаних нецільових ефектів. Молекули засобу на основі азКЕМА можуть бути модифікованими шляхом хімічного кон'югування, наприклад вуглеводневий кон'югат, описаний вище.
МІ. Фармацевтичні композиції
Даний винахід також включає фармацевтичні композиції та склади, що включають засоби на основі а5КМА за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення в даному документі передбачені фармацевтичні композиції, що містять засіб на основі Д5ЕМА, описаний у даному документі, і фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтичні композиції, які містять засіб на основі а5зКМА, застосовні для лікування захворювання або порушення, асоційованого з експресією або активністю гена НВУ. Такі фармацевтичні композиції складають залежно від способу доставки. Одним прикладом є композицій, які складені для системного введення за допомогою доставки парентеральним шляхом, наприклад шляхом підшкірної (С), внутрішньом'язової (ІМ) або внутрішньовенної (ІМ) доставки. У певних варіантах здійснення даний винахід передбачає композиції, які складають для органоспецифічної (наприклад, печінкової) внутрішньоартеріальної, внутрішньопухлинної, внутрішньошкірної, інтравітреальної ін'єкції, місцевого офтальмологічного, офтальмічного (краплі для очей) шляху введення, шляху введення через розпилення, місцевого офтальмологічного або інших місцевих шляхів доставки,
Зо введення за допомогою супозиторію або перорального введення. У переважних варіантах здійснення композиції вводять підшкірно.
Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити в дозах, достатніх для інгібування експресії гена НВМ. У деяких варіантах здійснення засіб на основі аОБКМА будуть вводити в дозі, що становить від приблизно 0,5 мг/кг до 50 мг/кг або від 0,3 мг/кг до 20 мг/кг, або від З мг/кг до 10 мг/кг на дозу або переважно від З мг/кг до 10 мг/кг на дозу. Наприклад, 452ЕМА можна вводити за приблизно 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2 мг/кг, З мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 30 мг/кг, мг/кг або 50 мг/кг на одну дозу. У деяких варіантах здійснення засіб на основі Д5ЕМА вводять в дозі, що становить від 50 мг до 900 мг.
Композиції можна одержувати та упаковувати у фіксованій дозі для суб'єкта, незалежно від 40 його маси. Ілюстративні рівні дозування можна підрахувати за допомогою множення дози на кілограм маси тіла на масу тіла середньостатистичного суб'єкта. Наприклад, вважають, що маса середньостатистичної дорослої людини, зазвичай, становить приблизно 70 кг.
Режим повторюваного введення доз може передбачати регулярне введення терапевтичної кількості засобу на основі а5КМА, як, наприклад, один раз на місяць, один раз на два місяці або один раз на три місяці. У переважних варіантах здійснення засіб на основі ОБКМА вводять не частіше, ніж один раз на місяць. Після здійснення схеми первинного лікування засоби лікування можна вводити з меншою частотою.
Фармацевтичну композицію можна вводити протягом невизначеного періоду часу, наприклад суб'єкта з однією або більше ознаками або симптомами інфекції, спричиненої НВУ, наприклад, визначуваним антигеном НВМ або ДНК НВУ, включаючи сссОМА НВУ. У деяких варіантах здійснення проводять лікування засобом на основі а5ЕМА протягом дискретного або визначеного періоду часу і здійснюють функціональне виліковування.
Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що на дози і часові рамки, необхідні для ефективного лікування суб'єкта, можуть впливати певні фактори, зокрема без обмеження тяжкість захворювання або порушення, види попереднього лікування, загальний стан здоров'я або вік суб'єкта та інші наявні захворювання. Крім того, лікування суб'єкта терапевтично ефективною кількістю композиції може передбачати курс лікування або декілька курсів лікування. Розрахунки ефективних доз і періодів напівжиття іп мімо для окремих засобів на основі 5ЕМА, охоплених даним винаходом, можна проводити із використанням традиційних методологій або на основі іп бо мімо тестування із використанням відповідної тваринної моделі, яка описана в іншому місці даного документа.
А. Наповнювачі «Фармацевтичний носій» або « фармацевтичний наповнювач» являє собою фармацевтично прийнятний розчинник, суспендувальний засіб або будь-яке інше фармакологічно інертне середовище-носій для доставки однієї або більше нуклеїнових кислот в організм тварини. Такі засоби добре відомі з рівня техніки.
В. Інші компоненти
Композиції за даним винаходом можуть додатково містити інші допоміжні компоненти, що традиційно містяться у фармацевтичних композиціях, за рівнів використання, визначених у рівні техніки. Таким чином, наприклад, композиції можуть містити додаткові сумісні фармацевтично активні матеріали, такі як наприклад, протисвербіжні засоби, в'яжучі засоби, місцеві анестетики або протизапальні засоби, або можуть містити додаткові матеріали, застосовні для фізичного складання композицій за даним винаходом у вигляді різних лікарських форм, такі як консерванти, антиоксиданти й стабілізатори. Однак, такі матеріали, за додавання, не повинні суттєво перешкоджати прояву видів біологічної активності компонентів композицій за даним винаходом. Склади можна піддавати стерилізації та за необхідності змішувати з допоміжними засобами, наприклад консервантами, стабілізаторами, змочувальними засобами, емульгаторами, солями для впливу на осмотичний тиск або буферами тощо, які не взаємодіють несприятливим чином з нуклеїновою(ими) кислотою(ами) складу.
У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції, наведені в даному винаході, включають (а) одну або більше сполук, що являють собою засіб на основі а5ЕМА, і (Б) один або більше засобів, які діють за механізмом, відмінним від КМАЇ, їі які застосовні під час лікування порушення, асоційованого з НВМ порушення. Приклади таких засобів включають без обмеження протизапальний засіб, засоби проти стеатозу, противірусний засіб та засіб проти фіброзу.
Крім того, інші речовини, зазвичай застосовувані для захисту печінки, такі як силімарин, також можна застосовувати в поєднанні із засобами на основі а5ЕМА, описаними в даному документі. Інші засоби, застосовні для лікування захворювань печінки, включають телбівудин, ентекавір та інгібітори протеаз, такі як телапревір та інші, розкриті, наприклад, у 052005/0148548, 052004/0167116, 052003/0144217 та О052004/0127488.
Зо Токсичність і терапевтична ефективність таких сполук можуть бути визначені за допомогою стандартних фармацевтичних процедур на культурах клітин або експериментальних тваринах, наприклад, для визначення 050 (дози, летальної для 5095 популяції) і ЕО5О (дози, терапевтично ефективної для 50 95 популяції). Співвідношення доз, що обумовлюють токсичний і терапевтичний ефекти, являє собою терапевтичний індекс і його можна виразити як співвідношення ГО050/ЕЮО50О. У деяких варіантах здійснення переважними є сполуки, які характеризуються високими терапевтичними індексами.
Дані, одержані в аналізах на культурах клітин і в дослідженнях на тваринах, можна застосовувати при складанні діапазону доз для використання у людей. У даному винаході доза композицій, наведених у даному документі, зазвичай, входить у межі діапазону циркулювальних концентрацій, який включає ЕЮ5О зі слабкою токсичністю або без неї. Доза може варіювати в цьому діапазоні залежно від застосовної лікарської форми й використовуваного шляху введення. Для будь-якої сполуки, застосовуваної в способах, наведених у даному винаході, терапевтично ефективну дозу можна спочатку визначити за результатами аналізів на культурах клітин. Дозу можна складати в тваринних моделях з одержанням діапазону концентрацій сполуки або, за необхідності, поліпептидного продукту з цільовою послідовністю, що циркулюють у плазмі крові (наприклад, для досягнення зменшеної концентрації поліпептиду), яка включає /ІС5О (тобто концентрацію досліджуваної сполуки, за якої досягають напівмаксимального інгібування симптомів), що визначають у культурі клітин. Таку інформацію можна застосовувати для більш точного визначення доз, застосовних у людей. Рівні в плазмі крові можна вимірювати, наприклад, за допомогою високоефективної рідинної хроматографії.
Крім того для їх введення, обговореного вище, засоби на основі а5ЕМА, описані в даному документі, можна вводити в комбінації з іншими відомими засобами, ефективними під час лікування інфекції, спричиненої НВМ. У кожному випадку лікар, що здійснює введення, може коригувати кількість і часові межі введення засобу на основі а5ЕМА, виходячи з результатів, спостережуваних у разі використання стандартних показників ефективності, відомих з рівня техніки або описаних у даному документі.
МІ. Способи
Даний винахід також передбачає способи інгібування експресії НВМ в клітині. Способи включають приведення клітини в контакт із засобом на основі ахКМА, наприклад двонитковим 60 засобом на основі йа5КМА, за кількості, що є ефективною для інгібування експресії НВМ в клітині,
з інгібуванням таким чином експресії НВМ в клітині.
Приведення клітини в контакт із засобом на основі ахКМА, наприклад двонитковим засобом на основі О5ЕМА, можна здійснювати іп міїго або іп мімо. Приведення клітини в контакт іп мімо із засобом на основі ахКМА передбачає приведення клітини в контакт або групи клітин в організмі суб'єкта, наприклад суб'єкта-людини, із засобом на основі 45ЕЕМА. Також можливі комбінації способів приведення клітини в контакт іп міїго та іп мімо. Приведення клітини в контакт може бути безпосереднім або опосередкованим, як обговорювалося вище. Більш того, приведення клітини в контакт можна виконувати за допомогою націлювального ліганду, зокрема будь-якого ліганду, описаного в даному документі або відомого з рівня техніки. У переважних варіантах здійснення націлювальний ліганд являє собою вуглеводний фрагмент, наприклад ліганд СсСаіМАсз, або будь- який інший ліганд, який спрямовує засіб на основі а5КМА до сайту, що становить інтерес.
У деяких варіантах здійснення способів за даним винаходом засіб на основі а5КМА вводять суб'єкту так, що засіб на основі а5хКМА доставляється в специфічний сайт в організмі суб'єкта.
Інгібування експресії гена НВМ можна оцінювати за допомогою вимірювань рівня або зміни рівня
ТЕМА НВУ або білка НВМУ у зразку, одержаному з рідини або тканини з конкретного сайту в організмі суб'єкта. У переважних варіантах здійснення сайт вибирають з печінки та крові. Сайт також може являти собою підрозділ або підгрупу клітин або рідину, одержані з будь-якого із вказаних вище сайтів.
У деяких варіантах здійснення способи, розкриті в даному документі, є застосовними для лікування суб'єкта, що має інфекцію, спричинену НВМ, наприклад суб'єкта, якому принесе користь зменшення експресії гена НВМ або реплікації НВМ. В одному аспекті даний винахід передбачає способи зниження рівня сссОМА вірусу гепатиту В у суб'єкта, інфікованого НВМ. В іншому аспекті даний винахід передбачає способи зниження рівня антигена НВУ, наприклад
НВЗАЯд або НВедоа, у суб'єкта, інфікованого НВУ. В іншому аспекті даний винахід передбачає способи зниження вірусного навантаження НВМ у суб'єкта, інфікованого НВМ. Даний винахід також передбачає способи зниження рівня аланінамінотрансферази (АТ) або аспартатамінотрансферази (АТ) у суб'єкта, інфікованого НВМ (хоча тимчасове підвищення рівнів АЇТ або АБТ може бути асоційоване з виведенням вірусу). В одному аспекті даний винахід передбачає способи підвищення рівня антитіл до НВМ у суб'єкта, інфікованого НВМ. В
Зо іншому аспекті даний винахід передбачає способи лікування суб'єкта, що має інфекцію. спричинену НВУ. В одному аспекті даний винахід передбачає способи лікування суб'єкта, що має асоційоване з НВМ захворювання, наприклад інфекцію. спричинену вірусом гепатиту 0, гепатит дельта, гострий гепатит В; гострий фульмінантний гепатит В; хронічний гепатит В; фіброз печінки; захворювання печінки на термінальній стадії або гепатоцелюлярну карциному.
Також, оскільки інфекція, спричинена НОМ, залежить від обов'язкових допоміжних функцій, що надаються НВУ, для передачі, та суб'єкти, що мають інфекцію, спричинену НВУ, також можуть мати інфекцію, спричинену НОМ, у деяких варіантах здійснення способи лікування, описані в даному документі, є також застосовними для лікування суб'єкта, що має інфекцію, спричинену
НОМ, або асоційоване з НОМ порушення, таке як інфекція, спричинена вірусом гепатиту В, інфекція, що являє собою хронічний гепатит В (СНВ), інфекція, що являє собою хронічний гепатит В (СНВ), цироз, печінкова недостатність та гепатоцелюлярна карцинома (НСС). У деяких варіантах здійснення способи (і шляхи використання) лікування за даним винаходом включають введення суб'єкту, наприклад людині, терапевтично ефективної кількості засобу на основі а45ЕМА за даним винаходом, що націлюється на ген НВМ, або фармацевтичної композиції, що містить засіб на основі 45ЕМА за даним винаходом, що націлюється на ген НВУ.
В одному аспекті даний винахід передбачає способи попередження щонайменше одного симптому у суб'єкта, що має інфекцію, спричинену НВУ, наприклад наявність сссОМА НВМ в сироватці крові або печінці; наявність ДНК НВМ в сироватці крові; наявність антигена НВМ в сироватці крові або печінці, наприклад НВ5ЗАд або НВедАо; підвищений рівень АЇТ; підвищений рівень А5Т; відсутність або низький рівень антитіл до НВУ; враження печінки; цироз; гепатит дельта, гострий гепатит В; гострий фульмінантний гепатит В; хронічний гепатит В; фіброз печінки; захворювання печінки на термінальній стадії; гепатоцелюлярну карциному; подібний сироватковій хворобі синдром; анорексію; нудоту; блювання, слабку гарячку; міалгію; втомлюваність; порушені відчуття смакової гостроти та запаху (відраза до їжі та сигарет); біль у правому верхньому квадранті та епігастральний біль (періодичний, від легкого до помірного); енцефалопатію печінки; сонливість; порушення режиму сну; сплутаність свідомості; кому; асцит; шлунково-кишкову кровотечу; коагулопатію; розлиття жовчі; гепатомегалію (злегка збільшена, м'яка печінка); спленомегалію; еритему долонь; павукоподібну гемангіому; м'язову атрофію; павукоподібну ангіому; запалення кровоносних судин; варикозну кровотечу; периферійний бо набряк; гінекомастію; атрофію тестикул; порушення з боку черевних колатеральних вен (голова медузи); рівні АЇТ вищі, ніж рівні А5Т; підвищені рівні гама-глутаміл-транспептидази (СТ) та лужної фосфатази (АГР), є не більшим, ніж З-кратне значення ШІ М); злегка низькі рівні альбуміну; підвищені рівні заліза в сироватці крові; лейкопенію (тобто гранулоцитопенію); лімфоцитоз; підвищену швидкість осадження еритроцитів (Е5К); скорочене виживання червоних клітин крові; гемоліз; тромбоцитопенію; пролонгацію міжнародного коефіцієнта нормалізації (ІМК); наявність в сироватці крові або печінці НВ5ЗАд, НВедо, антитіло класу імуноглобуліна М (І9М) до корового білка гепатиту В (антитіло до НВс); антитіло до поверхневого білка гепатиту В (антитіло до НВ5) або антитіло до е білка гепатиту В (антитіло до
НВе) або ДНК НВУ; підвищені рівні білірубіну; гіперглобулінемію; наявність тканино- неспецифічних антитіл, таких як антитіла до гладеньких м'язів (АБМА) або антитіла до ядер (АМА) (10-20 95); наявність тканино-специфічних антитіл, таких як антитіла до щитовидної залози (10-20 95); підвищені рівні ревматоїдного фактору (КЕ); низький рівень тромбоцитів і лейкоцитів; лобулярний некроз з дегенеративними та регенеративними гепатоцелюлярними змінами та супутніми запаленнями або переважно центрилобулярний некроз, що виявляється чи не виявляється. Способи включають введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості засобу на основі 45ЕМА, наприклад а5ЕМА, або фармацевтичної композиції, що містить засіб на основі Д5ЕМА, з попередженням таким чином щонайменше одного симптому у суб'єкта, що має порушення, який буде мати користь від зниження експресії гена НВУ, такого як суб'єкт, що має інфекцію, спричинену НВУ, або суб'єкт, що має інфекцію, спричинену як НВУ, так і НОМ.
В іншому аспекті даний винахід передбачає шляхи використання терапевтично ефективної кількості засобу на основі 45КМА за даним винаходом для лікування суб'єкта, наприклад суб'єкта, який буде мати користь від зниження або інгібування експресії гена НВМ, такого як суб'єкт, що має інфекцію, спричинену НВУ, або суб'єкт, що має інфекцію, спричинену як НВУ, так і НОМ.
У додатковому аспекті даний винахід передбачає шляхи використання засобу на основі а5зКМА, наприклад азКМА, за даним винаходом, що націлюється на ген НВМ, або фармацевтичної композиції, що містить засіб на основі 5КМА, що націлюється на ген НВУ, у виробництві лікарського препарату для лікування суб'єкта, наприклад суб'єкта, який буде мати користь від зниження експресії гена НВУ або реплікації НВУ, такого як суб'єкт, що має інфекцію,
Зо спричинену НВУ, або суб'єкт, що має інфекцію, спричинену як НВУ, так і НОМ, та суб'єкт, що має порушення, за якого буде користь від зменшення експресії гена НВМУМ, наприклад асоційоване з НВМ захворювання.
В іншому аспекті даний винахід передбачає шляхи використання засобу на основі а5КМА, описаного в даному документі, для попередження щонайменше одного симптому у суб'єкта, що страждає від порушення, за якого буде користь від зниження або інгібування експресії гена НВМ або реплікації НВМ.
В додатковому аспекті даний винахід передбачає шляхи використання засобу на основі а5зКМА, описаного в даному документі, у виробництві лікарського препарату для попередження щонайменше одного симптому у суб'єкта, що страждає від порушення, за якого буде користь від зниження або інгібування експресії гена НВМ або реплікації НВУ, такого як асоційоване з НВУ захворювання.
У деяких варіантах здійснення засіб на основі О5КМА , що націлюється на НВУ, вводять суб'єкту, що має інфекцію, спричинену НВУ, або інфекцію. спричинену як НВУ, так і НОМ, або асоційоване з НВМ захворювання так, що експресія одного або більше генів НВУ, рівень сссОМА НВУ, рівень антигена НВУ, рівень вірусного навантаження НВУ, рівень АЇТ або АЗ5Т, наприклад, в клітині, тканині, крові або іншій тканині або рідині суб'єкта знижується або нормалізується на щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 9595, 9895 або більше в напрямку до нормального, коли засіб на основі 45ЕМА вводять суб'єкту.
Способи і шляхи використання за даним винаходом включають у деяких варіантах здійснення введення композиції, описаної в даному документі, так, що експресія цільового гена
НВМ є зниженою, як протягом приблизно 1 місяця. У деяких варіантах здійснення експресія цільового гена НВМ є зниженою протягом більш тривалого періоду часу, наприклад щонайменше двох місяців, трьох місяців або довше. У деяких варіантах здійснення способи і шляхи використання за даним винаходом включають введення композиції, описаної в даному документі, що приводить до функціонального виліковування.
Уведення Я5ЕМА згідно зі способами і шляхами використання, описаними в даному документі, може привести до зниження тяжкості, ступеню прояву ознак, симптомів або рівня маркерів таких захворювань або порушень у пацієнта з інфекцією, спричиненою НВУ, або інфекцією, спричиненою як НВУМ, так і НОМ, або асоційованим з НВМ захворюванням. Під бо «зниженням» у даному контексті розуміють клінічно значуще зниження такого рівня. Зниження може становити, наприклад, на щонайменше 80 9», 85 95, 90 95, 95 95 або 98 95 або до рівня, нижчого, ніж той, що можна виявити.
У деяких варіантах здійснення ефективність способів за даним винаходом можна відстежувати за допомогою виявлення або відстежування зниження щодо ступеню прояву симптому асоційованого з НВМ захворювання. Такі симптоми можна оцінювати іп міго або іп мімо з використанням будь-якого способу, відомих з рівня техніки.
Ефективність лікування захворювання можна оцінювати, наприклад, шляхом вимірювання прогресування захворювання, ремісії захворювання, тяжкості симптомів, зменшення болю, оцінки якості життя, дози лікарського препарату, необхідної для підтримання ефекту лікування, рівня маркера захворювання або будь-якого іншого вимірюваного параметра, відповідного вказаному захворюванню, лікування якого здійснюють. Контроль ефективності лікування шляхом вимірювання будь-кого з таких параметрів або будь-якої комбінації параметрів належить до компетенції фахівця в даній галузі. Наприклад, ефективність лікування СНВ можна оцінювати, наприклад, шляхом періодичного відстежування вірусного навантаження та рівнів трансамінази. Шляхом порівняння пізніших даних із вихідними даними лікар одержує показання того, чи є лікування ефективним. Контроль ефективності лікування шляхом вимірювання будь- кого з таких параметрів або будь-якої комбінації параметрів належить до компетенції фахівця в даній галузі. Стосовно введення засобу на основі а5ЕМА, що націлюється на НВУ, або фармацевтичної композиції на його основі, «ефективний щодо» асоційованого з НВМ захворювання означає, що введення клінічно придатним чином приводить до корисного ефекту у щонайменше статистично значущої частини пацієнтів, такого як поліпшення щодо симптомів, виліковування, зниження ступеню прояву захворювання, подовження життя, поліпшення якості життя або інший ефект, який, як правило, визначається як позитивний лікарями, компетентними в лікуванні інфекції, спричиненої НВУ, або асоційованого з НВМ захворювання та споріднених випадків.
Лікувальний ефект є очевидним, коли спостерігається клінічно значуще поліпшення одного або більше параметрів хворобливого стану або коли відсутнє погіршення або розвиток симптомів у тих випадках, коли вони, навпаки, прогнозувалися. Зазвичай, позитивна зміна вимірюваного показника захворювання щонайменше на 50 95 і переважно щонайменше на 70 Фо
Зо або більше, може служити ознакою ефективного лікування. Про ефективність даного лікарського засобу, що являє собою засіб на основі 45ЕМА, або складу з таким лікарським засобом можна також робити висновок за допомогою експериментальної тваринної моделі даного захворювання, яка відома з рівня техніки. У разі використання експериментальної тваринної моделі ефективність лікування доведена в тому випадку, коли спостерігають статистично значуще зниження ознаки або ослаблення симптому.
Уведення засобу на основі 45ЕМА може знизити наявність СССОМА НВМ в сироватці крові або печінці, наявність антигена НВУ в сироватці крові або печінці, наприклад НВ5Ад або НВедо; або нормалізувати рівні АЇ Т або рівні А5Т, наприклад, в клітині, тканині, крові, сечі або іншому компартменті в організмі пацієнта на щонайменше 70 95, 75 90, 80 Фо, 85 95, 90 956 або 95 95 або до рівня, нижчого, ніж той, що можна виявити аналізом, в напрямку до вищого рівня нормального значення для лабораторного значення або до нього.
Уведення засобу на основі 45КМА може сприяти виявленню або підвищити наявність антитіл до НВМ в сироватці крові або печінці, наприклад антитіл до НВ5АЯ, наприклад, в клітині, тканині, крові, сечі або іншому компартменті в організмі пацієнта на щонайменше 80 95, 85 о, 90 Уь, 95 95 або більше; або сприяти виявленню антитіл, якщо вони були невиявлюваними до лікування.
Завдяки ефектам інгібування щодо експресії НВМ у деяких варіантах здійснення композиція за даним винаходом або фармацевтична композиція, одержана з неї, може підвищити якість життя.
Суб'єкти, які будуть мати користь від зниження або інгібування експресії гена НВУ, являють собою тих, які мають інфекцію, спричинену НВМУ, або асоційоване з НВМ захворювання або порушення, описані в даному документі.
Лікування суб'єкта, який буде мати користь від зниження або інгібування експресії гена НВМ, включає терапевтичне і профілактичне лікування.
Даний винахід додатково передбачає способи і шляхи використання засобу на основі а5ЕМА або фармацевтичної композиції на його основі для лікування суб'єкта, який буде мати користь від зниження або інгібування експресії гена НВУ, наприклад суб'єкта, що має асоційоване з НВМ захворювання, в комбінації з іншими фармацевтичними або іншими терапевтичними способами, наприклад з відомими фармацевтичними препаратами або відомими терапевтичними 60 способами, такими як, наприклад, такі, які застосовуються в даний час для лікування таких порушень.
Наприклад, у деяких варіантах здійснення засіб на основі 45ЕМА, що націлюється на один або більше генів НВУ, вводять в комбінації з, наприклад, засобом, придатним для лікування асоційованого з НВМ захворювання, описаного в даному документі. Наприклад, додаткові терапевтичні засоби і терапевтичні способи, придатні для лікування суб'єкта, який буде мати користь від зниження експресії НВМ, наприклад суб'єкта, що має асоційоване з НВМУ захворювання, включають засіб на основі ахКМА, що націлюється на різні частини геному НВУ, противірусний засіб, аналог нуклеотиду, аналог нуклеозиду, інгібітор зворотної транскриптази (наприклад, тенофовіру дизопроксилу фумарат (ТОБ), тенофовіру алафенамід, ламівудин, адефовіру дипівоксил, ентекавір (ЕТМ), телбівудин, АСХ-1009, емтрицитабін, клевудин, ритонавір, дипівоксил, лобукавір, фамвір, ЕТС, М-ацетил-цистеїн (МАС), РС1323, терадигм-НВУ, тимозин-альфа й ганцикловір), імуностимулятор (наприклад, пегільований інтерферон альфа- га (РЕС-ІЕМ-ага), інтерферон альфа-2Б, рекомбінантний людський інтерлейкін-7 та агоніст ТоЇЇ- подібного рецептора 7 (ТІ К7)), терапевтичну вакцину (наприклад, 55-4774, ЮБМ-601 та ТО1050), інгібітор вірусного проникнення (наприклад, мірклудекс), олігонуклеотид, що інгібує секрецію або вивільнення НбзАд (наприклад, КЕР 9АС), інгібітор збирання капсиду (наприклад, Вау41- 4109 та ММА-1221), інгібітор сссОМА (наприклад, ІНМК-25) або інші терапевтичні засоби або процедури, наприклад трансплантанти печінки або хіміотерапевтичні засоби, для лікування асоційованого з НВМ захворювання або будь-які комбінації вищенаведеного.
Суб'єкту, якому вводять засіб на основі О5КМА за даним винаходом, можна додатково вводити один або більше інших терапевтичних засобів, які діють відмінним від КМАЇї механізмом і які є застосовними під час лікування інфекції, спричиненої НВУ. Ілюстративні терапевтичні засоби, які можна використовувати в комбінованій терапії за даним винаходом, включають імуномодулятори, які стимулюють імунну систему за допомогою, наприклад, посилення активності Т-хелперних клітин, дозрівання В-лімфоцитів, інгібування пригнічувачів Т-клітин та посилення експресії НГА | типу. Придатні імуномодулятори включають інтерферони, які характеризуються різноманітними властивостями, що включають противірусні, імуномодуляторні та антипроліферативні ефекти.
Наприклад, в даний час лікування хронічного гепатиту В представляє собою терапію
Зо інтерфероном, який вводять суб'єктам, у яких є задокументована інфекція, спричинена НВУ, протягом щонайменше шести місяців, підвищений рівень печінкових ферментів (А5Т та АГ Т) та вірусу в крові, що активно ділиться (НВелйод- або ДНК-НВМУ-позитивні тести). Терапія інтерфероном-а надає довготривалу, стабільну ремісію захворювання у приблизно 35 95 тих, Що мають хронічний гепатит В, з нормалізацією рівня печінкових ферментів та втратою трьох маркерів активної інфекції (НВелХо, ДНК НВМ та НВз5АЯд). Суб'єктів з гострою інфекцією, спричиненою НВМ, цирозом на термінальній стадії або іншими основними медичними проблемами, зазвичай, не лікують інтерфероном.
Крім того, терапія інтерфероном для пацієнтів з асоційованим з НВМ цирозом значно знижує розмір гепатоцелюлярної карциноми (НСС), особливо у пацієнтів з більшою кількістю ДНК НВМ у сироватці крові. У пацієнтів з НВедд-позитивним компенсованим цирозом вірологічна та біохімічна ремісія після терапії інтерфероном пов'язана з поліпшеним виживанням. У пацієнтів з хронічною інфекцією, спричиненою НВУ, виведення НВеАд після лікування інтерфероном-а асоційоване з поліпшеними клінічними результатами. Вважається, що стандартна тривалість терапії складає 16 тижнів. Пацієнти, які демонструють низький рівень реплікації вірусу в кінці стандартної схеми лікування, отримують найбільшу користь від подовженого лікування.
У деяких варіантах здійснення способи за даним винаходом включають введення інгібітору зворотної транскриптази суб'єкту, що має інфекцію, спричинену НВУ, або асоційоване з НВМ захворювання. У деяких варіантах здійснення способи за даним винаходом включають введення інгібітора зворотної транскриптази й імуностимулятора суб'єкту, що має інфекцію, спричинену НВУ, або асоційоване з НВМ захворювання.
Засіб на основі Й5КМА та додатковий терапевтичний засіб або засіб лікування можна вводити в той самий час або в тій самій комбінації, наприклад парентерально, або додатковий терапевтичний засіб можна вводити як частину окремої композиції або в окремі моменти часу або за допомогою іншого способу, відомого з рівня техніки або описаного в даному документі.
Даний винахід також передбачає способи використання засобу на основі 45ЕМА або композиції, що містить засіб на основі а5КМА, описаний у даному документі, для зниження або інгібування експресії НВМ в клітині. У ще додаткових аспектах передбачається використання засобу на основі а5КМА або композиції, що містить засіб на основі Д5ЕМА, описаний в даному документі, для виробництва лікарського препарату для зниження або інгібування експресії гена 60 НВМ в клітині. У ще інших аспектах даний винахід передбачає засіб на основі 45ЕМА або композицію, що містить засіб на основі а5КМА, розкритий у даному документі, для використання для зниження або інгібування реплікації НВМ в клітині У ще додаткових аспектах передбачається використання засобу на основі 5ЕМА або композиції, що містить засіб на основі Д5КМА, розкритий у даному документі, для виробництва лікарського препарату для зниження або інгібування реплікації НВМ в клітині. Способи і шляхи використання передбачають приведення клітини в контакт із засобом на основі а5КМА, який розкритий у даному документі, і підтримання клітини протягом часу, достатнього для досягнення руйнування теЕМА-транскрипту гена НВУ, з інгібуванням таким чином експресії гена НВМ або з інгібуванням реплікації НВМ в клітині.
У вищезгаданих способах і шляхах використання клітину можна приводити в контакт іп міїго або іп мімо, тобто клітина може бути в організмі суб'єкта.
Клітина, придатна для лікування з використанням способів, розкритих у даному документі, може являти собою будь-яку клітину, яка експресує ген НВУ, наприклад клітину, інфіковану
НВУ, клітину, що містить вектор експресії, що містить геном НВМ або частину гена НВУ, або трансгенну мишу, що експресує ген НВМ. Клітина, придатна для використання в способах і шляхах використання, розкритих у даному документі, може являти собою клітину ссавця, наприклад клітину примата (таку як клітина людини або клітина примата, відмінного від людини, наприклад клітина мавпи або клітина шимпанзе) або відмінну від клітини примата (таку як клітина миші, клітина пацюка або клітина іншого ссавця). У певних варіантах здійснення клітина являє собою клітину, яка може бути інфікована НВМ. У певних варіантах здійснення клітина являє собою клітину людини, наприклад клітину печінки людини.
