CN102395590A - 用于治疗癌症和病毒感染的嘌呤核苷单磷酸酯前药 - Google Patents
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明涉及化合物、组合物和方法，它们用于治疗或预防人患者或其它动物宿主中的癌症和病毒感染，尤其是HIV、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2、登革热病毒、黄热病、和HBV。所述化合物是某些6-取代的嘌呤单磷酸酯和其药学上可接受的盐、前药、和其它衍生物。具体地，所述化合物表现出有效的针对HIV-1、HIV-2、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2、登革热病毒、黄热病、和HBV的抗病毒活性。
Description
技术领域
本发明涉及化合物、使用核苷酸类似物治疗或预防病毒感染的方法和组合物。更具体地，本发明描述了6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯和单膦酸酯前药和修饰的前药类似物、其药学上可接受的盐或其它衍生物以及它们在治疗癌症或病毒感染中的应用，所述癌症或病毒感染尤其是：1)人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)；2)黄病毒科的病毒，包括丙型肝炎病毒(HCV)、西尼罗病毒、登革热病毒、和黄热病；3)杯状病毒科感染，包括诺如病毒（Norovirus)和沙波病毒（Saporovirus)；和4)乙型肝炎病毒(HBV)感染。本发明教导了如何修饰特定6-取代的-2-氨基嘌呤核苷的代谢途径和以迄今为止难以获得的治疗上有关的浓度将核苷酸三磷酸酯递送给逆转录酶和聚合酶。
背景技术
核苷类似物作为一个类别具有非常确定的调节历史，超过10种目前被美国食品和药品管理局(US FDA)批准用于治疗人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、或丙型肝炎病毒(HCV)。在开发抗病毒疗法中的挑战是，不损伤宿主细胞地抑制病毒复制。在HIV中，药物开发的关键靶标是逆转录酶(HIV-RT)，即一种独特的病毒聚合酶。该酶在病毒复制周期的早期是有活性的，并将病毒的遗传信息从RNA转化成DNA，这是连续的病毒复制所必需的一个过程。核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)会模仿天然的核苷。在三磷酸酯形式，每种NRTI与4种天然存在的2’-脱氧核苷5’-三磷酸酯(dNTP)之一(即dCTP、dTTP、dATP、或dGTP)竞争结合HIV-1逆转录酶(RT)的活性部位，并在所述活性部位附近延长DNA链。
逆转录是HIV-1复制周期中的一个必要事件，且是开发抗逆转录病毒药物的一个重要靶标(参见Parniak MA，Sluis-Cremer N.Inhibitors ofHIV-1reverse transcriptase.Adv.Pharmacol.2000，49，67-109；Painter GR，Almond MR，Mao S，Liotta DC.Biochemical and mechanistic basis for theactivity of nucleoside analogue inhibitors of HIV reverse transcriptase.Curr.Top.Med.Chem.2004，4，1035-44；Sharma PL，Nurpeisov V，Hernandez-Santiago B，Beltran T，Schinazi RF. Nucleoside inhibitors ofhuman immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase.Curr.Top.Med.Chem.2004，4895-919)。已经鉴别出了抑制HIV-1逆转录酶的2组不同的化合物。它们是核苷或核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)和非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)。
NRTI是缺少在核糖上的3’-OH基团的脱氧核糖核苷类似物。它们是用于治疗HIV-1感染的第一种药物，且它们保留了几乎所有抗逆转录病毒方案的完整组分。
在1985年，报道了合成的核苷3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(齐多夫定，AZT，一种代表性的NRTI)会抑制HIV的复制。此后，已经证实了几种其它的NRTI对HIV是有效的，所述NRTI包括但不限于：2’，3’-二脱氧肌苷(去羟肌苷，ddI)、2’，3’-二脱氧胞苷(扎西他滨，ddC)、2’，3’-二脱氧-2’，3’-二脱氢胸苷(司他夫定，d4T)、(-)-2’，3’-二脱氧-3’-硫代胞苷(拉米夫定，3TC)、(-)-2’，3’-二脱氧-5-氟-3’-硫代胞苷(恩曲他滨，FTC)、(1S，4R)-4-[2-氨基-6-(环丙基-氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-环戊烯-1-甲醇琥珀酸酯(阿巴卡韦，ABC)、(R)-9-(2-膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤(PMPA，富马酸替诺福韦酯)(TDF)、和(-)-碳环的2’，3’-二脱氢-2’，3’-二脱氧鸟苷(卡波佛)和它的前药阿巴卡韦。在被细胞激酶磷酸化成5’-三磷酸酯以后，这些NRTI掺入病毒DNA的生长链中，造成链终止，因为它们缺少3’-羟基。
一般而言，为了表现出抗病毒活性，NRTI必须被宿主-细胞激酶代谢地转化成它们的对应的三磷酸酯形式(NRTI-TP)。NRTI-TP通过起DNA合成的链终止子的作用，抑制HIV-1逆转录酶DNA合成(参见Goody RS，Muller B，RestleT.Factors contributing to the inhibition of HIV reversetranscriptase by chain terminating nucleotides in vitro and in vivo.FEBSLett.1991，291，1-5)。尽管含有一种或多种NRTI的联合治疗已经大幅降低了与AIDS有关的发病率和死亡率，被批准的NRTI具有很多限制。这些限制包括：急性和慢性毒性、与其它抗逆转录病毒药的药代动力学相互作用、以及表现出与其它NRTI的交叉抗药性的HIV-1抗药变体的选择。
在个体内的HIV-1抗药性源自病毒群体的遗传变异性和治疗对抗性变体的选择(参见Chen R，Quinones-Mateu ME，Mansky LM.Drugresistance，virus fitness and HIV-1 mutagenesis.Curr.Pharm.Des.2004，10，4065-70)。HIV-1遗传变异性是由于HIV-1逆转录酶不能在复制过程中校正核苷酸序列。该变异性会被高HIV-1复制速率、前病毒变体的积累(在HIV-1感染过程中)和基因重组(当具有不同序列的病毒感染相同细胞时)增加。结果，在初次感染后的数年中，无数的遗传上不同的变体(称作准种)在个体内进化。抗药性的发展依赖于在药物治疗期间病毒复制的持续程度、获得特定突变(或突变集合)的容易性、抗药性突变对药物敏感性和病毒适合度的影响。一般而言，NRTI治疗会选择具有在RT中的突变的病毒。依赖于选择的NRTI抗性突变，突变型病毒通常会在某些情况下表现出对某些或所有NRTI的降低的敏感性。从临床角度看，抗药的HIV-1的发展会限制将来的治疗选择，因为有效地减少了保留对抗性病毒的效价的可利用药物的数目。这经常需要更复杂的药物方案(包括强给药方案)和更大的严重副作用风险(由于药物毒性)。这些因素经常促成对药物方案的不完全坚持。因而，具有优良活性和安全性特性以及有限的或没有与目前可利用的药物的交叉抗药性的新颖NRTI的开发，对于HIV-1感染的有效治疗而言是关键的。
对抗药HIV-1有活性的核苷类似物的开发需要详细理解对这类化合物的抗性所涉及的分子机制。因此，提供了所述突变和HIV-1对NRTI的抗性的分子机制的简要概述。已经提出了2个动力学上不同的HIV-1对NRTI的抗性的分子机制(参见Sluis-Cremer N，Arion D，Parniak MA.Molecularmechanisms of HIV-1resistance to nucleoside reverse transcriptaseinhibitors(NRTIs).Cell Mol.Life Sci.2000；57，1408-22)。一个机制涉及在病毒DNA合成过程中NRTI-TP相对于正常dNTP掺入的选择性减少。该抗性机制已经被称作辨别(discrimination)。第二个机制涉及终止链的NRTI-单磷酸酯(NRTI-MP)从过早终止的DNA链的选择性去除(参见Arion D，Kaushik N，McCormick S，Borkow G，Parniak MA.Phenotypicmechanism of HIV-1 resistance to 3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)：increased polymerization processivity and enhanced sensitivity topyrophosphate of the mutant viral reverse transcriptase.Biochemistry.1998，37，15908-17；Meyer PR，Matsuura SE，Mian AM，So AG，Scott WA.A mechanism of AZT resistance：an increase in nucleotide-dependentprimer unblocking by mutant HIV-1 reverse transcriptase.Mol.Cell.1999，4，35-43)。该机制已经被称作切除。
辨别机制涉及逆转录酶中一种或多种抗性突变的获取，所述突变提高了该酶的辨别天然dNTP底物和NRTI-TP的能力。在这方面，抗性通常与NRTI-TP掺入的降低的催化效率有关。NRTI-TP(和dNTP)催化效率由2个动力学参数驱动：(i)核苷酸对逆转录聚合酶活性部位的亲和力(Kd)和(ii)核苷酸掺入的最大速率(kpol)，它们二者都可以使用前稳态动力学分析来确定(参见Kati WM，Johnson KA，Jerva LF，Anderson KS.Mechanismand fidelity of HIV reverse transcriptase.J.Biol.Chem.1992，26：25988-97)。
关于NRTI抗性的切除机制，突变型HIV-1逆转录酶在核苷酸掺入步骤中不能辨别天然dNTP底物和NRTI-TP(参见Kerr SG， Anderson KS.Pre-steady-state kinetic characterization of wild type and 3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)resistant human immunodeficiency virus type 1reverse transcriptase：implication of RNA directed DNA polymerization inthe mechanism of AZT resistance.Biochemistry.1997，36，14064-70)。相反，在有生理浓度的ATP(通常在0.8-4mM的范围)或焦磷酸盐(PPi)存在下，含有“切除”突变的逆转录酶显示出增加的解除NRTI-MP终止的引物的能力(参见Arion D，Kaushik N，McCormick S，Borkow G，Parniak MA.Phenotypic mechanism of HIV-1 resistance to 3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)：increased polymerization processivity and enhanced sensitivity topyrophosphate of the mutant viral reverse transcriptase.Biochemistry.1998，37，15908-17；Meyer PR，Matsuura SE，Mian AM，So AG， Scott WA.A mechanism of AZT resistance：an increase in nucleotide-dependentprimer unblocking by mutant HIV-1 reverse transcriptase.Mol. Cell.1999，4，35-43)。与切除机制有关的NRTI抗性突变包括胸苷类似物突变(TAMS)和T69S插入突变。
另一种造成严重的人类健康问题的病毒是乙型肝炎病毒(HBV)。作为人类癌症的引发因素，HBV仅次于烟草。HBV的致癌机理尚不清楚。有假说认为，它可能直接地触发肿瘤发展，或间接地触发肿瘤发展(通过与感染相关的慢性炎症、肝硬化、以及细胞再生)。
在2-6个月的宿主通常未察觉感染的潜伏期以后，HBV感染可以导致急性肝炎和肝损伤，从而引起腹痛、黄疸以及某些酶的血液水平升高。HBV可以造成暴发性肝炎，这是一种发展迅速、常常致死的疾病形式，其中肝脏的大部分受到损害。
患者一般能够从HBV感染的急性期恢复。但对于有些患者，病毒会长时间或无限期地持续复制，从而造成慢性感染。慢性感染可以导致慢性迁延性肝炎。被慢性迁延性HBV感染的患者最常见于发展中国家。截至1991年中期，仅亚洲就有大约2.25亿慢性HBV携带者，在全球几乎有3亿携带者。慢性迁延性肝炎可以造成疲劳、肝硬化、和肝细胞癌症(一种原发性肝癌)。
在工业化国家，HBV感染的高危人群包括与HBV携带者或其血样接触的那些人。HBV的流行病学与HIV/AIDS非常相似，这就是为什么HIV感染者或AIDS患者中常常发生HBV感染的原因。然而，HBV比HIV的传染性更强。
3TC(拉米夫定)、干扰素α-2b、聚乙二醇干扰素α-2a、贺维力(阿德福韦酯)、博路定(恩替卡韦)、和Tyzeka(替比夫定)是目前FDA批准的用于治疗HBV感染的药物。但是，有些药物具有严重的副作用，且在用这些药治疗的患者中快速地发展出病毒抗性。
诺如病毒是在无外膜的正链RNA杯状病毒科中发现的4个病毒属之一。杯状病毒科中的其它3个种是兔病毒、囊病毒、和沙波病毒。沙波病毒是以人作为宿主的除了诺如病毒以外的属的唯一成员。诺如病毒基因组是大约7.56kb，具有3个开放读码框(ORF)。第一个ORF编码非结构蛋白，包括解螺旋酶、蛋白酶、和RNA指导的RNA聚合酶(RDRP)，它们都是病毒复制所需的。其它2个ORF编码衣壳蛋白(Jiang，X.(1993)Virology 195(1)：51-61)。已经将许多诺如病毒株归类为5个基因群，其中I、IV、和V感染人类(Zheng，D.P.等人(2006)Virology 346(2)：312-323)，据疾病控制中心(CDC)估计，每年在美国造成大约2300万胃肠炎病例，对应着40％的食物传染疾病(Mead PS.(1999)Emerg.Infect.Dis.5(5)：607-625)。
常见征状是呕吐、腹泻、和肠痉挛。呕吐是在儿童中最常见的征状，而腹泻是在受感染的成年人中更常见。脱水是一个严重的问题。该病毒每年在美国造成约300位患者丧生，且这些死亡通常发生在具有弱免疫系统的患者中(疾病控治和预防中心.“Norwalk-like viruses：”public healthconsequences and outbreak management.MMWR 2001；50(No.RR-9)：3)。从暴露至完全感染的潜伏期通常是24-48个小时，大约30％的受感染者不表现出征状。征状通常持续24-60个小时(Adler，J.L.和Zickl，R.，J.(1969)Infect.Dis.119：668-673)。在感染后，病毒排除可以持续多达2周，但是，不清楚该病毒是否是传染性的。
诺如病毒主要通过污染的食物或水、人与人的接触、呕吐物或粪便样品的飞沫经由粪口途径传播。粪便样品中的病毒滴度可以达到106-107个颗粒/mL，且所述颗粒在0℃(32°F)-60℃(140°F)的温度是稳定的(Duizer，E.等人，(2004)Appl.Environ.Microbiol.70(8)；4538-4543)。该病毒是高度传染性的，不同的来源提示感染可能需要少至10-100个病毒颗粒的接种(疾病控治和预防中心.“Norwalk-like viruses：”public health consequencesand outbreak management.MMR 2001；50(No.RR-9)：3-6)。这导致在学校、医护疗养所、游船、医院、或其它人群聚集场合的流行病。
诺如病毒是指诺瓦克病毒样病毒，该名称源自1968年在俄亥俄州诺瓦克一所学校的爆发。在1972年，在直肠拭子滤液在3组人志愿者中传代以后，通过免疫电子显微术，鉴别出了引起诺瓦克病毒病的病毒颗粒(Kapikian，A.Z.等人(1972)J.Virol.10：1075-1081)。在以后几年中，该病毒被称作小圆结构病毒(由于它的电子显微图像)、杯状病毒(因为它是杯状病毒科的一个成员)、和/或可能最常见的诺瓦克病毒-样病毒(在最初分离的株以后)。该病毒的俗名包括冬季呕吐病毒、胃感冒、食物中毒、和病毒性胃肠炎。尽管感染的结果通常不会危及生命，设备使用损失的成本和生产力损失是巨大的，且结果，用于治疗人类的诺如病毒感染的疗法是非常合乎需要的。
目前没有经批准的用于诺如病毒感染的药物治疗(http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/gastro/norovirus-qa.htm)，这可能至少部分地归因于缺乏可利用的细胞培养系统。近年来，已经为最初的诺瓦克病毒G-I株开发了复制子系统(Chang，K.O.等人(2006)Virology353：463-473)。诺如病毒复制子和丙型肝炎复制子都需要有功能的病毒解螺旋酶、蛋白酶、和聚合酶，以便进行复制子的复制。最近，已经报道了使用诺如病毒基因群I和II接种物的体外细胞培养感染性试验(Straub，T.M.等人(2007)Emerg.Infect.Dis.13(3)：396-403)。该试验在转壁生物反应器中进行，其中使用在微载体珠子上的小肠上皮细胞，且至少在最初看起来使用该系统难以筛选有意义数目的化合物。最后，感染性试验可以用于筛选进入抑制剂。其它研究组，诸如Ligocyte Pharmaceuticals，Inc.(http://www.ligocyte.com/)，已经聚焦于尝试开发针对诺如病毒的疫苗，但是，这些努力尚未取得成功，且可能证实是困难的，正如经常遇到的其中低复制酶精确度具有进化益处的病毒系统的情况。
丙型肝炎病毒(HCV)已经在全世界感染了超过1.8亿人。据估计，每年有300-400万新感染者，其中70％会发展成慢性肝炎。HCV会引起所有肝癌病例中的50-76％，以及发达国家中所有肝移植的2/3。标准治疗[聚乙二醇化的干扰素α+利巴韦林(一种核苷类似物)]仅在50-60％的患者中是有效的，且与显著的副作用有关。因此，迫切需要新的HCV药物。
丙型肝炎病毒基因组包含包封在核衣壳和脂质外膜中的正链RNA，且由9.6kb核糖核苷酸组成，其编码约3000个氨基酸的大多肽(Dymock等人Antiviral Chemistry&Chemotherapy 2000，11，79)。在成熟以后，该多肽被切成至少10个蛋白。这些蛋白之一(NS5B)具有聚合酶活性，并参与从用作模板的单链病毒RNA基因组合成双链RNA。选择性地抑制HCV复制的新颖抗病毒策略的发现，长期以来受到缺乏用于繁殖HCV的方便的细胞培养模型的阻碍。在1999年，通过建立HCV复制子系统(Bartenschlager，R.，Nat.Rev.Drug Discov.2002，1，911-916和Bartenschlager，R.，J.Hepatol. 2005，43，210-216)和在2005年，通过开发稳健的HCV细胞培养模型(Wakita，T.等人，Nat.Med.2005，11，791-6；Zhong，J.等人，Proc.Natl. Acad.Sci. U.S.A.2005，102，9294-9；Lindenbach，B.D.等人，Science2005，309，623-6)，已经首次克服了该阻碍。
通过NS5B蛋白的竞争抑制而操纵NS5B的聚合酶活性，可以阻止HCV复制。或者，链-终止子核苷类似物也可以掺入延长的RNA链中。近年来，几个专利申请(包括WO 99/43691、WO 01/32153、WO 01160315、WO 01179246、WO 01/90121、WO 01/92282、WO 02/48165、WO 02/18404、WO 02/094289、WO 02/057287、WO 02/100415(A2)、US 06/040890、WO02/057425、EP 1674104(A1)、EP 1706405(A1)、US 06/199783、WO 02/32920、US 04/6784166、WO 05/000864、WO 05/021568)已经描述了核苷类似物作为抗-HCV剂。
增殖障碍是主要的威胁生命的疾病之一，已经被充分地研究了数十年。现在，癌症在美国是第二大死亡原因，每年有超过500,000人死于该增殖障碍。肿瘤是细胞生长的失调的、紊乱的增殖。如果它具有侵袭力和转移的性质，则肿瘤是恶性的或癌性的。侵袭力表示肿瘤进入周围组织的趋向，导致穿透限定组织边界的基底层，由此经常进入身体的循环系统。转移表示肿瘤迁移到其它身体区域并建立远离最初出现部位的增殖区域的倾向。
没有在分子水平充分理解癌症。已知，细胞向致癌物(诸如某些病毒、某些化学试剂、或辐射)的暴露会导致DNA改变，所述改变会失活“抑制”基因或活化“癌基因”。抑制基因是生长调节基因，其在突变后，不再能控制细胞生长。癌基因最初是正常基因(称为原癌基因)，其通过突变或表达情况改变而变为转化基因。转化基因的产物引起不适当的细胞生长。通过基因的改变，20多种正常细胞基因可以变为癌基因。转化的细胞与正常细胞有很多不同，包括细胞形态、细胞与细胞的相互作用、膜组成、细胞骨架结构、蛋白分泌、基因表达和死亡(转化的细胞可以无限生长)。
机体的所有不同的细胞类型可以转变为良性或恶性肿瘤细胞。最常见的肿瘤部位是肺，然后是结肠直肠、乳房、前列腺、膀胱、胰腺，再就是卵巢。其它较普遍的癌症类型包括白血病，中枢神经系统癌症，包括脑瘤、黑素瘤、淋巴瘤、红白血病、子宫癌、及头颈癌。
现在癌症主要用如下三种治疗方法之一或其联合进行治疗：手术、放疗及化疗。手术包括大量除去患病组织。虽然有时手术可以有效地除去位于某些部位(如乳房、结肠和皮肤)的肿瘤，但是它不能用于治疗位于其它区域(如脊椎)的肿瘤，也不能用于治疗弥散性肿瘤病症如白血病。
化疗包括破坏细胞复制或细胞代谢。它最常用来治疗白血病及乳腺癌、肺癌、和睾丸癌。目前用于治疗癌症的化疗剂有5个主要的种类：天然产物及其衍生物；蒽环类；烷基化剂；抗增殖药(也称为抗代谢药)；及激素药。化疗剂经常称为抗肿瘤剂。
已确定若干合成核苷(诸如5-氟尿嘧啶)表现出抗癌活性。5-氟尿嘧啶已用于临床治疗恶性肿瘤，包括，例如，癌、肉瘤、皮肤癌、消化器官的癌症、及乳腺癌。但是，5-氟尿嘧啶会引起严重的不良反应，如恶心、脱发、腹泻、口炎、白细胞性血小板减少症、厌食、色素沉着和水肿。
尽管可以使用疫苗(Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.2004，41，391-427)，黄热病病毒(YFV)仍然是严重的人类健康问题，每年造成大约30,000例死亡。YFV是人类的最致命的病毒感染之一(Expert Rev.Vaccines 2005，4，553-574.)。在感染的个体中，大约15％会发展成严重的疾病，在那些个体中，病死率为20-50％。没有经批准的对YFV的治疗特异性的疗法可利用。治疗是抑制征状的(symptomatic-rest)流体，布洛芬、萘普生、醋氨酚、或对乙酰氨基酚可以减轻发热和疼痛的征状。应当避免阿司匹林。尽管该病毒是在非洲和南美洲地方性的，但是有在这些地区以外暴发YFV的可能性，已经报道了这样的输入性病例(J. Travel Med.2005，12(Suppl.1)，S3-S11)。
西尼罗病毒(WNV)来自黄病毒科，主要是蚊传播的疾病。在1937年在乌干达的西尼罗地区首次发现它。根据来自疾病控治和预防中心的报告，已经在非洲、中东、欧洲、海洋群落、西亚和中亚、以及北美发现了WNV。它在北美的首次出现开始于1999年纽约市大都市市区。它在北美是季节性流行的，通常在夏季爆发，并持续至秋季，呈现对环境健康的威胁。它的天然循环是鸟-蚊-鸟和哺乳动物。当蚊以受感染的鸟类为食时，它们(尤其是尖音库蚊种)变成受感染。当受感染的蚊叮咬时，它们然后将WNV传播给其它鸟类和哺乳动物，包括人。在人和马中，致命的脑炎是WNV感染的最严重的表现。WNV也可以在有些受感染的鸟类中造成死亡。没有WNV感染的特异性治疗。在具有更轻微征状的情况下，人会经历一过性的诸如发热和疼痛等征状，尽管甚至健康的人已经变得患病数周。在更严重的情况下，人通常需要到医院就诊，他们在医院可以接受支持性疗法。
