BR112019014547A2 - Oligonucleotídeo de fita simples - Google Patents

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Nakajima Hiroyuki
KANAKI Tatsuro
Niwa Masatoshi
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Abstract

a presente invenção fornece um oligonucleotídeo de fita simples que pode controlar um gene alvo com alta eficiência e pode ser facilmente produzido. é um oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (i), em que x e y se hibridizam por uma primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica. x é composto por 7 a 100 nucleotídeos, contém pelo menos um nucleotídeo modificado e tem uma primeira sequência nucleotídica capaz de se hibridizar com um segundo oligonucleotídeo. y é composto por 4 a 100 nucleotídeos, permite a hibridização com o primeiro oligonucleotídeo mencionado acima e tem uma segunda sequência nucleotídica contendo pelo menos um ribonucleotídeo. pelo menos uma das sequências nucleotídicas x, xz e y tem uma sequência antissenso capaz de se hibridizar com um rna alvo. pelo menos um de l, lx e ly é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.

Description

CAMPO TÉCNICO [0001] A presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo de fita simples.
TÉCNICA ANTECEDENTE [0002] Os oligonucleotídeos antissenso (ASO) são DNA de fita simples, RNA e/ou análogos estruturais dos mesmos compostos por cerca de 8 a 30 bases que são oligonucleotídeos complementares ao mRNA ou ao precursor de mRNA de um gene alvo ou ncRNA (RNA não codificante) como RNA ribossômico, RNA de transferência ou miRNA. ASO suprime a função do mRNA, precursores de mRNA ou ncRNA, formando uma fita dupla com mRNA, precursor de mRNA ou ncRNA alvo desse oligonucleotídeo antissenso.
[0003] No entanto, a aplicação prática de ASO é difícil, uma vez que são facilmente degradados por nucleases no organismo vivo e a sua eficiência de absorção nas células alvo é baixa. A fim de superar esses dois grandes problemas, pesquisas foram conduzidas por muitos anos sobre a modificação química do ingrediente ativo na forma do oligonucleotídeo por si, bem como em sistemas de liberação de fármacos (DDS) capazes de liberar um oligonucleotídeo em uma célula alvo. [0004] Exemplos conhecidos de modificação química de ASO por si incluem S~oligo (fosforotioato), em que a porção fosfato foi modificada, e 2’,4’-BNA (ácido nucleico em ponte)/LNA (ácido nucléico bloqueado), em que a porção de açúcar foi modificada (ver Documentos de Patente 1 a 5).
[0005] Exemplos conhecidos de DDS incluem métodos utilizando veículos como lipossomas catiônicos ou micelas poliméricas. Adicionalmente, o Documento de Patente 6 descreve um ASO em que um derivado de GaINac (N-acetilgalactosamina), que é um derivado de
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2/259 açúcar tendo a capacidade de interagir com receptores de asialoglicoproteína, é ligado através de um ligante, e essa expressão de um gene alvo no fígado é suprimida após a administração deste ASO.
[0006] O Documento de Patente 7 e o Documento Não Patente 1 descrevem que, ligando o tocoferol (Toe) a um oligonucleotide© de fita dupla (HDO) contendo um oligonucleotide© de RNA complementar a ASO, o HDO é administrado e concentrado no fígado e expressão de um gene alvo no fígado é suprimida em camundongos. O Documento de Patente 8 descreve um ASO em que um derivado de GaINac está ligado a um HDO através de um ligante, e essa expressão é suprimida mais eficientemente do que a modificação de tocoferol (Toc) quando o oligonucleotídeo antissenso é administrado subcutaneamente.
[0007] O Documento de Patente 9 descreve que um oligonucleotídeo (HCDO), no qual um ASO está ligado à extremidade de uma fita de RNA de uma unidade de oligonucleotídeo de fita dupla consistindo em DNA e RNA, suprime um RNA alvo mais eficientemente do que o ASO. Documentos da Técnica Anterior
Documentos de Patente [0008] Documento de Patente 1: Publicação Internacional n° WO 98/39352 [0009] Documentos de Patente 2: Publicação Internacional n° WO 2005/021570 [0010] Documentos de Patente 3: Publicação Internacional n° WO 2003/068795 [0011] Documentos de Patente 4: Publicação Internacional n° WO 2011/052436 [0012] Documentos de Patente 5: Publicação Internacional n° WO 2011/156202 [0013] Documentos de Patente 6: Publicação Internacional n° WO 2014/179620
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3/259 [0014] Documentos de Patente 7: Publicação Internacional n° WO 2013/089283 [0015] Documentos de Patente 8: Publicação Internacional n° WO 2015/105083 [0016] Documentos de Patente 9: Publicação Internacional n° WO 2014/192310 [0017] Documentos de Não Patente [0018] Documento de Não Patente 1: Nature Communications, Vol. 6, Article No: 7969 (2015) DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção [0019] Há um desejo de novos fármacos de ácidos nucleicos capazes de suprimir eficientemente a expressão de um gene alvo quando indicado para uso como fármacos em mamíferos, incluindo seres humanos, no cenário clínico. Além disso, no caso da produção de oligonucleotídeos de fita dupla (como HDO ou HCDO mencionados acima), é necessária uma etapa para sintetizar separadamente a fita an~ tissenso e a fita de RNA complementar, seguindo-se a hibridização destas fitas. Além disso, quando é administrado a animais ou células, é necessário que o oligonucleotídeo de fita dupla seja inibido de se dissociar em fitas simples e pode presumir-se que existem casos em que é necessário um esforço considerável quando se estabelecem condições de manuseio para esse propósito.
[0020] Um objetivo da presente invenção é fornecer um novo oligonucleotídeo capaz de suprimir a expressão de um gene alvo com alta eficiência. Além disso, um objetivo da presente invenção é fornecer um oligonucleotídeo que possa ser mais facilmente produzido do que oiigonucleotídeos de fita dupla. Meios para Solução dos Problemas [0021] Os inventores da presente invenção descobriram que, por
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4/259 acoplamento de um oligonudeotídeo antissenso e uma fita complementar contendo seu RNA correspondente com um ligante contendo uma estrutura não nucleotideo para obter um oligonucleotídeo de fita simples com uma estrutura que hibridiza-se parcialmente dentro de uma molécula do mesmo, acoplando um oligodesoximbonucleotídeo e uma fita complementar contendo seu RNA correspondente com um ligante contendo uma estrutura não nucleotídica para obter um oligonucleotide© de fita simples com uma estrutura que hibridiza-se parcialmente dentro de uma molécula do mesmo, de forma que o oligonucleotídeo de fita simples demonstra um efeito antissenso que é igual ou superior ao dos oligonucleotídeos de fita dupla, possuindo uma sequência antissenso que é capaz de controlar a expressão de um gene alvo. Adicionalmente, foi descoberto que, acoplando o oligodesoxirribonucleotideo mencionado acima e a fita complementar contendo o seu RNA correspondente com um oligonucleotídeo, e mesmo quando se utiliza o ligante mencionado acima contendo uma estrutura não nucleotídica para ligação a uma das fitas oligonucleotídicas dos oligonucleotídeos de fita dupla (como ligação da fita de RNA de HCDO e ASO mencionada acima), demonstra um efeito antissenso que é igual ou maior que o efeito dos oligonucleotídeos de fita dupla. Além disso, uma vez que o oligonucleotídeo de fita simples consiste em uma fita simples, não existe uma etapa de hibridização complicada para formar uma fita dupla, de modo que possa ser produzido eficientemente. A presente invenção inclui os aspectos indicados abaixo.
[0022] Oligonucleotídeo de fita simples, caracterizado pelo fato de ser representado pela seguinte fórmula (I):
[Xz-Lx+x-L-Y-fLy-Yz 1 (I) {em que, X representa [0023] um grupo derivado de um primeiro oligonucleotídeo composto de 7 a 100 nucleotídeos que são independentemente seleciona
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5/259 dos de desoxirribonudeotideos, ribonudeotideos e nucleotídeos com açúcar modificado e [0024] que contenha peio menos um nucleotídeo do qual pelo menos uma de uma porção do açúcar, porção da base e porção do fosfato tenha sido modificada, [0025] Y representa [0026] um grupo derivado de um segundo oligonucleotídeo composto por 4 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonudeotideos, ribonudeotideos e nucleotídeos com açúcar modificado e [0027] que contém pelo menos um ribonudeotídeo, [0028] Xz representa [0029] um grupo derivado de um terceiro oligonucleotídeo composto de 7 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonudeotideos, ribonudeotideos e nucleotídeos com açúcar modificado e [0030] Yz representa [0031] um grupo derivado de um quarto oligonucleotídeo composto de 7 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonudeotideos, ribonudeotideos e nucleotídeos com açúcar modificado e [0032] L representa [0033] um grupo de ligação que contém uma estrutura não núcleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— p 5 _ 5 _ p 5 _ (em que, cada P5 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou [0034] -P(=O)(SH)-, e W5 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado),
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6/259 [0035] Lx representa [0036] -P(=O)(OH)-, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
- p6 - w6 - p6 (em que, cada P6 representa índependentemente -P(=O)(OH)- ou [0037] -P(=O)(SH)-, e W6 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado), [0038] Ly representa [0039] -P(=O)(OH)-, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
—p7—W7—P?— (em que, cada P7 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou [0040] -P(=O)(SH)-, W7 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoximbonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado), [0041] pelo menos um de L, Lx e Ly é um grupo de ligação contendo a estrutura não nucleotidica, [0042] L é, respectivamente, ligado covalentemente ao primeiro oligonucleotídeo e ao segundo oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, [0043] Lx é, respectivamente, ligado covalentemente ao primeiro oligonucleotídeo e ao terceiro oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, [0044] Ly é, respectivamente, ligado covalentemente ao segundo oligonucleotídeo e ao quarto oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, [0045] men representam respectiva e independentemente 0 ou 1;
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7/259 [0046] o primeiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica X, o segundo oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Y, o terceiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Xz e o quarto oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Yz, [0047] a sequência nucleotídica X contém uma primeira sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do segundo oligonucleotídeo, [0048] a sequência nucleotídica Y contém uma segunda sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do primeiro oligonucleotídeo e contém pelo menos um ribonucleotídeo, [0049] pelo menos uma da sequência nucleotídica X, da sequência nucleotídica Xz e da sequência nucleotídica Yz contém uma sequência antissenso capaz de se hibridizar com um RNA alvo, e [0050] no caso de ter duas ou mais sequências antissenso, o RNA alvo hibridizado por cada porção de sequência antissenso pode ser igual ou diferente} e [0051] X e Y se hibridizam pela primeira porção da sequência nucleotídica e a segunda porção da sequência nucleotídica.