Експресія гена НВМ може бути інгібована в клітині на щонайменше 80 95, 85 95, 90 95 або 9595 або більше, наприклад до рівня, нижчого ніж той, який можна виявити конкретним аналізом.
Реплікація НВМ може бути інгібована в клітині на щонайменше 80 95, 85 95, 90 95 або 95 95 або більше, наприклад до рівня, нижчого ніж той, який можна виявити конкретним аналізом.
Способи і шляхи використання іп мімо, розкриті в даному документі, можуть включати введення суб'єкту композиції, яка включає засіб на основі Д5КМА, при цьому засіб на основі а5КМА включає нуклеотидну послідовність, яка є комплементарною щонайменше частині РНК-
Зо транскрипту гена НВМ ссавця, що підлягає лікуванню. Якщо організм, який підлягає лікуванню, являє собою людину, композицію можна вводити за допомогою будь-якого із способів, відомих з рівня техніки, включаючи без обмеження підшкірне, внутрішньовенне або внутрішньом'язове введення. У деяких варіантах здійснення композиції вводять за допомогою підшкірної ін'єкції. У деяких варіантах здійснення засіб на основі ахКМА складають так, щоб вводити повну дозу за допомогою однієї ін'єкції. У деяких варіантах здійснення даний винахід передбачає композиції, які складають для органоспецифічної (наприклад, печінкової) внутрішньоартеріальної, внутрішньопухлинної, внутрішньошкірної, інтравітреальної ін'єкції, місцевого офтальмологічного, офтальмічного (краплі для очей) шляху введення, шляху введення через розпилення, місцевого офтальмологічного або інших місцевих шляхів доставки, введення за допомогою супозиторію або перорального введення.
В одному аспекті даний винахід також передбачає способи для інгібування експресії гена
НВМ у ссавця, наприклад людини. Даний винахід також передбачає композицію, що містить засіб на основі Д5ЕМА, який націлюється на ген НВМУ в клітині ссавця, для використання під час інгібування експресії гена НВМ у ссавця. В іншому аспекті даний винахід передбачає використання засобу на основі 45КЕМА, який націлюється на ген НВМ в клітині ссавця, для виробництва лікарського препарату для інгібування експресії гена НВУ у ссавця.
Способи і шляхи використання включають введення ссавцю, наприклад людині, композиції, що включає засіб на основі азКМА, який націлюється на ген НВМ в клітині ссавця, і підтримку дози для ссавця протягом часу, достатнього для досягнення руйнування ткМА-транскрипту гена НВУ, з інгібуванням таким чином експресії гена НВУ у ссавця.
У певних варіантах здійснення зниження в експресії гена можна оцінювати в зразку периферичної крові суб'єкта, якому вводиться засіб на основі Д5ЕМА, за допомогою будь-яких способів, відомих з рівня техніки, наприклад ДКТ-РСЕ, описаної в даному документі. Зниження ступеню продукування білка можна оцінювати за допомогою будь-яких способів, відомих з рівня техніки, та за допомогою способів, наприклад ЕГІ5ЗА або вестерн-блотингу, описаних у даному документі. Клінічно прийнятні способи для визначення рівнів експресії гена і білка, застосовують, як придатні. У певних варіантах здійснення зразок пункційної біопсії печінки служить матеріалом тканини, який використовують для відстежування зниження експресії гена або білка НВУ. У деяких варіантах здійснення зразок крові служить матеріалом тканини, який бо використовують для відстежування зниження експресії гена або білка НВУ.
У деяких варіантах здійснення підтвердження КІЗС-опосередкованого розщеплення мішені іп мімо з подальшим введенням засобу на основі азхКМА здійснюють за допомогою проведення 5-КАСЕ або модифікацій протоколів, відомих з рівня техніки (І азхпат А еї аї., (2010) Мисієїс Асіа
Вез., 38 (3) р-е19) (Літтетптанптп есеї аї. (2006) Маїшиге 441: 111-4).
Даний винахід додатково проілюстрований наступними прикладами, які не слід тлумачити як обмежувальні.
ПРИКЛАДИ
ПРИКЛАД 1
СИНТЕЗ ЗАСОБУ НА ОСНОВІ а5КМА
Джерело реагентів
Там, де джерело реагенту конкретно не вказано, такий реагент можна одержати у будь- якого постачальника реагентів для молекулярної біології за стандартом якості/чистоти для використання в молекулярній біології.
Конструювання засобу на основі а5ЕМА
Як описано в УУО/2016/077321, вибір конструкцій азЕМА, що націлюються на НВУ, проводили за допомогою двох основних факторів: а) ефективності та Б) необхідності залучати засоби зі спарюванням, близьким до ідеального, та більшим за 90 95 покриттям фракцій величезного числа загальнодоступних послідовностей НВМ всіх відомих генотипів (від А до Н).
Вибір координат для засобу на основі РНК проводили щодо референтної послідовності геному
НВМ з МСВІ під МС 003977.1 (Мо доступу в СепВапк 01:21326584 (5БО І МО'1)).
Конструювали, синтезували та проводили скринінг іп міго першого набору засобів на основі
РНК, що передбачають модифікації структури-активності, зокрема різноманітні 2'-О-метил- та 2'- фтор-заміщені мотиви, віддентровані на двох суміжних ділянках геному НВУ, які кодують поверхневий антиген (НЬБАЯ) та полімеразу НВМ. Також конструювали, синтезували та проводили скринінг іп міго другого набору засобів, що націлюються на додаткові ділянки в геномі НВУ, зокрема положення 1581-1599 5ЕО ІО МО", ділянку, яка кодує НЬЗАЯ, полімеразу та ген Х. Вибрані послідовності піддавали додатковій хімічній модифікації і тестуванню. Ці дуплексні конструкції представлені в ММО2016/077321 (повний вміст якої включений у даний документ за допомогою посилання); докладний перелік немодифікованих нуклеотидних послідовностей сенсової та антисенсової ниток НВМ представлений в таблицях 3, 6, 12, 22 та 25 в МО2016/077321 та докладний перелік модифікованих нуклеотидних послідовностей сенсової та антисенсової ниток НВМ представлений в таблицях 4, 7, 13, 23 та 26 в
УМО2016/077321. Результати з аналізу шляхом скринінгу, проведеного з цими засобами, також описані в тому документі.
За допомогою цих досліджень ідентифікували дуплекс АЮ-66810, що має антисенсову нитку з модифікованою нуклеотидною послідовністю 5'-ивсівидайтстстаадистсАїсасзиви-3 (ЗЕО 10
МО:13) ї сенсову нитку з модифікованою о нуклеотидною послідовністю //-5'- дзиздисИисАгТОтисодсиисаса-3 (ЗЕБЕО ІО МО:29), де а, с, д та и являють собою 2'-0- метиладенозин-3-фосфат, 2'-О-метилцитидин-3'-фосфат, 2'-О-метилгуанозин-3'і-фосфат та 2"-
О-метилуридин-3'і--фосфат відповідно; Аї, Сі, її та ШОЇ являють собою 2'-фтораденозин-3'- фосфат, 2'-фторцитидин-3'і-фосфат, 2'-фторгуанозин-3і--фосфат та 2'-фторуридин-3'і-фосфат відповідно; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; та де М-ацетилгалактозаміновий фрагмент,
М-І(Ітрис(СаІМАс-алкіл)-амідодеканоїл)|-4-гідроксипролінол (також відомий як (Нур-(СаІМАс- алкіл)3) або вказаний у даному документі як І 96) ковалентно прив'язаний до 3'-кінця сенсової нитки.
Додаткове дослідження, описане в даному документі, проводили для ідентифікації ефективності та специфічності молекул засобу на основі йа5КМА, і воно базувалося на попередньо ідентифікованій послідовності АЮ-66810, що націлюється на Х-транскрипт вірусу гепатиту В людини (НВМ; 095551). Для досягнення цієї мети конструювали, синтезували та тестували щодо активності іп мійго ряд хімічно модифікованих засобів на основі а5КМА з використанням аналізу на основі репортера ЮОпаї!-І ис та лінії клітин Нерс2.2.15. Всі сполуки кон'югували з триантенарним лігандом у вигляді М-ацетилгалактозаміну (СаІМАс) (196), ковалентно прив'язаним до 3'-кінця сенсової нитки.
Синтез засобу на основі а5ЕМА
Послідовності сенсової й антисенсової нитки НВМ синтезували в 1-мікромолярному масштабі на синтезаторі Мегтаде 192 (ВіоАшотаїйоп) з використанням хімії фосфорамідатів за опосередкування твердої основи. Тверда основа являла собою скляну основу із заданим розміром пор (500 А), навантажену спеціально розробленим лігандом СаїЇМАс, або універсальну тверду основу (АМ Віоспептіса!). Допоміжні реагенти для синтезу, 2-Е та 2'-О-метил-РНК та бо дезоксифосфорамідити, одержували від Тпегто-Різпег М (Мілуокі, штат Вісконсин, США) та
Нопдепе (Китай). 2'Є, 2'-О-метил, ОМА (глікольнуклеїнові кислоти), 5'-(фосфат та модифікації видалення азотистої основи вводили з використанням відповідних фосфорамідитів. Синтез окремих ниток, кон'югованих із саїІМАс на 3'-кінці, здійснювали на модифікованій замАс СРО- основі. Спеціально розроблену універсальну тверду СРО-основу застосовували для синтезу окремих антисенсових ниток. Час зв'язування для всіх фосфорамідитів (100 мм в ацетонітрилі) становив 5 хвилин з використанням 5-етилтіо-1Н-тетразолу (ЕТТ) як активатора (006М в ацетонітрилі). Фосфотіоатні зв'язки утворювали з використанням 50 мМ розчину 3- ((диметиламінометиліден)аміно)-3іН-1,2,4-дитіазол-З-тіону (0ОТТ, одержаного від Спетдепев (Вілмінгтон, штат Массачусетс, США)) у безводному ацетонітрилі/піридині (1:1 об'єм/об'єм). Час окиснення становив З хвилини. Всі послідовності синтезували з видаленням зрештою групи
ОМТ («без ОМТ»).
Після завершення твердофазного синтезу олігорибонуклеотиди відщеплювали від твердої основи, і з них видаляли захисні групи в запечатаних планшетах із 96 глибокими лунками з використанням 200 мкл реагенту, що являє собою водний метиламін, при 60 "С протягом хвилин. Наприкінці стадії відщеплення та видалення захисних груп планшету для синтезу дозволяли нагрітися до кімнатної температури, і його вміст осаджували шляхом додавання 1 мл суміші ацетонітрил'етанол (9:11). Планшети охолоджували при -80 "С протягом 2 годин, і надосадову рідину обережно зливали за допомогою багатоканальної піпетки. Осад з олігонуклеотидами ресуспендували в 20 мМ буфера МаоАс та знесолювали з використанням 20 колонки для ексклюзійної хроматографії НіТгтар'"М на 5 мл (СЕ Неайпсаге"М) на системі АКТА
Ригійег, обладнаній пристроєм автоматичної подачі зразків АО5 та колектором фракцій Егас 950. Знесолені зразки збирали в 9б-лункові планшети. Зразки з кожної послідовності аналізували за допомогою І С-М5 для підтвердження ідентичності, УФ-випромінювання (260 нм) для кількісного визначення, а вибраний набір зразків за допомогою ІЕХ-хроматографії для визначення чистоти.
Гібридизацію окремих ниток НВМ здійснювали на автоматичному пристрої Тесап для маніпуляції з рідинами. Еквімолярну суміш сенсових та антисенсових окремих ниток об'єднували та забезпечували гібридизацію в 9б-лункових планшетах. Після об'єднання окремих комплементарних ниток 96-лунковий планшет щільно запечатували та нагрівали в печі
Зо при 1009С протягом 10 хвилин, і йому дозволяли повільно досягти кімнатної температури протягом періоду 2-3 години. Концентрацію кожного дуплекса нормалізували до 10 мкМ в 1Х
РВ5.
Абревіатури для мономерів модифікованих нуклеотидів, розкритих у даному документі, продемонстровані в таблиці 1. В таблиці 2 продемонстровано АЮ-66810 та засоби на основі а5зКМА НВУ, синтезовані з використанням способів, наведених вище.
Таблиця 1
Скорочення нуклеотидних мономерів, використовувані в представленні модифікованих послідовностей нуклеїнової кислоти
Слід розуміти, що, якщо не зазначено інше, ці мономери, якщо вони присутні в олігонуклеотиді, зв'язані між собою 5'-3'-фосфодіестерними зв'язками.
Таблиця 1 а 11111111 02-О-метиладенозинЗ-фосфат.7//7/:/ ЛГ: ССС: ССС 9 11111111 02-О-метилгуанозин-З-фосфат.7//://С:(ХИ НСС
М-Ітрис(СаїІМАс-алкіл)-амідодеканоїл)|-4-гідроксипролінол (або «Нур-
СаІМАс-алкіл)3»)
Таблиця 2
Модифіковані нуклеотидні послідовності кон'югованого з СаІМАс засобу на основі а5ЕМА НВМ
Таблиця 2
Модифіковані нуклеотидні послідовності кон'югованого з СаІМАс засобу на основі а5ЕМА НВМ
ПРИКЛАД 2
СКРИНІНГ ДУПЛЕКСІВ ЗАСОБУ НА ОСНОВІ азЕеЕМА ІМ МІТКО
Аналіз за допомогою люциферази Юпиа1І-с1оФ
Клітини Со57 (АТССФ),, Манассас, штат Вірджинія, США) вирощували майже до злиття за 37 "С в атмосфері 5945 СО» в ОМЕМ (АТСС), з додаванням 1095 ЕВ5, потім вивільняли з планшета шляхом обробки трипсином. Здійснювали трансфекцію клітин Со57 двонитковими засобами та рхіСНЕСК2-НВУ (вектор експресії, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує частину консенсусної послідовності НВМ дикого типу; БЕО ІЮ МО:5) або двонитковими засобами та векторами рзісСНЕСК2, що експресують нуклеотидну послідовність генотипу А, С, Е або ЕЕ
НВМ (ЗЕО ІО МО:6, 7, 8 або 9, відповідно) за допомогою додавання 5 мкл дуплексів РНК та 5 мкл плазміди рліСНЕСК2-НВУ (або рхісНнЕСК2-НВУ генотипу А, С, Е або РЕ) на лунку, а також 5 мкл Оріїі-МЕМО плюс 0,1 мкл Гіроїтесіатіпе"М ЕМАїЇМах на лунку (Іпийгодеп"М, Карлобад, штат
Каліфорнія, США, Мо за каталогом 13778-150) та потім інкубували за кімнатної температури протягом 15 хвилин. Суміш потім додавали до клітин, які ресуспендували в 35 мкл свіжого повного середовища. Трансфековані клітини інкубували за 37 "С в атмосфері 5 95 СО».
Через сорок вісім годин здійснювали трансфекцію засобів на основі 45ЕМА та плазміди рзісСнЕСК2; вимірювали активність люциферази світляка (контроль трансфекції) та КепіШа (злита з цільовою послідовністю НВМ). Спочатку середовище відділяли від клітин. Потім вимірювали активність люциферази світляка шляхом додавання 20 мкл реагенту на основі люциферази ЮпцаЇІ-СіоФ в кількості, рівній щодо об'єму культурального середовища, в кожну лунку та перемішували. Суміш інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин, потім вимірювали люмінесценцію (500 нм) на зресігатахФ (МоїІесшаг Оемісе5) з виявленням сигналу люциферази світляка. Активність люциферази Кепійа вимірювали шляхом додавання 20 мкл реагенту ЮцаІ-сСіоєю 5іор 4 СіІоФ кімнатної температури, його додавали в кожну лунку та планшети інкубували протягом 10-15 хвилин, потім знову вимірювали люмінесценцію з визначенням сигналу люциферази Кепійа. Реагент ЮцчаІ-бЗіоФ ер 5 сСіІОФ гасить сигнал люциферази світляка та не перериває реакцію люмінесценції люциферази КепіПа. Активність засобу на основі О5ЕМА визначали шляхом нормалізації сигналу Кепійа (НВМ) щодо сигналу
Зо світляка (контрольного) в межах кожної лунки. Абсолютне значення активності засобу на основі а5КМА потім оцінюють стосовно клітин, щодо яких здійснювали трансфекцію з тим самим вектором, але не обробляли засобом на основі аБКМА або обробляли засобом на основі а5зКМА, що не націлюється. Всі реакцій трансфекції здійснювали за п-2 або більше.
Результати цих аналізів з використанням засобів, зазначених в таблиці 2, представлені в таблиці 3.
Скринінг Нербо2.2.15 та РІ С іп міго
Клітини Нерс2.2.15 та РІС (клітини гепатоми людини; АТССФ СКІ -8024) вирощували майже до злиття при 37 "С в атмосфері 5 95 СО» в середовищах ОМЕМ або ЕМЕМ (АТСОС), з додаванням, відповідно, 1095 ЕВ5 (АТСС), потім вивільняли з планшета шляхом обробки трипсином. Зворотну трансфекцію здійснювали шляхом додавання 5 мкл дуплексів засобу на основі ОБЕМА на лунку в 9б-лунковий планшет разом з 14,8 мкл Орі-МЕМУ?Е плюс 0,2 мкл
Проїесіатіпе"М ЕМАЇМах на лунку Іпмігодеп'"М, Карлсобад, штат Каліфорнія, США, Ме за каталогом 13778-150) та інкубували за кімнатної температури протягом 15 хвилин. Потім додавали вісім мікролітрів повного середовища для росту без антибіотика, що містить 2 х 107 клітин Нерс2.2.15 або РІ С. Клітини інкубували протягом 24, 48 та 72 годин до очищення РНК.
Результати цих аналізів з використанням засобів, зазначених в таблиці 2, представлені в таблиці 4.
Виділення тотальної РНК з використанням набору для виділення тотальної РНК МазмМАХ -96 (Арріїєа Віозуз(ет, Форер Сіті, штат Каліфорнія, США, Ме випуску: АМ1830):
Клітини збирали і лізували в 140 мкл лізувального/зв'язувального розчину, потім перемішували протягом 1 хвилини при 850 об./хв. за допомогою Еррепаогі"М ТнНептотіхег (швидкість перемішування була однаковою протягом всього процесу). Дванадцять мікролітрів магнітних гранул та суміш підсилювача лізування/зв'язування додавали до лізату клітин та перемішували протягом 5 хвилин. Магнітні гранули фіксували за допомогою магнітного стенда і надосадову рідину видаляли без зміщення гранул. Після вилучення надосадової рідини магнітні гранули промивали за допомогою розчину 1 для промивання (з додаванням ізопропанолу) та перемішували протягом 1 хвилини. Гранули знову фіксували і надосадову рідину видаляли.
Потім гранули промивали за допомогою 150 мкл розчину 2 для промивання (з додаванням етанолу), фіксували та видаляли надосадову рідину. Потім додавали п'ятдесят мкл суміші
ДНКази (буфера ДНКази МадмМах йїштгро та Тигро ДНКази) до гранул та перемішували їх протягом проміжку часу, що становив від 10 до 15 хвилин. Після перемішування додавали 100 мкл розчину для повторного зв'язування РНК та перемішували протягом З хвилин. Надосадову рідину видаляли та магнітні гранули промивали знову за допомогою 150 мкл розчину 2 для промивання, та перемішували протягом 1 хвилини, та повністю видаляли надосадову рідину.
Магнітні гранули перемішували протягом 2 хвилин до висушування, потім елюювали РНК за допомогою 50 мкл води.
Синтез СОМА із використанням набору для зворотної транскрипції СОМА з великою ємністю
АВІ (Арріїеа Віозуєіетв, Фостер Сіті, штат Каліфорнія, США, Мо за каталогом 4368813)
Майстер-мікс із 2 мкл 10Х буфера, О,вмкл 25Х амМТтР, 2 мкл випадкових праймерів, 1 мкл зворотної транскриптази, 1 мкл інгібітору РНКази та 3,2 мкл НгО на реакцію додавали до 10 мкл тотальної РНК. СсОМА одержували з використанням термоциклера Віо-КадФ С-1000 або 5-1000 (Геркулес, штат Каліфорнія, США) за допомогою наступних стадій: 2590 10 хв., 3790 120 хв., 8590 5 с, зберігання при 490.
ПЛР у реальному часі
Два мкл СОМА додавали до майстер-міксу, що містить 0,5 мкл зонду ТадМап до людського
САРБОН (Арріїєй Віозузіетв, Мо за каталогом 4319413Е), 1 мкл зонду ТадМапФ), специфічного до
ЗОКЕ2, та 5 мкл майстер-міксу із зондом ГГ ідпісусіег 480 (Коспе. Мо за каталогом 04887301001) на лунку в 384-лункових планшетах (Коспе, Мо за каталогом 04887301001). ПЛР у реальному часі здійснювали в системі для ПЛР у режимі реального часу ГідпіСусіег480 (Коспе), із використанням ООЮСККО)-аналізу. Для розрахунку відносної кратної зміни дані в реальному часі аналізували з використанням способу ОСІ і нормалізували щодо аналізів, виконаних з клітинами, щодо яких здійснювали трансфекцію, за допомогою АЮО-1955, або клітинами з імітацією трансфекції.
Для розрахунку відносної кратної зміни дані в реальному часі аналізували з використанням способу ОСІ і нормалізували щодо аналізів, виконаних з клітинами, щодо яких здійснювали трансфекцію, за допомогою контрольного засобу на основі а5КМА, що не націлюється.
ПРИКЛАД З
ТРАНСФЕКЦІЯ ЗАСОБІВ НА ОСНОВІ азкЕМА, КОН'ЮГОВАНИХ З АІЇМАС, ЩО
НАЦІЛЮЮТЬСЯ НА НВУ, В СИСТЕМІ ВОАГ-І ОС
Сайленсинг теМА НВУ, що ішов після трансфекції кожного з кон'югованих засобів на основі а5зКМА, продемонстрований в таблиці 3. Кожний засіб на основі ОБКМА тестували шляхом трансфекції в клітини Со57 за концентрацій засобу на основі О5ЕМА, що становили 50 нМ, 10 нм та 0,1 НМ. За заснованими на скринінгу результатами 7 з 20 засобів на основі а5ЕМА продемонстрували ефективність, порівнювану з вихідним АО-66810.
Таблиця З
Результати скринінгу за допомогою Юпцаї!-І ис-аналізу кон'югованих засобів на основі О5КМА НВУ, трансфікованих за 50 нМ, 10 нМ або 1 нм
ІО дуплексу на основі азЗЕМА НВМ ( 9У5)2
Таблиця З
Результати скринінгу за допомогою Юпцаї!-І ис-аналізу кон'югованих засобів на основі О5КМА НВУ, трансфікованих за 50 нМ, 10 нМ або 1 нм
Середнє значеннях5О залишкової кількості засобу
ІО дуплексу на основі азЗЕМА НВМ ( 9У5)2
АО-192277 43,08:2-1,58 34,8254,23 103,3252-12,95
АОр-192284 10,205,87 54,1053,08 119,01-2112,73
АОр-192292 10,91-13,89 65,9953,57 102,5858,12
АОр-192285 86,15:5-7,45 91,3928,92 116,62528,93
АОр-192293 48,05:20,45 46,38:16,26 120,8453-10,62
Ар-192279 51,29-6,93 38,3552,50 114,22:-10,41
АОр-192286 89,16--12,87 88,7454,44 118,16:2-12,97
АОр-192294 54,365,03 41,8925,61 114,19:2-11,55
АОр-192280 49,2057,13 57,2214,47 116,35-26,87
АОр-192287 81,73514,38 84,10510,24 127,1153-12,61
АОр-192281 38,744,01 38,4554,54 120,99527,00
АОр-192288 85,3759,30 86,1455,32 118,0959,30
Скорочення: ІО - ідентифікаційний номер; 5О - середньоквадратичне відхилення. а Частка залишкової відносної експресії НВМ (порівняно з контрольним трансфікованими клітинами) 48 годин після трансфекції набору засобів на основі Д5ЕМА НВУ для скринінгу.
ПРИКЛАД 4
ТРАНСФЕКЦІЯ ЗАСОБІВ НА ОСНОВІ азеЕМА, КОН'ЮГОВАНИХ З сАІЇМАС, ЩО
НАЦІЛЮЮТЬСЯ НА НВУ, В КЛІТИНИ Неро2.2.15
Сайленсинг тЕ МА НВМ (птКМА РОКНЕ1 та БОКЕ2, визначених з використанням прямого та зворотного праймерів та зонду ТадМап) в клітинах Нерб2.2.15, що ішов після трансфекції кожного з кон'югованих засобів на основі 5КМА, продемонстрований в таблиці 4. Загалом, більш стійкий сайленсинг вірусних транскриптів РОКЕЇ та 5ОКЕ2 спостерігали в клітинах
Нербо2.2.15 порівняно із сайленсингом, який спостерігали в системі з надлишковою експресією риаї!-І ис, з 10 засобами на основі 85ЕМА, що характеризувались порівнюваною ефективністю з вихідною молекулою вихідного АО-66810. Подібну активність засобу на основі азКМА спостерігали щодо ткМмМА РОКЕЇ1 та БОКЕ2, що й очікували через те, що цільові сайти засобу на основі а5КМА наявні в обох транскриптах.
Таблиця 4
Результати скринінгу кон'югованих засобів на основі 45ЕМА НВУ, трансфікованих за 50 нМ, 10 нМ або 1 нМ, з використанням Нерс2.2.15
Чо Чо Чо Чо
ІО Залишковог Залишковог Залишковог Залишковог дуплексу| оРОБЕ! 90 0 оРОВЕІ | ЗО) ОБОВ? | ЗО | ов5овв2 | 90 10 нмМ)а 0,1 нм) 10 нмМ)а 0,1 нм)
Ар-66810 1143 110,0
Ар-
Ар- бе 721571 ж | 55| я | ве| зи |в.
АО-81890
Ар-в18921. 329 | 01 | 822 | 85 | 281 | 26 | 7959 | 90
Ар-
Ар-
Таблиця 4
Результати скринінгу кон'югованих засобів на основі 45ЕМА НВУ, трансфікованих за 50 нМ, 10 нМ або 1 нМ, з використанням Нерс2.2.15
Чо Чо Чо Чо
ІО Залишковог Залишковог Залишковог Залишковог дуплексу| оРОБЕ! 90 0 оРОВЕІ | ЗО) ОБОВ? | ЗО | ов5овв2 | 90 10 нм)а 0,1 нм) 10 нмМ)а 01 нмМ)а
Ар-
Ар-
Ар-
Ар- бе 2 | 58| ви 551 и 18521 ви | тв.
Ар-
Ар-
Ар-
Ар-
Ар-
Ар- бе 7 |78| ве |ме| з 86) зо | 5.
Ар-
Ар-
Ар-
Скорочення: 5О - середньоквадратичне відхилення. а Частка залишкової відносної експресії НВМ (порівняно з контрольним трансфікованими клітинами) 24 години після трансфекції набору засобів на основі 45ЕМА НВУ для скринінгу.
Базуючись на вищенаведених аналізах, вибирали для подальших аналізів дуплекс АЮ- 81890.
ПРИКЛАД 5 . .
ОЦІНЮВАННЯ ФАРМАКОЛОГІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕ АО-81890 В АДЕНО-АСОЦІЙОВАНІЙ
МИШАЧІЙ МОДЕЛІ НВУ, ЩО ІШЛО ЗА ОДНОРАЗОВОЮ ПІДШКІРНОЮ ІН'ЄКЦІЄЮ
Фармакологічні властивості АЮ-81890 аналізували в адено-асоційованій мишачій моделі
НВМ (НВУ-ААМ). ААМ8-НВМ (Зідпасеп ГІ арогайогієз) розводили в 1х РВ5 до кінцевої концентрації 2х1012 бС/мл. Самцям мишей С57ВІ/6б, віком 6-8 тижнів, вводили внутрішньовенно через латеральну хвостову вену 2х10!"! вС/миша у фіксованому об'ємі 100 мкл.
АЮ0-81890 розводили стерильним 1хРВ5 та вводили у змінюваному об'ємі 10 мкл/г. Тварини отримали одноразову ЗС дозу АЮ-81890, що становила 0,3, 1 або З мг/кг, та кров збирали в дні - 24, -2, 0, 14, 21, 33, 47, 59 та 74 після введення дози з ретроорбітального синуса, як описано в таблиці 5.
Таблиця 5
Схема дослідження за участю ААМ-НВМ одноразового введення дози АЮ-81890 оопяео0осюеляа ЛДУ? | льтетнамн | зборустоть,
Група Сполука Кіль-ть тварин збору сироватки (мг/кг) ; крові 1171 РАІ ї777771710111111111111198 777035 717771717171711798677 | Дні-24,-2,0,14, др-втів9о | 77771771 177717171717179 11111171 21,233,47,59, 74 81111118
Скорочення: Кіль-ть - кількість; РВ5 - забуферений фосфатом сольовий розчин; ап - 8 тварин в день 47; п - 6 в день 59; п - 5 в день 72, тварин піддавали евтаназії через поранення внаслідок боротьби.
Після збирання, крові дозволяли згортатися протягом 30 хвилин та потім центрифугували в мікроцентрифузі протягом 10 хв. за 13000 об./хв. та 4 "С. Сироватку крові аспіргували та зберігали за - 20 "С.
Рівні білка поверхневого антигена вірусу гепатиту В визначали шляхом ЕГІЗА (ВіоТапад,
Уолтем, штат Массачусетс, США). Використовували білок НВзАд від О5 Віоіодіс5 (Мемфіс, штат
Теннессі, США) для одержання стандартної кривої. Зразки сироватки крові розводили в 1 х РВ5 (сірбсо, Гейтерсберг, штат Меріленд, США) 1:2000 або 1:500 та аналізували з використанням протоколу для ЕГІЗБА з незначними модифікаціями. Якщо коротко, 50 мкл/лунка розведеної сироватки крові або стандартного розчину поміщали в планшет та інкубували протягом 1 год. при 37 "С. Після такого інкубування в кожну лунку додавали 50 мкл/лунка ферментного кон'югату та планшет інкубували при 37 "С протягом 30 хв. Планшет промивали З рази за допомогою 300 мкл/лунка 1 х буфера для промивання, потім промокали допоки не видаляли всю рідину з лунок, додавали 100 мкл/лунка субстрату та планшети інкубували при 37" протягом 30 хв. Наприкінці додавали додаткові 100 мкл/лунка стоп-розчину та вимірювали поглинання за довжини хвилі 450 нм. В будь-якому випадку, коли підрахований рівень НВзАд потрапляв нижче нижнього граничного значення кількісного визначення (ГГ ОС)) аналізу, значення записували як І І СО (тобто 313 нг/мл).