登革热感染也来自黄病毒科，在新加坡是最重要的节肢动物传播的感染(Epidemiol News Bull 2006，32，62-6)。在全球，据估计每年有0.5-1亿例登革热(DF)和数十万例登革出血热(DHF)，平均死亡率为5％。许多患者会从登革热感染恢复，具有微小的或没有残余疾病。登革热感染通常是无症状的，但是可以呈现为典型的登革热、登革出血热或登革热休克综合征。甚至对于门诊患者，对于维持充足的水合的需要是非常重要的。通过静脉内补液治疗，可以有效地控制登革热感染，如果在早期确诊，病死率可以保持低于1％。为了控制疼痛和发热，应当给疑似具有登革热感染的患者施用醋氨酚制剂。阿司匹林和非类固醇类的抗炎药可能加重与某些登革热感染有关的出血倾向。但是，以前描述的登革热感染的有些表现包括肝功能衰竭(Dig Dis Sci 2005，50，1146-7)、脑病(J Trop Med Public Health 1987，18，398-406)、和格-巴二氏综合征(Intern Med 2006，45，563-4)。
已经发现，在细胞培养物中温育后，或在体内施用后，多种6-取代的-3’-叠氮基-2’，3’-二脱氧嘌呤核苷会被转化成对应的6-羟基-3’-叠氮基-2’，3’-二脱氧嘌呤核苷。我们还已经发现，对于多种其它的6-取代的嘌呤核苷也是如此。这些化合物起G或I类似物的前药的作用，非常类似于前药阿巴卡韦和它在体内转化成对应的G类似物卡波佛((-)-碳环的2’，3’-二脱氢-2’，3’-二脱氧鸟苷)的情况。该转化严重地限制了可以作为潜在抗病毒剂在体内形成的6-取代的嘌呤核苷三磷酸酯的种类。
鉴于下述事实，即获得性免疫缺陷综合征、艾滋病相关复合症、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2、登革热病毒、黄热病、癌症、和HBV在全世界已经达到令人担忧的水平，且对受累的患者具有重大的和在某些情况下悲惨的影响，仍然强烈地需要提供新的有效的药剂来治疗这些疾病，并且所述药剂对宿主具有低毒性。
提供新的抗病毒剂或化疗剂、包含这些药剂的组合物、和使用这些药剂的治疗方法(特别是用于治疗抗药的癌症或突变型病毒)，将是有利的。本发明提供了这样的药剂、组合物和方法。
发明内容
本发明提供了化合物、方法和组合物，它们用于治疗或预防宿主中的癌症或HIV-1、HIV-2、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2、登革热病毒、黄热病、或HBV感染。所述方法包括，施用治疗或预防有效量(以治疗或预防其感染)或足以减少癌症或HIV-1、HIV-2、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2登革热病毒、黄热病、或HBV感染的生物活性的量的至少一种本文所述的化合物。所述药物组合物包含与药学上可接受的载体或赋形剂相组合的一种或多种本文所述的化合物，用于治疗具有癌症或被HIV-1、HIV-2、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2、登革热病毒、黄热病、或HBV感染的宿主。所述制剂可以另外包含至少一种其它的治疗剂。另外，本发明包括制备这样的化合物的方法。
象丙型肝炎复制子一样，诺如病毒复制子需要有功能的病毒解螺旋酶、蛋白酶、和聚合酶，以便进行复制子的复制。所述复制子可以用于高处理量试验中，所述试验评价要筛选其活性的化合物是否会抑制诺如病毒解螺旋酶、蛋白酶、和/或聚合酶发挥功能的能力，这通过复制子复制的抑制来证实。
所述化合物是不同的6-取代的-2-氨基嘌呤核苷的单磷酸酯或单膦酸酯形式，或当在体内施用时也变成三磷酸化的单磷酸酯形式的类似物。我们已经非常令人惊奇地发现，这些核苷的单磷酸酯前药形式的制备保护6-位取代基免于转化成G类似物。通过制备单磷酸酯前药，我们已经开发了将核苷酸三磷酸酯递送给聚合酶或逆转录酶的方法，这在本发明之前是不可能的，或至少在治疗上有关的浓度是不可能的。本发明允许在体内制备新的和新颖的核苷酸三磷酸酯系列，和并用作抗病毒剂或抗癌剂。
本文所述的化合物包括β-D和β-L-6-取代的-2-氨基嘌呤核苷的单磷酸酯、膦酸酯、和其它类似物。在一个实施方案中，所述活性化合物具有式(I)：
或是其药学上可接受的盐或前药，其中：
i)当作为母体核苷施用时，R1是在体内被去除以形成OH的原子或基团，例如，卤素(F、Cl、Br、I)、OR’、N(R’)2、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、和NHCOOR’。
每个R’独立地是H、低级烷基(C1-C6)、低级卤代烷基(C1-C6)、低级烷氧基(C1-C6)、低级烯基(C2-C6)、低级炔基(C2-C6)、低级环烷基(C3-C6)芳基、杂芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基。
ii)W独立地是N、CH、CF、CCN、CC≡CH、或CC(O)N(R’)2；
iii)糖是通式(II)的核糖或修饰的核糖：
其中：
Y是O或S；
Z选自：CL2、CL2CL2、CL2OCL2、CL2SCL2、CL2O、OCL2和CL2NHCL2，其中L独立地选自：H、F、烷基、烯基、和炔基，其中烷基、烯基、和炔基可以各自任选地含有一个或多个杂原子；
A是O、S、CH2、CHF、CF2、C＝CH2、C＝CHF、或C＝CF2；
R4，、R5、R5′、R6、R6，、和R7’独立地选自：H、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、N3、C(O)OH、CN、C(O)NH2、C(S)NH2、C(O)OR、R、OR、SR、SSR、NHR、和NR2；
其中，对于其中糖是式(II)的式(I)，当A是O且R4，、R5、R5′、R6、R7’是H时，则R6，不能是N3；
其中，对于其中糖是式(II)的式(I)，当A是O或S时，则R7’不能是OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、OR、SR、SSR、NHR、和NR2；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基。
当在体内施用时，R2和R3理想地能够提供核苷单磷酸酯、单膦酸酯、硫代单膦酸酯、或硫代单磷酸酯。代表性的R2和R3独立地选自：
(a)OR8，其中R8是H、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-6卤代烷基、芳基、或杂芳基，包括、但不限于任选地被1-3个取代基取代的苯基或萘基，所述取代基独立地选自：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、(CH2)1-6CO2R9a、卤素、C1-6卤代烷基、-N(R9a)2、C1-6酰氨基、-NHSO2C1-6烷基、-SO2N(R9a)2、-SO2C1-6烷基、COR9b、硝基和氰基；
R9a独立地是H或C1-6烷基；
R9b是-OR9a或-N(R9a)2；
(b)
其中R10a和R10b是：
(i)独立地选自：H、C1-10烷基、-(CH2)rNR9a 2、C1-6羟基烷基、-CH2SH、-(CH2)2S(O)pMe、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、(1H-吲哚-3-基)甲基、(1H-咪唑-4-基)甲基、-(CH2)mCOR9b、芳基和芳基-C1-3烷基，所述芳基任选地被选自下述的基团取代：羟基、C1-100烷基、C1-6烷氧基、卤素、硝基、和氰基；
(ii)R10a是H，且R10b和R12一起是(CH2)2-4，以形成包含邻接的N和C原子的环；
(iii)R10a和R10b一起是(CH2)n，以形成环；
(iv)R10a和R10b都是C1-6烷基；或
(v)R10a是H，且R10b是H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3、CH2Ph、CH2-吲哚-3-基、-CH2CH2SCH3、CH2CO2H、CH2C(O)NH2、CH2CH2COOH、CH2CH2C(O)NH2、CH2CH2CH2CH2NH2-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2-咪唑-4-基、CH2OH、CH(OH)CH3、CH2((4’-OH)-Ph)、CH2SH、或低级环烷基；
p是0-2；
r是1-6；
n是4或5；
m是0-3；
R11是H、C1-10烷基、或被下述基团取代的C1-10烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(例如苯基)、杂芳基(例如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
R12是H、C1-3烷基，或者R10a或R10b和R12一起是(CH2)2-4，从而形成包含邻接的N和C原子的环；
(c)O连接的脂质(包括磷脂)、N或O连接的肽、O连接的胆固醇、或O连接的植物甾醇；
(d)R2和R3可以一起形成环
其中W2选自任选地被1-3个独立地选自下述的取代基取代的苯基或单环杂芳基：C1-6烷基、CF3、C2-6烯基、C1-6烷氧基、OR9c、CO2R9a、COR9a、卤素、C1-6卤代烷基、-N(R9a)2、C1-6酰氨基、CO2N(R9a)2、SR9a、-NHSO2C1-6烷基、-SO2N(R9a)2、-SO2C1-6烷基、COR9b、和氰基，且其中所述单环杂芳基和取代的单环杂芳基具有1-2个独立地选自N、O、和S的杂原子，条件是：
a)当存在两个杂原子且一个是O时，则另一个不能是O或S，
且
b)当存在两个杂原子且一个是S时，则另一个不能是O或S；
R9a独立地是H或C1-6烷基；
R9b是-OR9a或-N(R9a)2；
R9c是H或C1-6酰基；
(e)
其中R13选自H、C1-10烷基、任选地被下述基团取代的C1-10烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(例如苯基)、杂芳基(例如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
f)R2和R3可以一起形成环
其中R14是：(i)独立地选自：H、C1-10烷基、-(CH2)rNR2 9a、C1-6羟基烷基、-CH2SH、-(CH2)2S(O)pMe、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、(1H-吲哚-3-基)甲基、(1H-咪唑-4-基)甲基、-(CH2)mCOR9b、芳基和芳基-C1-3烷基或杂芳基和杂芳基-C1-3烷基，所述芳基和杂芳基任选地被选自下述的基团取代：羟基、C1-10烷基、C1-6烷氧基、卤素、硝基、和氰基；(ii)R14是H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3、CH2Ph、CH2-吲哚-3-基、-CH2CH2SCH3、CH2CO2H、CH2C(O)NH2、CH2CH2COOH、CH2CH2C(O)NH2、CH2CH2CH2CH2NH2、CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2-咪唑-4-基、CH2OH、CH(OH)CH3、CH2((4’-OH)-Ph)、CH2SH、或低级环烷基；
p是0-2；
r是1-6；
m是0-3；
Q1是NR9a、O、或S
Q2是C1-10烷基、C1-6羟基烷基、芳基和芳基-C1-3烷基、杂芳基和杂芳基-C1-3烷基，所述芳基和杂芳基任选地被选自下述的基团取代：羟基、C1-10烷基、C1-6烷氧基、氟代、和氯代；
R11是H、C1-10烷基、任选地被下述基团取代的C1-10烷基：
低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(例如苯基)、杂芳基(例如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
R12是H或C1-3烷基，或者R14b和R12一起是(CH2)2-4，从而形成包含邻接的N和C原子的环；
iv)或者，糖是通式(III)的修饰的核糖：
其中：
A、R2、R3、Y、Z、R4、R5′、R6′、和R7’如上面所定义；
其中，对于其中糖是式(III)的式(I)，当A是O或S时，则R7’不能是OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、OR、SR、SSR、NHR、和NR2；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基。
v)或者，糖是通式(IV)、(V)、(VI)、和(VII)的二氧戊环或氧硫杂环戊烷：
其中：
V是S或Se；
R2、R3、Y、和Z如上面所定义；
vi)或者，糖是通式(VIII)的膦酰基甲氧基烷基：
其中：
R2、R3、和Y如上面所定义；
R15选自：烷基(包括但不限于C1-C6)、烯基(包括但不限于C2-C6)、和炔基(包括但不限于C2-C6)、环烷基(包括但不限于C3-C8)、芳基(包括但不限于C6-C10)、杂芳基(包括但不限于C6-C10)、芳基烷基、和烷基芳基；
vii)或者，糖具有通式(IX)或(X)：
其中：
R2、R3、和Y如上面所定义；
Y2是O、S、Se NR；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基；
R16和R17被定义为H、CH3、CH2OR18；
R18是H或低级酰基(C1-C6)；
viii)或者，糖是通式(XI)的修饰的核糖：
其中：
R2、R3、和Y如上面所定义；
R4’、R5、R5′、R6、和R6′如上面所定义；
R19是H、F、Cl、Br、I、N3、C(O)OH、CN、C(O)NH2、C(S)NH2、C(O)OR、R
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基。
在本发明的一个实施方案中，所述活性化合物具有式(I)，其中R6’选自：H、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、C(O)OH、CN、C(O)NH2、C(S)NH2、C(O)OR、R、OR、SR、SSR、NHR、和NR2；
在本发明的另一个实施方案中，所述活性化合物具有式(XII)、(XIII)、或(XIV)：
或是其药学上可接受的盐或前药，其中：
R4，、R5、R5′、R6、Y、A、和R7′如上面所定义；
R20是低级烷基(C1-C6烷基)；
M是O、S、或NR；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基；
碱基选自：
在本发明的另一个实施方案中，所述活性化合物具有式(XV)或(XVI)：
或是其药学上可接受的盐或前药，其中：
R4，、R5、R5′、R6、Y、A、R7′、R20和碱基如上面所定义；
R21是H、C1-10烷基、任选地被下述基团取代的C1-10烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(诸如苯基)、杂芳基(诸如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；
其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
R22是H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3、CH2Ph、CH2-吲哚-3-基、-CH2CH2SCH3、CH2CO2H、CH2C(O)NH2、CH2CH2COOH 、CH2CH2C(O)NH2、CH2CH2CH2CH2NH2、CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2-咪唑-4-基、CH2OH、CH(OH)CH3、CH2((4’-OH)-Ph)、CH2SH、或低级环烷基；
在本发明的另一个实施方案中，所述活性化合物具有式(XVII)或(XVIII)：
其中：
R4，、R5、R5′、R6、Y、M、R7′、R20、R21、R22、和碱基如上面所定义；
本文所述的化合物可以是β-L-或β-D-构型的形式，或其混合物，包括其外消旋混合物。
可以如下制备化合物，例如，通过制备5’-OH类似物，然后将它们转化成单磷酸酯、膦酸酯、或其它类似物。
另外，本文所述的化合物是HIV-1、HIV-2、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2、登革热病毒、黄热病、癌症、和/或HBV的抑制剂。因此，这些化合物也可以用于治疗被HIV-1、HIV-2、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2、登革热病毒、黄热病、癌症、和/或HBV共感染的患者。
附图说明
图1：在50μM RS-457的人外周血单核(PBM)细胞中温育4小时以后形成的核苷酸的LC/MS分析。
图2：在50μM RS-527的PBM细胞中温育4小时以后形成的核苷酸的LC/MS分析。
图3：在50μM RS-464的PBM细胞中温育4小时以后形成的核苷酸的LC/MS分析。
图4：在50μM RS-512的PBM细胞中温育4小时以后形成的核苷酸的LC/MS分析。
图5：在50μM RS-506的PBM细胞中温育4小时以后形成的核苷酸的LC/MS分析。
图6：在50μM RS-667的PBM细胞中温育4小时以后形成的核苷酸的LC/MS分析。
图7：用50μM的药物(化合物6415或RFS-457，在本文中也称作AZG)温育4小时以后，MT-2和PBM细胞中的AZG-TP水平。
图8：在50μM RS-788的PBM细胞中温育4小时以后形成的核苷酸的LC/MS分析。
图9：在用脱氧助间型霉素(DCF)预处理的50μM RS-788的PBM细胞中温育4小时以后形成的核苷酸的LC/MS分析。
图10：在50μM(-)-β-D-2，6-二氨基嘌呤二氧戊环(DAPD)的PBM细胞中温育4小时以后形成的核苷酸的LC/MS分析。
图11：在50μM RS-864的PBM细胞中温育4小时以后形成的核苷酸的LC/MS分析。
图12：是xxLAI病毒的基因型的图示。
具体实施方式
本文所述的6-取代的-2-氨基嘌呤核苷酸单磷酸酯前药表现出对HIV、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2、登革热病毒、黄热病、癌症、和HBV的抑制活性。因此，所述化合物可以用于治疗或预防宿主中的病毒感染，或降低病毒的生物活性。所述宿主可以是被HIV-1、HIV-2、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2、登革热病毒、黄热病、癌症、和/或HBV感染的哺乳动物，尤其是人。所述方法包括，施用有效量的一种或多种本文所述的6-取代的-2-氨基嘌呤核苷酸单磷酸酯前药。
也公开了药物制剂，其包含与药学上可接受的载体或赋形剂相组合的一种或多种本文所述的化合物。在一个实施方案中，所述制剂包含至少一种本文所述的化合物和至少一种其它的治疗剂。
参考下面的定义，将会更好地理解本发明：
I.定义
本文使用的术语“独立地”表示，独立地使用的变量在每次使用时都独立地变化。因而，在化合物如R”XYR”(其中R”“独立地是碳或氮”)中，两个R”可以同时为碳，两个R”可以同时为氮，或者一个R”为碳而另一个R”为氮。
本文使用的术语“对映异构纯的”表示这样的核苷酸组合物，其包含该核苷酸的至少大约95％、和优选大约97％、98％、99％或100％的单一对映异构体。
本文使用的术语“基本上不含有”或“基本上不存在”表示这样的核苷酸组合物，其包含至少85-90％(按重量计算)、优选95％-98％(按重量计算)、和甚至更优选99％-100％(按重量计算)的该核苷酸的指定对映异构体。在一个优选的实施方案中，本文所述的化合物基本上不含有对映异构体。
类似地，术语“分离的”表示这样的核苷酸组合物，其包含至少85-90％(按重量计算)、优选95％-98％(按重量计算)、和甚至更优选99％-100％(按重量计算)的该核苷酸，余量包含其它化学物质或对映异构体。
除非另外指出，本文使用的术语“烷基”表示饱和的直链、支链、或环状的伯、仲、或叔烃，包括取代的和未取代的烷基。所述烷基可任选被不会另外对反应产生干扰或能改变过程的任何部分所取代，所述部分包括但不限于卤素、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、芳基、酰氧基、氨基、酰氨基、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫醇、亚胺、磺酰基、硫烷基、亚磺酰基、氨磺酰基、酯、羧酸、酰胺、膦酰基、氧膦基、磷酰基、膦、硫代酸酯、硫醚、酰卤、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、膦酸、膦酸酯，所述部分是未保护形式或根据需要加以保护，如本领域技术人员已知的，例如如在Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，第2版，1991(该文通过引用并入)中所教导的。具体包括CF3和CH2CF3。
在本文中，不论何时使用术语C(烷基范围)，该术语都独立地包括该类中的每一个成员，如同具体地且单独地列出一样。术语”烷基”包括C1-22烷基部分，且术语“低级烷基”包括C1-6烷基部分。本领域普通技术人员会理解，有关的烷基是通过将词尾“烷”换成词尾“基”来命名。
术语“烯基”表示包含一个或多个双键的直链或支链不饱和烃基。本文所述的烯基可任选被不会对反应进程产生不利影响的任何部分取代，所述部分包括但不限于关于烷基部分上的取代基所述的那些。烯基的非限制性实例包括亚乙基、甲基亚乙基、亚异丙基、1，2-乙烷-二基、1，1-乙烷-二基、1，3-丙烷-二基、1，2-丙烷-二基、1，3-丁烷-二基和1，4-丁烷-二基。
术语“炔基”表示包含一个或多个三键的直链或支链不饱和无环烃基。所述炔基可任选被不会对反应进程产生不利影响的任何部分取代，所述部分包括但不限于上面关于烷基部分所述的那些。合适的炔基的非限制性实例包括乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、戊炔-2-基、4-甲氧基戊炔-2-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-1-基、己炔-2-基、和己炔-3-基、3，3-二甲基丁炔-1-基。
术语“烷基氨基”或“芳基氨基”分别表示具有一个或两个烷基或芳基取代基的氨基。
除另有说明外，本文使用的术语“保护的”表示这样的基团，其为了防止其进一步反应或其它目的而加到氧、氮、或磷原子上。多种氧和氮保护基都是有机合成领域的技术人员已知的，并描述在例如，Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis，同上。
术语“芳基”，不论是单独使用还是组合使用，表示含有一个、两个或三个环的碳环芳族系统，其中这样的环可以以单键延伸的方式(pendentmanner)连接在一起，或可以稠合在一起。芳基的非限制性实例包括苯基、联苯基、或萘基，或从芳环中去掉氢之后剩下的其它芳族基团。术语芳基包括取代的和未取代的部分。所述芳基可任选被不会对进程产生不利影响的任何部分取代，所述部分包括但不限于上面关于烷基部分所述的那些。取代的芳基的非限制性实例包括杂芳基氨基、N-芳基-N-烷基氨基、N-杂芳基氨基-N-烷基氨基、杂芳烷氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳硫基、单芳基氨基磺酰基、芳基磺酰氨基、二芳基氨基磺酰基、单芳基氨基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、杂芳硫基、杂芳基亚磺酰基、杂芳基磺酰基、芳酰基、杂芳酰基、芳烷酰基、杂芳烷酰基、羟基芳烷基、羟基杂芳烷基、卤代烷氧基烷基、芳基、芳烷基、芳氧基、芳烷氧基、芳氧基烷基、饱和杂环基、部分饱和的杂环基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳氧基烷基、芳烷基、杂芳基烷基、芳基烯基、和杂芳基烯基、碳芳烷氧基(carboaralkoxy)。
术语“烷芳基”或“烷基芳基”表示具有芳基取代基的烷基。术语“芳烷基”或“芳基烷基”表示具有烷基取代基的芳基。
本文使用的术语“卤素”包括氯、溴、碘和氟。
术语“酰基”表示羧酸酯，其中酯基的非羰基部分选自直链、支链、或环状的烷基或低级烷基，烷氧基烷基包括但不限于甲氧基甲基，芳烷基包括但不限于苄基，芳氧基烷基如苯氧基甲基，芳基包括但不限于任选被下述基团取代的苯基：卤素(F、Cl、Br、I)、烷基(包括但不限于C1、C2、C3、和C4)或烷氧基(包括但不限于C1、C2、C3和C4)、磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基(包括但不限于甲磺酰基)、一、二或三磷酸酯、三苯甲基或单甲氧基三苯甲基、取代苄基、三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基任选地包括苯基。术语“低级酰基”表示其中的非羰基部分为低级烷基的酰基。
术语“烷氧基”和“烷氧基烷基”包括具有烷基部分的直链或支链含氧基基团，例如甲氧基。术语“烷氧基烷基”还包括具有一个或多个与其相连的烷氧基的烷基，从而形成单烷氧基烷基和二烷氧基烷基。“烷氧基”可进一步被一个或多个卤原子(如氟、氯或溴)取代，以形成“卤代烷氧基”。此类基团的实例包括氟甲氧基、氯甲氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟乙氧基、氟乙氧基、四氟乙氧基、五氟乙氧基、和氟丙氧基。
术语“烷基氨基”代表氨基上分别连有一个或两个烷基的“单烷基氨基”和“二烷基氨基”。术语芳基氨基代表氨基上分别连有一个或两个芳基的“单芳基氨基”和“二芳基氨基”。术语“芳烷基氨基”包括连接在氨基上的芳烷基。术语芳烷基氨基代表氨基上分别连有一个或两个芳烷基的“单芳烷基氨基”和“二芳烷基氨基”。术语芳烷基氨基进一步代表氨基上连接有一个芳烷基和一个烷基的“单芳烷基单烷基氨基”。
