CN107207554B - 作为抗癌化合物的新的2’和/或5’-氨基酸酯氨基磷酸酯3’-脱氧腺苷衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化合物，用于治疗方法的化合物，特别是在用于癌症的预防或治疗的方法中的化合物，制备该化合物的方法和包含该化合物的药物组合物。该化合物特别地可用于治疗智人中的白血病、淋巴瘤和/或实体瘤。该化合物是具有2’和/或5’‑氨基酸酯氨基磷酸酯部分的虫草素(3’‑脱氧腺苷)的衍生物。

Description

作为抗癌化合物的新的2’和/或5’-氨基酸酯氨基磷酸酯3’- 脱氧腺苷衍生物
技术领域
本发明涉及化合物、用于治疗方法的化合物，特别是在用于癌症的预防或 治疗的方法中的化合物，制备该化合物的方法和包含该化合物的药物组合物。
具体地，但不限于，但本发明涉及用于治疗智人的白血病、淋巴瘤和/或实 体瘤的化合物。
背景技术
虫草素是3’-脱氧腺苷(3’dA)。它是一种缺乏核糖部分上的3’-羟基的腺苷 的核苷类似物。
虫草素是蛹虫草(Cordyceps militaris)产生的主要生物活性物质之一，蛹虫 草是由于它的免疫激活剂、抗衰老和抗肿瘤作用而用于传统中药的寄生真菌。 可参考Tuli,H.S.等人，3Biotech(2014)4:1-12。
可从腺苷合成生产虫草素。这种合成程序可参考Robins,J.R.等人，J.Org.Chem.1995,60,7902-7908和Aman,S.等人，Organic Process Research& Development2000,4,601-605。
虫草素作为抗癌剂被最为广泛地进行研究。
由于它的结构，3’dA及其三磷酸酯形式可能潜在地干扰分别需要腺苷或 三磷酸腺苷(ATP)的任何过程。
然而，在施用后，3’dA被腺苷脱氨酶(ADA)快速脱氨基，并在体内迅速 代谢成无活性代谢物3’-脱氧肌苷。可参考Tsai,Y-J等人，J.Agri.Food Chem.58 4638-43(2010)。
如Glazer,R.等人，Cancer Research 38,2233-2238(1978)中描述的，当与腺 苷脱氨酶抑制剂组合使用时，虫草素被证实展示抗癌效力，如喷司他丁 (pentostatine)(2-脱氧助间型霉素，dCF)。还提出了其他ADA抑制剂作为与 虫草素一起施用的替代性复合药物(co-drugs)，但它是已经用于临床试验的 3’dA-dCF的组合。然而，如在Wehbe-Janek,H.等人，Anticancer Research 27:3143-3146(2007)中公认的，已知2-脱氧助间型霉素是相对毒性的药物。
也已知2-氟虫草素(3’脱氧-2-氟腺苷)是细胞毒性的(参见例如，Montgomery 等人，J.Med.Chem.,1969,12(3),498-504和Dickinson等人，J.Med.Chem.,1967, 10(6),1165-1166)。
已评估了2-氯虫草素(3’脱氧-2-氟腺苷)的抗病毒活性(Rosowsky等人，J.Med.Chem.,1989,32,1135-40)。
发明内容
本发明的目的是在预防或治疗方法中，特别地但不限于在包括治疗白血病、 淋巴瘤和/或实体瘤的化学疗法的抗癌化学疗法中，对提高基于嘌呤的3’-脱氧 核苷例如虫草素(3’-脱氧腺苷)的效力的问题提供解决方案。
本发明的另一个目的是对基于嘌呤的3’-脱氧核苷例如虫草素(3’-脱氧腺 苷)在施用时由ADA脱氨基，然后快速代谢为无活性代谢物的问题提供解决方 案。
本发明的另一个目的是对基于嘌呤的3’-脱氧核苷例如虫草素(3’-脱氧腺 苷)在施用时由ADA脱氨基，然后快速代谢为无活性代谢物的问题提供解决方 案，以在预防或治疗方法中，特别地但不限于，在包括治疗白血病、淋巴瘤和/ 或实体瘤的化学疗法的抗癌化学疗法中使用基于嘌呤的3’-脱氧核苷时，完全排 除或至少在某些程度上减少共同施用(co-administer)ADA抑制剂的需要。
根据本发明的第一方面，提供了一种化合物，其是式(Ia)的化合物：
Figure BDA0001303571290000031
其中：
W1和W2各自独立地选自-P(＝O)(U)(V)和H，条件是W1和W2中的至少一 个是-P(＝O)(U)(V)，
其中对于W1和W2中的每一个，U和V独立地选自：
(a)U是-OAr，结合V是-NR4-CR1R2-C(＝O)OR3，
其中Ar选自C6-30芳基和5-30杂芳基，其各自任选地被取代；
R1和R2各自独立地选自H和由C1-20烷基、C6-30芳基C1-6烷基、C2-20烯基、 C1-20烷氧基、C1-20烷氧基C1-20烷基、C1-20烷氧基C6-30芳基、C2-20炔基、C3-20环 烷基C6-30芳基、C6-30芳氧基和5-20杂环基组成的组，其中的任何一个任选地被取 代；
R3选自H和由C1-20烷基、C6-30芳基C1-20烷基、C2-20烯基、C1-20烷氧基C1-20烷基、C1-20烷氧基C6-30芳基、C2-20炔基、C3-20环烷基C6-30芳基和5-20杂环基组 成的组，其中的任何一个任选地被取代；
R4选自H和由C1-20烷基、C6-30芳基C1-20烷基、C2-20烯基、C1-20烷氧基、 C1-20烷氧基C1-20烷基、C1-20烷氧基C6-30芳基、C2-20炔基、C3-20环烷基C6-30芳基、 C6-30芳氧基和5-20杂环基组成的组，其中的任何一个任选地被取代；
且
(b)U和V各自独立地选自-NR5R6，
其中R5选自H和C1-6烷基且R6是-CR7R8CO2R9，其中R7和R8独立地选自 天然存在的α氨基酸的侧链，包括H，且R9选自H和由C1-20烷基、C6-30芳基 C1-20烷基-、C2-20烯基、C1-20烷氧基C1-20烷基、C1-20烷氧基C6-30芳基、C2-20炔基、 C3-20环烷基C6-30芳基和5-20杂环基组成的组，其中的任何一个任选地被取代；或
R5和R6与它们连接的N原子一起形成包含5至8个环原子的环部分；
Q选自O、S和CR10R11，其中R10和R11独立地选自H、F和C1-6烷基；
X和Z各自独立地选自H、OH、F、Cl、Br、I、C1-6烷基、-NR12R13，其中 R12和R13各自独立地选自H和C1-6烷基，和-SR14，其中R14选自H和C1-6烷基； 且
Y选自H、OH、F、Cl、Br、I、-OC1-6烷基、C1-6烷基、C2-8炔基、-NR15R16， 其中R15和R16各自独立地选自H和C1-6烷基，和-SR17，其中R17选自H和C1-6烷基，
或式(Ia)的化合物的药学上可接受的盐、酯、酯的盐、溶剂合物或前药。
本发明的化合物是基于嘌呤的3’-脱氧核苷，其中核苷的糖部分上的每个3’ 取代基位置被H占据。
在另一个实施方案中，本发明的化合物可以是式(Ib)的化合物：
Figure BDA0001303571290000041
其中：
W1和W2各自独立地选自-P(＝O)(U)(V)和H，条件是W1和W2中的至少一 个是-P(＝O)(U)(V)，
其中独立地对于W1和W2中的每一个，U和V选自：
(a)U是-OAr，且V是-NR4-CR1R2-C(＝O)OR3，
其中Ar选自C6-30芳基和5-30杂芳基，其各自任选地被取代；
R1和R2各自独立地选自H和由C1-20烷基、C6-30芳基C1-6烷基、C2-20烯基、 C1-20烷氧基、C1-20烷氧基C1-20烷基、C1-20烷氧基C6-30芳基、C2-20炔基、C3-20环 烷基、C6-30芳基、C6-30芳氧基和5-20杂环基组成的组，其中的任何一个任选地被 取代；
R3选自H和由C1-20烷基、C6-30芳基C1-20烷基、C2-20烯基、C1-20烷氧基C1-20烷基、C1-20烷氧基C6-30芳基、C2-20炔基、C3-20环烷基、C6-30芳基和5-20杂环基组 成的组，其中的任何一个任选地被取代；
R4选自H和由C1-20烷基、C6-30芳基C1-20烷基、C2-20烯基、C1-20烷氧基、 C1-20烷氧基C1-20烷基、C1-20烷氧基C6-30芳基、C2-20炔基、C3-20环烷基、C6-30芳 基、C6-30芳氧基和5-20杂环基组成的组，其中的任何一个任选地被取代；
且
(b)U和V各自独立地选自-NR5R6，
其中R5选自H和C1-6烷基且R6是-CR7R8CO2R9，其中R7和R8独立地选自 天然存在的α氨基酸的侧链，包括H，且R9选自H和由C1-20烷基、C6-30芳基 C1-20烷基-、C2-20烯基、C1-20烷氧基C1-20烷基、C1-20烷氧基C6-30芳基、C2-20炔基、 C3-20环烷基、C6-30芳基和5-20杂环基组成的组，其中的任何一个任选地被取代； 或
R5和R6与它们连接的N原子一起形成包含5至8个环原子的环部分；
X选自NR12R13，其中R12和R13各自独立地选自H和C1-6烷基；和-SR14， 其中R14选自H和C1-6烷基；
Z独立地选自H、OH、F、Cl、Br、I、C1-6烷基、-NR12R13，和-SR14，其中 R14选自H和C1-6烷基；且
Y选自H、OH、F、Cl、Br、I、-OC1-6烷基、C1-6烷基、C2-8炔基、-NR15R16， 其中R15和R16各自独立地选自H和C1-6烷基，和-SR17，其中R17选自H和C1-6烷基，
或式(Ib)的化合物的药学上可接受的盐、酯、酯的盐、溶剂合物或前药。
式(Ib)的化合物可以是式(II)的化合物：
Figure BDA0001303571290000061
其中Ar、Y、Z、R2和R3如以上对于式(Ib)的描述并且其中X是–NR12R13。
式(Ib)的化合物可以是式(III)的化合物：
Figure BDA0001303571290000062
其中Ar、R2和R3如以上对式(Ib)的描述的并且其中Y选自H、F、Cl和 OMe。
以下陈述适用于任何式(Ia)、(Ib)、(II)和(III)的化合物。这些陈述是 独立和可互换的。换言之，可将以下陈述中的任何一个中描述的任何特征(其 中化学上可允许的)与以下一个或多个其他陈述中描述的特征结合。特别地， 在本说明书中例示或说明的化合物的情况下，可将以任何一般性水平表示的描 述该化合物的特征的任何两个或多个以下陈述组合，以表示被考虑为在本说明 书中形成本发明的公开内容的一部分的主题。
在本说明书中，术语“天然存在的α氨基酸”是指可具有L或D立体化学的 氨基酸，其选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪 氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨 酸、天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸和蛋氨酸。因此，在本说明书中，天然存 在的α氨基酸的侧链是选自H、CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、 -CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2Ph、-CH2Ph-OH、-CH2SH、-CH2CH2SCH3、-CH2OH、 -(CH3)(OH)、-CH2CH2CH2CH2NH3 +、-CH2CH2CH2NHC(＝NH2 +)NH2、 -CH2C(O)O-、-CH2CH2C(O)O-、-CH2C(O)NH2、-CH2CH2C(O)NH2的成员。
Figure BDA0001303571290000071
可能的是W1是-P(＝O)(U)(V)且W2是H，且本发明的化合物是母体3’-脱氧 核苷的5’-氨基磷酸酯。在某些优选实施方案中，W1是-P(＝O)(U)(V)，其中U是 -OAr且V是-NR4-CR1R2-C(＝O)OR3，且W2是H。
可能的是W1是H且W2是-P(＝O)(U)(V)，且本发明的化合物是母体3’-脱氧 核苷的2’-氨基磷酸酯。在某些优选实施方案中，W1是H且W2是-P(＝O)(U)(V)， 其中U是-OAr且V是-NR4-CR1R2-C(＝O)OR3。
可能的是，W1和W2各自是-P(＝O)(U)(V)，且本发明的化合物是母体3’-脱 氧核苷的2’,5’-氨基磷酸酯。在某些优选实施方案中，其中W1和W2各自是 -P(＝O)(U)(V)，U是-OAr且V是-NR4-CR1R2-C(＝O)OR3。在某些优选实施方案中， W1与W2相同。
Ar可为未取代的。Ar可为取代的。在Ar为取代的情况下，它可被一个、 两个、三个、四个或五个取代基取代。取代基可选自：卤素、C1-C4-烷基、C1-C4- 烷氧基、硝基和氰基。
Ar无论是取代的或未取代的，可选自苯基、吡啶基、萘基和喹啉基。在某 些优选实施方案中，Ar选自苯基和萘基。在另外优选的实施方案中，其中Ar 为萘基，与-O-P的结合在萘基上的1-位。在进一步优选的实施方案中，Ar是未 取代的苯基或未取代的萘基，其在萘基上的1-位与-O-P结合。
可选择R1和R2使得部分-CR1R2COO-相应于天然存在的α氨基酸的相应 部分。
可能的是，R1和R2各自独立地选自Me和H。在某些优选实施方案中，R1和R2中的一个是Me且R1和R2中的一个是H使得具有R1和R2的C原子具有 与L-丙氨酸相同的绝对构型。
可能的是R1是H。可能的是R2是C1-C4烷基。可能的是R2是甲基。可能的 是具有R1和R2的C原子具有与L-丙氨酸相同的绝对构型。
可能的是R1和R2各自是Me。可能的是R1和R2各自是H。
可能的是具有R3选自C6-30芳基C1-6烷基和未取代的C1-20烷基。在某些优选 的实施方案中，R3选自苄基(-CH2-Ph)、未取代的甲基(-CH3)和未取代的正 戊基(-n-C5H11)。在进一步优选的实施方案中，R3是苄基。
R4可以是H。
U和V可独立地选自-NR5R6。优选地，U和V各自相同。在进一步优选的 实施方案中，R8是H且R7选自包含H、甲基、异丙基、-CH2Ph、-CH2CH(CH3)2和-CH(CH3)(CH2H5)的组。在进一步优选的实施方案中，R7是甲基。在进一步优 选的实施方案中，具有R7和R8的C原子的立体化学具有与L-丙氨酸相同的绝 对构型。可备选地，具有R7和R8的C原子的立体化学可具有与D-丙氨酸相同 的绝对构型。在某些优选的实施方案中，R9选自支链和无支链C1-C13无环烷基、C3-C18环烷基和C6-30芳基C1-6烷基，其中的任何一个任选地被取代。在某些优 选的实施方案中，R9是苄基。
在某些实施方案中，本发明的化合物包含U和V，其中U和V各自独立地 选自-NR5R6，其中R5和R6与它们连接的N原子一起形成包含5至8个环原子 的环部分。U和V可相同。
Q可为O。
可能的是W1是-P(＝O)(U)(V)，其中U是-O-1-萘基且V是 -NH-(L)CH(CH3)-C(＝O)-O-CH2-Ph，W2是H且Q是O。
可能的是X和Z各自独立地选自H、OH、F、Cl、NH2、SH和-SC1-6烷基， 且Y选自H、OH、F、Cl、-OC1-6烷基、NH2、C2-8炔基、SH和-SC1-6烷基。可 能的是X是NR12R13，例如NH2。在某些优选的实施方案中，Z是H。在进一步 优选的实施方案中，X是NH2且Z是H。在优选的实施方案中，X是NH2，Y 是H且Z是H；X是NH2，Y是F且Z是H；X是NH2，Y作为Cl且Z是H； 或者X是NH2，Y是-OCH3且Z作为H。在某些优选的实施方案中，X是NH2， Y是H且Z是H并且因此提供是虫草素(3’dA)的衍生物的本发明的化合物。
在某些特别优选的实施方案中，Ar是苯基，R3是苄基且R2是甲基。
本发明的化合物，其中当P不对称时，化合物可由非对映异构体Rp、非对 映异构体Sp或非对映异构体Rp和Sp的混合物组成。
本发明优选的化合物包括：
(2S)-苄基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲 氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯；
苄基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)乙酸酯；
(2S)-戊基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲 氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)-4-甲基戊酸酯；
甲基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)-2-甲基丙酸酯；
(2S)-苄基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲 氧基)(2-(3-乙氧基-3-氧代丙基)苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯；
(2S)-苄基2-(((((2R,3R,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)四氢呋喃-3- 基)氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯；
苄基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-((((1-(苄氧基)-1-氧代丙烷 -2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙 酸酯；
(2S)-苄基2-(((((2R,3R,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)四氢呋喃-3- 基)氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯；
苄基2-[({[5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基草脲胺-2-基]甲氧基}({[1-(苄氧基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基})磷酰基)氨基]丙酸酯；
(2S)-苄基2-((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-2-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃 -2-基)甲氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基氨基)丙酸酯；
(2S)-苄基2-((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-2-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃 -2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基氨基)丙酸酯；
(2S)-苄基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2- 基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯；
(2S)-己基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2- 基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯；
(2R)-苄基2-((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-2-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2- 基)甲氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基氨基)丙酸酯；
3’-脱氧腺苷-5’-O-[苯基(苄氧基-L-丙氨酸基)]磷酸酯；
2-O-甲基-3’-脱氧腺苷-5’-O-[1-萘基(1-戊氧基-L-亮氨酸基)]磷酸酯；
2-O-甲基-3’-脱氧腺苷-5’-O-[苯基(1-己氧基-L-丙氨酸基)]磷酸酯；
2-氟-3’-脱氧腺苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酸基)]磷酸酯；
2-氟-3’-脱氧腺苷-5’-O-[1-萘基(1-戊氧基-L-亮氨酸基)]磷酸酯；
2-氯-3’脱氧腺苷5’-O-[1-苯基(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酸)]磷酸酯；
2-氯-3’脱氧腺苷5’-O-[1-萘基(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酸)]磷酸酯；
2-氯-3’脱氧腺苷5’-O-[1-苯基(乙氧基-L-丙氨酸)]磷酸酯；和
(2S)-异丙基-2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基) 甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯
及其药学上可接受的盐、酯、酯的盐、溶剂合物或前药。
在某些实施方案中，本发明的化合物不是：
(2S)-异丙基-2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基) 甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯。
根据本发明的第二方面，提供了用于治疗方法的本发明的化合物。该化合 物可用于预防或治疗癌症。
根据本发明的第三方面，提供了本发明的化合物在制备用于预防或治疗特 别地但不限于癌症的药物中的用途。
根据本发明的第四方面，提供了一种预防或治疗特别地但不限于癌症的方 法，包括向需要这种治疗的患者施用有效剂量的本发明的化合物。
关于本发明的第二、第三和第四方面中的每一个，本发明的实施方案包括 选自血液学和实体瘤的癌症。特别地，癌症可选自白血病、多发性骨髓瘤、肝 癌、乳腺癌、头颈癌、神经母细胞瘤、甲状腺癌、皮肤癌(包括黑素瘤)、口腔 鳞状细胞癌、膀胱癌、间质细胞瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肺癌(非小细胞和 小细胞)、胆道癌(biliary cancer)、胰腺癌、肉瘤、前列腺癌，中枢神经系统癌、 尤文氏肉瘤、胆管癌(Cholangiocarcinoma)和妇科癌症包括卵巢癌、子宫癌和 宫颈癌(包括上皮宫颈癌)。在优选的实施方案中，癌症是白血病或淋巴瘤，例 如选自急性淋巴母细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、 急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、单核细胞白 血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的癌症。在进一步优选 的实施方案中，癌症是急性淋巴母细胞白血病。
本发明的第二，第三和第四方面中的每一个可以包括与其他癌症治疗组合 使用的治疗癌症的实施方案。其他癌症疗法的实例包括放射疗法和/或其他化学 疗法。不受理论或机制所束缚，据报道(例如，Robertson,J.B.等人，Int.J. Radiat.Biol.Relat.Stud.Phys.Chem.Med.1978 34(5):417-29，Hiraoka,W.等人， Radiat.Res.(1988)114(2):231-9和Hiraoka,W.等人，J.Radiat.Res.(Tokyo)(1990) 31(2):156-61)3’-脱氧腺苷抑制X射线诱导的DNA损伤的修复。在本发明的第 二、第三和第四方面中的每一个的某些优选实施方案中，本发明的化合物用于 或在治疗癌症的方法中使用，包括向需要这种治疗的患者施用本发明的化合物 结合放射疗法。
关于本发明的第二、第三和第四方面中的每一个，本发明的其他实施方案 包括用于或在预防或治疗骨髓增生异常综合征的方法中使用的本发明的化合 物。
不受理论或机制所束缚：Tuli等人(同上)报道，虫草素，不但具有抗肿瘤 活性和凋亡活性，也显示抗氧化、抗炎、抗疟疾、抗真菌、免疫调节、抗糖尿 病/降血糖，类固醇合成和抗衰老活性；Vodnala,S.K.等人，J.Med.Chem.2013,56, 9861-9873报道了虫草素和2-氟虫草素各自显示抗寄生虫活性；Ahn,Y.J.等人， J.Agric.Food Chem.2000 48(7)2744-8报道了虫草素显示抗菌活性和de Julian-Ortiz J.V.等人，J.Med.Chem.1999 42(17)3308-14报道了虫草素显示抗病 毒活性；Sugar等人，Antimicrob.Agents.Chemother.1998 42(6)1424-7证实虫草 素具有抗真菌活性。关于本发明的第二、第三和第四方面中的每一个，本发明 的实施方案包括用于或在预防或治疗患有需要至少一种治疗的疾病或病症的患者的方法中使用的本发明的化合物，所述治疗选自抗氧化、抗炎、抗疟疾、抗 真菌、免疫调节、抗糖尿病/降血糖、类固醇合成、抗衰老、抗寄生虫、抗菌和 抗病毒活性。
关于本发明的第二、第三和第四方面中的每一个，本发明的实施方案包括 用于或在预防或治疗方法中使用的本发明的化合物，其中该方法不使用作为腺 苷脱氨酶的抑制剂的复合药物的施用。与通常需要与ADA抑制剂共同施用从而 有效的母体化合物虫草素不同，本发明的化合物不需要这种共同施用。
然而，关于本发明的第二、第三和第四方面中的每一个，如果需要，ADA 抑制剂可以用作复合药物。与呈现本发明的化合物共同施用的合适的ADA抑制 剂是羟基脲或喷司他丁。
根据本发明的另一方面，提供了包含本发明的化合物组合药学上可接受的 载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
根据本发明的另一方面，提供了制备药物组合物的方法，其包括将本发明 的化合物与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的步骤。
根据本发明的另一方面，提供了制备式(Ia)的化合物的方法：
Figure BDA0001303571290000131
通过使式IV的化合物：
Figure BDA0001303571290000132
与
(a)式V的化合物：
Figure BDA0001303571290000133
或者
(b)POCl3，随后是N+R5R6H2的盐反应，
其中W1、W2、Q、X、Y、Z、Ar、R1、R2、R3、R4、R5和R6具有本文关 于式(Ia)阐述的含义。
令人惊奇地发现，呈现本发明的化合物与它们的母体基于嘌呤的3’-脱氧核 苷(即，其中W1和W2是H)相比具有增强的药物活性，特别是增强的抗癌活 性，尤其当用于治疗白血病、淋巴瘤和/或实体瘤时。
据发现，与不存在复合药物以抑制ADA的情况下施用的母体基于嘌呤的核 苷相比，在不施用复合药物以抑制腺苷脱氨酶的情况下活性增强。
因此，本发明意外地提供了使用3’-脱氧腺苷的衍生物或3’-脱氧腺苷的类似 物的衍生物作为药剂，特别是作为抗癌剂的方法，其减轻腺苷脱氨酶引起的脱 氨问题，同时如果需要，完全避免使用作为腺苷脱氨酶的抑制剂的复合药物， 包括相对毒性的2-脱氧助间型霉素。
不受任何理论束缚，本发明的化合物表现出的功效，特别是抗癌功效证实， 本发明的3’-脱氧核苷化合物细胞内磷酸化为3’-脱氧腺苷三磷酸酯，或3’-脱氧 腺苷类似物的三磷酸酯。在本发明的化合物具有-P-(＝O)(U)(V)形式的W1的情况 下，人们认为在磷酸化为三磷酸酯之前，细胞内的U和V的酶切割将化合物直 接转化成3’-脱氧腺苷单磷酸酯或3’-脱氧腺苷类似物的单磷酸酯。
上述本发明化合物的细胞内活性都不能预先预测。
