CN115181148A - 一种基于虫草素经衍生化具有抗肿瘤效应的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于虫草素经衍生化具有抗肿瘤效应的化合物，其结构如式I所示。本发明所提供的虫草素衍生物及其药物组合物具有良好的抗肿瘤增殖效果。相对于母体药物，虫草素衍生物对细胞膜有更好的亲和性，使药物在体内代谢的半衰期更长，留在体内的时间更长。相对于其他的核苷类抗肿瘤药物，本发明所提供的虫草素衍生物及其药物组合物对肿瘤的种类及作用范围更广泛，包括对胃癌、胰腺癌、肝癌、小细胞肺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌等均具有优秀的抑制作用，且副作用更低，疗效更好。
Figure DDA0003741658100000011

Description

一种基于虫草素经衍生化具有抗肿瘤效应的化合物
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于虫草素经衍生化的化合物及其制备方法与在制备防治细胞功能性损伤发生变异的相关疾病产品中的应用。
背景技术
随着外部环境刺激及细胞损伤累积，机体内细胞适应性发生变化，一种是细胞适应性丧失，最终演变为衰老，另外一种是细胞适应性异常增强，转变为癌症。其中癌症是危害人类生命健康的一种常见疾病，全世界癌症发病率及死亡率一直呈上升趋势。目前，对于恶性肿瘤的治疗方法主要包括手术、放疗及化疗等，其中化疗主要以合成药物为主。化疗药对于肿瘤的抑制效果值得肯定，也是对恶性肿瘤较为有效而又普遍使用的治疗方法之一，但其毒副作用广泛而严重，且存在耐药问题。此外，化疗药对肿瘤细胞与正常细胞的选择性较差，在杀灭或抑制肿瘤细胞的同时也能损伤正常细胞的生长，且会对心、肝、肾及神经系统功能产生直接的影响，对人体产生一定的毒性。因此，寻找低毒高效的抗肿瘤药物在肿瘤治疗中显得十分必要。
核苷作为最重要的人体内源性化合物之一，在机体代谢过程中发挥着重要的作用。通过对核苷类化合物进行改性及衍生化是制备抗肿瘤药物的主要途径之一，目前市面上的核苷类抗肿瘤药物包括呋咯地辛、氟达拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、磷酸氟达拉、曲沙他滨等。虫草素(3’-脱氧腺苷)是冬虫夏草的主要活性成分，属于核苷类似物，在机体内代谢过程中对细胞适应性变化(抗衰老，抗癌变)，调节免疫，消除炎症等具有优秀的效果。
虫草素抗癌作用的机制主要为诱导细胞凋亡，调控细胞周期，干预基质金属蛋白酶(MMP)表达，从而抑制肿瘤细胞侵袭和转移。其中诱导肿瘤细胞凋亡相关的信号通路有NF-κB信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等。调控细胞周期主要表现为在癌细胞中，虫草素使细胞周期中的G1期缩短，G2期和M期延长，使细胞周期阻滞于G2/M期进而抑制细胞增殖。干预基质金属蛋白酶表达发生过程主要通过抑制NF-κB信号通路，最终抑制MMP-9的表达。但核苷类似物脂溶性较差，难以吸收，易被脱氨酶代谢失活，半衰期短，靶向性较低，并且某些肿瘤细胞或病毒易产生耐药性等，这些都大大降低了核苷类药物的使用效果。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有核苷类药物的不足，结合虫草素的天然药理活性，提供一系列以虫草素作为母核，经化学改性修饰的核苷类似物(虫草素衍生物)。
本发明还要解决的技术问题是提供一种含有上述核苷类似物的组合物。
本发明还要解决的技术问题是提供上述核苷类似物和其组合物在防治哺乳动物或人体中细胞功能性损伤发生变异的相关疾病产品中的应用。
本发明最后还要解决的技术问题是提供上述核苷类似物的制备方法。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种如式I所示的虫草素衍生物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物、前药，或其代谢物；
Figure BDA0003741658080000021
其中，R1选自氢，磷酸基，取代的磷酸酯基，膦酸基，取代的膦酸酯基，烷基醇基，氨基酸烷基酯基，氨基酸烷基醇酯基，烷基酸烷基酯基，或环烷基多元醇基；所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代；R2选自氢，或叠氮基；R3选自氢，氟，氯，或叠氮基；R4选自羟基，氰基，β-酰胺-γ-环磺酰氧基，氨基酸羧酸酯基，氨基酸烷基酯膦酸苯酯基，或氨基酸烷基酯磷酸苯酯基；R5选自氢，溴乙烯基，巯基，甲基，氟，或氯；R6选自氨基，取代的甲酰胺基；所述取代为烷基、芳基、环烷基、呋喃基、吡啶基中的任意一种或多种官能团取代；R7选自氢，或异丙基氨基；且不存在R1、R2、R3、R5、R7选自氢、R4选自羟基、R6选自氨基的情况。
在一些实施例中，R1选自氢，如R1 1-R1 7所示的磷酸基，磷酸二乙酯基，磷酸二正丙酯基，磷酸二异丙酯基，磷酸二异丁酯基，磷酸二正丁酯基，或磷酸二异丁酰氧基甲氧基，如R1 8-R1 11所示的膦酸基，膦酸三氟乙酯基，膦酸二异丁酰氧基甲氧基，或膦酸新戊酰氧基甲氧基，如R1 12-R1 13所示的环膦酰基三氟乙醇酯乙二醇酯基，或环膦酰基乙二醇酯基，如R1 14-R1 16所示的(R)-磷酰基异亮氨酸甲酯苯酯基，(S)-磷酰基异亮氨酸甲酯苯酯基，或磷酰基丙氨酸异丙酯苯酯基，如R1 17-R1 22所示的羟基乙基，1，3-二羟基-2-丙基，丙氨酸乙酯基，异亮氨酸乙酯基，异亮氨酸-1，3-丙二醇酯基，或甘氨酸乙酯基，或如R1 23-R1 25所示的二碳酸二甲酯-丙二酯基，2-异丙氧基六氢环戊烷[d][1，3，2]二氧磷蛋白-7-醇基，或1-羟甲基-2，3-二羟基-4-环戊基；在一些实施例中，R1选自氢，或如R1 1、R1 5、R1 8、R1 10、R1 15、R1 16、R1 17、R1 21中任意一项所示的结构。
Figure BDA0003741658080000031
在一些实施例中，R4选自R4 1-R4 7所示的羟基，氰基，β-酰胺-γ-环磺酰氧基，2-氨基-丙酰氧基，2-氨基-3-甲基-丁酰氧基，磷酰氧基丙氨酸甲酯苯酯基，或膦酰胺基异亮氨酸甲酯苯酯基；在一些实施例中，R4选自氰基，氰基，或如R4 3、R4 5、或R4 6中任意一项所示的结构。
Figure BDA0003741658080000041
在一些实施例中，R5选自氢，溴乙烯基，巯基，氟，或氯。
在一些实施例中，R6选自氨基，或如R6 1-R6 16所示的乙酰胺基，丁酰胺基，辛酰胺基，十二烷基酰胺基，十八烷基酰胺基，异丙酰胺基，异丁酰胺基，新戊酰胺基，2-乙基正丁酰胺基，3，3-二甲基-丁酰胺基，环己基甲酰胺基，环戊基甲酰胺基，苯甲酰胺基，呋喃甲酰胺基，吡啶甲酰胺基，或十六烷基酰胺基；在一些实施例中，R6选自氨基，或如R6 5、R6 12、R6 13、或R6 15中任意一项所示的结构。
Figure BDA0003741658080000042
在一些实施例中，式I所示的虫草素衍生物选白化合物1～化合物40中的任意一种。
Figure BDA0003741658080000043
Figure BDA0003741658080000051
Figure BDA0003741658080000061
Figure BDA0003741658080000071
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种药物组合物，其包含上述至少一种所述的虫草素衍生物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物、前药，或其代谢物；以及至少一种免疫检查点抑制剂。
在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂选自PD-1和/或CTLA4单抗。
在一些实施例中，所述虫草素衍生物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物、前药，或其代谢物，与免疫检查点抑制剂的质量比为1∶0.2～10，在一些实施例中为1∶0.2～8，在一些实施例中为1∶0.2～5，在一些实施例中为1∶0.2～3，在一些实施例中为1∶0.2～2，在一些实施例中为1∶0.5～1.5，在一些实施例中为1∶0.8～1.2，在一些实施例中为1∶1。
在一些实施例中，所述药物组合物的剂型选自片剂、丸剂、胶囊、滴丸、糖浆、崩解剂、注射剂、缓释剂、或试剂盒。
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述虫草素衍生物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物、前药，或其代谢物，或上述药物组合在制备防治哺乳动物或人体中细胞功能性损伤发生变异的相关疾病产品中的应用。
在一些实施例中，所述细胞功能性损伤发生变异的相关疾病为肿瘤，在一些实施例中，所述肿瘤包括但不限于胃癌，胰腺癌，肝癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，结肠直肠癌，食道癌，前列腺癌，黑色素瘤，神经胶质瘤，和卵巢癌；在一些实施例中，所述肿瘤为胃癌、胰腺癌、肝癌、小细胞肺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤和卵巢癌中的任意一种。
在一些实施例中，所述产品包括但不限于药物。
为了解决上述第四个技术问题，本发明公开了上述虫草素衍生物的制备方法，所述的制备方法为对应改性方式的合成手段，考虑到反应过程中，虫草素或改性虫草素分子中的其他活性基团会参与反应进行，应当对其适当进行保护，本发明中涉及的保护方法为羟基和氨基的保护及脱保护，其中保护及脱保护手段均为本领域的常规手段，另外一些反应体系需要添加保护气体进行保护，这些均为本领域实验过程中的常规手段。
具体如下：
A.对R1进行改性
当式I中，R1选自磷酸基，取代的磷酸酯基，膦酸基，取代的膦酸酯基，烷基醇基，氨基酸烷基酯基，氨基酸烷基醇酯基，烷基酸烷基酯基，或环烷基多元醇基；所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-1为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure BDA0003741658080000081
式I-R-1中，R2～R7同式I中的R2～R7，或分别独立地选自保护基。
当式I中的R1选自磷酸基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于亚磷酸三甲酯和/或亚磷酸三乙酯中，化合物I-R-1与改性剂三氯氧磷反应，在一些实施例中，所述化合物I-R-1、改性剂和有机溶剂的用量比为1mmol∶3～6mmol∶15～30mL，在一些实施例中，所述反应的温度为-10～5℃，在一些实施例中，所述反应的时间为0.5～2h。
当式I中的R1选自取代的磷酸酯基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于无水N，N-二甲基甲酰胺和/或四氢呋喃中，以叔丁基氯化镁为催化剂，化合物I-R-1与改性剂取代的磷酸硝基苯酯反应，所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代，在一些实施例中，所述化合物I-R-1、改性剂、催化剂和有机溶剂的用量比为1mmol∶1～3mmol∶1～2mmol∶9～15mL，在一些实施例中，所述反应的温度为20～40℃，在一些实施例中，所述反应的时间为2～5h。
当式I中的R1选自膦酸基，或取代的膦酸酯基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于无水N，N-二甲基甲酰胺中，以NaH为催化剂，化合物I-R-1与改性剂取代或非取代的对甲苯磺酰氧甲基磷酸酯反应，所述取代为所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代，在一些实施例中，所述化合物I-R-1、改性剂、催化剂和有机溶剂的用量比为0.1mol∶0.1～0.15mol∶0.2～0.03mol∶100～200mL，在一些实施例中为0.1mol∶0.1～0.15mol∶0.2～0.03mol∶150mL，在一些实施例中，所述反应的温度为-20～0℃，在一些实施例中，所述反应的时间为0.5-6h。
当式I中的R1选自烷基醇基，氨基酸烷基酯基，氨基酸烷基醇酯基，烷基酸烷基酯基，或环烷基多元醇基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于丁酮中，以碳酸钾为催化剂，化合物I-R-1与改性剂反应，所述改性剂为卤素对应取代的烷基醇，氨基酸烷基酯，氨基酸烷基醇酯，烷基酸烷基酯或环烷基多元醇，在一些实施例中，所述卤素为溴或氯，在一些实施例中，所述化合物I-R-1、改性剂、催化剂与有机溶剂的用量比为1mmol∶0.5～1.5mmol∶1～3mmol∶5～8mL，在一些实施例中为1mmol∶1mmol∶1～3mmol∶5～8mL，在一些实施例中，所述反应的温度为40～100℃，在一些实施例中，所述反应的时间为8～20h。
B.对R2进行改性
当式I中，R2选自叠氮基时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-2为原料进行环化反应，制得中间体I-R-2a，5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-1，4-二氧杂吡咯[2.4]庚烷-6-醇或其衍生物；于有机溶剂中，所得中间体I-R-2a经开环反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure BDA0003741658080000101
式I-R-2中，R1、R3～R7同式I中的R1、R3～R7，或分别独立地选自保护基。
在一些实施例中，所述中间体I-R-2a的制备方法为：于二氯甲烷中，将化合物I-R-2在五氧化二磷及间氯过氧苯甲酸催化下进行环化反应，在一些实施例中，所述化合物I-R-2、五氧化二磷、间氯过氧苯甲酸与二氯甲烷的用量比为1mmol∶1.2～2mmol∶2～3mmol∶10～20mL，在一些实施例中，所述环化反应的温度为20～60℃，在一些实施例中，所述环化反应的时间为3～10h。
在一些实施例中，所述式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于无水二甲基甲酰胺中，所得中间体I-R-2a与叠氮化钠经开环反应，在一些实施例中，所述化合物I-R-2a、叠氮化钠与二甲基甲酰胺的用量比为1mmol∶4～5mmol∶2～5mL，在一些实施例中，所述开环反应的温度为100～120℃，在一些实施例中，所述开环反应的时间为12～16h。
Figure BDA0003741658080000102
C.对R3进行改性
当式I中，R3选自氟，氯，或叠氮基时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-3为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure BDA0003741658080000103
Figure BDA0003741658080000111
式I-R-3中，R1、R2、R5～R7同式I中的R1、R2、R5～R7，或分别独立地选自保护基。
当式I中R3选自氟，或氯时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于吡啶及二氯甲烷中，将化合物I-R-3与三氟甲磺酸酐反应，制得中间体I-R-3a，5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-基三氟甲烷磺酸酯或其衍生物；于乙酸乙酯中，将中间体I-R-3a与氢氟酸、三氟化硫或盐酸进行取代反应，制得式I所示的虫草素衍生物；其中，所述中间体I-R-3a的制备方法中，在一些实施例中，所述化合物I-R-3、三氟甲磺酸酐、吡啶及二氯甲烷的用量比为1mmol∶1～1.5mmol∶0.15～0.2mL∶10～20mL，在一些实施例中，所述反应的温度为-5～5℃，在一些实施例中为0℃，在一些实施例中，所述反应的时间为1～3h；其中，所述式I所示虫草素衍生物的制备方法中，在一些实施例中，将中间体I-R-3a与37％氢氟酸或二乙胺基三氟化硫或盐酸的三乙胺溶液进行取代反应，在一些实施例中，所述中间体I-R-3a，37％氢氟酸或二乙胺基三氟化硫或盐酸的三乙胺溶液，与乙酸乙酯的用量比为1mmol∶2～3mmol∶4～10mL，在一些实施例中，所述反应的温度为60～80℃，在一些实施例中，所述反应的时间为8～10h。
Figure BDA0003741658080000112
当式I中R3选自叠氮基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于N，N-二甲基甲酰胺中，将化合物I-R-3在三苯基磷及偶氮二甲酸二异丙酯催化下进行环化反应，制得中间体I-R-3b，4-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3，6-二氧杂环[3.1.0]己烷-2-基)甲醇或其衍生物；于二甲基甲酰胺中，所得中间体I-R-3b与叠氮化钠经开环反应，制得式I所示的虫草素衍生物；其中，所述中间体I-R-3b的制备方法中，在一些实施例中，所述化合物I-R-3、三苯基磷、偶氮二甲酸二异丙酯与N，N-二甲基甲酰胺的用量比为10.0mmol∶16～28mmol∶1.6～2.8mmol∶15～50mL，在一些实施例中为10.0mmol∶22mmol∶2.2mmol∶15～50mL，在一些实施例中，所述环化反应的温度为10～60℃，在一些实施例中，所述环化反应的时间为1～5h；在一些实施例中，所述式I所述虫草素衍生物的制备方法中，所述中间体I-R-3b、叠氮化钠与二甲基甲酰胺的用量比为1mmol∶4～5mmol∶2～5mL，在一些实施例中，所述开环反应的温度为100～120℃，在一些实施例中，所述开环反应的时间为12～16h。
D.对R4进行改性
当式I中，R4选自氰基，β-酰胺-γ-环磺酰氧基，氨基酸羧酸酯基，氨基酸烷基酯膦酸苯酯基，或氨基酸烷基酯磷酸苯酯基时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-4为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure BDA0003741658080000121
式I-R-4中，R1～R3、R5～R7同式I中的R1～R3、R5～R7，或分别独立地选自保护基。
当式I中R4选自氰基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于二氯甲烷中，先将化合物I-R-4、三氟甲烷磺酸、三氟甲磺酸三甲硅酯在-50～-30℃环境下搅拌，再与三甲基腈硅烷、三乙胺进反应；在一些实施例中，所述化合物I-R-4、三氟甲烷磺酸、三氟甲磺酸三甲硅酯、二氯甲烷的用量比为10mmol∶0.8～1.8mL∶2.2～3.2mL∶90～110mL，在一些实施例中为10mmol∶1.3mL∶2.7mL∶100mL，在一些实施例中，所述搅拌的时间为20～40min，在一些实施例中为30min；在一些实施例中，所述化合物I-R-4与三甲基腈硅烷、三乙胺的用量比为10mmol∶3.4～4.3g∶3～4mL，在一些实施例中，所述反应的温度为20～30℃，在一些实施例中为室温，在一些实施例中，所述反应的时间为2～4h。