本文使用的术语“杂原子”表示氧、硫、氮和磷。
本文使用的术语“杂芳基”或“杂芳族”表示芳族环中包括至少一个硫、氧、氮或磷的芳族。
术语“杂环的”、“杂环基”、和“环杂烷基”表示环中含有例如3-10个原子的非芳族环状基团，其中在环中存在至少一个杂原子，诸如氧、硫、氮、或磷。
杂芳基和杂环基的非限制性实例包括：呋喃基(furyl)、呋喃基(furanyl)、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、噁唑基、噻唑基、异噻唑基、1，2，4-噻二唑基、异噁唑基、吡咯基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、噻吩、呋喃、吡咯、异吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、嘧啶或哒嗪、以及喋啶基、氮丙啶、噻唑、异噻唑、1，2，3-噁二唑、噻嗪、吡啶、吡嗪、哌嗪、吡咯烷、氧氮杂环丙烷、吩嗪、吩噻嗪、吗啉基、吡唑基、哒嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、喋啶基、5-氮杂胞啶基、5-氮杂尿嘧啶基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-苄基嘌呤、N6-卤代嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙炔基嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-羟基烷基嘌呤、N6-硫烷基嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮杂嘧啶、2-巯基嘧啶、尿嘧啶、N5-烷基嘧啶、N5-苄基嘧啶、N5-卤代嘧啶、N5-乙烯基嘧啶、N5-乙炔基嘧啶、N5-酰基嘧啶、N5-羟烷基嘌呤、和N6-硫烷基嘌呤、以及异噁唑基。杂芳基可如上文关于芳基所述任选被取代。杂环基或杂芳基可任选被一个或多个选自以下的取代基所取代：卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、羟基、羧基衍生物、酰氨基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基。杂芳基视需要可被部分或全部氢化。作为非限制性实例，可以使用二氢吡啶替代吡啶。如果需要或必要的话，可以保护杂环基或杂芳基中的功能性氧和氮基团。适宜的保护基是本领域技术人员公知的，包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基或取代的三苯甲基、烷基、酰基(如乙酰基和丙酰基)、甲磺酰基、和对-甲苯磺酰基。杂环基或杂芳基可以被不会对反应产生不利影响的任何部分取代，所述部分包括但不限于上文关于芳基所述的那些。
本文使用的术语“宿主”表示病毒可以在其内复制的单细胞或多细胞生物体，包括但不限于细胞系和动物，优选人类。或者，宿主可以携带病毒基因组的一部分，其复制或功能可以被本发明化合物改变。术语宿主具体指受感染的细胞，用全部或部分病毒基因组转染的细胞以及动物，特别是灵长类动物(包括但不限于黑猩猩)和人类。在本发明的大多数动物应用中，宿主是人患者。但在某些适应征中，本发明明确地考虑了兽医领域(如用于治疗黑猩猩)。
术语“肽”表示含有2-100个氨基酸的不同的天然的或合成的化合物，所述氨基酸通过一个氨基酸的羧基连接到另一个氨基酸的氨基上。
术语“药学上可接受的盐或前药”在本说明书中用于描述核苷酸化合物的任何药学上可接受的形式(例如酯，磷酸酯，酯或相关基团的盐)，经施用给患者，其会提供核苷酸单磷酸酯化合物。药学上可接受的盐包括源自药学上可接受的无机或有机碱和酸的盐。除了源自药物领域公知的多种其它酸的盐外，合适的盐包括源自碱金属(如钾和钠)、碱土金属(如钙和镁)的盐。药学上可接受的前药表示在宿主中被代谢(例如水解或氧化)以形成本发明化合物的化合物。前药的典型实例包括这样的化合物，其具有在活性化合物的官能团上的生物不稳定的保护基。前药包括这样的化合物，其可以被氧化、还原、胺化、脱胺化、羟基化、脱羟基化、水解、脱水、烷基化、脱烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化、或去磷酸化，以生成活性化合物。本发明化合物的前药形式可以具有抗病毒活性，可以被代谢以形成表现出这种活性的化合物，或二者兼有。
前药也包括公开的核苷的氨基酸酯(参见，例如，欧洲专利说明书号99493，其内容通过引用并入，描述了阿昔洛韦的氨基酸酯(具体为甘氨酸和丙氨酸酯)，这种酯与阿昔洛韦本身相比显示出提高的水溶性，以及美国专利号4,957,924(Beauchamp)，该专利公开了阿昔洛韦的缬氨酸酯(其特征是α-碳原子的邻位上的侧链支化)，与丙氨酸和甘氨酸酯相比，在口服给药后，这种酯显示出提高的生物利用度)。制备这种氨基酸酯的方法公开在美国专利号4,957,924(Beauchamp)中，其内容通过引用并入。作为使用缬氨酸本身的替代方案，可以使用该氨基酸的功能等效物(例如酰卤(如酰氯)或酸酐)。在这种情形下，为避免不希望的副反应，可以有利地使用氨基被保护的衍生物。
II.活性化合物
在本发明的一个实施方案中，所述活性化合物具有式(I)：
或是其药学上可接受的盐或前药，其中：
(iii)当作为母体核苷施用时，R1是在体内被去除以形成OH的原子或基团，例如，卤素(F、Cl、Br、I)、OR’、N(R’)2、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、和NHCOOR’。
每个R’独立地是H、低级烷基(C1-C6)、低级卤代烷基(C1-C6)、
低级烷氧基(C1-C6)、低级烯基(C2-C6)、低级炔基(C2-C6)、低级环烷基(C3-C6)芳基、杂芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基。
iv)W独立地是N、CH、CF、CCN、CC≡CH、或CC(O)N(R’)2；
ix)糖是通式(II)的核糖或修饰的核糖：
其中：
Y是O或S；
Z选自：CL2、CL2CL2、CL2OCL2、CL2SCL2、CL2O、OCL2和CL2NHCL2，其中L独立地选自：H、F、烷基、烯基、和炔基，其中烷基、烯基、和炔基可以各自任选地含有一个或多个杂原子；
A是O、S、CH2、CHF、CF2、C＝CH2、C＝CHF、或C＝CF2；
R4，、R5、R5′、R6、R6，、和R7’独立地选自：H、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、N3、C(O)OH、CN、C(O)NH2、C(S)NH2、C(O)OR、R、OR、SR、SSR、NHR、和NR2；
其中，对于其中糖是式(II)的式(I)，当A是O且R4，、R5、R5′、R6、R7’是H时，则R6’不能是N3；
其中，对于其中糖是式(II)的式(I)，当A是O或S时，则R7’不能是OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、OR、SR、SSR、NHR、和NR2；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基。
当在体内施用时，R2和R3理想地能够提供核苷单磷酸酯、单膦酸酯、硫代单膦酸酯、或硫代单磷酸酯。代表性的R2和R3独立地选自：
(a)OR8，其中R8是H、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-6卤代烷基、芳基、或杂芳基，包括、但不限于任选地被1-3个取代基取代的苯基或萘基，所述取代基独立地选自：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、(CH2)1-6CO2R9a、卤素、C1-6卤代烷基、-N(R9a)2、C1-6酰氨基、-NHSO2C1-6烷基、-SO2N(R9a)2、-SO2C1-6烷基、COR9b、硝基和氰基；
R9a独立地是H或C1-6烷基；
R9b是-OR9a或-N(R9a)2；
(b)
其中R10a和R10b是：
(i)独立地选自：H、C1-10烷基、-(CH2)rNR9a 2、C1-6羟基烷基、-CH2SH、-(CH2)2S(O)pMe、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、(1H-吲哚-3-基)甲基、(1H-咪唑-4-基)甲基、-(CH2)mCOR9b、芳基和芳基-C1-3烷基，所述芳基任选地被选自下述的基团取代：羟基、C1-10烷基、C1-6烷氧基、卤素、硝基、和氰基；
(ii)R10a是H，且R10b和R12一起是(CH2)2-4，以形成包含邻接的N和C原子的环；
(iii)R10a和R10b一起是(CH2)n，以形成环；
(iv)R10a和R10b都是C1-6烷基；或
(v)R10a是H，且R10b是H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3、CH2Ph、CH2-吲哚-3-基、-CH2CH2SCH3、CH2CO2H、CH2C(O)NH2、CH2CH2COOH、CH2CH2C(O)NH2、CH2CH2CH2CH2NH2-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2-咪唑-4-基、CH2OH、CH(OH)CH3、CH2((4’-OH)-Ph)、CH2SH、或低级环烷基；
p是0-2；
r是1-6；
n是4或5；
m是0-3；
R11是H、C1-10烷基、或被下述基团取代的C1-10烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(例如苯基)、杂芳基(例如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
R12是H、C1-3烷基，或者R10a或R10b和R12一起是(CH2)2-4，从而形成包含邻接的N和C原子的环；
(c)O连接的脂质(包括磷脂)、N或O连接的肽、O连接的胆固醇、或O连接的植物甾醇；
(d)R2和R3可以一起形成环
其中W2选自任选地被1-3个独立地选自下述的取代基取代的苯基或单环杂芳基：C1-6烷基、CF3、C2-6烯基、C1-6烷氧基、OR9c、CO2R9a、COR9a、卤素、C1-6卤代烷基、-N(R9a)2、C1-6酰氨基、CO2N(R9a)2、SR9a、-NHSO2C1-6烷基、-SO2N(R9a)2、-SO2C1-6烷基、COR9b、和氰基，且其中所述单环杂芳基和取代的单环杂芳基具有1-2个独立地选自N、O、和S的杂原子，条件是：
a)当存在两个杂原子且一个是O时，则另一个不能是O或S，
且
b)当存在两个杂原子且一个是S时，则另一个不能是O或S；
R9a独立地是H或C1-6烷基；
R9b是-OR9a或-N(R9a)2；
R9c是H或C1-6酰基；
(e)
其中R13选自H、C1-10烷基、任选地被下述基团取代的C1-10烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(例如苯基)、杂芳基(例如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
f)R2和R3可以一起形成环
其中R14是：(i)独立地选自：H、C1-10烷基、-(CH2)rNR2 9a、C1-6羟基烷基、-CH2SH、-(CH2)2S(O)pMe、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、(1H-吲哚-3-基)甲基、(1H-咪唑-4-基)甲基、-(CH2)mCOR9b、芳基和芳基-C1-3烷基或杂芳基和杂芳基-C1-3烷基，所述芳基和杂芳基任选地被选自下述的基团取代：羟基、C1-10烷基、C1-6烷氧基、卤素、硝基、和氰基；(ii)R14是H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3、CH2Ph、CH2-吲哚-3-基、-CH2CH2SCH3、CH2CO2H、CH2C(O)NH2、CH2CH2COOH、CH2CH2C(O)NH2、CH2CH2CH2CH2NH2、CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2-咪唑-4-基、CH2OH、CH(OH)CH3、CH2((4’-OH)-Ph)、CH2SH、或低级环烷基；
p是0-2；
r是1-6；
m是0-3；
Q1是NR9a、O、或S
Q2是C1-10烷基、C1-6羟基烷基、芳基和芳基-C1-3烷基、杂芳基和杂芳基-C1-3烷基，所述芳基和杂芳基任选地被选自下述的基团取代：羟基、C1-10烷基、C1-6烷氧基、氟代、和氯代；
R11是H、C1-10烷基、任选地被下述基团取代的C1-10烷基：
低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(例如苯基)、杂芳基(例如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
R12是H或C1-3烷基，或者R14b和R12一起是(CH2)2-4，从而形成包含邻接的N和C原子的环；
x)或者，糖是通式(III)的修饰的核糖：
(III)
其中：
A、R2、R3、Y、Z、R4，、R5′、R6′、和R7’如上面所定义；
其中，对于其中糖是式(III)的式(I)，当A是O或S时，则R7’不能是OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、OR、SR、SSR、NHR、和NR2；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基。
xi)或者，糖是通式(IV)、(V)、(VI)、和(VII)的二氧戊环或氧硫杂环戊烷：
其中：
V是S或Se；
R2、R3、Y、和Z如上面所定义；
xii)或者，糖是通式(VIII)的膦酰基甲氧基烷基：
其中：
R2、R3、和Y如上面所定义；
R15选自：烷基(包括但不限于C1-C6)、烯基(包括但不限于C2-C6)、和炔基(包括但不限于C2-C6)、环烷基(包括但不限于C3-C8)、芳基(包括但不限于C6-C10)、杂芳基(包括但不限于C6-C10)、芳基烷基、和烷基芳基；
xiii)或者，糖具有通式(IX)或(X)：
其中：
R2、R3、和Y如上面所定义；
Y2是O、S、Se NR；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基；
R16和R17被定义为H、CH3、CH2OR18；
R18是H或低级酰基(C1-C6)；
xiv)或者，糖是通式(XI)的修饰的核糖：
其中：
R2、R3、和Y如上面所定义；
R4，、R5、R5′、R6、和R6′如上面所定义；
R19是H、F、Cl、Br、I、N3、C(O)OH、CN、C(O)NH2、C(S)NH2、C(O)OR、R
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基。
在本发明的一个实施方案中，所述活性化合物具有式(I)，其中R6，选自：H、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、C(O)OH、CN、C(O)NH2、C(S)NH2、C(O)OR、R、OR、SR、SSR、NHR、和NR2；
在本发明的另一个实施方案中，所述活性化合物具有式(XII)、(XIII)、或(XIV)：
或是其药学上可接受的盐或前药，其中：
R4’、R5、R5′、R6、Y、A、和R7′如上面所定义；
R20是低级烷基(C1-C6烷基)；
M是O、S、或NR；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基 )、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基；
碱基选自：
在本发明的另一个实施方案中，所述活性化合物具有式(XV)或(XVI)：
或是其药学上可接受的盐或前药，其中：
R4，、R5、R5′、R6、Y、A、R7′、R20、和碱基如上面所定义；
R21是H、C1-10烷基、任选地被下述基团取代的C1-10烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(诸如苯基)、杂芳基(诸如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；
其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
R22是H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3、CH2Ph、CH2-吲哚-3-基、-CH2CH2SCH3、CH2CO2H、CH2C(O)NH2、CH2CH2COOH 、CH2CH2C(O)NH2、CH2CH2CH2CH2NH2、CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2-咪唑-4-基、CH2OH、CH(OH)CH3、CH2((4’-OH)-Ph)、CH2SH、或低级环烷基；
在本发明的另一个实施方案中，所述活性化合物具有式(XVII)或(XVIII)：
或是其药学上可接受的盐或前药，其中：
R4，、R5、R5′、R6、Y、M、R7′、R20、R21、R22、和碱基如上面所定义；
本文所述的化合物可以是β-L-或β-D-构型的形式，或其混合物，包括其外消旋混合物。
III.立体异构现象和多态性
本文所述的化合物可以具有不对称中心，且可以作为外消旋物、外消旋混合物、单一的非对映异构体或对映异构体存在，所有异构形式都包括在本发明之内。具有手性中心的本发明化合物可以以旋光的和外消旋的形式存在和分离。某些化合物可以呈现出多态性。本发明包括本发明化合物的外消旋的、旋光的、多晶型的、或立体异构的形式，或它们的混合物，它们具有本文所述的有用性质。旋光形式可以如下制备：例如，通过用重结晶技术拆分外消旋形式，通过从旋光原料合成，通过手性合成，或通过使用手性固定相的色谱分离，或通过酶促拆分。可以纯化各个核苷，然后衍生化核苷，以形成本文所述的化合物，或者纯化核苷酸本身。
使用本领域已知的任意方法，可以制备化合物的旋光形式，所述方法包括但不限于：通过用重结晶技术拆分外消旋形式，通过从旋光原料合成，通过手性合成，或通过使用手性固定相的色谱分离。
获得旋光物质的方法的实例至少包括以下方法。
i)晶体物理分离：一种人工分离肉眼可见的各对映异构体晶体的技术。如果存在各个对映异构体的晶体(即物料是外消旋混合物)，并且各晶体用肉眼看是不同的，则可以采用这种技术；
ii)同步结晶：一种从外消旋物的溶液中分别结晶单一对映异构体的技术，该技术只有当外消旋物为固态外消旋混合物时才可行；
iii)酶法拆分：一种利用对映异构体与酶反应的速率不同而部分或完全分离外消旋物的技术；
iv)酶促不对称合成：一种至少一个合成步骤采用酶反应以获得对映异构纯的或富集的所需对映异构体的合成前体的合成技术；
v)化学不对称合成：一种在能使产物产生不对称性(即手性)的条件下由非手性前体合成所需对映异构体的合成技术，该技术可以使用手性催化剂或手性助剂来实现；
vi)非对映异构体分离：一种使外消旋化合物与对映异构纯的试剂(手性助剂)反应将各个对映异构体转化成非对映异构体的技术。然后利用它们此时更加不同的结构差异通过色谱法或结晶分离所得非对映异构体，之后去除手性助剂，以得到所需对映异构体；
vii)一级和二级不对称转换：通过该技术，平衡由外消旋物得到的非对映异构体，从而优选产生所需对映异构体的非对映异构体溶液，或者所需对映异构体的非对映异构体优先结晶扰乱所述平衡，以致最后基本上使所有的原料都转化成所需对映异构体的非对映异构体结晶。随后从非对映异构体中释放出所需对映异构体；
viii)动力学拆分：该技术表示利用各对映异构体与手性、非外消旋试剂或催化剂在动力学条件下的不同反应速度而实现部分或完全拆分外消旋物(或进一步拆分部分地拆分的化合物)；
ix)以非外消旋前体为原料的对映专一性合成：一种从非手性原料获得所需对映异构体的合成技术，在合成过程中不危及或者仅在很小程度上危及立体化学完整性；
x)手性液相色谱法：一种利用外消旋物的对映异构体与固定相的不同相互作用(包括但不限于通过手性HPLC)在液体流动相中分离它们的技术。固定相可以由手性材料制成，或者流动相可以含有另外的手性材料以诱导不同的相互作用；
xi)手性气相色谱法：通过该技术，挥发外消旋物，利用各对映异构体在气态流动相中与含有固定的非外消旋手性吸附相的柱的不同相互作用，分离各对映异构体；
xii)手性溶剂萃取：一种利用一种对映异构体优先溶解于特定手性溶剂来分离各对映异构体的技术；
xiii)透过手性膜迁移：一种使外消旋物与薄膜隔板(barrier)接触的技术。这种隔板通常将两种互溶液体分隔开，其中一种含有外消旋物，驱动力(如浓度或压力的差异)造成选择性穿越膜隔板的迁移。由于膜的非外消旋的手性性质，只允许外消旋物的一种对映异构体透过，从而实现分离。
在一个实施方案中使用手性色谱法，包括但不限于模拟移动床色谱法(simulated moving bed chromatography)。可以从市场上购得各种各样的手性固定相。
IV.核苷酸盐或前药制剂
在化合物具有足够强的碱性或酸性能形成稳定的无毒酸或碱盐的情况下，所述化合物宜以药学上可接受的盐形式给药。药学上可接受的盐的实例是与能提供生理上可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油基磷酸盐。也可以形成合适的无机酸盐，包括但不限于硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。
药学上可接受的盐可以使用本领域公知的标准方法制得，例如通过使具有足够碱性的化合物(如胺)与能提供生理上可接受的阴离子的适宜酸反应。也可以制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。
为了额外地增加核苷酸单磷酸酯的活性、生物利用度、稳定性或以其它方式改变其性质，可以施用本文所述的核苷酸前药。
许多核苷酸前药配体是已知的。一般而言，对核苷的单磷酸酯或其它类似物进行烷基化、酰基化或其它亲脂修饰，会增加核苷酸的稳定性。
能够替换单磷酸酯部分上的一个或多个氢的取代基的实例是：烷基，芳基，甾类，碳水化合物(包括但不限于糖)，1，2-二酰基甘油和醇。许多记载在R.Jones&N.Bischofberger，Antiviral Research，1995，27，1-17和S.J.Hecker&M.D.Erion，J.Med. Chem.，2008，51，2328-2345中。这些中的任一种都可以与本文公开的核苷联用，以达到预期效果。
活性核苷酸也可以提供成5’-磷酸醚脂质，如在下述参考文献中公开的，它们通过引用并入：Kucera，L.S.，N.Iyer，E.Leake，A.Raben，ModestE.K.，D.L.W.，和C.Piantadosi，“Novel membrane-interactive ether lipidanalogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virusformation，”AIDS Res.Hum.Retroviruses，1990，6，491-501；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，S.L.Morris-Natschke，K.L.Meyer，F. Gumus，J.R.Surles，K.S.Ishaq，L.S.Kucera，N.Iyer，C.A.Wallen，S.Piantadosi，和E.J.Modest，“Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleosideconjugates for anti-HIV activity，”J.Med. Chem.，1991，34，1408-14；Hosteller，K.Y.，D.D.Richman，D.A.Carson，L.M.Stuhmiller.G.M.T.vanWijk，和H.van den Bosch，“Greatly enhanced inhibition of humanimmunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by3’-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol，a lipid prodrug of3，-deoxythymidine，”Antimicrob.Agents Chemother.，1992，36，2025-29；Hostetler，K.Y.，L.M.Stuhmiller，H.B.Lenting，H.van den Bosch，和D.D.Richman，“Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs ofazidothymidine and other antiviral nucleosides.”J.Biol.Chem.，1990，265，61127。