Середні значення5О концентрації НВзАд у сироватці крові у НВМ-ААМ-мишей після одноразової дози АЮ-81890 підшкірно (50) продемонстровані на фігурі 2А. Середні значення:5О рівнів НВ5зАд у сироватці крові у НВМ-ААМ-мишей щодо початкового значення продемонстровані на фігурі 28. Одноразова 5С ін'єкція АЮ-81890 за концентрації 0,3, 1 або
З мг/кг привела до ефективного та стабільного зниження концентрацій НВзАд в сироватці крові у НВУ-ААМ-мишей з максимальним значенням зниження 92 95, яке спостерігали на день 7 у групі, якій вводили найбільшу дозу (3 мг/кг» АЮ-81890. Максимальний рівень зниження підтримувався в групі, якій вводили найбільшу дозу, до дня 33, після чого рівні НВ5Ад починали повертатися в напрямку до початкового значення (фігура 28). Проміжні значення зниження концентрацій НВзЗАд в сироватці крові спостерігали в групах, яким вводили дозу АБО81890 в 0,3 мг/кг та 1 мг/кг, з максимальним значенням зниження в день 7, яке становило 23 95 та 72 95 відповідно. Рівні НВ5Ад в групах, яким вводили дозу АЮ-81890 як 0,3 мг/кг, так і 1 мг/кг, поверталися до початкових рівнів до часу закінчення аналізу (день 74).
ПРИКЛАД 6
ОЦІНЮВАННЯ ФАРМАКОЛОГІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕ АО-81890 В АДЕНО-АСОЦІЙОВАНІЙ
МИШАЧІЙ МОДЕЛІ НВМ, ЩО ІШЛО ЗА БАГАТЬМА ПІДШКІРНИМИ ІН'ЄКЦІЯМИ
Фармакологічні властивості АЮ-81890 аналізували в адено-асоційованій мишачій моделі
НВМ (НВУ-ААМ). ААМ8-НВМ (5Бідпабеп І арогафогіеєїє) розводили в 1 хРВ5 до кінцевої концентрації 2х1012 5С/мл. Самцям мишей С57ВІ /6, віком 6-8 тижнів, вводили внутрішньовенно через латеральну хвостову вену 2х10"! зС/миша у фіксованому об'ємі 100 мкл.
Кожен з АО-66810 та АО-81890 розводили стерильним 1Х ОРВ5 та вводили у змінюваному об'ємі 10 мкл/г. Тварини отримували АЮ-66810 в концентрації 1 мг/кг, введений 0О2МУхб, або одноразову дозу АЮ-81890 в концентрації 9 мг/кг або більше доз АЮ-81890 в концентрації 1 або
З мг/кг, введених О2УУхб або ОМХ3. Сироватку крові збирали у тварин в декілька моментів часу, як описано в таблиці 6. Кров збирали з ретроорбітальних синусів, як описано в таблиці 6.
Таблиця 6
Схема дослідження за участю ААМ-НВМ багаторазового введення дози АЮ-81890
Група Сполука Доза в день 0 Схема М- Збирання (мг/кг) введення сироватки крові 71 РВ5 | 0 | ом | 6 2 ДА0-ббВО | 1 7 (| о2Мхб | 6 шк ослів 177757 День 55,27, 1 13, 0, 14, 28, 42,
ОМ 117655 ,Ви Зв
АО-81890 З Ох 1010736 ов 6 | ом | 6 7иИЙБ9 | ом | 6
Зразки крові обробляли та проводили аналіз шляхом ЕГІЗА, як описано в попередньому прикладі. Результати продемонстровані в таблиці 7 нижче. Результати із значеннями середньоквадратичного відхилення продемонстровані на фігурі 3.
Таблиця 7
Результати дослідження за участю ААМ-НВМ багаторазового введення дози АЮ-81890, виражені як середня І од-кратна зміна
Засіб на Схема основі | мг/кг |введен-| -55 | -27 | -13 14128142 |56 | 70 | 84 111 11251140 а5зАМА ня теє | фомов оре|осв/оов осо осв ост от ооз 0оз ооо оов| ості ооя ооо,
АОр-66810| 1 /О2Мухві 0,02 |-0,05| 0,00 | 0,00 |-0,74|-0,77|-1,41|-1,84|-1,91|-2,12|-1,781|-1,291-0,971-0,811 1 ГоО2мухв 0,02 |0,0410,06 10,00 |-0,594-0,76 -0,89|-1,021-1,131-1,23|-0,951-0,951-0,39|-0.13 1 |омхз 006 |0,0110,06 10,00 |-0,51)-0,32.-0,73|-0,51|-0,791-0,63|-0,451-0,201-0,111 0,09 до-вівео! З | О2Мух6і 0,03 |-0,04| 0,02 10,00 |-1,30|-1,731-2,49|-2,57|-2,61|-2,77|-2,03|-1,591-1,16|-0,53) з емо | ро|ооо оло|ого пло пов ля паерплв пхо пив от пав Гос 9 |омх1 | 006 |0,.03|0,00 | 0,00 |-2,71|-2,60|-2,03|-1,16|-0,811-0,45|-0,291-0,071-0,04|-0,01
Спостерігали дозозалежний рівень НВ5ЗАд у сироватці крові в мишачій моделі ААМ8-НВУ після введення АЮ-81890. Максимальне значення зниження НВ5зАд, що становило приблизно 2,7 Ісд 10 спостерігали після одноразового введення дози АЮ-81890, що становила 9 мг/кг, або дем х 6 введення З мг/кг. Тварини, що отримували З мг/кг д2у/ х 6, мали стабільне значення зниження НВ5ЗАд, що становило більше, ніж 2 І0д10, загалом протягом близька 8 тижнів.
Ці дослідження іп мімо продемонстрували, що АЮО-81890 є ефективним для зниження значення НВ5АдЯ в сироватці крові в мишачій моделі НВУ-ААУ.
ПРИКЛАД7 .
СПЕЦИФІЧНИЙ НЕЦІЛЬОВИИЙ АНАЛІЗ АО-81890
Для оцінки ефективності нецільової активності антисенсової нитки Аб-81890 використовували комбінацію біоїінформатичних способів іп 5іїйсо та способів іп міїго.
Біоінформатика
Набір засобів на основі 5ЕМА, що націлюються на ген «Х» вірусу гепатиту В (НВУМ) підтипу аум (ОО нуклеотидів в сепВапк Ше5551; Сепе!О в МСВІ: 7276; 5ЕО ІЮ МО:49) з використанням спеціалізованих К- та Руїпоп-скриптів. Кільцевий геном НВМ 095551 має довжину, що становить 3182 основи, та СО5-ділянка гена «Х» кодується положеннями 1376-1840 за записом в МУВІ.
Деталі конструювання засобу на основі й5КМА та спосіб скринінгу представлені вище та в
МО2016/077321.
Скринінг з трансфекцією засобів на основі О5ЕМА кон'югованих з саїІМАс, щодо нецільового виявлення в клітинах Нерс2.2.15
Для вимірювання нецільового інгібування тестували відповідь ендогенно експресованих транскриптів за допомогою ФРС в лінії клітин-гепатоцитів Нерб2.2.15. Клітини, трансфекували в 96-лунковому планшеті (2 х 107 клітин на лунку) за допомогою АЮ-81890 за концентрацій, які знаходились в діапазоні від 50нНМ до 5 ФМ з використанням | іроїесіатіпе КМАЇїМах (Тпептогізпег). Через 24 години РНК виділяли з клітин з використанням набору для ізолювання тотальної РНК МадмАХ "7-96 (ТпептоРїізпег); та одержували СОМА з використанням набору для зворотної транскрипції СОМА з великою ємністю АВІ (ТпептоРізпег). Зразки аналізували щодо інгібування тЕкМА НВМ та ефективності нецільового сайленсингу. Для кількісного підрахунку шляхом ЯДРСОСК оцінювали експресію НВМ з використанням двох різних спеціалізованих аналізів
ТадМап, з використанням РОКЕ-1 та ЗОКЕ-2, які розпізнають різні ділянки вірусних транскриптів НВМ.
Для оцінки нецільового сайленсингу для кількісного підрахунку використовували зонди
Тадмап, специфічні до кожного з потенційних елементів, що не є мішенями (таблиця 8). ЧЗРСК проводили з використанням пристрою для ПЛР у реальному часі ГідпіСусіег 480 (Коспе).
Таблиця 8
Потенційні послідовності, що не є мішенями для АЮ-81890 . . Бал Неправильно
ІО нецільової . . Ь . - впливу положення? а неспарені положення, визначені щодо антисенсової нитки в напрямку 5-3", таким чином, положення 1 відповідає комплементарності основи з крайнім у 5'-кінці нуклеотидом антисенсової нитки АО-81890. ь У випадку, коли декілька ІЮ РеїзЗед пов'язані з тим самим цільовим геном та нецільовим профілем, зазначені обидва ІЮ.
Для визначення надлишку цільового (НВМ) та потенційного нецільвого інгібування генів, визначали відносні рівні РНК шляхом нормалізації до експресії РНК людського САРОН в тому самому зразку. Результати порівнювали з неспецифічними трансфікованими контрольними засобами на основі а5КМА, та помилка виражена, як середньоквадратичне відхилення. ІС5О
АО-81890 становило 0,803 нМ щодо транскрипту-мішені РОКЕ1 та 0,766 нМ щодо транскрипту- мішені БОКЕ2. Не спостерігали значного цільового нокдауну щодо транскриптів 5ІОТ2 та 28182 навіть за найвищої концентрації АО-81890.
Надлишок нецільового інгібування за допомогою АЮО-81890 оцінювали за допомогою дозозалежних скринінгів для 2 потенційних елементів, що не є мішенями, з ендогенно експресованих транскриптів в Нерс2.2.15. АЮ-81890 не інгібував експресію 5ІОТ2 або 2ВТВ82 за будь-яких з протестованих доз, в той час як інгібування НВМ було дозозалежним. Апроксимація інформації щодо залежності від доз з використанням чотирьох-параметричної моделі апроксимації (ХІ її) дає в результаті значення ІС50О, які становлять 803 пМ та 766 пМ для РОКЕ- 1 або БОРЕЕ-2 відповідно.
ПРИКЛАД 8
Зо АНАЛІЗ ІМ МІТКО СПЕЦИФІЧНОСТІ АО-81890 З ВИКОРИСТАННЯМ КМА-5ЕО В КЛІТИНАХ
Нераг.2.15
Вимірювали вплив хімічних модифікацій засобу на основі ОБКМА шляхом порівняння АЮ- 66810 та АО-81890 в лінії клітин Нербс2.2.15, що експресує НВУ, з використанням зміни рівнів експресії по всьому транскриптому за допомогою КМА-5ед. Молекули АЮ-66810 та АЮ-81890 характеризувались однаковою нуклеотидною послідовністю, але відрізнялись заміщенням на гліколь-нуклеїнову кислоту (ЗМА) в положенні 6 з 5'-кінця молекули антисенсової нитки (див. таблицю 2).
Клітини Нерос2.2.15, лінія клітин, одержана з Нерс2, стабільно трансфековані цілим геномом НВУ, розводили культуральним середовищем до кінцевої концентрації, що становила 187500 клітин/мл, та 80 мкл переносили за допомогою піпетки в 96-лункові планшети, покриті колагеном (ВО Віосоаї, Ме за каталогом 356407) з одержанням кінцевої концентрації, що становила 15000 клітин/лунка.
Стокові концентрації засобу на основі а45ЕЕМА розводили в ЇХ ОРВ5 до наступних концентрацій: 1000 НМ або 100 нм. ЕМАЇМАХ (ТпептоРізпег, Мо за каталогом 13778150) розводили за допомогою Орії-МЕМ (ТпегтоРїі5пег, Мо за каталогом 31985062) в концентрації, що становила 0,3 мкл КМАЇМАХ/10 мкл ОріЇї-МЕМ, та інкубували протягом 5 хвилин за кімнатної температури. Після інкубації додавали 10 мкл/лунка в кожну лунку 96-лункових планшетів, покритих колагеном (ВО Віосоаї, Мо за каталогом 356407), разом з 10 мкл/лунка придатного розведення засобу на основі а5ЕМА, обережно перемішували та інкубували протягом 20 хвилин за кімнатної температури. 80 мкл одержаної суспензії клітин додавали в кожну лунку з одержанням кінцевої щільності клітин 15000 клітин/лунка та кінцевих концентрацій засобу на основі ахзхКМА, що становили 100 нМ та 10 нМ. Клітини інкубували в інкубаторі з температурою 37"Сб з 595 СО протягом 16-22 годин. Клітини розміщали таким чином, щоб для кожного експериментального стану було по 16 лунок та експеримент проводили двічі.
Для виділення РНК використовували набір для виділення тотальної РНК ТпепторРівпег
АМАдиеои5-96 так, як зазначено в протоколі. Якщо коротко, після 16-22 годин надосадову рідину аспіргували з кожної лунки, додавали 100 мкл/лунка ТХ ОРВ5, щоб змити залишкове середовище, потім аспіргували. Додавали 200 мкл лізувального/зв'язувального розчину в кожну лунку в ряду 1 та ряду 5 кожного планшета, перемішували за допомогою піпетки декілька разів та переносили до наступного ряду так, щоб 4 лунки/стан були об'єднані для забезпечення належного відновлення РНК. Це обумовлювало чотири репліки на стан. 100 мкл 100 95 етанолу додавали в кожну лунку культурального планшета, що містить лізати, перемішували декілька разів та переносили в лунки планшета для фільтрування. За допомогою ряду стадій центрифугування (1900х9, 1 хвилина) зразки промивали за допомогою забезпечуваного розчину для промивання, обробляли за допомогою реагентів ДНКази та елюювали в 100 мкл води, що не містить нуклеаз. Концентрацію РНК визначали за допомогою спектрофотометра МапоОгор 8000 (ТПнегтовівнег).
РНК додатково обробляли за допомогою ДНКази ТОКВО (Атрбіоп). Кожен зразок РНК («10 мкг РНК/зразок) перемішували з 2 мкл ДНКази, 10 мкл ТОХ буфера та водою, що не містить нуклеаз, до загального об'єму, що становив 100 мкл, потім інкубували за 37 "С протягом 30 хвилин. Після обробки ДНКазою РНК додатково очищали за допомогою набору для очищення
КМеазу МіпЕІше (Сіадеп), як зазначено в протоколі. РНК елюювали в 30 мкл води, що не містить нуклеаз, та концентрацію РНК визначали за допомогою спектрофотометра МапоОгор 8000. РНК зберігали за -80 "С. Цю РНК далі використовували для одержання бібліотеки СОМА
Зо за допомогою набору Тгибед Зігапдей Тоїаї! КЕМА Гібгагу Ргер (Питіпа) та секвенували на настільному секвенаторі Мехізед500 (ПШитіпа), все згідно інструкцій виробника. Проводили два повтори експерименту.
Щодо клітин Нерс2.2.15 здійснювали трансфекцію в чотирьох екземплярах за допомогою 10 або 100 НМ АО-66810 або АО-81890 та культивували поруч з необробленими контролями протягом 24г. РНК, виділену за допомогою набору Ригейпк МА (Тпегторгізпег), використовували для одержання бібліотеки СОМА за допомогою набору ТгизЗед 5ігападей Тоїаї
КМА ГІбгагу Ргер з використанням Кіро-2его Нитап/Моизе/Каї для виснаження за геЕМА (Шитіпа) та секвенували на настільному секвенаторі МехіЗед500 (Шиптіпа), все згідно інструкцій виробника. Загалом було об'єднано 40 зразків для проточної камери МехізЗед 500/550 Ніднп
Ошриї вер. 2 (75 циклів) (Питіпа). Проводили два повтори експерименту.
Необроблені ріди КМА-Зед фільтрували за допомогою мінімальних середніх балів якості, що становили 25, та мінімальної залишкової довжини, що становила 36, з використанням Газід-тсії.
Відфільтровані ріди вирівнювали одночасно до геномів людини (п919/3КСп37) та НВМ (І0 нуклеотидів в зЗепВапк 095551; бепе!О в МСВІ : 7276) з використанням 5ТАК (версія 2.4.2а).
Через кільцеву структуру геному НВМ 46 пар основ повторювались на кінці лінеаризованої версії послідовності НВМ для того, щоб дозволити рідам картувати точку розриву. Однозначно вирівняні ріди, що картувалися як екзони, підраховували за допомогою ГеайштеСоипів (версія 1.5.0. Всі зразки характеризувались »5М картованими рідами. Аналіз диференційної експресії генів проводили в К (версія 3.4.1) з використанням пакету ОЕзЗед2 (версія 1.16.1). Проводили багаторазове калібрування тесту з одержанням відрегульованих р-значень за допомогою рЕзед2 з використанням способу, описаного в Вепіатіпі 5. Носпрего, 1995.
Графіки МА використовували для візуалізації як ефектів цільового нокдауну НВУ, так і нецільових ефектів. Аналіз хімічних властивостей ОМА в зниженні глобальних нецільових ефектів обмежували генами, що пригнічені (одг-кратна зміна « 0). Активовані гени (Іодг-кратна зміна » 0) вважали другорядними ефектами. Оцінку нецільових ефектів обмежували найнижчою (10 НМ) дозою, через те, що був досягнутий нокдаун НВУ, близький до максимального. Для порівняння транскриптомного шуму, ідектифікували гени, що були значно пригнічені (відрегульоване р-значення х 0,05) з АЮ-66810 та/"або АЮ-81890. Надлишкове пригнічення візуалізували за допомогою коробкового графіку з Іодо-кратною зміною (фігура 4) зі 60 статистичними відмінностями між АЮО-66810 та АЮО-81890, оціненими з використанням двостороннього двозразкового І-критерію Велча (таблиця 9).
Таблиця 9
Статистичне тестування генів, що є значно пригніченими середнє середнє 66810.1ЕС | 81890.ЕС начення ехр: повтор експерименту; середнє значення. АЮ-66810.1ЕС: середнє значення Іодг-кратної зміни значно пригнічених генів з АЮ-66810 та/або АО-81890; середнє значення. АЮ-81890.1ЕС: середнє значення Іодг-кратної зміна значно пригнічених генів з АЮ-81890 та/або АЮ-66810;
Ї.статистичне значення: 1і-статистичне значення з двостороннього двозразкового І-критерію
Велча; р.значення: р-значення з двостороннього двозразкового І-критерію Велча; а.о.ї.: кількість ступенів свободи; М: число генів, значно пригнічених (р«е0,05), з АЮ-66810 та/або АЮ- 81890.
Спостерігали стійке зниження нецільового ефекту з використанням АЮ-81890 порівняно з
АО-66810 в обох повторах експерименту (фігура 4, таблиця 9). За 10 нм АО-81890 демонстрував зниження на 52 95 (повтор 1) або 54 95 (повтор 2) середнього значення Іодг- кратної зміни значно пригнічених генів порівняно з АЮ-66810 (таблиця 9). За 100 нМ АО-81890 демонстрував зниження на 71 95 (повтор 1) або 43 95 (повтор 2) середнього значення Іодг- кратної зміни порівняно з АЮ-66810 (таблиця 9). У всіх випадках спостережуване значення зниження Іодг-кратної зміни було високо статистично значущим. Таким чином, АО-81890 характеризувався по суті нижчими рівнями транскриптомного шуму.
ПРИКЛАД 9
ОЦІНЮВАННЯ ГЕПАТОТОКИЧНОСТІ, СПЕЦИФІЧНОЇ ДО ЛЮДИНИ, В РХВ-МИШАХ
РХВ-миша являє собою химерну мишу з гуманізованою печінкою, яку у великій мірі повторно заселили людськими гепатоцитами (РПпоепіхВіо) Миша являє собою мишей з активатором плазміногену типу урокінази (иРА)/з важким комбінованим імунодефіцитом (ЗСІЮ), яким трансплантували гепатоцити людини (миші иРА/5СІЮО з гуманізованою печінкою) (Мегсег еї а!., Маї. Мей. 7:927-933, 2001). Повідомляється, що миші чиРА/5ЗСІЮ з гуманізованою печінкою характеризуються індексом заміщення (КІ), відсотком гепатоцитів людини в печінці, що становить більше, ніж 70 956. Мишей можна використовувати як модель для прогнозування метаболізму лікарських засобів, фармакокінетики та гепатотоксичності у людини (Магіюоті еї аї.,
Огид Меїаб Рпагтасокіпеї. 33:31-39, 2018).
Дослідження проводили на РВХ-мишах для порівняння гепатотоксичності АО-66810 та АО- 81890. Мишам вводили дози в дні: 0, 21, 28, 35 та 42 з використанням 12, 36 або 100 мг/кг АО- 66810, АО-81890 або РВ5З (контроль) за допомогою підшкірної ін'єкції (п-4 на групу).
Спостереження за загальним станом та вимірювання маси тіла проводили двічі на тиждень до дня 49. Кров збирали за допомогою способу забору крові через ретроорбітальний синус двічі на тиждень і сироватку крові готували із використанням стандартних способів. Проводили термінальний забір крові, і тварин умертвляли шляхом серцевої пункції та знекровлення.
Зо Розтин проводили після знекровлення. Печінку відбирали і зважували. Зразки печінки розподіляли для зберігання в розчині ЕМАЇагег (Атбіоп), у формаліні до введення парафіну, і швидко заморожували.
В усіх тварин зберігалась маса тіла більша, ніж 80 95 від початкових рівнів протягом усього періоду дослідження. Крім того, найнижчі середні арифметичні значення маси тіла в групах, які обробляли сполукою, були вищими, ніж у контрольної групи, яку обробляли РВ5.
Рівні людського альбуміну в сироватці крові в крові відстежували протягом усього дослідження. У всіх тварин, що вижили, підтримувалась концентрація пП-АІр у крові понад 7,0 мг/мл протягом прижиттєвої фази дослідження.
Ферменти печінки відстежували протягом усього дослідження. Зокрема, відстежували рівні
АІ Т, А5Т, АГР, ОСТ, ТВІЇ ії ТО протягом усього дослідження. Рівні ферментів, виміряні на 49 день для мишей, які отримували АОЮ-66810, АО-81890 або РВ5, наведені в таблиці 10 нижче. На фігурах 5А і 58 продемонстровані рівні АЇТ з плином часу після введення АЮ-66810 (фігура 5А) або АО-81890 (фігура 58) щодо введення РВ5.
Таблиця 10
Рівні ферментів в печінці
Група Засю на Доза Рівень діт Рівень Авт Півень пень Гтвень Рівень то азвМА | (МТ КО | (од/л) | (од/лу | (одулу | (од/л) | (од/л) | Д./Л) 6 АО-81890, 100 / 330 | 237 | 40 | 74 | 02 | 103 7 1 РВ5 | 0 | 139 | 7146 | 329 | ло | 02 | по
Для обох протестованих груп, оброблених сполукою, у рівнях АТ, А5Т, АР та СОТ продемонстроване збільшення порівняно з контрольною групою. Крім того, продемонстрована дозозалежна зміна рівнів АТ, А5Т та ОСТ у групі, яку обробляли АО-66810.
Під час розтину не виявили специфічних для протестованих сполук результатів ні в одній із груп. У порівнянні з контрольною групою не було чітких змін у відносних (печінка/маса тіла) значеннях маси печінки тварин у групах, які обробляли сполукою.
ЕКВІВАЛЕНТИ
Фахівцям у даній галузі будуть зрозумілі, або вони будуть здатні визначити, використовуючи лише проведення стандартних експериментів, багато еквівалентів конкретних варіантів здійснення та способів, описаних у даному документі. Передбачається, що такі еквіваленти охоплені обсягом наступної формули винаходу.
Хоча конкретні варіанти здійснення були проілюстровані та описані, буде легко зрозуміти, що різні варіанти здійснення, описані вище, можуть бути об'єднані для забезпечення додаткових варіантів здійснення, і що в них можуть бути внесені різні зміни, не відступаючи від суті та обсягу даного винаходу.
Усі фігури, патенти США, публікації заявок на видачу патентів США, заявки на видачу патентів США, іноземні патенти, заявки на видачу іноземних патентів і непатентні публікації, на які посилаються в даному описі або які перелічені в інформаційному листку заявки, включаючи попередню заявку на патент США Мо 62/718314, подану 13 серпня 2018 року, включені в даний документ за допомогою посилання в усій своїй повноті, якщо не зазначено інше. Аспекти варіантів здійснення за необхідності можуть бути модифіковані для реалізації ідей різних патентів, заявок і публікацій із забезпеченням одержання додаткових варіантів здійснення.
Ці та інші зміни можна здійснювати щодо варіантів здійснення з урахуванням вищенаведеного докладного опису. Загалом, у представленій далі формулі винаходу застосовувані терміни не повинні бути витлумачені як такі, що обмежують формулу винаходу
Зо конкретними розкритими в описі й формулі винаходу варіантами здійснення, при цьому вона повинна бути витлумачена як така, що включає всі можливі варіанти здійснення разом із повним обсягом еквівалентів, до яких застосовна така формула винаходу. Відповідно, формула винаходу не обмежена даним розкриттям.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» Альнілам Фармацевтікалс, Інк.
Ядав, Васант Р.
Майєр, Мартін А.