[0052] 2. Oligonucleotídeo de fita simples, caracterizado pelo fato de ser representado pela seguinte fórmula (I):
ÍXz-Lx4x-L—Y-ÍLy—Yz: ] ( I ) {em que, X é [0053] um grupo derivado de um primeiro oligonucleotídeo composto de 7 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxlrrlbonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e que contenha pelo menos um nucleotídeo do qual pelo menos uma de uma porção do açúcar, porção da base e porção do fosfato tenha sido modificada, [0054] Y representa [0055] um grupo derivado de um segundo oligonucleotídeo com
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8/259 posto por 4 a 100 nucleotideos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e que contém pelo menos um ribonucleotideo, [0056] Xz representa [0057] um grupo derivado de um terceiro oligonucleotide© composto de 7 a 100 nucleotideos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e [0058] Yz representa [0059] um grupo derivado de um quarto oligonucleotídeo composto de 7 a 100 nucleotideos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e [0060] L representa [0061] um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( —O) (OH) -W5~P (-O) (OH) (em que, W5 representa um grupo derivado de um quinto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotideos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado), [0062] Lx representa [0063] -P(=O)(OH)~, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (===O) (OH) -W6-P (===O) (OH) -(em que, W6 representa um grupo derivado de um sexto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotideos que são selecionados, independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado), [0064] Ly representa
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9/259 [0065] -P(=O)(OH)-, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (:;=O) (OH) -W7--P (==O) (OH) (em que, W7 representa um grupo derivado de um sétimo oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado), [0066] pelo menos um de L, Lx e Ly é um grupo de ligação contendo a estrutura não nucleotídica, [0067] L é, respectivamente, ligado covalentemente ao primeiro oligonucleotídeo e ao segundo oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, [0068] Lx é, respectivamente, ligado covalentemente ao primeiro oligonucleotídeo e ao terceiro oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, [0069] Ly é, respectivamente, ligado covalentemente ao segundo oligonucleotídeo e ao quarto oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, [0070] men representam respectiva e independentemente 0 ou 1; [0071] o primeiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica X, o segundo oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Y, o terceiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Xz e o quarto oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Yz, [0072] a sequência nucleotídica X contém uma primeira sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do segundo oligonucleotídeo, [0073] a sequência nucleotídica Y contém uma segunda sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do primeiro oligonucleotídeo e contém pelo menos um ribonucleotídeo, [0074] pelo menos uma da sequência nucleotídica X, da sequência
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10/259 nudeotídica Xz e da sequênda nudeotídica Yz contém uma sequênda antissenso capaz de se hibridizar com um RNA alvo, e [0075] no caso de ter duas ou mais sequências antissenso, o RNA alvo hibridizado por cada porção de sequência antissenso pode ser igual ou diferente} e [0076] X e Y se hibridizam pela primeira porção da sequência nudeotídica e a segunda porção da sequência nudeotídica.
[0077] 3. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1 ou 2, em que X liga-se a L no lado 3’ e Y liga-se a L no lado 5’.
[0078] 4. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1 ou 2, em que X liga-se a L no lado 5’ e Y liga-se a L no lado 3’.
[0079] 5. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 4, em que cada grupo de ligação que contém uma estrutura não nudeotídica representa independentemente um grupo representado pela seguinte fórmula:
-- L P 1 1 - ( - O - V ! 1 -) q , , -- O -- J q , 2 - P 1 1 {em que, V11 representa [0080] um grupo alquileno C2-50 [0081] (0 grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente seledonados de um grupo substituinte Va), [0082] um grupo selecionado do grupo consistindo nas seguintes fórmulas (XIII-1) a (XIII-11):
Rc
H
Figure BR112019014547A2_D0001
(XiiM )
Re
NH
Figure BR112019014547A2_D0002
(XSI-2 } b n' y ο η ίΟ {Xlií-3)
Figure BR112019014547A2_D0003
{XiiM )
Figure BR112019014547A2_D0004
(xurs)
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11/259
Figure BR112019014547A2_D0005
(xüs-íi)
CX84-&) (»ia? (χιιι-11) (em que, o1 é um número inteiro de 0 a 30, p1 é um número inteiro de 0 a 30, d1 é um número inteiro de 1 a 10, w é um número inteiro de 0 a 3, Rb representa um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo amino, um grupo alcóxi C1-6, um grupo alcóxi C1-6 substituído por um grupo alcóxi Ci-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilamino C1-6, um grupo dialquilamino C1-6 ou um grupo alquila C1-6, Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6, um grupo halo-alquila C1-6, um grupo alquilcarbonila C1-6, um grupo haloalquilcarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila Ci-β, um grupo alcoxicarboníla Ci-e substituído por um grupo alcoxila C1-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaminocarbonila C1-6, um grupo dialqullaminocarbonila C1-6, um grupo alquilsulfonila C1-6, um grupo haloalquilsulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila Ci-β, um grupo alcoxissulfonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi Ci-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaminossulfonila C1-6 ou um grupo dialquilaminossulfonila Ci-e), um grupo ribonucleosídeo ou um grupo desoxirribonucleosídeo, pelo menos um de V11 representa um grupo alquileno C2-50 (0 grupo alquileno C2-50 é não substituído, ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados de um grupo substituinte Va), ou um grupo selecionado das fórmulas mencionadas acima (XIII-1) a (XIII-11), [0083] 0 grupo substituinte Va significa um grupo substituinte constituído por um grupo hidroxila, um átomo de halogêneo, um grupo cia
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12/259 no, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo carbamoíla, um grupo sulfamoíla, um grupo fosfono, um grupo sulfo, um grupo tetrazolila e um grupo formila, [0084] cada P11 representa independentemente -P(“0)(0H)- ou P(=O)(SH)-, pelo menos um P11 representa -P(™O)(OH)-, [0085] qn é um número inteiro de 1 a 10, qi2 é um número inteiro de 1 a 20, e quando pelo menos um de qn e qi2 é 2 ou mais, V11 é igual ou diferente}.
[0086] 6. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 5, em que cada grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica representa independentemente um grupo representado pela seguinte fórmula:
- ΓΡ (===O) (OH) -- (-O--V0--) : (; <.· P (===O) (OH) {em que, Vo representa um grupo alquíleno C2-50 (0 grupo alquileno C250 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados de um grupo substituinte Va), [0087] um grupo selecionado do grupo consistindo nas seguintes fórmulas (X-1) a (X-9):
Figure BR112019014547A2_D0006
í X-1 )
Figure BR112019014547A2_D0007
Figure BR112019014547A2_D0008
(X-3)
Figure BR112019014547A2_D0009
(X-4) (X-5)
Figure BR112019014547A2_D0010
Figure BR112019014547A2_D0011
Figure BR112019014547A2_D0012
(X-9 ) (em que 0 é um número inteiro de 0 a 30 e p é um número inteiro de 1
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13/259 a 30.) [0088] um grupo ribonucleoside© ou [0089] um grupo desoxirribonucleosídeo, [0090] pelo menos um Vo representa um grupo alquileno C2-50 (0 grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados de um grupo substituinte Va) ou [0091] um grupo selecionado das fórmulas mencionadas acima (X1) a (X-9), [0092] 0 grupo substituinte Va significa um grupo substituinte constituído por um grupo hidroxila, um átomo de halogêneo, um grupo ciano, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo carbamoíla, um grupo sulfamoíla, um grupo fosfono, um grupo sulfo, um grupo tetrazolila e um grupo formila, [0093] qi é um número inteiro de 1 a 10, qz é um número inteiro de 1 a 20, e quando pelo menos um de qi e qz é 2 ou mais, Vo é igual ou diferente}.
[0094] 7. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 6, em que a primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso.
[0095] 8. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 7, em que X contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, e a primeira sequência nucleotídica é uma sequência que contém pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos por RNase H.
[0096] 9. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 8, em que a primeira porção da sequência nucleotídica contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado e não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonudeotídeos contíguos.
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14/259 [0097] 10. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 9, em que o primeiro oligonucleotídeo contém um nucleotídeo com açúcar modificado adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da primeira porção da sequência nucleotídica.
[0098] 11.0 oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 10, em que o primeiro oligonucleotídeo contém uma ligação fosforotioato.
[0099] 12. Oligonucleotídeo de fita simples, descrito em qualquer um de 1 a 11, em que a primeira sequência nucleotídica é uma sequência composta por 4 a 20 nucleotídeos, incluindo pelo menos um desoximbonucleotídeo.
[00100] 13. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 12, em que a segunda sequência nucleotídica é uma sequência que contém pelo menos quatro nucleotídeos contíguos clivados por RNase H.
[00101] 14. Oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 13, em que o segundo oligonucleotídeo contém um núcleotídeo com açúcar modificado adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica.