公开了可以共价地掺入本文所述核苷酸的核苷(优选在R2和/或R3位)中的适宜亲脂取代基或亲脂制品的美国专利的非限制性实例包括：美国专利号5,149,794(Yatvin等人)；5,194,654(Hostetler等人)，5,223,263(Hostetler等人)；5,256,641(Yatvin等人)；5,411,947(Hostetler等人)；5,463,092(Hostetler等人)；5,543,389(Yatvin等人)；5,543,390(Yatvin等人)；5,543,391(Yatvin等人)；和5,554,728(Basava等人)，它们都通过引用并入。公开了可以连接到本发明的核苷上的亲脂取代基或亲脂制品的外国专利申请包括：WO 89/02733、WO 90/00555、WO 91/16920、WO 91/18914、WO 93/00910、WO 94/26273、WO 96/15132、EP 0350287、EP 93917054.4、和WO 91/19721。
V.治疗方法
通过给患者施用存在于药学上可接受的载体或稀释剂中的有效量的活性化合物或其药学上可接受的前药或盐，可以治疗受到HIV-1、HIV-2、HBV、HCV、诺如病毒、沙波病毒、HSV-1、HSV-2、登革热病毒、黄热病、或其基因片段感染的宿主，包括但不限于人。所述活性物质可以以液体或固体形式通过任何适当的途径给药，例如，口服、肠胃外、静脉内、真皮内、皮下、或局部给药。
所述化合物也可以用于治疗癌症。根据本发明的方法，可以用本文所述的化合物和这些化合物的药学上可接受的盐和前药治疗的患者包括，例如，已经被诊断为具有下述癌症的患者：肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌或肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、妇科肿瘤(例如，子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌或外阴癌)、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌(例如、甲状腺癌、甲状旁腺癌或肾上腺癌)、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌(例如、肾细胞癌、肾盂癌)、或中枢神经系统肿瘤(例如、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤或垂体腺瘤)。
本发明也涉及用于抑制患者的异常细胞增殖的方法和药物组合物，所述药物组合物包含一定量的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药以及一定量的一种或多种选自下述的物质：抗血管生成剂、信号转导抑制剂、和抗增殖剂。
诸如MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂、和COX-II(环加氧酶II)抑制剂等抗血管生成剂可以与本文所述的式1化合物和药物组合物联合使用。有用的COX-II抑制剂的实例包括西乐葆TM(塞来昔布)、伐地考昔、和罗非昔布。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例包括描述在：WO 96/33172(1996年10月24日公开)、WO96/27583(1996年3月7日公开)、欧洲专利申请号97304971.1(1997年7月8日提交)、欧洲专利申请号99308617.2(1999年10月29日提交)、WO 98/07697(1998年2月26日公开)、WO 98/03516(1998年1月29日公开)、WO 98/34918(1998年8月13日公开)、WO 98/34915(1998年8月13日公开)、WO 98/33768(1998年8月6日公开)、WO 98/30566(1998年7月16日公开)、欧洲专利公开606,046(1994年7月13日公开)、欧洲专利公开931,788(1999年7月28日公开)、WO 90/05719(1990年5月31日公开)、WO 99/52910(1999年10月21日公开)、WO 99/52889(1999年10月21日公开)、WO 99/29667(1999年6月17日公开)、PCT国际申请号PCT/IB98/01113(1998年7月21日提交)、欧洲专利申请号99302232.1(1999年3月25日提交)、英国专利申请号9912961.1(1999年6月3日提交)、美国临时申请号60/148,464(1999年8月12日提交)、美国专利号5,863,949(1999年1月26日授权)、美国专利号5,861,510(1999年1月19日授权)、和欧洲专利公开780,386(1997年6月25日公开)，它们都通过引用整体并入本文。优选的MMP抑制剂是没有表现出关节痛的那些。更优选的是相对于其它基质金属蛋白酶(即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12、和MMP-13)而言选择性地抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。
本文所述的化合物也可以与信号转导抑制剂一起使用，所述信号转导抑制剂例如可抑制EGFR(表皮生长因子受体)应答的试剂，例如EGFR抗体、EGF抗体，和作为EGFR抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，例如VEGF受体和可抑制VEGF的分子；和erbB2受体抑制剂，例如可结合erbB2受体的有机分子或抗体，例如赫赛汀
(SouthSan Francisco，Calif.，USA的Genentech，Inc.)。
EGFR抑制剂描述在：例如WO 95/19970(1995年7月27日公开)、WO 98/14451(1998年4月9日公开)、WO 98/02434(1998年1月22日公开)和美国专利号5,747,498(1998年5月5日授权)中，这些物质可用于本文所述的发明中。EGFR抑制剂包括、但不限于：单克隆抗体C225和抗-EGFR 22Mab(New York，N.Y.，USA 的ImClone SystemsIncorporated)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(MerckKgaA)、EMD-5590(Merck KgaA)、MDX-447/H-477(Medarex Inc.ofAnnandale，N.J.，USA和Merck KgaA)、和化合物ZD-1834、ZD-1838和ZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novartis)、PTK 787(Novartis)、CP 701(Cephalon)、来氟米特(Pharmacia/Sugen)、CI-1033(Warner Lambert Parke Davis)、CI-1033/PD 183，805(Warner Lambert Parke Davis)、CL-387，785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer MannheimGmbH/Roche)、Naamidine A(Bristol Myers Squibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103(Whitehouse Station，N.J.，USA 的Merck &Co.)、VRCTC-310(Ventech Research)、EGF融合毒素(Hopkinton，Mass.的Seragen Inc.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperical CancerResearch Fund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(Parker Hughes CancerCenter)、WHI-P97(Parker Hughes Cancer Center)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)和EGFR疫苗((York Medical/Centro deImmunologia Molecular(CIM))。这些和其它EGFR抑制剂可用于本发明。
VEGF抑制剂，例如CP-547，632(Pfizer Inc.，N.Y.)、AG-13736(AgouronPharmceuticals，Inc.a Pfizer Company)、SU-5416和SU-6668(South SanFrancisco，Calif.，USA的Sugen Inc.)、和SH-268(Schering)，也可和本发明化合物相组合。VEGF抑制剂描述于：例如WO 99/24440(1999年5月20日公开)、PCT国际申请PCT/IB99/00797(1999年5月3日提交)、WO 95/21613(1995年8月17日公开)、WO 99/61422(1999年12月2日公开)、美国专利号5,834,504(1998年11月10授权)、WO 98/50356(1998年11月12日公开)、美国专利号5,883,113(1999年3月16日授权)、美国专利号5,886,020(1999年3月23日授权)、美国专利号5,792,783(1998年8月11日授权)、WO 99/10349(1999年3月4日公开)、WO97/32856(1997年9月12日公开)、WO 97/22596(1997年6月26日公开)、WO 98/54093(1998年12月3日公开)、WO 98/02438(1998年1月22日公开)、WO 99/16755(1999年4月8日公开)和WO 98/02437(1998年1月22日公开)，它们都通过引用整体并入本文。可用于本发明的一些具体的VEGF抑制剂的其它实例是：IM862(Kirkland，Wash.，USA的CytranInc.)；抗-VE GF单克隆抗体(South San Francisco，Calif.的Genentech，Inc.)；和angiozyme，来自Ribozyme(Boulder，Colo.)和Chiron(Emeryville，Calif.)的合成核酶。这些和其它VEGF抑制剂可用于本文所述的发明中。
ErbB2受体抑制剂，例如CP-358，774(OSI-774)(Tarceva)(OSIPharmaceuticals，Inc.)、GW-282974(Glaxo Wellcome plc)、和单克隆抗体AR-209(The Woodlands，Tex.，USA的Aronex Pharmaceuticals Inc.)以及2B-1(Chiron)，可进一步和本发明化合物相组合，例如在WO98/02434(1998年1月22日公开)、WO 99/35146(1999年7月15日公开)、WO 99/35132(1999年7月15日公开)、WO 98/02437(1998年1月22日公开)、WO97/13760(1997年4月17日公开)、WO95/19970(1995年7月27日公开)、美国专利号5,587,458(1996年12月24日授权)、和美国专利号5,877,305(1999年3月2日授权)(它们都通过引用整体并入本文)中指出的那些。可用于本发明中的ErbB2受体抑制剂也描述在美国临时申请号60/117,341(1999年1月27日提交)和美国临时申请号60/117,346(1999年1月27日提交)中，它们二者通过引用整体并入本文。在前述PCT申请、美国专利、和美国临时申请中描述的erbB2受体抑制剂化合物和物质、以及抑制erbB2受体的其它化合物和物质，可以根据本发明与本文所述的化合物一起使用。
所述化合物也可以与用于治疗异常细胞增殖或癌症的其它药剂一起使用，所述其它药剂包括、但不限于，能够增强抗肿瘤免疫应答的药剂，例如CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4)抗体和能够阻断CTLA4的其它药剂；抗增殖药例如其它法呢基蛋白转移酶抑制剂等。可以用于本发明中的具体的CTLA4抗体包括在美国临时申请60/113,647(1998年12月23日提交，通过引用整体并入)中描述的那些，但是其它CTLA4抗体也可以用于本发明中。
也可以使用其它抗血管生成剂，包括、但不限于，其它COX-II抑制剂、其它MMP抑制剂、其它抗-VEGF抗体或其它血管生成效应物的抑制剂。
本文所述的化合物和药物组合物可以用于治疗或预防一种或多种诺如病毒以及杯状病毒科分类科中的其它病毒的感染。
在用于治疗诺如病毒感染的治疗用途中，可以将在适合实现治疗益处的剂量水平的化合物和/或组合物施用给诊断出诺如病毒感染的患者。“治疗益处”和语法等效描述是指化合物的施用在患者中随时间产生有益效果。例如，当患者中的诺如病毒滴度或病毒载量减少或停止增加时，可以实现治疗益处。
如果化合物的施用降低或完全停止通常伴随诺如病毒感染的不利征状的出现(不论患者中的诺如病毒滴度或病毒载量)，也可以实现治疗益处。也可以将本文所述的化合物和/或组合物预防性地施用给处于发展诺如病毒感染的危险中或已经暴露于诺如病毒的患者，以预防诺如病毒感染的发展。例如，可以将所述化合物和/或其组合物施用给可能已经暴露于诺如病毒的患者。
诺如病毒病的暴发经常发生在封闭或半封闭群体中，例如长期护理场所、医院、监狱、和游船，该病毒一旦被引入其中，感染会通过人-至-人传播或通过污染的食物非常快速地传播。许多诺如病毒暴发已经追踪至被受感染者拿过的食物。因此，可以有利地将预防剂量的本文所述的化合物提供给在这些场所中可能接触诺如病毒或其它杯状病毒科的个体。
VI.联合治疗或交替治疗
在一个实施方案中，本发明的化合物可以与至少一种选自下述的其它抗病毒剂一起使用：进入抑制剂、逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、和基于免疫的治疗剂。
例如，当用于治疗或预防HIV或HBV感染时，所述活性化合物或其前药或药学上可接受的盐可以与另一种抗病毒剂联合施用或交替施用，所述另一种抗病毒剂例如抗-HIV、抗-HBV、或抗-HCV剂，包括，但不限于上式的那些。一般而言，在联合治疗中，将有效剂量的2种或更多种药剂一起施用，而在交替治疗中，将有效剂量的每种药剂连续施用。所述剂量依赖于药物的吸收、失活和排泄速度、以及本领域技术人员已知的其它因素。应当注意，剂量值还会随要减轻的病症的严重性而变化。还应理解，对于任何特定的受试者，应按照个体需要和施用或监督施用此组合物的人的专业判断，随时间调整特定的剂量方案和计划。
可以与本文公开的化合物联合使用的抗病毒剂的非限制性实例包括下表中的那些。
乙型肝炎治疗
| 药物名称 | 药物类别 | 公司 |
| EHT 899 | 病毒蛋白 | Enzo Biochem |
| Dexelvuecitabine/Reverset/D-D4FC | 核苷类似物 | Pharmasset |
| APD | 核苷类似物 | RFS Pharma |
| HBVDNA疫苗 | 免疫刺激物 | PowderJect(UK) |
| MCC 478 | 核苷类似物 | Eli Lilly |
| valLdC(valtorcitabine) | 核苷类似物 | Idenix |
| ICN 2001 | 核苷类似物 | ICN |
| Racivir | 核苷类似物 | Pharmasset |
| Robustaflavone | 核苷类似物 | Advanced Life Sciences |
| LM-019c | Emory University | |
| 喷昔洛韦 | 核苷类似物 | |
| 泛昔洛韦 | ||
| DXG | 核苷类似物 | |
| ara-AMP前药 | ||
| HBV/MF59 | ||
| HDP-P-阿昔洛韦 | 核苷类似物 | |
| 锤头状核酶 | ||
| 糖苷酶抑制剂 | ||
| 聚乙二醇化的干扰素 | ||
| 人单克隆抗体 |
HIV治疗：蛋白酶抑制剂(PI)
HIV治疗：核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)
HIV治疗：非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)
HIV治疗：其它类的药物
细胞抑制剂
进入抑制剂(包括融合抑制剂)
| 商品名 | 通用名 | 缩写 | 实验代码 | 制药公司 |
| FuzeonTM | 恩夫韦地 | T-20 | Trimeris | |
| T-1249 | Trimeris | |||
| AMD-3100 | AnorMED，Inc. | |||
| CD4-IgG2 | PRO-542 | Progenics |
HIV治疗：基于免疫的治疗
目前处于临床开发中的抗-丙型肝炎化合物的列表
VII.用于治疗增殖性病症的联合治疗
在另一个实施方案中，当用作抗增殖药时，这些化合物可以与增加治疗功效的其它化合物联合施用，所述其它化合物包括但不限于抗叶酸药，5-氟嘧啶(包括5-氟尿嘧啶)，胞苷类似物如β-L-1，3-二氧戊环基胞苷或β-L-1，3-二氧戊环基5-氟胞苷，抗代谢药(包括嘌呤抗代谢药、阿糖胞苷、fudarabine、氮尿苷、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、和6-硫鸟嘌呤)，羟基脲，有丝分裂抑制剂(包括CPT-11，依托泊苷(VP-21)，紫杉醇，和长春花生物碱如长春新碱和长春碱，烷基化剂(包括但不限于白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、和塞替派)，非经典的烷基化剂，含铂的化合物，博莱霉素，抗肿瘤抗生素，蒽环类抗生素如多柔比星和dannomycin，蒽二酮类，拓扑异构酶II抑制剂，激素剂(包括但不限于皮质类固醇(地塞米松、泼尼松、和甲基泼尼松)，雄激素如氟甲睾酮和甲睾酮，雌激素如己烯雌酚，抗雌激素如他莫昔芬，LHRH类似物如亮丙瑞林，抗雄激素如氟他胺、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、和甲羟孕酮)，天冬酰胺酶，卡莫司汀，洛莫司汀，六甲基-三聚氰胺，达卡巴嗪，米托坦，链佐星，顺铂，卡铂，左旋咪唑，和亚叶酸。本发明的化合物还可与酶治疗剂及免疫系统调节剂(如干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、巨噬细胞集落刺激因子和集落刺激因子)联合使用。在一个实施方案中，本文所述的化合物可以与至少一种选自下述的其它抗病毒剂一起使用：逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂、进入抑制剂和聚合酶抑制剂。
另外，根据本发明的化合物可以与一种或多种抗-逆转录病毒剂、抗-HBV剂、干扰素、抗癌剂或抗菌剂联合施用或交替施用，所述药剂包括但不限于本发明的其它化合物。本文所述的某些化合物可以有效地增强根据本发明的某些药剂的生物活性(通过减少其它化合物的代谢、分解代谢或失活)，并因而为了该预期效果而共同施用。
VIII.用于治疗诺如病毒感染的联合治疗
除了本文所述的抗病毒化合物以外，还可以存在其它化合物。例如，已知I型干扰素(IFN)会抑制诺如病毒复制。认为某些维生素(尤其是维生素C)可以有效地治疗某些病毒感染。一项研究已经证实，维生素A补充会减少诺如病毒GII感染的流行、增加诺如病毒GI和GII脱落的长度、和减少NoV-相关的腹泻的流行(1：J Infect Dis.2007Oct 1；196(7)：978-85.Epub 2007Aug 22)。已知赖氨酸是抗病毒剂。还已知，源自基因群II(GII)诺如病毒的病毒样颗粒(VLP)会结合到细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和其它带负电荷的糖胺聚糖上。为了治疗感染征状，还可以施用止吐药、抗腹泻剂、和/或镇痛药。
IX.药物组合物
通过给患者施用存在于药学上可接受的载体或稀释剂中的有效量的活性化合物或其药学上可接受的前药或盐，可以治疗受到人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、黄病毒科病毒或杯状病毒科病毒或其基因片段或癌症感染的宿主，包括但不限于人。所述活性物质可以以液体或固体形式通过任何适当的途径给药，例如，口服、肠胃外、静脉内、真皮内、皮下、或局部给药。
化合物的优选剂量范围是，约0.1至约100mg/kg受体体重/天，更通常地约1至50mg/kg受体体重/天，优选约1至约20mg/kg受体体重/天。基于要递送的母体核苷的重量，可以计算药学上可接受的盐和前药的有效剂量范围。如果盐或前药本身具有活性，有效剂量可以如上所述用盐或前药的重量估算，或通过本领域技术人员已知的其它途径估算。
所述化合物以任何适宜的剂型方便地给药，包括但不限于每个单位剂型含有7-3000mg、优选70-1400mg活性成分。50-1000mg的口服剂量一般是便利的。
理想地，活性成分的施用应达到约0.2-70μM、优选约1.0-15μM的活性化合物的峰值血浆浓度。例如，可以通过静脉内注射活性化合物的0.1-5％溶液(任选地在盐水中)或通过活性成分的快速浓注达到此目的。
在药物组合物中活性化合物的浓度依赖于药物的吸收、失活和排泄速度以及本领域技术人员已知的其它因素。应当注意，剂量值还会随要减轻的病症的严重性而变化。还应理解，对于任何特定的受试者，应按照个体需要和施用或监督施用此组合物的人的专业判断，随时间调整特定的剂量方案，本文中给出的浓度范围只是举例，而非旨在限制要求保护的组合物的范围或实施。该活性成分可以一次性给药，或可以分为许多更小的剂量以可变的时间间隔给药。
活性化合物的优选给药方式是口服。口服组合物一般含有惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以包封在明胶胶囊中或压制为片剂。为了口服治疗给药，活性化合物可以与赋形剂掺混，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。药用粘合剂和/或辅料也可包含为此组合物的一部分。
片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何下列成分或具有类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或矫味剂如薄荷、水杨酸甲酯、或橙味香料。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的物质外，其可以含有液体载体如脂肪油。此外，单位剂型可以含有多种其它物质，其修饰此剂量单位的物理形式，例如，糖、紫胶、或其它肠溶试剂的包衣。
所述化合物可以作为酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂、口香糖等的一种组分来给药。除活性化合物外，糖浆剂可以含有作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂及矫味剂。
所述化合物或其药学上可接受的前药或盐还可以与不损害所需作用的其它活性物质混和，或与增补所需作用的物质混和，例如抗生素、抗真菌药、抗炎药或其它抗病毒药，包括但不限于其它核苷化合物。用于肠胃外、真皮内、皮下、或局部给药的溶液剂或混悬剂可以含有下列组分：无菌的稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、枸橼酸盐或磷酸盐，以及渗透压调节剂如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以包封在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制的多剂量管形瓶中。
如果静脉内给药，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个优选的实施方案中，使用保护化合物以防止其在体内快速消除的载体来配制活性化合物，如控释制剂，包括但不限于埋植剂和微囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。例如，肠溶衣化合物可以用于保护免于胃酸裂解。制备这类制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。合适的物质也可商业上得到。
脂质体混悬剂(包括但不限于用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染的细胞的脂质体)也是优选的药学上可接受的载体。它们可以按照本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利号4,522,811(通过引用并入)所述。例如，可以如下制备脂质体制剂：将适宜的脂(如硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、硬脂酰基磷脂酰胆碱、花生酰基磷脂酰胆碱、和胆固醇)溶解于无机溶剂，然后将此溶剂蒸发，在容器的表面上留下干燥脂质的薄膜。然后将活性化合物或其单磷酸酯、二磷酸酯、和/或三磷酸酯衍生物的水溶液引入该容器中。然后，用手旋转此容器，以让脂质物质从容器壁释出，并分散脂质聚集体，由此形成脂质体混悬液。
在描述本发明时使用的术语是常用的，且是本领域技术人员已知的。本文使用的以下缩写具有指示的含义：
aq 含水的
CDI 羰二咪唑
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺氢氯化物
EtOAc 乙酸乙酯
h 小时
HOBt N-羟基苯并三唑
M 摩尔
min 分钟
rt或RT 室温
TBAT 丁基铵二氟代三苯基硅酸盐
TBTU O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
THF 氢呋喃
X.用于制备活性化合物的一般方案