当式I中R4选自β-酰胺-γ-环磺酰氧基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：化合物I-R-4先经氧化反应制备中间体I-R-4a，2-(6-氨基-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)二氢呋喃-3(2H)-酮或其衍生物，再经氰基化反应制备中间体I-R-4b，2-(6-氨基-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)-3-异氰四氢呋喃-3-醇或其衍生物，再经甲基磺酸酯化制备中间体I-R-4c，2-(6-氨基-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)-3-异氰四氢呋喃-3-基甲烷磺酸盐或其衍生物，最后经环合反应制备式I所示的虫草素衍生物；在一些实施例中，所述中间体I-R-4a的制备方法为：于丙酮中，化合物I-R-4与琼斯试剂2.2M三氧化二铬反应，在一些实施例中，所述化合物I-R-4、琼斯试剂与丙酮的用量比为20mmol∶5～8mL∶50～100mL，在一些实施例中，所述反应的温度为0～40℃，在一些实施例中，所述反应的时间为1～4h；在一些实施例中，所述中间体I-R-4b的制备方法为于二氯甲烷中，中间体I-R-4a与三甲基硅氰化物、三氟化硼乙醚进行反应，在一些实施例中，所述中间体I-R-4a、三甲基硅氰化物、三氟化硼乙醚与二氯甲烷的用量比为20mmol∶20～40mmol∶10～30mmol∶50～100mL，在一些实施例中为20mmol∶20～40mmol∶20mmol∶50～100mL，在一些实施例中，所述反应的温度为0～40℃，在一些实施例中，所述反应的时间为1～4h；在一些实施例中，所述中间体I-R-4c的制备方法为：于无水二氯甲烷中，中间体I-R-4b与三乙胺、甲磺酰氯反应，在一些实施例中，所述中间体I-R-4b、三乙胺、甲磺酰氯与无水二氯甲烷的用量为2.2mmol∶10～15mmol∶4～8mmol∶5～10mL，在一些实施例中，所述反应的温度为-30～0℃，在一些实施例中，所述反应的时间为2～4h；在一些实施例中，所述式I所述虫草素衍生物的制备方法为：于无水乙腈中，中间体I-R-4c与碳酸铯进行反应，在一些实施例中，所述中间体I-R-4c、碳酸铯与无水乙腈的用量比为1mmol∶0.5～2.5mmol∶3～10mL，在一些实施例中为1mmol∶1.5mmol∶3～10mL，在一些实施例中，所述反应的温度为0～40℃，在一些实施例中，所述反应的时间为2～4h。
Figure BDA0003741658080000131
当式I中R4选自氨基酸羧酸酯基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于无水吡啶中，将化合物I-R-4与氨基酸酰氯反应，制得式I所示的虫草素衍生物；在一些实施例中，所述化合物I-R-4、氨基酸酰氯与吡啶的用量比为10mmol∶5～15mmol∶50～100mL，在一些实施例中为10mmol∶10mmol∶50～100mL，在一些实施例中，所述反应的温度为20～60℃，在一些实施例中为40℃，在一些实施例中，所述反应的时间为6～20h。
当式I中R4选自氨基酸烷基酯膦酸苯酯基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于无水N，N-二甲基甲酰胺中，以NaH为催化剂，化合物I-R-4与改性剂氨基酸烷基酯取代的对甲苯磺酰氧甲基磷酸苯酯反应，在一些实施例中，所述化合物I-R-4、改性剂、NaH和无水N，N-二甲基甲酰胺的用量比为0.1mol∶0.1～0.15mol∶0.2～0.03mol∶100～200mL，在一些实施例中为0.1mol∶0.1～0.15mol∶0.2～0.03mol∶150mL，在一些实施例中，所述反应的温度为-20～0℃，在一些实施例中，所述反应的时间为0.5-6h。
当式I中R4选自氨基酸烷基酯磷酸苯酯基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于无水N，N-二甲基甲酰胺和/或四氢呋喃中，以叔丁基氯化镁为催化剂，化合物I-R-4与以改性剂取代的磷酸硝基苯酯反应，所述取代为芳氧基，烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代，在一些实施例中，所述化合物I-R-4、改性剂、催化剂和有机溶剂的用量比为1mmol∶1～3mmol∶1～2mmol∶9～15mL，在一些实施例中，所述反应的温度为20～40℃，在一些实施例中，所述反应的时间为2～5h。
E.对R5进行改性
当式I中，R5选自溴乙烯基，巯基，甲基，氟，或氯；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-5为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure BDA0003741658080000141
式I-R-5中，R1～R4、R6～R7同式I中的R1～R4、R6～R7，或分别独立地选自保护基。
当式I中R5选自溴乙烯基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：将化合物I-R-5经碘化反应制得中间体I-R-5a，2-(6-氨基-2-碘-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇或其衍生物，中间体I-R-5a经丙烯酸甲酯取代反应制得中间体I-R-5b，甲基(E)-3-(6-氨基-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)丙烯酸酯或其衍生物，中间体I-R-5b经水解制得中间体I-R-5c，(E)-3-(6-氨基-9-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)丙烯酸或其衍生物，中间体I-R-5c经N-溴代琥珀酰亚胺经溴化反应，制得式I所示的虫草素衍生物；在一些实施例中，所述中间体I-R-5a的制备方法为，于稀硝酸中，将化合物I-R-5与碘单质，经碘化反应制备中间体I-R-5a，在一些实施例中，所述化合物I-R-5与碘单质的用量比为1mmol∶0.5～0.8mmol，在一些实施例中，所述反应温度为100～120℃，在一些实施例中为110℃，在一些实施例中，所述反应的时间为4～6h；在一些实施例中，所述中间体I-R-5b的制备方法为，于1，4-二氧六环中，中间体I-R-5a与丙烯酸甲酯及三乙胺，在醋酸钯及三苯基膦催化下反应，在一些实施例中，所述中间体I-R-5a、丙烯酸甲酯、三乙胺、醋酸钯、三苯基膦与1，4-二氧六环的用量比为1mmol∶3～4mmol∶0.1～0.5mL∶0.01～0.09mmol∶0.05～0.15mmol∶10～20mL，在一些实施例中为1mmol∶3～4mmol∶0.1～0.5mL∶0.05mmol∶0.01mmol∶10～20mL，在一些实施例中，所述反应的温度为50～90℃，在一些实施例中，所述反应的时间为0.5～2h；在一些实施例中，所述中间体I-R-5c的制备方法为，中间体I-R-5b与氢氧化钠溶液进行水解反应，在一些实施例中，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5～3.5mol/L，在一些实施例中为2mol/L，在一些实施例中，所述中间体I-R-5b与氢氧化钠溶液的用量比为1g∶10～14mL，在一些实施例中为1g∶12mL，在一些实施例中，所述反应温度为20～30℃，在一些实施例中为室温，在一些实施例中，所述反应的时间为3～5h；在一些实施例中，式I所述虫草素衍生物的制备方法为，在水和丙酮的混合溶剂中，中间体I-R-5c与N-溴代琥珀酰亚胺在碳酸钾催化下反应，在一些实施例中，所述中间体I-R-5c、N-溴代琥珀酰亚胺、碳酸钾、混合溶剂的用量比为1mmol∶1～3mmol∶1～3mmol∶15～30mL，在一些实施例中，所述水与丙酮的体积比为1∶4～8，在一些实施例中为1∶6。
Figure BDA0003741658080000151
在一些实施例中，直接对未改性虫草素进行溴乙烯基改性，其反应路径如下：
Figure BDA0003741658080000161
当式I中R5选自巯基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于乙酸中，将化合物I-R-5与双氧水反应，制得中间体I-R-5d，1N-氧化-3’-脱氧腺苷或其衍生物，将中间体I-R-5d于盐酸水溶液中加热回流，制得中间体I-R-5e，5-氨基-N’-羟基-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1H-咪唑-4-羧酰胺或其衍生物，将中间体I-R-5e溶于水中，经雷尼镍催化，在氢气环境下反应，制得中间体I-R-5f，5-氨基-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1H-咪唑-4-羧酰胺或其衍生物，将中间体I-R-5f与甲醇、吡啶和二硫化碳反应，制得式I所示的虫草素衍生物；在一些实施例中，所述中间体I-R-5d的制备方法为，在双氧水中，化合物I-R-5与乙酸进行反应，在一些实施例中，所述双氧水的浓度为20％～40％，在一些实施例中为30％，在一些实施例中，所述化合物I-R-5、双氧水与乙酸的用量比为1mmol∶2～3mol∶1～6mL，在一些实施例中，所述反应的温度为30～50℃，在一些实施例中，所述反应的时间为2～4天；在一些实施例中，所述的中间体I-R-5e的制备方法为，在盐酸水溶液中，中间体I-R-5d加热回流，在一些实施例中，所述盐酸水溶液的浓度为1～5mol/L，在一些实施例中为3mol/L，在一些实施例中，所述中间体I-R-5d、盐酸水溶液的用量比为1mmol∶3～5mL，在一些实施例中，所述加热回流的时间为10～30min；其中，所述的中间体I-R-5f的制备方法中，在一些实施例中，所述中间体I-R-5e、雷尼镍和水的用量比为1mmol∶0.08～0.2g∶10～20mL，在一些实施例中，所述反应的温度为50～70℃，在一些实施例中，所述反应的时间为2～5天；其中，式I所述虫草素衍生物的制备方法中，在一些实施例中，所述中间体I-R-5f、与甲醇、吡啶和二硫化碳的用量比为1mmol∶5～10mL，在一些实施例中，所述甲醇、吡啶和二硫化碳的体积用量比4∶3～7∶0.5～3.5，在一些实施例中为4∶5∶2，在一些实施例中，所述反应的温度为30～50℃，在一些实施例中为40℃，在一些实施例中，所述反应的时间为3～5天。
Figure BDA0003741658080000171
在一些实施例中，直接对未改性虫草素进行巯基改性，具体反应方式如下：
Figure BDA0003741658080000172
当式I中R5选自甲基时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：在二氯甲烷溶剂中，化合物I-R-5、碘甲烷、碳酸钾反应，在一些实施例中，所述化合物I-R-5、碘甲烷、碳酸钾与二氯甲烷的用量比为1mmol∶1～2mmol∶1.5～3mmol∶5～10mL，在一些实施例中，所述反应的温度为20～50℃，在一些实施例中，所述反应的时间为3～10h。
当式I中R5选自氟或氯时，在一些实施例中，式I所示虫草素衍生物的制备方法为：将化合物I-R-5经硝基衍生化反应制得硝基化中间体I-R-5g，2-(6-氨基-2-硝基-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇，再进行取代反应，制得式I所示的虫草素衍生物；在一些实施例中，所述的中间体I-R-5g制备方法为，于二氯甲烷中，将化合物I-R-5与四丁基硝酸铵在三氟乙酸酐催化下进行反应，在一些实施例中，所述化合物I-R-5、四丁基硝酸铵、三氟乙酸与二氯甲烷的用量比为1mmol∶1.4～2mmol∶1～2mmol∶15～35mL，在一些实施例中，所述反应的温度为-10～10℃，在一些实施例中，所述反应的时间为0.5～20h；在一些实施例中，式I所述虫草素衍生物制备方法为，于乙腈中，将硝基化中间体I-R-5g与四丁基氟化铵或四丁基氯化铵进行反应，在一些实施例中，所述硝基化中间体I-R-5g、四丁基氟化铵或四丁基氯化铵，与乙腈的用量比1mmol∶1.3～1.5mmol∶30～50mL，所述反应的温度为-5～5℃，在一些实施例中为0℃，在一些实施例中，所述反应的时间为20～30min。
Figure BDA0003741658080000181
F.对R6进行改性
当式I中，R6选自取代的甲酰胺基；所述取代为烷基、芳基、环烷基、呋喃基、吡啶基中的任意一种或多种官能团取代时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-6为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure BDA0003741658080000182
式I-R-6中，R1～R5、R7同式I中的R1～R5、R7，或分别独立地选自保护基。
在一些实施例中，，式I所示的虫草素衍生物的制备方法为：于无水吡啶下，将化合物I-R-6与取代酰氯反应，所述取代为烷基、芳基、环烷基、呋喃基、吡啶基中的任意一种或多种官能团取代，在一些实施例中，化合物I-R-6、取代酰氯与无水吡啶的用量比为1mmol∶1～2mmol∶5～10mL，在一些实施例中，所述反应的温度为0～60℃，在一些实施例中，所述反应的时间为2～20h。
G.对R7进行改性
当式I中，R7选自异丙基氨基时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-7为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure BDA0003741658080000183
式I-R-7中，Ri～R6同式I中的R1～R6，或分别独立地选自保护基。
在一些实施例中，式I所示的虫草素衍生物的制备方法为：在二氧六环中，将化合物I-R-7经2-丙胺取代反应，在一些实施例中，化合物I-R-7与2-丙胺及二氧六环的用量比为10mmol∶10～30mmol∶50～100mL，在一些实施例中，所述反应的温度为60～120℃，在一些实施例中，所述反应的时间为10～30h。
本发明中，所述保护基包括但不限于-OTBS、-OAc、-NHCbz、-OTBPS。
本发明中，所述取代的磷酸硝基苯酯(所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代)按照如下方法或现有技术中其他方法制备得到。
在无水二氯甲烷中，氯磷酸苯酯、对硝基苯酚及对应取代的醇或胺，在0～25℃环境下经三乙胺的催化下制备，所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代，在一些实施例中，所述氯磷酸苯酯、对硝基苯酚、对应的取代物、三乙胺及无水二氯甲烷的摩尔体积比为1mmol∶1mmol∶1～2mmol∶2～5mmol∶5～10mL。
本发明中，所述取代的对甲苯磺酰氧甲基磷酸酯(所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代)按照如下方法或现有技术中其他方法制备得到。
在对应取代的氯磷酸酯、对甲苯磺酰氯、甲醛在甲苯中，在0～105℃环境下经三乙胺催化制备，所述取代的氯磷酸酯为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代的氯磷酸酯，在一些实施例中，所述对应取代的氯磷酸酯、对甲苯磺酰氯、甲醛、三乙胺与甲苯的摩尔体积比为1mol∶1mol∶0.8～1.2mol∶180～210mL∶500～800mL。
本发明中术语“预防”意为将本申请所述化合物或制剂进行给药以预防疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：预防疾病或疾病状态在哺乳动物中出现，特别是当这些哺乳动物易诱发相关的癌症症状。
本发明中术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明所提供的虫草素衍生物及其药物组合物具有良好的抗肿瘤增殖效果。相对于母体药物，虫草素衍生物对细胞膜有更好的亲和性，使药物在体内代谢的半衰期更长，留在体内的时间更长。相对于其他的核苷类抗肿瘤药物，本发明所提供的虫草素衍生物及其药物组合物对肿瘤的种类及作用范围更广泛，包括对胃癌、胰腺癌、肝癌、小细胞肺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌等均具有优秀的抑制作用，副作用更低，疗效更好。
说明书附图
图1为空白组，虫草素对照组和化合物组对肝癌细胞Hep-1-6移植小鼠模型中的抗肿瘤作用效果。
图2为对照组及各化合物组对小细胞肺癌H446细胞荷瘤斑马鱼模型的抑制效果。
图3为化合物16以及免疫检查点抑制剂对结肠癌MC38细胞移植小鼠模型的抑制效果。
图4为对照组及化合物组对黑色素瘤B16-F10移植小鼠模型的抗肿瘤效果。
图5为化合物24以及免疫检查点抑制剂对小鼠ID8卵巢癌同种移植瘤模型的抑制效果。
图6为对照组及化合物组对胃癌BGC-823细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果。
图7为对照组及化合物组对胰腺癌Pan02-luc细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，其中所述的药物评价实验包括细胞模型及动物模型如无特殊说明可从商业途径获得。
本发明中所述虫草素来源于生物发酵途径(CN 111117896B)制备获得，其中虫草素或其衍生物的制备方法根据说明书中的方法进行制备，后处理方式主要采用包括但不局限于过滤，淬灭，萃取，旋蒸，重结晶，柱层析等常规有机实验后处理的操作方式。实施例中所提到的化合物的制备方法并非是全部化合物，为了便于说明在此处仅列举其中几种代表性的化合物的制备过程。
实施例中虫草素或其衍生物的抗癌相关的细胞，动物模型实验并非是全部有效果的实验结果，仅仅是为了说明效果列举的相关实验，并且所述的药物评价实验包括细胞模型及动物模型的实验遵循伦理学规则。
其中所述的药物评价对老鼠模型饲养遵循：在层流柜中饲养和处理小鼠每笼饲养5只裸鼠，3天添加1次饮水与饲料，一周更换1次垫料；每笼内饲养小鼠数量不超过5只，分笼的小鼠尽量让其群居，尽量不要单笼放小鼠；动物管理必须符合国家关于动物饲养管理的相关标准，同时要重视动物的行为需求，避免产生不必要的应激；满足动物正常生理及行动需求，如排粪、排尿、维持体温恒定、正常活动、调整姿势及繁殖；通风良好，保持动物干爽；能自由的获取饮水及食物，且易于补充与更换操作、清洗；提供坚固、安全的环境，避免动物逃脱或肢体陷于缝隙之中等意外；避免尖锐的边缘或突出物对动物的伤害；观察动物时不至于干扰到动物。
其中所述的斑马鱼模型为野生型AB品系斑马鱼，来源于南京工业大学生物与制药工程学院，以自然成对交配繁殖方式进行，每实验组为30尾，年龄为2dpf。饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510uS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3)，饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
其中所述的MTT法测定化合物对肿瘤细胞增殖抑制活性的方法如下：取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×104个/mL，制成细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，90μL/孔，置恒温CO2培养箱中培养24小时。加入制备的化合物进行测试，10μL/孔，培养72小时。将MTT试剂加入96孔板中，10μL/孔，培养箱中反应4小时吸去上清液，加入二甲亚砜，100μL/孔，待结晶溶解后，用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算细胞抑制率。以化合物浓度和相应的抑制率做S曲线。得到相应化合物的IC50。
实施例1：制备化合物：2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(2-羟基乙氧基)甲基)四氢呋喃-3-醇；
(1)虫草素中羟基保护及脱保护的方法
其中所述的虫草素R1，R4位羟基的保护1a及脱保护方法：
Figure BDA0003741658080000221
保护：在10mL DMF中，加入虫草素0.251g(1mmol)，TBSC1 0.3618g(2.4mmol)和咪唑0.3404g(5mmol)，在室温下搅拌10h，反应结束后用水与乙酸乙酯萃取，浓缩有机相得1a0.4607g，产率为96.03％，MSI-MS：480.8[M+H]+。