[00102] 15. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 14, em que méO, néOeLéum grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
[00103] 16. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 14, em que n é 1, o Yz contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado e a sequência nucleotídica Yz contém a sequência antissenso.
[00104] 17. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 16, em que a sequência antissenso contida na sequência nucleotídica Yz é uma sequência que contém pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H quando se hibridizam com um RNA alvo.
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15/259 [00105] 18. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 16, em que a porção da sequência antissenso contida na sequência nucleotídica Yz contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado e nâo contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00106] 19. O oligonucleotídeo de fita simples, descrito em qualquer um de 16 a 18, em que o quarto oligonucleotídeo contém um nucleotídeo com açúcar modificado ligado adjacentemente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da porção da sequência antissenso contida no Yz.
[00107] 20. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 16 a 19, em que o quarto oligonucleotídeo contém pelo menos quatro nucleotídeos contíguos clivados por RNase H.
[00108] 21. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 16 a 20, em que L é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica e Y e Yz são acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00109] 22. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 16 a 20, em que L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (=O) (OH) VV P (=O) (OH) (em que, W5 representa um grupo derivado de um quinto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado), e [00110] Ly representa um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
[00111] 23. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 16 a 20, em que L e Ly, respectivamente, representam independentemente um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
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16/259 [00112] 24. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 16 a 23, em que m é 0.
[00113] 25. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 14 e 16 a 23, em que m é 1 e o Xz contém pelo menos um ribonucleotídeo.
[00114] 26. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 14, 16 a 23 e 25., em que m é 1, e oXz contém pelo menos quatro nucleotideos contíguos clivados por RNase H.
[00115] 27. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 14 e 16 a 23, em que m é 1, o Xz contém pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado e a sequência nucleotídica Xz contém uma sequência antissenso.
[00116] 28. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 27, contendo ainda um grupo derivado de uma molécula funcional tendo pelo menos uma função selecionada do grupo consistindo em uma função de marcação, uma função de purificação e uma função de entrega no sítio alvo.
[00117] 29. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 28, em que a molécula funcional é selecionada do grupo consistindo em açúcares, lipídios, peptídeos, proteínas e derivados dos mesmos.
[00118] 30. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 28 ou 29, em que a molécula funcional é um Hpídio selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol e tocotrienol.
[00119] 31. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 28 ou 29, em que a molécula funcional é um derivado de açúcar que interage com um receptor de asialoglicoproteína.
[00120] 32. O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 28 ou 29, em que a molécula funcional é um peptídeo ou proteína selecionados do grupo consistindo em ligantes de receptor e anticorpos.
[00121] 33. Uma composição farmacêutica contendo o oligonucleo
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17/259 tídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 32, e um veículo farmacologicamente aceitável.
[00122] 34. Um método para controlar a função de um RNA alvo, incluindo uma etapa de colocar o oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 32 em contato com uma célula.
[00123] 35. Um método para controlar a função de um RNA alvo em um mamífero, incluindo uma etapa para administrar uma composição farmacêutica contendo o oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 32 no mamífero.
[00124] 36. Um método para controlar a expressão de um gene alvo, incluindo uma etapa para colocar o oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 32 em contato com uma célula.
[00125] 37. Método para controlar a expressão de um gene alvo em um mamífero, incluindo uma etapa para administrar uma composição farmacêutica contendo o oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 32 no mamífero.
[00126] 38. Método para produzir o oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1 a 32, incluindo uma etapa para alongamento da fita nucleotidica na extremidade 3’ ou na extremidade 5’ de um oligonucleotídeo contendo pelo menos um de X, L e Y.
Efeitos da Invenção [00127] De acordo com a presente invenção, um oHgonucleotídeo pode ser fornecido que é capaz de controlar a expressão de um gene alvo com alta eficiência. Adicionalmente, pode ser fornecido um oHgonucleotídeo que pode ser produzido mais facilmente do que um oligonucleotídeo de fita dupla (como um HDO ou HCDO).
[00128] O oHgonucleotídeo de fita simples da presente invenção é capaz de controlar eficazmente a expressão de um gene alvo por um constituinte do mesmo na forma de um oligonucleotídeo antissenso, e é útil como um fármaco de ácido nucleico.
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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [00129] A Figura 1 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y2 de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00130] A Figura 2 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y2 de um exempio da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00131] A Figura 3 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y2 de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00132] A Figura 4 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y2 de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00133] A Figura 5 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y° de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00134] A Figura 6 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y° de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples
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19/259 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00135] A Figura 7 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y° de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00136] A Figura 8 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y° de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, e Yz contendo uma porção da sequência antissenso e uma terceira porção da sequência nucleotidica Xz2 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00137] A Figura 9 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y° de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, e Yz contendo uma porção da sequência antissenso e uma terceira porção da sequência nucleotidica Xz2 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00138] A Figura 10 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y2 de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00139] A Figura 11 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotidica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotidica Y° de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
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20/259 [00140] A Figura 12 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que X e uma segunda porção de sequência nucleotídica Y2 de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00141] A Figura 13 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que X e uma segunda porção de sequência nucleotídica Y2 de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00142] A Figura 14 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que X e uma segunda porção de sequência nucleotídica Y2 de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00143] A Figura 15 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que X e uma segunda porção de sequência nucleotídica Y° de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00144] A Figura 16 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que uma primeira porção da sequência nucleotídica X2 e uma segunda porção da sequência nucleotídica Y° de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00145] A Figura 17 é um diagrama conceituai que representa um aspecto em que X e uma segunda porção de sequência nucleotídica Y° de um exemplo da presente modalidade na forma de um oligonucleotídeo de fita simples se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
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21/259 [00146] A Figura 18 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos de fita simples de acordo com a presente modalidade no nível de expressão de PTEN em células derivadas de hepatoma humano.
[00147] A Figura 19 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos de fita simples de acordo com a presente modalidade no nível de expressão de PTEN em células derivadas de hepatoma humano.
[00148] A Figura 20 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos no nível de expressão de PTEN em células derivadas de hepatoma humano.
[00149] A Figura 21 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos no nível de expressão de ApoB em células derivadas de hepatoma humano.
[00150] A Figura 22 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos de fita simples de acordo com a presente modalidade no nível de expressão de PTEN em células derivadas de hepatoma humano.
[00151] A Figura 23 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos de fita simples de acordo com a presente modalidade no nível de expressão de ApoB em células derivadas de hepatoma humano.
[00152] A Figura 24 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos de fita simples de acordo com a presente modalidade no nível de expressão de PTEN em células derivadas de hepatoma humano.
[00153] A Figura 25 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos de fita simples de acordo com a presente modalidade no nível de expressão de ApoB em células derivadas de hepatoma humano.
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22/259 [00154] A Figura 26 indica os resultados da eietroforese em gel de nucleotideos de fita simples de acordo com a presente modalidade antes e depois do tratamento de hibridização.
[00155] A Figura 27 indica os resultados da eietroforese em gel de nucleotideos de fita simples de acordo com a presente modalidade antes e depois do tratamento de hibridização.
[00156] A Figura 28 indica os resultados da eietroforese em gel de nucleotideos de fita simples de acordo com a presente modalidade antes e depois do tratamento de hibridização.
[00157] A Figura 29 indica os resultados da eietroforese em gel de nucleotideos de fita simples de acordo com a presente modalidade antes e depois do tratamento de hibridização.
[00158] A Figura 30 é um gráfico que indica os efeitos no nível de expressão de ApoB no fígado de camundongos C57BL/6J aos quais foi administrado um oligonucleotide© de fita simples de acordo com a presente modalidade.
[00159] A Figura 31 é um gráfico que indica os efeitos no nível de colesterol total no plasma no fígado de camundongos C57BL/6J aos quais foi administrado um oligonucleotídeo de fita simples de acordo com a presente modalidade.
[00160] A Figura 32 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos de fita simples de acordo com a presente modalidade no nível de expressão de PTEN em células derivadas de hepatoma humano.
[00161] A Figura 33 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos de fita simples de acordo com a presente modalidade no nível de expressão de PTEN em células derivadas de hepatoma humano.
[00162] A Figura 34 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos de fita simples de acordo com a presente modalidade no
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23/259 nível de expressão de Aldolase A em células derivadas de hepatoma humano.
[00163] A Figura 35 é um gráfico que indica os efeitos no nível de expressão de ApoB no fígado de camundongos C57BL/6J aos quais foi administrado um oligonucleotides de fita simples de acordo com a presente modalidade.
[00164] A Figura 36 é um gráfico que indica os efeitos no nível de colesterol total no plasma no fígado de camundongos C57BL/6J aos quais foi administrado um oligonucleotídeo de fita simples de acordo com a presente modalidade.
[00165] A Figura 37 é um gráfico que indica os efeitos de oligonucleotídeos no nível de expressão de PTEN em células derivadas de hepatoma humano.
[00166] A Figura 38 é um gráfico que indica os efeitos no nível de expressão de ApoB no fígado de camundongos C57BL/6J aos quais foi administrado um oligonucleotídeo de fita simples de acordo com a presente modalidade.
[00167] A Figura 39 é um gráfico que indica os efeitos no nível total de colesterol no plasma de camundongos C57BL/6J aos quais foi administrado um oligonucleotídeo de fita simples de acordo com a presente modalidade.
[00168] A Figura 40 é um gráfico que indica efeitos no nível de expressão de SRB1 no fígado de camundongos C57BL/6J aos quais foi administrado um oligonucleotídeo de fita simples de acordo com a presente modalidade.