与3’-脱氧腺苷母体或3’-脱氧腺苷类似物母体相比，上述益处另外还增强本 发明的氨基磷酸酯核苷的细胞膜渗透性，其中增强的细胞膜渗透性归因于本发 明化合物的氨基磷酸酯结构。此外，不能假定增强的细胞膜渗透性的益处对于 任何核苷的氨基磷酸酯呈现先验性。相对于它们的母体3’-脱氧核苷，人们认为 本发明的化合物是显示增强的抗癌功效的3’-脱氧核苷的氨基磷酸酯的第一个实 例。因此，本发明的化合物引起的增强细胞膜渗透性的益处是惊人的。
本发明的化合物的优选实施方案具有结合上述关于本发明的化合物的实施 方案阐述的特征。
Ar、R1、R2、R3和R4各自可被一个、两个、三个、四个或五个取代基取代。
Ar上的取代基可位于芳族基团上的邻位、间位、对位或其他位置。Ar上的 取代基独立地选自羟基、C1-6酰基、C1-6酰氧基、硝基、氨基、羧基、C2-6酯、 C1-6醛、氰基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、硫醇、氯、溴、氟、碘、C1-6烷基、C2-6烯基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基C6-10芳基、C5-7环烷基、C5-11环烷基C1-6烷基、C5-7环烯基、C8-12环炔基、C6-11芳基C1-6烷基、C1-6烷基C6-11芳基、C6-11芳基、C1-6氟烷基、C2-6氟烯基、SO3H、SH和SR’，其中R’独立地 选自与上文关于式Ia所阐述的R1相同的基团。各个取代基可被任何其他取代基 取代。
R1、R2、R3和R4上的取代基独立地选自羟基、C1-6酰基、C1-6酰氧基、硝基、 氨基、酰胺基、羧基、C2-6酯、C1-6醛、氰基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、 硫醇、氯、溴、氟、碘、C5-7环烷基、C5-7环烯基、C8-12环炔基、C6-11芳基、C6-11芳基C1-6烷基、5-20杂环基、SO3H、SH和SR’，其中R’独立地选自与上文关于 式Ib所阐述的R1相同的基团。
在某些优选的实施方案中，R1和R2独立地选自H、C1-10烷基、C6-30芳基C1-6烷基、C2-10烯基、C2-10烷氧基C1-10烷基、C1-10烷氧基C6-10芳基、C2-10炔基、C3-20环烷基、C3-20环烯基、C8-20环炔基和5-10杂环基。
在某些实施方案中，R1和/或R2相应于可具有L或D立体化学的天然存在 的α氨基酸的侧链(包括H)。因此，可能的是R1和/或R2(例如，单独一个或 R1和R2)选自H、CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、 -CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2Ph、-CH2Ph-OH、-CH2SH、-CH2CH2SCH3、-CH2OH、CH(CH3)(OH)、-CH2CH2CH2CH2NH3 +、-CH2CH2CH2NHC(＝NH2 +)NH2、 -CH2C(O)O-、-CH2CH2C(O)O-、-CH2C(O)NH2、-CH2CH2C(O)NH2，
Figure BDA0001303571290000151
在某些优选的实施方案中，R1和R2独立地选自H、-CH3和-CH2CH(CH3)2。 在进一步优选的实施方案中，R1和R2一起相应于L丙氨酸的侧链。
R3可选自H、C1-20烷基、C6-30芳基C1-6烷基、C2-10烯基、C1-10烷氧基C1-10烷基、C1-10烷氧基C6-10芳基、C2-10炔基、C3-20环烷基、C3-20环烯基、C8-20环炔 基和5-20杂环基。
R3可选自H、C1-20烷基、C6-30芳基C1-6烷基和C3-20环烷基。R3可选自C6-30芳基C1-6烷基和未取代的C1-20烷基。在某些优选的实施方案中，R3选自苄基 (-CH2Ph)、未取代的甲基(-CH3)和未取代的正戊基(-n-C5H11)。R3可为苄基。
R4可选自H、C1-20烷基、C6-30芳基C1-6烷基、C2-10烯基、C1-10烷氧基、C1-10烷氧基C1-10烷基、C1-10烷氧基C6-10芳基、C2-10炔基、C3-20环烷基、C3-20环烯基、 C8-20环炔基和5-20杂环基。
R4可选自H、C1-18烷基、C6-30芳基C1-6烷基、C3-20环烷基和5-20杂环基。R4可选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基和环己基。R4可以是H。
本发明提供了用于靶向癌症干细胞的本发明的化合物。
本发明提供了本发明的化合物在制备用于靶向癌症干细胞的药物中的用 途。
本发明提供了一种靶向癌症干细胞的方法，所述方法包括提供癌症干细胞 群以及一定数量的足以靶向这种癌症干细胞的本发明化合物。
本发明中提及的癌症干细胞的靶向可用于预防或治疗癌症。在这样的实施 方案中，所述癌症干细胞群可能在需要这种靶向的患者中处于癌症或癌前状态， 并且该方法可包括向患者施用治疗有效量的本发明的化合物。
本发明提供了用作抗癌干细胞药物的本发明的化合物。本发明的化合物的 这种用途也可用于预防或治疗癌症。
本发明提供了一种确定患有癌症或癌前状态的患者是否将受益于用本发明 的化合物预防或治疗癌症的方法，所述方法包括：
测定代表患者的癌症或癌前状态的生物学样品中癌症干细胞的存在；其中 生物样品中的癌症干细胞的存在表明患者将受益于用本发明的化合物的治疗。
本发明提供了一种确定患有癌症或癌前状态的患者的合适治疗方案的方 法，所述方法包括：
测定代表患者的癌症或癌前状态的生物样品中癌症干细胞的存在；其中生 物样品中癌症干细胞的存在表明合适的治疗方案将包括用本发明的化合物治疗 患者。
本发明提供了用于通过一种方法预防或治疗为这种治疗选择的患者的癌症 的本发明的化合物，所述方法包括：
测定代表患者的癌症或癌前状态的生物学样品中癌症干细胞的存在；其中 生物样品中的癌症干细胞的存在表明患者适于用本发明的化合物的治疗。
上述方法可进一步包括使用本发明的化合物预防或治疗癌症或癌前状态的 步骤。
在本发明的方法的合适实施方案中，癌症是复发性或难治性癌症。本发明 的化合物可用于治疗这种复发性或难治性癌症。
本发明提供了用于治疗受试者中的难治性癌症的本发明的化合物。受试者 可为人患者。受试者可为家畜，例如哺乳动物。
本发明提供了本发明的化合物在制备用于治疗受试者中的复发性或难治性 癌症的药物中的用途。受试者可为家畜，例如哺乳动物。
本发明提供了治疗受试者中的复发性或难治性癌症的方法，所述方法包括 向需要这种治疗的受试者提供治疗有效量的本发明的化合物。受试者可为家畜， 例如哺乳动物。
本发明提供了用于治疗癌症的本发明的化合物，其中本发明的化合物在至 少一个初始治疗周期中以每周约25mg/m2和4000mg/m2之间的剂量使用，然后 在至少一个另外的治疗周期中以较低的每周剂量使用。癌症可能是复发性或难 治性癌症。
本发明的各个方面基于本发明的化合物能够减少癌症干细胞数目，并且与 其他细胞类型相比可优先地减少这些的发现。这一发现令人惊奇，因为已知癌 症干细胞对许多化学治疗剂具有抗性，并且之前没有提出本发明的化合物或虫 草素或2-氟虫草素、衍生本发明的化合物的母体前药化合物能够靶向癌症干细 胞。因此，本发明的化合物能够靶向癌症干细胞并由此减少它们的数量的发现， 本发明人已确认适用于广泛的癌症的发现代表能够实现本发明的化合物的一系 列新的治疗应用的惊人突破。
以前没有报道的本发明的化合物所发挥的生物活性表明，这些化合物能够 提供在患有复发性或难治性癌症的患者中可能有效的治疗。使用本发明的化合 物的这种种类的治疗可能导致肿瘤大小的减小和/或临床相关生物标志物的减 少，这两者可能与更有利的预后相关。此外，用本发明的化合物的治疗可有助 于维持患有复发性或难治性癌症的患者中肿瘤大小的减小。因此，使用本发明 的化合物的治疗可在患有复发性或难治性癌症的患者中实现高度持久的疾病控 制率(DCR)。
不希望受任何假设束缚，发明人认为本发明的化合物靶向癌症干细胞的能 力有助于这些化合物在复发性或难治性癌症的治疗中的治疗效用。
除上下文另有要求之外，本公开内容中对根据本发明的本发明的化合物的 “用途”的引用可被认为适用于本文所述的本发明的化合物的任何医学用途。 类似地，对使用本发明的化合物的本发明的“方法”的引用应被认为适用于任 何本文所述的本发明的方法。
本发明的化合物靶向癌症干细胞的能力提供了针对被认为是最难治疗的那 些癌细胞的新疗法，并被认为在限制许多现有癌症疗法的有效性的抗性方面起 主要作用。这种能力还提供了一种靶向被认为与癌症发展、进展、复发和传播 相关的细胞的方法。因此，应认识到，本发明的化合物的这种抗癌症干细胞活 性在长期以来寻求新的和有效的疗法的背景下产生益处。
附图说明
在下文中参考附图进一步描述本发明的实施方案，其中：
图1.虫草素、化合物A、2-F-虫草素、化合物O、P、Q和R的LD50值的 比较。所有测定使用KG1a细胞进行，且数据以五次独立实验的平均值(±SD) 表示。
图2.虫草素和化合物A的白血病干细胞(LSC)靶向能力的分析。示出先 前生成的数据(ii)用于比较。所有数据均为三次独立实验的平均值(±SD)。
图3.2-F-虫草素和化合物O、P、Q的LSC靶向能力的分析。所有数据均为 三次独立实验的平均值(±SD)。
图4.2-F-虫草素和各个proTide的LSC靶向能力的比较。所有数据均为三次 独立实验的平均值(±SD)。
具体实施方式
如本文所用，术语“烷基”是指直链或支链饱和单价(除上下文另有要求 外)环状或无环烃基，具有所指示的碳原子数(或在未指示的情况下，无环烷 基可具有1-20、1-18、1-10、1-6或1-4个碳原子，且环烷基可具有3-20、3-10 或3-7个碳原子)，任选被一个、两个或三个独立地选自上文关于可能存在于R1、 R2、R3和R4上的取代基所阐述的基团的取代基取代。通过非限制性实例，烷基 可包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基、壬基和十二烷基。
如本文所用，术语“烯基”是指直链或支链不饱和单价(除上下文另有要 求外)无环或环烃基，其具有一个或多个C＝C双键并且具有所指示的碳原子数 (或在未指示的情况下，无环烯基可具有2-20、2-10、2-6或2-4个碳原子，且 环烯基可具有3-20或5-7个碳原子)，任选被一个、两个或三个独立地选自上文 关于可能存在于R1、R2、R3和R4上的取代基所阐述的基团的取代基取代。通过 非限制性实例，烯基可包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基。
如本文所用，术语“炔基”是指直链或支链不饱和单价(除上下文另有要 求外)无环或环烃基，其具有一个或多个C≡C三键并且具有所指示的碳原子数 (或在未指示的情况下，无环炔基可具有2-20、2-10、2-6或2-4个碳原子，且 环炔基可具有8-20个碳原子)，任选被一个、两个或三个独立地选自上文关于可 能存在于R1、R2、R3和R4上的取代基所阐述的基团的取代基取代。
如本文所用，术语“烷氧基”是指基团烷基-O-，其中烷基如上所定义，并 且其中烷基部分可任选被一个、两个或三个上文针对烷基所阐述的取代基取代。 通过-O-键合。通过非限制性实例，烷氧基可包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、 异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基 丁氧基。
如本文所用，术语“芳氧基”是指基团芳基-O-，其中芳基如下所定义，且 其中芳基部分可任选被一个、两个或三个如上文关于基团Ar所阐述的取代基取 代。通过-O-键合。
如本文所用，术语“烷氧基烷基”是指具有烷氧基取代基的烷基。通过烷 基键合。烷基部分和烷氧基部分分别如在本文中关于烷基和烷氧基所定义的定 义。烷氧基和烷基部分可各自被一个、两个或三个如上文关于烷基的定义所阐 述的取代基取代。
如本文所用，术语“芳基烷基”是指具有芳基取代基的烷基。通过烷基键 合。芳基部分和烷基部分分别如在本文中关于芳基和烷基所定义的定义。芳基 和烷基部分可各自被一个、两个或三个取代基取代，取代基如本文中分别关于 芳基和烷基可能存在的那些取代基的定义来定义。在优选的实施方案中，芳基 烷基是苄基，其为Ph-CH2-。
如本文所用，术语“烷氧基芳基”是指具有烷氧基取代基的芳基。通过芳 基键合。烷氧基部分和芳基部分分别如在本文中关于烷氧基和芳基的定义来定 义。烷氧基和芳基部分可各自被一个、两个或三个取代基取代，取代基如本文 分别关于烷氧基和芳基可能存在的那些取代基的定义来定义。
如本文所用，术语“环烷基芳基”是指具有环烷基取代基的芳基。通过芳 基键合。环烷基部分和芳基部分分别如在本文中关于环烷基和芳基的定义来定 义。环烷基部分和芳基部分可各自任选地被一个、两个或三个如本文分别关于 烷基和芳基的定义所阐述的取代基取代。
如本文所用，术语“芳基”是指具有一个、两个、三个、四个、五个或六 个环并且具有指示的碳原子数(或在未指示的情况下，6至30、6至12或6至 11个碳原子)的单价(除上下文另有要求外)芳族碳环基团。优选的实施方案 具有一个、两个或三个环。芳基可任选地被一个、两个、三个、四个或五个如 上文关于可能存在于基团Ar上的任选取代基所阐述的取代基取代。在优选的实 施方案中，芳基包括：包含6个碳原子的芳香族单环；包含7、8、9或10个碳 原子的芳族稠合双环体系；或包含10、11、12、13或14个碳原子的芳族稠合 三环体系。芳基的非限制性实例包括苯基和萘基。在优选的实施方案中，芳基 上的任选取代基可独立地选自羟基、C1-6酰基、C1-6酰氧基、硝基、氨基、羧基、 氰基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、硫醇、氯、溴、氟、碘、SO3H、SH和 SR’，其中R’独立地选自与关于式Ia的R1相同的基团。
如本文所用，术语“5-30杂芳基”是指单价(除上下文另有要求外)不饱和 芳族杂环基团，其具有5至30个形式为一个、两个、三个、四个、五个或六个 稠环并且包含在至少一个环内且至少一个杂原子选自N、O和S的环成员。优 选实施方案具有一个、两个或三个稠环。环体系中可用的碳原子和/或杂原子可 在环上被一个、两个、三个、四个或五个如上文关于可能存在于基团Ar上的取 代基所阐述的取代基取代。杂芳基可包括含有六个环成员的芳族单环环体系， 其中至少一个环成员是N、O或S原子，并且其任选地含有一个、两个或三个另外的环N原子；芳族单环具有六个成员，其中一个、两个或三个环成员是N 原子；芳族双环稠环体系具有九个成员，其中至少一个环成员是N、O或S原 子，并且其任选包含一个、两个或三个另外的环N原子；或具有十个环成员的 芳族双环稠环体系，其中一个、两个或三个环成员是N原子。实例包括但不限 于吡啶基和喹啉基。
如本文所用，术语“5-20杂环基”是指单价(除上下文另有要求外)饱和或 部分不饱和杂环基团，其具有5至20个环成员，其中至少一个环成员选自N、 O和S，并且为一个、两个、三个、四个、五个或六个稠环的形式。在优选的实 施方案中，所述基团具有一个、两个或三个环。在优选的实施方案中，所述基 团具有5至10个环成员。杂环基团可包括：具有五个环成员的单环环体系，其 中至少一个环成员是N、O或S原子，并且其任选含有一个另外的环O原子或 一个、两个或三个另外的环N原子；具有六个环成员的单环环体系，其中一个、 两个或三个环成员是N原子并且任选地包括O原子；具有九个环成员的双环稠 环体系，其中至少一个环成员是N、O或S原子，并且其任选地包含一个、两 个或三个另外的环N原子；或具有十个环成员的双环稠环体系，其中一个、两 个或三个环成员是N原子。实例包括但不限于吡咯啉基、吡咯烷基、1,3-二氧戊 环基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基。
上述“杂环基”环体系的可用环碳原子和/或环杂原子可被一个、两个、三 个、四个或五个取代基取代。在(多个)环被一个或多个杂原子取代的情况下， 杂原子取代基选自卤素(F、Cl、Br和I)并且选自氧、氮和硫，其中氧、氮或 硫形成取代基部分的一部分。在(多个)环被一个或多个杂原子取代的情况下， 优选地有1、2、3或4个杂原子取代基选自氧、氮、硫和卤素。可存在于杂环 环体系上的取代基的实例可独立地选自羟基、C1-6酰基、C1-6酰氧基、硝基、氨 基、羧基、氰基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、硫醇、氯、溴、氟、碘、SO3H、 SH和SR’，其中R’独立地选自与关于式Ia的R1相同的基团。
如本文所用，术语“酰基”是指包含部分-C(＝O)-的直链或支链、饱和或不 饱和、取代或未取代的单价(除上下文另有要求外)基团，其中键合是通过-C(＝O)- 部分的-C-原子，并且具有指示的碳原子数(或在未指示的情况下，酰基具有1-6、 或1-4、1-2个碳原子，包括-C(＝O)-部分的C原子)，任选被一个、两个或三个 独立地选自上文关于可能存在于R1、R2、R3和R4上的取代基所阐述的基团的取 代基取代。通过非限制性实例，酰基包括HC(＝O)-、CH3C(＝O)-、C2H5C(＝O)-、 C3H7C(＝O)-、C4H9C(＝O)-和C5H11C(＝O)-。
如本文所用，术语“酰氧基”是指包含部分-C(＝O)-O-的直链或支链、饱和 或不饱和、取代或未取代的单价(除上下文另有要求外)基团，其中键合是通 过-O-原子，并且具有指示的碳原子数，包括–C(＝O)-O-部分的C原子(或在未 指示的情况下，酰氧基具有1-6、1-4或1-2个碳原子，包括-C(＝O)-O-部分的碳 原子)，任选被一个、两个或三个可能存在于R1、R2、R3和R4上的取代基取代。 通过非限制性实例，酰氧基包括HC(＝O)-O-、CH3C(＝O)-O-、C2H5C(＝O)-O-、 C3H7C(＝O)-O-、C4H9C(＝O)-O-和C5H11C(＝O)＝O-。
如本文所用，术语“C2-6酯”是指包含R18C(＝O)-O-R19的取代或未取代的单 价(除上下文另有要求外)基团，其中R18选自H和C1-4烷基，且R19选自C1-5烷基，受制于R18C(＝O)-O-R19的C原子(包括-C(＝O)-O-部分的C原子)的最大 总数为6。键合是通过R18或R19，其中不存在相应基团的H，使得通过其键合 的烷基是二价的，或当R18是H时，通过-C(＝O)-O-部分的C。在优选的实施方 案中，包括-C(＝O)-O部分的C原子的C2-6酯具有2-5个碳原子。C2-6酯可任选被 一个、两个或三个独立地选自上文关于可能存在于R1、R2、R3和R4上的取代基 所阐述的基团的取代基取代。通过非限制性实例，C2-6酯可为 -C2H4-C(＝O)-O-C2H5，其中-C2H4-部分是-CH2-CH2-并且通过-C2H4-部分键合。
如本文所用，术语“醛”是指包含HC(＝O)-R20-的直链或支链、饱和或不饱 和、取代或未取代的单价(除上下文另有要求外)基团，其中键合是通过–R20-， 其具有指示的碳原子数，包括-C(＝O)-部分的C原子(或在未指示的情况下，醛 基具有1-6、1-4或1-2个碳原子，包括-C(＝O)-部分的C原子)，任选被一个、 两个或三个可能存在于R1、R2、R3或R4上的取代基取代。通过非限制性实例， 醛基团包括HC(＝O)-CH2-、HC(＝O)-C2H4-、HC(＝O)-C3H6-、HC(＝O)-C4H8-和 HC(＝O)-C5H10-。
如本文所用，术语“氟烷基”是指这样的一种烷基，其中烷基是被1至6 个F原子取代的直链或支链饱和单价(除上下文另有要求外)环状或无环烃基， 其具有指示的碳原子数(或在未指示的情况下，无环烷基具有1-6或1-4个碳原 子且环烷基具有3-6个碳原子)。
如本文所用，术语“氟烯基”是指这样的一种烯基，其中烯基是被1至6 个F原子取代的直链或支链不饱和单价(除上下文另有要求外)无环或环烃基， 具有一个或多个C＝C双键并且具有指示的碳原子数(或在未指示的情况下，无 环烯基具有2-6或2-4个碳原子且环烯基具有4-6个碳原子)。
优选地，在合适的溶剂的存在下进行制备式Ia或Ib的化合物的方法。
合适的溶剂包括烃溶剂，例如苯和甲苯；醚类型溶剂，例如乙醚、四氢呋 喃、二苯基醚、苯甲醚和二甲氧基苯；卤代烃溶剂，例如亚甲基氯、氯仿和氯 苯；酮类型溶剂，例如丙酮、甲基乙基酮和甲基异丁基酮；醇类型溶剂，例如 甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇和叔丁基醇；腈类型溶剂，例如乙腈、丙 腈和苄腈；酯类型溶剂，例如乙酸乙酯和乙酸丁酯；碳酸酯类型溶剂，例如碳 酸乙烯酯和碳酸丙烯酯等。可单独使用这些，或者可以混合物形式使用它们中 的两种或多种。
优选地，在本发明的方法中使用惰性溶剂。术语“惰性溶剂”是指在与其 结合描述的反应条件下惰性的溶剂，包括例如苯、甲苯、乙腈、四氢呋喃、二 甲基甲酰胺、氯仿、亚甲基氯(或二氯甲烷)、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、甲基乙 基酮、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、二氧六环、吡啶等。四氢呋喃是 特别优选的。
优选地，在基本上干燥的条件下进行本发明的方法。
氯代磷酸酯可由芳氧基二氯代磷酸酯和适当保护的氨基酸衍生物制备。可 备选地，可与合适的缩合剂一起使用磷酸酯化学。
优选地，制备式Ib的化合物的方法可包括保护除了氨基磷酸酯所连接的核 苷之外的核苷上的游离OH基团的步骤。例如，在t-BuMgCl存在下进行3’-脱 氧核苷与期望的氯代磷酸酯的反应允许制备2’-氨基磷酸酯。
使3’-脱氧核苷与POCl3随后与N+R5R6H2的盐反应允许制备化合物，其中U 和V各自是-NR5R6。合适的盐包括氯化物、甲苯磺酸盐、磺酸盐和酯盐如4-甲 基苯磺酸盐。随后加入诸如二异丙基乙胺的碱可帮助该方法。
如本文所用，术语“立体异构体”定义由通过相同的键合顺序键合的相同 原子构成的所有可能的化合物，但具有本发明化合物可能具有的不同的三维结 构。
在根据本发明的化合物具有至少一个手性中心的情况下，它们可因此以对 映异构体的形式存在。在化合物具有两个或更多个手性中心的情况下，它们可 另外以非对映异构体的形式存在。在根据本发明的化合物的制备方法产生立体 异构体的混合物的情况下，可通过诸如制备色谱的常规技术分离这些异构体。 可以立体化学混合形式制备这些化合物，或者可通过本领域技术人员已知的标 准技术制备单个对映异构体，例如通过对映特异性合成或拆分，通过用光学活 性酸的盐形成形成非对映异构体对，随后是游离碱的分级结晶和再生。也可通 过形成非对映异构体酯或酰胺，然后色谱分离和去除手性助剂拆分这些化合物。 可备选地，可使用手性HPLC柱拆分化合物。应当理解，所有这种异构体及其 混合物都包括在本发明的范围内。
此外，应当理解，磷酸酯中心在本发明的化合物中是手性的，并且化合物 可以RP和SP非对映异构体的形式存在。化合物的组成可以是混合的RP和SP或 者一种纯的非对映异构体。在优选的实施方案中，化合物是RP或SP的基本上纯 的单一非对映异构体。“基本上纯的单一非对映异构体”是指由RP或SP非对映 异构体的98％或更多组成的化合物。在另一个实施方案中，可以存在1:1的RP与SP非对映异构体的混合物。可备选地，化合物可包含RP和SP非对映异构体 的混合物，RP与SP非对映异构体的比例为1:90至90:1、1:50至50:1、1:20至20:1、1:15至15:1、1:10至10:1、1:9至9:1、1:8至8:1、1:7至7:1、1:6至6:1、 1:5至5:1、1:4至4:1、1:3至3:1或1:2至2:1。在优选的实施方案中，本发明的 化合物可包含大于1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、 1:50、1:90、1:95或1:99的RP与SP非对映异构体的比例，或反之亦然。
术语“溶剂合物”是指如本文所定义的式Ia或式Ib的化合物，其中合适溶 剂的分子被结合在晶格中。合适溶剂在施用剂量下是生理上可耐受的。合适溶 剂的实例是乙醇、水等。当水是溶剂时，分子被称为水合物。
本发明的化合物也可以药学上可接受的盐的形式存在。为了用于医学，本 发明的化合物的盐是指“药学上可接受的盐”。FDA批准的药学上可接受的盐形 式(参考文献International J.Pharm.1986,33,201-217；J.Pharm.Sci.,1977,Jan,66 (1))包括药学上可接受的酸性/阴离子或碱性/阳离子盐。
药学上可接受的酸性/阴离子盐包括但不限于乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、 碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、 柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺 酸盐、富马酸盐、甘油酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷盐(glycollylarsanilate)、 己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸 盐、碘酸盐、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基 溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、 泛酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙 酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(teoclate)、甲苯磺 酸盐和三乙基碘(triethiodide)。
药学上可接受的碱性/阳离子盐包括但不限于铝、苄星(benzathine)、钙、 氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、锂、镁、钾、普鲁卡因、钠和锌。
本发明在它的范围内包括本发明的化合物的前药。通常，这样的前药将是 在体内易于转化成所需化合物的化合物的功能衍生物。因此，在本发明的治疗 方法中，术语“施用”应包括与具体公开的化合物或可能未具体公开的化合物 一起描述的各种病症的治疗，但在对受试者施用后在体内转化为指定的化合物。 用于选择和制备合适的前药衍生物的常规方法在例如，“前药设计(Design of Prodrugs)”，H.Bundgaard,Elsevier编辑,1985中描述。
其中一个或多个游离羟基被以药学上可接受的酯的形式酯化的药学上可接 受的酯衍生物是在生理条件下通过溶剂分解可转化成具有游离羟基的本发明的 化合物的前药酯的具体实例。
可以常规方式，使用一种或多种生理学上可接受的载体(包括有助于将活 性化合物加工成药学上可使用的制剂的赋形剂和助剂)配制根据本发明使用的 药物组合物。这些药物组合物可以本身已知的方式制造，例如通过常规混合、 溶解、制粒、糖衣丸制备、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。适当的配方 取决于所选择的施用途径。
可将根据本发明的化合物或药物组合物通过任何合适的方式对可以是智人 或动物的患者施用。
本发明中使用的药物可通过口服或肠胃外途径施用，包括静脉内、肌内、 腹膜内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、直肠、阴道和局部(包括颊和舌下)施 用。
对于口服施用，通常以片剂或胶囊形式、以粉末剂或颗粒剂形式，或以水 溶液或悬浮液形式提供本发明的化合物。