脱保护：配置10ml(四丁基氟化铵∶THF＝2∶1)溶剂，加入1a 0.48g(1mmol)，室温下搅拌5h，反应结束后用水与乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，重结晶得到虫草素0.246g，产率97.96％。
其中所述的虫草素R1位的羟基的保护1b及脱保护方法：
Figure BDA0003741658080000222
保护：在10mL DMF中，加入虫草素0.251g(1mmol)，TBSCl 0.3618g(2.4mmol)和咪唑0.3404g(5mmol)，在室温下搅拌10h，反应结束后用水与乙酸乙酯萃取，浓缩有机相得1a0.4607g，产率为96.03％。另外后配置10mL(乙酸∶水∶THF＝13∶7∶3)溶剂，加入1a 0.48g(1mmol)，室温下搅拌15h，反应结束后用水与乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，柱层析制得1b0.293g，产率79.99％，MSI-MS：366.5[M+H]+。
脱保护：在10mL的0.1M盐酸甲醇溶液中，加入1b 0.366g(1mmol)，室温搅拌10h，反应结束后用0.1M的碳酸钠水溶液，调节pH至中性，并用乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，经旋蒸或重结晶得虫草素0.215g，产率85.56％。
其中所述的虫草素R4位的羟基的保护1c及脱保护方法：
Figure BDA0003741658080000231
保护：在氮气保护下的10mL二氯甲烷和10mL二异丙基乙胺溶剂中加入虫草素1.256g(5mmol)，随后滴加TBDPSCl 0.451g(1.6mmol)，室温下搅拌2h，浓缩后柱层析纯化，得到1c 2.20g，产率89.9％，MSI-MS：366.5[M+H]+。
脱保护：配置10mL(四丁基氟化铵∶THF＝2∶1)溶剂，加入1c 0.490g(1mmol)，室温下搅拌5h，反应结束后用水与乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，重结晶得到虫草素0.244g，产率为97.01％。
(2)化合物2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(2-羟基乙氧基)甲基)四氢呋喃-3-醇的具体制备方法
以化合物1b为原料，取1b 3.65g(10mmol)与化合物2-氯-乙醇0.81g(10mmol)于圆底烧瓶中，向其中加入60mL丁酮，加热溶解反应物，另外向其中加入碳酸钾2.07g(15mmol)。反应在80℃环境下反应8h，通过TLC监测反应进行。反应结束后过滤，浓缩反应液，加入60mL水及60mL乙酸乙酯进行萃取2次，合并有机相，减压旋蒸得粘稠状液体，对其进行脱保护并经柱层析得到化合物1，称重为2.24g，产率为76％。其中制备的化合物1的检测结果如下，1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.56(s，1H)，8.35(s，1H)，7.09(s，2H)，6.14(d，1H)，5.47-5.3(d，2H)，5.01(m，1H)，4.12(m，1H)，3.74(m，1H)，3.61-3.56(m，4H)，3.51-3.46(m，2H)，2.04-1-92(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ156.1，152.4，149.8，140.1，119.6，95.2，82.1，75.2，74.7，70.4，61.1，34.5.MSI-MS：296.3[M+H]+。
实施例2：制备化合物：(5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)磷酸二氢甲酯，其中制备过程如下：
按照实施例1中的保护方法，取化合物1b 3.65g(10mmol)在冰浴条件下加入亚磷酸三乙酯150mL，三氯氧磷4.62g(30mmol)。反应在0℃环境下反应2h，反应结束后，在冰浴环境中加入1000mL水进行淬灭反应，加入二氯甲烷进行多次萃取，合并有机相，经旋蒸除去溶剂，得到粘稠状液体，对制备得到的粘稠状液体进行制备液相分离纯化(C18制备柱，Waters制备液相，流动相为30％的乙腈水溶液，流速为2mL/min)，取样品峰段流出液进行浓缩后称重得磷酸化后的化合物，共3.02g，产率70％。
按照实施例1中的1b的脱保护方案，制备得到化合物2，其中制备的化合物2的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.54(s，1H)，8.36(s，1H)，7.11(s，2H)，6.19(d，1H)，5.15(d，1H)，4.28-4.23(m，2H)，4.2(s，2H)，4.02(m，1H)，3.71(m，1H)，2.06-1.90(m，2H).13CNMR(100MHz，DMSO-d6)δ156.2，152.7，149.5，140.2，119.3，97.2，76.1，74.6，69.5，34.5.MSI-MS：332.2[M+H]+。
实施例3：制备化合物：(((((5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸，其中制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000241
向500mL反应瓶中加入化合物1b 36.5g(100mmol)，加入150mL DMF作为溶剂，加热溶解。速冷至室温后，在搅拌下分批加入80％NaH 6.4g(267mmol)，并保持室温搅拌15min。在低温反应器下使反应液冷却至-10℃，开始滴加对甲苯磺酰氧甲基磷酸二乙酯45.1g(140mmol)，滴加结束后在此温下搅拌反应1h，再逐渐升温至室温搅拌4h，反应结束后滴加冰醋酸调pH至中性，反应液过滤，用二氯甲烷洗涤，滤液用水(60mL)进行萃取3次，合并二氯甲烷相，经减压蒸除溶剂，剩余物中加入甲苯后进行重结晶。对结晶母液过滤，将滤饼于50℃减压干燥后得白色粉末状固体3a，称重得26.87g，产率为52％，MSI-MS：540.6[M+23]+。
取化合物3a 5.17g(10mmol)，加入100mL反应瓶中，加入正丁腈20mL，室温下滴加三甲基氯硅烷6.52g(60mmol)，滴加结束后反应液升温回流反应24h。反应结束后减压蒸馏溶剂浓缩至干，剩余物中加入水20mL，另外加入加2M氢氧化钠调节pH≈8，之后用乙酸乙酯(50mL)萃取三次，水相用1M盐酸中和至pH＝3～4。然后加热升温至70～80℃进行结晶，得化合物3b，称重得3.40g，产率为74％，MSI-MS：460.6[M+H]+。
按照实施例1b的脱保护方案对化合物3b进行处理，得到化合物3，其中制备的化合物的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.58(s，1H)，8.32(s，1H)，7.13(s，2H)，6.12(d，1H)，5.39(d，1H)，4.81(s，2H)，4.02(m，1H)，3.98(m，1H)，3.74(d，2H)，3.63-3.56(m，2H)，2.08-1.94(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ156.7，152.6，149.1，140.4，119.5，98.2，81.1，76.3，74.3，73.1，34.7.MSI-MS：346.3[M+H]+。
实施例4：制备化合物：(5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲基磷酸二异丁酯，其中制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000251
向500mL反应瓶中加入化合物1b 3.65g(10mmol)，溶解在100mL的无水DMF中，另外加入磷酸二异丁酯(4-硝基苯基)4.96g(15mmol)。另外将叔丁基氯化镁1.17g(10mmol)溶解于20mL THF中，并将溶液缓慢滴加至上述反应液中。反应液逐渐升温至室温反应2h，并用TLC板进行监测反应。反应结束后静置反应所得混合物，用100mL的乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤并萃取三次，每次50mL，然后用50mL的饱和氯化钠水溶液萃取。在无水硫酸钠上干燥有机层减压浓缩。所得油用硅胶柱层析法(洗脱液∶二氯/甲醇＝10∶1)纯化，得到化合物4a，称重得4.24g，产率为76％。
通过实施例1中1b的脱保护方法对4a进行处理，得到化合物4，其中制备的化合物4的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.52(s，1H)，8.31(s，1H)，7.11(s，2H)，6.15(d，1H)，5.33(d，1H)，4.24-4.05(m，2H)，4.02(m，1H)，3.93(m，4H)，3.77(m，1H)，2.08-1.83(m，2H)，1.33(m，2H)，0.90(d，12H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ154.3，151.7，148.4，141.9，119.2，98.2，74.1，74.0，73.5，68.1，34.2，28.6，19.5.MSI-MS：466.7[M+Na]+。
实施例5：制备化合物：(((((((((5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)磷酰基)双(氧基)双(亚甲基)双(2-甲基丙酸)
Figure BDA0003741658080000261
按照实施例3中制备3a的方法并结合实施例1中1b的脱保护方法制备化合物5，其中将对甲苯磺酰氧甲基磷酸二乙酯等当量替换为(((甲苯氧基)甲基)磷酰基)双(氧基))双(亚甲基)双(2-甲基丙酸)，制备得化合物5的总产率为74％。其中制备的化合物5的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.57(s，1H)，8.33(s，1H)，7.11(s，2H)，6.84(d，4H)，6.18(d，1H)，5.46(d，1H)，4.12(m，1H)，3.94(m，1H)，3.81(d，2H)，3.60-3.44(m，2H)，2.55(m，2H)，2.08-1.82(m，2H)，1.14(d，12H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ174.2，155.7，153.6，149.5，141.2，119.5，99.4，93.2，77.4，74.5，74.1，71.5，34.2，33.6，19.3.MSI-MS：546.5[M+H]+。
实施例6：制备化合物：甲基((5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-D-缬氨酸，其中制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000262
甲基((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷酰基)-D-缬氨酸的制备方式如下：
将缬氨酸1.17g(10mmol)溶解于50mL的二氯甲烷中。将该溶液冷却至约0℃并添加二氯化磷酸苯酯2.11g(10mmol)，然后缓慢滴加三乙胺2.02g(20mmol)，反应升温至室温并搅拌80min。加入反应物对硝基苯酚1.39g(10mmol)，随后滴加三乙胺2.02g(20mmol)，室温下并搅拌180min。反应结束后，用乙醚洗涤，并过滤去除产生的固体。将滤液在旋转蒸发仪上进行浓缩，所得样品经硅胶柱层析纯化(洗脱液：正己烷/乙酸乙酯(1：1))，制备得化合检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.25(d，2H)，7.40(m，2H)，7.35(d，2H)，7.20(m，3H)，3.68(s，1H)，3.65(s，3H)，3.35(m，1H)，1.90(m，2H)，0.86(m，3H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ171.6，156.5，150.5，141.1，130.2，126.5，121.7，121.4，120.4，52.2，51.9，26.4，9.6.MSI-MS：395.3[M+H]+。
按照实施例4中制备4a的方法并结合实施例1中1b的脱保护方法制备化合物6，其中将对磷酸二异丁酯(4-硝基苯基)等当量替换为甲基((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷酰基)-D-缬氨酸，制备化合物6的产率为68％。最终制备的化合物6的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.58(s，1H)，8.33(s，1H)，7.43(m，2H)，7.20(m，3H)7.08(s，2H)，6.15(d，1H)，5.47(d，1H)，4.26-4.12(m，2H)，4.02(m，1H)，3.75(m，1H)，3.67(d，1H)，3.62(s，3H)，3.28(d，1H)，2.41(m，1H)，2.08-1.96(m，2H)，0.98(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ173.6，154.9，151.5，150.6，149.8，141.3，132.7，123.3，120.8，119.2，98.2，76.1，74.5，72.0，57.6，52.3，35.2，32.4，20.1.MSI-MS：521.4[M+H]+。
实施例7：制备化合物：异丙基(((((((((5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)丙氨酸酯，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000271
异丙基(苯氧基((甲苯氧基)甲基)磷酰基)丙氨酸酯的制备过程如下：
1000mL反应瓶中加入丙氨酸异丙酯216.15g(1.65mol)，苯酚155g(1.65mol)，氯仿240mL，在冰盐浴条件下搅拌于5℃左右开始滴加三氯化磷138.8g(1mol)，保持反应温度控制在5～10℃之间。滴加三氯化磷结束后，继续搅拌30min撤去冰盐浴，逐渐升温至室温继续搅拌2h后于50℃下减压抽走氯化氢气体。反应冷却至室温，缓慢加入80mL饱和碳酸氢钠水溶液，然后加入碳酸氢钠固体粉末调节反应溶液pH值在7～8。过滤滤去析出的盐，滤液置分液漏斗中分出氯仿层，水层用氯仿100mL萃取1次，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和水各洗1遍，取氯仿层减压蒸馏，剩余物即为目标产物氯磷酸苯酯丙氨酸异丙酯，收率87％。
1000mL反应瓶中投入氯磷酸苯酯丙氨酸异丙酯306g(1mol)、多聚甲醛40.6g(1.35mol)和三乙胺14mL、甲苯260mL。反应在氮气保护下缓慢升温至105℃，此时反应剧烈，回流反应3h。反应结束后将冰盐浴冷却至0℃，投入对甲苯磺酰氯169.5g(0.9mol)，加入甲苯220mL，另外滴加三乙胺177mL，并保持反应温度在0℃下搅拌2h及逐步升温至室温下搅拌12h。反应结束后过滤，用甲苯(50mL×3)洗涤滤饼，合并母液并依次用5％碳酸钠水溶液(200mL×2)、水(200mL×2)洗涤后，分层得到有机相。减压蒸馏有机相得到淡黄色油状物为异丙基(苯氧基((甲苯氧基)甲基)磷酰基)丙氨酸酯用于后续反应，称重291g，收率为64％，制备得化合检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.74(d，2H)，7.45-7.39(m，4H)，7.22(m，3H)，4.95(m，1H)，3.91(d，2H)，3.65(s，1H)，3.57(m，1H)，2.42(s，3H)，1.28(d，3H)，1.18(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ171.6，150.4，144.4，140.3，130.5，130.1，128.5，121.4，120.2，69.6，63.8，50.5，21.7，21.5，19.2.MSI-MS：456.5[M+H]+。
按照实施例3中制备3a的方法并结合实施例1中1b的脱保护方法制备化合物7，其中将对甲苯磺酰氧甲基磷酸二乙酯等当量替换为异丙基(苯氧基((甲苯氧基)甲基)磷酰基)丙氨酸酯，制备化合物7的产率为52％。其中制备的化合物7的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.59(s，1H)，8.37(s，1H)，7.45(m，2H)，7.24(m，3H)，7.12(s，2H)，6.16(d，1H)，5.33(d，1H)，4.98(m，1H)，4.08-3.99(m，2H)，3.84(m，1H)，3.77(m，2H)，3.58-3.42(m，3H)，2.08-1.96(m，2H)，1.29(d，3H)，1.16(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ172.1，156.3，152.5，150.4，149.8，140.1，130.2，122.1，120.5，119.1，98.2，79.1，74.8，74.7，73.1，69.6，52.3，34.5，22.5，18.8.MSI-MS：535.6[M+H]+。
实施例8：制备化合物：2-(-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)-3-羟丙基缬氨酸盐，其制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000281
以化合物1b为原料，取1b 3.65g(10mmol)与化合物2-氯-3-羟丙基缬氨酸2.10g(10mmol)于圆底烧瓶中，向其中加入60mL丁酮，加热溶解反应物，另外向其中加入碳酸钾2.07g(15mmol)。反应在80℃环境下反应10h，通过TLC监测反应进行。反应结束后过滤，浓缩反应液，加入60mL水及60mL乙酸乙酯进行萃取2次，合并有机相，减压旋蒸得粘稠状液体，对其进行柱层析得到化合物8a，称重为3.24g，产率为52％，MSI-MS：539.6[M+H]+。
将化合物8a为底物，将其按照实施例1中1b的脱保护方法制备得到化合物8，产率为91％。其中制备的化合物8的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.88(s，2H)，8.54(s，1H)，8.37(s，1H)，7.14(s，2H)，6.18(d，1H)，5.57(d，1H)，4.33-4.11(m，3H)4.03(m，1H)，3.96-3.89(m，3H)，3.61-3.36(m，4H)，2.37(m，1H)，2.08-1.82(m，2H)，0.98(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ173.5，154.6，153.5，150.4，141.3，119.6，99.5，85.6，75.7，74.0，73.1，63.3，62.5，58.7，34.7，30.8，18.8.MSI-MS：425.4[M+H]+。
实施例9：制备化合物：(4-氨基-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二氧化物-1，7-二氧杂-2-噻螺环[4.4]非-3-烯-8-基)磷酸二氢甲酯，制备方法如下：
Figure BDA0003741658080000291
以化合物2为原料进行反应，将化合物2 9.00g(27.2mmol)与CbzCl 4.88g(27.2mmol)添加到38.5mL甲苯与38.5mL水中，另外加入K2CO3 4.70g(34mmol)，混合物在25℃以下的温度剧烈搅拌。之后在室温下搅拌3h后，依次添加三乙胺0.275g(2.72mmol)和5.78g氯化钠，将混合物再搅拌30min。分离并浓缩有机层，得到所需的油状产物为9a，称重为11.38g，产率为90％，MSI-MS：488.7[M+Na]+。