也提供了可容易地制备6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯和膦酸酯前药的方法。如下面详细描述的，或通过本领域技术人员已知的其它方法，可以制备本文公开的6-取代的-2-氨基嘌呤核苷酸单磷酸酯和膦酸酯前药。本领域普通技术人员会理解，这些方案绝不是限制性的，且可以做出细节的变动，而不脱离本发明的精神和范围。
通常，如下制备式I-XVIII的核苷酸：首先制备对应的核苷，然后加帽5’-羟基，成为本文所述的单磷酸酯或其它类似物，其在体内可以容易地转化为化合物的活性三磷酸酯形式。
下面总结了不同的反应方案。
方案1是本发明的活性化合物的合成的一个非限制性实例，具体地，是单磷酸酯前药XII、XIII、XIV的一个合成方案。
方案2是本发明的活性化合物的合成的一个非限制性实例，具体地，是单磷酸酯前药XII、XIII、XIV的一个替代合成方案。
方案3是本发明的活性化合物的合成的一个非限制性实例，具体地，是单磷酸酯前药XV的一个合成方案。
方案4是本发明的活性化合物的合成的一个非限制性实例，具体地，是单磷酸酯前药XVI的一个合成方案。
方案5是本发明的活性化合物的合成的一个非限制性实例，具体地，是单磷酸酯前药XVII的一个合成方案。
方案6是本发明的活性化合物的合成的一个非限制性实例，具体地，是单磷酸酯前药XVII的一个替代合成方案。
方案7是本发明的活性化合物的合成的一个非限制性实例，具体地，是单磷酸酯前药XVIII的一个合成方案。
方案8是本发明的活性化合物的合成的一个非限制性实例，具体地，是单磷酸酯前药XVIII的一个替代合成方案。
方案9是本发明的活性化合物的合成的一个非限制性实例，具体地，是核苷1的一个合成方案。
方案10是本发明的活性化合物的合成的一个非限制性实例，具体地，是核苷1的一个替代合成方案。
在一个实施方案中，如下制备式XII、XIII或XIV的核苷：用诸如TIPS等基团保护化合物1，以得到在糖的3’-位携带游离α-羟基的2(方案1)。本领域普通技术人员通过下述文献所述的方法，和通过一般方案9-10，可以制备化合物1：a)Rajagopalan，P.；Boudinot，F. D；Chu，C.K.；Tennant，B.C.；Baldwin，B.H.；Antiviral Nucleosides：Chiral Synthesis andChemotheraphy：Chu，C.K.；Eds.Elsevier：2003.b)Recent Advances inNucleosides：Chemistry and Chemotherapy：Chu，C.K.；Eds.Elsevier：2002.c)Frontiers in Nucleosides&Nucleic Acids，2004，Eds.R.F. Schinazi&D.C.Liotta，IHL Press，Tucker，GA，USA，pp：319-37d)Handbook ofNucleoside Synthesis：Vorbruggen H.&Ruh-Pohlenz C.John Wiley&sons 2001。使用诸如EDC、EDC/HOBt、TBTU或CDI等试剂，可以使2与酸3或4偶联，以得到酯5或6。去除保护基以后，通过暴露于磷酰氯或硫代磷酰三氯(POCl3或PSCl3)，可以将得到的氨基醇转化成单磷酸酯前药XII或XIII，或者，在磷酰氯或硫代磷酰三氯反应的水后处理以后，可以将诸如DCC等偶联剂用于XII或XIII的形成。在磷酰氯或硫代磷酰三氯反应的水后处理以后，可以得到化合物7，随后将其暴露于光气或光气等效物(诸如CDI或三光气)，得到单磷酸酯前药XIV。
方案1单磷酸酯前药XII、XIII、XIV的一个合成方案。(碱基是天然的或非天然的核苷碱基；R4’、R5、R5′、R6、Y、M、R20、和R7′如在活性化合物部分中所定义)
或者，可以如在方案2中所述，合成单磷酸酯前药XII、XIII、XIV，即通过在磷酸三甲酯中的磷酰氯或硫代磷酰三氯的作用，可以直接地将核苷1转化成单磷酸酯8。使用诸如DCC等标准的偶联剂，可以实现与氨基酯9或10的偶联，以得到氨基磷酸酯7和11。去保护，并随后用诸如EDC、EDC/HOBt、TBTU、或CDI等试剂偶联7或11，得到单磷酸酯前药XII和XIII。如在方案1中所述，可以从7得到单磷酸酯前药XIV。
方案2单磷酸酯前药XII、XIII、XIV的一个替代合成方案。(碱基是天然的或非天然的核苷碱基；R4’、R5、R5′、R6、Y、M、R20、和R7′如在活性化合物部分中所定义)
如在方案3中所述，可以从苯酚12开始，制备单磷酸酯前药XV(方案3)。将12暴露于磷酰氯或硫代磷酰三氯，得到13，随后使13与氨基酯14反应，以得到氨基磷酸酯15。接着可以通过5’-羟基与氯代磷酰基氨基丙酸酯15的反应，将核苷1转化成单磷酸酯类似物16。去保护，并随后用诸如EDC、EDC/HOBt、TBTU、或CDI等试剂偶联16，得到单磷酸酯前药XV。
方案3单磷酸酯前药XV的一个合成方案。(碱基是天然的或非天然的核苷碱基；R4’、R5、R5′、R6、Y、R20R21R22、和R7′如在活性化合物部分中所定义)
可以如下制备单磷酸酯前药XVI：使苯酚12与磷酰氯或硫代磷酰三氯反应，以得到氯磷酸二苯酯17(方案4)。然后可以通过5’-羟基与氯磷酸二苯酯17的反应，将核苷1转化成中间体单磷酸酯类似物。去保护，并随后用诸如EDC、EDC/HOBt、TBTU、或CDI等试剂与3’-羟基进行酯形成，随后用R21OH再酯化，得到单磷酸酯前药XVI。
方案4单磷酸酯前药XVI的一个合成方案。(碱基是天然的或非天然的核苷碱基；R4’、R5、R5′、R6、Y、R21、和R7′如在活性化合物部分中所定义)
可以如下制备单磷酸酯前药XVII：使用诸如EDC、EDC/HOBt、TBTU、或CDI等偶联剂，通过受保护的色氨酸18与受保护的氨基酸19的初始反应，以得到二肽20(方案5)。然后去除胺保护基，得到二胺21，再使其与磷酰氯或硫代磷酰三氯反应，以得到环状氯代磷酰二胺22。接着通过5’-羟基与环状氯代磷酰二胺22的反应，可以将核苷1转化成单磷酸酯类似物。去保护，并随后用诸如EDC、EDC/HOBt、TBTU、或CDI等试剂偶联22，得到单磷酸酯前药XVII。
方案5单磷酸酯前药XVII的一个合成方案。(碱基是天然的或非天然的核苷碱基；R4’、R5、R5′、R6、Y、R20R21R22、和R7′如在活性化合物部分中所定义)
或者，通过用二肽20偶联，可以从单磷酸酯类似物8制备单磷酸酯前药XVII(方案6)。
方案6单磷酸酯前药XVII的一个替代合成方案。(碱基是天然的或非天然的核苷碱基；R4’、R5、R5′、R6、Y、R20R21R22、和R7′如在活性化合物部分中所定义)
通过二氯代磷酰胺23与核苷1的初始反应，可以制备单磷酸酯前药XVIII(方案7)。随后使生成的中间体与水、硫化氢、或胺反应，得到单磷酸酯类似物24(方案7)。使双亲核试剂24暴露于光气或光气等效物诸如CDI，得到单磷酸酯前药XVIII。
方案7单磷酸酯前药XVIII的一个合成方案。(碱基是天然的或非天然的核苷碱基；R4’、R5、R5′、R6、Y、M、R20R21R22、和R7′如在活性化合物部分中所定义)
或者，通过核苷1与磷酰氯或硫代磷酰三氯的初始反应，可以制备单磷酸酯前药XVIII(其中M不是NR)，如方案8所示。随后使生成的中间体与水或硫化氢反应，再与光气或光气等效物诸如CDI反应，得到单磷酸酯前药XVIII(方案8)。
方案8单磷酸酯前药XVIII的一个替代合成方案。(碱基是天然的或非天然的核苷碱基；R4’、R5、R5′、R6、Y、R20R21R22、和R7′如在活性化合物部分中所定义)
可以如下制备核苷1：在有诸如TMSOTf等路易斯酸存在下，用受保护的或甲硅烷基化的嘌呤碱基偶联糖26。去保护3’-和5’-羟基，得到核苷1。
方案9核苷1的一个合成方案。(碱基是天然的或非天然的核苷碱基；R4’、R5、R5′、R6、Y、R20R21R22、和R7′如在活性化合物部分中所定义)
或者，可以从1’-卤代或1’-羟基化合物27制备核苷1。对于1’-卤代的情况，在有诸如三乙胺或氢化钠等碱存在下，受保护的或游离的嘌呤碱基，然后去保护，得到核苷1。对于1’-羟基的情况，在有诸如偶氮二甲酸二异丙酯等Mitsunobu偶联剂存在下，受保护的或游离的嘌呤碱基，然后去保护，得到核苷1。
方案10核苷1的一个替代合成方案。(碱基是天然的或非天然的核苷碱基；R4’、R5、R5′、R6、Y、R20R21R22、和R7′如在活性化合物部分中所定义)
下面的实施例进一步例证了本发明。方案11-14和实施例1-6显示了用于合成6-取代的嘌呤核苷酸前药的制备方法，实施例7-35显示了6-取代的嘌呤核苷、核苷酸、和核苷酸类似物的生物学评价的方法。本领域普通技术人员会理解，这些实施例绝不是限制性的，且可以做出细节的变动，而不脱离本发明的精神和范围。
具体实施例
按照下述的实施例和反应次序，制备本发明的代表性的具体化合物；实施例和描述反应次序的简图作为例证来提供，以辅助理解本发明，不应解释为以任何方式限制在此后的权利要求书中阐述的发明。本发明的化合物也可以用作以后实施例的中间体，以生产本发明的其它化合物。未必已经进行了优化在任意反应中得到的产率的尝试。本领域技术人员会知道如何通过反应时间、温度、溶剂和/或试剂的常规变化来增加这样的产率。
无水溶剂购自Aldrich Chemical Company，Inc.(Milwaukee)。Reagents购自商业来源。除非另外指出，在实施例中使用的物质从可容易地得到的商业供应商得到，或通过化学合成领域的技术人员已知的标准方法来合成。熔点(mp)用电热数字(Electrothermao digit)熔点仪测定，未经校正。1H和13C NMR波谱用Varian Unity Plus 400波谱仪在室温测定，以距离内标四甲基硅烷的ppm低磁场报道。进行氘交换、去偶合实验或2D-COSY，以确认质子的归属。信号多重性表示如下：s(单峰)、d(双峰)、dd(双二重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、br(宽峰)、bs(宽单峰)、m(多重峰)。所有J值以Hz为单位。使用电喷雾技术，在Micromass Platform LC波谱仪上测定质谱。使用Atlantic Microlab Inc.(Norcross，GA)，进行元素分析。在Whatman LK6F硅胶板上进行分析TLC，在Whatman PK5F硅胶板上进行制备TLC。在硅胶上或通过反相高效液相色谱法，进行柱色谱法。
方案11.2，6-二氨基嘌呤2’-C-Me单磷酸酯前药的合成。
实施例1
(2S)-乙基2-((((2R，3R，4R，5R)-5-(2，6-二氨-9H-嘌呤-9-基)-3，4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基）甲氧基）（苯氧基）磷酰基氨基）丙酸酯（75）
向在0℃的(74)(30mg，0.1mmol)在THF(1mL)和DMF(1mL)中的溶液中，加入(2R)-乙基2-(氯代(苯氧基)磷酰基氨基)丙酸酯1(0.4mL，0.4mmol)，然后分份加入t-BuMgCl(0.4mL，0.4mmol)。在室温搅拌过夜后，用氯化铵(水溶液）中和反应混合物，浓缩，然后使用二氯甲烷∶甲醇＝7∶1-7∶2，通过快速柱色谱法纯化，以得到75(1mg，1.8％)。
C22H30N7O8P的LC/MS计算值551.1，实测值：552.1(M+1)。
参考文献：
1.(a)Perrone，P。；Daverio，F。；Valente，R.；Rajyaguru，S.；Martin J.A.；V.；Pogam，S.L.；Najera，I.；Klumpp，K.；Smith，D.；B.和McGuigan，C.First Example of Phosphoramidate Approach Applied to a4’-Substituted Purine Nucleoside(4’-Azidoadenosine)：Conversion of anInactive Nucleoside to a Submicromolar Compound versus Hepatitis CVirus.J.Med.Chem.2007，50，5463-5470.(b)Uchiyama，M.；Aso，Y.；Noyori，R.；Hayakawa，Y.O-Selective phosphorylation of nucleosideswithout N-protection.J.Org.Chem.1993，58，373-379。
方案12.2，6-二氨基嘌呤二氧戊环单磷酸酯前药的合成。
实施例2
(2R)-乙基-2-((((4R)-4-(2，6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-1，3-二草脲胺-2-基)甲氧基）（苯氧基)磷酰基氨基)丙酸酯（77）
向化合物76(30mg，0.12mmol)在THF(5mL)中的溶液中，加入1Mt-BuMgCl溶液(0.36mL，0.36mmol)，并搅拌30min。向反应混合物中，加入在室温在THF中的(2R)-乙基2-(氯代(苯氧基)磷酰基氨基)丙酸酯(0.36mL，0.36mmol)，并搅拌过夜，用氯化铵(水溶液)中和，浓缩，使用乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1，通过快速柱色谱法纯化粗混合物，以得到77(28mg，46％)。
1H-NMR(CD3OD，300MHz)δ：7.80-7.79(s，1H)，7.26-7.09(m，5H)，6.27(m，1H)，6.12(brs，2H)，5.25(m，3H)，4.47(m，2H)，4.22(m，2H)，4.03(m，2H)，3.83(m，1H)，1.33-1.15(m，6H)。
C20H27N7O7P的LC/MS计算值508.2，实测值：508.3(M+1)。
方案13.3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧鸟苷单磷酸酯前药的合成。
实施例3
(2R)-乙基2-((((2S，3S，5R)-3-叠氮基-5-(2，6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲氧基)-(苯氧基)磷酰基氨基)丙酸酯79)
将t-BuMgCl(0.22mL，0.22mmol)加入化合物78(34mg，0.11mmol)在THF(5mL)中的悬浮液中。将反应混合物搅拌30min，然后冷却至0℃，加入在THF中的(2R)-乙基2-(氯代(苯氧基)磷酰基氨基)丙酸酯(0.22mL，0.22mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，用氯化铵(水溶液)中和，浓缩，使用乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1，通过快速柱色谱法纯化粗混合物，以得到79(12mg，19％)。
1H-NMR(CD3OD，300MHz)δ：7.85，7.89(2s，1H)，7.12(m，5H)，6.17(m，1H)，4.60(m，1H)，4.37(m，1H)，4.22(m，2H)，4.03(m，3H)，3.83(m，1H)，2.85(m，1H)，2.46(m，1H)，1.22(m，3H)，1.15(m，3H)。
C21H28N10O6P的LC/MS计算值547.2，实测值：547.3(M+1)。
方案14.3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧鸟苷类似物(83)的合成。
实施例4
3-(2-(二氯磷酰氧基)苯基)丙酸甲酯(81)2
在氮下，将在无水乙醚(9.2mL)中的无水三乙胺(0.38mL，2.8mmol)和3-(2-羟基苯基)丙酸甲酯80(0.5g，2.77mmol)逐滴加入在-78℃的含有磷酰氯(0.25mL，2.8mmol)的无水乙醚溶液(5mL)中。加入后，将反应混合物缓慢地温热至室温，并搅拌1h。在减压下去除溶剂，以得到粗产物，为含有大量固体的油。
参考文献：
2.Lemmens，R.WO2003/070944，Method Of Separation UsingAromatic Thioether Ligands。
实施例5
(2R)-乙基2-(氯代(2-(3-甲氧基-3-氧代丙基)苯氧基)磷酰基氨基)丙酸酯(82)
将3-(2-(二氯磷酰氧基)苯基)丙酸甲酯(81)(2.77mmol)和L-丙氨酸甲基酯氢氯化物(0.42g，2.77mmol)悬浮于无水二氯甲烷(10mL)中。在氮下在-78℃逐滴加入无水三乙胺(0.37mL，2.77mmol)和二氯甲烷(5mL)。加入后，将反应混合物缓慢地温热至室温，并搅拌过夜。在减压下去除溶剂；用无水乙醚(20mL ×2)洗涤固体，并过滤。将滤液浓缩成残余物，以得到粗产物，为油。用THF(2.77mL)稀释，得到1M溶液，将其不经任何进一步纯化地用于下一步。
实施例6
(2R)-乙基2-((((2S，3S，5R)-3-叠氮基-5-((2，6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-)甲氧基)-(2-(3-甲氧基-3-氧代丙基)苯氧基)磷酰基氨基)丙酸酯(83)
以与实施例3中关于化合物79所述的方式，制备该化合物。
实施例7
6-取代-2-氨基嘌呤核苷向6-羟基-2-氨基嘌呤核苷的转化
当5’-OH基团未转化成单磷酸酯前药时，如上所述制备的不同的核苷(在6’-位具有除了羟基以外的官能团)在体内可容易地转化成6’-羟基形式。
下面显示了用50μM 6-取代的-2-氨基嘌呤核苷在PBM细胞中温育4小时后形成的核苷酸的LC/MS定性分析的多个实施例。在外周血单核(PBM)细胞中温育50μM的3’-叠氮基G(RS-527)，随后通过液相色谱法进行分析，并用质谱仪检测，得到RS-527-二磷酸酯(DP)和RS-527-三磷酸酯(TP)的强信号，而RS-527-单磷酸酯(MP)的信号接近检测水平(图1)。
在PBM细胞中温育RFS-427(其含有6-N-烯丙基)，导致RFS-457-DP和RFS-457-TP的检出。没有检出RFS-427、RFS-427-MP、RFS-427-DP、或RFS-427-TP(图2)。
在PBM细胞中温育RFS-464(其含有6-N-烯丙基、6-N-Me基团)，导致RFS-457-TP的检出。没有检出RFS-464、RFS-464-MP、RFS-464-DP、或RFS-464-TP(图3)。
在PBM细胞中温育RFS-512(其含有6-N-环丙基)，导致RFS-457-DP和RFS-457-TP的检出。没有检出RFS-512、RFS-512-MP、RFS-512-DP、或RFS-512-TP(图4)。
在PBM细胞中温育RFS-506(其含有6-甲氧基)，导致RFS-506-DP、RFS-457-DP、和RFS-457-TP的检出。没有检出RFS-506、RFS-506-MP、或RFS-506-TP(图5)。
在PBM细胞中温育RFS-667(其含有6-氨基)，导致RFS-457、RFS-457-MP、RFS-457-DP、RFS-457-TP RFS-667-DP、和RFS-667-TP的检出。没有检出RFS-667或RFS-667-MP(图6)。
在PBM和MT-2细胞中温育化合物6415(其含有6-氯基团)，随后分析形成的细胞内三磷酸酯，导致RFS-457-TP的检出。在PBM和MT-2细胞中，化合物6415被转化成AZG和AZG-TP。在用药物处理30min的MT-2细胞中，检测出可忽略水平的6415。在PBM细胞中没有检测出化合物6415或它的磷酸酯(图7)。
当用化合物6415处理它们时，MT-2和PBM细胞中的AZG-TP水平更高，这表明，当使用化合物6415时，向三磷酸酯形式的转化更快地发生。在4个不同的浓度温育AZG表明，在30μM时，在MT-2中的磷酸化达到稳态。在MT-2细胞中的AZG-TP/dGTP之比是PBM细胞的5倍。在用AZG或6415处理48小时后，所有dNTP水平增加(约倍增)，但是dGTP水平不然，这表明与AZG的磷酸化竞争。
为了确定这些6-取代的化合物是否被酶腺苷脱氨酶转化成G类似物，进行了一系列酶动力学实验。如表1所示，发现代表性数目的6-取代的核苷被腺苷脱氨酶转化成G类似物。发现化合物69(一种6-N，N-二甲基类似物)在测试的条件下对腺苷脱氨酶是稳定的。
表1：腺苷脱氨酶对核苷的脱氨作用
2’-脱氧腺苷在本文中也称作RFS-667。化合物72在本文中也称作RFS-512。化合物62在本文中也称作RFS-427。化合物70在本文中也称作RFS-506。
在表2中显示了MP前药RS-788和母体核苷RS-667的HIV和毒性数据。在该情况下，在EC50和EC90，观察到RS-788的抗-HIV活性的增加，但是，也存在与母体核苷RS-667相比毒性的增加。该化合物的EC50(针对HIV)和IC50(针对PBM和CEM细胞)分别表现出4300和3400倍差异。
表2：MP前药RS-788和母体核苷RS-667的HIV和毒性数据
在PBM细胞中温育RS-788(其含有6-氨基)和5’-MP前药，导致RFS-457-MP、RFS-457-DP、和RFS-457-TP的检出。但是，不同于RS-667的温育，检测到非常高水平的RS-667MP、RS-667DP、和RS-667TP(图8)。经MP前药RS-788温育产生的高水平的细胞间RS-667-TP指示，MP前药已经有效地限制或停止了6-氨基向6-OH的转化。
在用脱氧助间型霉素(一种已知的腺苷脱氨酶抑制剂)预处理的PBM细胞中温育RS-788(其含有6-氨基)和5’-MP前药，导致非常低水平的RFS-457-MP、RFS-457-DP、和RFS-457-TP的检出。但是，也不同于RS-667的温育，检测到非常高水平的RS-667-MP、RS-667-DP、和RS-667-TP(图9)。
以前评估了(-)-β-D-2，6-二氨基嘌呤二氧戊环(DAPD)在PHA-刺激的人PBMC和CEM细胞中的代谢(Antimicrob.Agents Chemother.2001，45，158-165)。在该以前的研究中，发现DAPD可容易地脱氨成(-)-β-D-二氧戊环鸟嘌呤(DXG)。尽管DXG和DAPD都可检出，PBMC中的DAPD水平是在CEM细胞中测得的DAPD水平的27倍；2种细胞类型中的DXG的水平大致相同。在相同的以前的研究中，定量了DAPD和DXG和它们的磷酸化的衍生物的细胞内水平。在任一种细胞类型中，都没有检测到DAPD向对应的单磷酸酯、二磷酸酯、或三磷酸酯形式的磷酸化。经证实，DAPD被脱氨成DXG，随后磷酸化成DXG-TP。
重新检查50μM的DAPD(其含有6-氨基)在PBM细胞(37℃，4h)中的细胞内代谢，导致除了DXG和DXG-MP以外，还检测到高水平的DXG-TP。观察到低水平的DAPD，但是，没有检测到磷酸化形式的DAPD(图10)。
在表3中显示了DAPD-MP前药RS-864和母体核苷DAPD的HIV和毒性数据。在该情况下，在EC50和EC90，观察到RS-864的抗-HIV活性的增加，但是，也存在与母体核苷DAPD相比毒性的轻微增加。
表3：MP前药RS-864和母体核苷DAPD的HIV和毒性数据
在PBM细胞中温育RS-864(其含有6-氨基)和5’-MP前药，导致低水平的DXG、DXG-MP、和DXG-TP的检出(图11)。但是，不同于DAPD的温育，检测到非常高水平的DAPD-TP。另外，也观察到低水平的DAPD、DAPD-MP、DAPD-DP。经DAPD-MP前药温育产生的高水平的细胞间DAPD-TP指示，MP前药已经有效地限制或停止了6-氨基向6-OH的转化。
实施例8
抗-HIV(在PBM细胞中)试验
上面已经证实，所述化合物的核苷类似物被转化成6-羟基类似物，核苷的单磷酸酯类似物耐受该转化，现在开始讨论本文所述的化合物的生物活性。
如以前所述(参见Schinazi R.F.，McMillan A.，Cannon D.，Mathis R.，Lloyd R.M.Jr.，Peck A.，Sommadossi J.-P.，St.Clair M.，Wilson J.，FurmanP.A.，Painter G.，Choi W.-B.，Liotta D.C.Antimicrob.Agents Chemother.1992，36，2423；Schinazi R.F.，Sommadossi J.-P.，Saalmann V.，Cannon D.，Xie M.-Y.，Hart G.，Smith G.，Hahn E.Antimicrob.Agents Chemother.1990，34，1061)，在人外周血单核(PBM)细胞中测定所述化合物的抗-HIV-1活性。在无菌DMSO中制备化合物的储备溶液(20-40mM)，然后在生长培养基中稀释到需要的浓度。以0.01的感染复数(multiplicity of infection)，用原型HIV-1LAI感染细胞。感染后第6天，使用(rA)n·(dT)12-18作为模板-引物，通过逆转录酶试验定量从细胞上清液得到的病毒。稀释溶液中存在的DMSO(＜0.1％)对病毒产量没有影响。包含AZT作为阳性对照。采用以前所述的中效方法(参见Chou T.-C.&Talalay P. Adv.Enzyme Regul.1984，22，27-55；Belen’kii M.S.&Schinazi R.F. Antival Res.1994，25，1-11)，从浓度-反应曲线得到抗病毒EC50和EC90。
实施例9
评估HIV-1逆转录酶对核苷-TP的掺入