用于口服使用的片剂可包括与诸如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、 甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。 合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和钙、磷酸钠和钙以及乳糖，而玉米淀粉和海藻 酸是合适的崩解剂。粘合剂可包括淀粉和明胶，而润滑剂(如果存在)通常是 硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，可用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘 油酯的材料涂覆片剂以延缓胃肠道的吸收。
用于口服使用的胶囊包括其中活性成分与固体稀释剂混合的硬明胶胶囊， 和其中活性成分与水或诸如花生油、液体石蜡或橄榄油的油混合的软明胶胶囊。
用于直肠施用的制剂可作为具有包含例如可可脂或水杨酸酯的合适基质的 栓剂提供。
适于阴道施用的制剂可作为除了活性成分外还含有本领域已知的适当的载 体的阴道栓剂、卫生棉条，乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂提供。
对于肌内、腹膜内、皮下和静脉内使用，通常以缓冲至适当的pH和等渗性 的无菌水溶液或悬浮液的形式提供本发明的化合物。合适的水性载体包括林格 氏溶液和等渗氯化钠。根据本发明的水性悬浮液可包括诸如如纤维素衍生物、 海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄蓍胶的悬浮剂，以及诸如卵磷脂的润湿剂。适 于水性悬浮液的合适防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯。
本发明的化合物还可作为脂质体制剂形式提供。
通常，合适的剂量将在每天每千克体重接受者0.1mg至300mg的范围内。 更合适的剂量可在每天每千克体重接受者0.5mg至150mg的范围内、每天每千 克体重接受者0.5mg至100mg的范围内、每天每千克体重接受者1mg至50mg 的范围内，或每天每千克体重接受者1mg至10mg的范围内。合适的较低剂量 可以是每天每千克体重接受者0.5mg或每天每千克体重接受者1mg。可备选地， 合适的剂量可以是每天每平方米接受者体表面积1mg至100mg或每天每平方 米接受者体表面积5mg至50mg的范围内。合适的剂量可以是每天每平方米接受者体表面积6mg、12mg、24mg或48mg。可以单次日剂量的形式提供和施 用期望的剂量，或者在全天以适当的间隔以二、三、四、五或六个或更多亚剂 量的形式施用。剂量可以单位剂量形式施用，例如含有10mg至1500mg，优选 地20mg至1000mg，且最优选地50mg至700mg的每单位剂型的活性成分。 总日剂量适当地为1000mg至3000mg，无论以单剂量形式还是在全天每隔一段 时间以亚剂量形式服用。
“癌症干细胞”
癌症干细胞，有时也以其他方式称为“肿瘤起始细胞”是本领域技术人员 所熟知的。如本文所用，术语“癌症干细胞”应根据它广泛接受的含义进行解 释，其为这样的细胞，所述细胞具有通过不对称分裂以自我更新的能力以诱发 肿瘤形成并通过分化产生更成熟的非干细胞癌症后代。
癌症干细胞在癌症的发展、进展、复发和传播中起主要作用。因此，本发 明的化合物能够靶向癌症干细胞从而降低它们的数量的发现提供了预防或治疗 这些活性的治疗可能性。
如在说明书中其他地方更详细地讨论的，癌症干细胞在癌前状态中发现， 其中它们的存在被认为有助于将这种状态发展成癌症。因此，本发明的治疗方 法和医疗用途(其中本发明的化合物用于靶向癌症干细胞)可用于减少癌前状 态(例如，骨髓增生异常综合征或在本说明书中的其他地方考虑的其他状态) 中的癌症干细胞数，从而防止这种癌前状态发展成癌症。
如上所述，癌症干细胞的不对称细胞分裂产生分化的非干癌细胞。因此， 癌症干细胞负责大量肿瘤的形成和维持。
这种非干癌细胞的积累在癌症的进展中起主要作用。通过本发明的化合物 靶向癌症干细胞能够减少癌症干细胞数量，这又减少非干癌细胞后代的数量。 因此，根据本发明的本发明的化合物的治疗方法和医疗用途在通过预防癌症进 展来治疗癌症方面是有益的。在本说明书的其他地方更详细地描述了这样的实 施方案。
癌症干细胞也能够充当癌细胞的储库，它们可能在缓解期后导致癌症复发。 即使在大多数患者的癌细胞已被去除(例如，通过单独或组合形式的手术、放 射疗法或化学疗法)的情况下，使得不存在可观察的癌症迹象，继续存在的癌 症干细胞可能随时间使癌症的复发成核。通过本发明的化合物靶向癌症干细胞 提供了可以减少癌症干细胞数量并杀死癌症干细胞的新模式。因此，如在说明 书中其他地方更详细讨论的，在合适的实施方案中，本发明提供了其中本发明 的化合物预防或延迟癌症复发的方法和医疗用途。
此外，癌症干细胞从癌症部位移动到体内的另一位置可能有助于癌症的传 播，例如通过发生转移。因此，本发明的化合物靶向癌症干细胞的能力因此提 供了预防或治疗癌症传播的新治疗方法和医疗用途。
除了癌症干细胞的生物活性外，可通过它们表达某些特征性细胞表面标志 物来鉴定它们。在血液学恶性肿瘤中鉴定的癌症干细胞通常是CD34+，而在实 体瘤中，CD44+、CD133+和CD90+已被鉴定为癌症干细胞标志物。下表总结了 已知的癌症干细胞表面表型的实例。预期可使用根据本发明的本发明的化合物 靶向这些形式的癌症干细胞中的每一种，因此使用本发明的化合物的方法或用 途可用于预防或治疗与表达任何这些组的标记物的癌症干细胞相关的癌症。
Figure BDA0001303571290000301
实施例中的数据表明，本发明的化合物能够靶向白血病干细胞系的癌症干 细胞，特别是存在于急性髓性白血病细胞系KG1a中的癌症干细胞。该细胞系显 示具有由本发明的化合物靶向的不同免疫表型(Lin-/CD34+/CD38-/CD123+)的 小干细胞样隔室。因此，根据本发明的本发明的化合物的治疗方法或医疗用途 可用于预防或治疗与表达这些特征性标志物的癌症干细胞相关的白血病或其他 癌症。
本发明还提供了在代表患者癌症或癌前状态的生物样品中鉴定癌症干细胞 的存在的基础上，使用本发明的化合物选择用于预防或治疗癌症的患者的方法 和医疗用途。根据本发明的这些实施方案，上述标记物提供了可用于鉴定癌症 干细胞的存在的合适实例。在本说明书中的其他地方进一步考虑可在生物样品 中研究这些标记物的表达的合适技术。
“靶向癌症干细胞”
本发明提供了可用于靶向癌症干细胞的本发明的化合物的第一指示。在本 说明书中公开的实施例中说明了本发明的化合物靶向癌症干细胞的能力。
可以看出，当将本发明的化合物提供给含有癌症干细胞的癌细胞群时，它 靶向存在的癌症干细胞，导致癌细胞总数的减少。如在本说明书中其他地方讨 论的，相对于大量的肿瘤细胞，本发明的某些化合物优先靶向癌症干细胞，并 且这种化合物的活性不仅能够减少存在的癌细胞的总数，而且还可减少展示癌 症干细胞的表型标志物的总的癌细胞的比例。
人们认为本发明的化合物进入癌细胞并且与细胞一起结合到核酸(RNA和/ 或DNA)中。不受任何理论束缚，人们认为本发明化合物所表现的功效，特别 是抗癌功效证实本发明化合物被磷酸化为虫草素或虫草素衍生物(例如，2-氟虫 草毒素或2-Cl-虫草素)的三磷酸酯，并且人们认为在磷酸化为三磷酸酯之前， 细胞内的酶切割将本发明的化合物直接转化为单磷酸8-氯腺苷。
人们还认为本发明的化合物具有增强的细胞膜渗透性(与虫草素相比)，并 且与从其中衍生它们的母体相比，这有助于本发明化合物的抗癌效力增强。
不希望受任何假设束缚，本发明人认为癌症干细胞数量的减少是靶向杀死 癌细胞群中的癌症干细胞的结果。因此，本发明的化合物能够导致癌症干细胞 的死亡。此外，本说明书中其他地方阐述的结果表明，与杀死非干癌细胞相比， 本发明的某些化合物似乎优先杀死癌症干细胞，从而不仅导致癌症干细胞的死 亡，而且还减少总癌细胞群中的癌症干细胞的比例。
尽管本发明人认为与非干癌细胞相比，优先靶向癌症干细胞的本发明的化 合物优先杀死癌症干细胞，但其他机制也可有助于由靶向这些细胞的本发明的 化合物引起的癌症干细胞比例的降低。
仅通过实例，用本发明的化合物治疗可能导致癌症干细胞分化的增加，从 而降低癌症干细胞数量以及由癌症干细胞代表的总癌细胞的比例。可备选地， 本发明的化合物可能导致癌症干细胞丧失它们的干细胞表型，例如丧失它们的 自我更新的能力，从而减少癌症干细胞数量。
应当相应地解释本公开中对癌症干细胞的靶向的引用。为了本公开的目的， 可将癌症干细胞的“靶向”视为包括本发明的化合物减少存在于细胞群中的癌 症干细胞的数量的任何机制，无论是体外还是体内。特别地，与其他细胞类型 相比，特别是与非干癌细胞相比，癌症干细胞的靶向可被视为包括癌症干细胞 数量的优先减少。对本说明书中的靶向的引用可被视为包括与非干癌细胞相比， 杀死和任选地优先杀死癌症干细胞。
“癌症的预防或治疗”
本发明提供了其中本发明的化合物用于预防或治疗癌症的医疗用途和治疗 方法。在本发明的上下文中，癌症的“预防”被认为是与在癌症发展前使用的 本发明化合物的预防性应用有关，并且旨在阻止癌症发展。另一方面，为了通 过减缓或停止癌细胞增殖和肿瘤生长来改善癌症，将癌症的“治疗”视为关于 癌症发生后的本发明的化合物的使用。有利地，癌症的治疗可能导致癌细胞数 量和肿瘤大小的部分或完全减少。癌症的有效治疗可能导致根据RECIST(实体 肿瘤的反应评估标准)指导准则“稳定”或“反应”的疾病。
如下面更详细地描述的，根据本发明的癌症的预防可能对于具有增加他们 发展癌症的可能性的癌前状态的患者特别有益。
“癌症的预防”
根据本发明的癌症的预防可通过使用根据本文所述的本发明的各个方面或 实施方案的本发明的化合物治疗癌前状态来实现。
特别地，在本发明的上下文中，可通过本发明的方法或医疗用途来实现癌 症的预防，其中将本发明的化合物提供给具有癌前状态的患者。根据本实施方 案的治疗方法或医疗用途可预防治疗的癌前状态发展成癌症，从而提供有效的 癌症预防。
在本发明的上下文中对癌症的预防的引用还可包括本发明的化合物的其他 预防性应用。例如，本发明的化合物靶向癌症干细胞从而预防癌症的发展，和/ 或预防癌症的进展和/或预防癌症的复发和/或预防癌症的传播的能力。
“癌前状态”
癌症往往发生在癌前状态的发展之后，癌前状态本身并不是癌性的，但与 癌症的风险增加有关。遗传或表观遗传变化的积累可能导致先前正常的细胞发 展为癌症干细胞表型。因此，癌症干细胞也可存在于这种癌前状态以及癌性状 态中。
人们认为癌症干细胞存在于癌前状态中有助于将这些状态发展为癌症。本 发明的方法和医疗用途可用于靶向存在于癌前状态中的癌症干细胞，从而治疗 这种状态。应当理解，本发明的化合物靶向癌症干细胞的新的和出乎意外的发 现意味着使用这种化合物治疗癌前状态可用于预防治疗的状态发展成癌症。这 表示其中本发明的化合物可在医学上用于预防癌症的方式，如本说明书中其他 地方所考虑的。
根据本发明可治疗的癌前状态的实例包括但不限于选自以下的那些：光化 性角化病、巴雷特食管、萎缩性胃炎、先天性角化不良、缺铁性吞咽困难、扁 平苔藓、口腔粘膜下纤维化、日光性弹力组织变性、宫颈发育不良，粘膜白斑 病、红斑病、未知意义的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、单克隆B细胞淋巴细 胞增多症(MBL)、骨髓增生异常综合征以及胃的癌前状态如萎缩性胃炎、胃溃 疡，恶性贫血、残胃、胃息肉和Ménétrier's病。在列出的胃的癌前状态中，萎 缩性胃炎、恶性贫血、残胃和某些类型的胃息肉可能特别提高发展成癌症的风 险。
癌前状态通常采取包括发育不良或增生性细胞的病变的形式。因此，作为 具有癌症干细胞的表达标志物或表型特征的细胞的存在的替代或添加，发育不 良或增生的存在可用于鉴定癌前状态。
发育不良的严重程度可在不同的癌前状态之间变化或随着时间的推移具有 单一癌前状态的发展。通常，与癌前状态相关的更高级的发育不良更可能是发 展成癌症的癌前状态。发育不良通常被分为轻度、中度或重度。如果不治疗， 重度发育不良通常发展为癌症。因此，适当地，使用本发明的化合物的治疗方 法或医疗用途可用于治疗具有与重度发育不良相关的癌前状态的患者。
在本发明的合适的实施方案中，本发明的化合物用于治疗患有重度宫颈发 育不良的患者。可通过涂片检查来诊断重度宫颈发育不良。在本发明的另一个 实施方案中，本发明的化合物用于治疗重度食管发育不良(“巴雷特食管”)。可 在组织活检后诊断重度食管发育不良。
最近报道，也可通过检测不知道患有癌症的个体的细胞中的体细胞突变来 鉴定前期恶性肿瘤。特别地，据报道，年龄相关的克隆造血是常见的癌前状态， 其与总体死亡率增加和心血管代谢疾病的风险增加相关。在血细胞中检测到的 大多数突变发生在三个基因中：DNMT3A、TET2和ASXL1。因此，可通过测 定包含血细胞的样品中存在指示癌前状态的在DNMT3A和/或TET2和/或 ASXL1中的至少一个中的基因突变来识别将受益于使用本发明化合物靶向癌症 干细胞并由此治疗癌前状态的患者。
还可通过参照基于癌症干细胞或癌症干细胞表型的标记物特征的表达的任 何技术确定癌症干细胞的存在来识别可受益于使用根据本发明的本发明的化合 物靶向癌症干细胞的治疗的癌前状态，在本说明书中的其他地方讨论。
“癌症的治疗”
技术人员理解存在通过其可评价癌症的“治疗”的很多评价方法。仅通过 实例，癌症发展的任何减少或预防、癌症进展、癌症复发或癌症传播都可被认 为指示癌症的有效治疗。
在某些实施方案中，可使用本发明的化合物：减少癌细胞群中的癌症干细 胞的比例；和/或抑制肿瘤生长；和/或降低致肿瘤性；和/或预防或治疗原发性癌 症；和/或预防或治疗复发性癌症；和/或预防或治疗转移性或继发性癌症；和/ 或治疗、预防或抑制转移或复发；和/或治疗或预防难治性癌症。
使用本发明的化合物治疗癌症以导致肿瘤大小的减小以及在施用治疗的时 间期间/之后维持肿瘤大小减少的能力代表有效的癌症治疗的特别相关指征。如 在实施例中阐述的，令人惊奇地，已证明本发明的治疗或医疗用途在这方面是 有效的，即使在使用代表复发性或难治性癌症的细胞的模型中，所述复发性或 难治性癌症先前耐受使用其他疗法的治疗。
实施例中提供的数据表明用本发明的化合物的治疗降低了癌细胞群中的癌 症干细胞的比例。在本说明书中其他地方描述了可鉴定癌症干细胞的特征生物 活性或细胞表面标志物。在合适的实施方案中，根据本发明的癌症的治疗可导 致患者癌症中存在的癌症干细胞的比例降低至少10％、至少20％、至少30％、 或至少40％。在合适的实施方案中，根据本发明的癌症的治疗可导致患者癌症 中存在的癌症干细胞的比例降低至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％。 根据本发明的癌症的治疗可导致患者癌症中存在的癌症干细胞的比例降低至少 85％、至少90％、或至少95％。实际上，根据本发明的癌症的治疗可导致患者 癌症中存在的癌症干细胞的比例降低至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％(使得基本上没有癌症干细胞残留)。
癌症干细胞的不对称分裂有助于肿瘤的生长。用根据本发明的本发明的化 合物治疗癌症可导致至少10％、至少20％、至少30％或至少40％的肿瘤生长抑 制。根据本发明的癌症的适当治疗可导致至少50％、至少60％、至少70％或至 少80％的肿瘤生长抑制。根据本发明的癌症的治疗可导致如此治疗的患者中至 少85％、至少90％或至少95％的肿瘤生长抑制。实际上，根据本发明的癌症的 治疗可在治疗的癌症中导致至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚 至100％的肿瘤生长抑制。
可通过任何合适的方法评估肿瘤生长，其中随着时间的推移评估肿瘤大小 的变化。在癌症治疗期间或之后，适当地将癌症治疗前的肿瘤大小与相同肿瘤 的大小进行比较。其中可评估肿瘤大小的很多方法是已知的。例如，可通过在 患者中原位成像肿瘤来评估肿瘤的大小。诸如成像技术的合适技术可允许确定 肿瘤的体积以及评估肿瘤体积的变化。
如本说明书的实施例阐述的结果所示，本发明的本发明的化合物的治疗方 法和医疗用途不仅能够阻止肿瘤生长，而且实际上能够实现癌症患者中肿瘤体 积的减小，包括患有复发性或难治性癌症的患者。根据本发明的癌症的适当治 疗可导致肿瘤体积减小至少10％、至少20％、至少30％或至少40％。在合适的 实施方案中，根据本发明的癌症的治疗可导致至少50％、至少60％、至少70％ 或至少80％的肿瘤体积减小。根据本发明的癌症的治疗可导致肿瘤体积减小至 少85％、至少90％或至少95％。实际上，根据本发明的癌症的治疗可导致肿瘤 体积减小至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％。
可参照适当的对照来计算上述类型的肿瘤体积的减小。例如，在体外或在 合适的动物模型中在体内进行的研究中，肿瘤体积的减小可通过用本发明的化 合物治疗的肿瘤的体积与对照肿瘤(其可能是未治疗的，或者可能已经接受除 了使用本发明的化合物之外的治疗)的体积之间的直接比较来确定。应当理解， 在临床试验或患者的治疗管理的背景下，需要缺乏肿瘤治疗的这种模型可能不 是伦理上可接受的，并且在这种情况下，可通过比较经治疗的肿瘤的体积与在 治疗之前相同肿瘤的体积，或与未被施加治疗的肿瘤已达到的预测体积来评估 肿瘤体积的减小。
本发明的化合物的治疗方法和医疗用途可能导致指示癌症的生物标志物的 减少。这种生物标志物的减少提供了进一步的评估，通过该评估可证明癌症的 有效治疗。可基于待治疗的癌症的类型选择这种生物标志物的合适实例：在妇 科癌症的情况下，CA125代表生物标志物的合适实例，而在胰腺癌或胆管癌的 情况下，CA19.9代表生物标志物的合适实例，并且在结肠直肠癌的情况下，CEA 可以是合适的生物标志物。
根据本发明的癌症的适当治疗可导致癌症生物标志物减少至少10％、至少 20％、至少30％或至少40％。在合适的实施方案中，根据本发明的癌症的治疗 可导致癌症生物标志物减少至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。根据 本发明的癌症的治疗可导致癌症生物标志物减少至少85％、至少90％或至少 95％。实际上，根据本发明的癌症的治疗可导致癌症生物标志物减少至少96％、 至少97％、至少98％、至少99％、或者甚至100％。
在根据本发明的癌症的治疗方面观察到的诸如存在的癌症干细胞的比例降 低、肿瘤生长减少、或肿瘤体积或癌症生物标志物减少的有益效果可维持至少 一个月。适当地，这种有益效果可维持至少两个月、至少三个月、至少四个月、 至少五个月、或至少六个月。实际上，这种有益效果可维持至少12个月、至少 18个月、或至少24个月。适当地，有益效果可维持至少三年、至少四年、至少 五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年、或十年或更长。
在本发明的合适的实施方案中，通过靶向癌症干细胞，本发明的化合物可 用于预防或治疗癌症或癌前状态的方法中。在一个合适的实施方案中，本发明 提供了本发明的化合物在预防或治疗癌症或癌前状态的方法中的用途，其中该 方法降低了一种或多种癌症干细胞的致肿瘤性。适当地，这种方法可防止癌症 的进展或抑制肿瘤生长。
当本发明的化合物用于本发明的方法或医疗用途中以预防或治疗癌症的进 展时，这种预防或治疗可能导致癌症进展减慢、延迟或完全停止。
通常通过为癌症分配阶段来确定癌症的进展。分阶段通常通过将I到IV的 数字分配给癌症进行，其中I是孤立的癌症，且IV是已经扩散到评估所度量的 极限的癌症。分阶段的细节在癌症之间有所不同，但阶段通常考虑肿瘤的大小， 它是否侵入相邻的器官，它已扩散到(如果有的话)多少区域(附近)淋巴结， 以及它是否出现在更远的部位(转移的)。
通常，阶段I定位局限于身体的一部分，并且可通过手术切除(对于足够小 的实体瘤)进行治疗。阶段II是局部晚期的，可通过化学疗法、放射疗法、手 术或它们的组合治疗。阶段III也是局部晚期的，并且阶段II或阶段III的指定 取决于特定的癌症类型，尽管阶段III通常被接受为“晚期”局部晚期的。阶段 IV癌症经常转移到第二器官。在本发明的方法或医疗用途中使用本发明的化合 物治疗癌症可用于通过靶向癌症干细胞治疗阶段I、II、III或IV癌症。使用本 发明的化合物治疗可用于预防癌症从一个阶段进展到下一个阶段。在一个实施 方案中，使用本发明的化合物的治疗用于防止从阶段I进展到阶段II。在另一个 实施方案中，使用本发明的化合物的治疗用于防止从阶段II进展到阶段III。在 另一个实施方案中，使用本发明的化合物的治疗用于防止从阶段III进展到阶段 IV。
预防或抑制癌症进展对于预防癌症的扩散尤其重要，例如在癌症局部扩散 的情况下从阶段I到阶段II的进展，或者在癌症转移到其他器官的情况下从阶 段III到阶段IV的进展。癌症干细胞是致肿瘤性的，因此被认为在局部和转移 性癌症扩散中起关键作用。因此，使用本发明化合物的本发明的治疗方法或医 疗用途可用于通过靶向致肿瘤性癌症干细胞并因此降低它们的数量来预防癌症 的扩散。
“癌症”
与衍生本发明的化合物的母体核苷相比，本发明的化合物表现出增加的抗 癌活性。由于对抗癌症干细胞和非干癌细胞的活性增加，似乎提供了这种增加 的抗癌活性。
癌症干细胞在范围广泛的癌症的生物活性中起作用。因此，存在范围广泛 的可根据本发明进行预防或治疗的癌症。
如本文其他地方所讨论的，已知癌症干细胞存在于许多肿瘤类型中，包括 液体瘤(包括诸如白血病和淋巴瘤的血液肿瘤)和实体瘤(例如，乳腺、肺、 结肠、前列腺、卵巢、皮肤、膀胱、胆管和胰腺肿瘤)。因此，预期本发明的化 合物靶向癌症干细胞的治疗方法和医疗用途可用于预防或治疗这种癌症。
适当地，本发明的化合物可用于预防或治疗选自以下的癌症：白血病、淋 巴瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、头颈癌、神经母细胞瘤、甲状腺 癌、皮肤癌(包括黑素瘤)、口腔鳞状细胞癌、膀胱癌、间质细胞瘤、胆道癌(biliary cancer)(例如胆管癌(cholangiocarcinoma)或道癌(bile duct cancer)、胰腺癌、 结肠癌、结肠直肠癌和妇科癌症包括卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、子宫癌 和宫颈癌(包括上皮宫颈癌)。在合适的实施方案中，癌症是白血病，并且可选 自急性淋巴母细胞白血病、急性髓细胞白血病(也称为急性髓性白血病或急性 非淋巴细胞白血病)、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病，慢性髓细 胞白血病(也称为慢性髓性白血病、慢性髓细胞白血病或慢性粒细胞白血病)、 慢性淋巴细胞白血病、单核细胞白血病和毛细胞白血病。在进一步优选的实施 方案中，癌症是急性淋巴母细胞白血病。在一个具体实施方案中，白血病是难 治性TdT阳性白血病。在合适的实施方案中，癌症是淋巴瘤，其可以选自：霍 奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；和小淋巴细胞淋巴瘤。
适当靶向这种癌症中的癌症干细胞可通过预防或治疗癌症的发展、通过预 防或治疗癌症的进展，通过预防或治疗癌症的复发、或通过预防或治疗癌症的 传播实现癌症的有效治疗。
在合适的实施方案中，本发明提供了用于靶向癌症干细胞以预防或治疗转 移性癌症的本发明的化合物。
在合适的实施方案中，本发明提供了用于靶向癌症干细胞以治疗复发性或 难治性癌症的本发明化合物。
在合适的实施方案中，本发明提供了用于靶向癌症干细胞以治疗原发性癌 症的本发明的化合物。适当地，治疗的原发性癌症可能是第二原发性癌症。
本发明提供了用于靶向癌症干细胞以治疗继发性癌症的本发明的化合物。 在合适的实施方案中，继发性癌症是转移性癌症。
在合适的实施方案中，本发明提供了用于靶向癌症干细胞的本发明的化合 物，其中靶向癌症干细胞预防或抑制：(i)癌症的复发；(ii)第二原发性癌症的 发生；或(iii)癌症的转移。
基于本发明的化合物靶向癌症干细胞的能力而使用本发明的化合物的治疗 方法或医疗用途可用于治疗复发性或难治性癌症。在这种实施方案中关于复发 性或难治性癌症的考虑(除了上下文另有要求的情况之外)与关于本发明的各 个方面的复发性或难治性癌症的治疗的考虑相同。
“复发性或难治性癌症”
如上所述，本发明的某些方面和实施方案特别地涉及本发明的化合物在治 疗复发性或难治性癌症中的用途。
为了本发明的目的，可将难治性癌症视为这样的癌症，该癌症对除了使用 本发明的化合物的疗法之外的抗癌疗法的治疗显示抗性。例如，本发明的化合 物可用于治疗对放射疗法有抗性的难治性癌症。可备选地或另外地，本发明的 化合物可用于治疗对用于治疗癌症的生物制剂有抗性的难治性癌症。在一个合 适的实施方案中，本发明的化合物可用于治疗对使用除本发明的化合物之外的 化学治疗剂进行治疗有抗性的难治性癌症。
特别地，可受益于使用本发明的化合物的本发明的治疗方法或医疗用途的 难治性癌症包括对虫草素或2-氟虫草素有抗性的那些癌症。
复发的癌症(或复发性癌症)是在无法检测到癌症的缓解期之后返回的那 些。癌症复发可发生在原始癌症部位(局部癌症复发)、接近于原始癌症部位的 部位(区域性癌症复发)、或远离原始癌症部位的部位(远端癌症复发)。据认 为癌症干细胞在癌症的复发中起作用，从而提供产生复发性癌症细胞的来源。 因此，能够靶向癌症干细胞的根据本发明的本发明的化合物的治疗方法和医学 用途在复发性癌症的背景下可能是非常有益的。本发明的化合物靶向癌症干细 胞的能力可用于去除能够引起复发的这种细胞的群体，从而预防复发性癌症的 发生。本发明的化合物的抗癌干细胞活性也可用于靶向已经复发的癌症中的癌 症干细胞，以及对非干癌细胞潜在地产生细胞毒性作用，从而提供复发性癌症的治疗。
鉴于上述，应当理解，本发明的化合物可用于本发明的预防或治疗复发性 癌症的方法或用途中。本发明的化合物可用于本发明的预防或治疗局部、区域 性或远端复发性癌症的方法或用途中。
本发明的化合物可用于本发明的方法或用途中，以通过提供至少2个月、 至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或至少30个月的缓解 期来预防癌症的复发。实际上，本发明的化合物可用于通过提供至少4年、至 少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年、或至少10年的缓解期来 预防癌症复发。
本发明的化合物可用于本发明的方法或用途中，以治疗在至少2个月、至 少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或至少30个月的缓解期 之后复发的复发性癌症。实际上，本发明的化合物可用于治疗在至少4年、至 少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年、或至少10年的缓解期之 后复发的复发性癌症。
根据本发明的医疗用途或治疗方法，本发明的化合物靶向癌症干细胞的能 力导致这些化合物预防或治疗癌症的能力。然而，应当注意，本发明的化合物 也对构成大部分肿瘤的非干癌细胞产生直接的细胞毒性作用。虽然癌症干细胞 的活性可能是使复发性或难治性癌症如此难以治疗的很多抗性的基础，但非干 癌细胞也是这种复发性或难治性癌症的主要成分。
本发明的化合物与剂量虫草素或2-氟虫草素(衍生本发明的化合物的化学 治疗分子)相比，对非干癌细胞具有更大的细胞毒性作用。因此，本发明的化 合物作用于治疗复发性或难治性癌症的机制可能不仅局限于该化合物的抗癌干 细胞活性，而且还可利用本发明的化合物对非干癌细胞的作用。在这种用途中， 用本发明的化合物治疗将减少癌症干细胞和非干癌细胞二者的总数。当使用本 发明的某些化合物时，这种治疗将优先减少治疗后残留的癌症干细胞的比例。
本发明的化合物的治疗有效剂量
本发明的化合物的治疗有效量可以是足以诱导癌细胞死亡的量。本发明的 化合物的治疗有效量可以是足以诱导癌症干细胞死亡的量。在一些实施方案中， 特别是涉及复发性或难治性癌症的治疗的那些，本发明的化合物的治疗有效量 可以是足以诱导癌症干细胞的死亡并且还诱导非干癌细胞的死亡的量。
有多种不同的方式可计算和表达准备对患者施用的治疗有效的化合物(例 如，本发明的化合物)的量。被认为与用于预防或治疗癌症的药剂的剂量特别 相关的一种这样的方式是每单位的患者体表面积施用的药剂的量。这样的剂量 通常以每平方米(m2)表面积的药剂的量(其可由质量确定)表示。