室温下化合物9a 9.3g(20mmol)在60mL丙酮中搅拌溶解，向溶液中添加琼斯试剂5.50mL(2.2M三氧化二铬，12.1mmol)溶液，在室温下滴加2h。在室温下将所得反应混合物再搅拌1h并过滤，减压浓缩后得到油状液体。将该液体溶解在30mL乙醚中，用30mL饱和氯化铵溶液洗涤一次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩后并进行柱层析得到化合物9b，称重3.98g，产率为43％，MSI-MS：464.4[M+H]+。
将三甲基硅氰化物4mL(30mmol)和三氟化硼乙醚2.53mL(20mmol)添加到9b9.26g(20mmol)的50mL二氯甲烷溶液中。在室温下将混合物搅拌2小时，并将溶剂蒸发至干燥。将由此获得的残渣溶解在100mL乙酸乙酯中，用50mL盐水洗涤两次并干燥(Na2SO4)。在过滤和蒸发溶剂后，通过柱层析(正己烷/L酸乙酯，1：2)纯化得到白色化合物9c，称重为7.45g，产率为76％，MSI-MS：491.9[M+H]+。
将1.9mL Et3N(14mmol)添加到5mL无水二氯甲烷中，添加化合物9c 1.08g(2.2mmol)至溶液中溶解。混合物冷却到-30℃之后，缓慢添加甲磺酰氯460uL(6mmol)。混合物在-20℃搅拌持续1h，0℃持续1h。之后减压浓缩去除挥发物，将残渣溶解在10mL乙酸乙酯中，然后用10mL水和10mL盐水连续洗涤两次。干燥有机相(Na2SO4)并2减压浓缩，通过柱层析纯化(正己烷∶乙酸乙酯，10∶1)得到白色无定形固体9d，称重为0.975g，产率为78％，其制备结果检测如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.45(s，1H)，8.36(s，1H)，8.20(s，1H)，7.34-7.32(s，5H)，6.12(s，1H)，4.65(s，2H)，4.30-4.03(m，4H)，3.74(m，1H)，3.15(s，3H)，2.41-2.16(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ153.6，152.5，151.7，149.8，140.2，136.4，128.9，127.7，127.2，123.5，120.4，97.4，71.6，69.2，68.2，66.9，38.2，37.8.MSI-MS：569.4[M+H]+。
将碳酸铯490mg(1.5mmol)添加到9d 0.568g(1mmol)的3mL无水乙腈悬浮液中，并在室温下将混合物搅拌2h。去除溶剂，将由此获得的残留物溶解在20mL乙酸乙酯中，并依次用10mL水和10mL盐水洗涤两次。干燥有机相(Na2SO4)并过滤，然后减压浓缩。通过柱层析纯化(正己烷/乙酸乙酯，3∶1)得到白色固体9e，称重为4.49g，产率为79％，MSI-MS：569.4[M+H]+。
将5.68g化合物9e(10mmol)溶解于200mL甲醇中。然后添加1.5g甲酸铵(30mmol)和0.75g 10％Pd-C，并在室温下搅拌反应混合物10min，然后加热至回流45min。通过硅藻土过滤混合物，将滤液蒸发至干燥，得到4.12g化合物9，产率为95％。其中制备的化合物9的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.59(s，1H)，8.38(s，1H)，7.14(s，2H)，6.88(s，2H)，6.16(d，1H)，5.25(s，1H)，4.28(m，1H)，4.18(s，2H)，4.02(m，1H)，3.74(m，1H)，2.09-1.96(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ168.5，155.1，151.4，147.8，141.1，119.4，98.2，88.9，86.1，73.0，68.1，37.9.MSI-MS：435.3[M+H]+。
实施例10：制备化合物：N-(3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)十八酰胺，其中制备方法如下：
Figure BDA0003741658080000311
取虫草素2.51g(10mmol)在冰浴条件下加入无水吡啶40.00mL，醋酸酐8.5mL。通过HPLC液相监测反应情况，反应约5h后反应结束。除去溶剂，得到黏稠状液体10a，称重得2.68g，产率80％，MSI-MS：358.6[M+Na]+。
取化合物10a 3.35g(10mmol)与十八酰氯2.89g(10mmol)在冰浴环境下加入无水吡啶60mL，反应逐渐升温至40℃反应10h，通过TLC进行监测反应进行，反应结束后加入水及乙酸乙酯萃取，有机相进行反萃，收集有机相进行旋蒸，得到油状液体10b，进行柱层析纯化后得10b纯化物为5.40g，产率为90％，MSI-MS：624.4[M+Na]+。
取化合物10b 6.01g(10mmol)，用氨甲醇溶液450mL溶解并进行反应，室温搅拌，通过薄层色谱法检测反应情况，4h后停止反应。除去溶剂，得到目标产物10，称重得到化合物4.67g，产率为90％。
或者参照实施例1中的1a的制备方法进行保护及脱保护，其中保护后的1a经此处第二步骤进行酰化反应，之后进行脱保护制备化合物10。其中制备的化合物10的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.55(s，1H)，8.64(s，1H)，8.38(s，1H)，6.18(d，1H)，5.35(d，1H)，5.04(m，1H)，4.02(m，1H)，3.76(m，1H)，3.58(m，1H)，3.52(m，1H)，2.35(m，2H)，2.07-1.94(m，2H)，1.58(m，2H)，1.30-1.26(m，28H)，0.89(m，3H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ173.5，153.3，152.5，148.8，141.0，122.6，99.2，84.1，74.3，63.8，38.5，34.8，31.5，29.5，28.8，25.6，22.4，14.7.(部分烷基峰重叠)MSI-MS：540.7[M+Na]+。
实施例11：制备化合物：N-(3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)环戊烷甲酰胺，其中制备方法如下：
按照实施例10的方法，从虫草素经保护，酰化，脱保护的步骤制备化合物11，其中十八酰氯替换为环戊基甲酰氯，总产率为72％。其中制备的化合物11的检测结果如下：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.52(s，1H)，8.66(s，1H)，8.38(s，1H)，6.16(d，1H)，5.28(d，1H)，5.01(m，1H)，4.01(m，1H)，3.77(m，1H)，3.57-3.46(m，2H)，2.46(m，1H)，2.08-1.88(m，2H)，1.80-1.55(m，8H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ172.5，153.3，151.5，149.5，139.8，123.6，98.4，82.1，74.9，63.8，49.5，34.5，32.4，24.5.MSI-MS：348.2[M+H]+。
实施例12：制备化合物：N-(3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)异烟酰胺，其中制备方法如下：
按照实施例10的方法，从虫草素经保护，酰化，脱保护的步骤制备化合物12，其中十八酰氯替换为吡啶-3-甲酰氯，总产率为76％。其中制备的化合物12的检测结果如下：1HNMR(400MHHz，DMSO-d6)δ11.05(s，1H)，8.86(d，2H)，8.41(s，1H)，8.22(s，1H)，8.01(d，2H)，6.15(d，1H)，5.22(d，1H)，4.98(m，1H)，4.02(m，1H)，3.75(m，1H)，3.58-3.46(m，2H)，2.08-1.88(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ165.5，152.3，151.9，149.8，149.7，140.9，140.4，123.4，120.5，99.4，82.8，74.7，63.8，35.4.MSI-MS：357.3[M+H]+。
实施例13：制备化合物：(5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)磷酸二氢甲酯，制备方法如下所示：
Figure BDA0003741658080000321
将2，2，2-三氟乙酸酐193μL(1.39mmol)在0℃环境下添加到硝酸四丁胺428mg(1.40mmol)的干燥二氯甲烷(15mL)中的溶液中，制备硝化混合物。在0℃下反应45分钟后，将溶液缓慢添加到化合物1a480mg(1mmol)的干燥二氯甲烷(15mL)中。在室温下避光反应14h后，将反应混合物倒入H2O(50mL)、饱和NaHCO3(35mL)和CH2Cl2∶Et2O(1∶2，30mL)的冷混合物中进行萃取。用CH2Cl2∶Et2O(1∶2，30mL)萃取两次。用盐水洗涤有机提取物，无水Na2SO4干燥，并在真空下烘干(保持温度低于40℃)。粗产物通过柱层析纯化，用CH2Cl2洗脱，然后用CH2Cl2：丙酮(99∶1至95∶5)得到化合物13a，称重273mg，产率为52％，MSI-MS：525.4[M+H]+。
在0℃下，将TBAF(1.3当量，600μL，0.6mmol)在1分钟内逐滴添加到13a 236mg(0.45mmol)的干燥乙腈(15mL)中的悬浮液中。搅拌混合物20分钟，并在真空下蒸发所得溶液，而不加热。粗产物通过柱层析纯化(CH2Cl2∶丙酮100∶0至90∶10)得到化合物13b，称重为78mg，产率为35％，MSI-MS：498.8[M+H]+。
将制备得到的化合物13b按照实施例2磷酸化方法及实施例1中的脱保护方法制备得到化合物13，产率为65％。其中制备的化合物13的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.38(s，1H)，6.98(s，2H)，6.16(d，1H)，5.36(d，1H)，4.28(m，1H)，4.21(s，2H)，4.02(m，1H)，3.95(m，1H)，3.74(m，1H)，2.02-1.82(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ158.3，157.2，148.8，141.5，118.6，97.2，74.9，74.6，67.1，35.5.MSI-MS：372.2[M+Na]+。
实施例14：制备化合物：(5-(6-氨基-2-巯基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)磷酸二氢甲酯，制备方法如下所示：
Figure BDA0003741658080000331
在乙酸60mL中加入化合物1a 4.80g(10mmol)，在40℃下搅拌至溶解。待溶液冷却至室温后，加入30％双氧水5mL(25mmol)。溶液在40℃环境下搅拌3天，过滤，固体在水中重结晶，得到化合物14a，称重为3.37g，产率68％，MSI-MS：497.4[M+H]+。
在3M的盐酸水溶液40mL中加入14a 4.96g(10mmol)，加热回流至固体全部溶解。继续回流10min后，冷却至室温，除去溶剂后加入乙醇20mL。析出晶体经过滤、干燥后得到化合物14b，称重为2.92g，产率62％，MSI-MS：487.5[M+H]+。
将化合物14b 4.86g(10mmol)溶解在水100mL中，分批加入活化后的RaneyNi1.0g，通入氢气。反应混合物在55℃下搅拌反应4天。停止通氢气，过滤除去无机盐，再减压蒸馏除去溶剂，粗产品分别用乙醇和乙醚洗涤，干燥后得到灰色固体14c，称重为3.30g，产率70％，MSI-MS：495.8[M+Na]+。
将甲醇、吡啶和二硫化碳按照体积比4∶5∶2混合得到溶液50mL，加入14c 4.72g(10mmol)，在回流冷凝管上套加气球，防止二硫化碳挥发。反应混合物在40℃下搅拌反应4天。过滤，粗产品在质量分数5％的硫酸水溶液中加热回流20min，趁热过滤，除去杂质。冷却至室温，再经过滤、干燥后得到灰色晶体14d，称重为2.82g，产率55％。将制备得到的化合物14d按照实施例2磷酸化方法及实施例1中的脱保护方法制备得到化合物14，产率为71％。其中制备的化合物14的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.22(s，1H)，8.36(s，1H)，6.99(s，2H)，6.16(d，1H)，5.33(d，1H)，4.30(m，1H)，4.21(s，2H)，4.02(m，1H)，3.94(m，1H)，3.71(m，1H)，2.06-1.88(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ154.3，152.1，149.2，139.8，118.6，99.2，74.8，74.3，67.1，35.1.MSI-MS：364.3[M+H]+。
实施例15：制备化合物：(5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-氟-4-羟基四氢呋喃-2-基)磷酸二氢甲酯
Figure BDA0003741658080000341
在10mL DMF中，加入腺苷2.67g(10mmol)，TBSCl 3.618g(24mmol)和吡啶3.95g(50mmol)，在室温下搅拌10h，反应结束后用水与乙酸乙酯萃取，浓缩有机相经柱层析得15a2.33g，产率为47％，MSI-MS：497.7[M+H]+。
氮气保护下将15a 4.96g(10mmol)和吡啶(1.5mL)的二氯甲烷(100mL)溶液搅拌冷却至-5℃，滴加三氟甲磺酸酐2.5mL(15mmol)，于0℃继续反应2h，TLC显示反应完全后倒至冰水(100mL)中，搅拌分层，水相用二氯烷(100mL)萃取。合并二氯甲烷相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压浓缩，剩余物中加入石油醚(40mL)重结晶，过滤后干燥，得15b，称重为5.65g，产率为90％，其制备结果检测如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.59(s，1H)，8.35(s，1H)，7.11(s，2H)，6.15(d，1H)，5.05(m，1H)，4.55(m，1H)，4.12(m，1H)，4.02-3.79(m，2H)，0.99(s，18H)，0.20(s，12H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ156.2，152.5，149.7，140.2，119.5，118.4，96.5，86.4，83.5，73.8，63.2，30.8，30.6，25.8，0.MSI-MS：628.8[M+H]+。
氮气保护下将15b 6.28g(10mmol)溶于乙酸乙酯(40mL)中，加入37％氢氟酸的三乙胺溶液10mL(22mmol)，搅拌升温至70℃反应约8h。TLC显示反应完全后冷却至室温，用饱和碳酸氢钠溶液洗至中性，再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压浓缩，剩余物用无水甲醇(30mL)重结晶，得固体15c，称重为2.04g，产率为41％。将制备得到的化合物15c按照实施例2磷酸化方法及实施例1中的脱保护方法制备得到化合物15，产率为77％。其中制备的化合物15的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.58(s，1H)，8.37(s，1H)，7.07(s，2H)，6.15(d，1H)，5.33(d，1H)，4.70(m，1H)，4.44(m，1H)，4.28(m，1H)，4.18(s，2H)，4.02(m，1H)3.55(m，1H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ155.3，151.4，148.9，141.1，119.6，97.2，90.1，79.0，73.4，61.5.MSI-MS：350.2[M+H]+。
实施例16：制备化合物：异丙基((((((((5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氰基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)丙氨酸酯，其制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000351
按照实施例7的方法制备得到化合物7，以化合物7为原料制备化合物16，取5.34g(10mmol)化合物7，溶于100mL的二氯甲烷溶液中，再添加三氟甲基磺酸1.3mL(1.50g，10mmol)。反应搅拌10分钟后，将2.7mL三氟甲磺酸三甲硅酯(10mmol)缓慢滴加至溶液中，并在-40℃的环境下将所得混合物搅拌30min。然后缓慢添加三甲基腈硅烷3.96g(40mmol)，并且将混合物搅拌2h。之后滴加三乙胺3.5mL并使反应混合物加热至室温。然后添加固体碳酸氢钠5.5g和水20.7mL。将所得混合物搅拌10min。然后用二氯甲烷与水萃取，得到有机提取物，并用盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。粗残渣经柱层析纯化得到灰色固体的产物化合物16，称重为1.71g，产率为32％。其中制备的化合物16的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.57(s，1H)，8.36(s，1H)，7.41(m，2H)，7.22(m，3H)，7.09(s，2H)，6.17(d，1H)，4.99(d，1H)，3.97(m，1H)，3.74-3.33(m，6H)，2.88(m，1H)，2.04-1.92(m，2H)，1.28-1.14(d，9H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ173.4，155.3，152.5，150.2，149.8，141.3，130.2，121.6，120.5，118.2，92.2，77.4，75.0，73.1，69.1，51.2，26.5，25.8，22.4，20.1.MSI-MS：544.5[M+H]+。
实施例17：制备化合物：(((((((((5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)磷酰基)双(氧基)双(亚甲基)双(2，2-二甲基丙酸)，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000361
按实施例13的方法制备得到化合物13b，以13b为原料按照实施例1中1b的保护方法制备得到的化合物17a，以化合物17a为原料参照实施例3制备3a的方法制备化合物17，其中将对甲苯酰磺氧甲基膦酸二乙酯等当量替换为(((甲苯氧基)甲基)磷酰基)双(氧基))双(亚甲基)双(2，2-二甲基丙酸)，将1b等当量替换为17a，总产率为61％。其中制备的化合物17的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.33(s，1H)，6.99(s，2H)，6.88(s，4H)，6.16(d，1H)，5.37(d，1H)，4.02(m，1H)，3.95(m，1H)，3.85(s，2H)，3.61-3.42(m，2H)，2.05-1.88(m，2H)，1.25(s，18H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ175.2，158.3，157.5，148.6，140.3，119.2，99.2，92.2，79.1，74.8，74.3，71.2，38.5，35.826.8.MSI-MS：592.5[M+H]+。