MELHOR MODO PARA REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO [00169] Os termos utilizados na presente descrição são utilizados no senso em que são normalmente utilizados na técnica, a menos que especificamente indicado de outro modo. O que se segue fornece uma explicação dos termos usados na presente descrição. Além disso, os
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24/259 termos utilizados na presente descrição têm o mesmo significado, tanto no caso em que são utilizados sozinhos como no caso de serem utilizados em conjunção com outros termos, salvo indicação em contrário.
[00170] Efeito antissenso refere-se ao controle da função de um RNA alvo por hibridização de um RNA alvo selecionado correspondente a um gene alvo e, por exemplo, um oligonucleotídeo tendo uma sequência complementar a uma sequência parcial do mesmo. Por exemplo, no caso do RNA alvo ser mRNA, um efeito antissenso refere-se a tradução do RNA alvo mencionado acima sendo inibido por hibridização, um efeito que converte uma função de junção como o salto do éxon ou o RNA alvo mencionado acima degradado como resultado do reconhecimento de uma porção hibridizada. Embora exemplos de oligonucleotídeos em que o efeito antissenso mencionado acima seja demonstrado incluem DNA e oligodesoxirribonucleotídeos, os oligonucleotídeos nos quais um efeito antissenso é demonstrado não são limitados a eles, mas podem ser RNA, oligombonucleotídeos ou oligonucleotídeos que foram projetados para demonstrar normalmente uma função antissenso.
[00171] RNA alvo refere-se a mRNA, precursor de mRNA ou ncRNA e inclui mRNA transcrito a partir de DNA genômico que codifica um gene alvo, mRNA não submetido à modificação de base, e precursor de mRNA e ncRNA que não foram submetidos a processamento. Não existem limitações particulares no RNA alvo para o qual a função do mesmo é controlada por um efeito antissenso, e os exemplos dos mesmos incluem RNA associado a genes para os quais a expressão aumenta em várias doenças. O RNA alvo pode ser qualquer RNA sintetizado por RNA polimerase dependente de DNA e é, de preferência, precursor de mRNA ou mRNA. O RNA alvo é, com mais preferência, um mRNA ou precursor de mRNA de mamífero e, ainda
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25/259 com mais preferência, mRNA ou precursor de mRNA humano.
[00172] Hibridizar refere-se ao ato de formar uma fita dupla entre oligonucleotídeos contendo sequências ou grupos complementares derivados desses oligonucleotídeos e constitui um fenômeno em que os oligonucleotídeos contendo sequências ou grupos complementares derivados desses oligonucleotídeos formam uma fita dupla.
[00173] Complementar refere-se a duas bases de ácidos nucleicos sendo capazes de formar um par de bases de Watson-Crick (par de bases de ocorrência natural) ou um par de bases não Watson-Crick (como um par de bases de Hoogsteen) através de ligações de hidrogênio. Dois oligonucleotídeos ou grupos derivados desses oligonucleotídeos são capazes de hibridizar” no caso das suas sequências serem complementares. Embora não seja necessário que as sequências sejam completamente complementares para que dois oligonucleotídeos ou grupos derivados desses oligonucleotídeos se hibridizem, a complementaridade para dois oligonucleotídeos ou grupos derivados desses oligonucleotídeos se hibridizarem é, de preferência, 70% ou mais, com mais preferência, 80% ou mais e, ainda com mais preferência, 90% ou mais (como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais). A complementaridade da sequência pode ser determinada utilizando um programa de computador que identifica automaticamente as sequências parciais dos oligonucleotídeos. Um exemplo de software usado para esse propósito é, por exemplo, o OligoAnalyzer disponível na Integrated DNA Technologies. Este programa também pode ser acessado online em um sítio da internet. Um versado na técnica é, portanto, capaz de determinar facilmente condições (como temperatura ou concentração de sais) para permitir a hibridização de dois oligonucleotídeos ou grupos derivados desses oligonucleotídeos. Além disso, um versado na técnica pode conceber facilmente um oligonucleotídeo antissenso complementar ao RNA alvo, por exemplo, utilizando software
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26/259 como o programa BLAST com base na informação dos dados da sequência nucleotidica do RNA alvo. Literatura como Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America (1990, Vol. 87, pp. 2264-2268; 1993, Vol. 90, pp. 5873-5877) e o Journal of Molecular Biology (1990, Vol. 215, p. 403) podem ser referidas em relação ao programa BLAST.
[00174] Um nucleotídeo refere-se a uma molécula capaz de servir como uma unidade estrutural de um ácido nucleico (oligonucleotídeo), e normalmente tem uma base como seus constituintes. Um nucleotídeo é composto, por exemplo, por um açúcar, uma base e um ácido fosfórico. Os nucleotídeos incluem desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, mencionados posteriormente.
[00175] Um oligonucleotídeo refere-se a uma molécula que tem uma estrutura na qual um ou mais nucleotídeos mencionados acima são polimerizados. Quando o oligonucleotídeo é composto de um nucleotídeo, esse oligonucleotídeo também pode ser chamado de nucleotídeo.
[00176] Os nucleotídeos contidos na molécula de oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção são cada um independentemente ligados um ao outro por uma ligação fosfodiéster, uma ligação fosfodiéster modificada mencionada depois ou um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica mencionada depois. O nucleotídeo na extremidade 3’ da molécula de oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção tem, de preferência, um grupo hidroxila ou um grupo fosfato na posição 3’, com mais preferência, tem um grupo hidroxila e normalmente tem um grupo hidroxila. O nucleotídeo na extremidade 5’ da molécula de oligonucleotídeo de fita simples tem, de preferência, um grupo hidroxila ou um grupo fosfato na posição 5’, com mais preferência, tem um grupo hidroxila e normalmente tem um grupo
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27/259 hidroxila.
[00177] Um grupo derivado de um oligonucleotídeo refere-se à estrutura parcial de um oligonucleotídeo formado pela remoção de um átomo de hidrogênio ou grupo hidroxila e similares de pelo menos um dos grupos hidroxila na extremidade 3’ ou na extremidade 5’ do oligonucleotídeo mencionado acima, e acoplado com o outro grupo (por exemplo, um grupo de ligação, ou outros grupos derivados de um oligonucleotídeo) diretamente ou por formação ou ligação fosfodiéster ou uma ligação fosfodiéster modificada indiretamente através de uma ligação covalente. O grupo hidroxila mencionado acima na extremidade 3’ ou na extremidade 5’ refere-se a um grupo hidroxila possuído por um grupo fosfato (incluindo um grupo fosfato modificado, como um grupo tiofosfato) além do grupo hidroxila na posição 3’ ou posição 5’ da porção de açúcar do nucleotídeo. Por exemplo, um grupo no qual um átomo de hidrogênio é removido do grupo hidroxila na extremidade 3’ do oligonucleotídeo e um grupo no qual um grupo hidroxila é removido do grupo fosfato na extremidade 5’ do oligonucleotídeo forma uma ligação fosfodiéster ou uma ligação fosfodiéster modificada.
[00178] Uma sequência de nucleotídeos refere-se à sequência de bases de nucleotídeos que compõem um oligonucleotídeo.
[00179] Uma porção da sequência nucleotídica refere-se a uma estrutura parcial de uma região possuindo a sequência nucleotídica mencionada acima em uma fita oligonucleotídica.
[00180] Na presente descrição, uma sequência nucleotídica contendo ou não contendo um nucleotídeo ou fita oligonucleotídica tem o mesmo significado que a porção da sequência nucleotídica correspondente contendo ou não aquele nucleotídeo ou aquela fita oligonucleotídica. Além disso, a sequência nucleotídica tem o mesmo significado que uma sequência de bases de uma porção da sequência nucleotídica contendo ou não aquele nucleotídeo ou aquela fita oiigonu
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28/259 cleotídica.
[00181] Uma porção de sequência refere-se a uma estrutura parcial de uma fita de oligonucleotideos. Por exemplo, uma porção de sequência contendo nucleotídeos é uma estrutura parcial de uma região de uma fita de oligonucleotideos que contém os nucleotídeos.
[00182] Uma sequência nucleotidica, sendo uma sequência selecionada de nucleotídeos ou uma sequência de nucleotídeos contíguos, tem o mesmo significado que a porção da sequência nucleotidica correspondente, sendo uma porção de sequência selecionada entre aqueles nucleotídeos ou uma porção sequencial de nucleotídeos contíguos, respectivamente.
[00183] Um desoxirribonucleotídeo refere-se a uma molécula na qual entre os nucleotídeos mencionados acima, o açúcar é 2’desoxirribose, uma base é ligada a um átomo de carbono na posição T da 2’-desoxirribose, e um grupo fosfato está ligado à posição 3’ ou posição 5’. O desoxirribonucleotídeo na presente invenção pode ser um desoxirribonucleotídeo de ocorrência natural ou um desoxirribonucleotídeo em que a porção de base ou porção de ligação fosfodiéster do desoxirribonucleotídeo de ocorrência natural é modificada. A modificação da porção de base e a modificação da porção de ligação fosfodiéster podem ser realizadas em combinação de dois ou mais tipos em um único desoxirribonucleotídeo. O desoxirribonucleotídeo modificado mencionado acima é descrito, por exemplo, no Journal of Medical Chemistry (2016, Vol. 59, No. 21, pp. 9645-9667), Medical Chemistry Communications (2014, Vol. 5, pp. 1454-1471) and Future Medicinal Chemistry (2011, Vol. 3, No. 3, pp. 339-365).