本发明的化合物用于预防或治疗癌症的用途可使用10mg/m2至1000mg/m2的每周剂量。这样的治疗可例如使用375mg/m2至900mg/m2的每周剂量。例如， 当向患者提供约500mg/m2至825mg/m2的范围的本发明的化合物的每周剂量 时，可提供复发性或难治性癌症的有效治疗。
不希望受任何假设束缚，本发明人认为本发明的化合物靶向癌症干细胞的 能力允许使用比另外所预期更低的该化合物的剂量实现治疗有效性。仅通过实 例，低至825mg/m2、750mg/m2、600mg/m2或500mg/m2的本发明的化合物的 每周剂量可证明在本发明的用途和方法中是治疗有效的。
可以单次施用发生率或在一周期间多次施用发生率提供本发明的化合物的 选择的每周剂量。例如，可以两次施用发生率、三次施用发生率或多次提供本 发明的化合物的每周剂量。因此，在每周剂量为750mg/m2的情况下，这可通过 在一周的过程中三次250mg/m2的施用或在一周期间两次375mg/m2的施用实 现。类似地，在600mg/m2的每周剂量的情况下，这可通过在一周的过程中三次 200mg/m2的施用或在一周期间两次300mg/m2的施用实现。
为了在一周内提供所需剂量的该化合物，以单次治疗发生率施用的本发明 的化合物的合适量可为约100mg/m2至300mg/m2。
所提供的本发明的化合物的每周剂量可随治疗过程而降低。例如，治疗可 以约1000mg/m2、900mg/m2、825mg/m2、750mg/m2或725mg/m2的每周剂量 开始，并且在治疗过程中，所需剂量可能降低至约750mg/m2(在初始剂量高于 该量的情况下)，约650mg/m2、约625mg/m2，甚至约500mg/m2或约375mg/m2。
当然，本发明的化合物的剂量可以其他方式呈现。这些中最常见的是以每 单位体重提供的活性剂的量。已经计算出，对于平均人类患者，1mg/m2的剂量 相当于约0.025mg/kg的体重。因此，数据表明本发明的化合物对于以从约6.25 mg/kg至约25mg/kg范围的剂量治疗复发性或难治性癌症是有效的。合适的剂 量可例如，为约9.5mg/kg至22.5mg/kg。在合适的实施方案中，当向患者提供 从约12.5mg/kg至20.5mg/kg范围的每周剂量时，本发明的化合物实现复发性 或难治性癌症的有效治疗。
关于适用于本发明的预防或治疗方法和医疗用途的本发明化合物的制剂的 注意事项在本公开的其他地方描述。在本发明的化合物的注射用制剂的情况下， 这些可静脉内施用。可在任何合适的时间范围内实现静脉内施用，例如在十分 钟注射等中。
治疗类型
在合适的实施方案中，本发明的化合物可用于靶向癌症干细胞，作为癌症 的一线治疗。
然而，本发明的化合物能够靶向癌症干细胞，从而治疗复发性或难治性癌 症的发现表明，本发明的化合物能够在其中其他治疗被证明无效的情况下提供 癌症的有效治疗。因此，在合适的实施方案中，本发明提供了用于靶向癌症干 细胞的本发明化合物作为癌症的第二线治疗。实际上，在合适的实施方案中， 本发明提供了用于靶向癌症干细胞的本发明的化合物作为癌症的第三线或进一 步治疗。
在合适的实施方案中，提供了用作治疗癌症的新辅佐剂的本发明的化合物。 新辅助剂是提供给患者的药剂，以在“主要”抗癌治疗之前减小肿瘤的大小， 例如手术切除癌症。本发明的化合物可用作随后进行癌症的手术治疗和/或癌症 的放射治疗的患者的新的辅助治疗。
可备选地或另外地，本发明提供了用作癌症的治疗中的佐剂的本发明的化 合物。佐剂是在“主要”的抗癌治疗(例如，手术切除癌症)之后提供给患者 的药剂，以预防主要治疗之后癌症的复发。本发明的化合物可用作用于已进行 癌症的手术治疗和/或癌症的放射治疗的患者的佐剂。
可以单一疗法形式将本发明的化合物用于本发明的方法或用途，即在预防 或治疗中，其中本发明的化合物基本上提供在预防或治疗中使用的所有治疗活 性。
或者，本发明的方法或用途可以组合疗法形式使用本发明的化合物。在这 样的实施方案中，结合至少一种其他癌症疗法使用本发明的化合物。其他癌症 疗法可包括手术和/或放射疗法。另外地或可备选地，其他癌症疗法可包括使用 至少一种有助于要实现的癌症的预防或治疗的其他治疗剂。适当地，这种药剂 可以是用于预防或治疗癌症的化学治疗剂或生物制剂。
在联合疗法的合适实施方案中，可向患者同时提供本发明的化合物和其他 治疗剂。在合适的实例中，可将本发明的化合物和其他治疗剂配制为相同药物 组合物的一部分。可备选地，可单独配制本发明的化合物和其他治疗剂以在基 本上同时提供给患者。
在联合疗法的另一个合适实施方案中，可在不同时间向患者提供本发明的 化合物和其他治疗剂。可向患者依次提供本发明的化合物和其他治疗剂。例如， 可在提供其他治疗剂之前将本发明的化合物提供给患者。可备选地，可在提供 其他治疗剂之后将本发明的化合物提供给患者。
“其他治疗剂”
本发明的化合物可与范围广泛的其他治疗剂联合用于预防或治疗癌症。这 些包括可用于预防或治疗癌症的生物制剂、免疫治疗剂和化学治疗剂。
尽管在以下段落中考虑了合适的其他药剂的具体实例，但这些不应被认为 限制适于与本发明的化合物一起使用的其他治疗剂的范围。实际上，本发明的 化合物靶向癌症干细胞的能力表明它可有益地与用于预防或治疗癌症的任何其 他治疗剂联用，无论这样的其他药剂是否靶向癌症干细胞、非干癌细胞或与癌 症的发展、维持、复发、传播或有关的其他细胞或成分。
可与本发明的化合物联用的其他治疗剂的实例包括：
(a)抗血管生成剂，任选地其中抗血管生成剂是：(i)VEGF途径的抑制 剂，任选地贝伐单抗；(ii)酪氨酸激酶抑制剂，任选地索拉非尼、舒尼替尼或 帕唑帕尼；或(iii)mTOR抑制剂，任选地依维莫司；
(b)烷基化试剂；
(c)抗代谢剂；
(d)抗肿瘤抗生素；
(e)拓扑异构酶；
(f)有丝分裂抑制剂；
(g)单克隆抗体；
(h)金属剂；或
(i)主动或被动免疫疗法。
除上下文另有要求的情况下外，上述列表中列出的其他治疗剂均应被认为 适用于上述考虑的具有本发明的化合物的组合疗法的任何实施方案中。
患者的选择
发明人发现本发明的化合物能够靶向癌症干细胞使许多方法成为可能，通 过这些方法，能够确定特定患者是否可能受益于在癌症(诸如复发性或难治性 癌症)的预防或治疗中接受本发明化合物。
因此，本发明提供了一种确定患有癌症或癌前状态的患者是否受益于使用 本发明的化合物预防或治疗癌症的方法，所述方法包括：测定患者的代表癌症 或癌前状态的生物样品中的癌症干细胞的存在；其中生物样品中癌症干细胞的 存在表明患者将受益于使用本发明的化合物的治疗。
本发明进一步提供了一种为患有癌症或癌前状态的患者确定合适的治疗方 案的方法，所述方法包括：测定患者的代表癌症或癌前状态的生物样品中癌症 干细胞的存在；其中生物样品中癌症干细胞的存在表明合适的治疗方案将包括 使用本发明的化合物的治疗。
本发明还提供了一种用于通过一种方法预防或治疗选择用于这种治疗的患 者中的癌症的本发明的化合物，所述方法包括：测定患者的代表癌症或癌前状 态的生物样品中的癌症干细胞的存在；其中生物样品中癌症干细胞的存在表明 患者适于使用本发明的化合物的治疗。
在合适的实施方案中，生物样品中的癌症干细胞可通过在本申请中先前讨 论的它们的标志物的特征图谱的表达来鉴定。
本领域技术人员理解，存在诸如上述阐述的那些的可用于本发明的实施方 案的生物样品的许多合适的实例。适当地，这种样品可包括来自癌症或癌前状 态的细胞。合适的生物样品可以是组织样品，例如用于组织学的样品。可直接 评估这种样品中的细胞的癌症干细胞标志物的表达，例如上述阐述的那些。
可备选地或另外地，合适的生物样品可包括代表癌症或癌前状态的细胞的 基因表达的靶分子。这种靶分子的实例包括由所表达的基因编码的蛋白质或代 表基因表达的核酸，例如mRNA。
可参照样品类型选择可评估癌症干细胞标记物的表达的技术的合适实例。 用于研究表达的标志物的技术经常在临床评估(例如，用于诊断或预后目的) 的背景下使用，并且它们的使用对于在本发明的上下文中实施它们所需的那些 来说将是熟悉的。仅通过实例，在包含蛋白质的样品中，可通过使用与所讨论 的癌症干细胞标记物反应的抗体的合适技术评估癌症干细胞标志物的存在。包 含蛋白质癌症干细胞标记物的这种样品的实例包括组织学样品(其中标记物的 存在可通过合适的免疫细胞化学技术显现)或源自循环的样品。此处，可使用 诸如流式细胞术的技术评估循环的癌症干细胞(其被认为通过转移促进癌症的 传播)的存在。
在包含代表癌症干细胞标志物的表达的核酸的样品中，可通过合适的分子 生物学技术(例如，通过使用合适的引物的聚合酶链反应(PCR)扩增)评估这 种表达。
实施例1-合成方法
可根据或类似于以下一般步骤和示例性合成步骤制备本发明的化合物。
一般步骤1(对于化合物A-F和L-U)
将N-甲基咪唑(1.0mmol)和合适的氯代磷酸酯(0.6mmol)的无水THF (2mL)溶液滴加至3’-脱氧腺苷(0.20mmol)或取代的3’-脱氧腺苷在无水THF (10mL)中的悬浮液，并在16小时的时间期间将反应混合物在室温下搅拌。 通过柱色谱法和制备TLC纯化，得到白色固体形式的目标化合物。所用组分的 量可能变化，并在下列实施例中给出实际量。
一般步骤2(对于化合物J)
将3’-脱氧腺苷(0.80mmol)悬浮于(CH3O)3PO(5mL)中，并在-5℃下滴 加POCl3(0.80mmol)。使反应混合物达到室温，并保持搅拌4小时。在-78℃ 下，加入溶于无水CH2Cl2(5mL)的合适的氨基酸酯盐(4.0mmol)的溶液， 然后加入二异丙基乙胺(8.0mmol)。在室温下搅拌20小时后，加入水，并分离 各层。用二氯甲烷萃取水相，并用盐水洗涤有机相。在Na2SO4上干燥合并的有 机层并浓缩。通过柱色谱法(CH2Cl2/MeOH＝100/0至93/7的梯度洗脱)纯化残 余物，得到白色泡沫形式的目标产物。所用组分的量可能变化，并在下列实施例中给出实际量。
一般步骤3(对于化合物G-I)
将3’-脱氧腺苷(0.20mmol)悬浮于无水THF(5mL)中，并在室温下滴 加tBuMgCl(1.0M的THF溶液，0.22mmol)。滴加合适的氯代磷酸酯(0.6mmol) 的无水THF(2mL)溶液，并在16小时的时间期间将反应混合物在室温下搅拌。 通过柱色谱法和制备TLC纯化，得到白色固体形式的目标化合物。所用组分的 量可能变化，并在下列实施例中给出实际量。
一般步骤4(对于化合物V)
加入叔丁基二甲基甲硅烷基氯(3.3mol/eq.)和咪唑6.6(mol/eq)至合适的 3’-脱氧腺苷衍生物(1mol/eq)在无水DMF中的溶液，并将反应混合物在室温 下搅拌过夜(16-20小时)。然后将NH4Cl加入到混合物中，用乙酸乙酯洗涤两 次。合并有机层，在Na2SO4上干燥，并在真空下除去溶剂。通过柱色谱法纯化 混合物，得到中间体C1。然后将中间体C1溶于THF/H2O/TFA 4/1/1(6ml/eq) 的水溶液中，并在0℃下搅拌4小时。然后，用饱和NaHCO3水溶液小心地中 和溶液，并用乙酸乙酯将混合物洗涤两次。合并有机层，在Na2SO4上干燥，并 在真空下除去溶剂。通过柱色谱法纯化混合物，得到中间体C2。然后应用一般 步骤B，并得到中间体C3。在0℃下将中间体C3溶于THF/H2O/TFA 1/1/1(6 ml/eq)的水溶液中，并在室温下搅拌24小时。通过色谱法纯化，得到白色固体 形式的目标化合物。
一般步骤5(用于制备实施例中使用的3’-脱氧腺苷和3’-脱氧基-2-氯腺苷)：
依次将H2O/CH3CN 1:9和α-AIBBr(4.0mol/eq)的溶液加入到干燥的腺苷 或2-氯腺苷的无水CH3CN的悬浮液中，并在室温(20℃)下继续搅拌。1小时 后，小心加入饱和NaHCO3溶液，并用EtOAc萃取溶液。用盐水洗涤合并的有 机相。用EtOAc萃取水相，并在Na2SO4上干燥合并的有机相，过滤并蒸发，得 到白色胶状物。将粗混合物溶于无水MeOH中，并用预先用无水MeOH充分洗 涤的Amberlite(2x OH-)树脂搅拌1小时。然后过滤溶液，并用无水甲醇小心地洗涤树脂。蒸发合并的滤液，得到白色固体形式的2’,3’-脱氢腺苷或2’,3’-脱 氢-2-氯腺苷。
在氩气气氛下将LiEt3BH(1M的THF溶液4-4.3mol/eq)溶液滴加到冷的 (4℃)2’,3’-脱氢腺苷或2’,3’-脱氢-2-氯腺苷(1mol/eq)在无水DMSO/THF(1/10) 中的溶液。在4℃继续搅拌1小时，并在室温下搅拌过夜(16小时)。将反应混 合物小心酸化(5％AcOH/H2O)，用N2吹扫1小时(在通风橱下)以除去自燃 的三乙基硼烷，并蒸发。将残余物进行色谱分离，得到白色粉末形式的3’-脱氧 腺苷或3’-脱氧基-2-氯腺苷。
使用一般步骤5：由10.0g(37.4mmol)的腺苷、7.5mL的H2O/CH3CN(1/9)、 22mL(149.7mmol)的α-AIBBr在500mL的无水CH3CN中的溶液和300mL 的Amberlite(2x OH-)树脂在400mL的无水甲醇中的溶液制备2,3’-脱氢腺苷。 获得白色固体形式的2’,3’-脱氢腺苷(9.12g,98％)。由9.12g(36.6mmol)的2’,3’- 脱氢腺苷和159mL(159mmol)的LiEt3BH/THF1M在无水DMSO/THF(1/10, 50mL)中的溶液制备3’脱氧腺苷。通过硅胶上的柱色谱纯化(洗脱液体系3-18％ 的MeOH的DCM溶液)，得到白色粉末形式的3’-脱氧腺苷(7.12g,77％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.37(s,1H,H8),8.17(s,1H,H2),7.29(br s, 2H,NH2),5.89(d,J＝2.5Hz,1H,H1’),5.68(d,J＝4.5Hz,1H,OH-2’),5.19(t,J＝ 6.0Hz,1H,OH-5’),4.63-4.58(m,1H,H2’),4.40-4.34(m,1H,H4’),3.71(ddd,J ＝12.0,6.0,3.0Hz,1H,H5’),3.53-3.49(ddd,J＝12.0,6.0,4.0Hz,1H,H5’), 2.30-2.23(m,1H,H3’),1.98-1.90(m,1H,H3’)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6) δ156.00(C6),152.41(C2),148.82(C4),139.09(C8),119.06(C5),90.79(C1’), 80.66(C4’),74.56(C2’),62.61(C5’),34.02(C3’)。
使用一般步骤5：由5.0g(16.6mmol)的2-氯腺苷、3.0mL的H2O/CH3CN (1/9)、9.7mL(66.2mmol)的α-AIBBr在38mL的无水CH3CN中的溶液和 150mL的Amberlite(2x OH-)树脂在200mL的无水甲醇中的溶液制备2,3’- 脱氢-2-氯腺苷。获得白色固体形式的2,3’-脱氢-2-氯腺苷(3.03g,60％)。由2.18 g(7.68mmol)的2’,3’-脱氢-2-氯腺苷和30.7mL(30.7mmol)的LiEt3BH/THF 1M 在无水DMSO/THF(1/10,30mL)中的溶液制备3’-脱氧-2-氯腺苷。通过硅胶上 的柱色谱纯化(洗脱液体系2-20％的MeOH的DCM溶液)，得到白色粉末形式 的3’-脱氧-2-氯腺苷(1.20g,55％)。
1H NMR(500MHz,CD3OD)：δH 8.41(s,1H,H8),5.93(d,J＝2.5Hz,1H, H1’),4.68-4.66(m,1H,H2’),4.56-4.52(m,1H,H4’),3.95(dd,J＝3,12.5Hz,1H, H5’),3.70(dd,J＝3,12.5Hz,1H,H5’),2.39-2.33(m,1H,H3’),2.08-2.03(m,1H, H3’)13C NMR(125MHz,CD3OD)：δC 158.14(C6),155.19(C2),151.15(C4), 141.30(C8),119.56(C5),93.58(C1’),82.80(C4’),76.81(C2’),64.01(C5’),34.33 (C3’)。
3’-脱氧-2-氟腺苷的制备：
依次将H2O/CH3CN(1:9；1.4mL)然后α-AIBBr(4.10mL,28.05mmol) 的溶液加入到干燥的2-氟腺苷(2.0g,7.01mmol)的无水CH3CN(50mL)的悬 浮液中，并在室温(20℃)下继续搅拌。1小时后，小心加入饱和NaHCO3溶液， 并用EtOAc(2x 100mL)萃取溶液。用盐水(1x50mL)洗涤合并的有机相。 用EtOAc(2x 50mL)萃取水相，并在Na2SO4上干燥合并的有机相，过滤并蒸 发，得到白色胶状物。将粗混合物溶于THF/H2O(4/1,50mL)的混合物中，并 用60mL的Amberlite(2x OH-)树脂(预先用THF充分洗涤)搅拌1小时。 然后过滤溶液，并用THF小心地洗涤树脂。蒸发合并的滤液并从EtOH中结晶 残余物，得到白色固体形式的2’,3’-脱氢-2-氟腺苷(1.13g,60％)。
在氩气氛下，将LiEt3BH/THF(1M；18.01mL,18.01mmol)的溶液滴加到 冷的(4℃，冰浴)2’,3’-脱氢-2-氟腺苷(1.13g,4.18mmol)在无水DMSO/THF (1/10,15mL)的溶液中。在4℃下继续搅拌1小时，并在室温下搅拌过夜(16 小时)。将反应混合物小心酸化(5％AcOH/H2O)，用N2吹扫1小时(在通风橱 下)以除去自燃的三乙基硼烷，并蒸发。在硅胶上色谱分离(3-18％的MeOH 的DCM溶液)残余物，得到白色粉末形式的3’-脱氧-2-氟腺苷(7.12g,77％)。
19F NMR(470MHz,DMSO-d6)：δF-52.19.1H NMR(500MHz,DMSO-d6) δH8.34(s,1H,H8),7.80(br s,2H,NH2),5.78(d,J＝2.25Hz,1H,H1’),5.68(br s, 1H,OH-2’),5.01(brs,1H,OH-5’),4.55-4.51(m,1H,H2’),4.39-4.32(m,1H,H4’), 3.73-3.76(m,1H,H5’),3.56-3.50(m,1H,H5’),2.26-2.18(m,1H,H3’),1.94-1.85 (m,1H,H3’)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δC158.51(d,1JC-F＝202.7Hz,C2), 157.55(d,3JC-F＝21.2Hz,C6),150.11(d,3JC-F＝20.3Hz,C4),139.22(d,6JC-F＝2.2 Hz,C8),117.37(d,4JC-F＝4.1Hz,C5),90.67(C1’),80.90(C4’),74.73(C2’),62.35 (C5’),33.89(C3’)。
3’-脱氧-2-甲氧基腺苷的制备：
依次将H2O/CH3CN(1:9；1.4mL)然后α-AIBBr(4.10mL,28.05mmol) 的溶液加入到干燥的2-氟腺苷(2.0g,7.01mmol)的无水CH3CN(50mL)的悬 浮液中，并在室温(20℃)下继续搅拌。1小时后，小心加入饱和NaHCO3溶液， 并用EtOAc(2x 100mL)萃取溶液。用盐水(1x50mL)洗涤合并的有机相。 用EtOAc(2x 50mL)萃取水相，并在Na2SO4上干燥合并的有机相，过滤并蒸 发，得到白色胶状物。将粗混合物溶于无水MeOH(50mL)中，并用60mL的Amberlite(2x OH-)树脂(预先用无水MeOH充分洗涤的)搅拌1小时。然后 过滤溶液，并用THF小心地洗涤树脂。蒸发合并的滤液并从EtOH中结晶残余 物，得到白色固体形式的2’,3’-脱氢-2-甲氧基腺苷(1.57g,84％)。
在氩气氛下，将LiEt3BH的溶液(1M的THF溶液；8.53mL,8.53mmol) 滴加到冷的(4℃)2’,3’-脱氢-2-甲氧基腺苷(762mg,2.84mmol)在无水 DMSO/THF(1/10,15mL)的溶液中。在4℃继续搅拌1小时，并在室温下搅 拌过夜(16小时)。将反应混合物小心酸化(5％AcOH/H2O)，用N2吹扫1小时 (在通风橱下)以除去自燃的三乙基硼烷，并蒸发。在硅胶上色谱分离(3-17％ 的MeOH的DCM溶液)残余物，得到白色粉末形式的3’-脱氧-2-甲氧基腺苷(650 mg,81％)。
1H NMR(500MHz,CD3OD)δH8.20(s,1H,H8),5.90(d,J＝2.4Hz,1H,H1’), 4.75-4.71(m,1H,H2’),4.54-4.48(m,1H,H4’),3.91(dd,J＝12.3,2.5Hz,1H,H5’), 3.69(dd,J＝12.30,4.0Hz,1H,H5’),3.37(s,3H,OCH3),2.43-2.35(m,1H,H3’), 2.08-2.02(m,1H,H3’)。13CNMR(125MHz,CD3OD)δC163.68(C2),158.12(C6), 151.94(C4),139.71(C8),116.64(C5),93.36(C1’),82.53(C4’),76.59(C2’),64.24 (C5’),55.29(OCH3),34.81(C3’)。
通过公开的方法由二氯磷酸芳基酯和氨基酸酯盐酸盐制备氯代磷酸酯。
3’-脱氧腺苷-5’-O-[苯基(苄氧基-L-丙氨酸基)]磷酸酯A
Figure BDA0001303571290000521
根据一般步骤1，使用3’-脱氧腺苷(50mg,0.20mmol)、N-甲基咪唑(80μL,1.0mmol)和苯基(苄氧基-L-丙氨酸基)氯代磷酸酯(212mg,0.6mmol)制备化 合物A。通过用CH2Cl2/MeOH(100％至95:5％)的梯度的柱色谱(洗脱液体系 CH3OH/CH2Cl2 0/100至7/93)和制备型TLC(1000μm,洗脱液体系 CH3OH/CH2Cl2 5/95)纯化，得到白色固体形式的标题化合物(31mg,28％)。
1H NMR(500MHz,CD3OD)：δH 8.26(s,0.5H,H8),8.24(s,0.5H,H8),8.22 (s,0.5H,H2),8.21(s,0.5H,H2),7.34-7.25(m,7H,Ar),7.21-7.13(m,3H,Ar),6.01 (d,J＝2.9Hz,1H,H1’),6.00(d,J＝2.9Hz,1H,H1’),5.15-5.04(m,2H,OCH2Ph), 4.73-4.63(m,2H,H2’,H4’),4.43-4.35(m,1H,H5’),4.27-4.20(m,1H,H5’), 4.03-3.91(m,1H,CHCH3),2.35-2.28(m,1H,H3’),2.09-2.02(m,1H,H3’),1.32(d, J＝7.4Hz,1.5H,CHCH3),1.28(d,J＝7.4Hz,1.5H,CHCH3)。
13C NMR(125MHz,CD3OD)：δC 174.84(d,3JC-P＝4.5Hz,C＝O),174.63(d, 3JC-P＝4.5Hz,C＝O),157.32(C6),157.31(C6),153.86(C2),153.84(C2),152.13 (C4),152.07(C4),150.20(C-Ar),150.18(C-Ar),140.47(C8),137.26(C-Ar),137.19 (C-Ar),130.76(CH-Ar),130.74(CH-Ar),129.57(CH-Ar),129.32(CH-Ar),129.31 (CH-Ar),129.29(CH-Ar),129.26(CH-Ar),126.16(CH-Ar),126.14(CH-Ar), 121.46(d,3JC-P＝4.7Hz,CH-Ar),121.38(d,3JC-P＝4.7Hz,CH-Ar)120.54(C5), 120.53(C5),93.24(C1’),93.18(C1’),80.43(d,3JC-P＝3.6Hz,C4’),80.36(d,3JC-P＝ 3.6Hz,C4’),76.62(C2’),68.62(d,2JC-P＝5.3Hz,C5’),68.30(d,2JC-P＝5.3Hz,C5’), 67.95(OCH2Ph),67.92(OCH2Ph),51.74(CHCH3),51.60(CHCH3),34.91(C3’), 34.70(C3’),20.45(d,3JC-P＝7.0Hz,CHCH3),20.28(d,3JC-P＝7.0Hz,CHCH3)。
31P NMR(202MHz,CD3OD)：δP 3.9,3.7。
MS(ES+)m/z：实测值：569.2(M+H+),591.2(M+Na+),1159.4(2M+Na+) C26H29N6O7P要求值：(M)568.2。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝254nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 14.02min和tR 14.26 min。
(2S)-苄基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2- 基)甲氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯B
Figure BDA0001303571290000531
使用上述一般步骤1，将(2S)-苄基2-((氯(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(727mg,1.8mmol)的无水THF(10mL)的溶液和N-甲基咪唑(240μL,3.0 mmol)滴加至3’-脱氧腺苷(150mg,0.6mmol)的无水THF的悬浮液，并在16 小时时间期间将反应混合物在室温下搅拌。通过用柱色谱(洗脱液体系 CH3OH/CH2Cl20/100至6/94)和制备型TLC(2000μM，洗脱液体系 CH3OH/CH2Cl25/95)纯化，得到白色固体形式的目标化合物(45mg,12％)。
MS(ES+)m/z：实测值：619.2(M+H+),641.2(M+Na+),1259.4(2M+Na+) C30H31N6O7P要求值：(M)618.58。
31P NMR(202MHz,CH3OD)：δP 4.3(s),4.1(s)。
1H NMR(500MHz,CH3OD)：δH 8.24(s,0.5H,H8),8.22(s,0.5H,H8),8.20 (s,0.5H,H2),8.19(s,0.5H,H2),8.14-8.09(m,1H,Ar),7.89-7.85(m,1H,Ar), 7.70-7.67(m,1H,Ar),7.53-7.42(m,3H,Ar),7.39-7.34(m,1H,Ar),7.31-7.25(m, 5H,Ar),5.99(d,J＝2.0Hz,0.5H,H1’),5.98(d,J＝2.0Hz,0.5H,H1’),5.10-5.01 (m,2H,CH2Ph),4.72-4.61(m,2H,H2’,H4’),4.47-4.40(m,1H,H5’),4.33-4.24(m, 1H,H5’),4.09-3.98(m,1H,CH ala)2.35-2.26(m,1H,H3’),2.07-1.98(m,1H,H3’), 1.30-1.24(m,3H,CH3)。