实施例18：制备化合物：(((((5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-氟-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)磷酰基)双(氧基))双(亚甲基)双(2，2-二甲基丙酸)，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000362
参照实施例15的方法，及实施例1中1b的保护方法制备得到化合物18a，以化合物18a为原料参照实施例3制备3a的方法制备化合物18，其中将对甲苯酰磺氧甲基膦酸二乙酯等当量替换为(((甲苯氧基)甲基)磷酰基)双(氧基))双(亚甲基)双(2，2-二甲基丙酸)，将1b等当量替换为18a，总产率为34％。其中制备的化合物18的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.59(s，1H)，8.32(s，1H)，7.09(s，2H)，6.84(s，4H)，6.15(d，1H)，5.35(d，1H)，4.71-4.64(m，2H)，3.85(m，2H)，3.60-3.33(m，3H)，1.27(s，18H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ175.9，157.3，151.5，149.8，141.3，118.9，98.2，92.8，91.5，79.4，73.3，71.4，70.5，38.6，27.8.MSI-MS：592.4[M+H]+。
实施例19：制备化合物：(((((5-(6-氨基-2-巯基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)磷酰基)双(氧基)双(亚甲基)双(2，2-二甲基丙酸)，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000371
参照实施例14的方法制备到化合物14d，以14d为原料按照实施例1中1b的保护方法制备得到化合物19a，以化合物19a为原料参照实施例3制备3a的方法制备化合物19，其中将对甲苯酰磺氧甲基膦酸二乙酯等当量替换为(((甲苯氧基)甲基)磷酰基)双(氧基))双(亚甲基)双(2，2-二甲基丙酸)，将1b等当量替换为19a，总产率为18％。其中制备的化合物19的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.12(s，1H)，8.34(s，1H)，7.01(s，2H)，6.84(s，4H)，6.12(d，1H)，5.35(d，1H)，4.01(m，1H)，3.93(m，1H)，3.85(s，2H)，3.63-3.37(m，2H)，2.06-1.85(m，2H)，1.27(s，18H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ175.8，155.4，152.5，149.7，140.5，118.9，98.7，92.8，78.1，74.9，74.7，71.2，38.7，34.5，27.5.MSI-MS：606.6[M+H]+。
实施例20：制备化合物：异丙基((((5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)丙氨酸酯，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000372
按实施例13及实施例17的方法制备得到化合物17a，参照实施例7的方法制备化合物20，其中将对甲苯酰磺氧甲基膦酸二乙酯等当量替换为异丙基(苯氧基((甲苯氧基)甲基)磷酰基)丙氨酸酯，1b替换为17a，总产率为67％。其中制备的化合物20的检测结果如下：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.37(s，1H)，7.40(m，2H)，7.20(m，3H)，7.02(s，2H)，6.15(d，1H)，5.38(s，1H)，4.94(m，1H)，4.00(m，1H)，3.95(m，1H)，3.71-3.53(m，5H)，3.34(m，1H)，2.06-1.82(m，2H)，1.28-1.14(d，9H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ172.1，157.3，156.8，150.0，149.8，140.2，121.3，120.6，119.2，97.4，76.6，75.0，74.8，72.1，69.4，50.1，34.5，21.7，19.5.MSI-MS：553.5[M+H]+。
实施例21：制备化合物：N-(2-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)十八酰胺，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000381
参照实施例13的方法制备得到化合物13b，以13b为原料，参照实施例10中10a制备10b的方法制备化合物21a，以21a为原料，参照实施例1中1a的脱保护方法制备化合物21，总产率为74％。其中制备的化合物21的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.53(s，1H)，8.34(s，1H)，6.15(d，1H)，5.6(d，1H)，5.02(m，1H)，4.01(m，1H)，3.78(m，1H)，3.57(m，1H)，3.51(m，1H)，2.35(m，2H)，2.09-1.91(m，2H)，1.52(m，2H)，1.33-1.25(m，28H)，0.88(m，3H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ172.5，153.5，152.7，148.6，141.2，122.4，99.1，84.5，74.6，63.4，37.3，34.2，32.3，29.4，28.7，25.7，22.3，14.5.(部分烷基峰重叠)MSI-MS：536.6[M+H]+。
实施例22：制备化合物：N-(4-氯-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)十八酰胺，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000391
以腺苷为原料参照实施例15中的方法制备得到15b，以15b为原料，氮气保护下将15b 6.28g(10mmol)溶于乙酸乙酯(40mL)中，加入37％盐酸的三乙胺溶液10mL(22mmol)，搅拌升温至70℃反应约8h。TLC显示反应完全后冷却至室温，用饱和碳酸氢钠溶液洗至中性，再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压浓缩，剩余物用无水甲醇(30mL)重结晶，得固体22a，称重为1.95g，产率为38％，MSI-MS：515.2[M+H]+。
以22a为原料，按照实施例10中10a制备10b的方法，结合实施例1中1a的脱保护方法制备化合物22，总产率为79％。其中制备的化合物22的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.60(s，1H)，8.67(s，1H)，8.35(s，1H)，6.15(d，1H)，5.33(d，1H)，4.98(m，1H)，4.31(m，1H)，4.02(m，1H)，3.78(m，1H)，3.58(m，1H)，3.53(m，1H)，2.32(m，2H)，1.51(m，2H)，1.34-1.21(m，28H)，0.87(m，3H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ171.4，152.5，151.6，148.4，140.5，121.4，98.7，77.5，74.3，68.1，59.4，38.2，33.7，31.5，28.1，27.5，25.4，22.1，14.6.(部分烷基峰重叠)MSI-MS：553.2[M+H]+。
实施例23：制备化合物：(((((4-羟基-5-(6-(异烟酰胺)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)磷酰基)双(氧基))双(亚甲基)双(2，2-二甲基丙酸)，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000392
以化合物12为原料，按照实施例1中1b的保护方法制备化合物23a，以23a为原料，按照实施例17中17a制备17的过程制备化合物23，将反应中17a等当量替换为23a，反应总产率为81％。其中制备的化合物23的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.05，(s，1H)，8,85(d，2H)，8.34(s，1H)，8.18(s，1H)，8.00(d，2H)，6.84(s，4H)，6.14(d，1H)，5.35(d，1H)，4.01(m，1H)，3.94(m，1H)，3.86(s，2H)，3.60-3.38(m，2H)，2.06-1.84(m，2H)，1.27(s，18H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ175.8，165.1，152.4，151.5，149.8，149.6，140.7，140.2，121.2，120.1，99.5，92.8，78.1，74.7，74.5，71.4，38.7，34.5，27.2.MSI-MS：679.6[M+H]+。
实施例24：制备化合物：异丙基((((4-羟基-5-(6-(异烟酰胺)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)丙氨酸酯，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000401
按照实施例23中的方法，制备得到化合物23a，以23a为原料按照实施例7的方法制备得到化合物24，其中将化合物1b等当量替换为23a，总产率为85％。其中制备的化合物24的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.08(s，1H)，8.81(d，2H)，8.36(s，1H)，8.18(s，1H)，8.02(d，2H)，7.42(m，2H)，7.21(m，3H)，6.16(d，1H)，5.35(s，1H)，4.92(m，1H)，4.01-3.95(m，2H)，3.65-3.54(m，5H)，3.35(m，1H)，2.04-1.84(m，2H)，1.25-1.18(d，9H).13CNMR(100MHz，DMSO-d6)δ171.1，165.2，152.7，151.8，150.4，149.8，149.5，140.5，140.1，130.4，123.2，121.8，121.4，120.2，99.3，76.7，74.8，74.5，72.5，69.8，50.4，34.7，21.5，19.3.MSI-MS：640.6[M+H]+。
实施例25：制备化合物：(5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-叠氮-4-羟基四氢呋喃-2-基)磷酸二氢甲酯
Figure BDA0003741658080000402
在氩气氛下向圆底烧瓶中加入腺苷2.67g(10.0mmol)和PPh3 5.78g(22mmol)。然后添加DMF 18mL，并在室温下搅拌所得混合物，直到固体完全溶解。将该溶液冷却至10℃，并快速滴加偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)4.4mL(2.2mmol)。使反应混合物达到室温。在40℃下搅拌2小时，之后减压蒸发DMF，以获得粘性液体，混合物在150mL水和100mL乙醚之间分配。收集水层并用100mL乙醚洗涤。在减压下浓缩有机相，并对粗产物进行柱层析纯化，用DCM和丙酮溶剂混合物(3∶1至2∶3)洗脱。得到白色固体的化合物25a，称重为1.84g，产率为74％，其制备化合物检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.57(s，1H)，8.36(s，1H)，7.10(s，2H)，6.37(d，1H)，4.59(m，1H)，3.95(s，1H)，3.57-3.50(m，2H)，2.62-2.55(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ156.3，152.5，149.9，140.5，119.5，90.4，82.6，63.5，60.8，59.6.MSI-MS：250.2[M+H]+。
将2.49g的化合物25a(10mmol)与叠氮化钠2.6g(40mmol)加入烧瓶中，另外加入20mL DMF作为溶剂，反应在120℃环境下反应16h，用TLC板监测反应进程，反应结束后加水淬灭，水相用乙酸乙酯(180mL)萃取3次，合并有机相，加水洗涤，减压除去溶剂得泡沫状固体25b，称重为2.22g，产率为76％，MSI-MS：293.2[M+H]+。
以25b为原料，按照实施例1中制备1b的保护方法制备得到25c，以25c为原料，按照实施例2中的方法，将1b等当量替换为25c，制备得到化合物25，产率为76％。其中制备的化合物25的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.57(s，1H)，8.38(s，1H)，7.09(s，2H)，6.17(d，1H)，5.35(d，1H)，4.27-4.24(m，2H)，4.19(s，2H)，4.02(m，1H)，3.81(m，1H)，1.75(m，1H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ158.2，152.4，149.8，140.5，119.4，101.2，78.1，73.2，68.4，57.5.MSI-MS：373.2[M+H]+。
实施例26：制备化合物：(((((5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-叠氮-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)磷酰基)双(氧基))双(亚甲基)双(2，2-二甲基丙酸)，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000411
按照实施例25中的制备方法制备得到化合物25c，以25c为原料按照实施例17中的化合物17a制备化合物17的方法制备得到化合物26a，经实施例1中1b的脱保护方法制备得到化合物26，其中将25c等当量替换17a，总产率为54％。其中制备的化合物26的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.58(s，1H)，8.34(s，1H)，7.04(s，2H)，6.82(s，4H)，6.15(d，1H)，5.35(d，1H)，4.00(m，2H)，3.85(s，2H)，3.62-3.41(m，2H)，1.84(m，1H)，1.26(s，18H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ175.4，157.3，152.5，149.7，140.2，119.5，99.8，92.8，79.0，72.3，71.5，71.1，56.5，38.827.6.MSI-MS：615.6[M+H]+。
实施例27：制备化合物：异丙基((((5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-叠氮-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)丙氨酸酯
Figure BDA0003741658080000421
按照实施例25中的制备方法制备得到化合物25c，以25c为原料，按照实施例7中的制备方法，将1b等当量替换为25c，制备得到化合物27，总产率为43％。其中制备的化合物27的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.58(s，1H)，8.34(s，1H)，7.42(m，2H)，7.21(m，3H)，7.07(s，2H)，6.15(d，1H)，5.34(s，1H)，4.95(d，1H)，3.99(m，2H)，3.76-3.34(m，6H)，1.88(m，1H)，1.27-1.16(d，9H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ171.4，156.4，152.1，150.1，149.5，140.3，130.5，121.2，120.5，119.4，100.5，78.4，72.8，72.0，71.5，69.1，57.2，50.5，21.5，19.1.MSI-MS：576.5[M+H]+。
实施例28：制备化合物：异丙基((((3-叠氮-4-羟基-5-(6-(异烟酰胺)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)丙氨酸酯，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000422
以制备得到的化合物27为原料，参照实施例1中的1a或1b的保护方法制备得到化合物28a，以化合物28a为原料，参照实施例12的制备方法，将虫草素或1b等当量替换为化合物28a，制备得到化合物28，总产率为37％。其中制备的化合物28的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.07(s，1H)，8.83(d，2H)，8.35(s，1H)，8.20(s，1H)，8.01(d，2H)，7.41(m，2H)，7.21(m，3H)，6.15(d，1H)，5.35(s，1H)，4.94(d，1H)，4.00(m，2H)，3.72-3.32(m，6H)，1.82(m，1H)，1.24-1.17(d，9H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ171.5，164.5，152.1，151.6，150.1，149.8，149.4，140.7，140.3，130.2，122.2，121.5，121.1，120.4，100.4，78.7，72.5，72.1，71.5，69.2，57.4，50.8，21.6，19.2.MSI-MS：681.6[M+H]+。
实施例29：制备化合物：2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-基缬氨酸盐，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000431
按照实施例1中制备1c的保护方法制备得到化合物1c，以1c为原料进一步进行反应，将化合物1c 9.95g(27.2mmol)与CbzCl 4.88g(27.2mmol)添加到38.5mL甲苯与38.5mL水中，另外加入K2CO3 4.70g(34mmol)，混合物在25℃以下的温度剧烈搅拌。之后在室温下搅拌3h后，依次添加三乙胺0.275g(2.72mmol)和5.78g氯化钠，将混合物再搅拌30min。分离并浓缩有机层，得到所需的油状产物为29a，称重为13.1g，产率为90％，MSI-MS：522.6[M+Na]+。
取化合物29a 4.99g(10mmol)与缬氨酸酰氯1.36g(10mmol)在冰浴环境下加入无水吡啶60mL，反应逐渐升温至40℃反应10h，通过TLC进行监测反应进行，反应结束后加入水及乙酸乙酯萃取，有机相进行反萃，收集有机相进行旋蒸，得到油状液体10b，进行柱层析纯化后得29b纯化物为5.03g，产率为84％，MSI-MS：625.5[M+Na]+。