i)蛋白表达和纯化：使用p6HRT-PROT表达载体，在细菌中过表达HIV-1逆转录酶(xxLAI背景)(参见Shi C，Mellors JW.A recombinantretroviral system for rapid in vivo analysis of human immunodeficiencyvirus type 1 susceptibility to reverse transcriptase inhibitors.AntimicrobAgents Chemother. 1997；41：2781-5)，并如前所述(参见Le Grice SF，Gruninger-Leitch F. Rapid purification of homodimer and heterodimerHIV-1 reverse transcriptase by metal chelate affinity chromatography.EurJ Biochem.1990；187：307-14；Le Grice SF，Cameron CE，Benkovic SJ.Purification and characterization of human immunodeficiency virus type 1reverse transcriptase.Methods Enzymol.1995；262：130-44)纯化至同质。使用260450M-1cm-1的消光系数(ε280)，使用分光光度计在280nm测定纯化的酶的蛋白浓度。如以前所述(参见Kati WM，Johnson KA，Jerva LF，Anderson KS.Mechanism and fidelity of HIV reverse transcriptase.J Biol.Chem.1992；267：25988-97)，从前稳态爆发实验，计算逆转录酶的活性部位浓度。使用活性部位浓度，进行下述的所有反应。
ii)前稳态动力学分析：在所有实验中，使用与57核苷酸DNA模板(5’-CTCAGACCCTTTTAGTCAGAATGGAAANTCTCTAGCAGTGGCGCCCG AACAGGGACA-3’)退火的[γ32P]-ATP 5’-末端标记的20核苷酸DNA引物(5’-TCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’)。DNA模板含有在位置30(N)处的T或C，这允许使用相同的20核苷酸引物评价单个核苷酸掺入的动力学。使用Kintek RQF-3仪器(Kintek Corporation，Clarence，PA)，进行快速淬灭实验。在所有实验中，在反应缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5，50mM KCl)中预温育300nM逆转录酶和60nM DNA模板/引物(T/P)，然后与在含有20mM MgCl2的相同反应缓冲液中的等体积的核苷酸相混合。通过用0.5M EDTA pH 8.0淬灭，在10ms至30min的时间内，终止反应。将淬灭的样品与等体积的凝胶加样缓冲液(98％去离子化的甲酰胺、10mMEDTA和1mg/mL的每种溴酚蓝和二甲苯蓝)相混合，在85℃变性5min，在7M脲-16％聚丙烯酰胺凝胶上，从底物分离产物。使用Bio-RadGS525分子成像仪(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)，分析产物形成。
iii)数据分析：使用具有适当方程的Sigma Plot软件(JandelScientific)，通过非线性回归，拟合从动力学试验得到的数据(参见JohnsonKA.Rapid quench kinetic analysis of polymerases，adenosinetriphosphatases，and enzyme intermediates.Methods Enzymol.1995；249：38-61)。通过将产物形成的时程拟合至下述方程，测定dNTP的每个具体浓度的表观爆发速率常数(kobs)：[产物]＝A[1-exp(-kobst)]，其中A表示爆发振幅。如下得到转换数(kpol)和dNTP的表观解离常数(Kd)：相对于dNTP浓度绘制表观催化率kobs，并用下述双曲线方程拟合数据：
kobs＝(kpol[dNTP])/([dNTP]+Kd)。
实施例10
评估6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药的抗-HIV活性和细胞毒性
i)病毒：使用xxHIV-1LAI克隆75，通过将5-10μg质粒DNA电穿孔(Gene Pulser；Bio-Rad)进1.3×107个MT-2细胞中，制备储存病毒。在转染后7天，收获无细胞的上清液，并在-80℃储存。如下证实储存病毒的基因型：从病毒体提取RNA，用DNA酶I处理提取物，通过RT-PCR扩增逆转录酶的全长编码区(氨基酸1-560)，纯化PCR产物，并使用Big Dye终止子试剂盒(v.3.1)，在ABI 3100自动化DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)上对PCR产物进行序列测定。通过3倍终点稀释试验(每个稀释度6个孔)，测定储存病毒对MT-2细胞、P4/R5细胞或PBM细胞的50％组织培养物感染剂量(TCID50)，并使用Reed和Muench方程进行计算(参见Reed LJ，Muench H.A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am.J.Hyg.1938；27：493-497)。
ii)单复制周期药物敏感性试验：在96孔平板中，将抑制剂的2或3倍系列稀释物一式三份地加给P4/R5细胞。用在没有药的、病毒感染的对照孔中产生100的相对光单位值的量的病毒来感染细胞。在感染后48h，将细胞裂解缓冲液和发光底物(Gal-Screen；Tropix/Applied Biosystems)加入每个孔中，并使用光度计(ThermoLabSystems，Waltham，Mass.)测定相对光单位值。将病毒复制的抑制计算为，使病毒复制抑制50％所需的化合物浓度(EC50)。
iii)多复制周期药物敏感性试验：在96孔平板中，将抑制剂的3倍系列稀释物一式三份地加给MT-2细胞。如在MT-2细胞中的终点稀释度所测得的，以0.01的感染复数来感染细胞。在感染后第7天，收获培养上清液，并用0.5％Triton X-100处理。使用商业的酶联免疫吸附测定(DuPont，NEN Products，Wilmington，Del.)，测定上清液中的p24抗原浓度。如上所述计算EC50值。
iv)在PBM细胞中的药物敏感性试验：如以前所述(参见Schinazi RF，Cannon DL，Arnold BH，Martino-Saltzman D.Combinations ofisoprinosine and 3′-azido-3′-deoxythymidine in lymphocytes infected withhuman immunodeficiency virus type 1.Antimicrob.Agents Chemother.1988；32：1784-1787；Schinazi RF，Sommadossi JP，Saalmann V，CannonDL，Xie MY，Hart GC，Smith GA.Hahn E.F. Activities of3′-azido-3′-deoxythymidine nucleotide dimers in primary lymphocytesinfected with human immunodeficiency virus type 1.Antimicrob.AgentsChemother.1990；34：1061-1067)，通过蔗聚糖-泛影钠不连续梯度离心，从健康的血清阴性的供体分离出PBM细胞。在使用之前，用植物凝集素A(PHA，Difco，Sparks，MD)刺激细胞2-3天。使用100TCID50/1×107个细胞(对于烧瓶(T25)试验)或使用200TCID50/6×107个细胞/孔(对于24-孔板试验)，批量(in bulk)感染1h。将细胞加入含有测试化合物的10倍系列稀释物的平板或烧瓶。在感染后5天，收获培养上清液，并用0.5％Triton X-100处理。如上所述，测定上清液中的p24抗原浓度。如上所述，计算EC50和抗性倍数值。
v)细胞毒性试验：评价了6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药对P4/R5细胞、MT-2细胞和未感染的PHA-刺激的人PBM细胞的潜在毒性作用。以5×103-5×104个细胞/孔，将对数期P4/R5、MT-2、和PHA-刺激的人PBM细胞接种进含有测试药物的10倍系列稀释物的96-孔细胞培养板中。温育培养物2-4天，然后将3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)染料溶液(Promega，Madison，WI)加入每个孔中，并温育过夜。用终止溶解溶液(Promega，Madison，WI)，终止反应，并在570nm波长读出平板。使用中效方法，从浓度-反应曲线确定半数50％细胞毒性浓度(CC50)。
实施例11
评估6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药对抗药HIV的活性
进一步评价了在上面鉴别为具有比母体类似物提高的活性和更少的细胞毒性的类似物对一组抗药病毒的活性。在该研究中使用的抗药病毒包括：HIV-1K65R、HIV-1K70E、HIV-1L74V、HIV-1M184V、HIV-1AZT2、HIV-1AZT3、HIV-1AZT7、HIV-1AZT9、HIV-1Q151M和HIV-169插入。这些病毒的基因型和HIV-RT中的突变如图12所述。在我们的HIV-1xxLAI克隆中，制备所有这些突变型病毒。
实施例12
评估6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药对抗药HIV的活性
i)病毒和药物敏感性试验：如上所述，制备病毒原液。使用也在上面描述的单和多复制周期试验，进行药物敏感性试验。将病毒复制的抑制计算为，使病毒复制抑制50％所需的化合物浓度(EC50)。通过将突变型HIV-1的EC50除以WT HIV-1的EC50，确定抗性值倍数。
ii)统计分析：为了确定抗性值倍数是否是统计上显著的，使用SigmaStat软件(Jandel Scientific)，使用双样品Student氏t检验，将来自至少3个独立实验的EC50值进行log10转化和对比。如果P值小于0.05，认为是统计上显著的。
实施例13
评估突变型HIV-1逆转录酶对核苷酸的掺入和切除
i)酶：下述的突变型HIV-1逆转录酶可以用于该研究中：K65R RT、K70E RT、L74V RT、M184V RT、AZT2RT、AZT3RT、Q151M RT和69Insert RT。如以前所述，可以开发这些突变型逆转录酶各自的大肠杆菌蛋白表达载体，并进行蛋白表达和纯化。如上所述，测定蛋白浓度和活性部位浓度。
ii)核苷酸掺入的动力学分析：前稳态动力学分析可以用于测定K65R、K70E RT、L74V RT、M184V RT和Q151M RT对每个新颖的核苷-TP的动力学参数Kd和kpol。可以如上所述进行实验设计和数据分析。
iii)切除试验：使用WT RT、AZT2RT、AZT3RT和69Insert RT，可以进行ATP-介导的新颖类似物从链-终止的模板/引物的磷酸解(phosphorolytic)切除。可以用[γ32P]-ATP在5’-末端标记上述的20核苷酸DNA引物，然后与适当的57核苷酸DNA模板退火。通过与WT RT和100μM适当修饰的核苷酸类似物一起在37℃温育30min，可以链-终止引物的3’-端。通过在7M脲-16％丙烯酰胺变性凝胶电泳以后提取适当的泳带，可以进一步纯化32P-标记的、链-终止的21核苷酸引物。然后可以使纯化的链-终止的引物重新与适当的DNA模板退火，用于磷酸解实验。通过用60nM链-终止的T/P目标复合物在50mM Tris-HCl pH 8.0、50mMKCl中温育300nM(活性部位)WT或突变型RT，可以实现核苷-MP的磷酸解去除。通过加入3.0mMATP和10mM MgCl2，可以开始反应。贯穿整个反应，可以存在无机焦磷酸酶(0.01U)。在给定的温育期以后，可以从反应试管取出等分试样，并用等体积的凝胶加样染料(98％去离子化的甲酰胺、10mM EDTA和1mg/mL的每种溴酚蓝和二甲苯蓝)淬灭。通过变性凝胶电泳，可以分离产物，使用Bio-Rad GS525分子成像仪可以分析与产物形成同时发生的底物消失。将数据拟合下述单指数方程，以确定ATP-介导的切除的表观速率(kATP)：[产物]＝A[exp(-kATPt)]，其中A表示产物形成的波幅。如以前所述(参见Meyer PR，Matsuura SE，Mian AM，So AG， ScottWA.A mechanism of AZT resistance：an increase in nucleotide-dependentprimer unblocking by mutant HIV-1 reverse transcriptase.Mol Cell.1999；4：35-43；Sluis-Cremer N，Arion D，Parikh U，Koontz D，Schinazi RF，Mellors JW，Parniak MA.The 3′-azido group is not the primarydeterminant of 3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)responsible for theexcision phenotype of AZT-resistant HIV-1.J Biol Chem.2005；280：29047-52)，可以测定失活复合物(Dead-end complex)形成。
实施例14
在HepG2细胞中的线粒体毒性试验：
i)6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药对细胞生长和乳酸生产的影响：通过在有0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM药物存在下温育细胞，测定对HepG2细胞的生长的影响。将细胞(5×104个/孔)涂布进12-孔细胞培养板的含有非必需氨基酸的最低基础培养基中，所述培养基添加了10％胎牛血清、1％丙酮酸钠、和1％青霉素/链霉素，并在37℃温育4天。在温育期结束后，使用血球计数器测定细胞数目。也参见：Pan-Zhou X-R，Cui L，Zhou X-J，Sommadossi J-P，Darley-Usmer VM.“Differential effectsof antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2cells”Antimicrob.Agents Chemother.2000；44：496-503。为了测量核苷类似物对乳酸产生的影响，稀释来自储用培养物的HepG2细胞，并以2.5×104个细胞/孔涂布12-孔培养板。加入不同浓度(0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM)的核苷类似物，并在恒湿5％CO2气氛中在37℃温育培养物4天。在第4天，测定每个孔中的细胞数目，并收集培养基。过滤培养基，使用色度法乳酸试验(Sigma-Aldrich)测定培养基中的乳酸含量。由于乳酸产物可以视作受损的线粒体功能的标志物，在有6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药类似物存在下生长的细胞中所检测出的升高的乳酸产生水平，指示药物诱导的细胞毒性效应。
ii)6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药对线粒体DNA合成的影响：
已经开发了实时PCR试验，用于准确地定量线粒体DNA含量(参见StuyverLJ，Lostia S，Adams M，Mathew JS，Pai BS，Grier J，Tharnish PM，Choi Y，Chong Y，Choo H，Chu CK，Otto MJ，Schinazi RF. Antiviral Activities andcellular toxicities of modified 2′，3′-dideoxy-2′，3′-didehydrocytidine analogs.Antimicrob.Agents Chemother.2002；46：3854-60)。该试验用于本申请所述的所有研究中，以确定核苷类似物对线粒体DNA含量的影响。在该试验中，以5,000个细胞/孔，将低传代数HepG2细胞接种进胶原-包被的96-孔平板中。将核苷单磷酸酯类似物加入培养基中，以得到0μM、0.1μM、10μM和100μM的终浓度。在培养第7天，使用可商业得到的柱(RNeasy96试剂盒；Qiagen)，制备细胞核酸。这些试剂盒共纯化RNA和DNA，因此，从该柱洗脱总核酸。使用多路Q-PCR方法，使用适合靶物和参照物扩增的引物和探针，从5μl洗脱的核酸扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基II(COXII)基因和β-肌动蛋白或rRNA基因。对于COXII，分别使用下述的有义、探针和反义引物：5′-TGCCCGCCATCATCCTA-3′，5′-四氯-6-羧基荧光素-TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-TAMRA-3′和5′-CGTCTGTTATGTAAAGGATGCGT-3′。对于β-肌动蛋白基因(GenBank登录号E01094)的外显子3，有义、探针和反义引物分别是：5′-GCGCGGCTACAGCTTCA-3′，5′-6-FAMCACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3′和5′-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。rRNA基因的引物和探针可从Applied Biosystems商业得到。由于对于所有基因得到相同的扩增效率，使用比较CT方法来研究线粒体DNA合成的潜在抑制。该比较CT方法使用这样的算术公式，其中靶物(COXII基因)的量被标准化成内源参照物(β-肌动蛋白或rRNA基因)的量，并与校准物(在第7天不含药物的对照)相对比。该方案的算术公式由2-ΔΔCT给出，其中ΔΔCT是(平均目标测试样品的CT-目标对照的CT)-(平均参照试验的CT-参照物对照的CT)(参见Johnson MR，K Wang，JB Smith，MJ Heslin，RB Diasio.Quantitation ofdihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reversetranscription polymerase chain reaction.Anal.Biochem.2000；278：175-184)。在有药物存在下生长的细胞中线粒体DNA含量的减少，指示线粒体毒性。
iii)电子显微形态学评价：已经证实，NRTI诱导的毒性会造成线粒体中的形态学变化(例如，嵴丧失、基体溶解和膨胀、和脂滴形成)，使用透射电子显微术，通过超结构分析可以观察这些变化(参见Cui L，Schinazi RF，Gosselin G，Imbach JL.Chu CK，Rando RF，Revankar GR，SommadossiJP.E ffect of enantiomeric and racemic nucleoside analogs onmitochondrial functions in HepG2cells.Biochem.Pharmacol.1996，52，1577-1584；Lewis W，Levine ES，Griniuviene B，Tankersley KO，ColacinoJM，Sommadossi JP，Watanabe KA，Perrino FW.Fialuridine and itsmetabolites inhibit DNA polymerase gamma at sites of multiple adj acentanalog incorporation，decrease mtDNA abundance，and causemitochondrial structural defects in cultured hepatoblasts.Proc Natl AcadSci U S A.1996；93：3592-7；Pan-Zhou XR，L Cui，XJ Zhou，JPSommadossi，VM Darley-Usmar.Differential effects of antiretroviralnucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2 cells.Antimicrob.Agents Chemother.2000，44，496-503)。例如，与10μM非阿尿苷(FIAU；1，2′-脱氧-2′-氟-1-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘-尿嘧啶)一起温育的HepG2细胞的电子显微照片证实了膨大的线粒体的存在，所述线粒体具有与线粒体功能障碍相一致的形态学变化。为了确定6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药是否促进线粒体中的形态学变化，将HepG2细胞(2.5×104个细胞/mL)接种进存在0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM核苷类似物的组织培养皿(35×10mm)中。在第8天，固定细胞，脱水，并包埋进以前描述的Eponas中。制备薄切片，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，然后使用透射电子显微术检查。
实施例15
在Neuro2A细胞中的线粒体毒性试验
为了估测核苷类似物的造成神经元毒性的潜力，可以使用小鼠Neuro2A细胞(美国典型培养物保藏中心131)作为模型系统(参见Ray AS，Hernandez-Santiago BI，Mathew JS，Murakami E，Bozeman C，Xie MY，Dutschman GE，Gullen E，Yang Z，Hurwitz S，Cheng YC，Chu CK，McClure H，Schinazi RF，Anderson KS.Mechanism of anti-humanimmunodeficiency virus activity ofbeta-D-6-cyclopropylamino-2′，3′-didehydro-2′，3′-dideoxyguanosine.Antimicrob.Agents Chemother. 2005，49，1994-2001)。如所述的，使用基于3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑染料的试验，可以测量使细胞生长抑制50％所需的浓度(CC50)。如上所述，可以进行在给定的药物浓度时对细胞乳酸和线粒体DNA水平的扰动。在所有实验中，ddC和AZT可以用作对照核苷类似物。
实施例16
核苷酸类似物对线粒体DNA聚合酶γ的DNA聚合酶和外切核酸酶活性的影响
i)人聚合酶γ的纯化：如以前所述(参见Graves SW，Johnson AA，Johnson KA.Expression，purification，and initial kinetic characterizationof the large subunit of the human mitochondrial DNA polymerase.Biochemistry.1998，37，6050-8；Johnson AA，Tsai Y，Graves SW，JohnsonKA.Human mitochondrial DNA polymerase holoenzyme：reconstitutionand characterization.Biochemistry 2000；39：1702-8)，可以纯化聚合酶γ的重组大和小亚基。通过分光光度计法在280nm测定蛋白浓度，聚合酶γ的大和小亚基的消光系数分别为234，420和71，894M-1cm-1。
ii)核苷酸掺入的动力学分析：可以进行前稳态动力学分析，以测定DNA聚合酶γ对核苷-TP和天然dNTP底物的掺入催化效率(k/K)。这允许测定该酶的掺入修饰的类似物的相对能力和预测毒性。可以基本上如以前所述(参见Murakami E，Ray AS，Schinazi RF，Anderson KS.Investigating the effects of stereochemistry on incorporation and removalof 5-fluorocytidine analogs by mitochondrial DNA polymerase gamma：comparison of D-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004，62，57-64；Feng JY，Murakami E，Zorca SM，Johnson AA，Johnson KA，Schinazi RF，FurmanPA，Anderson KS.Relationship between antiviral activity and host toxicity：comparison of the incorporation efficiencies of2′，3′-dideoxy-5-fluoro-3′-thiacytidine-triphosphate analogs by humanimmunodeficiency virus type 1reverse transcriptase and humanmitochondrial DNA polymerase.Antimicrob Agents Chemother.2004，48，1300-6)，进行DNA聚合酶γ对核苷酸类似物的掺入的前稳态动力学分析。简而言之，可以将聚合酶γ的大(250nM)和小(1.25mM)亚基和60nM DNA模板/引物在50mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH 7.8中的预温育混合物加入到含有MgCl2(2.5mM)和不同浓度的核苷酸类似物的溶液中。如以前所述，淬灭和分析反应。可以将数据拟合至与上述相同的方程。