13C NMR(125MHz,CH3OD)：δC 174.85(d,3JC-P＝3.7Hz,C＝O),174.56(d, 3JC-P＝3.7Hz,C＝O),157.33(C6),157.31(C6),153.87(C2),153.85(C2),150.24 (C4),150.23(C4),147.91(d,3JC-P＝7.5Hz,‘ipso’Nap),147.95,(d,3JC-P＝7.5Hz, ‘ipso’Nap),140.56(C8),140.50(C8),137.22(C-Ar),137.17(C-Ar),136.28(C-Ar), 129.55(CH-Ar),129.53(CH-Ar),129.30(CH-Ar),129.25(CH-Ar),128.88(CH-Ar), 128.82(CH-Ar),127.91(d,2JC-P＝6.25Hz,C-Ar),127.83(d,2JC-P＝6.25Hz,C-Ar), 127.77(CH-Ar),127.75(CH-Ar),127.49(CH-Ar),127.45(CH-Ar),126.48(CH-Ar), 126.47(CH-Ar),126.02(CH-Ar),125.97(CH-Ar),122.77(CH-Ar),122.63(CH-Ar), 120.58(C5),120.53(C5),116.35(d,3JC-P＝3.75Hz,CH-Ar),116.15(d,3JC-P＝3.75 Hz,CH-Ar),93.22(C1’),93.20(C1’),80.30(d,3JC-P＝2.75Hz,C4’),80.24(d,3JC-P＝2.75Hz,C4’),76.51(C2’),76.44(C2’),68.87(d,2JC-P＝5.2Hz,C5’),68.64(d, 2JC-P＝5.2Hz,C5’),67.93(OCH2Ph),51.82(CH ala),51.73(CHala),35.01(C-3’), 34.76(C3’),20.41(d,3JC-P＝6.7Hz,CH3ala),20.22(d,3JC-P＝6.7,CH3ala)。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝200nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 16.36min和tR 16.60 min。
苄基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧 基)(苯氧基)磷酰基)氨基)乙酸酯C
Figure BDA0001303571290000541
使用上述一般步骤1，将苄基2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)乙酸酯(204mg,0.6mmol)的无水THF(2mL)的溶液和N-甲基咪唑(80μL,1.0mmol)滴加至3’- 脱氧腺苷(50mg,0.20mmol)的无水THF的悬浮液，并将反应混合物在室温下 搅拌16小时。通过用柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl20/100至6/94)和制 备型TLC(500μM，洗脱液体系CH3OH/CH2Cl25/95)纯化，得到白色固体形 式的目标化合物(21mg,19％)。
(ES+)m/z，实测值：555.2(M+H+),577.2(M+Na+),1131.4(2M+Na+)。 C25H27N6O7P要求值：(M)554.2。
31P NMR(202MHz,CH3OD)δ5.1,4.9。
1H NMR(500MHz,CH3OD)δ8.27(s,0.5H,H8),8.24(s,0.5H,H8),8.22(s, 0.5H,H2),8.21(s,0.5H,H2),7.37-7.26(m,7H,Ph),7.22-7.13(m,3H,Ph),6.02 (d,J＝1.8Hz,0.5H,H1’),6.00(d,J＝1.8Hz,0.5H,H1’),5.14-5.11(m,2H, OCH2Ph),4.73-4.64(m,2H,H2’,H4’),4.50-4.39(m,1H,H5’),4.36-4.24(m,1H, H5’),3.53-3.71(m,2H,CH2gly),2.39-2.25(m,1H,H3’),2.13-2.02(m,1H,H3’)。
13C NMR(125MHz,CH3OD)δ172.30(d,3JC-P＝5.0Hz,C＝O),172.27(d, 3JC-P＝5.0Hz,C＝O),157.34(C6),157.32(C6),153.88(C2),153.87(C2),152.08(d, 3JC-P＝7.5Hz,C-Ar),152.05(d,3JC-P＝7.5Hz,C-Ar),150.20(C4),150.19(C4), 140.52(C8),140.42(C8),137.15(C-Ar),130.79(CH-Ar),129.57(CH-Ar),129.55 (CH-Ar),129.35(CH-Ar),129.34(CH-Ar),129.33(CH-Ar),126.22(CH-Ar), 121.44(d,JC-P＝3.7Hz,CH-Ar),121.40(d,JC-P＝3.7Hz,CH-Ar),120.51(C5), 120.49(C5),93.19,93.14(C1’),80.46(d,3JC-P＝4.60Hz,C4’),80.39(d,3JC-P＝4.60, C4’),76.66(C2’),68.68(d,2JC-P＝5.42Hz,C5’),68.24(d,2JC-P＝5.42Hz,C5’), 67.95(OCH2Ph),67.93(OCH2Ph),43.90(CH2gly),43.83(CH2gly),34.83(C3’), 34.54(C3’)。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝200nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 13.63min和tR 13.41 min。
(2S)-戊基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2- 基)甲氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)-4-甲基戊酸酯D
Figure BDA0001303571290000561
使用上述一般步骤1，将(2S)-戊基2-((氯(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)-4-甲基戊酸酯(250mg,0.6mmol)的无水THF(1mL)的溶液和N-甲基咪唑(76μL, 0.95mmol)滴加至3’-脱氧腺苷(48mg,19mmol)的无水THF(5mL)的悬浮 液，并在16小时时间期间将反应混合物在室温下搅拌。通过用柱色谱(洗脱液 体系CH3OH/CH2Cl2 0/100至5/95)和制备型TLC(1000μM，洗脱液体系 CH3OH/CH2Cl2 4/96)纯化，得到白色固体形式的目标化合物(27mg,22％)。
MS(ES+)m/z：实测值：641.3(M+H+),663.3(M+Na+),1303.6(2M+Na+) C31H41N6O7P要求值：(M)640.3。
31P NMR(202MHz,CH3OD)δ4.64,4.37。
1H NMR(500MHz,CH3OD)δ8.28(s,0.5H,H-8),8.25(s,0.5H,H-8),8.21(s, 0.5H,H-2),8.20(s,0.5H,H-2),8.17-8.12(m,1H,Nap),7.88-7.83(m,1H,Nap), 7.69-7.66(m,1H,Nap),7.54-7.42(m,3H,Nap),7.40-7.35(m,1H,Nap),7.31-7.26 (m,5H,Ar),6.01(d,J＝2.1Hz,0.5H,H1’),6.00(d,J＝2.1Hz,0.5H,H1’), 4.47-4.67(m,2H,H2’,H4’),4.55-4.44(m,1H,H5’),4.43-4.31(m,1H,H5’), 4.00-3.87(m,3H,CH leu,CH2Pen),2.44-2.30(m,1H,H3’),2.14-2.04(m,1H,H3’), 1.66-1.39(m,5H,CH2CH leu,CH2Pen),1.1.28-1.21(m,4H,CH2CH2Pen), 0.86-0.81(m,3H,CH3Pen),0.81-0.68(m,6H,(CH3)2leu)。
13C NMR(125MHz,CH3OD)δ175.42(d,3JC-P＝2.5Hz,C＝O),175.04(d, 3JC-P＝2.5Hz,C＝O),157.32(C6),153.87(C2),153.86(C2),150.23(C4),147.97(d, 3JC-P＝6.2Hz,‘ipso’Nap),140.55(C8),136.30(C-Ar),136.29(C-Ar),128.89 (CH-Ar),128.84(CH-Ar),127.95(C-Ar),127.91(C-Ar),127.84(C-Ar),127.78 (CH-Ar),127.76(CH-Ar),127.46(CH-Ar),126.50(C-Ar),126.48(C-Ar),126.46 (C-Ar),126.01(CH-Ar),125.91(CH-Ar),122.80(CH-Ar),122.70(CH-Ar),120.58 (C5),120.56(C5),116.40(d,3JC-P＝3.7Hz,CH-Ar),116.01(d,3JC-P＝3.7Hz, CH-Ar),93.31(C1’),93.27(C1’),80.35(d,3JC-P＝3.5Hz,C4’),80.29(d,3JC-P＝3.5 Hz,C4’),76.54(C2’),76.50(C2’),69.07(d,2JC-P＝5.5Hz,C5’),68.85(d,2JC-P＝5.5 Hz,C5’),66.33(CH2Pent),66.32(CH2Pent),54.81(CH leu),54.71(CHleu),44.22 (d,3JC-P＝7.6Hz,CH2leu),43.93(d,3JC-P＝7.6Hz,CH2leu),35.15(C3’),34.86(C3’),29.32(CH2pent),29.30(CH2Pent),29.11(CH2pent),25.67(CH leu),25.45 (CHleu),23.30(CH2pent),23.12(CH3leu),23.02(CH3leu),22.04(CH3leu),21.78 (CH3leu),14.28(CH3pent)。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝200nm，显示两个重叠的非对映异构体的一个峰，其中tR 20.84min。
甲基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-甲 氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)-2-甲基丙酸酯E
Figure BDA0001303571290000571
使用上述一般步骤1，将甲基2-((氯(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)-2-甲基丙酸 酯(612mg,1.8mmol)的无水THF(1mL)的溶液和N-甲基咪唑(24μL,3.0mmol) 滴加至3’-脱氧腺苷(150mg,0.6mmol)的无水THF(15mL)的悬浮液，并在 16小时时间期间将反应混合物在室温下搅拌。通过用柱色谱(洗脱液体系 CH3OH/CH2Cl2 0/100至7/93)和制备型TLC(1000μM，洗脱液体系 CH3OH/CH2Cl2 4/96)纯化，得到白色固体形式的目标化合物(20mg,6％)。
MS(ES+)m/z：实测值：557.2(M+H+),579.2(M+Na+),1135.4(2M+Na+) C25H29N6O7P要求值：(M)556.51。
31P NMR(202MHz,CH3OD)δ2.73。
1H NMR(500MHz,CH3OD)δ8.28(s,0.5H,H8),8.25(s,0.5H,H8),8.21(s, 0.5H,H2),8.19(s,0.5H,H2),8.18-8.14(m,1H,Nap),7.90-7.84(m,1H,Nap), 7.71-7.66(m,1H,Nap),7.53-7.47(m,3H,Nap),7.41-7.35(m,1H,Nap),6.03(d,J＝ 2.1Hz,0.5H,H1’),5.99(d,J＝2.1Hz,0.5H,H1’),4.76-4.67(m,2H,H2’,H4’), 4.52-4.44(m,1H,H5’),4.42-4.33(m,1H,H5’),3.65(s,1.5H,OCH3),3.64(s,1.5H, OCH3),2.48-2.41(m,0.5H,H3’),2.37-2.30(m,0.5H,H3’),2.15-2.09(m,0.5H, H3’),2.08-2.02(m,0.5H,H3’),1.47-1.44(m,6H,CH3)。
13C NMR(125MHz,CH3OD)δ177.25(d,3JC-P＝3.7Hz,C＝O),157.53(C6), 157.51(C6),153.86(C2),150.28(C4),150.25(C4),148.06(d,3JC-P＝7.5Hz,‘ipso’ Nap),148.04(d,3JC-P＝7.5,‘ipso’Nap),140.67(C8),140.60(C8),136.28(C-Ar), 136.27(C-Ar),128.82(CH-Ar),128.80(CH-Ar),127.93(d,2JC-P＝6.25Hz,C-Ar), 127.92(d,2JC-P＝6.25Hz,C-Ar),127.71(CH-Ar),127.69(CH-Ar),127.32(CH-Ar), 126.44(CH-Ar),125.84(CH-Ar),122.93(CH-Ar),120.56(C5),120.50(C5),116.38 (d,3JC-P＝3.75Hz,CH-Ar),116.36(d,3JC-P＝3.75Hz,CH-Ar),93.25(C1’),80.40(d, 3JC-P＝8.0Hz,C4’),80.33(d,3JC-P＝8.0Hz,C4’),76.57(C2’),76.43(C2’),68.99(d, 2JC-P＝5.5Hz,C5’),68.84(d,2JC-P＝5.5Hz,C5’),53.01(OCH3),35.22(C-3’),34.90 (C3’),27.85(d,3JC-P＝6.0Hz,CH3),27.80(d,3JC-P＝6.0,CH3),27.60(d,3JC-P＝6.0, CH3),27.56(d,3JC-P＝6.0,CH3)。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝254nm，显示两个峰，其中tR 16.51min和tR 16.75min。
(2S)-苄基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2- 基)甲氧基)(2-(3-乙氧基-3-氧代丙基)苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯F
Figure BDA0001303571290000581
使用上述一般步骤1，将(2S)-苄基2-((氯(2-(3-乙氧基-3-氧代丙基)苯氧基) 磷酰基)氨基)丙酸酯(1.14g,2.5mmol)的无水THF(2mL)的溶液和N-甲基 咪唑(32μL,4.2mmol)滴加至3’-脱氧腺苷(210mg,0.84mmol)的无水THF (10mL)的悬浮液，并在16小时时间期间将反应混合物在室温下搅拌。通过 用柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CHCl3 0/100至8/92)和制备型TLC(1000μM， 洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 5/95)纯化，得到白色固体形式的目标化合物(123mg, 22％)。
MS(ES+)m/z：实测值：669.3(M+H+),691.3(M+Na+),C31H37N6O9P要求 值：(M)668.63。
31P NMR(202MHz,CH3OD)：δP 3.95,3.65。
1H NMR(500MHz,CH3OD)：δH 8.25(s,0.5H,H8),8.21(s,1H,H8,H2), 8.20(s,0.5H,H2),7.35-7.29(m,6H,Ph),7.25-7.21(m,1H,Ph),7.16-7.07(m,2H, Ar),6.00(d,J＝1.9Hz,0.5H,H1’),5.98(d,J＝1.9Hz,0.5H,H1’),5.17-5.05(m, 2H,OCH2Ph),4.76-4.73(m,0.5H,H2’),4.70-4.59(m,1.5H,H2’,H4’),4.45-4.34(m, 1H,H5’),4.30-4.22(m,1H,H5’),4.08-3.96(m,3H,CH2CH3,CH ala),2.98-2.92(m, 2H,CH2CH2),2.62-2.56(m,2H,CH2CH2),2.40-2.29(m,1H,H3’),2.11-2.03(m,1H, H3’),1.36(d,J＝6.9Hz,1.5H,CH3ala),1.33(d,J＝6.9Hz,1.5H,CH3ala),1.17(t, J＝7.0Hz,1.5H,CH2CH3),1.16(t,J＝7.0Hz,1.5H,CH2CH3)。
13C NMR(125MHz,CH3OD)：δC 174.82(d,3JC-P＝3.7Hz,C＝O),174.62 (C＝O),174.58(C＝O),174.55(d,3JC-P＝3.7Hz,C＝O),157.34(C6),157.32(C6), 153.86(C2),153.84(C2),150.48(d,JC-P＝2.5Hz,C-Ar),150.44(C4),150.22(d, JC-P＝2.5Hz,C-Ar),140.49(C8),137.29(C-Ar),137.21(C-Ar),133.09(d,J＝7.5 Hz,C-Ar),132.94(d,J＝7.5Hz,C-Ar),131.62(CH-Ar),131.59(CH-Ar),129.58 (CH-Ar),129.34(CH-Ar),129.31(CH-Ar),129.28(CH-Ar),128.70(d,J＝5.0Hz, CH-Ar),128.69(d,J＝5.0Hz,CH-Ar),126.18(CH-Ar),121.02(d,J＝2.5Hz, CH-Ar),120.49(d,J＝2.5Hz,CH-Ar),120.58(C5),93.28(C1’),93.24(C1’),80.32 (d,3JC-P＝8.7Hz,C4’),76.57(C2’),68.86(d,2JC-P＝5.0Hz,C5’),68.53(d,2JC-P＝ 5.0Hz,C5’),67.98(OCH2Ph),67.95(OCH2Ph),61.57(CH2CH3),51.76(CH ala), 51.65(CH ala),35.37(CH2CH2),35.30(CH2CH2),35.08(C3’),34.85(C3’),26.77 (CH2CH2),26.72(CH2CH2),20.55(d,3JC-P＝6.2Hz,CH3ala),20.33(d,3JC-P＝6.2 Hz,CH3ala),14.53(CH2CH3)。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝245nm，显示一个峰，其中tR 15.99min。
(2S)-苄基2-(((((2R,3R,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)四氢呋 喃-3-基)氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯G
Figure BDA0001303571290000601
使用上述一般步骤3，将3’-脱氧腺苷(50mg,0.20mmol)悬浮于无水THF (5mL)中并在室温下滴加tBuMgCl(1.0M的THF溶液,0.22mL,0.22mmol)。 滴加(2S)-苄基2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(212mg,0.6mmol)在无水THF (2mL)中的溶液，并在16小时时间期间将反应混合物在室温下搅拌。通过用 柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl20/100至8/92)和制备型TLC(500μM，洗 脱液体系CH3OH/CH2Cl2＝5/95)纯化，得到白色固体形式的目标化合物(6mg, 5％)。
MS(ES+)m/z：实测值：569.2(M+H+),591.2(M+Na+),1159.4(2M+Na+) C26H29N6O7P要求值：(M)568.2。
31P NMR(202MHz,CH3OD)：δP 2.44(s),2.92(s)。
1H NMR(500MHz,CH3OD)：δH 8.41(s,0.5H,H8),8.28(s,0.5H,H8),8.19 (s,0.5H,H2),8.18(s,0.5H,H2),7.39-7.30(m,4H,Ar),7.28-7.18(m,4H,Ar), 7.17-7.11(m,1H,Ar),7.08-7.03(m,1H,Ar),6.23(d,J＝2.0Hz,0.5H,H1’),6.08(d, J＝3.4Hz,0.5H,H1’),5.52-5.43(m,1H,C2’),5.19-5.12(m,1H,CH2Ph),5.07-4.95 (m,1H,CH2Ph),4.48-4.42(m,1H,H4’),4.05-3.97(m,1H,CH ala),3.95-3.87(m, 1H,H5’),3.69-3.61(m,1H,H5’),2.59-2.45(m,1H,H3’),2.31-2.23(m,1H,H3’), 1.36-1.27(m,3H,CH3ala)。
13C NMR(125MHz,CH3OH)：δC 174.76(d,3JC-P＝5.0Hz,C＝O),174.52(d, 3JC-P＝5.0Hz,C＝O),157.44(C6),153.76(C2),151.93(C4),150.06(C-Ar),149.93 (C-Ar),141.38(C8),141.18(C8),137.33(C-Ar),137.10(C-Ar),130.69(CH-Ar), 130.79(CH-Ar),129.61(CH-Ar),129.51(CH-Ar),129.40(CH-Ar),129.30(CH-Ar), 129.23(CH-Ar),126.33(CH-Ar),126.16(CH-Ar),121.53(d,3JC-P＝4.5Hz,CH-Ar), 121.20(d,3JC-P＝4.5H,CH-Ar),120.76(C5),91.56(d,3JC-P＝7.7Hz,C1’),91.45(d, 3JC-P＝7.7Hz,C1’),82.78(C4’),82.28(C4’),81.83(d,2JC-P＝4.7Hz,C2’),80.96(2 x d,2JC-P＝4.7Hz,C2’),67.95(OCH2Ph),67.92(OCH2Ph),64.13(C5’),63.59(C5’), 51.88(CH ala),51.75(CH ala),33.75(d,3JC-P＝3.0Hz,C3’),33.59(d,3JC-P＝3.0 Hz,C3’),20.33(d,3JC-P＝7.1CH3ala),20.18(d,3JC-P＝7.1CH3ala)。
HPLC使用H2O/CH3OH从90/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝254nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 22.16min和tR 22.43 min。
苄基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-((((1-(苄氧基)-1-氧代 丙烷-2-基)氨基)(苯氧基)磷酰基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-氨基) 丙酸酯H
Figure BDA0001303571290000611
使用上述一般步骤3，将3’-脱氧腺苷(50mg,0.20mmol)悬浮于无水THF (5mL)中并在室温下滴加tBuMgCl(1.0M的THF溶液,0.22mL,0.22mmol)。 滴加(2S)-苄基2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(212mg,0.6mmol)在无水THF (2mL)中的溶液，并在16小时时间期间将反应混合物在室温下搅拌。通过用 柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl20/100至8/92)和制备型TLC(500μM，洗 脱液体系CH3OH/CH2Cl25/95)纯化，得到白色固体形式的目标化合物(19mg, 产率11％)。
MS(ES+)m/z,实测值：886.3(M+H+),1771.6(2M+H+),751.2(无核碱基M 的分子)。C42H45N7O11P2要求值：(M+)885.3。
31P NMR(202MHz,CH3OD)：δP 3.98,3.88,3.59,3.12,3.05,2.45,2.32。
1H NMR(500MHz,CH3OD)：δH 8.24-8.13(m,2H,H8,H2),7.39-7.08(m, 20H,Ph),6.27-6.23(m,0.5H,H1’),6.16-6.13(m,0.5H,H1’),5.61-5.48(m,1H, H2’),5.17-4.91(m,4H,CH2Ph),4.57-4.49(m,1H,H4’),4.41-4.29(m,1H,H5’), 4.25-4.15(m,1H,H5’),4.10-4.01(m,1H,CH ala),3.99-3.89(m,1H,CH ala), 2.57-2.41(m,1H,H3’),2.28-2.17(m,1H,H3’),1.38-1.23(m,6H,CH3ala)。
13C NMR(125MHz,CH3OD)：δC 174.88(C＝O),174.83(C＝O),174.79 (C＝O),174.73(C＝O),174.61(C＝O),174.57(C＝O),174.53(C＝O),157.36(C6), 157.34(C6),157.32(C6),157.29(C6),154.04(C2),154.01(C2),153.97(C2), 153.94(C2),152.09(C4),152.04(C4),152.02(C4),151.97(C4),150.31(C-Ar), 150.29(C-Ar),150.16(C-Ar),140.98(C8),140.91(C8),140.81(C8),137.31(C-Ar), 137.28(C-Ar),137.22(C-Ar),137.09(C-Ar),130.86(CH-Ar),130.78(CH-Ar), 130.77(CH-Ar),129.65(CH-Ar),129.61(CH-Ar),129.58(CH-Ar),129.55(CH-Ar), 129.44(CH-Ar),129.42(CH-Ar),129.38(CH-Ar),129.34(CH-Ar),129.32(CH-Ar), 129.30(CH-Ar),129.28(CH-Ar),129.23(CH-Ar),129.21(CH-Ar),12.42(CH-Ar), 126.23(CH-Ar),126.20(CH-Ar),126.17(CH-Ar),121.65(CH-Ar),121.63(CH-Ar), 121.61(CH-Ar),121.59(CH-Ar),121.52(CH-Ar),121.50(CH-Ar),121.47(CH-Ar), 121.46(CH-Ar),121.40(CH-Ar),121.39(CH-Ar),121.36(CH-Ar),121.35(CH-Ar), 121.30(CH-Ar),121.28(CH-Ar),121.26(CH-Ar),121.24(CH-Ar),120.61(C5), 120.57(C5),120.56(C5),120.54(C5),91.56(C1’),91.51(C1’),91.45(C1’),91.25(C1’),91.20(C1’),81.84(C2’),81.82(C2’),81.79(C2’),81.27(C2’),81.22(C2’),81.18(C2’),80.49(C4’),80.43(C4’),80.06(C4’),79.99(C4’),68.29(C5’, OCH2Ph),68.25(C5’,OCH2Ph),68.00(C5’,OCH2Ph),67.96(C5’,OCH2Ph),67.94 (C5’,OCH2Ph),67.90(C5’,OCH2Ph),67.71(C5’,OCH2Ph),67.67(C5’,OCH2Ph), 51.91(CH ala),51.74(CH ala),51.70(CH ala),51.59(CH ala),34.22(C3’),34.20 (C3’),34.16(C3’),33.97(C3’),33.94(C3’),33.91(C3’),20.44(CH3ala),20.43 (CH3ala),20.39(CH3ala),20.29(CH3ala),20.27(CH3ala),20.24(CH3ala),20.21 (CH3ala),20.19(CH3ala)。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝254nm，显示一个宽峰，其中tR 15.97min。