将5.99g化合物29b(10mmol)溶解于200mL甲醇中。然后添加1.5g甲酸铵(30mmol)和0.75g 10％Pd-C，并在室温下搅拌反应混合物10min，然后加热至回流45min。通过硅藻土过滤混合物，将滤液蒸发至干燥，得到4.41g化合物29c，产率为95％。以29c为原料，按照实施例1中1c的方法对其进行脱保护制备化合物29，产率为90％。其中制备的化合物29的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.89(s，2H)，8.58(s，1H)，8.37(s，1H)，7.05(s，2H)，6.73(d，1H)，5.01(m，1H)，4.92(s，1H)，4.27(m，1H)，3.75(m，1H)，3.56-3.47(m，2H)，2.38(m，1H)，2.13(m，1H)，1.89(m，1H)，0.98(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ172.1，156.0，152.3，149.5，140.1，119.4，102.2，82.5，74.4，63.7，59.5，33.1，30.5，19.1.MSI-MS：351.3[M+H]+。
实施例30：制备化合物：2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(膦酰氧基)甲基)四氢呋喃-3-基缬氨酸盐，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000441
以化合物29为原料，按照实施例2中的方法进行反应制备化合物30，其中将1b等当量替换为29，制备得化合物30，产率为84％。其中制备的化合物30的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.90(s，2H)，8.56(s，1H)，8.33(s，1H)，7.04(s，2H)，6.75(d，1H)，5.00(m，1H)，4.27-4.02(m，5H)，3.73(m，1H)，2.36(m，1H)，2.16(m，1H)，1.88(m，1H)，0.96(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ172.4，156.3，152.5，149.8，140.2，119.5，101.2，76.1，74.2，68.7，59.3，32.1，30.4，19.0.MSI-MS：431.3[M+H]+。
实施例31：制备化合物：2-(6-(异烟酰胺)-9H-嘌呤-9-基)-5-(膦酰基)甲基)四氢呋喃-3-基缬氨酸盐，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000442
以化合物30为原料，按照实施例12的制备方法，将其中1a等当量替换为化合物30制备得到化合物31，产率为91％。其中制备的化合物31的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.08(s，1H)，8.92(s，2H)，8.82(d，2H)，8.34(s，1H)，8.20(s，1H)，8.02(d，2H)，6.73(d，1H)，5.03(m，1H)，4.29-4.01(m，5H)，3.75(m，1H)，2.39(m，1H)，2.15(m，1H)，1.88(m，1H)，0.97(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ171.4，164.5，152.3，151.1，149.9，149.7，140.5，140.1，123.7，121.5，101.7，77.1，74.5，68.2，59.8，32.4，30.8，19.2.MSI-MS：558.4[M+Na]+。
实施例32：制备化合物：(((5-(6-(异烟酰胺)-9H-嘌呤-9-基)-4-(戊氧基)四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)膦酸，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000451
以化合物29为原料，按照实施例3中的制备方法，将化合物1b等当量替换为化合物29制备得到化合物32a，产率为77％。以化合物32a为底物，按照实施例12的制备方法，将其中1a等当量替换为化合物32a制备得到化合物32，产率为90％。其中制备的化合物32的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.05(s，1H)，8.91(s，2H)，8.84(d，2H)，8.35(s，1H)，8.18(s，1H)，8.01(d，2H)，6.75(d，1H)，5.01(m，1H)，4.81(s，2H)，4.24(m，1H)，3.95(m，1H)，3.73(d，2H)，3.60-3.35(m，2H)，2.37(m，1H)，2.14(m，1H)，1.89(m，1H)，0.96(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ171.5，165.5，152.4，151.1，149.8，140.7，140.1，123.5，121.7，102.7，76.8，76.6，75.5，74.3，59.5，32.5，30.5，18.9.MSI-MS：550.4[M+H]+。
实施例33：制备化合物：甲基(((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(苯氧基)磷酰基)丙氨酸盐，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000452
以化合物1c为原料，按照实施例6中的制备方法，将化合物1b等当量替换为化合物1c，制备得到化合物33a，产率为62％，按照实施例1中1c的脱保护方案对33a进行反应制备化合物33，产率为90％。其中制备的化合物33的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.58(s，1H)，8.33(s，1H)，7.42(m，2H)，7.21(m，3H)，7.08(s，2H)，6.15(d，1H)，5.00(m，1H)，4.02(m，1H)，3.71-3.48(m，8H)，2.24-1.98(m，2H)，1.25(d，3H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ172.1，156.1，152.4，149.9，149.6，140.3，131.0，121.5，120.2，119.6，101.8，82.1，74.3，63.4，52.1，46.2，32.5，19.2.MSI-MS：439.4[M+H]+。
实施例34：制备化合物：甲基(((5-(羟甲基)-2-(6-(异烟酰胺)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基)氧基)(苯氧基)磷酰基)丙氨酸盐，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000461
按照实施例33的过程制备得到化合物33a，以33a为原料，按照实施例12的制备方法，将其中1a等当量替换为化合物33a制备得到化合物34，总产率为83％。其中制备的化合物34的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.02(s，1H)，8.81(d，2H)，8.34(s，1H)，8.17(s，1H)，8.02(d，2H)，7.41(m，2H)，7.23(m，3H)，6.16(d，1H)，4.98(m，1H)，4.01(m，1H)，3.78-3.47(m，8H)，2.25-1.97(m，2H)，1.27(d，3H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ171.4，163.8，152.1，151.5，150.4，149.8，149.7，140.8，140.5，130.2，122.5，121.7，121.2，119.9，102.4，82.5，74.5，63.5，51.7，46.3，32.7，19.4.MSI-MS：598.5[M+H]+。
实施例35：制备化合物：(5-(2-((E)-2-溴代羰基)-6-(异烟酰胺)-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)磷酸二氢甲酯，制备过程如下所示：
Figure BDA0003741658080000462
取虫草素2.51g(10mmol)溶于稀硝酸中，加热至110C，加入1.26g(5mmol)单质碘反应4h，通过TLC法监测反应。反应结束后用石油醚萃取，收集水相，有机相溶液用去离子水萃取，合并水相进行旋蒸，得到化合物35a称重为2.72g，收率为72％，MSI-MS：378.2[M+H]+。
取无水1，4-二氧六环100mL于反应器中，通入氩气保护，加热至70℃，依次加入醋酸钯0.11g(0.5mmol)，三苯基膦0.26g(1mmol)，三乙胺1.8mL，搅拌约30min。加入化合物35a3.77g(10mmol)，丙烯酸甲酯2.59g(30mmol)，反应在80℃环境下反应2h后反应结束，过滤，收集滤液，静置，再过滤，得到白色絮状固体，即化合物35b称重为2.41g，收率为72.7％，MSI-MS：336.4[M+H]+。
取化合物35b 1.00g逐滴加入12mL氢氧化钠溶液(2mol/L)，室温搅3h后在冰浴条件下逐滴加入浓盐酸，直到pH为1，此时有大量白色沉淀生成。抽滤得到白色固体35c，称重为0.88g，收率为92％，MSI-MS：322.6[M+H]+。
取化合物35c 3.21g(10mmol)加入120mL水中并加热至100℃搅拌，再加入无水碳酸钾2.07g(15mmol)，取NBS2.67g(15mmol)分别溶于22.5mL丙酮和22.5mL水中，并将混合液滴加至烧瓶中，于135min内滴加完毕。搅拌3h，停止反应，除去一半溶剂，置于冰箱过夜。有大量针状棕色晶体析出，抽滤，得到化合物35d，称重1.78g，收率为50％，MSI-MS：357.3[M+H]+。
取化合物35d 1.78g(5mmol)在冰浴条件下加入无水吡啶40.00mL，醋酸酐8.5mL。通过HPLC液相监测反应情况，反应约5h后反应结束。除去溶剂，得到黏稠状液体35e，称重得1.76g，产率80％。将化合物35e采用实施例16的方法制备化合物35f，产率为95％；将化合物35f采用实施例2磷酸化方法及实施例1中的脱保护方法制备至化合物35，产率为72％，其中制备的化合物35的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.05(s，1H)，8.84(d，2H)，8.31(s，1H)，8.02(d，2H)，7.11(d，1H)，6.70(d，1H)，6.11(d，1H)，5.35(s，1H)，4.31-4.02(m，5H)，3.76(m，1H)，2.07-1.84(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ164.5，152.6，151.8，149.8，149.7，140.9，140.3，134.5，124.3，123.4，121.5，98.5，74.5，74.3，68.5，34.7.MSI-MS：542.2[M+H]+。
实施例36：制备化合物：3-((5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)-5-(羟甲基)环戊烷-1，2-二醇，制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000481
按实施例17的方法制备得到化合物17a，以17a为原料，将其按照实施例8的制备方法进行制备，其中将2-氯-3-羟丙基缬氨酸等当量替换为3-氯-5-(羟甲基)环戊烷-1，2-二醇，制备得到化合物36a，脱保护后制得到化合物36，总产率为41％。其中制备的化合物36的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.37(s，1H)，7.01(s，2H)，6.15(d，1H)，5.92(s，1H)，5.37(d，1H)，4.38(s，1H)，4.25(s，1H)，4.02(m，2H)，3.84(m，1H)，3.65-3.31(m，6H)，2.07-1.82(m，2H)，1.70-1.44(m，3H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ156.1，153.5，149.8，140.3，119.5，99.2，83.5，81.2，76.2，75.7，74.8，73.1，64.1，34.9，34.7，31.5.MSI-MS：416.8[M+H]+。
实施例37：制备化合物：(((((5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-叠氮-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)甲基)磷酰基)双(氧基)双(亚甲基)双(2，2-二甲基丙酸)，其制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000482
将化合物1b 3.65g(10mmol)与间氯过氧苯甲酸3.44g(20mmol)加入反应瓶中，加入无水二氯甲烷100mL进行溶解，在冰浴环境下另外向其中加入五氧化二磷2.13g(15mmol)，反应逐渐升温至40℃反应3h，反应结束后过滤，加入100mL饱和碳酸氢钠进行淬灭反应，另外用50mL二氯甲烷洗涤两次，并用60mL饱和碳酸氢钠反萃两次，合并有机相，减压浓缩，柱层析得化合物37a，称重为1.49g，产率为41％，其制备的化合物检测为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.56(s，1H)，8.36(s，1H)，7.10(s，2H)，6.16(d，1H)，4.02(s，1H)，2.75-2.45(m，2H)，2.13(d，2H)，0.99(s，9H)，0.22(s，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ156.5，152.5，149.8，140.4，119.6，102.5，85.9，69.3，52.7，42.5，30.8，25.8，0.MSI-MS：364.5[M+H]+。
将3.63g的化合物37a(10mmol)与叠氮化钠2.6g(40mmol)加入烧瓶中，另外加入20mL DMF作为溶剂，反应在120℃环境下反应16h，用TLC板监测反应进程，反应结束后加水淬灭，水相用乙酸乙酯(180mL)萃取3次，合并有机相，加水洗涤，减压除去溶剂得泡沫状固体37b，称重为2.77g，产率为68％。以37b为原料按照实施例17中的化合物17a制备化合物17的方法制备得到化合物37，其中将37b等当量替换17a，总产率为50％。其中制备的化合物37的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.58(s，1H)，8.34(s，1H)，7.07(s，2H)，6.82(d，4H)，6.15(d，1H)，5.34(d，1H)，4.02(m，1H)，3.84(d，2H)，3.61-3.42(m，2H)，2.11-1.80(m，2H)，1.28(d，18H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ175.2，156.3，152.6，149.9，140.2，119.4，100.3，93.1，90.2，81.0，71.5，68.8，38.6，36.2，27.4.MSI-MS：637.6[M+Na]+。
实施例38：制备化合物：(5-(6-氨基-2-((E)-2-溴代羰基)-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)磷酸二氢甲酯，反应过程如下：
Figure BDA0003741658080000491
以化合物2为原料通过采用实施例35的方法从化合物2制备得到化合物38，整体产率为24％，其中制备的化合物38的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.35(s，1H)，7.09(d，1H)，6.95(s，2H)，6.68(d，1H)，6.15(d，1H)，5.35(s，1H)，4.27-4.02(m，5H)，3.74(m，1H)，2.07-1.84(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ156.1，152.3，149.8，140.2，134.9，124.2，119.5，98.7，74.9，74.3，68.1，34.5.MSI-MS：458.3[M+N]+。
实施例39：制备化合物：(5-(6-氨基-8-(异丙基氨基)-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)磷酸二氢甲酯，其制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000492
以化合物1b为原料制备化合物39，首先将化合物1b 3.65g(10mmol)与2-丙胺1.18g(20mmol)加入反应瓶中，向其中加入60mL二氧六环作为溶剂，反应在80℃的环境下回流反应20h，通过TLC监测反应进行。反应结束后，浓缩反应液，之后加入50mL水与50mL乙酸乙酯进行萃取2次，合并有机相，减压浓缩得到油状液体，经柱层析纯化得到淡黄色油状液体为化合物39a，称重为1.44g，产率为34％。
以化合物39a为原料，将其按照实施例2中的制备方法制备化合物39，将其中1b等当量替换为39a，产率为91％。其中制备的化合物39的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.15(s，1H)，7.05(s，2H)，6.15(d，1H)，5.98(s，1H)，5.38(s，1H)，4.28-3.95(m，6H)，3.75(m，1H)，2.05-1.81(m，2H)，1.18(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ153.1，152.3，151.5，149.8，118.5，99.7，74.8，74.5，68.5，46.5，34.3，23.5.MSI-MS：389.3[M+H]+。
实施例40：制备化合物：3-((5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)-5-(羟甲基)环戊烷-1，2-二醇，其制备过程如下：
Figure BDA0003741658080000501
以化合物1b为原料，将其按照实施例8的制备方法进行制备，其中将2-氯-3-羟丙基缬氨酸等当量替换为3-氯-5-(羟甲基)环戊烷-1，2-二醇，制备得到化合物40，总产率为46％。其中制备的化合物40的检测结果如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.58(s，1H)，8.37(s，1H)，7.04(s，2H)，6.15(d，1H)，5.91(s，1H)，5.37(d，1H)，4.37(s，1H)，4.25(s，1H)，4.00(m，2H)，3.82(m，1H)，3.63-3.32(m，6H)，2.08-1.81(m，2H)，1.71-1.45(m，3H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ156.3，153.4，149.7，140.2，119.4，99.5，83.4，81.1，76.1，75.5，74.9，73.6，64.4，34.9，34.7，31.6.MSI-MS：382.3[M+H]+。
实施例41：虫草素改性衍生物对肝癌的抗肿瘤实验效果
小鼠移植肝癌模型建立及药物评价。在100μL的PBS中悬浮2.5×105个Hep-1-6肝癌细胞接种C57BL/6j裸鼠左下肢大腿外侧；1周后移植瘤达到约100mm3大小时，将小鼠随机分为十二组，每组10只，分别为空白组，虫草素对照组和药物组(化合物2，3，5，7，15，24，27，31，35，40)；空白组隔天灌胃给玉米浆等营养剂及DMSO作为溶剂对照，虫草素对照组和药物组隔天分别灌胃给药化合物药物(500ug/次/只)，连续观察14天；观察两组小鼠中肝癌肿瘤尺寸变化情况，实验结束后处死小鼠，采集血液和相应组织标本，肿瘤瘤体立刻拍照并称重，取部分肿瘤组织固定于福尔马林溶液中，待进一步检测，用卡尺每两天测量移植瘤两个垂直直径(长和宽)，计算移植瘤大小，肿瘤体积变化实验结果及14天内空白组、虫草素对照组和药物组的处理的肿瘤结果见图1。根据公式计算体积：肿瘤体积(mm3)＝1/2×(长×宽)2。实验结果表明药物组单独使用可明显抑制小鼠肿瘤的生长，效果均优于虫草素对照组，其中化合物24抗肝癌肿瘤效果优异(900mm3降低至＜100mm3)(P＜0.001)，说明化合物药物组具有灭杀肝癌肿瘤细胞功效或者具有激活肿瘤免疫功效。