iii)人聚合酶γ3′5′外切核酸酶活性的测定：通过测量在有dNTP存在下切割产物的形成速率，可以研究人聚合酶γ外切核酸酶活性。通过将MgCl2(2.5mM)加入到聚合酶γ大亚基(40nM)、小亚基(270nM)、和1,500nM链-终止的模板/引物在50mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH 7.8中的预温育混合物中，可以开始反应，并在指定的时间点，用0.3M EDTA淬灭。可以在20％变性聚丙烯酰胺测序凝胶(8M脲)上，分析所有反应混合物，在Bio-Rad GS-525分子图像系统上成像，并用分子分析仪(Bio-Rad)定量。可以相对于时间绘制从早期时间点形成的产物。使用Sigma Plot(JandelScientific)，通过线性回归，拟合数据。可以将直线的斜率除以反应物中的活性酶浓度，以计算外切核酸酶活性的kexo(参见Murakami E，Ray AS，Schinazi RF，Anderson KS.Investigating the effects of stereochemistry onincorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitochondrialDNA polymerase gamma：comparison of D-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004；62：57-64；Feng JY，Murakami E，Zorca SM，Johnson AA，JohnsonKA，Schinazi RF，Furman PA，Anderson KS.Relationship betweenantiviral activity and host toxicity：comparison of the incorporationefficiencies of 2，3-dideoxy-5-fluoro-3-thiacytidine-triphosphate analogsby human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and humanmitochondrial DNA polymerase.Antimicrob Agents Chemother. 2004；48：1300-6)。
实施例17
骨髓细胞毒性试验
从Cambrex Bioscience(Walkersville，MD)商业上得到原代人骨髓单核细胞。使用双层软琼脂，在有50单位/mL人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子存在下，进行CFU-GM试验，而BFU-E试验使用含有1单位/mL促红细胞生成素的甲基纤维素基质(参见Sommadossi JP，Carlisle R.Toxicity of 3’-azido-3’-deoxythymidine and9-(1，3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal humanhepatopoietic progenitor cells in vitro.Antimicrob.Agents Chemother.1987；31：452-454；Sommadossi，JP，Schinazi，RF，Chu，CK和Xie，MY.Comparison of Cytotoxicity of the (-)and (+) enantiomer of2’，3’-dideoxy-3’-thiacytidine in normal human bone marrow progenitorcells.Biochem.Pharmacol.1992；44：1921-1925)。在来自3个不同供体的细胞中，一式两份地进行每个实验。使用AZT作为阳性对照。在有化合物存在下，在37℃、5％CO2下温育细胞14-18天，并使用倒置显微镜计数大于50个细胞的菌落，以测定IC50。通过药物浓度的对数相对于BFU-E存活分数的最小二乘法线性回归分析，得到50％抑制浓度(IC50)。使用独立的未配对样品的Student氏t检验，进行统计分析。
实施例18
抗-HBV试验
通过在四环素对照下处理携带野生型HBV的AD-38细胞系，测定化合物的抗-HBV活性(参见Ladner S.K.，Otto M.J.，Barker C.S.，Zaifert K.，Wang G.H.，Guo J.T.，Seeger C.&King R.W.Antimicrob.AgentsChemother. 1997，41，1715-20)。从培养基中除去四环素[Tet(-)]，导致HBV的产生。将用化合物处理过的细胞的培养上清液中的HBV水平与未处理对照组相比较。也保存含有四环素[Tet(+)]的对照培养物，以测定HBV表达的基础水平。包括3TC作为阳性对照。
实施例19
细胞毒性试验
如以前所述(参见Schinazi R.F.，Sommadossi J.-P.，Saalmann V.，Cannon D.L.，Xie M.-Y.，Hart G.C.，Smith G.A.&Hahn E.F.Antimicrob.Agents Chemorger. 1990，34，1061-67)，可以在Vero、人PBM、CEM(人类淋巴母细胞)、MT-2、和HepG2细胞中评估化合物的毒性。可以包括环己酰亚胺作为阳性细胞毒性对照，并可以包括接触溶剂的未处理细胞作为阴性对照。使用前述中效方法(参见Chou T.-C.&Talalay P.Adv.EnzymeRegul.1984，22，27-55；Belen’kii M.S.&Schinazi R.F.Antiviral Res.1994，25，1-11)，可以从浓度-反应曲线得到细胞毒性IC50。
实施例20
腺苷脱氨酶试验
为了测定腺苷脱氨酶对6-取代的-2-氨基嘌呤核苷单磷酸酯前药脱氨的倾向，用可商业得到的纯化的酶温育核苷化合物，然后通过分光光度计法测定反应物。反应条件是：50mM磷酸钾，pH 7.4，含有50μM核苷类似物，0.5mL，25℃。反应时间是7分钟(使用0.002单位的酶)和120分钟(使用0.2单位的酶)。(腺苷脱氨酶的单位定义是，在pH 7.5、在25℃，1个单位每分钟将1.0μmol的腺苷脱氨为肌苷)。脱氧腺苷是阳性对照，其在给定的条件下被0.002单位的酶在7分钟内59％脱氨化。脱氧鸟苷是阴性对照。在265nm或285nm测量光密度。将在实验开始和结束之间的光密度之差除以消光系数，然后乘以反应体积，以确定转化成产物的底物的mol数。将产物的mol数除以与100％完全反应等效的底物的摩尔数，然后乘以100，以得到脱氨百分比。检测限是0.001光密度单位。
实施例21
抗性病毒对核苷酸单磷酸酯前药的选择
以1×107个细胞，将外周血单核(PBM)细胞1接种进在2个T25烧瓶1通过蔗聚糖-泛影钠(Histopaque 1077：Sigma)密度梯度离心，可以从购自American Red Cross(Atlanta，GA)的血沉棕黄层中分离出PBM细胞。血沉棕黄层可以源自健康的、血清阴性的供体。在使用之前，可以用在500mL RPMI-1640(Mediatech Inc.，Herndon，VA)中的3μg/mL植物凝集素A(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)灭活细胞2-3天，所述RPMI-1640含有100mL热灭活的胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)、83.3IU/mL青霉素、83.3μg/mL链霉素、1.6mM L-谷氨酰胺(Mediatech Inc.，Herndon，VA)。中的共5ml RPMI-1640(Mediatech Inc.，Herndon，VA)中，所述RPMI-1640含有100mL热灭活的胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)、83.3IU/mL青霉素、83.3μg/mL链霉素(Mediatech Inc.，Herndon，VA)、1.6mM L-谷氨酰胺(Mediatech Inc.，Herndon，VA)、0.0008％DEAE-葡聚糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、0.047％碳酸氢钠、和26IU/mL重组白介素-2(ChironCorporation，Emeryville，CA)，一个烧瓶作为对照(未处理)，一个用药物处理。
可以用0.1μM的核苷酸单磷酸酯前药处理原初PBM细胞1小时，然后接种在100×TCID50的HIV-1LAI 2。可以允许处理过的PBM细胞组和对照未处理的PBM细胞组感染例如1小时。可以将另外5mL RTU培养基加入到每个烧瓶中，并在37℃培养细胞例如6天。
在第6天，从每个烧瓶取出1ml上清液。在9,740g、4℃离心2小时。然后将得到的病毒沉淀物重新悬浮于病毒溶解缓冲液中，用于逆转录酶分析。使用商业的QIAmp病毒RNA微型试剂盒(Quiagen)，可以从培养上清液分离出总RNA。可以在对照病毒和核苷酸单磷酸酯前药处理过的病毒之间，平行地进行测序，以测定是否存在通过施加药物压力数周而产生的任意突变(其中病毒表现得有抗性)。
在处理之前，可以每周计算并密切监测处理的病毒组相对于未处理的病毒组的抑制百分比。在多达47周或更长的阶段内，病毒组的选择压力可以从0.1μM增加至3.5μM(EC50值的40倍)。
实施例22
核苷类似物三磷酸酯的合成
使用Ludwig和Eckstein的方法(Ludwig J，Eckstein F.“Rapid andefficient synthesis of nucleoside 5′-O-(1-thiotriphosphates)，5′-triphosphates and 2′，3′-cyclophosphorothioates using2HIV-1/LAI可以从疾病控治和预防中心得到，并用作抗性组的病毒，可以选择0.1的感染复数(MOI)来开始受感染组，所述感染复数通过在PBM细胞中的有限稀释方法来测定。2-chloro-4H-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one”J.Org.Chem.1989，54631-5)，从对应的核苷合成核苷类似物三磷酸酯。可以纯化粗核苷类似物三磷酸酯，例如，通过FPLC，其中使用HiLoad 26/10Q琼脂糖快速流Pharmacia柱和TEAB缓冲液梯度(pH 7.0)。通过紫外波谱学、质子和磷NMR、质谱法和HPLC，表征产物。
得到的三磷酸酯可以用作上述细胞药理学试验的对照，并用于HIV-RT的动力学测定(例如，6-取代的-2-氨基嘌呤核苷三磷酸酯和HIV-RT)。
实施例23
针对HSV-1和HSV-2的活性的筛选试验
在CPE-抑制试验中，在感染之前1h加入药物，所以试验系统将具有最大灵敏度，并检测早期复制步骤(诸如吸附或穿透)以及晚期事件的抑制剂。为了排除结合细胞的病毒的非特异性抑制，使用经典的噬斑减少试验(其中在感染之后1h加入药物)，可以验证在CPE试验中表现出适当活性的所有化合物。在化合物阻断吸附的情况下，它将在CPE试验中显示为阳性，但是可能在噬斑试验中是阴性的。效能：使用最少6种药物浓度，其覆盖了100mg/ml至0.03mg/ml的范围，增量为5倍。从这些数据，可以计算出使病毒复制抑制50％的剂量(有效浓度50；EC50)。毒性：在每个试验中，在未感染的细胞上，也可以使用用于测定效能的相同药物浓度，以测定每种实验化合物的毒性。通过它们不能成为活力株(中性红)，测定对细胞有细胞毒性的药物浓度。
还可以如以前所述(Schinazi，R.F.，Peters，J.，Williams，C.C.，Chance，D.，Nahmias，A.J.“Effect of combinations of acyclovir with vidarabine orits 5′-monophosphate on herpes simplex virus in cell culture and in mice.”Antimicrob.Agents Chemother.1982，22，499-507)，进行HSV-1药物敏感性试验。
实施例24
HCV复制子试验1
以5000个细胞/孔，将含有HCV复制子RNA的Huh 7克隆B细胞接种进96-孔板中，在接种后，立即一式三份地测试10μM的化合物。温育(37℃，5％CO2)5天后，使用来自Gentra的versaGene RNA纯化试剂盒，分离总细胞RNA。在单步多路实时RT-PCR试验中，扩增复制子RNA和内部对照(TaqMan rRNA对照试剂，Applied Biosystems)。通过从无药物对照的阈值RT-PCR循环中减去测试化合物的阈值RT-PCR循环(ΔCtHCV)，计算化合物的抗病毒有效性。3.3的ΔCt等于在复制子RNA水平的1-log减少(等于90％原料减少)。还使用ΔCt rRNA值，计算化合物的细胞毒性。(2′-Me-C)用作对照。为了测定EC90和IC50值2，首先将ΔCt：值转化成原料的分数3，然后用于计算％抑制。
参考文献：
1.Stuyver L等人，Ribonucleoside analogue that blocks replication orbovine viral diarrhea and hepatitis C viruses in culture.Antimicrob.AgentsChemother.2003，47，244-254.
2.Reed IJ&Muench H，A simple method or estimating fifty percentendpoints.Am.J.Hyg.27：497，1938.
3.Applied Biosystems Handbook
实施例25
还如以前所述(Song，G.Y.，Paul，V.，Choo，H.，Morrey，J.，Sidwell，R.W.，Schinazi，R.F.，Chu，C.K.Enantiomeric synthesis of D-andL-cyclopentenyl nucleosides and their antiviral activity against HIV andWest Nile virus.J.Med. Chem.2001，44，3985-3993)，进行西尼罗病毒药物敏感性试验。
实施例26
还如以前所述(Julander，J.G.，Furuta，Y.，Shafer，K.，Sidwell，R.W.Activity of T-1106in a Hamster Model of Yellow Fever Virus Infection.Antimicrob.Agents Chemother.2007，51，1962-1966)，进行黄热病药物敏感性试验。
实施例27
在Lim等人，A scintillation proximity assay for dengue virus NS52′-O-methyltransferase kinetic and inhibition analyses，AntiviralResearch，Volume 80，Issue 3，December 2008，第360-369页中，描述了鉴别可用于治疗登革热的化合物的一种代表性的高处理量试验。
登革热病毒(DENV)NS5在它的N-端氨基酸序列处具有甲基转移酶(MTase)活性，并负责病毒基因组RNA中1型帽结构m7GpppAm2′-O的形成。使用纯化的重组蛋白和短的生物素化的GTP-加帽的RNA模板，可以表征DENV22′-O-MTase活性的最佳体外条件。源自初速度的稳态动力学参数可以用于建立稳健的闪烁迫近试验，用于化合物测试。Lim等人，Antiviral Research，Volume 80，Issue 3，December 2008，第360-369页的预温育研究证实，MTase-AdoMet和MTase-RNA复合物同样是催化活性的，且该酶支持随机的bibi动力学机制。Lim使用竞争抑制剂S-腺苷基-高半胱氨酸和两种同源物西奈芬净和脱氢西奈芬净验证了试验。以前假定存在于DENV2Mtase的N-端处的GTP-结合袋是帽结合位点。该试验允许快速且非常灵敏地检测2′-O-MTase活性，且可以容易地适应抑制性的化合物的高处理量筛选。它适用于测定多种RNA加帽MTase的酶活性。
实施例28
抗-诺如病毒活性
通过抑制诺如病毒聚合酶和/或解螺旋酶，通过抑制在复制周期中需要的其它酶，或通过其它途径，化合物可以表现出抗-诺如病毒活性。
目前没有经批准的用于诺如病毒感染的药物治疗(http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/gastro/norovirus-qa.htm)，这可能至少部分地归因于缺乏可利用的细胞培养系统。近年来，已经为最初的诺瓦克病毒G-I株开发了复制子系统(Chang，K.O.等人(2006)Virology353：463-473)。
诺如病毒复制子和丙型肝炎复制子都需要有功能的病毒解螺旋酶、蛋白酶和聚合酶，以便进行复制子的复制。最近，已经报道了使用诺如病毒基因群I和II接种物的体外细胞培养感染性试验(Straub，T.M.等人(2007)Emerg.Infect.Dis.13(3)：396-403)。该试验在转壁生物反应器中进行，其中使用在微载体珠子上的小肠上皮细胞。该感染性试验可以用于筛选进入抑制剂。
实施例29
Hep G2细胞中核苷向有活性的三磷酸酯的磷酸化试验
为了测定化合物的细胞代谢，可以从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)得到HepG2细胞，并在225cm2组织培养瓶中培养，所述培养瓶含有添加了非必需氨基酸、1％青霉素-链霉素的最低必需培养基。每3天更换培养基，每周将细胞继代培养一次。在暴露于30ml胰蛋白酶-EDTA 10分钟、并用培养基连续洗涤3次，从而使贴壁单层细胞脱离之后，以2.5×106个细胞/孔的密度，将汇合的HepG2细胞接种进6-孔板，并暴露于10μM的[3H]标记的活性化合物(500dpm/pmol)指定的时间段。
在5％CO2气氛下，在37℃，维持细胞。在选择的时间点，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞3次。
如下提取细胞内活性化合物和它的各个代谢物：用60％甲醇在-20℃温育细胞沉淀物过夜，然后用在冰浴中的另外的20pal的冷甲醇提取1小时。然后合并提取物，在轻柔的滤过空气流下干燥，并在-20℃储存，直到HPLC分析。
实施例30
在食蟹猴中的生物利用度试验
下述方法可以用于测定化合物是否是生物可利用的。在研究开始之前1周内，可以通过手术给食蟹猴植入长期静脉导管和皮下静脉访问口(VAP)以便利血液收集，且可以经历体格检查，包括血液学和血清化学评价和体重记录。每只猴(共6只)接受大约250μCi的3H活性，活性化合物的每次给药是在10mg/kg的剂量水平，5mg/mL的剂量浓度，通过静脉内推注(3只猴，IV)，或通过经口管饲法(3只猴，PO)。在给药之前，称量每个给药注射器，以根据重量确定施用的制剂的量。在指定的间隔(给药前大约18-0小时，给药后0-4、4-8和8-12小时)，通过收集盘，收集尿样，并处理。通过长期静脉导管和VAP，或从末梢血管(如果长期静脉导管操作不可行的话)，同样收集血样(给药前，给药后0.25、0.5、1、2、3、6、8、12和24小时)。分析血样和尿样的最大浓度(Cmax)、达到最大浓度时的时间(TmaX)、曲线下面积(AUC)、剂量浓度的半衰期(TV)、清除率(CL)、稳态体积和分布(Vss)和生物利用度(F)。
实施例31
细胞保护试验(CPA)
基本上如Baginski，S.G.；Pevear，D.C.；Seipel，M.；Sun，S.C.C.；Benetatos，C.A.；Chunduru，S.K.；Rice，C.M.和M.S.Collett“Mechanismof action of a pestivirus antiviral compound”PNAS USA 2000，97(14)，7981-7986所述，进行试验。在使用之前24小时，将MDBK细胞(ATCC)接种到96-孔培养板上(4,000个细胞/孔)。以每个细胞0.02噬斑形成单位(PFU)的感染复数(MOI)，用BVDV(株NADL，ATCC)感染后，将测试化合物的系列稀释物加给受感染的和未感染的细胞，在生长培养基中的终浓度是0.5％DMSO。一式四份地测试每个稀释物。
调节细胞密度和病毒接种物，以确保在整个实验中的连续细胞生长，并在感染后4天后，在未处理的对照中达到超过90％病毒诱导的细胞破坏。4天后，用50％TCA固定平板，并用磺酰罗丹明B染色。在微量培养板读数器中，在550nm读取孔的光密度。
50％有效浓度(EC50)值被定义为使病毒的致细胞病变效应减少50％时的化合物浓度。
实施例32
噬斑减少试验
对于一种化合物，通过噬斑减少试验，在24-孔平板中一式两份地测定有效浓度。用100PFU/孔的病毒，感染细胞单层。然后，向所述单层添加测试化合物在MEM中的系列稀释物，所述MEM补充了2％灭活血清和0.75％甲基纤维素。另外在37℃温育培养物3天，然后用50％乙醇和0.8％结晶紫固定，洗涤，并风干。然后，计数噬斑，以测定达到90％病毒抑制的浓度。
实施例33
产量减少试验
对于一种化合物，通过产量减少试验，在24-孔平板中一式两份地测定达到病毒载量的6-log减少的浓度。如Baginski，S.G.；Pevear，D.C.；Seipel，M.；Sun，S.C.C.；Benetatos，C.A.；Chunduru，S.K.；Rice，C.M.和M.S.Collett“Mechanism of action of a pestivirus antiviral compound”PNAS USA 2000，97(14)，7981-7986所述，经过微小改进，进行试验。
简而言之，在用BVDV(NADL株，感染复数(MOI)为0.1PFU/细胞)感染之前24小时，将MDBK细胞接种到24-孔平板上(2×105个细胞/孔)。将测试化合物的系列稀释物加给细胞，在生长培养基中的终浓度为0.5％DMSO。一式三份地测试每个稀释物。3天后，通过3个冻融循环，裂解细胞培养物(细胞单层和上清液)，并通过噬斑试验，定量病毒产量。简而言之，在使用之前24h，将MDBK细胞接种到6-孔平板上(5×105个细胞/孔)。给细胞接种0.2ml测试裂解物1小时，洗涤，并覆盖在生长培养基中的0.5％琼脂糖。3天后，用3.5％甲醛固定细胞单层，并用1％结晶紫(w/v，在50％乙醇中)染色，以使噬斑显影。计数噬斑，以测定使病毒载量达到6-log减少的浓度。
实施例34
诺如病毒感染的诊断
可以如下诊断诺如病毒感染：使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)试验，检测受累的人的粪便中的病毒RNA。从在征状发作后48-72小时内采取的粪便样本中，可以鉴别出该病毒，尽管使用RT-PCR，在征状发作后长达7天时采取的样品上，也可以得到令人满意的结果。其它诊断方法包括电子显微术和血清学试验(对于间隔至少3周收集的双份血清中的滴度的升高)。也存在可利用的商业的酶联免疫测定法，但是它们倾向于具有相对低的灵敏度，这限制了它们用于诊断暴发的病原学。经常使用诺如病毒感染的临床诊断，特别当胃肠炎的其它致病因子已经被排除时。
实施例35
体外抗病毒活性
可以在下述细胞系中评价体外抗病毒活性：
诺瓦克病毒G-I株(Chang，K.O.等人(2006)Virology 353：463-473)，GII-4株复制子以及其它诺如病毒复制子可用于试验中，以测定本文所述的化合物或其它化合物或化合物文库的体外抗病毒活性。
在有些实施方案中，复制子系统是亚基因组的，因此允许评价非结构蛋白的小分子抑制剂。这可以为诺如病毒药物发现提供相同的益处，即丙型肝炎复制子促成可用于治疗该病毒的治疗剂的发现(Stuyver，L.J.等人(2006)Antimicrob.Agents Chemother.47：244-254)。诺如病毒复制子和丙型肝炎复制子都需要有功能的病毒解螺旋酶、蛋白酶、和聚合酶，以便进行复制子的复制。据信，本文所述的化合物会抑制病毒聚合酶和/或病毒解螺旋酶。
也可以使用体外细胞培养感染性试验，其使用诺如病毒基因群I和II接种物予以报道(Straub，T.M.等人(2007)Emerg.Infect.Dis.13(3)：396-403)。该试验可以在转壁生物反应器中进行，其中使用在微载体珠子上的小肠上皮细胞。感染性试验可以用于筛选化合物的抑制目标病毒的能力。
实施例36
用于鉴别抗癌化合物的筛选方法
在Skehan等人，Journal of the National Cancer Institute，Vol.82，No.13，1107-1112，July 4，1990中，描述了用于鉴别抗癌化合物的代表性的筛选方法。
Skehan的方法测量96-孔微孔滴定板中的贴壁和悬浮培养物的细胞蛋白含量，且适用于普通的实验室目的和非常大规模应用。