Мільштейн, Стюарт
Шлегель, Марк К. «1205 КОМПОЗИЦІЇ ЗАСОБУ НА ОСНОВІ Я5РНК ВІРУСУ ГЕПАТИТУ В (НВУ) ТА СПОСОБИ
ІХ ЗАСТОСУВАННЯ
«1305 930385.410М0
«1405 РСТ «1415 2019-08-12 «1505 75 62/718,314 «1515 2018-08-13 «1605» 49 «1705 БЕавЕе5ЕО для Віндовс Версія 4.0 «2105 1 «211» 3215 «2125» ДНК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» МС 003977.1, Вірус гепатиту В, повний геном «40051 сесссасааса Ссссассаад ссссдстада сссададеуд аддддссстає асссссстдс бо
ЕддеЕдодсесСс адеЕсссоодаа садесааассс сдссссдасо ассдссссас ссагбаєсдес 120 ааєсеЕєсесо аддасеєдддд ассседсасс даасасддад адсасаасає саддассссс 180 аддасссстд сЕСЧдЕДДЕсас аддсоадоадЕс ССсСсСссоєссд асаадааєсс сСсасаатсасс 240 асачадеЕсста дасссуасдує дчдассессся саассеєєеєсста дддодадсас ссасєдесс Зоо
Еддссаааає єсдсадессс саассоссаа Ссасссасса ассссссдсс ссссаасесєд 3З6о
ЕссеЕддсває содсеЕддаєдеЕ дЕСЕдсддсд ЄЕсСваєсава ЕЕсСсСЕСсСЕЕСсСа ЕССЄДСсСЕдсСЕ 420 агдссеЕсаєс сЄЕСЕСУЧЄЯдУ ЕСсСЕЄСЕдда сегассааддеЕ агдеЕсдсессд ЄЕС ЄссСЕсЕ 480 асЕєссадда асаєсааста ссадсасддда ассасдсада асссдсасда Ссссгдссса 5340
Зо аддаассесс агдесесссссЕЮ СЕГДСсСЕЧСсСУЧ Сасаааассе сСсоодасдддаа ассдсасеєвд 60
Ббаєєсссаєс ссаєсаєссяє доаодсЕсСссоас аадассссста сдддадсддд ссесадесссд 6б6о
СЕЄСЕССсСвддд сЕСадЕсСвас гадедссавєс соосеЕсадедд ЕЄєсдсадддсе ЕсЕсссссас 720 гЧЕсЕдЧУЧсСЕЄє єсадставає додчаєчаєдесд дсассддддадда ссаадсссдс асаасассєєс 78о0 чадЕсСссЕвеЕ срассеЕстає бассааресес сЕсСеЕсСуЧєЄсСЕє єдддсаєсаса ЕсЕДаасеосяе 840 аасаааасса аасдеЕєддду стасссссЕє аассеєсаєдуа часаєдсаає СодаачеЕс99ч 900 чдабасеЕєвас содсаддааса баєєдсасаа ааасссаадс аасдссссса ааааєссдсссо 960
ЧдЕаааєсадас сраєєсдаєсу дааадсаєсує сааадаасєєсуд єЕодФо9деЕСЕЕСЕ дддсЕСЕДсСЕ 1020 дссссЕЕсва сасааєдеду ссаєссвдсс сЕЧЧасдсесеє басаєдсаєд гагасааєсе 1080 аадсаддсеє Єсасеессесс дссаасесас ааддсссесс єдеЕдсаааса асаєсссааас 1140 сЕсвасссся Есодсссоудса асдддесаддеЕ сессдссаад ЄДЕСсСЕдссда сдсаассссс 1200 асдддЕєддд дсЕЕддссає аддссаєсдд содсаєдсуєд даассЕсвдЕ ддсєсссЕСТд 1260 ссдаєссаєса седсудаасе ссрадсадсесє ссЕсеЕдсеЕсС дсадссдудєс Еддадсддааа 1320 сЕвсаєсддаа ссудасаасес адеЕсдЕссяс ЕСЕСддааає асассєссьс сссаєддоасьд 1380 сЕаддсєдеЕд седссаасьд даєссеЕдсдс ддадасудєсся ЕсЯдсссасує сссдєсодсд 1440 седааєсссд сддасдассс дЕСсСсоддоддс судЕсЕдоддес єЕСвтассуєсс сесессевєсає 1500 сЕдссудєЄЕсСс ддссдассас ддддсдсасс ЕсЕСЕЄвасу сддесессссс дЕСЕДЕДСссЄ 1560
Есеєсаєсьдс соодассдєдЕ дсасеЕссдсс ссассеЕстьдс асдєадсаєд дадассассд 1620 бдаасдссса ссаддеЕсьсуд сссааддеєсс Сасасаадад дасеЕсеЕсдда сесссадсаа 1680 бдєсаасдас сддассеЕсдадд дсасасеєса аадасесдеЕес дЕссааадас Єдддаддадве 1740
Єддодддадда дасєстаддеЕса аадчддеЕсеЕсвд сасеаддада седсеаддсає ааасеєддесе 1800 дЕєЄсассадс ассаєдсаас ЕСЕСЕсСсссс сеЕДсССЕааєс аєсєсаєує саєдеЕсссвсас 1860 бдєЕсаадсс ЕссаадседЕ дссЕєдоадЕд дсЕЕсоддоддс аєддасаєсд асссдраєаа 1920 ачдааєєєдда дссЕСЕЧЕЧДЧУ адеЕсасеьсьс СсЕСЕСЕЧссСЕ ЕсеЕДдДасеЕвст ЕсСССсСЕЄСЯТває 1980
Єсдадаєсьєс сеЕСЧдасассу ссеЕСЕдсессе деаєсоддаад дссЕсададеі сессуддааса 2040
ЄЕдЕЄСсСассє сассаєбасад сасєсаддса адстаєсссу ЄдДдЕєдоадоаєд адеЕсдаєдаа 2100
Есеєддссасс соддуаєдоддаа деааєеєсодда адасссадса Ессадддаає садеадесад 2160 сеаєдеЕСаає деЕсаасаєдда дсссааааає бадасаасста ЕсСЯсодЕСЕС асаєеєссьяд 2220 ссЕБасеЕесеЕ ддаададааа сеЕдЕСсСсСеЄєда дсасєЕсдчдчеуд єСЕЄЕсоодад сдсдоддаєссд 2280 сасеЕссесссс дсеЕсасадас сассаааєдс ссстртаєсєса Есаасассєес сддааассас 2340 бо сбдсЕдеЕсада сдасдаддса ддЕСссссад аадаадаасе сссесдссссС дсадасддаад 2400
ЧдЕСЕСааєсдд ссдсдЕсуса даадаєссса аєсеЕсудддаа ЕсЕСВвасдєе адраєсссья 2460 ччдасєсаєаа доасдддааас ЕсСтаседддсес сЕсСаєсеЕсьсс гаседвассе деЕсСЕсЕсааєс 2520 сЕдаєєддаа аасссссеєсс ЕЕЕССЕЄСсаса сЕСАЕєЄсаса додаддасаєєс аєєсааєсадає 2580
ЧдЕсаасаава ЄдсдддсессЕ сєдасадесва аєдаааааад чадаєєаааа Есааєсаєдес 2640 сЕдсбтадчєе ссаєсстаас сеЕгассааає асеєсєдсссвЕ ддасаааддс аєсааассде 2700 аєсаєссєда агсаєдсадесе ааєсаєтасоі Ссаааастад дсаєсаєєсста сасасеєсьде 2760 чдааддсєдд саєеєставрає аадададааа срасасдсад сдссеЕСсаврєе гЕдЕдддЕСас 2820 саваєєсьсу ддаасаадад ссасадсаєд ддаддЕєддЕ сеЕЕссааасс ссдасааддс 2880 аєдодддасда арсЕсеЕсьЯеЕ Есссаарссє сеЕддддаєсеєся єєсссдаєса ссадеЕсддас 2940 ссеЕдсуєесу дадссаасес ааасааєсса даєсдуддасе Есаассссаа сааддаєсас Зоо
Еддссададд саааєсадчЕ адддадсддчда дсасстсдудсєс садддсєсас сссассасас З06о ччдаддссЕсЕ сддоддЕддад сссеЕсаддессє садуддсабає Єдасаасасе дссадсадса 3120 ссЕссессбуд ссессассаа Есдддсадеса ддаадасадс сеасесссає сессссассе 3180 сЕаададаса дессаєссеєса ддссаєдсад Єддаа 3215 «2105 2 «2115» 3215 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотна комплементарна послідовність для Б5БО І МО:1 «4005 2
БбЕєссасеєдса єддссеЕЧдадд аєчасеєдеЕся сеЕєсададдаєд дададчаєсддда адсаддссдеі бо сЕєССсСЕЧЄасеЕ дссодасєдуає одадодсадда дсдададєдсьтоа седдсадсдЕ ЄдЕСВагсаєд 120 ссссдадссо дадддсссса ссссаааагегдд ссессдгдрда дгдоддоаєдаа сссгддасса 180 аардсесссу сЕССТасстуд аЕєєвдссссо ддссадедасс ссссоєвододуа деЕєдаадесс 240 саасєссддає сДдсЕссдадесс ддссссдаас дсадддесса асгеддедаєс додааадаає Зоо сссададдає Сдддаасада аадасссудес сссардссеє деЕсдаддеЕсс дддаадассаа 3З6о
Зо ссЕССсССсСаєсдс ЄдегадсеЕсеЕс дЕсСсссаада асаєсдудсєдас ссасааагаєд аддсодседсд 420
ЕдеадеЕсеєсеЕ сеЕСЕваєаєа дааєдссадс сссссасада дсасдсааає аасдсстадс 480
ЄєєЧаадеаа єдаєєсаасьд саєаєссада асаасасоддс Ссаасдесес сдЕссаад9дадп 5340 сааасасссд дсааддссад дасадаассо адсаддсагра ассаарссста арссссеЕее 60
Ббєсаєєсаасяе деЕСададддс ссасасбсаєсдд ссдасаєсста ссааєсааєсдє ссесстсдсаа 6б6о асдчаасдеЕда ододаааддаду дадеЕсеЕссса ассаддасєса аадасаддєа садсадаача 720 аєааадссса десааадеЕсеєс ссассссаєсд адсссааддуда асассаасає Єдадаєсєсссс 78о0 чачаєєдада єсСЕєЄсСЕдсда соасоадсддасс дадасссссду сссдсдаддс даддадададеес 840 бЕСЕєСваду ддасседссе саєсдєсссаа саасадсадс ссссоаодаадс дЕсдасаада 900
БЕаддддадсаєє єддеєдЧдєсед єаадсдддад дадсдсдааєс ссасасссса ааадасасса 960 аасасєсаад дасадеЕсеєсеЕ сесссаааад Сааддсадда ааєсдеседааас сасаасадеє 1020 дЕСЕааєсєьс саддудсссаса Есаасаєсда сасадседас бассаарссс сеЕддаєдсьд 1080 дадЕсСЕєсСсаа аєсасьсссс асссаддбєдд ссадаєєссає саасессассс саасасадаа 1140 бадсЕєдссеЕ дадедссдса Еддєдаддед аасааєдеЕсс содддадасесе ааддссессс 1200 чаєасададс ададдсоддеєд єсдаддадає сссдаасада аддааадаад Ссадааддса 1260 аааагачадад Саассссаса даадссссаа ассссеєсаса судддеЕсааєсд єссаєдсссс 1320 ааадссассс ааддсасадс Еєсддаддсес даасадсадудч асаєдаасає дадаєдаєта 1380 часададддд ааааадесєдс асддєдссдда Єдаасадасс аареєсаєдсес гасадсесесс 1440 бадеасааад ассеЕстаасс гааєсьєссьс ссссаасссс ссссадеЕсьс бааасаааса 1500 дЕСЕЄєдаад басдссссаа ддЕсСоддЕСЯЧЄ Єдасаєсдсе дададеЕссаа дадессесьс 1560 дЧдЕдЕаадасс ЄЕдоадсаада ссеЕддсддас дЕсСасуддеєд дЕСЕССаєдс гасддеЕдсада 1620 чдаєдаадсда адедсасасуд дЕСсСсоддсада Сдадааддса садасдддда дассдсдгсаа 1680 ачачаддеєдс дссссодєбддЕ соддссддаас ддсадаєсдаа дааддддасд дгсададдссс 1740 ааасддсссс дадасодддеЕс дЕССсСоЯосддда сСссадсдссуд асдддадасдбра дасаааддас 1800 дЕсссдсдса ддаєссадсЕ ддсадсасад сссадсадсс аєддааадда дадеЕдваєсес 1860 сдадададда саасеєдадеЕєЄ деЕсддеЕєссуд аєаадеЕсссу сессадасся дсеЕдсдадса 1920 ааасаадсвєд сеаддадеЕєс соаосадсаєсдда ассддсадад дадссасааа ддДдЕсссасдс 1980 аєдсдссдає доасссасуддс саадссссаа сссуєбддуддуа ЕЄдсдЕСсСадс ааасасеєсд9дд 2040 сададасссд ассдЕсдссуд ддсаасдудду ЄаааддеЕєса давраєсдсес асасадааад 2100 дссЕєдЕаад ЄЕдодсдадаа адедааадсс ЄдсЕеЕсадаєсє десаєасаєдс асасаааддс 2160 бо ассааддсад дасадссаса СЕЧдсдеаааа доддсадсаа адсссаааад асссасаасе 2220 сСЕЄЕДдасаса сЕЕсссааєс аагаддесса ЕсСгасаддса асєсеЕсудааа асаєєдсевдп 2280 аєввевдна саавгаєдеЕсс сеЕдсддсааа дсассссаас ЕЄсСсааєсас агаєсссаєд 2340 аадеЕєааддд адсадсссса асчєєсодеЕс сваєсадуддеЕ Есаааєдрнає асссааадасєс 2400 аааввдаааає ЄддеЕаасада ддеааааадд дасесаадає дЕсдсасада сегддсесссс 2460 ааєсассасає саєссаєбаєа дсеєдааадсс ааасадсддуда ддааадсссє асдаассасе 2520 чаасаааєдд сассадсааа сеЕдадссадуч адааасудас Єдаддсссас Есссаєбадва 2580 аєсеЕєдсдаа адсссаддає чаєдододаєдд даасасаадеі дсадеЕессся Ессдааддаее 2640 бЕдеасадса асаададудда аасаєададд СЕССЕєдадс аддааєсуєд саддеЕсстсдс 2700 агддЕсссЯє дседдеадее даєдеЕєссвд даадсададд асааасдддс аасаграссьє 2760 чдабадеЕссад аадаассаас аадаачдаєда ддсасадсад саддаєдаад аддаасаєдва 2820
Єаааасдссуд садасасаєс садсдасадс саддасааде Сддаддасаа чададеЕєсєдаєд 2880 адєечаєєдда дасЕддддас Едсдаавсес додссаддаса сдєдддЕєдсЕ ссссстгадаа 2940 ааєєдадада адсссассас дадеЕСсСсадас Єссдсоддднає єдеЕдаддаєсе сеедеЕсааса Зоо адааавгассс сдсссдсаас асдадсаддд дЕССсСсаддаа ЕссеЕдаєдеЕе дсдсеЕсесса З06о
ЄдЕЕСсСододЕдс аддудєсссса деЕсСсЕСсСЧдада адаєсдасда баєдддеєдад дсадгадессд 3120 чаасадддЕє баседеЕсссу даасєддадс сассадсадуд аааасасадд ссссесасес 3180
Єдоадаєссад сададссєдуа Еддааєчєвда Єоддвад 3215 «2105 З «2115» 3215 «2125 ДНК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» АВО14381.1, геномна ДНК вірусу гепатиту В, повна послідовність, ізолят 22У04НСС «220» «221» інша ознака «2225 (1)...13215) «223» п - А,Т,С або б «4005 З ссссассаса ссссассаад ссссдсраса ссссададста аддддсстає асеЕсссстьдс бо
ЕддеЕдодсесс адеЕсссоодаа садесааассс сдссссдасо ассдсссссс ссагбаєсдєес 120 ааєсеЕссьсо аддасеєдддуд ассссдсасс даасаєддад аасасаасає саддаєсссь 180 аддасссстд сЕСЧдЕДДЕсас аддсоадоадЕс ССсСсСссоєссд асаадааєсс сСсасаатсасс 240 асадчадеЕСста дасеЕСсЧдеєдуадеЕ ддасеЕссссс сааєсссссста доддддадсас ссасдедссс Зоо
Еддссаааає єсдсадессс саассессаа сасесасса ассеЕсеЕрдес сьссааєєеєвд 3З6о
ЕссеЕддсває содсеЕддаєдеЕ дЕСЕдсддсд ЄЕсСваєсава ЕЕсСсСЕСсСЕЕСсСа ЕССЄДСсСЕдсСЕ 420 аєдссеЕсаєс сЕСЕСООЄЧдУЯ ЕССЕЄСЕдда сгассааддеЕ асдеЕсдсессся ЕЄЕСЕДЕССЕСЄ 480 асЕєссадда асаєсаасса ссадсасддда ассасдсаад асссдсасда Єсссгдсесса 5340 аддсассеєсеЕ аєсєдеЕсессссеЕ сЕєЧдЕсдссд Сасаааассо Ссддасддаа ассдсасесєд 60
Ббаєєсссаєс ссаєсаєссяє доаодсЕсСссоас аадассссста сдддадсддд ссесадесссд 6б6о
СЕЄСЕССсСвддд сЕСадЕсСвас гадедссавєс соосеЕсадедд Еєсдсадддсе ЕсЕсссссас 720
СгчсЕСоЯдДсСЕЄ Єсадесвсаває одаєчаєдед дсасєдоадоад ссаадеЕссдЕ асаасасссе 78о0 чадЕсСсстЕвеЕ срассуседеЕ бассааресес сЕсСЕеЕСсСУЧЄсСЕє Єдддсаєсаса ЕсЕДаасеосяе 840 ааєаааасса аасдеєєдоадоа Єсасеєссссс аассссаєда дасаєдсаає Єддаадесс9дь 900 чдабасеЕєвас содсаадасса баєєдсасса аааассаадс аасдЕссссд аааассдссе 960
ЧдЕаааєсадас сраєєсдаєсу дааадстаєсує сададааєсд єодФо9дЕСЕЕСЕ дддЧсСЕСЕСсЕ 1020 дссссЕєсва сасааєдеддч ссаєссвдсесс СЕаасуссєє басаєдсаєд гагсасааєсе 1080 аадсаддсеєсє Єсасеессесс дссаасесас ааддсссесс єдеЕдсаааса асаєсссдаас 1140 сЕсБассссу Есдсссоудса асуддесадде сЕСєдссаад ЕДЕсСЕдссда сддсаассссс 1200 асєддаєддад дсЕЕддстає єддссаєсодс соудсаєдсуєд даассЕсвдЕ ддсєсссЕСТ 1260 ссдаєссаєса седсудаасе ссрадсадсеЕ ЕДЕЄЕеЕєдсЕеЕсС дсадссудеЕсС єддадсдааа 1320 сеЕдаєсддаа сддасаасеЕс ЄДЕСДДЕСсСсССсС ЕСЕСОдааає асассеєссевє єссаєдоастд 1380 сЕаддаєдеЕд седссаасьд даєссеЕдсдс ддадасуєссяі ЕсЯдсЕеЕсасує сссдєсодсд 1440 сЕдааєсссу сддасдассс ассесуддддс сЯдаєЕЕдоддеЕсС ЕСвассуєсс ссеЕєствесСає 1500 сЕдссудєЄЕсСс ддссдассас ддддсдсасс ЕсЕСЕЄвасу сддесессссс дЕСЕДЕДСссЄ 1560
Есеєсаєсьдс соодассдєдЕ дсасеЕєсдсе ссассестьдс асдеЕсдсаєд дадассассд 1620 бо бдаасдссса ссаддеЕсесу сссааддеєсс сСасасаадад часеЕсеєсддда сесссадсаа 1680 бдєсаасдас сддассеЕсдадд дсабасесса аадасЕдеЕсєе дЕсЕааддас Еддодаддаде 1740
Єдадоададда даєтаддеЕса аєсєдчаєсьсьдя сасеаддадд сЕдЕаддсає аааєсодесь 1800 дЕєЄсассадс ассаєдсаас ЕСЕсЕеЕСсСассє сеЕдссеЕааєс аєсєсаєуєт саєдеЕсссвсас 1860 бдєЕСсаадсс ЕссаадседЕ дссЕєдоадЕд дсЕсЕсаддас аєддасаєсд асссасаєаа 1920 ачдааєєвєдда дссЕСЕЧЕЧДЧУ адеЕсасеьсьс СсЕСЕСЕЧссСЕ ЕсеЕДдасеЕвеЕЕ ЕсСССсСЕЄСЯТває 1980
Єсдадаєсєс сеЕсдасассу ссЕСЕдсссСЄ деаєсооддаад дссеЕсададеі сессоодааса 2040
ЕЕдеЕєсассе сассарасад сасєсадаса адссаєєстд ЕДдЕєдоаддЧаєЧ адеЕсдаєдаа 2100
Есеєддссасс бддоаєдддаа дсааєсвдда адасссадса Ессадддаає гадсадесад 2160 сеаєдеЕСаає деЕгаасаєдда дсссааааає садасаасса сЕдЕддЕвЕеЕсС асасесссьяд 2220
ЕсСЕгасЕєесє доаададааа сЕдЕЄСсСЕЄЧа драєсеЕдуєд ЕСЕ дддЧдач ЕДдЕДЯЧДЧдаєссо 2280 сасеЕсссссеЕ дсЕсСасадас саєсаааєдс ссстстаєсєса єсаасассєс сододааастас 2340 бдЕЕдеЕсада сдасдаддса ддЕсссссад аадаадаасе сссеЕСсдссЕсС дсадасддаад 2400 дЧдЕСЕСааєсдд ссдсдЕсуса даадаєссса аєсеЕсудддаа ссеЕСаасдєе адраєсссья 2460 ччдасєсаєаа доасдддааас ЕсСтаседддсес сЕсСаєсеЕсьсс гаседвассе деЕсСЕсЕсааєс 2520 сЕдадеЕддса аасессссЕсеЕ ЕЕЕССЕСаса ЕЄсСаєєєдса ододаддасаєєс аєсааєсадає 2580 дЕсаасааса СдсоддоасссЕ сеЕсасадесса асодаааааад дадаєсаааа СеЕааєтаєдес 2640 сЕдсбтадчєе ссаєсстаас сеЕгассааає асеєсдсссвЕ ддасаааддс аєсааассає 2700 аєсаєссдда асаєдсадее аассаєтасеі ссаааастад дсаєсаєтєса сагасесвде 2760 чдааддспдд саєєставрає аадададааа сграсасдсад сдссеєсаєвєсє єдеЕдддеЕсас 2820 саваєєсьсу ддаасаадад ссасадсаєд ддаддЕєддЕ сеЕЕссааасс ссдасааддс 2880 аєддддасаа ассЕсеЕсьдеЕ Есссааєссєї сеЕдодасеєся єЕссссдаєса ссадеЕсодас 2940 ссеЕдсуєесу дадссаасес ааасааєссса даєсдуддасе Есаассссаа сааддаєсас Зоо
Еддссададуд саааєсадчде аддадсоддда дсаєеєсодддс садддессас сссассасас З06о часоЯддЕСсСЕЕс соддоодеЕддад сссеЕсаддесє садуддсасає Єдасаасаде дссадсадса 3120 ссЕссессбуд ссессассаа Есуддсадеса ддаадасадс ссасесссає сеЕсСЕсСсассе 3180 сеЕаададаса дссаєссєса ддссаєдсад Єддаа 3215 «2105 4 «2115» 3215 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Зворотна комплементарна послідовність для Б5БО І МО:3 «2205 «221» інша ознака «2225 (1)...13215) «223» п - А,Т,С або с «4005 4
БбЕєссасеєдса єддссеЕЧдада аєчассдссс сссададоаєд дачачаєдоадч адсадасесае бо сЕссссдасо дссдассддс ддаддсадда ддаддеєдста срддсаседеЕ єдеЕСсСааєчдед 120 ссссдадссс дадддсссса ссссаааада ссдссудєодагда дгдодддєдаа сссрддсссд 180 ааєдсеєсссо сЕССгасстд аєєсдссссо ддссадесдає ссеЕсдєссддда дЕсдаадссс 240 сааєстдддає сдЕєсдадес ддсЕСсСсдаас дсадддссса ассддедаєс доадааадчаає Зоо сссададдає Сдддаасада аадассєсдеЕс сссардссеє деЕсдаддеЕсс дддаадассаа 3З6о ссесссссасдс сдсадссссс дсссссаада асасддедас ссасааааєд аддсдстдсд 420
ЕдеадеЕсеєсеЕ Ю сеЕСЕвсаєаєа дааєдсспде сЕсЄссасада дсаєдесааає аасоасстсаде 480
ЄєєЧаадеаа єдаєєсаасьд саєдеЕсссоод асаасаєсдудс ссаасдесес сдЕссаад9дад 5340 сааасаєссд дсааддеЕсад дасадаассо адсаддсаєба аєсааєєсєсса арсссстссе 60
Ебєсаєєсаасяе деаададддс ссасасасєсдд сСсдасаєсста сСсаасааєсдс ссесссдсаа 6б6о аєчааєсаєда ддаааачадуд чдадеЕсєсдсса сссаддаєса аадасаддсра садсадаада 720 аєааадссса десааадеЕсеєс ссассссаєсд адсссааддуда асассаасає Єдаддссссс 78о0 чачаєєдада єсСЕєЄсСЕдсда соасоадсддасс дадасссссду сссдсдаддс даддадададеес 840
ЕссСЕЄСтада додасседссе сдєсдєссаа саасадсадс єЕєсСсодааде дЕєДЧагаада 900
БЕаддддсаєє єдаєддеєсьд єаадсаддад дадсдсдааєс ссасасссса ааадасасса 960 аасасеєсаад аасадеЕсесеЕ сесссаааад Саадасадда ааєдедааас сасадсадее 1020 дЕСЕДЯДаєєьс саддудсссаса Есаасаєсда сасадсеєдас сасеааєєсс сеЕддаєдсьд 1080 дадЕсСЕєсСсаа аєсасьсссс асссаддбєдд ссадаєєссає саасессассс саасасадаа 1140 бо годдсЕсЧДЕСсСЕ дадедссодса єд9дсдадаєд аасааєдеЕсс судадасесе ааддсесессс 1200 чаєасададс ададдсоддеєд єсдаддадає сссдаасада аддаааааад Ссадааддса 1260 ааааададад баассссаса даадсєссаа асєсеЕстава содддєсааєд Ессаєсдєссь 1320 ааадссассс ааддсасадс Еєсддаддсес даасадсадудч асаєдаасає дадаєдаєта 1380 часададдеєд ааааадсєдс асддєдссддд Єдаасадасс аареєсаєдсес гасадсесесс 1440 бадеасааад аєсаєтаасс гааєсьєссьс ссссаасеьсс Есссадессе бааасаааса 1500 дЕСЕЄЄДдаад Сасдссссаа ддЕСоЯОДдЕСЯЄ Сдасаєсдсе дададеЕссаа дадсссЕсеє 1560 асаєаадасс ЄЕдддсаада ссеЕддЕддас дЕсСсСасоддед дЕСЕССаєдс дасдєдсада 1620 чдаєдаадсда адедсасасуд дЕСсСсоддсада Сдадааддса садасдддда дассдсдгсаа 1680 ачачаддеєдс дссссодєбддЕ соддссоодаас доасадаєдаа дааддддасд дгсададассс 1740 ааасддсссс дадаєдддеЕс дЕССсСоЯосддда сСссадсдссуд асдддадасдба аасаааддас 1800 дЕССсСсдсдса ддаєссадсє ддсадсасас сссадсадсс аєддааадда двдедраєсес 1860 сдадададаа саасададеЕє деЕссдЕсссу аєсадесєсєсу сессадассу дсеЕдсдадса 1920 ааасаадсвєд сеаддадеЕєс соаосадсаєсдда ассддсадад дадссасааа ддДдЕсссасдс 1980 аєдсддсдає додссаасадс саадссссає ссадсддудду ЕєЄдсдЕСадс ааасасеєсд9дд 2040 сададасссд ассдЕсдссуд ддсаасдудду ЄаааддеЕєса дараєсдсес асасадааад 2100 десЕєЄдсаад Єєдоасдадаа адедааадсс СдсЕсСадасє дсаєсасаєдс асасаааддс 2160 аєєсааддсад даєсадссаса ЄєдЕеЕдсаааа ддддсадсаа адсссаааад асссасааєсс 2220 сЕСЕДдасаса сЕЕсссааєс аагаддесса ЕсСгасаддса чЕЕсСЕСЧдааа асаєєдсевдп 2280 авфвєеєсадна саагаєдудєс ЕєдсддЕааа дегассссаас ЕЄсСсааєсас агаєсссаєд 2340 аадеЕєааддд адсаасссса асуєєсодеЕс сваєсадуддеЕ Есаааєдрнає асссааадасєс 2400 аааадаааає Сддеаасадс ддеЕааааадуд дасеєсаадає д«Есдсасада сегддссссс 2460 аасассасає саєссаєбаєа асеєдааадсс ааасадсддуда ддааадсссо асдаассасес 2520 чаасаааєдуд сассбадсааа седадссадд адааасддас Сдаддсссас сСсссагсаддвда 2580 аєсеЕєдсдаа адсссаддає чаєдододаєдд даасасаадеі дсадеЕессся Ессдааддаее 2640 бЕдеасадса асаададудда аасаєададд ЄдссесЕєдадс аддааєсуєд саддеЕсьсдс 2700 аєддеЕсссЯє дседдсадесеЕ даєдеЕсссьуд даадсададуда асааасдддс аасасасссе 2760 чдабадеЕссад аадаассаас аадаачдаєда ддсасадсад саддаєдаад аддаасаєдва 2820
Баааасдссуд садасасаєс садсдасадс саддасааасє Сддаддасаа дадаеєсд9даєд 2880 адєечаєєдда дасЕддддас Едсдаавсес додссаддаса сдєдддєдсЕ сссесстсадаа 2940 ааєєдадада адсссассас дадеЕСсСсадас Єссдсоддднає єдеЕдаддаєсе сеедеЕсааса Зоо
Зо адааааассс сдсссдсаас асдадсаддад дЕССсСаддаа ЕЄссеєдасоЯаєє дсодсесеЕсса З06о
ЄдЕЕСсСододЕдс аддудєсссса деЕсСсЕСсСЧдада адаєсдасда баєддададад дсадгадессд 3120 чаасадддЕеє саседеЕсссу даасєддадс сассадсадуд ааадгаєгадд ссссеЕрасес 3180
Єдаддадєдсад сададссєдуа Еддааєдчесда Єоддвад 3215 «2105 5 «2115 1200 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Плазміда рвіснЕСК2-НВУ «4005 5 сесссасааса СсСсссассаад ссссдсаада ссссададесс аддддсестдс асссссстдс бо
ЕддЕддсЕсСс адсссаддаа садсдаассс СдЕсСссчасе аседссессс ссагбаєсдес 120 ааєсеЕєсесо аддасеєдддд ассседсасс даасасддад аасаєссасає саддассссс 180 аддасссстд сЕСЧдЕДДЕсас аддсоадоадЕс ССсСсСссоссд асаааааєсс ссасаатсасс 240 асадчадеЕСста дасеЕСсЧдеєдуадеЕ ддасеЕссссст саасссссса доддддадсас ссддсдедссс Зоо
Еддссаааає єсдсадессс саассоссаа Ссасссасса ассссстдсс ссссаасесєд 3З6о
ЄссеЕддссає соасєддаєдЕ дсЕссдсоддсуд СЕСтаєсаєс єЕсссесевса ЕСССЯСтсСЄ 420 агдссеєсаєс сЄЕСЕСУЧЄоЯУ ЕСсСЕЄСвєдда ссаєссаадчаде агдеЕсдсессд ЄЕС ЄссЕсЕ 480 ааєєссадда Єсаєсаасса ссадсасддда ассасдсааа асссдсасда сссссдсесса 5340 аддаассеєсеЕ аєдеЕсессся саєдеЕсдссдд Сасаааассо Ссддасддаа ассдсасстд 60 баєєсссаєс ссаєсаєстЕє доддсеЕсссоас аааасассса Соддвдадсддадд ссссадесссд 6б6о
СЕСсСЕСЕсдд сеЕСаВдДЕсСВас гадсдссаєєс сосеєсадедд Ессдсадддсе ЕсЕсссссас 720 гЕЧдЕСЕДЧУЧСсСЕЄ ЄсадеЕсаєає додчаєчаєдесд дсассддддадда ссаадсссдс асадсаєссєєс 78о0 чадЕСссЕве арассуседЕ бассааресес сЕсСЕеЕсСуЧЄсСЕє Єдддсаєсаса ЕсСгааассся 840 аасаааасаа ааачаєдддд Єсаєєссста аасеЕєсаєдуа деЕгаєдесаає єддаадес9во 900 чадасаєєдс сасаддааса баєєдсасаа аааассааас аасдссссад аааасссссс 960 бо дЕсаасаддсес стаєсдаєсу дааадсасуає саасудаасєсу ЄдФо9деЕсСеЕЕсЕ одосСЕСЕДЧ СЕ 1020 дссссЕвЕсва сасааєдеду Есаєсстдсс сеЕаасдсесеє єдсаєдсаєд гасасаадсь 1080 ааасаддсеЕє єрасеесссс дссаасесас ааддсессесс єСсСеЕдсаааса асасаєсдаас 1140 сЕЄБассссу ЕсдсЕСсСуудса асдддссаддЕ седеЕдссаад ЕДЕСсСЕдссда сддсаассссс 1200 «2105 6 «2115» 681 «2125 ДНК «213» Вірус гепатиту В «2205 «223» НВУ, генотип А «4005 6 аєддадааса Єсасаєсадд аєєсссадда ссссдсссуа Сдссасаддс дядаодеЕсесес бо гєдеЕєдасаа дааєссяєсас аасассдсад адссстадасс сдасддсддас сссесессаає 120