实施例42：虫草素改性衍生物对小细胞肺癌的抗肿瘤实验效果
采用MTT实验法对虫草素，以及化合物1，2，4，5，7，8，10，12，16，18，21，23，24，35，38与虫草素在小细胞肺癌细胞株H1048、H446和H69的抗肿瘤量效关系曲线进行分析。通过计算半数抑制浓度(IC50)的结果进行汇总见下表所示。体外抗肿瘤实验结果表明，与虫草素相比，改性后的虫草素衍生物对肿瘤细胞的有效浓度降低，其中化合物35和38对三种细胞均具有较强的体外杀伤作用，但其毒性也较大，其次是化合物18和21。其中虫草素在小细胞肺癌细胞株H1048、H446的IC50均高于100μM，起作用浓度较高，在实际应用时可能需要大量药物才能起作用。
表1：化合物在三种小细胞肺癌细胞中的IC50(μM)
Figure BDA0003741658080000511
Figure BDA0003741658080000521
实施例43：虫草素改性衍生物对斑马鱼体内实验的最大耐受量测定
随机选取240尾3dpf野生型AB品系斑马鱼于8孔板中，每孔30尾，每孔养鱼水容量为3mL，将虫草素按照最大致死剂量进行稀释，溶于DMSO中并按浓度梯度(最大致死剂量稀释100倍，中间取8个浓度梯度值进行试验)加入每个孔中，同时设置正常对照组、溶剂对照组G(5％葡萄糖)和溶剂对照组D(DMSO)。实验期间，各组斑马鱼在35℃环境下培养，供试品处理斑马鱼至5dpf后，分别考察不同剂量下斑马鱼的致死和发育畸形的情况，以存活率＞90％，并且致畸率＜20％的浓度确定供试品对正常斑马鱼的最大耐受量(MTD)。选取虫草素作为对照组，其他选取化合物2，化合物5，化合物6，化合物7，化合物9，化合物11，化合物13，化合物20，化合物24，化合物25，化合物28，化合物35，化合物36，化合物37，化合物39按照上述的方法测试斑马鱼的MTD，测试结果如表2所示。
表2：天然产物以及阳性对照药在斑马鱼模型中的最大耐受量(MTD)
Figure BDA0003741658080000522
Figure BDA0003741658080000531
实施例44：虫草素改性衍生物对小细胞肺癌斑马鱼体内的抑制效果
分别建立三种H69，H446，H1048细胞的斑马鱼荷小细胞肺癌移植瘤模型：分别准备1×106mL浓度的H69，H446，H1048细胞悬液放置在无血清的细胞培养基中，每毫升细胞悬液加入5mL的红色荧光染料(CM-DiI)细胞标记液，轻轻地混匀，37℃孵育20min，1500rpm离心5min后移除上清液，重新加入无血清的培养基进行重悬，之后重复上述步骤两次即得所需标记的细胞悬液，通过以显微注射的方式移植到斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约100个细胞，建立斑马鱼-人小细胞肺癌敏感株移植瘤模型，并且注射卵巢癌细胞的斑马鱼放置35℃培养至3dpf。
测试虫草素与制备的化合物2，5，6，7，9，11，13，20，24，25，28，35，36，37，39对斑马鱼体内抗小细胞肺癌的增值影响：抑制肿瘤斑马鱼模型至3dpf时，在显微镜下挑选出移植瘤一致性较好的斑马鱼，随机分配至6孔板中，每孔30尾。在3dpf时，将上述化合物按照MTD剂量进行稀释，溶于DMSO中加入每个孔中，同时设置正常对照组、模型对照组和溶剂对照组(DMSO)，每孔养鱼水容量为3mL。将各实验组斑马鱼继续置于35℃培养至5dpf后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片，利用尼康NIS-Elements 13.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼移植瘤荧光强度(S)，抑制结果如下表3所示，其中对照组、虫草素组、化合物24及化合物35组对H446小细胞肺癌的移植斑马鱼模型的抑制结果如图2所示。以整体荧光强度来计算消癌平注射液和紫杉醇单用对斑马鱼-人卵巢癌敏感株的生长抑制作用，公式如下：
肿瘤生长抑制作用(％)＝S(模型对照组)-S(药物组)/S(模型对照组)×100％
表3：各化合物在斑马鱼模型中对三种细胞株增殖的影响
Figure BDA0003741658080000532
Figure BDA0003741658080000541
实施例45：虫草素改性衍生物对结肠癌的抑制实验效果
小鼠移植结肠癌模型建立及药物评价。在100μL的PBS中悬浮2.5×106个MC-38结肠癌细胞接种C57BL/6j裸鼠左下肢大腿外侧；1周后移植瘤达到约100mm3大小时，将小鼠随机分为七组，每组8只，分别为对照组IgG、化合物16药物+IgG组、PD-1抗体治疗组、CTLA4单抗治疗组、化合物16药物+PD-1联合治疗组、化合物16药物+CTLA4单抗联合治疗组。对照组IgG：每天灌胃给药免疫球蛋白G(IgG)(500ug/次/只)，连续28天；虫草素+IgG：每天灌胃给药免疫球蛋白G(IgG)和虫草素(均是500ug/次/只)，连续28天；化合物16药物+IgG组：每天灌胃给药免疫球蛋白G(IgG)和化合物16药物(均是500ug/次/只)，连续28天；抗体治疗组：每4天灌胃给药抗体(500ug/次/只)，连续28天；化合物16药物+抗体联合治疗组：每天灌胃给药免疫球蛋白化合物16药物(500ug/次/只)，每4天灌胃给药抗体(500ug/次/只)，连续28天。实验结束后处死小鼠，采集血液和相应组织标本，肿瘤瘤体立刻拍照并称重，取部分肿瘤组织固定于福尔马林溶液中，待进一步检测，用卡尺每两天测量移植瘤两个垂直直径(长和宽)，计算移植瘤大小，并根据公式计算体积：肿瘤体积(mm3)＝1/2×(长×宽)2，观察七组小鼠中结肠癌肿瘤尺寸变化情况，结果如图3所示。28天后，实验结果表明，虫草素具有抗结肠癌增殖的效果(尺寸1300mm3降至730mm3)，化合物16单独使用具有比虫草素明显抗肿瘤生长的功效(尺寸1300mm3降至480mm3)(P＜0.01)，免疫检查点抑制剂PD-1和CTLA4单独使用，也有显著的抗肿瘤生长作用(尺寸1300mm3降至448mm3左右)(P＜0.01)，化合物16和免疫检查点抑制剂PD-1和CTLA4分别同时使用时，两者协同作用能大幅度提高抗肿瘤的作用(尺寸1300mm3降至260mm3左右)。
实施例46：虫草素改性衍生物对黑色素瘤的抑制实验效果
小鼠移植黑色素瘤模型建立及药物评价：在100μL的PBS中悬浮2.5×105个B16-F10黑色素瘤细胞接种C57BL/6j裸鼠左下肢大腿外侧；1周后移植瘤达到约100mm3大小时，将小鼠随机分为十组，每组10只，分别为空白对照组、虫草素组、化合物13组、化合物14组、化合物17组、化合物19组、化合物22组、化合物26组、化合物29组、化合物34组。其中空白对照组：每天灌胃给玉米浆等营养剂及DMSO作为溶剂对照组，连续24天；化合物组：隔天灌胃给药对应的化合物(均是500ug/次/只)，连续24天；前期每4天，后期每两天观察十组小鼠中黑色素瘤尺寸变化情况，实验结束后处死小鼠，采集血液和相应组织标本，肿瘤瘤体立刻拍照并称重，取部分肿瘤组织固定于福尔马林溶液中，待进一步检测，用卡尺每两天测量移植瘤两个垂直直径(长和宽)，计算移植瘤大小，并根据公式计算体积：肿瘤体积(mm3)＝1/2×(长×宽)2，实验结果见图4所示。实验结果表明虫草素本身可以抑制黑色素瘤的增殖(1760mm3降低至600mm3)，虫草素改性衍生物比虫草素效果更好(1760mm3降低至＜560mm3)，其中化合物19和34单独使用可明显抑制小鼠肿瘤的生长(1760mm3降低至约240mm3)(P＜0.001)，上结果提示合成的具有杀肿瘤细胞功效。
实施例47：虫草素改性衍生物对卵巢癌的抑制实验效果
小鼠移植卵巢癌模型建立及药物评价。在100μL的PBS中悬浮2.5×106个ID8卵巢癌细胞接种C57BL/6j裸鼠左下肢大腿外侧；约一周后移植瘤达到约100mm3大小时，将小鼠随机分为五组，每组10只，分别为对照组、虫草素组，化合物24药物组、PD-1+TIM3抗体治疗组、化合物24药物+PD-1+TIM3抗体治疗组。对照组：每天灌胃给药免疫球蛋白G(IgG)(500ug/次/只)及PBS，连续15天；虫草素组：每天灌胃给药虫草素(500ug/次/只)并用PBS配置，连续15天；化合物24药物组：每天灌胃给药化合物24(500ug/次/只)并用PBS配置，连续15天；PD-1+TIM3抗体治疗组：每4天灌胃给药抗体PD-1+TIM3(分别500ug/次/只)，连续15天；化合物24药物+PD-1+TIM3抗体治疗组：每天灌胃给药免疫球蛋白化合物24药物(500ug/次/只)，每4天灌胃给药抗体PD-1+TIM3(分别500ug/次/只)，连续15天。每两天观察五组小鼠中卵巢瘤尺寸变化情况，实验结束后处死小鼠，采集血液和相应组织标本，肿瘤瘤体立刻拍照并称重，取部分肿瘤组织固定于福尔马林溶液中，待进一步检测，用卡尺每两天测量移植瘤两个垂直直径(长和宽)，计算移植瘤大小，并根据公式计算体积：肿瘤体积(mm3)＝1/2×(长×宽)2，实验结果见图5所示。实验结果表明，虫草素具有抗卵巢癌增殖的效果(15天尺寸降低1.5倍)，化合物24单独使用具有比虫草素明显抗肿瘤生长的功效(15天尺寸降低约2倍)，免疫检查点抑制剂PD-1和CTLA4单独使用，也有显著的抗肿瘤生长作用(15天尺寸降低约2倍以上)，化合物24和免疫检查点抑制剂PD-1和CTLA4分别同时使用时，能大幅度提高抗肿瘤的作用(15天尺寸降低约4倍)。
实施例48：虫草素改性衍生物对体外-胃癌细胞的抑制实验效果
采用MTT实验法对虫草素及四十种制备得到的化合物分别在胃癌细胞株AGS及BGC-823的抗肿瘤量效关系曲线进行分析。通过计算半数抑制浓度(IC50)的结果进行汇总见下表4所示。体外抗肿瘤实验结果表明，与虫草素相比，改性后的虫草素衍生物对肿瘤细胞的有效浓度降低。
表4：虫草素及虫草素改性化合物在胃癌细胞中的IC50(μM)
Figure BDA0003741658080000561
Figure BDA0003741658080000571
实施例49：虫草素改性衍生物对胃癌-小鼠模型体内肿瘤抑制实验效果
小鼠移植胃癌模型建立及药物评价：在100μL的PBS中悬浮2×107个BGC-823胃癌细胞接种C57BL/6j裸鼠前胸壁以75％乙醇消毒，用手触及心尖搏动最明显处，约于胸骨左旁3mm第二肋间的左心室进行接种，约一周后移植瘤达到约100mm3大小时，将小鼠随机分为五组，每组10只，分别为对照组、虫草素组，化合物16、18、24药物组。对照组：每天灌胃给玉米浆等营养剂及DMSO作为溶剂对照组，虫草素组：每天灌胃给药虫草素(500ug/次/只)并用DMSO配置；化合物药物组：每天灌胃给药化合物(500ug/次/只)并用DMSO配置。连续给药18天。每两天观察五组小鼠中胃部肿瘤尺寸变化情况，实验结束后处死小鼠，采集血液和相应组织标本，肿瘤瘤体立刻拍照并称重，称重实验结果见图6所示。从实验结果可以发现，虫草素可以有效抑制胃部肿瘤的增殖，相比对照组降低了约4倍(1.73g降低至0.46g)，改性后的虫草素具有比虫草素更明显的效果，其中化合物24组相对对照组降低了约12倍(1.73g降低至0.14g)。
实施例50：虫草素改性衍生物对胰腺癌-小鼠模型体内肿瘤抑制实验效果
小鼠移植胰腺癌模型建立及药物评价：胰腺癌Pan02-luc细胞置于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃ CO2培养箱中。胰酶ED-TA消化传代，每2～3d传代一次。待细胞达到所需数量时，取对数生长期的细胞，用培养基重悬为1×107/mL。取C57BL/6j裸鼠在无病原体条件下喂养，待小鼠生长至6周时，在每只小鼠右背侧近腋部皮下注射200uL胰腺癌Pan02-uc系细胞，约一周内移植瘤出现表示模型建立成功。将小鼠随机分为五组，每组10只，分别为对照组、虫草素组，化合物11、16、24药物组。对照组：每天灌胃给玉米浆等营养剂及DMSO作为溶剂对照组，虫草素组：每天灌胃给药虫草素(500ug/次/只)并用DMSO配置；化合物药物组：每天灌胃给药化合物(500ug/次/只)并用DMSO配置。连续给药24天。之后观察每天观察五组的小鼠存活率，研究中位存活时间情况，实验结果如图7所示。实验结果表明，单独虫草素给药已经产生显著的延长荷瘤鼠生存期的作用(41天提升至52天)，化合物组在虫草素的基础上进一步延长了荷瘤鼠生存期(41天提升至＞58天)，其中化合物24效果最好，延长了荷瘤鼠生存期近一半(41天提升至76天)。
本发明提供了一种基于虫草素经衍生化的化合物及其制备方法与在制备防治细胞功能性损伤发生变异的相关疾病产品中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (15)

1.一种如式I所示的虫草素衍生物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物、前药，或其代谢物；
Figure FDA0003741658070000011
其中，R1选自氢，磷酸基，取代的磷酸酯基，膦酸基，取代的膦酸酯基，烷基醇基，氨基酸烷基酯基，氨基酸烷基醇酯基，烷基酸烷基酯基，或环烷基多元醇基；所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代；R2选自氢，或叠氮基；R3选自氢，氟，氯，或叠氮基；R4选自羟基，氰基，β-酰胺-γ-环磺酰氧基，氨基酸羧酸酯基，氨基酸烷基酯膦酸苯酯基，或氨基酸烷基酯磷酸苯酯基；R5选自氢，溴乙烯基，巯基，甲基，氟，或氯；R6选自氨基，取代的甲酰胺基；所述取代为烷基、芳基、环烷基、呋喃基、吡啶基中的任意一种或多种官能团取代；R7选自氢，或异丙基氨基；且不存在R1、R2、R3、R5、R7选自氢、R4选自羟基、R6选自氨基的情况。
2.根据权利要求1所述的虫草素衍生物，其特征在于，R1选自氢，如R1 1-R1 7所示的磷酸基，磷酸二乙酯基，磷酸二正丙酯基，磷酸二异丙酯基，磷酸二异丁酯基，磷酸二正丁酯基，或磷酸二异丁酰氧基甲氧基，如R1 8-R1 11所示的膦酸基，膦酸三氟乙酯基，膦酸二异丁酰氧基甲氧基，或膦酸新戊酰氧基甲氧基，如R1 12-R1 13所示的环膦酰基三氟乙醇酯乙二醇酯基，或环膦酰基乙二醇酯基，如R1 14-R1 16所示的(R)-磷酰基异亮氨酸甲酯苯酯基，(S)-磷酰基异亮氨酸甲酯苯酯基，或磷酰基丙氨酸异丙酯苯酯基，如R1 17-R1 22所示的羟基乙基，1，3-二羟基-2-丙基，丙氨酸乙酯基，异亮氨酸乙酯基，异亮氨酸-1，3-丙二醇酯基，或甘氨酸乙酯基，或如R1 23-R1 25所示的二碳酸二甲酯-丙二酯基，2-异丙氧基六氢环戊烷[d][1，3，2]二氧磷蛋白-7-醇基，或1-羟甲基-2，3-二羟基-4-环戊基；
Figure FDA0003741658070000021
3.根据权利要求1所述的虫草素衍生物，其特征在于，R4选自R4 1-R4 7所示的羟基，氰基，β-酰胺-γ-环磺酰氧基，2-氨基-丙酰氧基，2-氨基-3-甲基-丁酰氧基，磷酰氧基丙氨酸甲酯苯酯基，或膦酰胺基异亮氨酸甲酯苯酯基；
Figure FDA0003741658070000022
4.根据权利要求1所述的虫草素衍生物，其特征在于，R6选自氨基，或如R6 1-R6 16所示的乙酰胺基，丁酰胺基，辛酰胺基，十二烷基酰胺基，十八烷基酰胺基，异丙酰胺基，异丁酰胺基，新戊酰胺基，2-乙基正丁酰胺基，3，3-二甲基-丁酰胺基，环己基甲酰胺基，环戊基甲酰胺基，苯甲酰胺基，呋喃甲酰胺基，吡啶甲酰胺基，或十六烷基酰胺基；
Figure FDA0003741658070000031
5.根据权利要求1所述的虫草素衍生物，其特征在于，式I所示的虫草素衍生物选自化合物1～化合物40中的任意一种；
Figure FDA0003741658070000032
Figure FDA0003741658070000041
Figure FDA0003741658070000051
Figure FDA0003741658070000061
6.一种药物组合物，其包含权利要求1～5中至少一种所述的虫草素衍生物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物、前药，或其代谢物；以及至少一种免疫检查点抑制剂；
优选地，所述免疫检查点抑制剂选自PD-1和/或CTLA4单抗；
优选地，所述虫草素衍生物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物、前药，或其代谢物，与免疫检查点抑制剂的质量比为1∶0.2～10，优选为1∶0.2～8，优选为1∶0.2～5，优选为1∶0.2～3，优选为1∶0.2～2，优选为1∶0.5～1.5，优选为1∶0.8～1.2，优选为1∶1。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自片剂、丸剂、胶囊、滴丸、糖浆、崩解剂、注射剂、缓释剂、或试剂盒。
8.权利要求1～5中任一项所述的虫草素衍生物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物、前药，或其代谢物，或权利要求6或7所述的药物组合在制备防治哺乳动物或人体中细胞功能性损伤发生变异的相关疾病产品中的应用；
优选地，所述细胞功能性损伤发生变异的相关疾病为肿瘤；
优选地，所述肿瘤包括胃癌，胰腺癌，肝癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，结肠直肠癌，食道癌，前列腺癌，黑色素瘤，神经胶质瘤，和卵巢癌；
优选地，所述肿瘤为胃癌、胰腺癌、肝癌、小细胞肺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤和卵巢癌中的任意一种。
9.权利要求1～5中任一项所述的虫草素衍生物的制备方法，其特征在于，当式I中，R1选自磷酸基，取代的磷酸酯基，膦酸基，取代的膦酸酯基，烷基醇基，氨基酸烷基酯基，氨基酸烷基醇酯基，烷基酸烷基酯基，或环烷基多元醇基；所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-1为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure FDA0003741658070000071
式I-R-1中，R2～R7同式I中的R2～R7，或分别独立地选自保护基；
当式I中的R1选自磷酸基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于亚磷酸三甲酯和/或亚磷酸三乙酯中，化合物I-R-1与改性剂三氯氧磷反应，优选地，所述化合物I-R-1、改性剂和有机溶剂的用量比为1mmol∶3～6mmol∶15～30mL，优选地，所述反应的温度为-10～5℃，优选地，所述反应的时间为0.5～2h；
当式I中的R1选自取代的磷酸酯基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于无水N，N-二甲基甲酰胺和/或四氢呋喃中，以叔丁基氯化镁为催化剂，化合物I-R-1与改性剂取代的磷酸硝基苯酯反应，所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代，优选地，所述化合物I-R-1、改性剂、催化剂和有机溶剂的用量比为1mmol∶1～3mmol∶1～2mmol∶9～15mL，优选地，所述反应的温度为20～40℃，优选地，所述反应的时间为2～5h；
当式I中的R1选自膦酸基，或取代的膦酸酯基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于无水N，N-二甲基甲酰胺中，以NaH为催化剂，化合物I-R-1与改性剂取代或非取代的对甲苯磺酰氧甲基磷酸酯反应，所述取代为所述取代为烷氧基、卤素取代的烷氧基、芳氧基，氨基酸酯酰胺基，烷基酯基、烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代，优选地，所述化合物I-R-1、改性剂、催化剂和有机溶剂的用量比为0.1mol∶0.1～0.15mol∶0.2～0.03mol∶100～200mL，优选为0.1mol∶0.1～0.15mol∶0.2～0.03mol∶150mL，优选地，所述反应的温度为-20～0℃，优选地，所述反应的时间为0.5-6h；