[00184] Quando o desoxirribonucleotídeo mencionado acima compõe a molécula oligonucleotídica de fita simples da presente invenção, normalmente a posição 3’ do desoxirribonucleotídeo é acoplada a outro nucleotídeo ou a um grupo de ligação através de uma liga
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29/259 ção fosfodiéster ou de uma ligação fosfodiéster modificada (por exemplo, uma ligação fosforotioato), e a posição 5’ do desoximbonucleotídeo é acoplada a outro nucleotideo ou a um grupo de ligação através de uma ligação fosfodiéster ou de uma ligação fosfodiéster modificada (por exemplo, uma ligação fosforotioato). O desoximbonucleotídeo na extremidade 3’ da molécula de oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção tem, de preferência, um grupo hidroxila ou um grupo fosfato na posição 3’, e a posição 5’ é como anteriormente descrita. O desoxirribonucleotídeo na extremidade 5’ da molécula de oligonucleotídeo de fita simples tem, de preferência, um grupo hidroxila ou um grupo fosfato na posição 5’, e a posição 3’ é como anteriormente descrita.
[00185] Um oligodesoxirribonucleotídeo refere-se a um oligonucleotídeo que é composto dos desoxirribonucleotídeos mencionados acima. Os desoxirribonucleotídeos que compõem o oligodesoxirribonucleotídeo podem ser iguais ou diferentes.
[00186] DNA refere-se a um oligonucleotídeo que é composto por desoxirribonucleotídeos de ocorrência natural. Os desoxirribonucleotídeos de ocorrência natural que compõem o DNA podem ser iguais ou diferentes.
[00187] Um grupo desoxirribonucleosídeo refere-se a um grupo no qual uma base está ligada a um átomo de carbono na posição 1’ da 2’desoxirribose, e grupos hidroxila na posição 3’ e na posição 5’ de 2’ desoxirribose são removidos. Uma porção de base do grupo desoxirribonucleosídeo na presente invenção pode ser uma base de ocorrência natural ou uma base na qual uma base de ocorrência natural foi modificada. A modificação da porção de base mencionada acima pode ser realizada em uma combinação de uma pluralidade de tipos de modificações em um grupo desoxirribonucleosídeo simples. A modificação mencionada acima é descrita, por exemplo, no Journal of Medical
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Chemistry (2016, Vol. 59, No. 21, pp. 9645-9667), Medical Chemistry Communications (2014, Vol. 5, pp. 1454-1471) and Future Medicinal Chemistry (2011, Vol. 3, No. 3, pp. 339-365).
[00188] Um ribonudeotídeo refere-se a uma molécula em que urn açúcar é ribose no nudeotideo mencionado acima, uma base é ligada a um átomo de carbono na posição Γ da ribose, e um grupo fosfato está na posição 3’ ou na posição 5’. O ribonudeotídeo na presente invenção pode ser um ribonudeotídeo de ocorrência natural ou um ribonucleotídeo no qual uma porção de base ou uma porção de ligação fosfodiéster do ribonudeotídeo de ocorrência natural é modificada. A modificação da porção de base ou modificação da porção de ligação fosfodiéster pode ser realizada em uma combinação de uma pluralidade de tipos de modificações em um único ribonudeotídeo. O ribonudeotídeo modificado mencionado acima é descrito, por exemplo, no Journal of Medical Chemistry (2016, Vol. 59, No. 21, pp. 9645-9667), Medical Chemistry Communications (2014, Vol. 5, pp. 1454-1471) e Future Medicinal Chemistry (2011, Vol. 3, No. 3, pp. 339-365).
[00189] Quando o ribonudeotídeo mencionado acima compõe a molécula de oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção, tipicamente a posição 3’ do ribonudeotídeo é acoplada a outro nucleotideo ou a um grupo de ligação através de uma ligação fosfodiéster ou de uma ligação fosfodiéster modificada (por exemplo, uma ligação fosforotioato), e a posição 5’ do ribonudeotídeo é acoplada a outro nucleotide© ou a um grupo de ligação através de uma ligação fosfodiéster ou de uma ligação fosfodiéster modificada (por exemplo, uma ligação fosforotioato). O ribonudeotídeo na extremidade 3’ da molécula de oiigonucleotídeo de fita simples da presente invenção tem, de preferência, um grupo hidroxila ou um grupo fosfato na posição 3’ do mesmo, e a posição 5’ é como anteriormente descrita. O ribonudeotídeo na extremidade 5’ da molécula de oligonucleotídeo de fita simples tem, de
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31/259 preferência, um grupo hidroxila ou um grupo fosfato na posição 5’, e a posição 3’ é como anteriormente descrita.
[00190] Um oligorribonucleotídeo refere-se a um oligonucleotídeo que é composto do ribonucleotide© mencionado acima. O ribonucleotídeo que compõe o oligorribonucleotideo pode ser o mesmo ou diferente.
[00191] RNA refere-se a um oligonucleotídeo que é composto por ribonucleotídeos de ocorrência natural. Os ribonucieotideos de ocorrência natural e que compõem o RNA podem ser iguais ou diferentes.
[00192] Um grupo ribonucleosídeo refere-se a um grupo no qual uma base está ligada a um átomo de carbono na posição T da ribose, e os grupos hidroxila na posição 3’ e na posição 5’ da ribose são removidos. A porção de base no grupo ribonucleosídeo da presente invenção pode ser uma base de ocorrência natural ou uma base na qual a base de ocorrência natural é modificada. A modificação da porção de base mencionada acima pode ser realizada em uma combinação de uma pluralidade de tipos de modificações em um grupo de ribonucleotídeos simples. A modificação mencionada acima é descrita, por exemplo, no Journal of Medical Chemistry (2016, Vol. 59, No. 21, pp. 9645-9667), Medicinal Chemistry Communications (2014, Vol. 5, 14541471), Future Medicinal Chemistry (2011, Vol. 3, No. 3, pp. 339-365).
[00193] Nucleotideo com açúcar modificado refere-se a urn nucleotideo no qual a porção açúcar do desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo mencionado acima é parcialmente substituído por um ou mais substituintes, toda a sua estrutura de açúcar foi substituída por uma estrutura de açúcar diferente de ribose e 2’-desoxirribose (por exemplo, uma fita principal de açúcar de 5 ou 6 membros, como hexitol e treose), toda a fita principal do açúcar ou uma porção do anel da fita principal do açúcar foi substituída por um anel saturado ou insaturado de 5 a 7 membros associados (por exemplo, ciclo-hexano, ciclo
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32/259 hexeno, morfolina e similares) ou com uma estrutura parcial (por exemplo, estrutura peptídica) que permite a formação de um anel de 5 a 7 membros por ligação de hidrogênio, ou a o anel da porção açúcar é um anel aberto, ou ainda, a porção de anel aberto é modificada. Uma porção de base de um nucleotídeo com açúcar modificado pode ser uma base de ocorrência natural ou uma base modificada. Além disso, uma porção de ligação fosfodiéster de um nucleotídeo com açúcar modificado pode ser uma ligação fosfodiéster ou uma ligação fosfodiéster modificada. A modificação de uma porção da base ou modificação de uma porção de ligação fosfodiéster em um nucleotídeo com açúcar simples modificado pode ser realizada em uma combinação de uma pluralidade de tipos de modificações. A modificação da porção de anel aberto mencionada acima pode incluir, por exemplo, halogenação, alquilação (por exemplo, metilação e etilação), hldroxilação, aminação e tionação assim como desmetilação.
[00194] Um nucleotídeo com açúcar modificado pode ser um nucleotídeo em ponte ou nucleotídeo não ponte. Exemplos de nucleotídeos com açúcar modificado incluem nucleotídeos descritos como sendo preferenciais para utilização em um método antissenso, por exemplo, na Publicação de Patente Japonesa Não Examinada n° H10304889, Publicação Internacional n° WO 2005/021570, Publicação de Patente Japonesa Não Examinada n° H10-195098, Tradução Japonesa do Pedido PCT n° 2002-521310, Publicação Internacional n° WO 2007/143315, Publicação Internacional n° WO 2008/043753, Publicação Internacional n° WO 2008/029619 ou Publicação Internacional n° 2008/049085 (estes documentos devem ser coletivamente referidos como documentos relacionados ao método antissenso). Os documentos mencionados acima revelam nucleotídeos como nucleotídeos de hexitol (HNA), nucleotídeos de ciclo-hexeno (CeNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), nucleotídeos
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33/259 de treose (TNA), ácidos nucléicos de morfolino, triciclo-DNA (tcDNA ), 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-MOE (2’-O-metoxietil) nucleotídeos, 2’-AP (2’-O-aminopropil) nucleotídeos, 2’~fluoronucleotideos, 2’-F~arabinonuoleotideos (2’-F-ANA), nucleotídeos em ponte (BNA (Ácido Nucleico em Ponte)) e 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos (MCE). Além disso, nucleotídeos com açúcar modificado também são revelados na literatura, como o Journal of Medical Chemistry (2016, Vol. 59, No. 21, pp. 9645-9667), Medicinal Chemistry Communications (2014, Vol. 5, 14541471) ou Future Medicinal Chemistry (2011, Vol. 3, No. 3, pp. 339365).
[00195] Quando o nucleotídeo com açúcar modificado mencionado acima compõe a molécula oligonucleotídica de fita simples da presente invenção, por exemplo, a posição 3’ do nucleotídeo com açúcar modificado é acoplada a outro nucleotídeo ou a um grupo de ligação através de uma ligação fosfodiéster ou ligação fosfodiéster modificada (por exemplo, uma ligação fosforotioato) e a posição 5’ do nucleotídeo com açúcar modificado é acoplada a outro nucleotídeo ou a um grupo de ligação através de uma ligação fosfodiéster ou ligação fosfodiéster modificada (por exemplo, uma ligação fosforotioato). Um nucleotídeo com açúcar modificado na extremidade 3’ da molécula de oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção tem, de preferência, por exemplo, um grupo hidroxila ou um grupo fosfato na posição 3’ do mesmo, e a posição 5’ é como anteriormente descrita. Um nucleotídeo com açúcar modificado na extremidade 5’ do oligonucleotídeo de fita simples tem, de preferência, por exemplo, um grupo hidroxila ou um grupo fosfato na sua posição 5’ e a posição 3’ é como anteriormente descrito.