ЕсЕСєадодуа дчаєссасссує дЕдЕссЕсСдудс сааааєєсдс адеЕссссаас сеЕсСсааєсас 180
Есассаассеє ссеЕДдЕССсСЕЄСС ааєєсвдессся даєсаєсоасс додасачсдаєсес дсоадсасеее 240 аєсаваєєссс ссеЕеСсаєсся дседссаєсудс сеЕсасрсеєєсьт гасвдуаєєсЕ ЕСЕаДЧдаєває Зоо сааддсасдс сдсссдсссд сссссрааєс ссаддаєсаа саасаассад гбасдддасса 3З6о
Едсаааассе дсасдасеєсс єдсеЕСааддс аассстаєсдс сссссосаєдд ссдссдсаса 420 ааасссасод аєддааасьу сасссудсбаєреє сссассссає сдеЕСССдддс ЕЕсСсосаааа 480 бассваєддд адсдддесесс адеЕссдеЕєєс ссевддсесеєса дЕЄвасвтаде дссаєєседеє 5340 садсддсєссду Садддссссс ссссастдеЕс годдсЕсссад стасаєддває дчаєдеддвтає 60
Едвддддссаа дЕСЕЧдДсасад саєсдєдаде сссеЕссасас соассдеЕсСасс аасссссевсс 6б6о
ЄдЕСЕСєдддуд бабсасаєсеса а 681 «2105 7 «2115» 681 «2125 ДНК «213» Вірус гепатиту В
Зо «2205 «223» НВУ, генотип С «4005 7 асддадааса саасаєсадуч асєсстадда ссссдсссу Сдссасаддс доддсеЕесесс бо гєдеЕєдасаа дааєссяєсас аасассасад адссстадасс сдасддсддас сссесессаає 120 бЕєСвєадоадуа дадсасссас дЕДдЕСССддес сааааєсссдос адсссссаас сессааєсас 180
Есассаассеє сЕЄдеЕСсСсЕСсСсС ааєєвдессся ддассаєссоасос ддасдсдесс дсоддсєсссе 240 аєсаваєєссс єсеЕесаєсся дседсваєсодс сьсассєєссе єдеЕсддЕЕсСЕ ЕСЕЯДдассвсас Зоо сааддтасдЕеЕ СдсссддєеЕсдд ЕССЕСсТасос ссаддаасає саастассад сасдддасса 3З6о
Едсаадассеє дсасдаєєсс єдсеЕСаадда асссстасдс сссссссссд ссдссдсаса 420 ааассеЕєсодд асододааасєд сасеєєдсаєсс сссаєсссає саєссєдддсес ссссоасаава 480 вЕССваєддад адедддсесесс адеЕссдЕєєс сссеЕдддсеЕса ДЯдЕЄвастаде дссаєєседеє 5340 садеЕдЧачЕєсу гадддсесєеєс ссссассусєе гЕддсеЕєеєсад Есасаєддває даєдеЕддтає 60 бддодддссаа дЕСЕДдсасаа саєсеЕсдадес сссЕСЕсСТтТас сеСстаєсаєс аассеЕсссеє 6б6о
ЄЧдЕСЕЕвддда басасаєсєєсд а 681 «2105 8 «2115» 681 «2125 ДНК «213» Вірус гепатиту В «2205 «223» НВУ, генотип Е «4005 8 аєддааадса Єсасаєсадд аєєсссадда ссссдсссуа Сдссасаддс дядаодеЕсесес бо гєдеЕєдасаа аааєссеєсас аасассоасад адесссадасе сасддсєддас Єссесессаає 120
ЄЕЕєСвєадоадуа дадсесссЯяє деЕдЕСсСссддес сааааєсссдос адсссссаас сессааєсас 180 бо Есассаассс сЕСдЕССССсССсС ааєссуєсся доссаєсусе дчаьдесддесс дсудсаєсвте 240 аєсаєсвьєсс ЄсеЕеСаєссся дседссаєсудс срсассєєсет єдеЕєоддЕСсСЕ Есесодастає Зоо сааддсасдс сСдсссдсссд сссоссраарс ссаддаєсає саассассад гасдддассс 3З6о
Едссдаассе дсасдасеєсе єдсеЕСсСаадда ассссстаєсдс сссссссаєдад Єсоседесса 420 ааассеЕєсодд асододаааєєд сасеєєдсаєсс сссаєсссає сассасдддес ссссоддаааа 480
ЕЕССсСвгаєдод адедддсесес адсссдєсеєс єСССддссса дЕссассаде дессасссдесє 5340 садсдЧчєссоу ссуддсеЕвсс ссссастуєс єддсЕСсСссад Есасаєддає чдаєдесдавсає 60 бдаддддссаа дЕСЕДдЕасаа саєсеЕєсдаде сссеЕстарас сЕСЕДЕСасс ааєсесстве 6б6о
ЄЧдЕСЕевдда басасаєсеса а 681 «2105 9 «2115» 681 «2125 ДНК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» НВУ, генотип ЕЕ «4005 9 аєддасааса Єсасаєсадд асеєсссадда ссссдсссуа Сдссасаддс ЯдсдсдеЕсес бо гєдеЕєдасаа аааєссеєсас аасассасад адссстадасс сдсддеддас ЄссеЕсСессаає 120
ЕсЕСєадодуа дчассасссоод деЕдессссдудс сааааєєсдс адеЕссссаас сеЕссааєсас 180
Ебассаассеє ссеЕдеЕсСсЕсс аасеЕсдесссо ддассаєссоаєс дадасдсдесс дсоддсєсссе 240 аєсаєсвьєсс ссеЕеСаєсся дседссаєсудс сесассєєссе єдеЕгдЧєєсСЕ ЕСЕЯЬДдасває Зоо сааддсасдс сСдсссасссд сссоссасос ссаддаєсса сдассассад сасдддасса 3З6о
Едсаааассеє дсасаасеєсе ЄдсеЕСсаадда асссстасдс ссссссссгд ссдседеЕссс 420 адаасссісоудд асддааасеуд сасссдсбаєюеє сссассссає саєсеєсдддас гєЕеєсСаддаааа 480
Бассваєдоад адедддсесес адсссдсссс сссгддсессса деЕсССассаде дсаасссоаєс 5340 садсддєдсу Садддссссс ссссасурдеЕс сгчддсеЕєссад єсасаєдває даєстєддатає 60
Едвддддссаа аєсеєдеЕдсад саєсєсдадес сссессасас сдассдессасс аасссесссде 6б6о баєсєдеддад баєссаєсеса а 681
Зо «2105 10 «2115 19 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотид (сенсовий) «4005 10 дидидсасии сдсцисаса 19 «2105 11 «2115 19 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотид (сенсовий) «4005 11 чидидсасври сдсицсаса 19 «2105 12 «2115 19 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотид (сенсовий) бо «4005 12 чидидсасври сдсицсаса 19 «2105 13 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-66810 «4005 13 идидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 14 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192282 «4005 14 идидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 15 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність
Зо «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192289 «4005 15 идидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 16 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-81890 «4005 16 чдидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 17 «2115 21 «2125 РНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-81892 «4005 17 идидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 18 «2115 21 бо «2125 РНК «2135 Штучна послідовність
«223» Антисенсова послідовність АР-192283 «4005 18 идидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 19 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192291 «4005 19 идидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 20 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192277 «4005 20 идидаадсда адидсасаси ци 21
Зо «2105 21 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192284 «4005 21 идидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 22 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192285 «4005 22 чдидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 23 «2115 21 «2125 РНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192293 бо «4005 23 идидаадсда адидсасаси ци 21
«2105 24 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192279 «4005 24 идидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 25 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192294
«4005 25 идидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 26 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192280 «4005 26 идидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 27 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192287 «4005 27 идидаадсда адидсасаси ци 21
«2105 28 «2115 21 «2125 РНК «2135 Штучна послідовність
«2205 «223» Антисенсова послідовність АР-192281 «4005 28 чдидаадсда адидсасаси ци 21 «2105 29 «2115 19 «2125 РНК 6о0 «213» Штучна послідовність
«223» Синтетичний олігонуклеотид (сенсовий) «4005 29 дидидсасци сдсцпцсаса 19 «2105 30 «2115 19 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетичний олігонуклеотид (сенсовий) «4005 30 чидидсасври сдсицсаса 19 «2105 31 «2115 19 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетичний олігонуклеотид (сенсовий) «4005 31 чидидсасври сдсицсаса 19 «2105 32
Зо «2115» 832 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «2205
З5 «223» Білок Р НВУ (УР 009173866) «4005 32
Ме Рго Гей бек Тук біп Ні Рпе Агкуд Агд Гец Іецй Іецй Іецй Авр Авр 1 5 10 15 40 сі Азїа сб1у Рго Гей бій бій бій Гей Рго Агд Гей Аїа АБр б1ц 1У 20 25 30
Тец АвБп Агуд Агуд Уаі Аїа сій Авр Гей Ап Гей сіу Авп Гец АвБп Уаї зек Іїе Рго Тгр ТПг Нів пув Уа1ії б1у АвБп Рпе ТПг с1у Гей Тук 5ег 45 50 55 бо зек ТПг Уаї Рко Уаі Рпе АБп о Рго Нів Тер ГПув ТПг Рго Бек РоОе Рго 65 70 75 80
Ап отІ1е Нів Гец Ні біп Авр І1е І1е Гув Гпув Сув бі біп Рібе Уаї 85 90 95 с1у Рго Гецш ТПг Уаі Авп бій Гпув Агуд Агд Гей сіп Те І1е Меє Рго 100 105 110
Аза Акуд Рпе Тукг Ркго пув УМа1ії ТБПг пув Тук Гей Рго Гей Авр ув 1У 115 120 125
ІТ1е Ппув Рго Тук Тук Рго бій Нів Іец Маі АвБп Нів Тує Рпе сіп ТПг 130 135 140
Акуд Нів Тук Гец Нів ТПг ІТецйп Тгр ув Аїа с1іу Іїе Гей Тук пув Агд 145 150 155 160 біц Тс Тс о Нів бек Аїа бек Рпе Сув сіу Бек Рго Тукг бек Тгр б1іц 165 170 175 бо сіп Авр Ге біп Нів сіу Аїа бій бек Рібпе Нів сіп сбіп бек бек б1Уу 180 185 190
І1е Гец бБег Агд Рго Рго Уа! Сіу бек бек Гей Ссіп Бек Ппув Нів Агд 195 200 205 пув век Агд Гей с1у Гей біп бек сбіп сбіп сіу Нів Гей Аїа Агд Аг4д 210 215 220 сіп біп б1у Агуд бек Тгр бек І1їе Агуд Аї1а с1іу Рпе Нів Рго ТПг Аїа 225 230 235 240
Акуд Агуд Рго Роре біу УМаії бій Ркго бек біу бек с1у Нів ТПг ТПг Авп 245 250 255
Рпе Аїа бек пуб бек Аза бек Суб Тецй Нів сіп Бек Рго Уа1 Агд Гув 260 265 270
Аза Аза Туг Рго Аїа Уаії бек ТПг Роре біцш Гув Нів Бек Бек Бех Щ1У 275 280 285
Нів Аїа Уаі1 сій Рбе Нібв Авп Гей Рго Рго АвБп бег Азї1а Агд бек сіп 290 295 300 зек бій Акуд Рго Маі Ррпе Рго Сув Тер Тгр Гей сбіп Рпе Агд Авп бег 305 310 315 320
Тув Ркго Сув Бек Авр Тук Сув Гей бек Гей Іїе Уаі1і Авп Гец Іец сій 325 330 335
Авр Тер с1у Рго Суб Аїа біп Ні сі1у б1цп Нів Нів Іїе Агу Ії1їе Рго 340 345 350
Акуд ТЕ Рго бБег Агд Уаі ТПг сіу біу Маії Рпе Гей Уаі Авр Гув Авп 355 360 365
Ркго Нів АвБп ТПг Аза бій бек Агд ІТец Уаії Уаії Авр Рпе бек сбіп Ріє 370 375 380 зек Акад б1іу Авп Туг Агуд Уаі бек Тер Рго Ппув Рпе Аїа Уаї Рго Авп 385 390 395 400
Тецп біп бек Гей ТПг Авп Гей Гей бБег Бек Авп Гей бек Тгр Іец 5ег 405 410 415
Тец Авр Уаії бек Аза Аїа Рпе Тук Нів Гец Рго Іец Нів Рго Аза Аїа
Зо 420 425 430
Ме Рго Нів Гей Гей Уаї сіу Бек бек сіу Пец бег Агуд Тук Уаї Аїа 435 440 445
Акуд Гей бек бек Авп бек Агуд І1е Іец АБп АБп о біп Нів сіу ТПг Меє 450 455 460
Рго Авр Гей Нів Авр Тук Сув Бек Агкуд Авп Гей Тук Уаї бек Іеч Іецй 465 470 475 480
Тецшп Гей Тук сбіп ТПг Рпе сіу Агкуд Ппув Гей Нів Гей Туг бек Нів Рго 485 490 495
І1е Іїе Гец сіу Рпре Агуд ГПув І1е Ркго Меє сіу Уаі с1у Гей бек Рго 500 505 510
Рпе Гей Гец Аза біп Рпе ТПг бек Аїа І1е Сув Бек Уаі Уаі Аг9д Аг4д 515 520 525
Аза Рпе Рго Нів Суб ІТец Аза Рібе бек Тук Меє Авр Авр Уа1ї Уа1ї Іец 530 535 540 сі1у Аїа Ппув Бек Уаі біп Нів Гей бій бек Гей Рпе ТПг Аза Уаї Тіг 545 550 555 560
Авп о Рпе Гей Гец бек Іец біу Ії1е Нів Іец Авп Рго АвБп о ГПув ТПг Гув 565 570 575
Акуд Тер с1і1у Тук бек ІТец АвБп Рібе Меє с1у Тук Уаі І1е о1Уу Сув Туг 580 585 590 бі1у бек Гей Рго сбіп біш Нів Іїе Іїе сіп пув Іїе пув біц Сув РБПе 595 6боо 605
Акуд пув Гей Рго І1е АБп Агуд Рго І1е АБр Тгр Гпув Уаі Сув біп Агд 610 615 620
Іїе Уаі с1у Гей Геш с1у Рпе Аїа Аза Рго Рпе ТПг сіп Сув с1у Туг 625 630 635 640
Рго Аїа Гец Меєсє Рго Іїецй Туг Аїа Суб І1е біп бек Ппув біп Аїа Ріе 645 650 655
ТПЕ Рпе бек Рго ТПг Тук Гув Аза Рпе Гей Сув Ппув біп Тук Гец Авп 60 бо 6бе5 670
Тец Тук Рго Уаі Аза Агуд сбіп Агуд Рго сіу Гей Сув біп Уаї Робе А1а
675 68 685
Авр Аза ТПг Рго ТПг б1у Тер сб1у Іец Уаї Меє сіу Нів біп Агд Меє 690 695 700
Акуд с1у ТБкг Рбре бек Аза Рго Гец Рго І1е Нів ТПг Аза сій Гецй Гей 705 710 715 720
Аза Аїа Сув Рре Аза Агд бек Агд бек бі1у Аї1а АБп І1е І1е с1у ТЕПг 725 730 735
Авр Ап обек Уаї Уаі Іец бек Агкд Гуз Тук ТПг Бек Рпе Рго Тер Іец 740 745 750 їеч біу Сув Аїа Аїа Авп Тгр І1е Гей Агуд с1іу ТПг бек Ріре Уаї Туг 755 760 765
Уаї Ркго Бек Аїа Гей Авп Рго Аїа Авр Авр Рго бБег Агд б1у Агд Іецй 770 775 780 сб1у Гей Бек Агуд Рго Гей Гей Агд Гей Рго Рпе Агуд Рго ТПг ТПг о1Уу 785 790 795 800
Акуд Тк бек Гец Туг Аза Авр бек Рго бек Уаі! Рго Бек Нів Гей Рго 805 810 815
Авр Агуд Уаії Нів Рре Аза бек Рго Іец Нів Уаі Аза Тгр Агд Рго Рго 820 825 830 «2105 33 «2115» 389 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» Білок 5 НВУ (УР 009173869) «4005 33
Зо Меє б1у біп Авп Гей бек ТПг бек АвБп о Рго Гей біу Рпе Роре Рго Авр 1 5 10 15
Нів біп Гей Авр Рго Аїа Робе Агуд Аїа АвБп ТПг Аза АБп о Рго АвБр Тгр 20 25 30
Авр Рпе Авп о Рго АвБп оГув Авр о ТБг Тер Рго Авр Аїа АвБп Ггув Уаі1і ШУ
З5 35 40 45
А1їа сіу Аїа Рбе сіу Іец б1у Робе ТПг Рго Рго Нів сіу сіу Гец Іей 50 55 бо б1у Тер бек Рго сбіп Аїа сіп с1іу Іїе Гей біп ТПг Гей Рго Аїа Авп 65 70 75 80
Рго Рго Рго Аїа Бек ТПг Ап Агуд біп бек б1у Агд біп Рго ТПг Рго 85 90 95
Тец бек Рго Рго Гей Агуд Ап о ТПг Нів Рго біп Аїа Меє сбіп Тгр Авп 100 105 110 ек ТПг ТПг Роре Ні біп ТПг о Гец біп Авр Рго Агуд Уаі Агуд с1Уу Гей 115 120 125
Тук Рпе Рго Аїа сіу біу бек бек бек біу ТПг Уаії Авп Ркго Уаї1ї Іеєец 130 135 140
ТПЕ ТпПкг АТа бек Рго Пец бек бек І1їе Рібе б5ег Агд І1е Сс1у АвБр Рго 145 150 155 160
А1а Гей Авп Меє бі АвБп І1е ТПг бек с1іу Рібе Гецй с1у Рго Іеч Іецй 165 170 175
Уаї гей біп Аїа сіу Рібе Рібе Гей Гей ТПг Агуд І1е Іїецй ТПг ІШе Рго 180 185 190 біп бек Гей Авр бек Тер Тер ТПг бек Гей Ап Ропе Гец сіу с1іу ТЕПг 195 200 205
ТПЕ Уаї Сув Гей сіу біп Авп бек біп бек Рго ТПг бек АБп Нів 5бег 210 215 220
Рко ТПг бек Сув Ркго Рго ТПг Сув Рго біу Тугк Агд Тгр Меє Сув Іец 225 230 235 240 бо Агуд Агуд Рпе І1їе І1е Рбе Гей Рпе І1їе Гей Гей Гецй Сув Гей І1е РіПе 245 250 255
Тецп ІГецп Уаї Гей Гей Авр Туг сіп сіу Меє Гей Ркго Уаї Сув Рго Іей 260 265 270
ІТ1е Рго біу бек бек ТПг ТПг бек ТП о біу Рго Сув Агд ТПг Сув Меє 275 280 285
ТП ТрПг АТа сіп сіу ТПг бек Меє Тук Рго бек Сув Сув Сув ТПг Гуз 290 295 300
Ркго Бек Авр б1іу Авп Сув ТПг Сув І1е Рго І1е Рго Бек бБег Тер Аїа 305 310 315 320
Рпе сі1у Ппув Рбе Іецй Тер бій Тгр Аї1а бек Аїа Акуд Рібе бек Тгр Іей 325 330 335 зек Гей Гец Уаії Ркго Рпе Уаі бСіп Тгр Рпе Уаї сіу Гей Бек Рго ТЕГ 340 345 350
Уаї ТЕр Геш бек Уа1 Іїе Тер Меє Меє Тер Туг Тгр б1у Рго бек Іец 355 3З6о 365
Тук Бек Іїе Гей бек Рго Рре Гецй Рго Гей Темп Рго І1е Рпе РоПе Сувг 370 375 380
Тец Тер Уаї Ту Ше 385 «2105 34 «2115 281 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» Білок Ргеб52 НВУ (УР 009173870.1) «4005 34
Мен біп Тер Авп бек ТПг ТБг Рпе Нів сіп ТБПг Гец біп Авр Рго Аг4д
Зо 1 2 10 15
Уаї Ак с1у Гей Тук Рпе Рго Аїа сіу сіу бек бек бек біу ТПг Уаї 20 25 30
АвпоРго Уаії Гец ТПг ТПг Аза бек Рго ІТецй бек бек Іїе Рпе бБег Аг4д 35 Іїе с1у Авр Рго Аїа Гей Ап Меє сій Авп І1е ТПг бек с1у Рібе Іецй бо б1у Ркго Гей Гей Уаі Гей сіп Аїа с1іу Рпе Рпе Гей Гец ТПг Агд І1е 65 70 75 80
Тецп ТПпг І1їе Рго сбіп Бек Гей Авр бек Тер Тер ТПг бек Гец Авп Ріе 40 85 90 95
Тец бі1у с1у ТПг ТПг Уа1 Сув Гей с1у біп Авп бек біп бек Рго ТЕПг 100 105 110 зек Авп о Нів бек Рго ТПг бек Сув Рго Рго ТПг Сув Рго с1у Тукг Аг4д 115 120 125 45 Тер Меє Сув Гей Агуд Акуд Рпе І1їе Іїе Рібе Гей Рібе І1е Гей Гей Іец 130 135 140
Сув Теп І1їе Рпе Гей Гей Уа1 Гей Гей Авр Туг сіп сіу Меєсє Іецй Рго 145 150 155 160
Уаї Сув Рго Гей Іїе Рго сіу Бек бек ТПг ТПг бек ТПг с1у Рго Сув 50 165 170 175
Акуд Тк Сув Месє ТПг ТБПг Аза біп сбіу ТПг бек Меє Тук Рго Бек Сув 180 185 190
Сув Сув ТПг Ппув Рго Бек Авр с1у Авп Сув ТПг Сув І1е Рго І1е Рго 195 200 205 55 Ззек бек Ткгр Аїа Рпе сіу Ппув Рпе Гей Тгр бій Тгр Аїа бек Аза Агд 210 215 220
Рпе бек Тер Іїец бек ІГецй Гей Уаі! Ркго Рпе Уаі сіп Тгр Рпе Уа1і1 0Щ1У 225 230 235 240
Тецп бек Рго ТПг Уаі Тер Гей бек Уаі Іїе Тер Меє Меєсє Тгр Туг Тгр 60 245 250 255 б1у Ркго Бек Гей Туг Бек Іїе Гей Бек Рго Рпе Гей Рго Гец Іецй Рго
260 265 270
І1е Рбе Рібе Суб Іецй Тер Уаї Тук І1е 275 280 «2105 35 «2115» 226 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» Білок 5 НВУ (УР 009173871.1) «4005 35
Меє бій Авп І1їе ТПг бек сіу Рпе Гей бі1у Рго Гей Гей Уаі1і Іец сіп 1 2 10 15
Аза сіу РіПе Рібе Іец Іецй ТПг Агуд І1е Іїецй ТПг Іїе Рго сіп Бек Іец
Авр Бек Тер Тер ТПг бек Гей АвБп Рпе ІТецп сіу сіу ТПг ТПг Уаї Сув 20 їемч біу біп Авп бек біп бек Ркго ТПг бек Авп о Нів бек Рго ТПг 5ег бо
Сув Ркго Рго ТПг Сув Рго сіу Туг Агуд Тер Меє Сув Гей Агд Агд РіПе 65 70 75 80
І1е Іїе Рібе Іецш Рбе І1е Гей Іецшц Іїецй Сув Гей Іїе РПе Гей Іец Уаї 25 85 90 95
Тецшц Гей Авр Тук сбіп сіу Меє Гей Рго Уаі Сув Рго Гей І1е Рго с1Уу 100 105 110 зек бек ТПг ТПг бек ТПг б1у Рго Суб Агуд ТПг Сув Меє ТПг ТПг Аї1а 115 120 125
Зо сіп б1і1у ТПг Бек Меє Тук Рго бек Сув Сув Сув ТПг Гув Рго бБег Авр 130 135 140 б1у Авп Сув ТПг Сув Іїе Рго Іїе Рго бек бек Тгр Аїа Робе С1Уу Гув 145 150 155 160
Рпе Гей Тгр біц Тгр А1ї1а бек Аза Агуд Рпе бек Тгр Гей Бек ГІецй Іец
З5 165 170 175
Уаї Ркго Рпе Уаі1і сіп Тер Робе Уа1 сіу Гей бек Ркго ТПг Уаї Тгр Гей 180 185 190 зек Уаї І1їе Ткр Меє Меє Тер Туг Ткгр б1у Рго Бек Гей Тукг бек І1е 195 200 205 40 Пен бек Рго Рре Гей Ркго Гей Гецй Рго І1їе Рібе Рібе Су5з Гецп Тер Уаї1! 210 215 220
Тук Ше 225 45 «2105 36 «2115» 154 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В 50 «2205 «223» Білок Х НВУ (УР 009173867.1) «4005 36
Меє Аза Аза Агд Гей Сув Сув біп Гей Авр Рго Аза Агуд Авр Уаі1ї Іец 55 1 2 10 15
Сув Тецп Агуд Рго Уаі с1у Аїа сій бек Сув с1у Акд Рго Робе бег 01Уу 20 25 30 зек Гей біу ТПг Іец бек бек Рго бек Рго бек Аза Уаі Рго ТПг Авр 35 40 45 бо Нів сб1іу Аїа Нів ІТецй бек Гецп Агуд с1іу Гей Рго Уа! Сув Аза Рпе 5ег 50 55 бо зек Аїа біу Ркго Суб А1їа їей Агуд Роре ТПг бек Аза Агуд Агуд Меє сіц 65 70 75 80
ТПЕ ТпкЕ Уаі1 Авп Аза Нів біп Ії1е Гей Рго пуб Уаії Іец Нів Гпув Агд 85 90 95
ТПЕ Гецп с1у Гей бек Аїа Меє бек ТПг ТПг Авр тей сбіц Аїа Тук Ріе 100 105 110 ув Авр Сув Гей Рпе Ппув Ар Тгр бій бій Геш сіу сій біц І1е Агд 115 120 125
Тец Ггув Уаї Рпе Уаі Ггеш сіу сіу Сув Акуд Нів Ппув Гец Уаї Сув А1а 130 135 140
Рго Аїа Рго Суб Авп Рпе Рпе ТПг б5ег А1а 145 150 «2105 37 «2115 212 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» Білок Ргес НВУ (УР 009173857.1) «4005 37
Меє сіп Гей Рпе Нів Гей Суб Гей Іїе І1ї1е бек Сув бек Сув Рго ТПг 1 5 10 15
Уаї біп Аза бек Пув Гей Сув Гей с1у Тер Гей Тгр б1у Меє АвБр Пе 20 25 30
Авр Рго Тук Ппув біц Рпе б1у Аїа ТПг Уаї бій Гей Гей бек РПе ГІецй
Ркго Бек Авр РоПе РобПе Рго бек Уаі Агд Авр ІТецп Гей Авр ТПг Аїа 5ег
Зо 50 З бо
А1ї1а гей Тут Агуд біц Аза Іїецй біц бек Рго біц Нів Сув Бек Рго Нів 65 70 75 80
Нів ТПг Аїа Гей Агуд біп Аїа Іїе Гец Сув Тгр біу б1іцп Іеип Меє ТПг 85 90 95 35 Те Аїа ТПг Тер Уаі с1і1у Маї Авп Гей б1іц Авр Рго Аїа б5ег Агд Авр 100 105 110
Тец Маї Уаї бек Тук Уаі Авп ТПг Авп Меє сіу Гей пув Робе Агд сіп 115 120 125
Тецп Гей Тер Рпе Нів Іїе бек Сув Гей ТПг Рпе сіу Агд біц ТПг Уаї 40 130 135 140
І1е сіц Тук Іїец Уаії бек Рпе сіу Уаі Тер Іїе Агд ТПг Рго Рго А1а 145 150 155 160
Тук Агуд Рго Рго Авп Аза Рго Іїе Гей бек ТПг Іец Рго бій ТПг ТПс 165 170 175 45 Уа1 Уаї Агд Агд Акуд біу Агуд бек Рго Агд Акуд Агуд ТП о Рго бек Рго 180 185 190
Ак Агуд Агуд Агуд бБег біп бек Рго Агд Агуд Агуд Агуд Бек біп бБег Агд 195 200 205 бі бек сіп Сув 210 «2105 38 «211» 843 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» Білок рої НВУ (ВААЗ2913.1) 60 «4005 38
Ме Рго Гей бек Тук біп Нів Рпе Акд пуб Гец Іец ІТецй Іецй Авр Авр
1 5 10 15 бі Аза с1у Рго гейш біш біц бій Гей Рго Агд Гей Аза АвБр сбіц с1Уу 20 25 30
Тец АвБп Агуд Агуд Уаі Аїа сій Авр Гей Ап Гей сіу Авп Гец АвБп Уаї 35 40 45 зек Іїе Рго Тгр ТПг Нів пув Уа1ії б1у АвБп Рпе ТПг с1у Гей Тук 5ег 50 55 бо зек ТПг Уаї Ркго Уаі Рпе АБп о Рго біц Тер біп ТП Рго Бек Роіе Рго 65 70 75 80
Нів Іїе Нів Гей біп біц Авр І1е І1е Авп Акуд Сув біп біп Тук Уаї1ї 85 90 95 б1у Ркго Гей ТПг Уаі Авп бій пув Агуд Агуд Гей пуб Гей І1е Меє Рго 100 105 110
Аза Акуд Рпе Тукг Рго Авп Гей ТПг пуб Тук Гей Рго Гей Авр Ггув 1У 115 120 125
ІТІе Ппув Рго Тук Тук Рго бій Ні Аза УМаії АвБп Нів Тук Рпе Гпув ТЕПг 130 135 140
Акуд Нів Тук Гец Нів ТПг Гей Тгр ув Аїа с1у Іїе Гей Туг Ппув Агд 145 150 155 160 бій ТЕ ТЕ Агуд бек Аїа бек Рпе Сув с1іу бек Рго Туг Бек Тер с1іци 165 170 175 біп бій Гей сіп Нів сіу Акд Гей Уаі Рпе сіп ТПг бБег ТПг Агд Нів 180 185 190 б1у Авр Гув Бек РПпе Сув Бек біп бек бек біу І1е Іецй бек Агд 5бег 195 200 205
Рко Уаї бі1у Рко Сув УМаі Агкуд бек біп Іїецй Гув біп Бек Агд Гешй 0Щ1У 210 215 220
Тец біп Рго сбіп сбіп сіу Бек Гей Аза Агуд сіу Ппув бек с1у Агкд 5Бег 225 230 235 240
Зо сіу бек І1е Агд Аїа Акуд УМа1ї Нів Рго ТПг ТрПг Агуд Акуд бег Рпе О1У 245 250 255
Уаї бій Рго Бек сіу бек сіу Нів Іїе Авр Авп бБег Аза бек бек ТПг 260 265 270 зек бек Сув ІТец Нів біп бек Аїа Уаії Агуд Ппув ТПг Аїа Тук бек Нів