(2S)-苄基2-(((((2R,3R,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)四氢呋 喃-3-基)氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯I
Figure BDA0001303571290000631
使用上述一般步骤3，将3’-脱氧腺苷(50mg,0.20mmol)悬浮于无水THF (5mL)中并在室温下滴加tBuMgCl(1.0M的THF溶液,0.3mL,0.3mmol)。 滴加(2S)-苄基2-((氯(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(323mg,0.8mmol)在无 水THF(2mL)中的溶液，并在16小时时间期间将反应混合物在室温下搅拌。 通过用柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl20/100至6/94)和制备型TLC(500μM， 洗脱液体系CH3OH/CH2Cl25/95)纯化，得到白色固体形式的目标化合物(14mg, 11％)。
(ES+)m/z,实测值：619.2(M+H+),641.2(M+Na+),1259.4(2M+Na+)。 C30H31N6O7P要求值：(M)618.20。
31P NMR(202MHz,CH3OD)：δP 3.27(s),2.75(s)。
1H NMR(500MHz,CH3OD)：δH 8.37(s,1H,H8),8.18(s,1H,H8),8.14(s, 1H,H2),8.13-8.11(m,0.5H,Nap)8.11(s,1H,H2),7.94-7.90(m,0.5H,Ar), 7.90-7.87(m,0.5H,Ar),7.86-7.82(m,0.5H,Ar),7.74-7.70(m,0.5H,Ar), 7.66-7.61(m,0.5H,Ar),7.57-7.47(m,1.5H,Ar),7.46-7.37(m,2.5H,Ar), 7.34-7.27(m,4H,Ar),7.25-7.17(m,1H,Ar),6.19(d,J＝2.4Hz,0.5H,H1’),6.04 (d,J＝2.4Hz,0.5H,H1’),5.60-5.54(m,0.5H,H2’),5.50-5.42(m,0.5H,H2’), 5.16-4.99(m,2H,OCH2Ph),4.46-4.40(m,0.5H,H4’),4.36-4.30(m,0.5H,H4’), 4.13-4.04(m,1H,CH ala),3.90-3.83(m,1H,H5’),3.64-3.56(m,1H,H5’),2.61-2.54(m,0.5H,H3’),2.49-2.41(m,0.5H,H3’),2.35-2.27(m,0.5H,H3’), 2.22-2.16(m,0.5H,H3’),1.35-1.24(m,3H,CH3ala)。
13C NMR(125MHz,CH3OH)：δC 174.52(C＝O),174.49(C＝O),157.27(C6), 153.58(C2),149.97(C4),149.93(C-4),147.70(d,3JC-P＝7.5,‘ipso’Nap),147.48(d, 3JC-P＝7.5,‘ipso’Nap),141.36(C8),141.19(C8),137.25(C-Ar),137.05(C-Ar), 136.31(C-Ar),136.20(C-Ar),129.58(CH-Ar),129.48(CH-Ar),129.37(CH-Ar), 129.26(CH-Ar),129.22(CH-Ar),128.88(CH-Ar),127.84(CH-Ar),127.75(CH-Ar), 127.49(CH-Ar),127.44(CH-Ar),126.48(CH-Ar),126.39(CH-Ar),126.26(CH-Ar), 126.05(CH-Ar),122.76(CH-Ar),122.38(CH-Ar),120.68(C5),120.61(C5),116.64 (d,3JC-P＝3.75Hz,CH-Ar),116.13(d,3JC-P＝3.75,CH-Ar),91.60(d,3JC-P＝7.5Hz, C1’),91.43(d,3JC-P＝7.5Hz,C1’),82.74(C4’),82.27(C4’),81.99(d,2JC-P＝5.5Hz, C2’),81.12(d,2JC-P＝5.5Hz,C2’),67.97(OCH2Ph),67.94(OCH2Ph),64.16(C5’), 63.51(C5’),51.96(CH ala),51.89(CH ala),33.89(d,3JC-P＝7.5Hz,CH3ala),33.63 (d,3JC-P＝7.5Hz,CH3ala)。
HPLC使用H2O/CH3ON从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝200nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 24.84min和tR 25.43 min。
苄基2-[({[5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基]甲氧基}({[1-(苄 氧基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基})磷酰基)氨基]丙酸酯J
Figure BDA0001303571290000641
使用上述一般步骤2，将3’-脱氧腺苷(200mg,0.80mmol)悬浮于(CH3O)3PO (5mL)中，并在-5℃下滴加POCl3(75μL,0.80mmol)。使反应混合物达到室 温，并保持搅拌4小时。在-78℃下，加入溶于无水CH2Cl2(5mL)的(S)-1-(苄 氧基)-1-氧代丙烷-2-铵4-甲基苯磺酸酯(1.4g,4.0mmol)的溶液，然后加入二 异丙基乙胺(1.4mL,8.0mmol)。在室温下搅拌20小时后，加入水，并分离各 层。用二氯甲烷萃取水相，并用盐水洗涤有机相。在Na2SO4上干燥合并的有机 层并浓缩。通过柱色谱法(CH2Cl2/MeOH＝100/0至93/7的梯度洗脱)纯化残余 物，得到白色泡沫(256mg,49％)。
MS(ES+)m/z：实测值：654.2(M+H+),676.2(M+Na+),1329.5(2M+Na+) C30H36N7O8P要求值：(M)653.62。
31P NMR(202MHz,CH3OD)δ13.9。
1H NMR(500MHz,CH3OD)δ8.28(s,1H,H8),8.22(s,1H,H2),7.37-7.26 (m,10H,Ph),6.00(d,J＝1.9Hz,1H,H1’),5.15-5.05(m,4H,OCH2Ph),4.74-4.70 (m,1H,H2’),4.63-4.56(m,1H,H4’),4.24-4.18(m,1H,H5’),4.11-4.05(m,1H, H5’),3.97-3.87(m,1H,CH ala),2.35-2.27(m,1H,H3’),2.07-2.01(m,1H,H3’), 1.34-1.27(m,3H,CH3ala)。
13C NMR(125MHz,CH3OD)δ175.40(d,3JC-P＝5.0Hz,C＝O),175.36(d, 3JC-P＝5.0Hz,C＝O),157.36(C6),153.91(C2),150.25(C4),140.64(C8),137.33 (C-Ar),137.29(C-Ar),129.58(CH-Ar),129.57(CH-Ar),129.33(CH-Ar),129.31 (CH-Ar),129.29(CH-Ar),120.55(C5),93.18(C1’),80.67(d,3JC-P＝8.4Hz,C4’), 76.59(C2’),67.90(OCH2Ph),67.47(d,2JC-P＝5.2Hz,C5’),51.14(d,2JC-P＝1.7Hz, CH ala),51.11(d,2JC-P＝1.7Hz,CH ala),35.08(C3’),20.77(d,3JC-P＝6.5Hz,CH3 ala),20.59(d,3JC-P＝6.5Hz,CH3ala)。
HPLC使用H2O/CH3CN从90/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝254nm，显示一个峰，其中tR 13.87min。
(2S)-苄基2-((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-2-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢 呋喃-2-基)甲氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基氨基)丙酸酯K
Figure BDA0001303571290000651
使用上述一般步骤1，将(2S)-苄基2-((氯(萘-1-基氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(303mg,0.75mmol)的无水THF(5mL)的溶液和N-甲基咪唑(99μL,1.24 mmol)滴加至2-O-甲基-3’-脱氧腺苷(70mg,0.25mmol)的无水THF(10mL) 的悬浮液，并在16小时时间期间将反应混合物在室温下搅拌。通过用柱色谱(洗 脱液体系CH3OH/CH2Cl2 0/100至6/94)和制备型TLC(洗脱液体系 CH3OH/CH2Cl2 5/95)纯化，得到白色固体形式的目标化合物(96mg,60％)。
MS(ES+)m/z：实测值：649.2(M+H+)C31H33N6O8P要求值：648.21(M)。 31P NMR(202MHz,CD3OD)：δP 4.38(s),4.08(s)。1H NMR(500MHz,CD3OD)： δH 8.14-8.11(d,J＝8.0Hz,0.5H,Ar),8.07(d,J＝8.0Hz,0.5H,Ar),8.05(s,0.5H, H8),8.02(s,0.5H,H8),7.82-7.80(m,1H,Ar),7.61(d,J＝7.0Hz,Ar),7.47-7.44(m, 4H,Ar),7.35-7.29(m,2H,Ar),7.24-7.22(m,3H,Ar),5.88(s,1H,H1’),4.71-4.68(m, 1H,H4’),4.65-6.60(m,1H,H2’),4.42-4.40(m,1H,H5’),4.30-4.27(m,1H, H5’),4.08-3.98(m,1H,CH ala)3.88(s,1.5H,OCH3),3.86(s,1.5H, OCH3),2.37-2.33(m,1H,H3’),2.04-2.01(m,1H,H3’),1.27(d J＝7.0Hz,1.5H,CH3), 1.24(d J＝7.0Hz,1.5H,CH3)。13C NMR(125MHz,CH3OD)：δC 174.83(d,3JC-P＝3.7Hz,C＝O),174.60(d,3JC-P＝3.7Hz,C＝O),163.70(C-2),158.10(C6),151.95(C4),147.95(d,3JC-P＝7.5Hz,‘ipso’Nap),147.91,(d,3JC-P＝7.5Hz,‘ipso’ Nap),139.39(C8),139.37(C8),137.12,137.17(C-ipso CH2Ph),136.22 (C-Ar),129.57,129.54,129.48,129.32,129.27,129.12,129.24 128.89,128.83, (CH-Ar),127.85(d,2JC-P＝6.25Hz,C-Ar),127.86,127.76,127.51,127.48,126.49, 126.00,125.97,122.73,122.63(CH-Ar),116.86(C5),116.72(C5),116.29(d,3JC-P＝ 3.75Hz,CH-Ar),116.22(d,3JC-P＝3.75Hz,CH-Ar),93.33(C1’),93.31(C1’),80.24 (d,3JC-P＝2.75Hz,C4’),76.29(C2’),76.26(C2’),69.09(d,2JC-P＝5.0Hz,C5’), 68.16(d,2JC-P＝8.2Hz,C5’),67.95(OCH2Ph),55.28,55.32(OCH3),51.79(CH ala), 51.71(CH ala),35.40(C-3’),35.12(C3’),20.49(d,3JC-P＝6.7Hz,CH3ala),20.35(d, 3JC-P＝6.7,CH3ala)。HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的 反相HPLC，F＝1ml/min，λ＝280nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR16.22 min和tR 16.48min。
(2S)-苄基2-((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-2-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢 呋喃-2-基)甲氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基氨基)丙酸酯L
Figure BDA0001303571290000671
使用上述一般步骤1，将(2S)-苄基2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(264 mg,0.75mmol)的无水THF(2mL)的溶液和N-甲基咪唑(99μL,1.24mmol) 滴加至2-O-甲基-3’-脱氧腺苷(70mg,0.25mmol)的无水THF的悬浮液，并将 反应混合物在室温下搅拌16小时。通过用柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 0/100至6/94)和制备型TLC(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl25/95)纯化，得到白 色固体形式的目标化合物(13mg,10％)。
(ES+)m/z，实测值：599.2(M+H+),C27H31N6O8P要求值：598.19(M)。
31P NMR(202MHz,CD3OD)δ3.97,3.64。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ 8.06(s,0.5H,H8),8.04(s,0.5H,H8),7.33-7.28(m,7H,Ph),7.20-7.14(m,3H, Ph),5.92(d,J＝1.5Hz,0.5H,H1’),5.90(d,J＝1.5Hz,0.5H,H1’),5.14-5.04(m,2H, OCH2Ph),4.78-4.76(m,0.5H,H4’),4.74-4.72(m,0.5H,H4’),4.63-4.59(m,1H, H2’),4.10-4.34(m,1H,H5’a),4.25-4.20(m,1H,H5’b),3.94,3.95(OCH3),3.99-3.90 (m,1H,CHala),2.40-2.37(m,1H,H3’),2.07-2.04(m,1H,H3’),1.31(d J＝7.0Hz, CH3),1.26(d,J＝7.0Hz,CH3)。13C NMR(125MHz,CD3OD)δ174.82(d,3JC-P＝ 3.7Hz,C＝O),174.62(d,3JC-P＝3.7Hz,C＝O),163.80(C-2),158.16,158.13(C6), 152.15(C4),152.05(d,3JC-P＝4.8Hz,C-ipso Ph),152.00(d,3JC-P＝4.8Hz,C-ipso Ph),139.39(C8),137.30,137.21(C-ipso CH2Ph),130.72,129.57,129.31,129.27,126.122(CH-Ar),121.42(d,JC-P＝4.5Hz,CH-Ar),121.37(d,JC-P＝4.5Hz, CH-Ar),116.72(C5),116.69(C5),93.33,93.24(C1’),80.26(d,3JC-P＝8.87,C4’), 80.19(d,3JC-P＝8.87,C4’),76.35(C2’),68.78(d,2JC-P＝5.0Hz,C5’),68.35(d,2JC-P＝5.0Hz,C5’),67.94(OCH2Ph),67.92(OCH2Ph),55.25,55.28(OCH3),51.69, 51.57(CHala),35.23(C3’),34.96(C3’),20.38(d,3JC-P＝6.7,CH3ala),20.26(d, 3JC-P＝6.7,CH3ala)。HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，F＝1ml/min，λ＝280nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 14.22 min和tR 14.51min。
2-O-甲基-3’-脱氧腺苷-5’-O-[1-萘基(1-戊氧基-L-亮氨酸基)]磷酸酯M
Figure RE-GDA0001354666680000011
根据一般步骤1，使用2-O-甲基-3’-脱氧腺苷(70mg,0.25mmol)、N-甲基 咪唑(99μL,1.24mmol)和萘基(戊氧基-L-亮氨酸基)氯代磷酸酯(330mg,0.75 mmol)制备化合物M。通过用柱色谱(洗脱液体系梯度CH3OH/CH2Cl2 0/100 至6/94)和制备型TLC(2000μM，洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 7/93)纯化，得 到白色固体形式的目标化合物(50mg,30％)。
31P NMR(202MHz,CD3OD)δP 4.53,4.28。
1H NMR(500MHz,CD3OD)δH 8.04-7.96(m,1H,H8),7.77-7.71(m,1H, Nap),7.58-7.53(m,1H,Nap),7.45-7.17(m,5H,Nap),5.83-5.75(m,1H,H1’), 4.64-4.51(m,2H,H2’,H4’),4.40-4.16(m,2H,H5’),3.88-3.75(m,6H,OCH3, O(CH2)4CH3,CHCH2CH(CH3)2),2.38-2.24(m,1H,H3’),2.00-1.91(m,1H,H3’), 1.53-1.05(m,11H,O(CH2)4CH3,CHCH2CH(CH3)2),0.77-0.55(m,9H,O(CH2)4CH3, CHCH2CH(CH3)2)。
13C NMR(125MHz,CD3OD)δC 175.02(d,3JC-P＝2.5Hz,C＝O),174.78(d, 3JC-P＝2.5Hz,C＝O),163.76(C2),158.14(C6),151.03(C4),147.96(d,3JC-P＝7.2, ‘ipso’Nap),138.96(C8),136.30(C-Ar),136.28(C-Ar),136.22(C-Ar),128.93 (CH-Ar),128.88(CH-Ar),128.81(CH-Ar),128.48(CH-Ar),127.77(CH-Ar), 127.73(CH-Ar),127.44(CH-Ar),127.42(CH-Ar),127.06(CH-Ar),126.86(CH-Ar), 126.45(CH-Ar),126.44(CH-Ar),126.31(CH-Ar),125.98(CH-Ar),125.88(CH-Ar), 123.83(CH-Ar),123.43(CH-Ar),123.24(CH-Ar),122.81(CH-Ar),122.77(CH-Ar), 122.69(CH-Ar),116.34(d,3JC-P＝3.7Hz,CH-Ar),116.02(d,3JC-P＝3.7Hz,CH-Ar), 115.71(C5),93.42(C1’),93.32(C1’),80.22(d,3JC-P＝5.3Hz,C4’),80.15(d,3JC-P＝ 5.3Hz,C4’),76.29(C2’),76.27(C2’),69.22(d,2JC-P＝5.2Hz,C5’),69.028(d,2JC-P＝5.2Hz,C5’),66.31(O(CH2)4CH3),66.30(O(CH2)4CH3),55.29(OCH3),55.24 (OCH3),54.79(CHCH2CH(CH3)2),54.68(CHCH2CH(CH3)2),44.20(d,3JC-P＝7.25Hz,CHCH2CH(CH3)2),43.93(d,3JC-P＝7.25Hz,CHCH2CH(CH3)2),35.49(C3’), 35.17(C3’),29.31(O(CH2)4CH3),29.11(O(CH2)4CH3),25.67(CHCH2CH(CH3)2), 25.44(CHCH2CH(CH3)2),23.30(O(CH2)4CH3),23.10(CHCH2CH(CH3)2),23.00 (CHCH2CH(CH3)2),22.94(CHCH2CH(CH3)2),22.81(CHCH2CH(CH3)2),14.27 (O(CH2)4CH3)。
(ES+)m/z，实测值：671.3(M+H+),C32H43N6O8P要求值：670.69(M)。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝254nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 20.83min和tR 20.93 min。
2-O-甲基-3’-脱氧腺苷-5’-O-[苯基(1-己氧基-L-丙氨酸基)]磷酸酯N
Figure BDA0001303571290000691
根据一般步骤1，使用2-O-甲基-3’-脱氧腺苷(70mg,0.25mmol)、N-甲基 咪唑(99μL,1.24mmol)和苯基(己氧基-L-丙氨酸基)氯代磷酸酯(261mg,0.75 mmol)制备化合物N。通过用柱色谱(洗脱液体系梯度CH3OH/CH2Cl2 0/100至 6/94)和制备型TLC(1000μM，洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 7/93)纯化，得到 白色固体形式的目标化合物(26mg,18％)。
31P NMR(202MHz,CD3OD)δP 3.87,3.65。
1H NMR(500MHz,CD3OD)δH 8.08(s,0.5H,H8),8.07(s,0.5H,H8), 7.36-7.29(m,2H,Ph),7.24-7.14(m,3H,Ph),5.94(d,J＝2.0Hz,0.5H,H1’),5.92(d, J＝2.0Hz,0.5H,H1’),4.81-4.76(m,1H,H2’),4.71-4.62(m,1H,H4’),4.48-4.43(m, 0.5H,H5’),4.42-4.36(m,0.5H,H5’),4.33-4.25(m,1H,H5’),4.10-3.83(m,6H, OCH3,O(CH2)5CH3,CHCH3),2.48-2.40(m,1H,H3’),2.13-2.07(m,1H,H3’), 1.61-1.51(m,2H,O(CH2)5CH3),1.33-1.24(m,9H,O(CH2)5CH3,CHCH3),0.89(m, 3H,O(CH2)5CH3)。
13C NMR(125MHz,CD3OD)δC 175.13(d,3JC-P＝4.3Hz,C＝O),174.94(d, 3JC-P＝4.3Hz,C＝O),163.80(C2),163.78(C2),158.17(C6),158.15(C6),152.17(d, 2JC-P＝6.3Hz,C-Ar),152.15(d,2JC-P＝6.3Hz,C-Ar),152.03(C4),151.99(C4), 139.42(C8),139.39(C8),130.75(CH-Ar),130.74(CH-Ar),126.13(CH-Ar),121.43 (CH-Ar),121.41(CH-Ar),121.39(CH-Ar),121.37(CH-Ar),116.74(C5),116.69 (C5),93.40(C1’),93.27(C1’),80.30(C4’),80.23(C4’),76.40(C2’),68.85(d,2JC-P＝5.2Hz,C5’),68.42(d,2JC-P＝5.2Hz,C5’),66.43(O(CH2)5CH3),55.30(OCH3), 55.26(OCH3),51.64(CHCH3),51.54(CHCH3),35.30(C3’),35.04(C3’),32.58 (O(CH2)5CH3),29.67(O(CH2)5CH3),29.64(O(CH2)5CH3),26.61(O(CH2)5CH3), 23.59(O(CH2)5CH3),20.56(d,3JC-P＝6.4Hz,CHCH3),20.41(d,3JC-P＝6.4Hz, CHCH3),14.36(O(CH2)5CH3)。
(ES+)m/z，实测值：593.3(M+H+),C32H43N6O8P要求值：592.58(M)。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝254nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 17.02min和tR 17.23 min。
2-氟-3’-脱氧腺苷-5’-O-[1-萘基(苄氧基-L-丙氨酸基)]磷酸酯O
Figure BDA0001303571290000701
根据一般步骤1，使用2-氟-3’脱氧腺苷(50mg,0.18mmol)、N-甲基咪唑(74 μL,0.93mmol)和苯基(苄氧基-L-丙氨酸基)氯代磷酸酯(196mg,0.56mmol)制 备化合物O。通过用柱色谱(洗脱液体系梯度CH3OH/CH2Cl2 0/100至6/94)和 制备型TLC(500μM，洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 5/95)纯化，得到白色固体 形式的目标化合物(5mg,4％)。
31P NMR(202MHz,CD3OD)δP 4.33,4.08。