当式I中的R1选自烷基醇基，氨基酸烷基酯基，氨基酸烷基醇酯基，烷基酸烷基酯基，或环烷基多元醇基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于丁酮中，以碳酸钾为催化剂，化合物I-R-1与改性剂反应，所述改性剂为卤素对应取代的烷基醇，氨基酸烷基酯，氨基酸烷基醇酯，烷基酸烷基酯或环烷基多元醇，优选地，所述卤素为溴或氯，优选地，所述化合物I-R-1、改性剂、催化剂与有机溶剂的用量比为1mmol∶0.5～1.5mmol∶1～3mmol∶5～8mL，优选为1mmol∶1mmol∶1～3mmol∶5～8mL，优选地，所述反应的温度为40～100℃，优选地，所述反应的时间为8～20h。
10.权利要求1～5中任一项所述的虫草素衍生物的制备方法，其特征在于，当式I中，R2选自叠氮基时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-2为原料进行环化反应，制得中间体I-R-2a，5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-1，4-二氧杂吡咯[2.4]庚烷-6-醇或其衍生物；于有机溶剂中，所得中间体I-R-2a经开环反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure FDA0003741658070000081
式I-R-2中，R1、R3～R7同式I中的R1、R3～R7，或分别独立地选自保护基；
所述中间体I-R-2a的制备方法优选为：于二氯甲烷中，将化合物I-R-2在五氧化二磷及间氯过氧苯甲酸催化下进行环化反应，优选地，所述化合物I-R-2、五氧化二磷、间氯过氧苯甲酸与二氯甲烷的用量比为1mmol∶1.2～2mmol∶2～3mmol∶10～20mL，优选地，所述环化反应的温度为20～60℃，优选地，所述环化反应的时间为3～10h；
所述式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于无水二甲基甲酰胺中，所得中间体I-R-2a与叠氮化钠经开环反应，优选地，所述化合物I-R-2a、叠氮化钠与二甲基甲酰胺的用量比为1mmol∶4～5mmol∶2～5mL，优选地，所述开环反应的温度为100～120℃，优选地，所述开环反应的时间为12～16h；
Figure FDA0003741658070000082
11.权利要求1～5中任一项所述的虫草素衍生物的制备方法，其特征在于，当式I中，R3选自氟，氯，或叠氮基时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-3为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure FDA0003741658070000091
式I-R-3中，R1、R2、R5～R7同式I中的R1、R2、R5～R7，或分别独立地选自保护基；
当式I中R3选自氟，或氯时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于吡啶及二氯甲烷中，将化合物I-R-3与三氟甲磺酸酐反应，制得中间体I-R-3a，5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-基三氟甲烷磺酸酯或其衍生物；于乙酸乙酯中，将中间体I-R-3a与氢氟酸、三氟化硫或盐酸进行取代反应，制得式I所示的虫草素衍生物；其中，所述中间体I-R-3a的制备方法中，优选地，所述化合物I-R-3、三氟甲磺酸酐、吡啶及二氯甲烷的用量比为1mmol∶1～1.5mmol∶0.15～0.2mL∶10～20mL，优选地，所述反应的温度为-5～5℃，优选为0℃，优选地，所述反应的时间为1～3h；其中，所述式I所示虫草素衍生物的制备方法中，优选地，将中间体I-R-3a与37％氢氟酸或二乙胺基三氟化硫或盐酸的三乙胺溶液进行取代反应，优选地，所述中间体I-R-3a，37％氢氟酸或二乙胺基三氟化硫或盐酸的三乙胺溶液，与乙酸乙酯的用量比为1mmol∶2～3mmol∶4～10mL，优选地，所述反应的温度为60～80℃，优选地，所述反应的时间为8～10h；
Figure FDA0003741658070000092
当式I中R3选自叠氮基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于N，N-二甲基甲酰胺中，将化合物I-R-3在三苯基磷及偶氮二甲酸二异丙酯催化下进行环化反应，制得中间体I-R-3b，4-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3，6-二氧杂环[3.1.0]己烷-2-基)甲醇或其衍生物；于二甲基甲酰胺中，所得中间体I-R-3b与叠氮化钠经开环反应，制得式I所示的虫草素衍生物；其中，所述中间体I-R-3b的制备方法中，优选地，所述化合物I-R-3、三苯基磷、偶氮二甲酸二异丙酯与N，N-二甲基甲酰胺的用量比为10.0mmol∶16～28mmol∶1.6～2.8mmol∶15～50mL，优选为10.0mmol∶22mmol∶2.2mmol∶15～50mL，优选地，所述环化反应的温度为10～60℃，优选地，所述环化反应的时间为1～5h；优选地，所述式I所述虫草素衍生物的制备方法中，所述中间体I-R-3b、叠氮化钠与二甲基甲酰胺的用量比为1mmol∶4～5mmol∶2～5mL，优选地，所述开环反应的温度为100～120℃，优选地，所述开环反应的时间为12～16h。
12.权利要求1～5中任一项所述的虫草素衍生物的制备方法，其特征在于，当式I中，R4选自氰基，β-酰胺-γ-环磺酰氧基，氨基酸羧酸酯基，氨基酸烷基酯膦酸苯酯基，或氨基酸烷基酯磷酸苯酯基时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-4为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure FDA0003741658070000101
式I-R-4中，R1～R3、R5～R7同式I中的R1～R3、R5～R7，或分别独立地选自保护基；
当式I中R4选自氰基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于二氯甲烷中，先将化合物I-R-4、三氟甲烷磺酸、三氟甲磺酸三甲硅酯在-50～-30℃环境下搅拌，再与三甲基腈硅烷、三乙胺进反应；优选地，所述化合物I-R-4、三氟甲烷磺酸、三氟甲磺酸三甲硅酯、二氯甲烷的用量比为10mmol∶0.8～1.8mL∶2.2～3.2mL∶90～110mL，优选为10mmol∶1.3mL∶2.7mL∶100mL，优选地，所述搅拌的时间为20～40min，优选为30min；优选地，所述化合物I-R-4与三甲基腈硅烷、三乙胺的用量比为10mmol∶3.4～4.3g∶3～4mL，优选地，所述反应的温度为20～30℃，优选为室温，优选地，所述反应的时间为2～4h；
当式I中R4选自β-酰胺-γ-环磺酰氧基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：化合物I-R-4先经氧化反应制备中间体I-R-4a，2-(6-氨基-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)二氢呋喃-3(2H)-酮或其衍生物，再经氰基化反应制备中间体I-R-4b，2-(6-氨基-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)-3-异氰四氢呋喃-3-醇或其衍生物，再经甲基磺酸酯化制备中间体I-R-4c，2-(6-氨基-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)-3-异氰四氢呋喃-3-基甲烷磺酸盐或其衍生物，最后经环合反应制备式I所示的虫草素衍生物；其中，所述中间体I-R-4a的制备方法优选为：于丙酮中，化合物I-R-4与琼斯试剂2.2M三氧化二铬反应，优选地，所述化合物I-R-4、琼斯试剂与丙酮的用量比为20mmol∶5～8mL∶50～100mL，优选地，所述反应的温度为0～40℃，优选地，所述反应的时间为1～4h；其中，所述中间体I-R-4b的制备方法优选为于二氯甲烷中，中间体I-R-4a与三甲基硅氰化物、三氟化硼乙醚进行反应，优选地，所述中间体I-R-4a、三甲基硅氰化物、三氟化硼乙醚与二氯甲烷的用量比为20mmol∶20～40mmol∶10～30mmol∶50～100mL，优选为20mmol∶20～40mmol∶20mmol∶50～100mL，优选地，所述反应的温度为0～40℃，优选地，所述反应的时间为1～4h；其中，所述中间体I-R-4c的制备方法优选为：于无水二氯甲烷中，中间体I-R-4b与三乙胺、甲磺酰氯反应，优选地，所述中间体I-R-4b、三乙胺、甲磺酰氯与无水二氯甲烷的用量为2.2mmol∶10～15mmol∶4～8mmol∶5～10mL，优选地，所述反应的温度为-30～0℃，优选地，所述反应的时间为2～4h；其中，所述式I所述虫草素衍生物的制备方法优选为：于无水乙腈中，中间体I-R-4c与碳酸铯进行反应，优选地，所述中间体I-R-4c、碳酸铯与无水乙腈的用量比为1mmol∶0.5～2.5mmol∶3～10mL，优选为1mmol∶1.5mmol∶3～10mL，优选地，所述反应的温度为0～40℃，优选地，所述反应的时间为2～4h；
Figure FDA0003741658070000111
当式I中R4选自氨基酸羧酸酯基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于无水吡啶中，将化合物I-R-4与氨基酸酰氯反应，制得式I所示的虫草素衍生物；优选地，所述化合物I-R-4、氨基酸酰氯与吡啶的用量比为10mmol∶5～15mmol∶50～100mL，优选为10mmol∶10mmol∶50～100mL，优选地，所述反应的温度为20～60℃，优选40℃，优选地，所述反应的时间为6～20h；
当式I中R4选自氨基酸烷基酯膦酸苯酯基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于无水N，N-二甲基甲酰胺中，以NaH为催化剂，化合物I-R-4与改性剂氨基酸烷基酯取代的对甲苯磺酰氧甲基磷酸苯酯反应，优选地，所述化合物I-R-4、改性剂、NaH和无水N，N-二甲基甲酰胺的用量比为0.1mol∶0.1～0.15mol∶0.2～0.03mol∶100～200mL，优选为0.1mol∶0.1～0.15mol∶0.2～0.03mol∶150mL，优选地，所述反应的温度为-20～0℃，优选地，所述反应的时间为0.5-6h；
当式I中R4选自氨基酸烷基酯磷酸苯酯基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于无水N，N-二甲基甲酰胺和/或四氢呋喃中，以叔丁基氯化镁为催化剂，化合物I-R-4与以改性剂取代的磷酸硝基苯酯反应，所述取代为芳氧基，烷基酸甲酯氧基中任意一种或多种官能团取代，优选地，所述化合物I-R-4、改性剂、催化剂和有机溶剂的用量比为1mmol∶1～3mmol∶1～2mmol∶9～15mL，优选地，所述反应的温度为20～40℃，优选地，所述反应的时间为2～5h。
13.权利要求1～5中任一项所述的虫草素衍生物的制备方法，其特征在于，当式I中，R5选自溴乙烯基，巯基，甲基，氟，或氯；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-5为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure FDA0003741658070000121
式I-R-5中，R1～R4、R6～R7同式I中的R1～R4、R6～R7，或分别独立地选自保护基；
当式I中R5选自溴乙烯基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：将化合物I-R-5经碘化反应制得中间体I-R-5a，2-(6-氨基-2-碘-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇或其衍生物，中间体I-R-5a经丙烯酸甲酯取代反应制得中间体I-R-5b，甲基(E)-3-(6-氨基-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)丙烯酸酯或其衍生物，中间体I-R-5b经水解制得中间体I-R-5c，(E)-3-(6-氨基-9-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)丙烯酸或其衍生物，中间体I-R-5c经N-溴代琥珀酰亚胺经溴化反应，制得式I所示的虫草素衍生物；其中，所述中间体I-R-5a的制备方法优选为，于稀硝酸中，将化合物I-R-5与碘单质，经碘化反应制备中间体I-R-5a，优选地，所述化合物I-R-5与碘单质的用量比为1mmol∶0.5～0.8mmol，优选地，所述反应温度为100～120℃，优选为110℃，优选地，所述反应的时间为4～6h；其中，所述中间体I-R-5b的制备方法优选为，于1，4-二氧六环中，中间体I-R-5a与丙烯酸甲酯及三乙胺，在醋酸钯及三苯基膦催化下反应，优选地，所述中间体I-R-5a、丙烯酸甲酯、三乙胺、醋酸钯、三苯基膦与1，4-二氧六环的用量比为1mmol∶3～4mmol∶0.1～0.5mL∶0.01～0.09mmol∶0.05～0.15mmol∶10～20mL，优选为1mmol∶3～4mmol∶0.1～0.5mL∶0.05mmol∶0.01mmol∶10～20mL，优选地，所述反应的温度为50～90℃，优选地，所述反应的时间为0.5～2h；其中，所述中间体I-R-5c的制备方法优选为，中间体I-R-5b与氢氧化钠溶液进行水解反应，优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5～3.5mol/L，优选为2mol/L，优选地，所述中间体I-R-5b与氢氧化钠溶液的用量比为1g∶10～14mL，优选为1g∶12mL，优选地，所述反应温度为20～30℃，优选为室温，优选地，所述反应的时间为3～5h；其中，式I所述虫草素衍生物的制备方法优选为，在水和丙酮的混合溶剂中，中间体I-R-5c与N-溴代琥珀酰亚胺在碳酸钾催化下反应，优选地，所述中间体I-R-5c、N-溴代琥珀酰亚胺、碳酸钾、混合溶剂的用量比为1mmol∶1～3mmol∶1～3mmol∶15～30mL，优选地，所述水与丙酮的体积比为1∶4～8，优选为1∶6；
Figure FDA0003741658070000131
当式I中R5选自巯基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：于乙酸中，将化合物I-R-5与双氧水反应，制得中间体I-R-5d，1N-氧化-3’-脱氧腺苷或其衍生物，将中间体I-R-5d于盐酸水溶液中加热回流，制得中间体I-R-5e，5-氨基-N’-羟基-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1H-咪唑-4-羧酰胺或其衍生物，将中间体I-R-5e溶于水中，经雷尼镍催化，在氢气环境下反应，制得中间体I-R-5f，5-氨基-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1H-咪唑-4-羧酰胺或其衍生物，将中间体I-R-5f与甲醇、吡啶和二硫化碳反应，制得式I所示的虫草素衍生物；其中，所述中间体I-R-5d的制备方法优选为，在双氧水中，化合物I-R-5与乙酸进行反应，优选地，所述双氧水的浓度为20％～40％，优选为30％，优选地，所述化合物I-R-5、双氧水与乙酸的用量比为1mmol∶2～3mol∶1～6mL，优选地，所述反应的温度为30～50℃，优选地，所述反应的时间为2～4天；其中，所述的中间体I-R-5e的制备方法优选为，在盐酸水溶液中，中间体I-R-5d加热回流，优选地，所述盐酸水溶液的浓度为1～5mol/L，优选为3mol/L，优选地，所述中间体I-R-5d、盐酸水溶液的用量比为1mmol∶3～5mL，优选地，所述加热回流的时间为10～30min；其中，所述的中间体I-R-5f的制备方法中，优选地，所述中间体I-R-5e、雷尼镍和水的用量比为1mmol∶0.08～0.2g∶10～20mL，优选地，所述反应的温度为50～70℃，优选地，所述反应的时间为2～5天；其中，式I所述虫草素衍生物的制备方法中，优选地，所述中间体I-R-5f、与甲醇、吡啶和二硫化碳的用量比为1mmol∶5～10mL，优选地，所述甲醇、吡啶和二硫化碳的体积用量比4∶3～7∶0.5～3.5，优选为4∶5∶2，优选地，所述反应的温度为30～50℃，优选为40℃，优选地，所述反应的时间为3～5天；
Figure FDA0003741658070000141
当式I中R5选自甲基时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：在二氯甲烷溶剂中，化合物I-R-5、碘甲烷、碳酸钾反应，优选地，所述化合物I-R-5、碘甲烷、碳酸钾与二氯甲烷的用量比为1mmol∶1～2mmol∶1.5～3mmol∶5～10mL，优选地，所述反应的温度为20～50℃，优选地，所述反应的时间为3～10h；
当式I中R5选自氟或氯时，式I所示虫草素衍生物的制备方法优选为：将化合物I-R-5经硝基衍生化反应制得硝基化中间体I-R-5g，2-(6-氨基-2-硝基-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇，再进行取代反应，制得式I所示的虫草素衍生物；优选地，所述的中间体I-R-5g制备方法为，于二氯甲烷中，将化合物I-R-5与四丁基硝酸铵在三氟乙酸酐催化下进行反应，优选地，所述化合物I-R-5、四丁基硝酸铵、三氟乙酸与二氯甲烷的用量比为1mmol∶1.4～2mmol∶1～2mmol∶15～35mL；其中，式I所述虫草素衍生物制备特方法优选为，于乙腈中，将硝基化中间体I-R-5g与四丁基氟化铵或四丁基氯化铵进行反应，优选地，所述硝基化中间体I-R-5g、四丁基氟化铵或四丁基氯化铵，与乙腈的用量比1mmol∶1.3～1.5mmol∶30～50mL，所述反应的温度为-5～5℃，优选为0℃，优选地，所述反应的时间为20～30min；
Figure FDA0003741658070000142
14.权利要求1～5中任一项所述的虫草素衍生物的制备方法，其特征在于，当式I中，R6选自取代的甲酰胺基；所述取代为烷基、芳基、环烷基、呋喃基、吡啶基中的任意一种或多种官能团取代时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-6为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure FDA0003741658070000151
式I-R-6中，R1～R5、R7同式I中的R1～R5、R7，或分别独立地选自保护基；
其中，式I所示的虫草素衍生物的制备方法优选为：于无水吡啶下，将化合物I-R-6与取代酰氯反应，所述取代为烷基、芳基、环烷基、呋喃基、吡啶基中的任意一种或多种官能团取代，优选地，化合物I-R-6、取代酰氯与无水吡啶的用量比为1mmol∶1～2mmol∶5～10mL，优选地，所述反应的温度为0～60℃，优选地，所述反应的时间为2～20h。
15.权利要求1～5中任一项所述的虫草素衍生物的制备方法，其特征在于，当式I中，R7选自异丙基氨基时；式I所示虫草素衍生物的制备方法为：于有机溶剂中，以化合物I-R-7为原料经化学反应，制得式I所示的虫草素衍生物；
Figure FDA0003741658070000152
式I-R-7中，R1～R6同式I中的R1～R6，或分别独立地选自保护基；
其中，式I所示的虫草素衍生物的制备方法优选为：在二氧六环中，将化合物I-R-7经2-丙胺取代反应，优选地，化合物I-R-7与2-丙胺及二氧六环的用量比为10mmol∶10～30mmol∶50～100mL，优选地，所述反应的温度为60～120℃，优选地，所述反应的时间为10～30h。
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