[00196] As porções de base em um desoxirribonucleotídeo, ribonucleotídeo e nucleotídeo com açúcar modificado são, de preferência, pelo menos um tipo selecionado do grupo consistindo em adenina (A),
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34/259 guanina (G), timina (T), citosina (C), uracila ( U) e 5’-metilcitosina (5me-C).
[00197] Exemplos de modificações de uma porção de base em urn desoxirribonucleotideo, ribonucleotide© e nucleotideo com açúcar modificado incluem halogenação, metilação, etilaçâo, n-propilaçâo, isopropilação, ciclopropilação, n~butilação, isobutilação, s~butilação, t-butilação, ciclobutilaçâo, hidroxilaçâo, aminação, tionaçâo e desmetilação. Exemplos específicos incluem 5-metilação, 5-fluoração, 5-brominação, 5-iodinação e N4-metilação da citosina, 2-tionação, 5-desmetilação, 5fluoração, 5-brominação e 5-iodinação de timina, 2-tionaçâo, 5-fluoração, 5~bromação e 5-iodinação de uracila, N6-metilação e 8~bromição de adenina, e N2-metilação e 8-brominação de guanina. Adicionalmente, exemplos de modificação de porções de açúcar em nucleotideos são revelados no Journal of Medicinal Chemistry (2016, Vol. 59, No. 21, pp. 9645-9667), Medicinal Chemistry Communications (2014, Vol. 5, 1454-1471) e Future Medicinal Chemistry (2011, Vol. 3, No. 3, pp. 339-365), e estes podem ser utilizados nas porções de bases de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado.
[00198] Exemplos de modificação de uma porção de ligação fosfodiéster (porção de fosfato) em desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado incluem fosforotioação, metilfosfonação (incluindo metilfosfonação quiral), metiltiofosfonação, fosforoditioaçâo, fosforamidação, fosforodiamidação, fosforoamidotioação e boranofosforilação. Além disso, exemplos da modificação da porção de ligação fosfodiéster em nucleotideos são descritos, por exemplo, no Journal of Medical Chemistry (2016, Vol. 59, No. 21, pp. 9645-9667), Medical Chemistry Communications (2014, Vol. 5, pp. 1454-1471) θ Future Medicinal Chemistry (2011, Vol. 3, No. 3, pp. 339365), e estes podem ser utilizados na porção de ligação fosfodiéster
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35/259 em desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado.
[00199] Exemplos de modificações nas quais uma unidade de açúcar de um desoxirribonudeotídeo ou ribonudeotídeo pardalmente substituída por um substituinte simples incluem 2’-O-metilação, 2’-Ometoxietilação (MOE), 2!-O-aminopropilação (AP) , 2’-fluoração e 2’-O{(N-metilcarbamoil)etil}ação (MCE).
[00200] Um nucleotídeo em ponte refere-se a um nucleotídeo com açúcar modificado no qual uma unidade de ponte foi substituída por substituições em dois locais em uma porção de açúcar, e um exemplo do mesmo inclui nucleotideos que foram ligados em ponte na posição 2’ e na posição 4’.
[00201] Um nucleotídeo que tenha sido ligado na posição 2’ e na posição 4’ (2 ζ,4’~ΒΝΑ) só é necessário ser um nucleotídeo tendo uma porção de açúcar na qual o átomo de carbono na posição 2’ e o átomo de carbono na posição 4’ são ligados em ponte com dois ou mais átomos, e os exemplos incluem nudeotídeos tendo uma porção de açúcar que foi ligada a um grupo alquileno C2-6 (em que 0 grupo alquileno é não substituído ou substituído com um ou mais substituintes selecionados do grupo que consiste em um átomo de halogênio, um grupo oxo e um grupo tioxo, e um ou dois grupos metileno do grupo alquileno não são substituídos ou são substituídos independentemente por um grupo selecionado do grupo consistindo em -O-, -NR1- (em que, R1 representa um átomo de hidrogênio, grupo alquila C1-6 ou um grupo haloalquila C1-6) e S-).
[00202] Os grupos que ligam a posição 2’ e a posição 4’ de 2’, 4’BNA combinando as substituições mencionadas adma e as substituições podem conter um grupo representado por -C(=O)-O-, -O-C(=O)NR1- (em que, R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-β), “C(=O)-NR1- (em que, R1 repre
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36/259 senta um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-e) ou -C(=S)-NR1- (em que, R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquiia C1-6 ou um grupo halo-alquila Cve). Neste pedido, um nucieotídeo com açúcar modificado contendo -C(=S)-NR1pode ser sintetizado a partir de um nucieotídeo com açúcar modificado contendo -C(™O)-NR1~ ou um intermediário do mesmo usando um reagente de tiocarbonilação (como o reagente de Lawesson) e a realização de uma reação de proteção e uma reação de desproteção conforme necessário.
[00203] Exemplos de tal BNA incluem Ácido Nucleico Bloqueado □ também referido como LNA, a-L-metilenóxi(4,-CH2~O-2!)BNA ou β-Dmetilenóxi(4’-CH2-O-2’)BNA, etilenóxi(4’-(CH2)2-O-2’)BNA também referido como ENA, p-D-tio(4’-CH2-S-2’)BNA, aminóxi(4’-CH2-O-N(R11)2’)BNA (em que, R11 representa H ou CH3), oxiamino(4’-CH2~N(R12)-O~ 2’)BNA também referido como 2’,4’-BNANC (em que, R12 representa H ou CH3), 2’,4’-BNAcoc, 3’-amino-2’,4’-BNA, 5’-metil BNA, (4’-CH(CH3)O-2’)BNA também referido como CET-BNA, (4!-CH(CH2OCH3)-O2’)BNA também referido como CMOE-BNA, BNA de tipo amida (4!C(=O)-N(R13)~2’)BNA (em que, R13 representa H ou CH3), também referido como AmNA, e outros BNA conhecidos pelos versados na técnica.
[00204] Um nucieotídeo do qual pelo menos uma de uma porção de açúcar, porção da base e porção de fosfato foi modificada referese a um desoxirribonucleotídeo, no qual pelo menos uma da porção da base e da porção de fosfato de um desoxirribonucleotídeo de ocorrência natural foi modificado, um ribonucleotídeo em que pelo menos uma de uma porção da base e porção de fosfato de um ribonucleotídeo de ocorrência natural foi modificada, ou um nucieotídeo com açúcar modificado.
[00205] n- refere-se a normal, s- secundário, i- iso e t terciá
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37/259 rio.
[00206] Um átomo de halogêneo refere-se a um átomo de flúor, um átomo de cloro, um átomo de bromo ou um átomo de iodo.
[00207] Um grupo alquila Ci-e refere-se a um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado possuindo 1 a 6 átomos de carbono, e os exemplos do mesmo incluem um grupo metila, um grupo etila, um grupo n-propila, um grupo isopropila, um grupo n-butila, um grupo isobutila, um grupo s-butila, um grupo t-butila, um grupo n-pentila, um grupo isopentíla, um grupo neopentila, um grupo n-hexila e um grupo iso-hexila. Na presente descrição, Me refere-se à metila, Et etila e Pr propila.
[00208] Um grupo halo-alquila Ci-e refere-se a um grupo no qual um átomo de hidrogênio em uma posição opcional do grupo alquila C1-6 mencionado acima é substituído por um ou mais dos átomos de halogêneo mencionados acima.
[00209] Um grupo alquileno Ci-δ refere-se a um grupo divalente no qual um átomo de hidrogênio em uma posição opcional é removido de um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado tendo 1 a 6 átomos de carbono, e exemplos incluem um grupo metileno, um grupo etileno (etanodiila), um grupo propano~1,3-diila, um grupo propano-2,2diila, um grupo 2,2-dimetil-propano-1,3-diila, um grupo hexano-1,6-diila e um grupo 3-metilbutano-1,2-diila.
[00210] Um grupo alquileno C2-6 refere-se a um grupo divalente linear ou ramificado possuindo 2 a 6 átomos de carbono entre 0 grupo alquileno Ci-e mencionado acima, e os exemplos dos mesmos são os mesmos que 0 grupo alquileno Ci e mencionados acima com exceção do grupo metileno.
[00211] Um grupo alquileno C2-20 refere-se a um grupo divalente no qual um átomo de hidrogênio em uma posição opcional é removido de um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado possuindo 2
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38/259 a 20 átomos de carbono. Similarmente, um grupo alquileno Ca-12 refere-se a um grupo divalente no qual um átomo de hidrogênio em uma posição opcional é removido de um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado tendo 8 a 12 átomos de carbono, e um grupo alquileno C2-50 refere-se a um grupo divalente no qual um átomo de hidrogênio em uma posição opcional é removido de um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado tendo 2 a 50 átomos de carbono. [00212] Um grupo alquenileno C2-20 refere-se a um grupo divalente no qual um átomo de hidrogênio em uma posição opcional é removido de um grupo hidrocarboneto insaturado linear ou ramificado tendo 2 a 20 átomos de carbono contendo peio menos uma ligação dupla.
[00213] Um grupo alcóxi Ci-δ refere-se a um grupo no qual 0 grupo alquila C1-6 mencionado acima está ligado a um grupo óxi, e exemplos dos mesmos incluem um grupo metóxi, um grupo etóxi, um grupo n-propóxi, um grupo isopropóxi, um grupo n-butóxi, um grupo ibutóxi, um grupo s-butóxi, um grupo t-butóxi, um grupo n-pentilóxi, um grupo isopentilóxi, um grupo neopentilóxi, um grupo n~hexiióxi e um grupo iso-hexilóxi.