З5 275 280 285
Тецп бек ТПг бек Ппув Агуд біп бек Бек бек сіу Нів Аїа Уаї сій Іей 290 295 300
Нів Нів Іїе Рго Рго бек бек Аза ТПг Рго біп бек Гув б1у Рго Ше 305 310 315 320
Тем бек Сув Тер Тер Гей біп Рбе Агуд АБп бек Ппув Рго Сув бек Авр 325 330 335
Тук Сув Гей бек Нів І1е Уаі Авп Гец Гец біц Авр Тгр с1у Рго Сув 340 345 350
ТП біц Нів сіу біц Нібв АвБп ч1І1е Агуд І1е Рго Агд Тс Рго Аїа Аг4д 355 360 365
Уаї ТП сі1у сі1у Уаі1 Рбе Гец Уаі1і Авр пуб Авп Рго Нів АБп ТПг ТПг 370 375 380 біц бек Агкд Гей Уаі Уа1і Авр Рпе бек біп Рпе бБег Агуд біу бек ТЕПг 385 390 395 400
Нів Маї бек Тер Рго Ппув Рре Аїа Уаії Рго Авп Гей сбіп бек Гей ТЕПг 405 410 415
Авп оГецй Ггец бек бек АвБп Гей бек Тгр ІТецй бек Гей Авр Уаі1і бБег Аї1а 420 425 430
Аза Рпе Тукг Нів І1е Рго Іїецй Нів Рго Аза Аїа Меє Рго Нів Іец Іей 435 440 445
Уаї сі1у Бек Бек сіу Гей Рго Агуд Тук Уаі Аза Агд Іецй бек бек ТПг 450 455 460 зек Агуд АвБп о І1е АБп о Тук біп Нів біу ТПг Меє сіп Авр Гец Нів Авр 465 470 475 480 бо зек Сув бек Агуд Нів Гей Тук Уаї бек Темп Гей Гецп Гей Тук Тув ТПг 485 490 495
Рпе с1у Акд Гпув Іец Нів Гей Туг бек Нів Рго Іїе Іїе Гец с1у РБПе 500 505 510
Акуд пув І1е Рго Месє с1у УМа1ї сіу Іец бек Рго Рпе Гей Гей Аїа сіп 515 520 525
Рпе ТПг бек Аїа І1е Сув бек Уаі Уаі Агуд Агуд Аза Рпе Рго Нів Сув 530 535 540
Тец Аза Рпе бБег Тук Меє Авр Авр Уаі Уаі Гей сіу Аїа Ппув бек Уаї 545 550 555 560 сіп Нів Гецп біц бек Гей Робе ТБг Аза Уаії Тр Авп Рібе ТІей Гей 5ег 565 570 575
Тец б1у І1їе Нів Гей Авп Рго Авп о ГПув ТПг Ппув Агуд Тер б1іу Тукг вег 580 585 590
Тец АвБп Рпе Меє сіу Тук Уаі1 І1їе сіу Бек Тер сіу ТБбг Гец Рго сіп 595 бо 605
Авр Нів Іїе Уаї Гецшп Ппув Іїе пув сіп Сув Рпбе Агд Ппув Гечп Рго Уаї 610 615 620
Ап о Агуд Рго І1е Авр Тгр Гув Уаї Сув біп Акд Іїе Уа1і со1Уу Гецй Іец 625 630 635 640 сб1у Рпе Аї1а Аза Рго Рпе ТПг сіп Сув с1іу Тук Рго Аїа Гец Меє Рго 645 650 655
Тецп Тук Аї1а Сув Іїе біп Бек пув біп Аїа Рпе ТПг Рібе бекг Рго ТЕПг 6бво 665 670
Тук пув Аїа Рпе Гец Сув Гуз біп Тук Гец Авп Тец Тук Рго Уаї Аїа 675 68 685
Агуд біп Акуд бек б1у Геш Сув біп Уаі Рбе Аїа АБр Аїа ТПг Рго ТПг 690 695 700 сб1у Тер с1у гейш Аза Іїе сіу Нів Агуд Агуд Месє Агуд б1у ТПг Рпе Уаї 705 710 715 720
Аза Ркго Гей Рго І1е Ні ТПг Аза біцш Іїейп їешп Аза Аїа Сув Рібе Аї1а
Зо 725 730 735
Акуд бБекг Агуд бек біу Аїа Гув Гец І1е б1у ТПг Авр Авп бек Уа1ї! Уаї 740 745 750
Тецп бек Агуд Ппув Туг ТПг Бек Рпе Рго Тгр Гей Гей сіу Сув Аїа А1а 755 760 765
АвБп оТегр І1ї1е ІТей Агуд сіу ТПкКг бек Рпе Уа1! Туг Уаії Рго бек Аїа Гей 770 775 780
АвпоРго Аза Авр Авр Рго бек Агуд біу Агд ІТеп сіу Гей Туг Агд Рго 785 790 795 800
Тецшп еп Нів Гей Рго Рпе Агуд Рго ТПг ТпПг с1іу Акуд ТБг бек Іец Туг 805 810 815
А1їа Уа1 бек Ркго бек Уаії Рго бек Нів Іецй Рго Авр Агуд Уа1 Нів Ре 820 825 830
Аза бек Рго Гец Ні Уаії Аза Тгр Агд Рго Рго 835 840 «2105» 39 «2115» 400 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» Білок оболонки НВУ (ВААЗ2914.1) «4005 39
Меє с1у б1у Тер бек бек пуб Рго Агуд біп сіу Меє с1у ТПг Авп Гец 1 5 10 15 зек Маії Рго Авп о Рго Тецйп с1іу Робе Робе Рго Авр Нів Ссіп Гец Авр Рго 20 25 30
Аза Рпе с1у Аза Авп бек АвБп АвБп о Рго Авр Тгр Авр Рпе Авп Рго Авп 60 35 40 45
Тув Авр Нів Тер Рго бій Аза Авп сбіп Уаі1 с1іу Аїа сС1у Аї1а Рпе С1У
50 55 бо
Ркго сіу Робе ТПг Рго Рго Нів біу б1і1у Іецйп Гей с1іу Тгр Бек Рго сіп 65 70 75 80
Аза сбіп с1іу ТБг Іецп ТПг ТПг о Уаї Рго Уаі Аза Рго Рго Рго Аїа 5ег 85 90 95
ТПЕ Авп Агуд біп бек б1і1у Агд біп Рго ТПг Рго І1е бек Рго Рго Іец 100 105 110
Акуд Авр бек Нів Рго біп А1ї1а Месє біп Тгр Авп бек ТПг ТПс Рое Нів 115 120 125 сіп Аїа Гецп Гецп Нів Рго Агуд Уаі Агкуд с1у Гецп Тук Рбе Рго Аї1а 1У 130 135 140 б1і1у бек бек бек с1іу ТпПг Уаі1і Авп Рго Уаі Рго ТПг ТПг Аїа бек Рго 145 150 155 160
І1е бек бек І1е Рре бек Агуд ТПг б1у Авр Рго Аза Рго Авп Меє сіц 165 170 175
АвпоТПг ТБг бек біу Рпе Гей сіу Ркго Іецй Іецп Уаі Гей сбіп Аїа 0Щ1У 180 185 190
Рпе РібПе Гец Іїец ТПг Агуд І1е їецш ТПг І1е Рго Ссіп Бек Гей Авр б5ег 195 200 205
Тер Тер ТпПг бек Гей АБп Рпе Гей сіу с1у Аїа Рго ТПг Сув Рго б1Уу 210 215 220 біп Авп обек біп Бек Рго ТПг Бек Авп о Нів бек Рго ТПг бек Сув Рго 225 230 235 240
Рго Іїе Сув Ркго біу Тук Агд Ткр Меє Сув Гей Агуд Агуд Рпе І1е І1е 245 250 255
Рпе Гей Рбе І1е Іецй Іїецй Гей Суб Іец Іїе Рпе Гей Гей Уаї Іец Іей 260 265 270
Авр Тук біп сіу Меє ІТец Ркго Уаї Суб Ркго Гей Гей Рго с1іу ТПг 5ег 275 280 285
Зо ТПЕ ТПг бек ТПг б1іу Рго Сув пуб ТПкК Сув ТПг І1е Рго Аїа сіп 01У 290 295 300
ТПг Бек Меє Рібе Рго бек Сув Сув Сув ТПг пув Рго Бек Авр с1у Авп 305 310 315 320
Сув ТПкгЕ Сув Іїе Рго Іїе Рго Бек Бек Тгр Аїа Рпе Аза Агд РіПе Іей
З5 325 330 335
ТЕр бі Тер Аза бек Уаії Агд РібПе бек Тгр Іїец бек Іецй Іецй Уаї Рго 340 345 350
Рпе Уаї біп Тер Рпе Уаї с1у Іец бек Рго ТПг Уаі Тер Гей бек Уаї 355 360 365 40 І1їе Тер Меє Мес Тер Тук Тер с1у Рго бек ІГецй Туг Авп І1е Іец 5ег 370 375 380
Рко РіПе Гец Ркго ІТецй Тецй Рго І1е Рпе Рпе Сув Гей Тгр Уа1 Тук Те 385 390 395 400 45 «2105» 40 «2115» 210 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В 50 «2205 «223» Білок Х НВУ (ВААЗ2912.1) «4005» 40
Меє с1у Ге с1у Тук Тер Рго Бек Рго Нів Аза Тгр АвБп Тецй Сув ШУ 55 1 2 10 15 зек Бек Аза Авр Рго Тук Сув с1у ТПг Ркго бек бек Гей РПе Сув б5ег 20 25 30 біп Ркго Уаі Тер Бек бій ТПг Авр Агуд Авп о сбіу біп Гей Сув Сув вег бо Тем бек біц Іїе Нів Гей Гей бек Мес Аїа Аза Акуд Уаї Сув Сув сіп бо
Тец Авр Рго Аза Агуд Авр Уа1і Гей Сув Гей Агуд Рго Уаії с1у Аїа с1іц 65 70 75 80 зек Агуд біу Агд Рго І1е бек біу Ркго Рпе сіу Бек Гей Рго бек Рго 85 90 95
Ззек бек бек Аїа Уаії Рго Аза Авр Нів сіу Аїа Нів Гей бек Іеч Агд 100 105 110 сб1у Гей Рго Уаі Сув Аїа Рпе бек Бек Аїа сіу Рго Сув Аза Іецй Агд 115 120 125
Рпе ТПг бБег Аза Агуд Акуд Меє біц ТПг Тс о Уаії АБп Аза Нів сіп Уаї 130 135 140
Тецп Ркго Ппув Уаії Гей Тук Ппув Агуд ТПг Ге сіу Гей бБег Аїа Меє 5ег 145 150 155 160
ТПЕ ТПЕгЕ Авр Гей сіц Аїа Тук Рбе пуб Авр Сув ІТецй Рпе Гув Авр Тгр 165 170 175 сій бій Гецп сіу бій бій Іїе Ак9д Гей Мес І1їе Рпе Уаі! Іїешй с1у С01У 180 185 190
Сув Акуд Нів Ппув Гей Уа1 Сув Бек Рго Аїа Рго Сув Авп Рпе Рое ТЕПг 195 200 205 зек А1їа 210 «2105» 41 «2115» 389 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» Білок 5 великий НВУ (РОЗ3138.3)
Зо «4005 41
Мен с1у біп Авп Гей бек ТПг Бек Авп Рго Гец біу Рпе Рпе Рго Авр 1 5 10 15
Нів біп Гей Авр Рго Аїа Робе Агуд Аїа АвБп ТПг Аза АБп о Рго АвБр Тгр 20 25 30
Авр Рпе Авп о Рго АБп пуб Авр о ТВбг Тер Рго Авр А1а Авп пув Уа1 с1У 35 40 45
Аза сі1у Аїа Рбе с1і1у Іїец б1у Робе ТПг Рго Рго Нів сіу со1у Гецй Іец 50 55 бо б1у Тер бек Рго сбіп Аїа сбіп с1у Іїе Ггец біп ТПг Іец Рго Азїа Авп 65 70 75 80
Ркго Рго Рго Аїа бек ТПг АБп Агуд біп бек б1у Агд біп Рго ТПг Рго 85 90 95
Тец бек Рго Рго Гец Агуд Ап о ТПг Нів Рго біп Аїа Меє б1і1іп Тгр Авп 100 105 110 зек ТПг ТіПг Рре Нів сбіп ТпПг Гей сіп Авр Рго Агуд Уаі Акуд с1Уу Іецй 115 120 125
Тук Рпе Рго Аїа сіу біу бек бек бек біу ТПг Уаії Авп Ркго Уаї1ї Іеєец 130 135 140
ТПЕ ТпПкг АТа бек Рго Пец бек бек І1їе Рібе б5ег Агд І1е Сс1у АвБр Рго 145 150 155 160
Аза гей Авп Месє біц АвБп о І1е ТПг бек б1у Рпе Гей сіу Рго Гей Іец 165 170 175
Уаї гей біп Аїа сіу Рібе Рібе Гей Гей ТПг Агуд І1е Іїецй ТПг ІШе Рго 180 185 190 сіп бек Гец Авр бек Тер Тгр ТПг бек Гей Авп Рпе Гей сіу с1у ТіПг 195 200 205
ТПЕ Уаї Сув Гей сіу біп Авп бек біп бек Рго ТПг бек АБп Нів 5бег 210 215 220
Рко ТПг бек Сув Ркго Рго ТПг Сув Рго біу Тугк Агд Тгр Меє Сув Іец бо 225 230 235 240
Акуд Агуд Робе Ії1е І1е Рпе Гей Рбе І1е Іецй Гей Гей Сув Гей Іїе Ріе
245 250 255
Тецп ІГецп Уаї Гей Гей Авр Туг сіп сіу Меє Гей Ркго Уаї Сув Рго Іей 260 265 270
ІТ1е Рго біу бек бек ТПг ТПг бек ТП о біу Рго Сув Агд ТПг Сув Меє 275 280 285
ТПг ТпПг АТа сіп сіу ТБПг бек Меє Тук Ркго бек Сув Сув Сув ТПгЕ Гув 290 295 300
Ркго Бек Авр б1іу Авп Сув ТПг Суб Іїе Рго Іїе Рго бек бек Тгр А1а 305 310 315 320
Рпе с1у Пув РіПе Гей Тгр сій Тер Аїа бек Азїа Агуд Ррпе бек Тер Іецй 325 330 335 зек Гей Гец Уаії Ркго Рпе Уаі бСіп Тгр Рпе Уа1 сіу Гей бек Рго ТЕПг 340 345 350
Уаї ТеЕр Геш бек Уа1 І1їе Тер Меє Меє Тер Туг Тгр б1у Рго бек Іец 355 360 365
Тук Бек Іїе Гей бек Ркго Робе Гей Рго Гец ІТец Рго І1е Рпе Ріе Сув 370 375 380
Тец Тер Уаї Ту Ше 385 «2105 42 «2115 183 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» Коровий білок НВУ (РОЗ146.1) «4005 42
Зо Меє АБр І1е Авр Рго Туг Ппув бій Рпе сіу Аїа ТПг Уаї сі Геч Іеч 1 5 10 15 зек РПе Гец Рго бек Авр Рпе Робе Рго бек Уаі Агуд Авр Гей Гей Авр 20 25 30
ТПг АТїа бек Аза Гец Туг Агд сій Аза Гец біц бек Рго сій Нів Сув
З5 35 40 45 зек Рго Нів Ні ТПг Аза їецй Агуд біп Азї1а І1е Гей Сув Тер С1у сіц 50 55 бо
Тецп Меє ТпПг Ге Аза ТПг Тер Уаі сіу Уаі Ап Гей біц Авр Рго А1а 65 70 75 80 зек АгкЯд Авр Гей Уаі! Уа1ї бек Тук Уаі Авп ТПг Авп Меє с1Уу Іецй Гуз 85 90 95
Рпе Агуд біп Іїец ІТецй Тер Рпе Ні І1е бек Сув Гей ТПг Рпе с1у Аг4д 100 105 110 бі Тпг Уаї І1їе сій Тук Ггецй Уаі Бек Рпе сіу Уаі1і Тер І1е Агд ТЕПг 115 120 125
Рго Рго Аїа Туг Агд Рго Рго АБп Аза Рго І1ї1е Гей Бек ТПг Гей Рго 130 135 140 бі Тс Тпс о Уаії Уаі Агу Агуд Агуд с1у Агд бБег Рго Агд Агд Агд ТПг 145 150 155 160
Рго Бек Рго Агуд Агуд Агуд Акуд бек біп бек Рго Агуд Агд Агд Акд 5бег 165 170 175 біп век Акд бій Бек сбіп Сув 180 «2105 43 «211» 3182 «2125» ДНК «213» Вірус гепатиту В 60 «2205 «223» Геном вірусу гепатиту В (штам аухм)
«4005 43 ааєєссасвед саєддссеєда ддваєчадсдс сссссааадда Сддадасадс дадддсаддсс бо дсесЕЄсСсЕда седдсчаєєсд деддаддсад даддсоддасс сдссддсааа ЯЕссоасСадса 120
Едссссдадс сеЕдадддсес сассссаааа додсссссоасдд соддЕдддЧаєд ааасссадсес 180 сдаасдсссс адсссссасс СссдссоодсоЯє седдссадде деЕссЕсЧЄв9 додваєєсдаадиі 240 сссаасєссдд асссдсодесд ЄСсСдсеЕСсСєда аддссддаєс саассддєда ссоддааадвда Зоо аєсссададуч аєєдседаеєд дааачдчаєєся дссссасдсс дсадасссєсд Ссссссаадаа 3З6о
Ббаєддеєдасс сасааааєда доасоассасдєс ЯяЕсЯдссЕсссс ссссасаєаа сагсасссдсес 420
Есссасадчад Едсдеаааса дЕЧЕСТадеЕє Содаадеаає даєєаастад аєдеЕессдва 480
Бааєааддеє єааврасссеє аєссааєддас ааасасссддд СаассеЕєсвду асаааасстд 5340 чдсаддсаєаа Єсааєєдсаа ЄСЕЄСсСЕССЕссС ссаєссаассд сдадсдддес Сасааасо ді 60
Єсасавфеєес сдаєааєдес ЕсоддЕдЕааа Судсасаєстад даааадаєдуа ЕДдЕСЕСссСсаа 6б6о
Едчаддаєсаа адасаддебас адсадаадаа Сааадсссад Сааадессссс сассеєсаєда 720
ЧдЕссааддаа бассаасаєє дачасеєсссу ачассддадає ссеСсСсдсдас дсддсдчаєстд 78о0 ачассеЕєсЯає седсдаддасо адоачадеЕссс ссеЕсссаддад дассідсссс деЕсдеЕсСсаас 840 аасадеадеЕс Ессододаадед ЄЄЧаєсаддає аддддсассс доадсддЕСсСстає аадссддадд 900 адеЕдсдааєс сасасеєссда аадасассаа асасссстаса ассдеЕсссеєс ссссаааадве 960 чадасаадаа аєдеЕдааасс асаададевд ссєдаасесе аддсссаває гадсдєсеєдас 1020 аєаасєдасе ассаддєссс гадасдссду аєсеЕсссааа Єсаасассса сссаддеадс 1080 бададесаєе адсесссссос адсааадаає сСдсЕсдссвд адеЕдсаднає дадеЕдадаєда 1140 асааєдсеса ддадасссса аддсеЕєсссуд агасададсеЕ даддсддеає ссадаадаєс 1200
Есдбасеєдаа ддааадааде садааддсаа ааасчдададс аассссасад Сбадссссааа 1260 гЕСЕЄвсаєсаа доаодеЕсдаєдЕ ссаєдсссса аадссассса аддсасадсе Еддаддасеєвд 1320 аасадсадда саєдаасаадч адаєдаєсад дсададодаєда аавгадеЕєдса ЄддеЕдссодеЕ 1380 дсдсадасса арсраєдссе асадссессс адсасааада ссеЕєсаассе аарсесстсс 1440 сссаасеєссеЕ сссадесеесє ааасааасад ЕСЕЄЕдааді асдссссаад дЕСООДЕСЯЕЕ 1500 часаєєдсьд ададесссаауд адессєссва сдсаадассе Едддсаавгає ЕсодЕд9д9асд 15560 бЕсасддедд Єссссаєдсуд асдєдсадад деЕдаадсдаа деЕдсасасддд Ессддсадає 1620
Зо чадааддсас адасддддад СссдсуєЄбааа дачаддедсу ссссусдЧдеєс ддссодаасд 1680 дсадасддад ааддодасда дададесссса адсдассссу адаададдессу Ессдсаддає 1740
Есадсдссда содддасуєбаа асаааддасуд Есссдсдсад даєссадессд дсадсасадс 1800 сЕадсадсса Еддааасдає деасаєсеєдс доадаєаддас аасададесвта ссадеЕсссда 1860 бааєдеЕєсдс сссадассвд сєдсдадсаа аасаадсудс баддадеесс дсадгаєдда 1920
Есдодсададуд адссддаааад деЕєсСсасдса ЄдсдсеЕЧдаєсуд дсссасдасс аадссссадс 1980 садеЕдддадЕ ЕдсдЕСсадса аасасесддс асадассвдд ссдєсЕдссудд дсаасдоддаЧе 2040 аааддеєєсад деаєсдсєеєса сасадааадд сссЕдеЕаадеі Єддсдадааа деЕдааадссе 2100
ЧдсЕсадаєєд аасасаєсудса басаааддса Ссаасусадуд аєаассасає ЕдЕДЧЕаааад 2160 чдддсадсааа асссаааада сссасааєєс дЕєдасаєсас СЄЕсЄсСсааєса агаддесьде 2220 бааєаддаад ЄЕСЕСтаааа саєєсссєєса СЕСЕСЕУЯває дчаєсдеЕдесеєсе єдеЕддсаа9д 2280 асссаєбааса Сссааєдаса баасссаєаа аасеЕсадада деЕаассссає сесссеЕсуєее 2340 бдЕсадоддесє сСаааєдсаса сссааадаса ааадааааєє додсаасадсуд деЕаааааддчд 2400 асєсаадаєд сЕдгасадас Есддссссса агассасаєс аєссавраєаа ссдааадсса 2460 аасадедддд дааадссста сдаассассд аасааасддс ассадсааас Сдадссадда 2520 чааасдддсє даддсссасеЕ сссагбаддаа СЕСЕСсСсдааа дсссаддаєд асоддваєдад 2580 аасасаддед саарсессЯдє ссдааддЕсЕ ддеасадсаа саддаддачає асагададдаде 2640
ЕссеЕєдадса деадессаєдс аддеЕссдддса ЄддЕССсСУЄд сЕдЧЧєЕдДЕЄЯЧ аддаєсствд 2700 ааєсададда сааасдддса асасассссд асадсссада адаассааса адаадаєдад 2760 чдсаєадсадс аддаєдаада ддаачаєдаєсє аааасдссдс адасасаєсєсс адсдаєаасс 2820 аддасаадесє ддааддасаач аддсєєдоаєда деЕдаєсєддад ЧдЕсдддадасе дсдаасЕсту 2880 дссаадасас асдудбадесс ссссрадааа аєсдададаа дЕссассасу адеЕСтадасе 2940 сЕдсдЧабаєсеЕ десдаддаєєс єсдеЕсаасаа дааааасссс дсссдсааса сдадаад9адад Зоо
Ессегаддаає ссєдаєдеЕда ЕдДдЕєсЕССсСає дЕсСсадсдса доддЕСсСсссаа ЕСссЕСсдадаа З06о чаєєдасдає аадддададу садсадесад аасадуадЕеЕсеЕ асеЕдееєссвд аассддадсс 3120 ассадсаддуд ааасасаддс сесєсасессс додасєсєєдс ададеЕеєсодЕ ододаададеЕєде 3180 ча 3182 «2105» 44 «2115 3182 6о0 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність
«223» Зворотна комплементарна послідовність для 5ББО І МО: 16 «4005 44 ссасаасссс ссассааасс ссдсаадаєс ссададедад аддсседрає сеЕссстьостдл бо чЧЕддсЕсСсад ЕЄЄсаддааса деааассстд ЄЄСсСЕЧСассас Сдсссссссс ссассдаєсаа 120
ЕсЕєсСеЕСсСЯдад даєєдоаддас сседсдссда асасддадаа сассасаєса ддасєссстгад 180 чассссЕсєсЕ сЧдЕєдЕсасад дсоададЕссЕс ссссодссдас аадааєссссєс асаагсассдс 240 ачзачЕССТада сЕСЧЯгЧОдєсєЧдуа асеЕссеєссса арєсссвада дддаассасс дЕЧдЧсдЕсССссо Зоо дссаааареєс дсадеЕсссса ассеєссааєсс асссассаас сссссдсссє ссаасесдес 3З6о сЕддЕБаєсу седдаєдеЕдЕ сеЕдсоддсуєЕ Есаєсаєсьє ссеЕСЕЄсСаєсС сеЕДСєДстає 420 дссеЕСАЕЄСЬЄ СЕСЧОЄСЕЧУЄє сЕєСЕдддасеі аєсааддтає дЕсдсссуєЕ ЕДдДЕССЄСваа 480
БбЕєссаддаєс сеЕсаасаасс адсасдддас сасдссддас ссдсаєдасс ассдсссаад 5340 чаассестає деассссссс соЯєсдссдсра ссааассссс ддасоуадааає Єдсассоднга 60
БЕСсСссаєссс аєсаєсстдуа дсЕсєесоддаа аасссстаєсда ддадсдддес Ссадсссдєс 6б6о
ЕсЕССЕДЧдсЕ садеЕєсаста дедссасссд сссадсоддесс счдрадддсесее єсссссастьд 720
ЄЕС ЕеСсС адеЕсаєаєдуа аєчаєдсддадс ассоддддсесс аадссстдсас адсаєссеєєсда 78о0
ЧдФЕСССЕЕЕЕЕ ассуседеЕса ссааресессє сЕСУУЄсСЄєвд ддабасасасе гааасссваа 840 саааасааад ачдаєддодЧчЕЄсЄ асссеЕСстааа ЕЄССаєдоаЧчЕ Саєдессаєсо даєчеЕсаєдо 900
ЧдЕСсСсСЕєЄдсса саадаасаса Єсасбасаааа аассааадаа СЯСсСссСсадаа аасесссстає 960 баасаддсессеЕ аєсдаєсоода аадсаєдесса асдаасгсуєд дсдеЕсСЕЕсвЧдЧ ЯдЕЕСсСЕДЧСсСвдсС 1020 сссСЕсЕсаса сааєсдесдуєє ассстдсуєє даєдссеЕєеєсву гаєдсаєдна сЕСааєстаа 1080 чдсаддсЕсЕеЕс асеЕессссдс саасеЕсасаа ддессєсЕсвд сдсааасаає асседаассь 1140 сгассссуєс дсссддсаас ддссаддєссї деЕдссаадсд ЕсЄсдседасо саасссссас 1200
ЄдасеЕдддадс Ед єсаєду дссаєсадсуд саєдсуєдда ассЕсессдуд сессестдсе 1260 чаєссавасе дсддаасесс гадссдссвд ЄЕСсСЕдсссдс адсаддессд дадсааасає 1320 баєсдддасе даєсаассссуд ЕсдЕССваєс ссдсааатєає асаєсуєвсс саєддсеседся 1380 аддсЕдЕдсЕ дссаассдда ЕссЕдсдсудд дасуєссьсеЕ дЕсвасдесс сдесоддсасе 1440
Зо чааєссєдсуд дасдассссє сесдддаєсу сЕсддддасес ЄсссдЕсссс ЕсСсСсссуєсе 1500 дссдЕєЕссда ссдассасду ддсдсассес ЕсСЕсСтасодсу дасессссує сеЕдедсесссес 1560
Есаєсьдссдд дассдеЕдеЕдс асеЕєсдсевс ассеЕстЕдсас дЕСЯдсаєдда дассассдаєд 1620 аасдсссасс ааагаєсудсес сааддессва сасаададда сеЕСЕсддасе сессадсааєд 1680
Єсаасдассуд ассеЕсдаддс асасеЕссааа дасЕдеЕсвдЕеЕ Єсааадассд дддаддадеЕвд 1740 чадчдаддада ЄгаддеЕсааа одсдЕСЕсЕдва сеаддаддасЕ дсаддсаєаа аседдсєссдс 1800 дсассадсас саєсдсаасеє ЕсеЕСсСассеєсс дссеааєссає сеЕСЕсдеєеСса ЕДдЕСССасьтд 1860 бЕсаадссес саадсеЕдеЕдс сЕгЕдоодЕдДЯдс сЕсоддуддсає ддасаєсдас ссеЕсСаєсааад 1920 ааєєєддадс сасеЕдеЕддад ЕсасеЕсссує єЕсЕСУЧСсССсСЕєСсС ЕдасЕссеЕвс ссессадвас 1980 чадаєсєєсеЕ адаграссусс Есадсеєссудс аєсудддаадс сЕсададесь ссеЕдадсаєє 2040 дЕєЄСсСассєса ссагассдса сссаддсаад сааєсссєсд седдддддаа ссааєдасес 2100 бадсвассвд дасоддУЧєУЧєЕ ааєседдаад аєссадсуєс гададассста дсадеЕсадсе 2160 аєдеЕсаасас баараєдуддс ссааадесєса ддсаасєссеє дЕддЕЕссас асеЕссесвдєс 2220
ЕсасЕєеєсдд аададаааса деЕсагадаче аЕсеЕдудєдеЕС ЕЕсСсСоддадед Еддаєссовса 2280 сЕСссЕСсСсадс Есасадасса ссаааєдссс ссаєсстаєс аасассвссдуд дадастасьд 2340 сєЕдЕсадасу асдаддсадуд Ессссбадаа даадаасссс сЕСдссЕСсСдс адасддаадде 2400 сЕСсааєсудсс дсудєсдсада адаєсеєсаає сесдддааєс ЕсааєдеЕсад сасеєссев9є 2460 асєсаєаадд Єддоддаасеє гасеєдддсес сасеєсеЕссвта сеЕдрассьдеЕ сеЕЕсааєсся 2520 саєєддаааа сассассеЕве єсссаасаса саєсєсасасс аадасаєсає сааааааєде 2580 чаасадЕесєвд баддсссасе сасадеєаає дадаааадаа чаєєдсааєсе даєсаєдесе 2640 дссаддЕсєес аєссаааддЕ бассааасає сеассаєєду аєаадддрає гааассесає 2700 баєссадаас аєстадесваа Есаєтасеес сааастадас астаєеєсаса сасесссаєд 2760 ааддсдддЕа басрагаєаа дададаааса асасаєадсу ссеСсаєєесд гЕдодддЕсасса 2820 баєєсевдудд аасаадаєсе асадсаєдудад дсадааєсєє Ессассадса асссеЕстд9д9ад 2880 авєсьееєссс дассассадеі Еддаєссадс сЕссададса аасассдсаа асссадаєєтд 2940 чддасеЕссаас сссаасаадуд асассеєддсс адасдссаас аадчдсаддадч сеЕддадсасе Зоо сддадсЕдддЕ Ессассссас сдсасудаддч ссЕсєеЕсєдоаддаа єддадсссвс аддсесаддад З06о сабасврасаа асеЕсЕдссад саааєссусс ЕссЕдссесСс ассааєсдсс адссаддаад 3120 чдсадссвасс ссдесудсєсесс сассеЕсрдад ааасасєсає ссесаддсса Едсадесддаа 3180
Те 3182 60 «2105» 45
«2115» 389 «212» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «2205 «223» Білок 5 НВУ (РОЗ142.4) «4005 45
Ме с1у ТПг Авп о Гей бек Уаі Рго Авп Рго Гец біу РпПе Іецй Рго Авр 1 2 10 15
Нів біп Гей Авр Рго Аїа Робе сіу Аза Авп о бБег ТПг АБп Рго АвБр Тгр 20 25 30
Авр Рпе Авп Рго І1е Гу Авр Нів Тгр Рго Аї1а Аїа АвБп сбіп Уаі1і Щ1У 35 40 45
Уаї б1у Аза Рпе с1у Рго с1у Гей ТПг Рго Рго Нів сіу с1у І1е ГІец 50 55 бо б1у Тер бек Рго сбіп Аїа сіп сіу Іїе Гей ТПг ТПг Уаї бек ТПгЕ І1е 65 70 75 80
Ркго Рго Рго Аїа бек ТПг АБп Агуд біп бек б1у Агд біп Рго ТПг Рго 85 90 95
ІТ1е Бек Рго Рго ІТец Агуд Авр бек Ні Рго біп Аїа Меє сбіп Тер Авп 100 105 110 зек ТПг Аїа Іїец Ні біп Аї1а Гей сбіп Авр Рго Акуд Уаії Агд Сс1Уу Іей 115 120 125
Тук Гецп Рго Аїа сіу сіу Бек бек бек с1у ТБг Уаї АБп Рго Аїа Рго 130 135 140
Ап от1І1е Аза бек Нів І1е бек бБег І1е бек Аза Агуд ТПг С1у АБр Рго 145 150 155 160
Уаї ТПпг Іїе Меє сій Авп І1е ТПг бек сіу Рібе Гец біу Рго Іец Іецй
Зо 165 170 175
Уаї гей сбіп Аїа сіу Рібе Рібе Гей Гей ТПг Агуд І1е Іїей ТПг Ії1їе Рго 180 185 190 біп бек Гей Авр бек Тер Тер ТПг бек Гей Ап Ропе Гец сіу сіу б5ег 195 200 205
Рго Уаї Сув Гей сб1у біп Авп бек біп бек Рго ТПг бек Авп Нів 5бег 210 215 220
Ркго ТПг бек Сув Рго Рго І1е Суб Рго біу Тугк Агд Тгр Меє Сув Іец 225 230 235 240
Акуд Агуд Робе Ії1е І1е Рпе Гей Рбе І1е Іецй Гей Гей Сув Гей Іїе Ріе 245 250 255
Тецп ІГецп Уаї Гей Гей Авр Туг сіп сіу Меє Гей Ркго Уаї Сув Рго Іей 260 265 270
ІТ1е Рго біу бек ТПг ТП ТПгобек ТП о б1іу Рго Сув Пув ТПг Сув ТПг 275 280 285
ТПЕ Рго Аїа сіп сбіу АвБп бек пуб РПе Рго бек Сув Сув Сув ТПг Туз 290 295 300
Ркго ТПг Авр о б1іу АвБп о Сув ТПг Сув І1е Рго І1е Рго Бек бБег Тер Аїа 305 310 315 320