用三氯乙酸固定培养物，并用溶解在1％醋酸中的0.4％(重量/体积)磺酰罗丹明B(SRB)染色30分钟。通过用1％醋酸洗涤4次，去除未结合的染料，用10mM未缓冲的Tris碱[三(羟甲基)氨基甲烷]提取蛋白结合的染料，用于在与计算机接口的96-孔微孔滴定板读数器中测定光密度。
在稀疏亚汇合至多层超汇合范围的密度，SRB试验结果与细胞数目成线性关系，且与通过Lowry和Bradford试验测得的细胞蛋白的值成线性关系。
对于1,000个细胞/孔，在564nm的信噪比是大约1.5。将SRB试验的灵敏度有利地与几个荧光试验的灵敏度相对比，且据称优于Lowry和Bradford试验的灵敏度和20种其它可视染料的灵敏度。SRB试验提供了色度法终点，它是对裸眼无害的、无限稳定的、和可见的。它提供了药物诱导的细胞毒性的灵敏度量，可用于定量集落生成，且非常适用于高容量、自动化的药物筛选。用在488nm的激光激发，SRB强烈地发出荧光，且可以通过静态荧光细胞计量术在单细胞水平定量地测量。
尽管前面的说明书教导了本发明的原理，并为例证目的提供了实施例，应该理解，本发明的实践包括落入下面的权利要求和它们的等同方案的范围内的所有常见的变化、改进和/或修饰。
Claims (61)
1.式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
v)当作为母体核苷施用时，R1是在体内被去除以形成OH的原子或基团，例如，卤素(F、Cl、Br、I)、OR’、N(R’)2、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、和NHCOOR’；
每个R’独立地是H、低级烷基(C1-C6)、低级卤代烷基(C1-C6)、低级烷氧基(C1-C6)、低级烯基(C2-C6)、低级炔基(C2-C6)、低级环烷基(C3-C6)芳基、杂芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基；
vi)W独立地是N、CH、CF、CCN、CC≡CH、或CC(O)N(R’)2；
xv)糖是通式(II)的核糖或修饰的核糖：
其中：
Y是O或S；
Z选自：CL2、CL2CL2、CL2OCL2、CL2SCL2、CL2O、OCL2和
CL2NHCL2，其中L独立地选自：H、F、烷基、烯基、和炔基，其中烷基、烯基、和炔基可以各自任选地含有一个或多个杂原子；
A是O、S、CH2、CHF、CF2、C＝CH2、C＝CHF、或C＝CF2；
R4，、R5、R5′、R6、R6′、和R7’独立地选自：H、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、N3、C(O)OH、CN、C(O)NH2、C(S)NH2、C(O)OR、R、OR、SR、SSR、NHR、和NR2；
其中，对于其中糖是式(II)的式(I)，当A是O且R4，、R5、R5′、R6、R7’是H时，则R6，不能是N3；
其中，对于其中糖是式(II)的式(I)，当A是O或S时，则R7’不能是OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、OR、SR、SSR、NHR、和NR2；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基；
R2和R3独立地选自：
(a)OR8，其中R8是H、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-6卤代烷基、芳基、或杂芳基，包括、但不限于任选地被1-3个取代基取代的苯基或萘基，所述1-3个取代基独立地选自：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、(CH2)1-6CO2R9a、卤素、C1-6卤代烷基、-N(R9a)2、C1-6酰氨基、-NHSO2C1-6烷基、-SO2N(R9a)2、-SO2C1-6烷基、COR9b、硝基和氰基；
R9a独立地是H或C1-6烷基；
R9b是-OR9a或-N(R9a)2；
(b)
其中R10a和R10b是：
(i)独立地选自：H、C1-10烷基、-(CH2)rNR9a 2、C1-6羟基烷基、-CH2SH、-(CH2)2S(O)pMe、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、(1H-吲哚-3-基)甲基、(1H-咪唑-4-基)甲基、-(CH2)mCOR9b、芳基和芳基-C1-3烷基，所述芳基任选地被选自下述的基团取代：羟基、C1-10烷基、C1-6烷氧基、卤素、硝基、和氰基；
(ii)R10a是H，且R10b和R12一起是(CH2)2-4以形成包含邻接的N和C原子的环；
(iii)R10a和R10b一起是(CH2)n，以形成环；
(iv)R10a和R10b都是C1-6烷基；或
(v)R10a是H，且R10b是H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3、CH2Ph、CH2-吲哚-3-基、-CH2CH2SCH3、CH2CO2H、CH2C(O)NH2、CH2CH2COOH、CH2CH2C(O)NH2、CH2CH2CH2CH2NH2-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2-咪唑-4-基、CH2OH、CH(OH)CH3、CH2((4’-OH)-Ph)、CH2SH、或低级环烷基；
p是0-2；
r是1-6；
n是4或5；
m是0-3；
R11是H、C1-10烷基、或被下述基团取代的C1-10烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(例如苯基)、杂芳基(例如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
R12是H、C1-3烷基，或者R10a或R10b和R12一起是(CH2)2-4从而形成包含邻接的N和C原子的环；
(c)O连接的脂质(包括磷脂)、N或O连接的肽、O连接的胆固醇、或O连接的植物甾醇；
(d)R2和R3可以一起形成环
其中W2选自任选地被1-3个独立地选自下述的取代基取代的苯基或单环杂芳基：C1-6烷基、CF3、C2-6烯基、C1-6烷氧基、OR9c、CO2R9a、COR9a、卤素、C1-6卤代烷基、-N(R9a)2、C1-6酰氨基、CO2N(R9a)2、SR9a、-NHSO2C1-6烷基、-SO2N(R9a)2、-SO2C1-6烷基、COR9b、和氰基，且其中所述单环杂芳基和取代的单环杂芳基具有1-2个独立地选自N、O、和S的杂原子，条件是：
a)当存在两个杂原子且一个是O时，则另一个不能是O或S，
且
b)当存在两个杂原子且一个是S时，则另一个不能是O或S；
R9a独立地是H或C1-6烷基；
R9b是-OR9a或-N(R9a)2；
R9c是H或C1-6酰基；
(e)
其中R13选自H、C1-10烷基、任选地被下述基团取代的C1-10烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(例如苯基)、杂芳基(例如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
f)R2和R3可以一起形成环
其中R14是：(i)独立地选自：H、C1-10烷基、-(CH2)rNR2 9a、C1-6羟基烷基、-CH2SH、-(CH2)2S(O)pMe、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、(1H-吲哚-3-基)甲基、(1H-咪唑-4-基)甲基、-(CH2)mCOR9b、芳基和芳基-C1-3烷基或杂芳基和杂芳基-C1-3烷基，所述芳基和杂芳基任选地被选自下述的基团取代：羟基、C1-10烷基、C1-6烷氧基、卤素、硝基、和氰基；(ii)R14是H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3、CH2Ph、CH2-吲哚-3-基、-CH2CH2SCH3、CH2CO2H、CH2C(O)NH2、CH2CH2COOH、CH2CH2C(O)NH2、CH2CH2CH2CH2NH2、CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2-咪唑-4-基、CH2OH、CH(OH)CH3、CH2((4’-OH)-Ph)、CH2SH、或低级环烷基；
p是0-2；
r是1-6；
m是0-3；
Q1是NR9a、O、或S；
Q2是C1-10烷基、C1-6羟基烷基、芳基和芳基-C1-3烷基、杂芳
基和杂芳基-C1-3烷基，所述芳基和杂芳基任选地被选自下述的基团取代：羟基、C1-10烷基、C1-6烷氧基、氟代、和氯代；
R11是H、C1-10烷基、任选地被下述基团取代的C1-10烷基：
低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(例如苯基)、杂芳基(例如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
R12是H或C1-3烷基，或者R14b和R12一起是(CH2)2-4，从而形成包含邻接的N和C原子的环；
xvi)或者，糖是通式(III)的修饰的核糖：
其中：
A、R2、R3、Y、Z、R4，、R5′、R6′、和R7’如上面所定义；
其中，对于其中糖是式(III)的式(I)，当A是O或S时，则R7’不能是OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、OR、SR、SSR、NHR、和NR2，
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基；
xvii)或者，糖是通式(IV)、(V)、(VI)、和(VII)的二氧戊环或氧硫杂环戊烷：
其中：
V是S或Se；
R2、R3、Y、和Z如上面所定义；
xviii)或者，糖是通式(VIII)的膦酰基甲氧基烷基：
其中：
R2、R3、和Y如上面所定义；
R15选自：烷基(包括但不限于C1-C6)、烯基(包括但不限于C2-C6)、和炔基(包括但不限于C2-C6)、环烷基(包括但不限于C3-C8)、芳基(包括但不限于C6-C10)、杂芳基(包括但不限于C6-C10)、芳基烷基、和烷基芳基；
xix)或者，糖具有通式(IX)或(X)：
其中：
R2、R3、和Y如上面所定义；
Y2是O、S、Se NR；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基；
R16和R17被定义为H、CH3、CH2OR18；
R18是H或低级酰基(C1-C6)；
xx)或者，糖是通式(XI)的修饰的核糖：
其中：
R2、R3、和Y如上面所定义；
R4，、R5、R5′、R6、和R6′如上面所定义；
R19是H、F、Cl、Br、I、N3、C(O)OH、CN、C(O)NH2、C(S)NH2、C(O)OR、R，
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基；
其中所述化合物可以是β-L-或β-D-构型的形式，或其混合物，包括其外消旋混合物。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R6’选自：H、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、C(O)OH、CN、C(O)NH2、C(S)NH2、C(O)OR、R、OR、SR、SSR、NHR、和NR2。
3.式(XII)、(XIII)、或(XIV)的化合物：
(XII)(XIII)(XIV)
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R4，、R5、R5′、R6、Y、A、和R7′如上面在权利要求1中所定义；
R20是低级烷基(C1-C6烷基)；
M是O、S、或NR；
R独立地是低级烷基(C1-C6烷基)、低级烯基、低级炔基、低级环烷基(C3-C6环烷基)芳基、烷基芳基、或芳基烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上面所定义的取代基取代，所述取代基例如，羟基烷基、氨基烷基、和烷氧基烷基；
碱基选自：
其中所述化合物可以是β-L-或β-D-构型的形式，或其混合物，包括其外消旋混合物。
4.式(XV)或(XVI)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R4，、R5、R5′、R6、Y、A、R7′、R20和碱基如上面在权利要求1中所定义；
R21是H、C1-10烷基、任选地被下述基团取代的C1-10烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基(诸如苯基)、杂芳基(诸如吡啶基)、取代的芳基、或取代的杂芳基；其中所述取代基是C1-5烷基或被下述基团取代的C1-5烷基：低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟代、C3-10环烷基、或环烷基；
R22是H、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3、CH2Ph、CH2-吲哚-3-基、-CH2CH2SCH3、CH2CO2H、CH2C(O)NH2、CH2CH2COOH 、CH2CH2C(O)NH2、CH2CH2CH2CH2NH2、CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2-咪唑-4-基、CH2OH、CH(OH)CH3、CH2((4’-OH)-Ph)、CH2SH、或低级环烷基；
其中所述化合物可以是β-L-或β-D-构型的形式，或其混合物，包括其外消旋混合物。
5.式(XVII)或(XVIII)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R4’、R5、R5′、R6、Y、M、R7′、R20、R21、R22、和碱基如上面在权利要求1中所定义；且其中所述化合物可以是β-L-或β-D-构型的形式，或其混合物，包括其外消旋混合物。
6.如权利要求1所述的化合物，其中R5选自：NH2、二甲胺、甲基-烯丙基-胺、甲氧基、氯代、环丙胺、5-羟基-戊基胺、1，1-二甲基-乙醇胺、和2-甲氧基-乙胺。
7.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是β-L-或β-D构型或其外消旋混合物。
8.一种用于治疗被HIV-1或HIV-2感染的宿主的方法，所述方法包括，给需要该治疗的患者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
9.一种用于预防HIV-1或HIV-2感染的方法，所述方法包括，给需要该预防的患者施用预防有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
10.一种用于减少宿主中的HIV-1或HIV-2感染的生物活性的方法，所述方法包括，给需要该治疗的患者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述HIV-1或HIV-2感染由包含突变的病毒造成，所述突变选自TAM突变和M184V突变。
12.一种用于治疗被HIV-1或HIV-2感染的宿主的方法，所述方法包括，与另一种抗-HIV剂组合地施用在药学上可接受的载体中的有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述HIV-1或HIV-2感染由包含突变的病毒造成，所述突变选自TAM突变和M184V突变。
14.一种用于预防HIV-1或HIV-2感染的方法，所述方法包括，与另一种抗-HIV剂组合地给需要该预防的患者施用在药学上可接受的载体中的预防有效量的如权利要求1-6中任一项所述的化合物。
15.一种用于治疗被HBV感染的宿主的方法，所述方法包括，给需要该治疗的患者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
16.一种用于预防HBV感染的方法，所述方法包括，给需要该预防的患者施用预防有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
17.一种用于减少宿主中的HBV感染的生物活性的方法，所述方法包括，给需要该治疗的患者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
18.一种用于治疗被HBV感染的宿主的方法，所述方法包括，与另一种抗-HBV剂组合地施用在药学上可接受的载体中的有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
19.一种用于预防HBV感染的方法，所述方法包括，与另一种抗-HBV剂组合地给需要该预防的患者施用在药学上可接受的载体中的预防有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
20.一种用于治疗被诺如病毒或沙波病毒感染的宿主的方法，所述方法包括，给需要该治疗的患者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
21.一种用于预防诺如病毒或沙波病毒感染的方法，所述方法包括，给需要该预防的患者施用预防有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
22.一种用于减少宿主中的诺如病毒或沙波病毒感染的生物活性的方法，所述方法包括，给需要该治疗的患者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
23.一种用于治疗被诺如病毒或沙波病毒感染的宿主的方法，所述方法包括，与另一种抗-诺如病毒或抗-沙波病毒剂组合地施用在药学上可接受的载体中的有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
24.一种用于预防诺如病毒或沙波病毒感染的方法，所述方法包括，与另一种抗-诺如病毒或抗-沙波病毒剂组合地给需要该预防的患者施用在药学上可接受的载体中的预防有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
25.一种用于治疗被包括HCV、黄热病、登革热、和西尼罗病毒在内的黄病毒科病毒感染的宿主的方法，所述方法包括，给需要该治疗的患者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
26.一种用于预防包括HCV、黄热病、登革热、和西尼罗病毒在内的黄病毒科病毒的感染的方法，所述方法包括，给需要该预防的患者施用预防有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
27.一种用于减少宿主中包括HCV、黄热病、登革热、和西尼罗病毒在内的黄病毒科病毒感染的生物活性的方法，所述方法包括，给需要该治疗的患者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
28.一种用于治疗被包括HCV、黄热病、登革热、和西尼罗病毒在内的黄病毒科病毒感染的宿主的方法，所述方法包括，与另一种抗-诺如病毒或抗-沙波病毒剂组合地施用在药学上可接受的载体中的有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
29.一种用于预防包括HCV、黄热病、登革热、和西尼罗病毒在内的黄病毒科病毒的感染的方法，所述方法包括，与另一种抗-诺如病毒或抗-沙波病毒剂组合地给需要该预防的患者施用在药学上可接受的载体中的预防有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
30.一种用于治疗被HSV-1或HSV-2感染的宿主的方法，所述方法包括，给需要该治疗的患者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
31.一种用于预防HSV-1或HSV-2感染的方法，所述方法包括，给需要该预防的患者施用预防有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
32.一种用于减少宿主中的HSV-1或HSV-2感染的生物活性的方法，所述方法包括，给需要该治疗的患者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
33.一种用于治疗被HSV-1或HSV-2感染的宿主的方法，所述方法包括，与另一种抗-HSV-1和HSV-2剂组合地施用在药学上可接受的载体中的有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
34.一种用于预防HSV-1或HSV-2感染的方法，所述方法包括，与另一种抗-HSV-1或抗-HSV-2剂组合地给需要该预防的患者施用在药学上可接受的载体中的预防有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
35.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于治疗被HIV-1或HIV-2感染的宿主。
36.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于预防HIV-1或HIV-2感染。
37.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于减少HIV-1或HIV-2感染的生物活性。
38.如权利要求35所述的应用，其中所述HIV-1或HIV-2感染由包含突变的病毒造成，所述突变选自TAM突变和M184V突变。
39.如权利要求1-7中任一项所述的化合物和另一种抗-HIV剂用于制备药物的应用，所述药物用于治疗被HIV-1或HIV-2感染的宿主。
40.如权利要求39所述的应用，其中所述HIV-1或HIV-2感染由包含突变的病毒造成，所述突变选自TAM突变和M184V突变。
41.如权利要求1-7中任一项所述的化合物和另一种抗-HIV剂用于制备药物的应用，所述药物用于预防HIV-1或HIV-2感染。
42.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于治疗被HBV感染的宿主。
43.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于预防HBV感染。
44.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于减少宿主中HBV感染的生物活性。
45.如权利要求1-7中任一项所述的化合物和另一种抗-HBV剂用于制备药物的应用，所述药物于治疗被HBV感染的宿主。
46.如权利要求1-7中任一项所述的化合物和另一种抗-HBV剂用于制备药物的应用，所述药物用于预防HBV感染。
47.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于治疗被诺如病毒或沙波病毒感染的宿主。
48.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于预防诺如病毒或沙波病毒感染。
49.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于减少宿主中诺如病毒或沙波病毒感染的生物活性。
50.如权利要求1-7中任一项所述的化合物和另一种抗-诺如病毒或抗-沙波病毒剂用于制备药物的应用，所述药物用于治疗被诺如病毒或沙波病毒感染的宿主。
51.如权利要求1-7中任一项所述的化合物和另一种抗-诺如病毒或抗-沙波病毒剂用于制备药物的应用，所述药物用于预防诺如病毒或沙波病毒感染。
52.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于治疗被包括HCV、黄热病、登革热、和西尼罗病毒在内的黄病毒科病毒感染的宿主。
53.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于预防包括HCV、黄热病、登革热、和西尼罗病毒在内的黄病毒科病毒的感染。
54.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于减少宿主中包括HCV、黄热病、登革热、和西尼罗病毒在内的黄病毒科病毒感染的生物活性。
55.如权利要求1-7中任一项所述的化合物和另一种抗-诺如病毒或抗-沙波病毒剂用于制备药物的应用，所述药物用于治疗被包括HCV、黄热病、登革热、和西尼罗病毒在内的黄病毒科病毒感染的宿主。
56.如权利要求1-7中任一项所述的化合物和另一种抗-诺如病毒或抗-沙波病毒剂用于制备药物的应用，所述药物用于预防包括HCV、黄热病、登革热、和西尼罗病毒在内的黄病毒科病毒的感染。
57.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于治疗被HSV-1或HSV-2感染的宿主。
58.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于预防HSV-1或HSV-2感染。
59.如权利要求1-7中任一项所述的化合物用于制备药物的应用，所述药物用于减少宿主中HSV-1或HSV-2感染的生物活性。
60.如权利要求1-7中任一项所述的化合物和另一种抗-HSV-1和HSV-2剂用于制备药物的应用，所述药物用于治疗被HSV-1或HSV-2感染的宿主。
61.如权利要求1-7中任一项所述的化合物和另一种抗-HSV-1和HSV-2剂用于制备药物的应用，所述药物用于预防HSV-1或HSV-2感染。
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