[00214] Um grupo monoalquilamino C1-6 refere-se a um grupo em que 0 grupo alquila C1-6 mencionado acima está ligado a um grupo amino, e exemplos do mesmo incluem um grupo metilamino, um grupo etilamino, um grupo n-propilamino, um grupo isopropilamino, um grupo n~butilamino, um grupo isobutilamino, um grupo s-butilamino, um grupo t-butilamino, um grupo n-pentilamino, um grupo isopentilamino, um grupo neopentilamino, um grupo n-hexilamino e um grupo isohexilamino.
[00215] Um grupo dialquilamino C1-6 refere-se a um grupo em que os mesmos ou diferentes dois grupos alquila Ci-β mencionados acima estão ligados a um grupo amino, e os exemplos do mesmo incluem um grupo dimetilamino, um grupo dietilamino, um grupo di-n-propilamino,
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39/259 um grupo di-isopropilamino, um grupo di-n-butilamino, um grupo di-npentilamino, um grupo di-n-hexilamino, um grupo N-metil-N-etilamino e um grupo N-metil-N-isopropilarnino.
[00216] Um grupo alquilcarbonila Ci-β, um grupo haloalquilcarbonila Οι-s, um grupo alcoxicarbonila Ci-β, um grupo monoalquilaminocarbonila Ci-β e um grupo dialquilaminocarbonila Ci-β cada um se refere a um grupo no qual o grupo alquila Ci-β mencionado acima, grupo haloalquila Ci-δ, grupo alcoxila Ci-e, grupo monoalquilamino C1-6 e grupo dialquilamino Ci e estão cada um ligados a um grupo carbonila (-0(0)-).
[00217] Um grupo alquilsulfonila Ci-e, um grupo halo-alquilsulfonila Ci-6, um grupo alcoxisulfonila Ci-©”, um grupo monoalquilaminossulfonila Ci-δ e um grupo dialquilaminossulfonila Ci-e cada um se refere a um grupo no qual o grupo alquila Ci-β mencionado acima, grupo haloalquila Ci-e, grupo alcoxila Ci-e, grupo monoalquilamino Ci-δ e grupo dialquilamino Ci-s estão cada um ligados a um grupo sulfonila (-S(O)z-).
[00218] Um grupo oxo indica um grupo em que um átomo de oxigênio é substituído através de uma ligação dupla (=O). No caso de um grupo oxo ser substituído por um átomo de carbono, o grupo oxo forma um grupo carbonila em conjunto com o átomo de carbono.
[00219] Um grupo tioxo indica um grupo em que um átomo de oxigênio é substituído através de uma ligação dupla (=S). No caso de um grupo tioxo ser substituído por um átomo de carbono, o grupo tioxo forma um grupo tiocarbonila em conjunto com o átomo de carbono.
[00220] O nucleotideo com açúcar modificado não está limitado ao exemplificado neste pedido. Numerosos nucleotídeos com açúcar modificado são conhecidos neste campo da técnica, e nucleotídeos com açúcar modificado descritos, por exemplo, na Patente US n° 8.299.039, concedida a Tachas et al. (e particularmente as colunas 17 a 22), ou o
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Journal of Medicinal Chemistry (2016, Vol. 59, No. 21, 9645-9667), Medicinal Chemistry Communications (2014, Vol. 5, pp. 1454-1471) ou Future Medicinal Chemistry (2011, Vol. 3, No. 3, pp. 339-365), também podem ser utilizados como modalidades da presente invenção.
[00221] Um versado na técnica é capaz de selecionar e usar adequadamente um nucleotídeo com açúcar modificado entre esses nucleotídeos com açúcar modificado levando em consideração pontos de vista como efeito antissenso, afinidade para uma sequência parcial de um RNA alvo ou resistência à nuclease.
[00222] RNase H é tipicamente conhecida por ser uma ribonuclease que reconhece uma fita dupla obtida por hibridização de DNA e RNA e cliva o RNA para formar DNA de fita simples. A RNase H é capaz de reconhecer não apenas uma fita dupla obtida por hibridização de DNA e RNA, mas também uma fita dupla em que pelo menos uma da porção da base, porção de ligação fosfodiéster ou porção de açúcar de pelo menos um de DNA e RNA tem foi modificada. Por exemplo, a RNase H pode também reconhecer uma fita dupla obtida por hibridização de um oligodesoxirribonucletídeo e um oligorribonucletídeo.
[00223] Portanto, o DNA pode ser reconhecido pela RNase H quando se hibridiza com o RNA. Isto aplica-se similarmente no caso em que pelo menos uma de uma porção de base, porção de ligação fosfodiéster e porção de açúcar foi modificada em pelo menos um de DNA e RNA. Por exemplo, um exemplo típico do mesmo é um oligonucleotídeo em que uma porção fosfodiéster de DNA foi modificada para fosforotioato.
[00224] O RNA pode ser clivado pela RNase H ao se hibridizar com o DNA. Isto aplica-se similarmente no caso em que pelo menos uma de uma porção de base, porção de ligação fosfodiéster e porção de açúcar foi modificada em pelo menos um de DNA e RNA.
[00225] Exemplos de modificação de DNA e/ou RNA capazes de
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41/259 serem reconhecidos pela RNase H são descritos na literatura, exemplos dos quais incluem Nucleic Acids Research (2014, Vol. 42, No. 8, pp. 5378-5389), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (2008, Vol. 18, pp. 2296-2300), Molecular Biosystems (2009, Vol. 5, pp. 838843), Nucleic Acid Therapeutics (2015, Vol. 25, pp. 266-274) e The Journal of Biological Chemistry (2004, Vol. 279, No. 35, pp. 3631736326).
[00226] A RNase H utilizada na presente invenção é, de preferência, RNase H de mamífero, com mais preferência, RNase H humana e, de um modo particularmente preferencial, RNase H1 humana.
[00227] Embora não existam limitações particulares em pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H, desde que incluam quatro ou mais nucleotideos contíguos e sejam reconhecidos pela RNase H, os nucleotideos contíguos são, de preferência, selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e são, com mais preferência, independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos. Estes nucleotideos contíguos podem ser iguais ou diferentes.
[00228] Embora não existam limitações particulares em pelo menos quatro nucleotideos contíguos clivados por RNase H desde que incluam quatro nucleotideos contíguos e sejam clivados por RNase H, eles incluem pelo menos um ribonucleotídeo. Além disso, os quatro nucleotideos contíguos, de preferência, incluem um oligonucleotídeo e, com mais preferência, incluem RNA. Os nucleotideos contíguos são, com mais preferência, selecionados independentemente dos ribonucleotídeos. Além disso, os nucleotideos contíguos são, com mais preferência, acoplados mutuamente através de uma ligação fosfodiéster. Estes nucleotideos contíguos podem ser iguais ou diferentes.
[00229] Em seguida, o que se segue fornece uma explicação de uma sequência antissenso, porção de sequência antissenso, e porção
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42/259 de sequência de nucleotídeos que se hibridiza com uma sequência antissenso dentro de uma molécula da mesma como usado na presente invenção.
[00230] Uma sequência antissenso refere-se a uma sequência de bases de nucleotídeos que compõem um oligonucleotídeo capaz de se hibridizar com um RNA alvo.
[00231] Uma porção de sequência antissenso refere-se a uma estrutura parcial de uma fita oligonucleotídica em uma região que possui a sequência antissenso mencionada acima.
[00232] Além disso, na presente descrição, uma sequência antissenso contendo ou não contendo um nucleotídeo ou fita oligonucleotídica tem o mesmo significado que a correspondente porção de sequência antissenso contendo ou não contendo o nucleotídeo ou a fita oligonucleotídica. Além disso, a sequência antissenso tem o mesmo significado que uma sequência de base de uma porção de sequência antissenso contendo ou não contendo o nucleotídeo ou a fita oligonucleotídica e similares.
[00233] A porção da sequência antissenso mencionada acima não é necessária para se hibridizar com o RNA alvo completo, mas apenas necessária para se hibridizar com pelo menos uma porção do RNA alvo, e normalmente se hibridiza com pelo menos uma porção do RNA alvo. Por exemplo, a expressão de um gene alvo controlada por um oligonucleotídeo com uma sequência antissenso complementar à sequência parcial do RNA alvo (como DNA, oligodesoximbonucleotídeo ou um oligonucleotídeo concebido de modo a demonstrar normalmente um efeito antissenso) se hibridizando com pelo menos um porção do RNA alvo. Além disso, embora não seja necessário se hibridizar com a totalidade da porção da sequência antissenso e não se hibridizar com uma porção da mesma, é preferencial a hibridização com toda a porção da sequência antissenso.
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43/259 [00234] A complementaridade entre a sequência antissenso mencionada acima e a sequência parcial de RNA alvo é, de preferência, de 70% ou mais, com mais preferência, 80% ou mais e, ainda com mais preferência, 90% ou mais (como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais). Embora não seja necessário que as sequências sejam completamente complementares para que a porção da sequência antissenso se hibridize com pelo menos uma porção do RNA alvo, as sequências são, com mais preferência, completamente complementares.
[00235] A sequência antissenso mencionada acima é, de preferência, uma sequência que contém pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se híbridizarem com RNA alvo, ou uma sequência que contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, mas não contém uma fita ollgonucleotídíca composta por quatro desoxírribonucleotídeos contíguos.
[00236] Um versado na técnica é capaz de determinar facilmente uma sequência de bases compatível com uma sequência antissenso capaz de se hibridizar com o RNA alvo utilizando o programa BLAST e similares. Isso aplica-se similarmente a uma sequência de nucleotídeos compatível com pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se híbridizarem com o RNA alvo.