1H NMR(500MHz,CD3OD)δH 8.17(s,0.5H,H8),8.14(s,0.5H,H8), 8.14-8.09(m,1H,Ar),7.89-7.85(m,1H,Ar),7.70-7.66(m,1H,Ar),7.54-7.42(m, 4H,Ar),7.40-7.24(m,5H,Ar),5.89(d,J＝2.3Hz,0.5H,H1’),5.88(d,J＝2.3Hz, 0.5H,H1’),5.08-5.01(m,2H,OCH2Ph),4.70-4.60(m,2H,H2’,C4’),4.46-4.39(m, 1H,C5’),4.32-4.24(m,1H,C5’),4.09-3.97(m,1H,CHCH3),2.36-2.25(m,1H, H3’),2.06-1.98(m,1H,H3’),1.32-1.25(m,3H,CHCH3)。
13C NMR(125MHz,CD3OD)δC 175.54(CO),175.22(CO),161.02(d,1JC-F＝ 207.3Hz,C2),160.89(d,1JC-F＝207.3Hz,C2),158.45(d,3JC-F＝18.2Hz,C6), 158.23(d,3JC-F＝18.2Hz,C6),150.63(d,3JC-F＝18.4Hz,C4),140.67(C8),136.26 (C-Ar),131.62,131.54,129.56(CH-Ar),129.52(CH-Ar),129.37(CH-Ar),129.31 (CH-Ar),129.26(CH-Ar),128.87(CH-Ar),128.81(CH-Ar),128.29(CH-Ar), 128.02(CH-Ar),127.79(CH-Ar),127.76(CH-Ar),127.51(CH-Ar),127.49(CH-Ar), 127.47(CH-Ar),126.47(CH-Ar),126.33(C-Ar),126.27(C-Ar),125.97(CH-Ar), 122.78(CH-Ar),122.74(CH-Ar),122.64(CH-Ar),122.62(CH-Ar),116.35(d,4JC-F＝3.0Hz,C5),116.15(d,4JC-F＝3.0Hz,C5),93.25(C1’),93.20(C1’),80.41(d, 3JC-P＝7.5Hz,C4’),80.33(d,3JC-P＝7.5Hz,C4’),76.43(C2’),76.35(C2’),68.84(d, 2JC-P＝5.5Hz,C5’),68.45(d,2JC-P＝5.5Hz,C5’),67.92(OCH2Ph),67.92(OCH2Ph), 51.75(CHCH3),51.52(CHCH3),34.97(C3’),34.74(C3’),20.42(d,3JC-P＝6.7Hz,CHCH3),20.20(d,3JC-P＝6.7Hz,CHCH3)。
19F NMR(470MHz,CD3OD)δF-53.14,-53.22。
(ES+)m/z，实测值：637.2(M+H+),C30H30FN6O7P要求值：636.57(M)。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝254nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 17.09min和tR 17.34 min。
(2S)-苄基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋 喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯P
Figure BDA0001303571290000721
使用上述一般步骤1，将(2S)-苄基2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(196 mg,0.56mmol)的无水THF(2mL)的溶液和N-甲基咪唑(74μL,0.93mmol) 滴加至2-氟-3’-脱氧腺苷(50mg,0.18mmol)的无水THF(5mL)的悬浮液， 并将反应混合物在室温下搅拌16小时。通过用柱色谱(洗脱液体系 CH3OH/CH2Cl2 0/100至6/94)和制备型TLC(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 5/95) 纯化，得到白色固体形式的目标化合物(5mg,7％)。
(ES+)m/z，实测值：587.1(M+H+),C26H28FN6O7P要求值：586.17(M)。19F NMR(470MHz,CD3OD)：δF-53.17,-53.23。31P NMR(202MHz,CD3OD)：δP 3.95(s),3.67(s)。1H NMR(500MHz,CDCl3)：δH 8.19(s,0.5H,H8),8.16(s,0.5H, H8),7.36-7.27(m,7H,Ar),7.22-7.13(m,3H,Ar),5.91(d,J＝1.5Hz,0.5H,H1’), 5.89(d,J＝1.7Hz,0.5H,H1’),5.15-5.06(m,2H,OCH2Ph),4.73-4.58(m,2H,H2’, H4’),4.42-4.34(m,1H,H5’),4.02-3.90(m,1H,H5’),3.27-3.24(m,1H,H3’), 2.08-2.00(m,1H,H3’),1.33(d,J＝7.1Hz,1.5H,CH3ala),1.29(d,J＝7.1Hz,1.5H, CH3ala)。13C NMR(125MHz,CD3OD)：δC 175.85(d,3JC-P＝3.7Hz,C＝O),174.63 (d,3JC-P＝5.0Hz,C＝O),160.58(d,1JC-F＝207.5Hz,C2),160.53(d,1JC-F＝207.5Hz,C2),159.06(d,3JC-F＝18.7Hz,C6),159.05(d,3JC-F＝17.5Hz,C6),152.11(d,2JC-P＝8.75Hz,C-Ar),152.08(d,2JC-P＝8.7Hz,C-Ar),151.58(d,3JC-F＝19.7Hz,C4), 151.56(d,3JC-F＝19.5Hz,C4),140.63(C8),137.28(C-Ar),137.21(C-Ar),130.78 (CH-Ar),130.75(CH-Ar),129.58(CH-Ar),129.38(CH-Ar),129.34(CH-Ar), 129.32(CH-Ar),129.28(CH-Ar),128.3(CH-Ar),128.02(CH-Ar),121.16 (CH-Ar),121.18(CH-Ar),121.47(CH-Ar),121.51(CH-Ar),121.42(CH-Ar), 121.39(CH-Ar),121.36(CH-Ar),118.75(d,4JC-F＝3.7Hz,C5),118.72(d,4JC-F＝ 3.7Hz,C5),93.25(C1’),93.18(C1’),80.48(d,3JC-P＝8.3Hz,C4’),80.46(d,3JC-P＝ 8.1Hz,C4’),76.51(C2’),76.49(C2’),68.54(d,2JC-P＝5.2Hz,C5’),68.18(d,2JC-P＝ 5.6Hz,C5’),67.94(CH2Bn),67.91(CH2Bn),51.71(CH ala),51.56(CH ala),34.85(C3’),34.64(C3’),20.42(d,3JC-P＝7.1Hz,CH3ala),20.25(d,3JC-P＝7.5Hz,CH3 ala)。HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝280nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 14.98min和tR 15.12 min。
2-氟-3’-脱氧腺苷-5’-O-[1-萘基(1-戊氧基-L-亮氨酸基)]磷酸酯Q
Figure BDA0001303571290000731
根据一般步骤1，使用2-氟-3’脱氧腺苷(50mg,0.18mmol)、N-甲基咪唑(74 μL,0.93mmol)和萘基(戊氧基-L-亮氨酸基)氯代磷酸酯(246mg,0.56mmol)制 备化合物Q。通过用柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CHCl30/100至6/94)和制备 型TLC(1000μM，洗脱液体系CH3OH/CH2Cl25/95)纯化，得到白色固体形式 的目标化合物(65mg,53％)。
31P NMR(202MHz,CD3OD)：4.60,4.35。
1H NMR(500MHz,CD3OD)：δH 8.23(s,0.5H,H8),8.20(s,0.5H,H8), 8.18-8.12(m,1H,Ar),7.92-7.86(m,1H,Ar),7.73-7.68(m,1H,Ar),7.57-7.46(m, 3H,Ar),7.42-7.36(m,1H,Ar),5.93-5.91(m,1H,H1’),4.74-4.62(m,2H,H2’,H4’), 4.55-4.50(m,0.5H,H5’),4.49-4.44(m,0.5H,H5’),4.43-4.37(m,0.5H,H5’), 4.36-4.31(m,0.5H,H5’),4.02-3.86(m,3H,CHCH2CH(CH3)2,O(CH2)4CH3), 2.43-2.29(m,1H,H3’),2.12-2.04(m,1H,H3’),1.67-1.20(m,11H,O(CH2)4CH3, CHCH2CH(CH3)2),0.89-0.67(m,9H,O(CH2)4CH3,CHCH2CH(CH3)2)
13C NMR(125MHz,CD3OD)：δC 175.03(d,3JC-P＝2.5Hz,C＝O),174.93(d, 3JC-P＝2.5Hz,C＝O),161.45(d,1JC-F＝205.5Hz,C2),160.39(d,1JC-F＝205.5Hz, C2),158.33(C6),151.60(C4),147.92(C-Ar),140.69(C8),136.30(C-Ar),128.88 (CH-Ar),128.83(CH-Ar),127.80(CH-Ar),127.76(CH-Ar),127.49(CH-Ar), 127.46(CH-Ar),126.48(CH-Ar),126.45(CH-Ar),126.02(CH-Ar),125.91(CH-Ar), 123.03(C-Ar),122.81(CH-Ar),122.69(CH-Ar),116.39(d,3JC-P＝2.9Hz,CH-Ar), 116.28(C5),116.26(C5),115.97(d,3JC-P＝2.9Hz,CH-Ar),93.29(C1’),93.23(C1’), 80.45(d,3JC-P＝6.0Hz,C4’),80.38(d,3JC-P＝6.0Hz,C4’),76.45(C2’),76.41(C2’), 68.99(d,2JC-P＝5.4Hz,C5’),68.78(d,2JC-P＝5.4Hz,C5’),66.31(O(CH2)4CH3), 66.29(O(CH2)4CH3),54.78(CHCH2CH(CH3)2),54.66(CHCH2CH(CH3)2),44.16(d, 3JC-P＝7.25Hz,CHCH2CH(CH3)2),43.84(d,3JC-P＝7.3Hz,CHCH2CH(CH3)2), 35.09(C3’),34.79(C3’),29.31(O(CH2)4CH3),29.12(O(CH2)4CH3),25.65 (CHCH2CH(CH3)2),25.41(CHCH2CH(CH3)2),23.33(O(CH2)4CH3),23.11 (CHCH2CH(CH3)2),23.00(CHCH2CH(CH3)2),21.95(CHCH2CH(CH3)2),21.68 (CHCH2CH(CH3)2),14.29(O(CH2)4CH3)。
19F NMR(470MHz,CD3OD)：δF-53.15,-53.20。
(ES+)m/z,实测值：659.3(M+H+),C31H40FN6O7P要求值：658.66(M)。
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，1 ml/min，l＝254nm，显示重叠的非对映异构体的一个峰，其中tR 21.95min。
(2S)-己基2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋 喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯R
Figure BDA0001303571290000741
使用上述一般步骤1，将(2S)-己基2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(196 mg,0.56mmol)的无水THF(2mL)的溶液和N-甲基咪唑(74μL,0.93mmol) 滴加至2-氟-3’-脱氧腺苷(50mg,0.18mmol)的无水THF(5mL)的悬浮液， 并将反应混合物在室温下搅拌16小时。通过用柱色谱(洗脱液体系 CH3OH/CH2Cl20/100至6/94)和制备型TLC(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl25/95) 纯化，得到白色固体形式的目标化合物(5mg,7％)。
(ES+)m/z，实测值：587.1(M+H+),C26H28FN6O7P要求值：586.17(M)。19F NMR(470MHz,CD3OD)：δF-53.15,-53.20。31P NMR(202MHz,CD3OD)：3.91 (s),3.73(s)。1H NMR(500MHz,CDCl3)：δH 8.21(s,0.5H,H8),8.20(s,0.5H,H8), 7.37-7.29(m,7H,Ar),7.26-7.13(m,3H,Ar),5.94-5.91(m,1H,H1’),4.76-4.64(m, 2H,H2’,H4’),4.49-4.44(m,0.5H,H5’),4.43-4.37(m,0.5H,H5’),4.33-4.26(m,1H, H5’),4.11-3.99(m,2H,CH2Hex),3.97-3.83(m,1H,CH ala),2.41-2.32(m,1H, H3’),2.13-2.06(m,1H,H3’),1.62-1.52(m,2H,CH2Hex),1.37-1.23(m,9H,CH3 ala,CH2Hex),0.92-0.85(m,3H,CH3Hex)。
13C NMR(125MHz,CD3OD)：δC 175.15(d,3JC-P＝3.7Hz,C＝O),174.96(d, 3JC-P＝5.0Hz,C＝O),160.59(d,1JC-F＝207.5Hz,C2),160.56(d,1JC-F＝207.5Hz, C2),159.09(d,3JC-F＝21.2Hz,C6),159.08(d,3JC-F＝20.0Hz,C6),152.16(d,2JC-P＝7.5Hz,C-Ar),152.14(d,2JC-P＝6.3Hz,C-Ar),151.71(d,3JC-F＝20.0Hz,C4), 151.67(d,3JC-F＝20.0Hz,C4),140.70(d,5JC-F＝2.5Hz,C8),140.68(d,5JC-F＝2.5 Hz,C8),130.77(CH-Ar),130.74(CH-Ar),126.16(CH-Ar),126.24(CH-Ar),121.48 (CH-Ar),121.44(CH-Ar),121.41(CH-Ar),121.37(CH-Ar),118.80(d,4JC-F＝3.7 Hz,C5),118.77(d,4JC-F＝3.7Hz,C5),93.37(C1’),93.25(C1’),80.52(d,3JC-P＝3.7 Hz,C4’),80.45(d,3JC-P＝4.1Hz,C4’),76.52(C2’),76.49(C2’),68.69(d,2JC-P＝5.4 Hz,C5’),68.30(d,2JC-P＝4.9Hz,C5’),66.46(CH2Hex),51.68(CH ala),51.57(CH ala),35.02(C3’),34.80(C3’),32.58(CH2Hex),29.65(CH2Hex),26.61(CH2Hex), 23.59(CH2Hex),20.60(d,3JC-P＝7.1Hz,CH3ala),20.43(d,3JC-P＝7.5Hz,CH3ala), 14.35(CH3Hex)。HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反 相HPLC，1ml/min，l＝280nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 17.83min 和tR 18.02min。
(2R)-苄基2-((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-2-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃- 2-基)甲氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基氨基)丙酸酯S
Figure BDA0001303571290000751
向搅拌的2-氯-3’-脱氧腺苷(100mg,1.0mol/eq.)的10mL的无水THF溶液 滴加溶于10mL的无水THF的424mg的(2S)-苄基2-(氯(萘-1-基氧基)磷酰基氨 基)丙酸酯(3.0eq/mol)。在氩气气氛下，在室温下，向该反应混合物滴加0.14mL 的NMI(5mol/eq.)。将反应混合物搅拌88小时。在减压下除去溶剂，并通过 用洗脱液梯度(CH3OH/CH2Cl20/100至5/95)的柱色谱法纯化残余物，得到黄 色固体形式的目标产物。(7mg,产率＝3％)。MS(ES+)m/z：实测值：653(M+ H+),675(M+Na+)C30H30ClN6O7P要求值：652.16(M)；31P NMR(202MHz, CD3OD)：δP4.39(s),4.12(s)；1H NMR(500MHz,CD3OD)：δH 8.10(s,0.5H, H8),8.07(s,0.5H,H8),8.02-7.97(m,3H,CH2Ph and Naph),7.43-7.14(m,9H, CH2Ph and Naph),5.80-5.81(m,1H,H1’),4.89-4.97(m,2H,CH2Ph)4.49-4.53(m, 2H,H4’和H2’),4.30-4.35(m,1H,H5’),4.15-4.21(m,1H,H5’),3.87-3.95(m,1H, CHCH3),2.12-2.23(m,1H,H3’),1.86-1.93(m,1H H3’),1.14-1.17(m,3H, CHCH3)；13C NMR(125MHz,CD3OD)：δC 174.85(d JCP＝4.0Hz,C＝O),174.55(d JCP＝4.3Hz,C＝O),158.07,158.04(C6),155.31,155.28(C2),151.34, 151.31(C4),149.69(C-Ar),147.96(d 3JCP＝7.25Hz,C-ipso Naph),147.90(d 3JCP＝ 7.0Hz,C-ipso Naph),140.70(C8),137.21,137.16(C-ipso CH2Ph),136.26(C-Ar), 130.92,130.80,129.56,129.53,129.31,129.27,129.25,128.88,128.81(CH-Ar), 127.78(d JCP＝4.7Hz,CH-Ar),127.50(d JCP＝6.2Hz,CH-Ar),126.48,126.02, 125.97(CH-Ar),119.46,119.42(C5),116.33(d,JCP＝3.0,CH-Ar),116.16(d,JCP＝ 3.4,CH-Ar),93.30,93.27(C1’),80.56(d J＝8.3Hz,C4’),80.51(d J＝8.4Hz,C4’), 76.61,76.54(C2’),68.74(dJCP＝5.3Hz,C5’),68.54(d JCP＝5.1Hz,C5’),67.93, 67.90(CH2Ph),51.81,51.70(CHCH3),34.79,34.53(C3’),20.42(d JCP＝6.5Hz, CHCH3),20.23(d JCP＝7.7Hz,CHCH3)；HPLC使用H2O/CH3CN从90/10至0/100 洗脱30分钟的反相HPLC，F＝1ml/min，l＝254nm，tR 18.03min。
2-氯-3’脱氧腺苷5’-O-[1-苯基(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酸)]磷酸酯T
Figure BDA0001303571290000761
根据一般步骤1，使用2-氯-3’-脱氧腺苷(350mg,1.25mmol)、N-甲基咪唑 (490μL,6.15mmol)和苯基(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酸基)氯代磷酸酯(1231 mg,3.69mmol)制备化合物T。通过用柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl20/100 至5/95)和制备型TLC(1000μM，洗脱液体系CH3OH/CH2Cl24/96)纯化，得 到白色固体形式的目标化合物(181mg,25％)。
31P NMR(202MHz,CD3OD)：δP 3.93,3.72。
1H NMR(500MHz,CD3OD)：δH 8.12(s,0.5H,H8),8.10(s,0.5H,H8), 7.19-7.23(m,2H,Ph),7.03-7.12(m,3H,Ph),5.84(d J＝2,0.5H,H1’),5.83(d J＝2, 0.5H,H1’),4.54-4.60(m,2H,H4’and H2’),4.34-4.38(m,0.5H,H5’),4.27-4.31(m, 0.5H,H5’),4.16-4.23(m,1H,H5’),3.80-3.90(m,1H,CHCH3),3.57-3.73(m,2H OCH2C(CH3)3),2.18-2.28(m,1H,H3’),1.94-1.99(m,1H,H3’),1.20-1.24(m,3H, CHCH3),0.81(s,4.5H OCH2(CH3)3),0.79(s,4.5H OCH2C(CH3)3)。
13C NMR(125MHz,CD3OD)：δC 175.09(d 3JCP＝4.75Hz,C＝O),174.90(d 3JCP＝5.37Hz,C＝O),158.10,(C6),155.31,155.28(C2),152.14(d 2JCP＝6.37Hz, C-ipso Ph),152.13(d 2JCP＝6.25Hz,C-ipso Ph),151.33,151.30(C4),140.87,140.76 (C8),130.78,130.77(CH-Ar),126.17,126.42(CH-Ar),121.45(d 3JCP＝11.75Hz, CH-Ar),121.41(d 3JCP＝11.75Hz,CH-Ar),119.52,119.48(C5),93.49,93.35(C1’), 80.67(d 3J＝8.62Hz,C4’),80.65(d 3J＝8.25Hz,C4’),76.70,76.67(C2’),75.43, (OCH2C(CH3)3),68.68(d 2JCP＝5.12Hz,C5’),68.42(d 2JCP＝5.12Hz,C5’),51.77, 51.60(CHCH3),34.94,34.67(C3’),32.36,32.32(OCH2C(CH3)3),26.78,26.76 (OCH2C(CH3)3),20.83(d JCP＝6.25Hz,CHCH3),20.61(d JCP＝7.12Hz,CHCH3)。
MS(ES+)m/z：实测值：583(M+H+),605(M+Na+)C24H32ClN6O7P要求值： 582.18(M)。
HPLC使用H2O/CH3CN从90/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，F＝1 ml/min，l＝254nm，tR 16.37,16.55min。
2-氯-3’-脱氧腺苷5’-O-[1-萘基(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酸)]磷酸酯U
Figure BDA0001303571290000781
根据一般步骤1，使用2-氯-3’脱氧腺苷(350mg,1.25mmol)、N-甲基咪唑 (490μL,6.15mmol)和萘基(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酸基)氯代磷酸酯(1416 mg,3.69mmol)制备化合物U。通过用柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 0/100 至5/95)和制备型TLC(1000μM，洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 4/96)纯化，得 到白色固体形式的目标化合物(264mg,34％)。
31P NMR(202MHz,CD3OD)：δP 4.35,4.20。
1H NMR(500MHz,CD3OD)：δH 8.23(s,0.5H,H8),8.21(s,0.5H,H8), 8.11-8.16(m,1H,Naph),7.86-7.89(m,1H,Naph),7.69-7.70(m,1H,Naph), 7.54-7.46(m,3H,Naph),7.37-7.41(m,1H,Naph),5.95(d J＝2,0.5H,H1’),5.94 (d J＝1.5,0.5H,H1’),4.67-4.73(m,2H,H4’and H2’),4.34-4.55(m,2H,H5’), 4.00-4.08(m,1H,CHCH3),3.66-3.81(m,2HOCH2C(CH3)3),2.28-2.41(m,1H, H3’),2.03-2.10(m,1H,H3’),1.31-1.34(m,3H,CHCH3),0.90(s,4.5H OCH2C(CH3)3),0.89(s,4.5H CH2(CH3)3)。
13C NMR(125MHz,CD3OD)：δC 175.11(d JCP＝4.1Hz,C＝O),174.85(d JCP＝5.0Hz,C＝O),158.10,158.04(C6),155.32,155.30(C2),151.33(C4),147.96(d 2JCP＝7.25Hz,C-ipso Naph),147.93(d 2JCP＝7.25Hz,C-ipso Naph),140.84,140.76 (C8),136.29(C-Ar),128.87,128.82(CH-Ar),127.85(C-Ar),127.77,127.74,127.48, 127.45,126.47,125.99,125.96,122.74,122.66(CH-Ar),119.47(C5),116.29(d 3JCP＝3.4Hz,CH-Ar),116.17(d3JCP＝2.9Hz,CH-Ar),93.42,93.34(C1’),80.57(d 3JCP＝8.1Hz,C4’),80.53(d 3JCP＝5.1Hz,C4’),76.61,76.53(C2’),75.41,75.38 (OCH2C(CH3)3),68.95(d 2JCP＝5.3Hz,C5’),68.82(d 2JCP＝5.2Hz,C5’),51.84, 51.73(CHCH3),35.04,34.75(C3’),32.29(OCH2C(CH3)3),26.70(OCH2C(CH3)3), 20.76(d 3JCP＝6.4Hz,CHCH3),20.55(d 3JCP＝7.2Hz,CHCH3)。