Рпе Аїа Ппув Тук ІТец Тер бій Тгр А1їа бек Уаі Агуд Рпе Бек Тер ГІец 325 330 335 зек Гей Гец Уаії Ркго Рпе Уаі бСіп Тгр Рпе Уаї сіу Гей Бек Рго ТЕГ 340 345 350
Уаї Тер Геш Бек Аза Іїе Тер Месє Меє Тер Туг Тгр б1у Рго бек Іец 355 3З6о 365
Тук Бек Іїе Уа1ї бек Рго Рре І1е Рго Гей Гей Рго І1е Рпе РоПе Сувг 370 375 380
Тец Тер Уаї Ту Ше 385 60 «2105 46 «211» 185
«2125 БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «2205 «223» Коровий білок НВУ (РОЗ149.1) «4005 46
Меє Авр І1ї1е Авр Рго Тук Ппув бі Рпе сіу Аїа ТПг Уаї бій Іец Гей 1 2 10 15 зек Рпе Гемй Рго бек Авр Рпе Рпе Рго бек Уаії Агд Авр Іецй Гей Авр 20 25 30
ТПг АТїа бек Аза Гец Туг Агд сій Аза Гец біц бек Рго сій Нів Сув 35 40 45 зек Рго Нів Ні ТПг Аза їецй Агуд біп Азїа І1е Гей Сув Тгр б1у сіц 50 З бо
Тецп Меє ТпПг Ге Аза ТпПг Тер Уаі с1у Авп Авп Гей біп АвБр Рго А1а 65 70 75 80 зек Агуд Авр Іец Уаії Уаї Авп Тук УМаії Авп ТПг Авп Меє с1іу Гей Гув 85 90 95
І1їе Ак9д сіп Гей Геш Тер Рпе Ні І1їе бек Сув Гей ТПг Рпе с1у Агд 100 105 110 бі Тс Уаї Гей бі Тук Гей Уаі Бек Рпе сіу Уаі1і Тер І1е Агд ТЕПг 115 120 125
Рго Рго Аїа Туг Агд Рго Рго АБп Аза Рго І1ї1е Гей Бек ТПг Гей Рго 130 135 140 бі Тс Тпс о Уаі Уаі Агу Агуд Агуд Авр Агуд с1у Агуд бБег Рго Агд Агд 145 150 155 160
Акуд ТЕ Рго бБег Рго Агуд Агуд Агуд Агуд бек біп бек Рго Агд Агд Агд 165 170 175
Зо Агуд бек біп бек Агкуд бій бек біп Сув 180 185 «2105» 47 «2115 3200 «2125 ДНК «213» Вірус гепатиту В «2205 «223» Повна послідовність ДНК вірусу гепатиту В (підтип адм) «4005 47
БбЕєссаседсс ЕЄдсассаад сЕСЄдсадда Ссссададесс аддоддеЕсстдє ассЕссстгдас бо
ЕддеЕдодсесСс адеЕссаддаа садсааассс сдссссдаає ассдсессссс асаєссєсдес 120 ааєсеєссоосду аддасеєддду ассссдедас даєсаєсддад аасаєсасає саддаєєссь 180 аддасссстд сЕСЧдЕДДЕсас аддсоадоадЕс ССсСсСссоєссд асаадааєсс сСсасаатсасс 240 чдсадчадеЕСсСта дасеЕсЧдеЕддеЕ ддасеЕссессст саасєссєссса доддддаєсас ссасдсдессе Зоо
БЕддссаааає єсдсадессс саасссссаа Ссасссасса ассссссдсс сессавааєєвд 3З6о
ЕссеЕддЕває содсеЕддаєдеЕ дЕСЕдсуддсдд СЕсСваєсава ЕЕсСсСЕСЕЕСсСа ЕССЄДСсСЕдсСЕ 420 аєдссеЕсаєс ЄЕеЕСсСЕСсСаєЄЧд94 ЕССЕЕСЕДда СгаєсааддеЕ асдеЕсдсессся ЄЕСЕДЕССЄСЕ 480 ааєєссадда Єсаасаасаа ссадсасддда ассасдсааа асссдсасда сссссдсесса 5340 аддсаасеєсеЕ аадеЕсеєсссе саєдеЕсдссд басаааассо асддаєсддаа ассдсасстд 60
Ббаєєсссаєс ссаєсдеЕсся доддсЕсссдс аааасассста сддвдадсддд ссесадесссд 6б6о
ЕЕСсСЕСЕвдд сЕСадЕеЕсСвас гадедссавєс соосеЕсадедд Еєсдсадддсе ЕсЕсссссас 720 гдЕЕЄдДЯсСЕС ЕСадстасає ддаєдаєсдеуд деассододадоа ссаадеЕСсдЕ асадсаєсде 78о0 чадЕСссЕве арассуседЕ бассааресес сЕсеЕсудєЄсЕсС Єдддбаєсаса ЕсСгааассся 840 аасаааасаа ааачаєдддда Єсаєєсссста аассссаєдда дссасаєсаає Єддаадесс9д 900 чддаасеЕєвсєдс сасаддаєса баєєдсасаа аадаєссааас ассдссссад аааасссссс 960
ЧдЕєсаасаддс сргаєєсдаєсу дааадваєде сааадаасєєсд єЕодФо9деЕСЕЕСЕ дддсЕСЕДсСЕ 1020 бо дсеєссаєєста сасааєдедч асасссвдсс СеЕаасусєссєє Єдсаєдсаєд гагасаадсе 1080 ааасаддсесє Єсасеессесс дссаасесас ааддсессесс аадсаааса дсасаєсдаас 1140 сЕсвассссу ЕсдсЕСсСуудса асдддсссддЕ седесдссаад ЕДЕЄсдседа сдсаассссс 1200 асєддсеЕддд дсеЕгадссає аддссаєсад сдсаєдсуєд даассЕсвдЕ ддсєсссеЕСтд 1260 ссдаєссаєса седсудаасе ссрадссусЕеЕ ЕДЕЄЕєдсЕеЕсС дсадссудеЕсС сддадсааад 1320 сЕСаєсддаа сєдасааєєс єдЕСЯЕСсСЄСсС Есудсуддааає асасаєсаєс сссаєддасьд 1380 сеаддсєдса ссдссаасвд даєссеЕссдс ддчдасуєссяє ЕсСоЯсЕеЕсСасає сссодаєсдадсд 1440 сЕдааєсссу сддасдассс сеЕСсСссуддуддес содасЕєдддас ЕсСЕСЕСуЄсСс ссеЕссеЕссоє 1500 сЕдссудєЄЕсСс адссдассас ддддсдсасс ЕсЕСЕЄвасу сддесессссс дЕСЕДЕДСссЄ 1560
ЕсеЕСаєсвдс судеЕсСсЯєЯДє дсасеЕссдсс ссассєсвєдс асудєєдсаєд дсдассассд 1620 бдаасдссса Єсадаєсссуд сссааддеєсс Сасасаадад дасеЕсеЕсдда сесссадсаа 1680 бдссаасдас сдассеЕсдад дсссасесса аадасеЕдедЕ дЕсєааддас, єдоададдваде 1740
Єдадоададда даєстаддеЕса аєдчаєсьсьд сасеаддада сЕдеЕаддсає ааастддесе 1800 дсдсассадс ассаєдсаас ЕСЕсЕеЕСсСассє сеЕдссЕааєс аєсЕсеЕсдбра саєдеЕсссас 1860 бдєЕСсаадсс ЕссаадседЕ дссЕєдоадЕд дсЕЕсоддоддс аєддасаєсу асссеЕсаєаа 1920 ачааєєєдда дссасеЕдеєду адеЕсасеьсьс дЕСЕСЕддссеЕ ЕсеЕДДасеЕвсь ЕсССсСсСЕЄССЕ 1980 асудадаєсєс срадасассу ссеЕСсадсссе дсассдадаа дссЕсададе сеЕСсЄдадса 2040 бЕдсеєсассеє сассаврассуд сасєсаддса адссаєсєсєс єдсєЕдддоада ааєсдаєдас 2100
Есвбадсвасс сддуаєддуєса асааєсвдса адаєссадса Ессададаєс гадсадесаа 2160
ЕгаєдеЕсєаає ассаасаєду дЕЕсааадає саддсаасса ЕЄДЧЕдЧУЧєЄЕссС асасаєсев 2220 ссЕБасеЕесеЕ ддоаададада сеЕдсассєеєда асасєсддеЕс ЕСЕсЕСООддад Єдесддаєєссдв 2280 сасессссса дсссасадас сассаааєдс ссстстаєсєса єсаасассєс сододааастас 2340 бдЕЕдеЕсада сддасдуддасс даддсаддес сссрадаада адаасесссе сдссеЕСсдсад 2400 асдсадаєсеЕ сааєсудссдс деЕсдсадаад аєсссааєсє судддааєсєс ааєсдєстадса 2460 вЕССЕєдддас ссаєаадудес ддааасеста суддуддсеєеЕса ЕЕєсСсЕСсаса дсасстсаєсе 2520
ЄЕааєссєда аєддсааасеі ссЕсссеЕсеЕсС сеЕаадаєєса ЕЄсасаадад дасаєсаєта 2580 асгаддеЕдеєса асаасєсооєу ддсссєссса сеЕдсаааєда ааададаада єсСдаааєтаа 2640
Егаєдссвдс садасеєстає ссрасссаса сгааатавєсєє дсссеЕгадас аааддааєта 2700 аассеЕвсаєвта сссадаєсад дсадеЕсаарс аєсасессса аассадасає гаєстасаєа 2760 сЕСЕЄЕдддаа ддсєддваєє сьтасаєаада доддааассас асудсадсдса Єсаєєєвєдсд 2820 чддєсассава ЄЕСЕсСдддудаа саададсвас адсаєссдса ааддсаєддд дасддаасссе 2880
Зо ЄседЕсссса асссессоодуа асєссеєєссс даєсаєсадеі Єддасссвдс асесодадсс 2940 аасеєсаасаа аєссадаєєсд ддасеЕссаас сссаєссаадда ассассддсес адсадссаас Зоо саддбаддад Едддадсаєє сдддссаддуд сесассссеєс сасасддсуд гаєсеЕсо9вод З06о бддадсссес аддсссадду сабгаєєсдасс асадсудсєсаа саарсєссьсс Есседсесесе 3120 ассааєсддс адссаддаад дсадсстасе сссаєсєсеєс сассеєссаад адасадесає 3180 ссеЕсаддадсса Сдсадеддаа 3200 «2105» 48 «2115 3200 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Зворотна комплементрарна послідовність для 5БЕО І МО: 47 «4005 48
БбЕєссасеєдса єддссеЕЧдада аєчассдсссо сссададдаєд дададаєсддд адсаддсесдс бо сЕссссдасо дссдассддс ддаддсадда ддаддааєсд єєдЧдасасьде ддеЕсаасаєд 120 ссссдадссс дадддсссса ссссаааара ссдссудєрдара даддддеєдад сссгрддсссд 180 ааєдсессса сЕССтасствд дЕєЄЧДоаоссдсо ддссадсддс ссесдаєддада деЕсдаадссс 240 сааєстдодає ссдеєсдадес ддсЕСсСсдаає дсадддссса ассдаєдаєс доадааддаає Зоо сссададддс Сдддаасада аадасссддєсс сссардссеє гдсдаардсе драдсесево 3З6о
БбЕсссаадаа баєддеєдасс содсааааєсда Сдсдсстасуає дсддЕссссс ссесасаєад 420 аасассадсс ЕЄєЄсСсааадад баєдесаааса асдсссддєс сддаадсаає даєссаастас 480 сеЕдаєссдда Саасааддес СаассссеЕєеЕ деЕСЕсаадддс ааасаєссад Єдесдддсадда 5340 асачааєста дсаддсасаа Сгаасеєссаваа ССЕССЕСССЄ ссаєссасад єдададддсс 60 сасааассдс Сдасасссаєс сСаасаардеЕс сЕСЕєЧдтрааа єдааєстєсад даааддаачдд 6б6о адЕеєвеєдссає єсаддаєсаа адаєаддсас сдсададдаа Сааадссссуд СааадеЕсссс 720 чассеЕсаєда деЕСсСсааддаа бассаасаєє дадасссссу адаєссдадає сеЕсссдсдас 78о0 чдсоддсдаєєд адаєсєдсЯає седсдаддсоа адддчадеЕссс ссеЕсссаддадд дассудссес 840 бо чдадЕсСссЯдєсЯ ЕссСаасааса дгадсесссу даадсдеєсда Саачасадоад ддсасєєдоаєд 900 чЧЕСваєаддс єдддаддадед сдааєссаса ссссдааада дассааасгає єссаадсасад 960
ЄсЕСсСЕСсСЕссс аааадеааду саадаєасає дааассасаа бадеЕсдссвуд асссесааас 1020 ссаєдеЕсадеі асєаасаєаа ЕЄдастасса даєсеЕстдда Едссддаєсє єдсаааєтає 1080 басссассса додасадссада дессаєсаавс ссссссадса дадааєдасеЕ ЕдссЕдадед 1140 садеаєдаєд адудєдадсаа єЄдсЕсаддад асестааддс Ессссдаєсас ададсеєдадд 1200 сдадсдЕССсСад дачаєсєсесудсє асддааддаа адаадссада аддсааааас дачадеаасе 1260 ссасадсадс Ессаааєссе єсасаадуддеЕ сааєдеЕссає дссссааадс сасссааддс 1320 асадсеЕєдда доасЕсдааса дедддасаєд сбСасаададає даєсєсаддсад аддеЕдааааа 1380 чЧЕєдсаєдуає дсеєддЕдсдс адассааєьс агдсстасад ссеЕссЕааса сааадаєсає 1440 баассвааєс Єссессссса асеЕсссссса дЕСсСЄгааас асасадеЕссе Едаадсаддс 1500 сЕСааддеЕсд дЕсдЕсдаса Єсдсеєддаад Ессаададес ссссваєдга адассеЕє9д9 1560 саддаєсєда ЕдддсдЕсса соддєЕдудсєсдс саєдсаасЯє дсададудєда адсдаадедс 1620 асасддассуд дсадаєдада аддсасадас ддддадассуд сдбааадада дадсдсдсссс 1680 дЕддЕсСддсЕ ддаасддсад асддадаадд ддасдадада деЕсссаадсд дссссдадад 1740 чЧадЕСсСЧдЕСсСсСЯ сододдаєєсєсад содссдасоддда асдєбааасаа аддасдессс дсдааддасс 1800 садеЕсддсад басадсссад садссаєдда ааєдаєдеає асеєсссоосда даддасдаса 1860 чааєєдеЕСсСад ЄЕССЯДдаєдад сЕЕсдсЕеЕсСса дассддсєдс дадсааааса адсддстадд 1920 адеЕЕссдсад басоддаєсду сададдадсс асаааддеєс сасдсаєдсу седаєддсесе 1980 аєддстаадс сссадссадеЕ доаодоаддссдсд Ссадсаааса сссддсасад ассаддссдао 2040 бдссдадсаа сддодадеааад деЕЕсСаєдсас суосЕсСасеса даааддсесеє дсаадеседдс 2100 чадааадеєда аадссЕдеЕсЕ адсеєсдраєва сасдсасаса ааддсаєсаа ддсаддаєсає 2160 ссасаєєсдсєд гаааєддадс адсааадссс аааадассса сааєєссеЕвсу асасасесес 2220 сааєсааєад дссєдеЕсаас аддаазсеЕсеЕ ссаааасаде ЧЕЕсЧдаєсьс седеасаава 2280
Єдаєссьдед дсааадесесс ссаасеесса аєсаєсдсадс ссаєдааде гадддааєсаа 2340 ссссавфсЕсЕ ЕСОСЕСЕЧЧеЕЄ адддеЕєсааа Єдеасассса дадасаааад ааааєсодднка 2400 асадсддбає ааадддассс асчаєдссдс асадасссєдуд сссссаарас сасаєсаєсс 2460 аєаєадсеєда аадссаааса деЕддодддааа дссссасдаа ссассдааса аасддсаста 2520
ЧдЕааасєдад ссаададааа сддасєдадд сссасессса баддраєесеЕ дсдааадссс 2580 аддасчдаєдд даєдддааса саддеЕдсаає Есссаєссує аддЕеЕсеЕдна садсаасаєд 2640 аддачдааасесє ададесеЕдссеЕ Едадсаддад ЄсдЕдсаддЕ ЕЄЕддсаєддеЕ сссдрасесд 2700
Зо ЄЕЧДЕєдДЕсДда ЄссеЕддаасе ададдасааа соддсаасає ассесдаєаа Ессадаадаа 2760 ссаасаадаа дасдаддсасє адсадсадда сдаададдаа баєдаєсаааа сдссдсадас 2820 асаєссадсд агаассадда саааєсоддад дасаддадає ЕддЕЧдадеда Есодадчєтд 2880 чадасеЕдсда аєсеЕсдддсса адасасасудд деЕдаєссссс гадааааєсд ададаадесс 2940 ассасдадеЕсС бадасеЕстдс доагаєсуєда ддаєссесвдеЕ саасаадааа аассссдесе Зоо дЕаасасдад садоадддаєссЕ аддааєсссд асоєдасдеЕє сессаєдаєс дессасаддаде З06о ссссадессеЕ сдсддадаєє дасдачдаєдЕ дададдсаає асесодддадса додЕЄтсасьд 3120 вЕССсСЕєДдаасі ддадссасса дсаддаадає асадассссе дасеЕсЕддда Есссдсадад 3180 сЕєддЕдсаа ддсадесддаа 3200 «2105» 49 «2115 3182 «2125» ДНК «213» Вірус гепатиту В «220» «223» Вірус гепатиту В підтип аумш, повний геном «4005» 49 ааєєссасаа ссЕсЕсасса аасеєссдсаа дассссадад Сдададдесс дсассссссс бо чЧсЕдасдоассІ ссадеєсадуа адсадесааас ссЕдЕсСссуда сртаседссес Ссессетаєссд 120
ЕсааєсєєсеЕ сдаддаєєдуа ддасссодсд ссдаасаєсдуда адаасаєсас ассаддасєес 180 сстаддасссс СсСсссЯоссс асаддсудуддд ЄЕЕЕЕсСеЕсдеЕ сдасаадаає ссесасаатга 240 ссдсададесс сСадасссодєсд дсддасеЕссе ссесаарєєєс гаддаддоадаас гбассардеде Зоо сеЕсддссааа асссдсадесс сссаассосс аассасссас саассеєсстд гссессаасье 3З6о
ЄодсссеЕдУєс аєсосеєддає чссодсссдсоад сосеЕсСтТаєса ЕЄЕСсСЕЄсСсСЕсСеЕЄ саєсссоостд 420 сеЕаєдссеса ЕСЕССЕЕУЧЕЄ ддЕсСЕсССсСс9д дасваєсаад чсасуєдсс сєевдеЕсся 480 сстаассссад дасссссаас сассадсасу ддассасдсс даасссдсає дассасесдсе 5340 сааддаассс ссасдсбаєссс сссссдеЕсдс єдсассааас сЕссоддасдд аааєєсдсасс 60
Едвеаєєссса Еєсссаєсаєс сеЕддоасЕссс ддааааєсссс сасдддаадесд ддссеісадсс 6б6о бо сСЯсЕсСсСЕсСсЕ ддсеєсадсеЕє асвсадедсса ЕСЕДЕЄСВадЕ Ч9ЯдДЕсСЯгадуд десЕсссссс 720 асЕдеЕсєсєддас ЕЄЄєСаЧаєсає аєдвдчаєдаєда сддвсаєссдддоа ддссаадессо дсасадсаєс 78о0 гЕЧдадеЕсссяє ЕЕсСвассусе десрассааєс СЕСЕСЕсСуЧЄсС ЕЄеддудбаєса саєстааваасе 840 ссаасаааас ааадзачаєсдд ддссасеєсеєс гєдааєеєеєвтає дводесаєдес аєсддаадесе 900 аєдддЕссЕЕ дссасаадаа сасаєсаєрас аааардаєсаа адааєдеЕее адаааасьєс 960 сеаєсаасад дсссаєсеєдає єддаааднає дсЕсаасдаає єЕдЕДЧОДЕСЕЄ СЕЧООДЕЄЕвД 1020 сЕдссссаєсеє гасасааєдеЕ ддЕсаєсссд судєсааєдсес сеЕєдгаєдса Єдсаєєссаає 1080 сЕаадсаддс ЕсСЕСасСЕСЄЕеЕсС Есудссаассє асааддсесеЕє ЕСЕДдЕдДЕааа саасассвда 1140 ассеЕвєврассс сусгдсссдуа саасуддссад дЕСЕдеЕдсса адеЕдеЕеЕсдсеЕ дасдсаассс 1200 ссасєддсєд доадсЕсддЕсС аєдддадссаєс адсдсудєдсу Еддаассєвс ссоддсессес 1260 бдссдаєсса баседсддаа сеЕсстадссдуд сЕсдсЕседс єсдсадсадд ЕСЕддддадсаа 1320 асаєсаєсдуд дасеєдасаас ЕСЕДЕсдЕсСсС ЕСЕСССсСдсаа асасасаєсдд сасссаєддас 1380 бдсеаддсвд ЄдсеЕдссаас Еддаєсстсдс дсдудадасуєс сЕсЕдЕсвас деЕсСссаеєс9д 1440 сдсЕдааєсс Едсддасдас ссЕЄсСЕСсСуддуа деЕсодсеЕсдду асесесьсує ссссеЕрсесс 1500 дЕСЕдссЯвЕ ссдассдасс асддддсдса ссЕСЕСЕсЄва содсууддасесс ссддєсьдедс 1560 сЕєсСЕсСаєсе дссоддассує деЕдсассссу сессассесь дсасуєсдса сддадассас 1620 сдєдаасдсс сассдааєде єдсссааддЕ сеЕбасаєаад аддассссвуд дасеЕСсеєстдс 1680 ааєдеЕсаасд ассдассесд аддсасасьс сааадаседеЕ ЕЄДЕсЕеааад асеЕддоддадва 1740 чЧчЕєдоадоадад дадаєтадає гаааддеЕсеЕ єдсасеадда доасЕдгаддс асаааєтєадЧе 1800 сЕдсдсасса дсассаєдса асеЕсееЕссас сеЕСЕдссваа Есассєсства сеЕСаєдеЕсся 1860 асєдеЕсєсаад ссессаадсеЕ деЕдссЕвдоад ЄдоасЕЕсоодуа дсаєддасає сдасссеває 1920 ааачдааєєстєдд дадссаседЕ ддадеЕсСасес ссуЕєсЕСЕуус сесстдасеЕєс сЕсесствса 1980 чЧдЕасдадаєс ЄЕСвадавас сдссеЕСадсс сЕДдгаєсудду аадссеЕсада деЕСЕсСсСсеЕдад 2040 саєеєдеЕсєсас сссассасас єдсасесадуд саадсааєєс ЕсЕдСссоодоад ддаастааєд 2100 асєЕсвадсва сседдуаєдоадд ЕдЕсааєсьд даадаєссад саєссадада ссгадсадес 2160 адеЕваєдеса асассааває дддссвааад СЕСаддсаас ЕСЕЕДЕДдДУЄЕ Есасасеєся 2220
Єдссеєсасесє седоаадада аассудєтава дадеаєстдуа ЄДдЕСЕЕссСоЯд адеЕдеЕдчаєс 2280 сдсасесссс садсеЕсасад ассассааає дссссвраєсс гаєсаасасеі єссддааасе 2340 асєдЕєдеЕва дасддасдадуд саддеЕсссссї адаадаадаа сЕсСссеЕсдсс Есдсадасда 2400 аддеЕсЕсаає содссдсдЕсу садаадаєссі сааєсеєсудду аассеєсааєу Есадраєссс 2460
ЄгЕддасесає ааддєддоддда асеЕєтассодд СсеЕеЕсасеєсь єсвтаседнас седессесесаа 2520
Зо ЄссеЕСаєєсду аааасассає сЕЕсессссаа сСасасасеєса сассаадаса єсСассааааа 2580 аєдеЕдаасад ЄЕсЧдсаддсес сасеєсасаді Сааєдадааа адаадаєєдс ааєсдаєвсає 2640 дссЕдсвадд ЄЕсСваєссаа аддеЕсассаа агаєстасса Еєддаєааду дсастааасс 2700
Егаєвсаєсса даасаєста Есааєсаєвта сЕсСссааасе адасасстасе гасасасесе 2760 аєддааддсд дудбасаєстає аєаададада аасаасасає адсдссеЕсає сЕЄсдЕдодЕС 2820 ассаваєєсє сдддаасаачдч асссасадса Сддоадсадаа ЕСЕЄсссасс адсааєсссяс 2880 бдоададавеєсьс ссссдассас садебддаєс садссеЕссад адсааасаса дсаааєсссад 2940 аєєдодадасеє сааєсссаас ааддасассо ддссадасдс саасааддса ддадссддад Зоо саєеЕсоддадсЕ доддЕсЕЕссасс ссассусасу даддссЕвЕсЕ ддоадеЕддадсес ссесаддсес З06о адддсаєасеЕ асааассеєсу ссадсаааєс судссеєссрдс сеЕсСсассаає сдссадасад 3120 чааддсадсс бассссудсесуд ЕсЕСсССсСассвс Сдадааасас Єсаєссссад дссаєдсаде 3180 ча 3182

Claims (63)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Засіб на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (05ЕКМА) для інгібування експресії гена вірусу гепатиту В (НВМ) або інгібування реплікації НВМ в клітині, що містить сенсову нитку й антисенсову нитку, які утворюють двониткову ділянку, де сенсова нитка містить 5'- дзиздисИисАгОтисодсиисаса! 96-3., (ЗЕО ОО МО: 10) і антисенсова нитка містить 5- 50 изасізида(Адп)дстстаадисисАтсасзиви-3 (ЗЕО ІЮ МО: 16); де а, с, д та и являють собою 2'-О-метиладенозин-3-фосфат, 2'-О-метилцитидин-3-фосфат, 2'- О-метилгуанозин-3'-фосфат та 2'-О-метилуридин-3'-фосфат, відповідно; АЇ, Ст. Ої та 7 являють собою 2'-фтораденозин-3-фосфат, 2'--фторцитидин-3'--фосфат, 2'- фторгуанозин-3'-фосфат та 2'і-фторуридин-3'-фосфат, відповідно; 55 (Адп) являє собою аденозин-гліколь-нуклеїнову кислоту (ОМА); являє собою фосфотіоатний зв'язок; і І 96 являє собою М-Ігрис(СаІМАс-алкіл)-амідодеканоїл)|-4-гідроксипролінол.
2. Засіб на основі 5КМА за п. 1, де щонайменше одна нитка містить 3'-липкий кінець, що складається зі щонайменше 1 нуклеотиду, або 3'-липкий кінець, що складається із 2 60 нуклеотидів.
3. Засіб на основі а5зКМА за п. 1 або 2, де довжина двониткової ділянки становить 19-21 пару нуклеотидів або кожна нитка незалежно має 19-23 нуклеотиди.
4. Засіб на основі а5КМА за будь-яким із пп. 1-3, де І 96 кон'югований на 3'-кінці сенсової нитки, як показано на наступному схематичному зображенні: з З т сти з сдруюгегок, р о шов Я й о | е О2Р-Х і ов М у Он Ї Н Ноя ма а с но НН Ноти т мини 7 м Тї но НН Ко ит С в Пон в Що де Х являє собою О або 5.
5. Засіб на основі а5ЕМА за п. 4, де Х являє собою 0.
б. Засіб на основі азКМА за будь-яким із пп. 1-5, де засіб на основі а5КМА інгібує експресію вірусу гепатиту В (НВУ) в клітині.
7. Клітина, що містить засіб на основі Д5КМА за будь-яким із пп. 1-6.
8. Фармацевтична композиція, що містить засіб на основі О5КМА за будь-яким із пп. 1-6 та фармацевтичний наповнювач.
9. Спосіб інгібування експресії гена вірусу гепатиту В (НВУМ) або інгібування реплікації НВМ в клітині іп міго, при цьому спосіб передбачає приведення клітини в контакт із засобом на основі азЕМА за будь-яким із пп. 1-6 або фармацевтичною композицією за п. 8 з інгібуванням таким чином експресії або реплікації гена НВМУ в клітині.
10. Спосіб зниження рівня антигену вірусу гепатиту В (НВМ) або зниження вірусного навантаження НВУ у суб'єкта, інфікованого НВУ, який включає введення суб'єктові засобу на основі а5ЕМА за будь-яким із пп. 1-6.
11. Спосіб за п. 10, де антиген НВМ являє собою НВзАд або НВедо.
12. Спосіб за п. 10 або 11, де суб'єкт є НВеАод-позитивним.
13. Спосіб за п. 10 або 11, де суб'єкт є НВеАд-негативним.
14. Спосіб за будь-яким із пп. 10-13, де засіб на основі 45ЕМА суб'єкту вводять у дозі, що становить від 0,01 до 10 мг/кг, від 0,5 до 50 мг/кг або від З до 10 мг/кг; або у фіксованій дозі, що становить від 50 до 200 мг або від 50 до 900 мг.
15. Спосіб за будь-яким із пп. 10-14, де засіб на основі а5зКМА суб'єкту вводять підшкірно.
16. Спосіб за будь-яким із пп. 10-15, де засіб на основі а5КМА суб'єкту вводять у кількості двох або більше доз.
17. Спосіб за будь-яким із пп. 10-16, де засіб на основі 45Е2ЕМА суб'єкту вводять один раз на Зо місяць, один раз на два місяці, один раз на три місяці або не більше одного разу на місяць.
18. Спосіб за будь-яким із пп. 10-17, який додатково включає введення суб'єкту одного або більше додаткових терапевтичних засобів.
19. Спосіб за п. 18, де додатковий терапевтичний засіб являє собою противірусний засіб, інгібітор зворотної транскриптази, імуностимулятор, терапевтичну вакцину, інгібітор вірусного проникнення, олігонуклеотид, що інгібує секрецію або вивільнення НЬзАд, інгібітор збирання капсиду або інгібітор утворення ковалентно замкненої кільцевої (ссс) ДНК НВМ або комбінацію будь-яких з вищенаведених.
20. Спосіб за п. 19, де додатковий терапевтичний засіб являє собою тенофовіру дизопроксилу фумарат (ТОБ), тенофовіру алафенамід, ламівудин, адефовіру дипівоксил, ентекавір (ЕТМ), телбівудин, АОХ-1009, пегильований інтерферон альфа-га (РЕС-ІЕМ-ага), інтерферон альфа- 20, рекомбінантний людський інтерлейкін-7 або агоніст ТоїІ-подібного рецептора 7 (ТІК).
21. Спосіб за будь-яким із пп. 10-20, де суб'єкт також має інфекцію, спричинену вірусом гепатиту р(ноу).
22. Спосіб за будь-яким із пп. 10-20, де суб'єкт також має гепатит дельта, гострий гепатит В; гострий фульмінантний гепатит В; хронічний гепатит В; фіброз печінки; захворювання печінки на термінальній стадії або гепатоцелюлярну карциному.
23. Спосіб зниження рівня антигену вірусу гепатиту В (НВМ) або зниження вірусного навантаження НВМ у суб'єкта, інфікованого НВМ, який включає введення суб'єктові фармацевтичної композиції за п. 8.
24. Спосіб за п. 23, де антиген НВМ являє собою НВ5Ад або НВедо.
25. Спосіб за п. 23 або 24, де суб'єкт є НВеАод-позитивним.
26. Спосіб за п. 23 або 24, де суб'єкт є НВеАод-негативним.
27. Спосіб за будь-яким із пп. 23-26, де засіб на основі 45ЕМА суб'єкту вводять у дозі, що становить від 0,01 до 10 мг/кг, від 0,5 до 50 мг/кг або від З до 10 мг/кг; або у фіксованій дозі, що становить від 50 до 200 мг або від 50 до 900 мг.