MS(ES+)m/z：实测值：633(M+H+),655(M+Na+)C28H34ClN6O7P要求值： 652.16(M)。
HPLC使用H2O/CH3CN从90/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，F＝1 ml/min，l＝254nm，tR 19.16min。
2-氯-3’脱氧腺苷5’-O-[1-苯基(乙氧基-L-丙氨酸)]磷酸酯V
Figure BDA0001303571290000791
根据一般步骤4，使用2-氯-3’-脱氧腺苷(343mg,0.66mmol)、叔丁基二甲 基甲硅烷基氯(328mg 2.18mmol)咪唑(297mg,4.36mmol)制备化合物V。 通过柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 0/100至12/88)纯化得到定量产率的 中间体1。接下来，将中间体1(970mg,1.89mmol)与12mL的THF/H2O/TFA 4/1/1溶液反应。通过柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl20/100至12/88)纯化 得到中间体2(544mg,72％)。然后，将中间体2(204mg,0.51mmol)与苯基 (乙氧基-L-丙氨酸基)氯代磷酸酯(348.56mg,1.02mmol)的无水THF(5mL) 溶液和叔丁基氯化镁反应。通过柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 0/100至 8/92)纯化得到中间体3(93mg,28％)。最后将中间体3(93mg,0.14mmol) 与THF/TFA/H2O 1/1/1(3mL)的溶液反应。通过制备TLC(2000μm，洗脱液 体系CH3OH/CH2Cl2 4/96)纯化，得到白色固体形式的标题化合物(50mg,66％)。 (总产率13％)
31P NMR(202MHz,CD3OD)：δP 3.93,3.72。
1H NMR(500MHz,CD3OD)：δH 8.12(s,0.5H,H8),8.11(s,0.5H,H8), 7.18-7.23(m,2H,Ph),7.03-7.12(m,3H,Ph),5.85(d J＝1.5,0.5H,H1’),5.84(d J ＝2,0.5H,H1’),4.55-4.62(m,2H,H4’and H2’),4.34-4.38(m,0.5H,H5’), 4.28-4.32(m,0.5H,H5’),4.16-4.22(m,1H,H5’),3.93-4.03(m,2H,OCH2CH3), 3.70-3.84(m,1H,CHCH3),2.20-2.28(m,1H,H3’),1.95-1.99(m,1H,H3’), 1.15-1.21(m,3H,CHCH3),1.06-1.11(m,3H,OCH2CH3)。
13C NMR(125MHz,CD3OD)：δC 173.66(d 3JCP＝4.5Hz,C＝O),173.65(d 3JCP＝5.3Hz,C＝O),156.68,156.70(C6),153.93,153.88(C2),150.72(d 2JCP＝6.7 Hz,C-ipsoPh),150.71(d 2JCP＝6.5Hz,C-ipso Ph),149.89,149.94(C4),139.41, 139.35(C8),129.33(CH-Ar),124.74,124.73(CH-Ar),120.03(d 3JCP＝4.75Hz, CH-Ar),119.97(d 3JCP＝4.87Hz,CH-Ar),118.07,118.03(C5),92.02,91.88(C1’), 79.26,79.19(C4’),75.26,75.24(C2’),67.18(d 2JCP＝5.25Hz,C5’),66.81(d 2JCP＝ 5.12Hz,C5’),60.96(OCH2CH3),50.23,50.12(CHCH3),33.46,33.21(C3’),19.16 (d 3JCP＝6.3Hz,CHCH3),18.97(d 3JCP＝7.2Hz,CHCH3),13.10,13.07 (OCH2CH3)。
MS(ES+)m/z：实测值：541(M+H+),563(M+Na+)C21H26ClN6O7P要求值： 540(M)。
HPLC使用H2O/CH3CN从90/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，F＝1 ml/min，l＝254nm，tR 12.41,12.83min。
(2S)-异丙基-2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃- 2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯W
Figure BDA0001303571290000801
将(2S)-异丙基2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(546mg,3mmol)的无 水THF(5mL)溶液和N-甲基咪唑(240μL,5mmol)滴加至(2R,3R,5S)-2-(6- 氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(150mg,0.6mmol)在无水THF (3mL)中的悬浮液，并在16小时时间期间将反应混合物在室温下搅拌。通过 用柱色谱(洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 0/100至6/94)和制备型TLC(2000μM， 洗脱液体系CH3OH/CH2Cl2 5/95)纯化，得到白色固体形式的目标化合物(40mg, 13％)。
MS(ES+)m/z：实测值：521.2(M+H+),543.3(M+Na+),1063.4(2M+Na+) C31H33N6O8P要求值：520.18(M)。
31P NMR(202MHz,CD3OD)：δP 3.99(s),3.82(s)。
1H NMR(500MHz,CD3OD)：δH 8.16(s,0.5H,H8),8.15(s,0.5H,H8),8.11 (s,1H,H-2)7.23-7.20(m,2H,Ph),7.11-7.03(m,3H,Ph),5.91(d J＝2.0Hz,0.5H, H1’),5.90(d J＝2.0Hz,0.5H,H1’),4.85-4.79(m,1H,CH(CH3)2,4.64-4.63(m,1H, H4’),4.60-6.57(m,1H,H2’),4.37-4.33(m,1H,H5’),4.31-4.28(m,1H, H5’),3.74-4.22-4.17(m,1H,H5’),3.70(m,1H,CH ala),2.02-1.97(m,1H, H3’),2.04-2.01(m,1H,H3’),1.18-1.14(m,3H,CH3),1.24(m,6H,CH(CH3)2)
HPLC使用H2O/CH3CN从100/10至0/100洗脱30分钟的反相HPLC，F＝ 1ml/min，λ＝200nm，显示非对映异构体的两个峰，其中tR 11.58min和tR 11.92 min。
溶剂和试剂。以下无水溶剂购自Sigma-Aldrich：二氯甲烷(CH2Cl2)、磷酸 三甲酯((CH3O)3PO)。可商购的氨基酸酯购自Sigma-Aldrich。所有可商购的试 剂无需进一步纯化即可使用。
薄层色谱(TLC)。
在短波和长波紫外光(254和366nm)下或通过使用以下TLC指示剂进行 燃烧可视化预涂铝背板(60F254，0.2mm厚度，Merck)：(i)钼酸铵硫酸铈； (ii)高锰酸钾溶液。制备型TLC板(20cm×20cm,500-2000μm)购自Merck。
快速柱色谱。使用由Fisher供应的硅胶(60A,35-70μm)进行快速柱色谱。 使用适当的洗脱液将玻璃柱匀浆填充，将样品预吸附到硅胶上或以在相同的洗 脱液中的浓缩溶液的形式将样品装载到硅胶上。通过TLC鉴定含有产物的馏分， 并且合并并真空除去溶剂。
高效液相色谱(HPLC)。通过使用I)ThermoSCIENTIFIC，SPECTRA SYSTEM P4000，检测器SPECTRA SYSTEM UV2000，Varian Pursuit XRs 5 C18,150x 4.6mm(作为分析柱)或II)Varian Prostar(LC工作站-Varian Prostar 335LC检测器)，Thermo SCIENTIFICHypersil Gold C18,5μ，150x 4.6mm(作 为分析柱)的HPLC分析，验证最终化合物的纯度>95％。关于洗脱方法参见实 验部分。
核磁共振(NMR)。在25℃下，在Bruker Avance 500MHz光谱仪上记录1H NMR(500MHz)、13C NMR(125MHz)、31P NMR(202MHz)和19F NMR(470 MHz)。相对于内标MeOH-d4(δ3.34 1H-NMR,δ49.86 13C-NMR)和CHCl3-d4 (δ7.26 1H NMR,δ77.36 13C NMR)或外标85％H3PO4(δ0.00 31P NMR)将化 学位移(δ)引述为百万分之一份(ppm)。以赫兹测量耦合常数(J)。在NMR 信号的归属中使用以下缩写：s(单峰)、d(二重峰)、t(三重峰)，q(四重峰)、 m(多重峰)、bs(宽单峰)、dd(双二重峰)、dt(双三重峰)、app(明显的)。 基于偶合常数和附加二维实验(COZY、HSQC、HMBC、PENDANT)的分析 进行1H NMR和13C NMR中的信号归属。
质谱(MS)。在Bruker Daltonics microTof-LC(大气压电离，电子喷雾质谱) 上以正或负模式进行低分辨率质谱。
最终化合物的纯度。使用HPLC分析证实所有最终化合物的纯度≥95％。
实施例2-细胞毒性
按以下步骤评估体现本发明的示例性化合物的抗癌效力。
使用CellTiterGlo(CTG，Promega-G7573)测定法，在72小时内进行体外 生存力测定以评估化合物对7种选择的细胞系中细胞生存力的影响。一式二份 地进行测试，在约72小时内，在96孔板中3.16倍滴定，在9个点处理化合物。 化合物起始浓度为198mM。进行在96孔板中使用CellTiterGlo的细胞生存力测 定。在标准生长条件下一式二份地化合物处理为72小时。将化合物溶解至40 mM，解冻100％。将化合物在解冻的DMSO中以3.16倍连续稀释，并在溶于培 养基(2μl+200μl)中之前，加热至37℃。在将化合物溶于培养基后(培养基也加热至37℃)。一式二份地，在孵化器中将包含化合物的培养基加热至37℃， 然后将培养基中的化合物加入到细胞板(50μl+50μl)中。化合物最终浓度为 198M至19.9nM。再次检查并记录所有化合物溶解度，然后将平板立即转移到 CO2组织孵化器中，并孵育3天。DMSO最终浓度为0.5％。
初步筛选的结果在表II中提供。A表示从0.1至5μM的相对IC50，B表示 大于5μM且高达15μM的相对IC50，C表示大于15μM且高达100μM的相对 IC50；D表示大于100μM的相对IC50。
表II
Figure BDA0001303571290000831
aMOLT-4：急性淋巴母细胞白血病；bKG-1：急性髓细胞白血病；cHL-60： 急性早幼粒细胞白血病；dCCRF-CEM：急性淋巴母细胞白血病；eK562：慢性髓 细胞白血病。fIC50μM：相对IC50；gM.I.％：细胞生存力的最大百分比抑制。
表II(续)
Figure BDA0001303571290000832
Figure BDA0001303571290000841
hMCF-7：乳腺癌；1HepG2：肝细胞癌
然后使用以下测定法，在更广泛的不同实体瘤和血液学恶性肿瘤阵列中测 定本发明的化合物的亚组的细胞毒活性。
实体瘤和血液学恶性肿瘤测定
使用CellTiterGlo(CTG，Promega-G7573)测定，在72小时内进行体外生 存力测定以评估化合物对选择的细胞系中细胞生存力的影响。一式二份地进行 测试，在约72小时内，在96孔板中3.16倍滴定，在9个点处理化合物。化合 物起始浓度为198mM。进行在96孔板中使用CellTiterGlo的细胞生存力测定。 标准生长条件一式二份地化合物处理为72小时。将化合物溶解至40mM，解冻 100％。将化合物在解冻的DMSO中以3.16倍连续稀释，并在溶于培养基(2μl+ 200μl)中之前，加热至37℃。在将化合物溶于培养基之后，在孵化器中将包含化合物的培养基加热至37℃，然后一式二份地将培养基中的化合物加入到细胞 板(50μl+50μl)中。化合物最终浓度为198M至19.9nM。再次检查并记录所 有化合物溶解度，然后将平板立即转移到CO2组织孵化器中，并孵育3天。DMSO 最终浓度为0.5％。
测试以下细胞系，并在下表IV中提及：
表III
Figure BDA0001303571290000851
初步筛选的结果在表IV-VII中提供。对于表IV至VI：A表示从0.1μM至 5μM的绝对IC50，B表示大于5μM且高达15μM的绝对IC50，C表示大于15μM 且高达100μM的绝对IC50；且D表示大于100μM的绝对IC50。对于表VII：A 表示从0.1μM至5μM的绝对EC50，B表示大于5μM且高达15μM的绝对EC50， C表示大于15μM且高达100μM的绝对EC50；且D表示大于100μM的绝对EC50。
表IV
Figure BDA0001303571290000852
Figure BDA0001303571290000861
表IV(续)
Figure BDA0001303571290000862
表IV(续)
Figure BDA0001303571290000863
表IV(续)
Figure BDA0001303571290000871
表IV(续)
Figure BDA0001303571290000872
表V
Figure BDA0001303571290000873
Figure BDA0001303571290000881
表V(续)
Figure BDA0001303571290000882
表VI
Figure BDA0001303571290000883
表VI(续)
Figure BDA0001303571290000884
Figure BDA0001303571290000891
表VI(续)
Figure BDA0001303571290000892
表VII
Figure BDA0001303571290000893
表VII(续)
Figure BDA0001303571290000894
Figure BDA0001303571290000901
测试的所有化合物显示对所测试的细胞系的细胞毒活性。在大多数情况下， 本发明的化合物对所有细胞系比母体核苷更有效。
实施例3-细胞毒性和癌症干细胞活性的评估
进行在扩大的剂量范围内的化合物在急性髓性白血病(AML)细胞系KG1a 中的毒性的进一步比较分析，并在整个剂量范围内评估化合物对KG1a细胞系内 的白血病干细胞(LSC)隔室的相对影响。
材料和方法
KG1a细胞培养条件
将KG1a细胞系保持在补充有100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素和20％ 胎牛血清的RPMI培养基(Invitrogen，Paisley，UK)中。随后，将细胞等分(105个细胞/100μl)到96孔板中，并在核苷类似物和它们各自的proTides的存在下， 所述核苷类似物和它们各自的proTides具有针对各个系列的化合物实验测定的 浓度，在37℃，在潮湿的5％二氧化碳气氛中孵育72小时。此外，进行其中没 有加入药物的对照培养。随后通过离心收获细胞，并使用膜联蛋白V测定法通 过流式细胞术进行分析。
体外细胞凋亡的测定
通过离心收获培养的细胞，然后重悬于195μl富含钙的缓冲液中。随后， 将5μl的膜联蛋白V(Caltag Medsystems，Botolph Claydon，UK)加入到细胞 悬液，并在洗涤之前将细胞在黑暗中孵育10分钟。最后，将细胞重新悬浮在190 μl的富含钙的缓冲液连同10μl的碘化丙啶中。如前所述，通过双色免疫荧光流 式细胞术评估细胞凋亡。随后，计算每种核苷类似物和ProTide的LD50值(杀 死培养基中50％的细胞所需的剂量)。
白血病干细胞隔室的免疫表型鉴定
在各种浓度范围的各个测定的化合物的存在下，将KG1a细胞培养72小时。 然后，收获细胞，并用抗谱系抗体(PE-cy7)、抗CD34(FITC)、抗CD38(PE) 和抗CD123(PERCP cy5)的混合物标记。随后，鉴定表达LSC表型的亚群， 并表示为培养基中剩余的所有活细胞的百分比。然后，将剩余的干细胞的百分 比绘制在剂量反应图上，并将化合物的效果彼此比较，并与母体核苷进行比较。
统计分析
使用单因素方差分析评估在这些实验中获得的数据。使用综合K2测试将所 有数据确认为高斯或高斯近似。从非线性回归和S形剂量-反应曲线的最佳拟合 分析线计算LD50值。使用Graphpad Prism 6.0软件(Graphpad Software Inc.,San Diego,CA)进行所有统计分析。
结果
使用膜联蛋白V/碘化丙啶测定法测量体外药物敏感性。当与虫草素相比时， 化合物A显示体外效能增加(P<0.0001)。2-F-虫草素比虫草素显著更强效 (P<0.0001)，并且与母体核苷相比，所有测试的ProTides显示更强的效力(图 1)。
这些实验证实，化合物A显示在高于1mM的浓度下的干细胞隔室中效力 增强的证据。从图2可以看出，化合物A显示不仅能够减少总共的癌症干细胞 数量，而且还减小这种细胞的数量占存在于培养基中的癌细胞总数的比例。这 表明化合物A优先靶向癌症干细胞的能力。在测试的较高浓度(1mM及以上) 下，化合物A优先靶向LSC的能力明显高于母体化合物。
当与母体核苷相比时，2-F-虫草素proTides化合物P、Q和R还显示显著提 高的LSC的优先靶向。相比之下，虽然化合物O能够使处理的细胞群体中存在 的LSC的比例降低(表明靶向LSC的能力)，但在任何测试的浓度下，它的活 性与2-F-虫草素没有显著差异。图3显示2-F-虫草素和所有测试的proTides之 间的比较，而个别比较显示在图4的系列图中。
实施例4-进一步的细胞毒性评估和抑制研究
对本发明的某些化合物进行进一步的研究以测试本发明的某些化合物的细 胞毒活性，并且还测量它们对4种血液癌细胞系的活性。
TdT阳性CEM(人ALL)
TdT阴性K562(人CML)
TdT阴性H1-60(人ANLL)
RL(CRL-2261)非HD淋巴瘤
还测量了这些细胞系中活性代谢物dATP(三磷酸虫草素)的浓度。
还在CEM和RL癌细胞系中，在hENT1、腺苷激酶(AK)和腺苷脱氨酶 药理学抑制剂的存在下研究细胞毒活性和细胞内3’-dATP浓度。所述抑制剂模 拟已知的抗癌机制。
方法
细胞培养
HL-60(
Figure BDA0001303571290000921
CCL-240TM)、K562(
Figure BDA0001303571290000922
CCL-243TM)、CCRF-CEM (
Figure BDA0001303571290000923
CRM-CCL-119TM)和RL(
Figure BDA0001303571290000924
CRL-2261TM)白血病细胞系，得 自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，米德尔塞克斯。HL-60和K562细胞系为 脱氧核苷酸基转移酶阴性(TdT-ve)，而CCRF-CEM细胞系为TdT+ve。
HL-60细胞系为急性早幼粒细胞白血病；K562为CML细胞系、CCRF-CEM 细胞系为急性淋巴母细胞白血病(ALL)且RL为非霍奇金淋巴瘤细胞系。
细胞系维持
将HL-60、K562、CCRF-CEM和RL细胞系在补充有10％胎牛血清(FBS) (PAA实验室)、1％两性霉素B(5.5ml)和1％青霉素/链霉素(5.5ml)(PAA 实验室)的RPMI-1640培养基(Sigma Aldrich，UK)中培养，并在含有5％CO2的37℃的孵化器中生长在烧瓶中。
腺苷5’-三磷酸酯(ATP)测定
ATP的量用作细胞数量和细胞生存力的量度。ATP ViaLightTM plus检测试 剂盒(Lonza，USA：产品编号LT07-121)以检测在发光相容性96孔板中处理 的细胞中的ATP(细胞的初始浓度为1x104个细胞/孔)，其中虫草素和ProTides 的浓度为：0、0.1、0.5、1,5和10μM，然后在包含5％CO2的37℃孵化器中孵 育72小时。对于抑制剂研究，加入10μM的NBTI或1μ的MEHNA或A-134974， 并在加入药物之前放置5分钟(参见第5节的抑制剂细节)。
孵育后，向96孔板中加入50μl的细胞裂解试剂以释放细胞内ATP，然后 加入100μl的ATP监测试剂(AMR)。使用FLUOstar OPTIMA酶标仪(BMG Labtech)测定每个孔的发光值，其通过使用荧光素酶将ATP转化成光。因此， 所产生的发光量与ATP的量成正比。
处理细胞和提取样品进行细胞内三磷酸酯分析
使用具有5x106个细胞/ml的细胞系。用1μl的50μM的各个虫草素和化合 物A、B、D、E和F处理细胞，并在包含5％CO2在37℃下孵育2小时。孵育 后，将细胞离心(环境，1200rpm，5分钟)，除去培养基上清液，用1ml的PBS 洗涤细胞聚合体并离心(环境，1200rpm，5分钟)。除去上清液；将聚合体重 构在100μl的PBS和100μl的0.8M高氯酸中并涡旋混合并保持在冰上30分钟。 然后离心(环境，1200rpm，5分钟)，将180μl的上清液转移到新管中，并保 存在-80℃直到分析时间。
在分析过程中，将90μl的提取物转移到新鲜管中。向提取物中加入25μl 的1M乙酸铵，然后通过加入10μl的10％氨水和5μl的去离子水中和，然后转 移到LC-MS小瓶中，将10μl注入到UPLC-MS/MS系统中。
抑制剂研究
以与上述相同的方式处理细胞系，但在用药物处理之前，加入许多抑制剂：
硝基苄基硫肌苷(NBTI)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,产品编号N2255) 阻断核苷转运蛋白
EHNA盐酸盐(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,产品编号E114))阻断腺苷脱 氨酶
腺苷激酶抑制剂A-134974二盐酸盐水合物(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO， 产品编号A2846)：阻断腺苷激酶
用10μM的NBTI或1μM的EHNA或A-134974处理细胞，并在加入药物 前放置5分钟。然后，将细胞用5％CO2在37℃下孵育2小时。
LC-MS/MS分析
使用配备有Biobasic Ax5μm，50×2.1mm柱(Thermo Electron Corporation，Murrieta，CA，USA)的超高效液相色谱系统(Accela UPLC，Thermo Scientific， UK)和由10mM NH4Ac在ACN/H2O(30:70v/v)(pH6.0)(A)中以及1mM NH4Ac 在ACN/H2O(30:70v/v)(pH10.5)(B)中的混合物组成的流动相拆分分析物。 使用包括：缓冲液A＝95％保持在0-0.5分钟，在1.25分钟内从95％至0％，保持 在0％持续1.75分钟，在0.1分钟内从0-95％，以95％持续2.9分钟结束的流动 相梯度，全部在500μl/min的流速下。
使用装备有电喷雾离子源的三重四极杆Vantage质谱系统(Thermo Scientific，UK)检测感兴趣的洗脱化合物。在多重反应监测，负离子模式下， 在3000V的喷雾电压下分析样品。氮气以分别为50和20任意单位的流量用作 鞘流气和辅助气体。氩气被用作压力为1.5毫托的碰撞气体。每个分析者的最佳 过渡子离子质量和碰撞能量如下：3’ATP 490.1→392.1(碰撞能量19V)和内标 ChloroATP 539.9→442.2(碰撞能量24V)。
统计分析
使用百分比细胞生存力的非线性回归分析对浓度确定药物的细胞毒性的剂 量-反应曲线，并获得EC50值。各个条件进行5次重复的细胞内测定。使用 3`ATP/ATP浓度的配对t检验(双尾)分析确定细胞内测定，并获得p值。对于 所有分析，使用Prism Software程序(GraphPad软件)，并使用Microsoft
Figure BDA0001303571290000941
绘制结果。
结果
总结IC50表(μM)
Figure BDA0001303571290000951
(Fd)＝与虫草素相比的倍数差异＝虫草素IC50/ProTide IC50
总结平均细胞内3’-dATP水平(μg/ml)
Figure BDA0001303571290000952
(Fd)＝与虫草素比的倍数差异＝Protide细胞内TP/虫草素细胞内TP
化合物A和B是最好的表现者，其中IC50优于虫草素3至150倍。化合物 A和B产生的细胞内3’-dATP浓度优于虫草素3至56倍。
总结IC50表(全部以μM计)
Figure BDA0001303571290000961
(FD)＝与对照相比的倍数差异
总结平均细胞内3’-dATP水平(μg/ml)
Figure BDA0001303571290000962
Figure BDA0001303571290000971
(FD)＝与对照相比的倍数差异
NBTI、AK和EHNA不影响由测试的本发明的三种化合物产生的细胞内 3’-dATP，表明在本研究中使用的血液癌细胞系中，这些抑制剂不干扰本发明的 化合物产生活性剂3’-dATP所凭借的代谢。由于这些抑制剂模拟已知的抗癌机 制，这些结果表明本发明的化合物不易受虫草素的抗癌机制的影响。

Claims (16)

1.3’-脱氧腺苷-5’-O-[苯基(苄氧基-L-丙氨酸基)]磷酸酯
Figure FDA0002524424650000011
或其药学上可接受的盐。
2.3’-脱氧腺苷-5’-O-[苯基(苄氧基-L-丙氨酸基)]磷酸酯
Figure FDA0002524424650000012
3.权利要求1或2所述的化合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，所述化合物在治疗癌症时用于靶向癌症干细胞。
5.如权利要求3所述的用途，其中所述癌症选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、头颈癌、神经母细胞瘤、肉瘤、甲状腺癌、皮肤癌、口腔鳞状细胞癌、间质细胞瘤、胆道癌、胰腺癌、结肠癌和妇科癌症。
6.如权利要求3所述的用途，其中所述癌症是尿膀胱癌，结肠直肠癌，卵巢癌或子宫内膜癌。
7.如权利要求5所述的用途，其中所述癌症是白血病或淋巴瘤。
8.如权利要求3所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌和小细胞肺癌。
9.如权利要求3所述的用途，其中所述癌症是尤文氏肉瘤。
10.如权利要求3所述的用途，其中所述癌症是黑素瘤。
11.如权利要求5所述的用途，其中所述胆道癌是胆管癌或道癌。
12.如权利要求7所述的用途，其中所述白血病选自急性淋巴母细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述白血病是急性淋巴母细胞白血病。
14.如权利要求3所述的用途，其中所述癌症是复发性或难治性癌症。
15.如权利要求3所述的用途，其中所述癌症是转移性癌症。
16.一种药物组合物，其包含如权利要求1或2所述的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
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