28. Спосіб за будь-яким із пп. 23-27, де засіб на основі азКМА суб'єкту вводять підшкірно.
29. Спосіб за будь-яким із пп. 23-28, де засіб на основі а5КМА суб'єкту вводять у кількості двох або більше доз.
30. Спосіб за будь-яким із пп. 23-29, де засіб на основі й5КМА суб'єкту вводять один раз на місяць, один раз на два місяці, один раз на три місяці або не більше одного разу на місяць.
31. Спосіб за будь-яким із пп. 23-30, що додатково включає введення суб'єкту одного або більше додаткових терапевтичних засобів.
32. Спосіб за п. 31, де додатковий терапевтичний засіб являє собою противірусний засіб, інгібітор зворотної транскриптази, імуностимулятор, терапевтичну вакцину, інгібітор вірусного проникнення, олігонуклеотид, що інгібує секрецію або вивільнення НбрзАОд, інгібітор збирання капсиду або інгібітор утворення ковалентно замкненої кільцевої (ссс) ДНК НВМ або комбінацію будь-яких з вищенаведених.
33. Спосіб за п. 32, де додатковий терапевтичний засіб являє собою тенофовіру дизопроксилу фумарат (ТОБ), тенофовіру алафенамід, ламівудин, адефовіру дипівоксил, ентекавір (ЕТМ), телбівудин, АОХ-1009, пегильований інтерферон альфа-га (РЕС-ІЕМ-ага), інтерферон альфа- 20, рекомбінантний людський інтерлейкін-7 або агоніст ТоїІ-подібного рецептора 7 (ТІК).
34. Спосіб за будь-яким із пп. 23-33, де суб'єкт також має інфекцію, спричинену вірусом гепатиту р(ноу).
35. Спосіб за будь-яким із пп. 23-33, де суб'єкт також має гепатит дельта, гострий гепатит В; гострий фульмінантний гепатит В; хронічний гепатит В; фіброз печінки; захворювання печінки на термінальній стадії або гепатоцелюлярну карциному.
36. Спосіб лікування суб'єкта, що має інфекцію, спричинену вірусом гепатиту В (НВМ), або асоційоване з вірусом гепатиту В (НВУ) захворювання або порушення, який включає введення суб'єктові засобу на основі азхеЕМА за будь-яким із пп. 1-6.
37. Спосіб за п. 36, де асоційоване з НВМ порушення являє собою хронічний гепатит та суб'єкт є НВедАд-позитивним.
38. Спосіб за п. 36, де асоційоване з НВМ порушення являє собою хронічний гепатит та суб'єкт є НВеАд-негативним.
39. Спосіб за будь-яким із пп. 36-38, де засіб на основі 45КМА суб'єкту вводять у дозі, що становить від 0,01 до 10 мг/кг, від 0,5 до 50 мг/кг або від З до 10 мг/кг; або у фіксованій дозі, що становить від 50 до 200 мг або від 50 до 900 мг.
40. Спосіб за будь-яким із пп. 36-39, де засіб на основі азКМА суб'єкту вводять підшкірно.
41. Спосіб за будь-яким із пп. 36-40, де засіб на основі а5КМА суб'єкту вводять у кількості двох або більше доз.
42. Спосіб за будь-яким із пп. 36-41, де засіб на основі Д5ЕМА суб'єкту вводять один раз на місяць, один раз на два місяці, один раз на три місяці або не більше одного разу на місяць.
43. Спосіб за будь-яким із пп. 36-42, що додатково включає введення суб'єкту одного або БО більше додаткових терапевтичних засобів.
44. Спосіб за п. 43, де додатковий терапевтичний засіб являє собою противірусний засіб, інгібітор зворотної транскриптази, імуностимулятор, терапевтичну вакцину, інгібітор вірусного проникнення, олігонуклеотид, що інгібує секрецію або вивільнення НбрзАОд, інгібітор збирання капсиду або інгібітор утворення ковалентно замкненої кільцевої (ссс) ДНК НВМ або комбінацію будь-яких з вищенаведених.
45. Спосіб за п. 44, де додатковий терапевтичний засіб являє собою тенофовіру дизопроксилу фумарат (ТОБ), тенофовіру алафенамід, ламівудин, адефовіру дипівоксил, ентекавір (ЕТМ), телбівудин, АОХ-1009, пегильований інтерферон альфа-га (РЕС-ІЕМ-ага), інтерферон альфа- 20, рекомбінантний людський інтерлейкін-7 або агоніст ТоїІ-подібного рецептора 7 (ТІК).
46. Спосіб за будь-яким із пп. 36-45, де асоційоване з НВМ захворювання являє собою інфекцію, спричинену вірусом гепатиту Ю (НОМ).
47. Спосіб за будь-яким із пп. 36-45, де асоційоване з НВМ захворювання являє собою гепатит дельта, гострий гепатит В; гострий фульмінантний гепатит В; хронічний гепатит В; фіброз печінки; захворювання печінки на термінальній стадії або гепатоцелюлярну карциному.
48. Спосіб лікування суб'єкта, що має інфекцію, спричинену вірусом гепатиту В (НВМ), або асоційоване з вірусом гепатиту В (НВМ) захворювання або порушення, який включає введення суб'єктові фармацевтичної композиції за п. 8.
49. Спосіб за п. 48, де асоційоване з НВМ порушення являє собою хронічний гепатит, та суб'єкт є НВедд-позитивним.
50. Спосіб за п. 48, де асоційоване з НВМ порушення являє собою хронічний гепатит, та суб'єкт є НВедАд-негативним.
51. Спосіб за будь-яким із пп. 48-50, де засіб на основі 45КМА суб'єкту вводять у дозі, що становить від 0,01 до 10 мг/кг, від 0,5 до 50 мг/кг або від З до 10 мг/кг; або у фіксованій дозі, що становить від 50 до 200 мг або від 50 до 900 мг.
52. Спосіб за будь-яким із пп. 48-51, де засіб на основі 45КМА суб'єкту вводять підшкірно.
53. Спосіб за будь-яким із пп. 48-52, де засіб на основі а5ЕМА суб'єкту вводять у кількості двох або більше доз.
54. Спосіб за будь-яким із пп. 48-53, де засіб на основі й5КМА суб'єкту вводять один раз на місяць, один раз на два місяці, один раз на три місяці або не більше одного разу на місяць.
55. Спосіб за будь-яким із пп. 48-54, що додатково включає введення суб'єкту одного або більше додаткових терапевтичних засобів.
56. Спосіб за п. 55, де додатковий терапевтичний засіб являє собою противірусний засіб, інгібітор зворотної транскриптази, імуностимулятор, терапевтичну вакцину, інгібітор вірусного проникнення, олігонуклеотид, що інгібує секрецію або вивільнення НЬзАОд, інгібітор збирання капсиду або інгібітор утворення ковалентно замкненої кільцевої (ссс) ДНК НВМ або комбінацію будь-яких з вищенаведених.
57. Спосіб за п. 56, де додатковий терапевтичний засіб являє собою тенофовіру дизопроксилу фумарат (ТОБ), тенофовіру алафенамід, ламівудин, адефовіру дипівоксил, ентекавір (ЕТМ), Зо телбівудин, АОХ-1009, пегильований інтерферон альфа-га (РЕС-ІЕМ-ага), інтерферон альфа- 20, рекомбінантний людський інтерлейкін-7 або агоніст ТоїІ-подібного рецептора 7 (ТІ 7).
58. Спосіб за будь-яким із пп. 48-57, де асоційоване з НВМ захворювання являє собою інфекцію, спричинену вірусом гепатиту Ю (НОМ).
59. Спосіб за будь-яким із пп. 48-57, де асоційоване з НВМ захворювання являє собою гепатит дельта, гострий гепатит В; гострий фульмінантний гепатит В; хронічний гепатит В; фіброз печінки; захворювання печінки на термінальній стадії або гепатоцелюлярну карциному.
60. Засіб на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (05ЕМА) для інгібування експресії гена вірусу гепатиту В (НВМ) або інгібування реплікації НВМ в клітині, що містить сенсову нитку й антисенсову нитку, які утворюють двониткову ділянку, де сенсова нитка містить 5'- дзивдисИсАТОТИисодсиисаса! 96-3.,. (ЗЕБО ОО МО: 10) і антисенсова нитка містить 5- изасїзида(Аап)дстстаадистсАїсасзиви-3 (ЗЕО ІЮ МО: 16); де а, с, д та и являють собою 2'-О-метиладенозин-3-фосфат, 2'-О-метилцитидин-3-фосфат, 2'- О-метилгуанозин-3'-фосфат та 2'-О-метилуридин-3'-фосфат, відповідно; АЇ, Ст. Ої та 7 являють собою 2'-фтораденозин-3-фосфат, 2'--фторцитидин-3'--фосфат, 2'- фторгуанозин-3'-фосфат та 2'і-фторуридин-3'-фосфат, відповідно; (Адп) являє собою аденозин-гліколь-нуклеїнову кислоту (ОМА); 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і І 96 являє собою М-Ітрис(СаіІМАс-алкіл)-амідодеканоїл)|-4-гідроксипролінол, де ГОб кон'югований на 3'-кінці сенсової нитки, як показано на наступному схематичному зображенні:
З о З шк я р КИ СИ ОЇ о шкюокй щи вх О2хР-Х о
М. м М но ЄН но чини тва С но он о но мини ді Я т но ЄН Ко кА но М Мо АСНМ ев Н і де Х являє собою 0.
61. Спосіб лікування суб'єкта, що має інфекцію, спричинену вірусом гепатиту В (НВМ), або асоційоване з вірусом гепатиту В (НВМ) захворювання або порушення, який включає введення суб'єктові засобу на основі азеЕМА за п. 60.
62. Спосіб за п. 61, де асоційоване з НВМ захворювання являє собою інфекцію, спричинену вірусом гепатиту Ю (НОМ).
63. Набір для інгібування експресії гена вірусу гепатиту В (НВМУ) або інгібування реплікації НВМ в клітині, що містить: а) засіб на основі азхЕМА за будь-яким із пп. 1-6 або фармацевтичну композицію за п. 8; і БЮ) інструкції із використання. -4 дит ж н. БІК В яяяю пн ан Й ж де женні дж ОВО ТУ - т я КЕ 7 «роес Пре Ва о СХ х я й манти та я а. х. ї / опис ККУ ї ЖЕ Ка ше ве ие чи й й я я я ех Ах х хх : ? й І М А х 5 5 У ух і Й -к цк ці у з і ро нини шини ши ши і: ЖЕ; : : : ше 5 ї 1 ро й ше ї 1 х х о Х Ї Ї і Ї у хх с Мен і / і хо ж з У у я де и Звичайний , Ж М, ня -е що я К-внень х ОТ, ення йо па Ко Б зе Ду а а т з с т пюкжду еттт т стекти пит т ко со жу дян оч т КОД ння ит -- Я. В. АЮ З ж Фіг
UAA202100688A 2018-08-13 2019-08-12 КОМПОЗИЦІЇ, ЩО МІСТЯТЬ ЗАСІБ НА ОСНОВІ dsRNA ВІРУСУ ГЕПАТИТУ В (HBV), ТА СПОСОБИ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ UA127745C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862718314P 2018-08-13 2018-08-13
PCT/US2019/046142 WO2020036862A1 (en) 2018-08-13 2019-08-12 HEPATITIS B VIRUS (HBV) dsRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127745C2 true UA127745C2 (uk) 2023-12-20

Family

ID=67766385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA202100688A UA127745C2 (uk) 2018-08-13 2019-08-12 КОМПОЗИЦІЇ, ЩО МІСТЯТЬ ЗАСІБ НА ОСНОВІ dsRNA ВІРУСУ ГЕПАТИТУ В (HBV), ТА СПОСОБИ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ

Country Status (18)

Country Link
US (2) US11492623B2 (uk)
EP (1) EP3837366A1 (uk)
JP (1) JP2021533767A (uk)
KR (1) KR20210043647A (uk)
CN (1) CN112673103A (uk)
AR (1) AR114551A1 (uk)
AU (1) AU2019321375A1 (uk)
BR (1) BR112021001613A2 (uk)
CA (1) CA3106701A1 (uk)
EA (1) EA202190528A1 (uk)
IL (1) IL280559A (uk)
JO (1) JOP20210007A1 (uk)
MX (1) MX2021001056A (uk)
PH (1) PH12021550287A1 (uk)
SG (1) SG11202100715WA (uk)
TW (1) TW202023574A (uk)
UA (1) UA127745C2 (uk)
WO (1) WO2020036862A1 (uk)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3139325A1 (en) * 2019-05-13 2020-11-19 Vir Biotechnology, Inc. Compositions and methods for treating hepatitis b virus (hbv) infection
AU2021288648A1 (en) 2020-06-10 2023-02-09 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Conjugate of double-stranded siRNA analogue
US20240124879A1 (en) * 2020-12-18 2024-04-18 Olix Pharmaceuticals, Inc. Rnai agent for inhibiting hbv expression and use thereof
TW202310852A (zh) 2021-05-13 2023-03-16 美商基利科學股份有限公司 ＴＬＲ８調節化合物及抗ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ療法之組合
CN115267193B (zh) * 2022-09-20 2022-12-27 北京大学 用于判断生物样本中HBsAg来源的方法及系统和用途

Family Cites Families (311)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
ATE113059T1 (de) 1987-06-24 1994-11-15 Florey Howard Inst Nukleosid-derivate.
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
FR2623508B1 (fr) 1987-11-20 1990-04-20 Commissariat Energie Atomique Proteine basique denommee phospholipase a2 isolee de venin de serpent de la famille des elapides et sa sequence en amino-acides, derives et fragments de ladite proteine, leur procede d'obtention, compositions therapeutiques et agents de diagnostic contenant ladite proteine et/ou ses derives et/ou ses fragments
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
EP0942000B1 (en) 1989-10-24 2004-06-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-Modified oligonucleotides
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5629153A (en) 1990-01-10 1997-05-13 Chiron Corporation Use of DNA-dependent RNA polymerase transcripts as reporter molecules for signal amplification in nucleic acid hybridization assays
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5610050A (en) 1990-04-20 1997-03-11 The General Hospital Corporation Methods of preventing viral replication
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
CA2085353A1 (en) 1990-06-18 1991-12-19 Chandrakant P. Giri Eukaryotic expression vector system
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
WO1992002258A1 (en) 1990-07-27 1992-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
AU667459B2 (en) 1990-08-03 1996-03-28 Sanofi Compounds and methods for inhibiting gene expression
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
CA2092002A1 (en) 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
WO1992008728A1 (en) 1990-11-08 1992-05-29 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
ATE262374T1 (de) 1991-11-22 2004-04-15 Affymetrix Inc Kombinatorische strategien für polymersynthese
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
EP1695979B1 (en) 1991-12-24 2011-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped modified oligonucleotides
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US20030206887A1 (en) 1992-05-14 2003-11-06 David Morrissey RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) using short interfering nucleic acid (siNA)
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
AU4769893A (en) 1992-07-17 1994-02-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5783701A (en) 1992-09-08 1998-07-21 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
DK0691968T3 (da) 1993-03-30 1998-02-23 Sanofi Sa Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
EP0729474A4 (en) 1993-11-16 1998-10-21 Genta Inc SYNTHETIC OLIGOMERS THAT HAVE CHIRALITY-PURE PHOSPHONATE INTERNUCLEOSIDYL BINDINGS MIXED WITH NON-PHOSPHONATE INTERNUKLEOSIDYL BINDINGS
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
WO1995027788A1 (fr) 1994-04-11 1995-10-19 Dainabot Co., Ltd. Polypeptide derive d'une variante du virus de l'hepatite b, gene le codant et adn associe
EP0759979A4 (en) 1994-05-10 1999-10-20 Gen Hospital Corp ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES INHIBITION OF HEPATITIS C VIRUS
JPH07303485A (ja) 1994-05-13 1995-11-21 Tonen Corp Ｈｃｖアンチセンスｒｎａ、それを含む発現ベクター、及び該ｒｎａ又は発現ベクターを含むｈｃｖ関連疾患治療剤
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5646262A (en) 1994-07-28 1997-07-08 Georgetown University Antisense oligonucleotides against hepatitis B viral replication
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5571026A (en) 1994-12-09 1996-11-05 Kcs Industries, Inc. Flat mount electrode socket
US6057153A (en) 1995-01-13 2000-05-02 Yale University Stabilized external guide sequences
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
US6222025B1 (en) 1995-03-06 2001-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of 2′-O-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
AU1039397A (en) 1995-11-22 1997-06-27 Johns Hopkins University, The Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US5843770A (en) 1996-03-11 1998-12-01 The Immune Response Corporation Antisense constructs directed against viral post-transcriptional regulatory sequences
US5877162A (en) 1996-03-14 1999-03-02 Innovir Laboratories, Inc. Short external guide sequences
AU737680C (en) 1996-05-16 2002-05-02 Nissin Foods Holdings Co., Ltd. Novel compounds having antiviral activity
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6610478B1 (en) 1996-08-16 2003-08-26 Yale University Phenotypic conversion of cells mediated by external guide sequences
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
AUPO434196A0 (en) 1996-12-24 1997-01-23 Crown In The Right Of The Queensland Department Of Health, The An improved therapeutic
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
DE19725803C1 (de) 1997-06-18 1999-02-11 Deutsches Krebsforsch HBV-gerichtete Antisense-Nukleinsäuren
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
AU752531B2 (en) 1997-09-17 2002-09-19 East Carolina University Multiple target hybridizing nucleic acids, their preparation, compositions, formulation, kits and applications
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US6436989B1 (en) 1997-12-24 2002-08-20 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
AU2092599A (en) 1997-12-24 1999-07-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
JP2002510464A (ja) 1998-01-27 2002-04-09 サイトセル・リミテッド Ｒｎａプロモーターからのインビトロ転写を伴う核酸標的配列の検出方法
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
IL123998A (en) 1998-04-08 2004-09-27 Galmed Int Ltd Conjugates of bile salts and pharmaceutical preparations containing them
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
WO2000044914A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
TWI260322B (en) 1999-02-12 2006-08-21 Vertex Pharma Inhibitors of aspartyl protease
US7601494B2 (en) 1999-03-17 2009-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of screening candidate compounds for susceptibility to biliary excretion
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
CN102180924A (zh) 1999-05-04 2011-09-14 桑塔里斯制药公司 L-核糖-lna类似物
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
EP1238061A2 (en) 1999-11-24 2002-09-11 Pharmasset, Ltd. A new genotype of hepatitis b virus
EP1234040A2 (en) 1999-12-03 2002-08-28 Innogenetics N.V. Hbv sequences
AU2001227965A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'-p5'phosphoramidates: their synthesis and use
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
AU2001249622B2 (en) 2000-03-30 2007-06-07 Massachusetts Institute Of Technology RNA sequence-specific mediators of RNA interference
US6573048B1 (en) 2000-04-18 2003-06-03 Naxcor Degradable nucleic acid probes and nucleic acid detection methods
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
DK1334109T3 (da) 2000-10-04 2006-10-09 Santaris Pharma As Forbedret syntese af purin-blokerede nukleinsyre-analoger
AU2002217980A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Cell Works Inc. Conjugates of glycosylated/galactosylated peptide
KR100909681B1 (ko) 2000-12-01 2009-07-29 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
US20030087855A1 (en) 2001-09-13 2003-05-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of protein kinase R expression
AU2002250254A1 (en) 2001-03-09 2002-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
EP1389209B1 (en) 2001-04-24 2009-04-08 Purdue Research Foundation Folate mimetics and folate-receptor binding conjugates thereof
JP2002335968A (ja) 2001-05-16 2002-11-26 Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho 新規転写因子、その遺伝子及びその結合ｄｎａ配列
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
AU2002316135B9 (en) 2001-05-18 2009-05-28 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2007022369A2 (en) 2005-08-17 2007-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified short interfering nucleic acid molecules that mediate rna interference
IL159053A0 (en) 2001-05-25 2004-05-12 Univ Duke Modulators of pharmacological agents
EP2360251B1 (en) 2001-07-12 2016-09-28 University of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
AU2002313699A1 (en) 2001-07-20 2003-03-03 Ribozyme Pharmacuticals, Inc. Enzymatic nucleic acid peptide conjugates
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
CN1311084C (zh) 2001-12-06 2007-04-18 阿隆戴蒙德艾滋病研究中心 利用嵌合噬菌体标准物的高灵敏基因组检测
EP1432724A4 (en) 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
MXPA04009361A (es) 2002-03-27 2005-05-17 Aegera Therapeutics Inc Oligomeros de nucleobases iap anti-sentido y sus usos.
WO2004011624A2 (en) 2002-07-31 2004-02-05 Nucleonics, Inc. Double stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
SI3222724T1 (sl) 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
WO2004024757A2 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Santaris Pharma A/S Modified pna molecules
CA2500224C (en) 2002-09-25 2015-04-28 University Of Massachusetts In vivo gene silencing by chemically modified and stable sirna
US9150605B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
WO2004044136A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2’-modified nucleosides for use in gene modulation
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
EP1560931B1 (en) 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
JP3839453B2 (ja) 2002-11-22 2006-11-01 株式会社バイオシンクタンク Ｒｎａ干渉の標的塩基配列検索方法、ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法、２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法、遺伝子の発現抑制方法、塩基配列処理装置、塩基配列処理方法をコンピュータに実行させるプログラム、記録媒体、および、塩基配列処理システム
WO2004063375A1 (en) 2003-01-15 2004-07-29 Hans Prydz OPTIMIZING siRNA BY RNAi ANTISENSE
WO2004078974A1 (ja) 2003-01-24 2004-09-16 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research Ｃ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸
CN1257284C (zh) 2003-03-05 2006-05-24 北京博奥生物芯片有限责任公司 一种体外阻断乙肝病毒表达的方法
WO2004080406A2 (en) 2003-03-07 2004-09-23 Alnylam Pharmaceuticals Therapeutic compositions
JP2006522158A (ja) 2003-04-03 2006-09-28 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ｉＲＮＡ複合体
EP2660322A3 (en) 2003-04-17 2013-11-13 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US7067249B2 (en) 2003-05-19 2006-06-27 The University Of Hong Kong Inhibition of hepatitis B virus (HBV) replication by RNA interference
US20070027099A1 (en) 2003-05-19 2007-02-01 Lin Marie C Gene therapy of HBV infection via adeno-associated viral vector mediated long term expression of small hairpin RNA (shRNA)
US8350021B2 (en) 2003-06-12 2013-01-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
US8575327B2 (en) 2003-06-12 2013-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
CN1322898C (zh) 2003-06-17 2007-06-27 杭州新瑞佳生物医药技术开发有限公司 攻击人类乙型肝炎病毒的小干扰RNA分子（SiRNA）及其应用
ES2382807T3 (es) 2003-08-28 2012-06-13 Takeshi Imanishi Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación
US20100145038A1 (en) 2003-11-24 2010-06-10 Merck & Co., Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7626014B2 (en) 2004-04-27 2009-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
AU2005272816B2 (en) 2004-08-10 2011-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides
US7985581B2 (en) 2004-08-23 2011-07-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multiple RNA polymerase III promoter expression constructs
WO2006069064A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Nucleonics, Inc. Conserved hbv and hcv sequences useful for gene silencing
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
CN102827841A (zh) 2005-09-12 2012-12-19 索马根尼科斯公司 利用小干扰rna抑制病毒基因表达
EP1782826A1 (en) 2005-11-08 2007-05-09 GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH PQS and c-diGMP and its conjugates as adjuvants and their uses in pharmaceutical compositions
CN100447243C (zh) 2005-11-15 2008-12-31 中国人民解放军第四军医大学 HBV特异性干涉靶位点基因及其siRNA和其在抗HBV感染中的应用
ES2516815T3 (es) 2006-01-27 2014-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
JP2010519203A (ja) 2007-02-16 2010-06-03 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 生物活性分子の活性を強化するための組成物及び方法
US20100105134A1 (en) 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
JP5726520B2 (ja) 2007-05-22 2015-06-03 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 治療剤のためのｕｎａオリゴマー
AU2008260277C1 (en) 2007-05-30 2014-04-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
CN101314047A (zh) 2007-06-01 2008-12-03 中国科学院微生物研究所 治疗病毒感染的方法及其药物
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
CN101796062B (zh) 2007-07-05 2014-07-30 Isis制药公司 6-双取代双环核酸类似物
EP3156077B1 (en) 2007-12-04 2022-03-09 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
CN101603042B (zh) 2008-06-13 2013-05-01 厦门大学 可用于乙型肝炎病毒感染治疗的rna干扰靶点
CN103275971A (zh) 2008-06-13 2013-09-04 厦门大学 可用于乙型肝炎病毒感染治疗的rna干扰靶点
CN101322847A (zh) 2008-06-23 2008-12-17 淮安市第四人民医院 基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物
EP2370577B1 (en) 2008-12-03 2019-08-28 Arcturus Therapeutics, Inc. Usirna complexes
WO2010080724A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
WO2011005861A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
WO2011005860A2 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5' phosphate mimics
BR112012008865A2 (pt) 2009-10-16 2019-09-24 Glaxo Group Ltd inibidores de hbv anti-sentido.
WO2011139710A1 (en) 2010-04-26 2011-11-10 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers and uses thereof
CA2807307C (en) 2010-08-17 2021-02-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Rna interference mediated inhibition of hepatitis b virus (hbv) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
CN101948827A (zh) 2010-08-19 2011-01-19 中国人民解放军第三〇二医院 一种低载量乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法
EP3505528B1 (en) 2011-04-21 2020-11-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
EP3564393A1 (en) 2011-06-21 2019-11-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
US8809293B2 (en) 2011-06-30 2014-08-19 Arrowhead Madison Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression of hepatitis B virus
CN104136451A (zh) 2011-09-07 2014-11-05 玛瑞纳生物技术有限公司 具有构象限制的单体的核酸化合物的合成和用途
CN102559657A (zh) 2011-11-09 2012-07-11 中国人民解放军第三〇二医院 两片段连接法进行hbv全基因组克隆的方法
KR102534909B1 (ko) 2011-11-18 2023-05-30 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 변형된 ＲＮＡｉ 제제
KR20220045091A (ko) 2011-11-18 2022-04-12 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴（ＴＴＲ） 관련 질병을 치료하기 위한 ＲＮＡｉ 제제, 조성 및 그의 사용방법
US9133461B2 (en) 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
CN103333890B (zh) 2012-12-21 2015-04-15 厦门成坤生物技术有限公司 治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰制剂
CN103014045B (zh) 2012-12-30 2014-09-17 中国人民解放军第三军医大学 表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体及其构建方法和应用
US20150374844A1 (en) 2013-02-15 2015-12-31 University Of Pennsylvania Novel ph -switchable peptides for membrane insertion and pore formation
PL2992009T3 (pl) 2013-05-01 2020-11-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Kompozycje i sposoby modulowania ekspresji apolipoproteiny(a)
JOP20200092A1 (ar) * 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
WO2016081444A1 (en) * 2014-11-17 2016-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
WO2016209862A1 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glucokinase (gck) irna compositions and methods of use thereof
CN115957337A (zh) 2015-08-07 2023-04-14 箭头药业股份有限公司 乙型肝炎病毒感染的RNAi疗法
WO2017100542A1 (en) * 2015-12-10 2017-06-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sterol regulatory element binding protein (srebp) chaperone (scap) irna compositions and methods of use thereof
ES2834698T3 (es) 2016-01-12 2021-06-18 Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh Medios y métodos para tratar el HBV
JOP20170161A1 (ar) * 2016-08-04 2019-01-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل RNAi للعدوى بفيروس التهاب الكبد ب
US11504391B1 (en) * 2016-11-23 2022-11-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified RNA agents with reduced off-target effect
CA3059446A1 (en) 2017-04-18 2018-10-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (hbv) infection
US11324820B2 (en) 2017-04-18 2022-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (HBV) infection

Also Published As

Publication number Publication date
SG11202100715WA (en) 2021-02-25
IL280559A (en) 2021-03-25
US20230128522A1 (en) 2023-04-27
US20210332365A1 (en) 2021-10-28
BR112021001613A2 (pt) 2021-05-04
JOP20210007A1 (ar) 2021-01-12
WO2020036862A9 (en) 2021-03-11
AU2019321375A1 (en) 2021-03-11
KR20210043647A (ko) 2021-04-21
JP2021533767A (ja) 2021-12-09
AR114551A1 (es) 2020-09-16
PH12021550287A1 (en) 2021-09-27
WO2020036862A1 (en) 2020-02-20
EP3837366A1 (en) 2021-06-23
EA202190528A1 (ru) 2021-04-23
CA3106701A1 (en) 2020-02-20
MX2021001056A (es) 2021-04-12
CN112673103A (zh) 2021-04-16
US11492623B2 (en) 2022-11-08
TW202023574A (zh) 2020-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA127745C2 (uk) КОМПОЗИЦІЇ, ЩО МІСТЯТЬ ЗАСІБ НА ОСНОВІ dsRNA ВІРУСУ ГЕПАТИТУ В (HBV), ТА СПОСОБИ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ
US20210308283A1 (en) Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
Ali et al. Selected replicon variants with low-level in vitro resistance to the hepatitis C virus NS5B polymerase inhibitor PSI-6130 lack cross-resistance with R1479
TWI790485B (zh) 用於降低pd-l1表現之寡核苷酸
Lohmann et al. Selective stimulation of hepatitis C virus and pestivirus NS5B RNA polymerase activity by GTP
Sofia et al. Nucleoside, nucleotide, and non-nucleoside inhibitors of hepatitis C virus NS5B RNA-dependent RNA-polymerase
US10286086B2 (en) Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
Lam et al. PSI-7851, a pronucleotide of β-D-2′-deoxy-2′-fluoro-2′-C-methyluridine monophosphate, is a potent and pan-genotype inhibitor of hepatitis C virus replication
US20160348099A1 (en) Modified nucleic acid molecules and uses thereof
CN108368507A (zh) 程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)的iRNA组合物及其使用方法
CN102395590A (zh) 用于治疗癌症和病毒感染的嘌呤核苷单磷酸酯前药
US20170175129A1 (en) Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
US20170136132A1 (en) Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
US20160304552A1 (en) Modified nucleic acid molecules and uses thereof
CN104884462A (zh) 用于治疗病毒感染和癌症的嘧啶核苷及其单磷酸酯前药
TWI816066B (zh) 用於降低PAPD5及PAPD7 mRNA以治療B型肝炎感染之核酸分子
CN103215269A (zh) 用于治疗病毒感染的dsRNA
KR20220150380A (ko) 케토헥소키나제 (KHK) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법
Momparler Biochemical pharmacology of cytosine arabinoside
Hodge Meeting report: 29th international conference on antiviral research in La Jolla, CA, USA
OA20174A (en) Hepatitis B Virus (HBV) dsRNA Agent Compositions And Methods Of Use Thereof
Zhang et al. Isarubrolone C promotes autophagic degradation of virus proteins via activating ATG10S in HepG2 Cells
CA3234478A1 (en) Pharmaceutical combinations for treatment of hbv
Chandra et al. Virus Associated DNA Polymerizing Activities: Their Role in Designing Antiviral and Antitumor Agents
WO2020020935A1 (en) Hiv inhibitors