[00237] Pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se híbridizarem com o RNA alvo são normalmente 4 a 30 nucleotídeos contíguos, de preferência, 4 a 20 nucleotídeos contíguos, com mais preferência, 5 a 16 nucleotídeos contíguos, ainda com mais preferência, 6 a 12 nucleotídeos contíguos e, particularmente preferencialmente, 8 a 10 nucleotídeos contíguos. Os nucleotídeos contíguos mencionados acima são, de preferência, selecionados independentemente de desoxírribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, e, são com mais preferência, selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos. Os nucleotídeos contíguos mencio
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44/259 nados acima são particularmente preferencialmente 8 a 10 desoxirribonucleotídeos contíguos. Estes nudeotídeos contíguos podem ser iguais ou diferentes.
[00238] Além disso, pelo menos um dos nudeotídeos entre os nudeotídeos contíguos é, de preferência, fosforotioado do ponto de vista da farmacocinética superior. Com mais preferência, pelo menos um dos nudeotídeos na extremidade 3’ e na extremidade 5’ destes nudeotídeos contíguos é fosforotioado, e ainda com mais preferência, tanto a extremidade 3’ como a extremidade 5’ são fosforotioadas. Ainda com mais preferência, 80% dos nudeotídeos entre estes nudeotídeos contíguos são fosforotioados, e, ainda com mais preferência, 90% dos nudeotídeos são fosforotioados. Particularmente preferendalmente, todos os nudeotídeos contíguos são fosforotioados.
[00239] No caso, a sequência antissenso é uma sequência que contém pelo menos quatro nudeotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com RNA alvo, 1 a 10 nudeotídeos com açúcar modificado são, de preferência, ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ de pelo menos quatro nudeotídeos contíguos reconhecidos por RNase H ao se hibridizarem com RNA alvo (porção de sequência antissenso) do ponto de vista de afinidade crescente por uma sequência parcial do RNA alvo ou resistência crescente à nuclease, com mais preferência, 1 a 7 nudeotídeos com açúcar modificado estão ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5!, com mais preferência, 2 a 5 nudeotídeos com açúcar modificado estão ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’, e, ainda com mais preferência, 2 a 3 nudeotídeos com açúcar modificado estão ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’. Neste pedido, embora um ou uma pluralidade de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou ambos possam estar contidos entre uma pluralidade de nudeotídeos com açúcar modificado pelo menos em um dos
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45/259 lados 3’ e 5’, a pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado são, de preferência, contíguos. Adicionalmente, um nucleotídeo ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado estão, de preferência, ligados adjacentemente a ambos os lados 3’ e 5’ da porção de sequência antissenso mencionada acima. No caso de uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado estarem ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da porção de sequência antissenso, uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado estão ligados a” refere-se à pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado e uma fita de oligonucleotideos composta por desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos contidos entre a pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado ligados adjacentes. No caso de uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado estar ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’, cada nucleotídeo com açúcar modificado pode ser o mesmo ou diferente.
[00240] Embora uma porção nucleotidica modificada de açúcar ligada a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ de pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H quando hibridando com o RNA alvo mencionado acima pode ou pode não hibridizar com o RNA alvo, a parte nucleotidica modificada com o açúcar se hibridiza, de preferência, com o RNA alvo do mesmo ponto de vista anteriormente descrito.
[00241] Além disso, pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado localizado no lado 3’ e no lado 5’ de pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizarem com o RNA alvo mencionado acima é, de preferência, fosforotioado do ponto de vista de farmacocinética superior, com mais preferência, pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado localizado no lado 3’ e pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado localizado no lado 5’ são fosforotioados, ainda com mais preferência, 50% são fosforotioa
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46/259 dos e, ainda com mais preferência, 80% são fosforotioados. Além disso, de preferência todos são fosforotioados. No caso, uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado está localizada no lado 3’, as ligações entre os nucleotídeos são, de preferência, fosforotioadas, e isto aplica-se similarmente ao caso de uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado estar localizada no lado 5’.
[00242] Pelo menos uma porção de pelo menos quatro nucieotideos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo pode se hibridizar dentro de uma molécula ou pode não se hibridizar na mesma, e, de preferência, todos são hibridizados. Os nucleotídeos com açúcar modificado ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e lado 5’ de pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H quando se hibridizam com o RNA alvo também podem ou não se hibridizar dentro de uma molécula.
[00243] No caso, a sequência antissenso é uma sequência que contém pelo menos um nucieotídeo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta de quatro desoxirribonucleotídeos contíguos”, embora a porção da sequência antissenso (mixmer) possa ou não conter um ribonudeotídeo e pode ou não conter um desoxirribonudeotídeo, contém pelo menos um nucieotídeo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucieotideos contíguos. A porção de sequência antissenso é, de preferência, uma estrutura parcial de um oligonucleotídeo que é composto por nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucieotideos e nucleotídeos com açúcar modificado, e a porcentagem de conteúdo de nucleotídeos com açúcar modificado é, por exemplo, 25% ou mais. A porcentagem de conteúdo de nucleotídeos com açúcar modificado é, com mais preferência, 30% ou mais e, ainda com mais preferência, 50% ou mais do ponto de vista de afinidade crescente para uma sequência parcial de um RNA alvo ou
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47/259 aumento da resistência à nuclease. Do mesmo ponto de vista, pelo menos um dos nucleotideos no lado 3’ e no lado 5’ desta porção de sequência antissenso é, de preferência, um nucleotideo com açúcar modificado, e o nucleotideo no lado 3’ e o nucleotideo no lado 5’ são, com mais preferência, nucleotideos com açúcar modificado.
[00244] Em outro aspecto, a porcentagem de conteúdo dos nucleotideos com açúcar modificado da porção da sequência antissenso mencionada acima é, de preferência, 40 a 70%, com mais preferência, 50% a 60%.
[00245] Em outro aspecto, a porcentagem de conteúdo dos nucleotideos com açúcar modificado da porção da sequência antissenso mencionada acima é, de preferência, 100%.
[00246] A porção da sequência antissenso que contém pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos, com mais preferência, não contém uma fita oligonucleotídica composta por três desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00247] A porção de sequência antissenso (mixmer) que contém pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos é normalmente de 4 a 30 nucleotideos contíguos, de preferência, 8 a 25 nucleotideos contíguos, com mais preferência, 10 a 20 nucleotideos contíguos, e, ainda com mais preferência, 14 a 16 nucleotideos contíguos. Estes nucleotideos contíguos podem ser iguais ou diferentes.
[00248] Além disso, do ponto de vista da farmacocinética superior, entre os nucleotideos que compõem a porção da sequência antissenso (mixmer) que contém pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta de quatro desoxirribonucleotideos contíguos, pelo menos um dos nucleotí
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48/259 deos é, de preferência, fosforotioado. Com mais preferência, pelo menos um dos nucleotídeos na extremidade 3’ e na extremidade 5’ da porção da sequência antissenso é fosforotioada. Entre as ligações entre os nucleotídeos contidos na porção da sequência antissenso, com mais preferência, 80% são fosforotioados, ainda com mais preferência, 90% são fosforotioados, e particularmente preferencialmente, todos são fosforotioados.
[00249] Embora pelo menos uma porção da porção da sequência antissenso (mixmer) que contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, mas não contém uma fita de oligonucleotídeos composta de quatro desoxirribonudeotideos contíguos pode ou não se hibridizar dentro de uma molécula da mesma. Na molécula de oligonucleotídeo de fita simples, na qual a porção da sequência antissenso mencionada acima (mixmer) não se hlbridiza dentro de uma molécula da mesma, por exemplo, tem a porção de sequência antissenso na ordem da porção da sequência antissenso (mixmer), Lx, uma primeira porção da sequência nucleotídica, L, e uma segunda porção da sequência nucleotídica, e o número de nucleotídeos incluídos por Y (e Yz, Ly) definido de modo a que a porção da sequência antissenso mencionada acima não se hibridlze em uma molécula da mesma ou tenha a porção de sequência de senso inverso na ordem de uma primeira porção de sequência nucleotídica, L, uma segunda porção de sequência nucleotídica, Ly e a porção de sequência antissenso (mixmer) e o número de nucleotídeos incluídos por X (e Xz, Lx) a porção da sequência antissenso mencionada acima não se hibridizam dentro de uma molécula da mesma.
[00250] Não é necessário ligar um a dez nucleotídeos com açúcar modificado adjacentes a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da porção de sequência antissenso que contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, mas não contém contém uma fita oligonucleotídica
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49/259 composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos, mas podem estar ligados. Neste caso, o dito um ou vários nucleotídeos com açúcar modificado são aplicados da mesma maneira que no caso da sequência mencionada acima contendo pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizarem com o RNA alvo, e podem ou não se hibridizarem dentro de uma molécula da mesma.
[00251] Embora o nucleotideo com açúcar modificado contido na porção da sequência antissenso seja somente requerido por ser um nucleotideo para o qual a afinidade por uma sequência parcial de RNA alvo tenha sido aumentada ou a resistência à nuclease tenha sido aumentada como resultado da substituição e similares, de preferência um 2’-O-metil nucleotideo, 2’-O-metoxietil nucleotideo (2’-MOE), 2’-Oaminopropil nucleotideo (2’-AP), 2’-fluoronucleotídeo, 2’-F-arabinonu~ cleotídeo (2’-F-ANA), nucleotideo em ponte (BNA (Ácido Nucleico em Ponte)) ou 2!-O-metilcarbamoiletil nucleotideo (2’-MCE), e, com mais preferência, BNA, 2’-O~metil nucleotideo, 2’-MOE nucleotideo ou 2’MCE nucleotideo, ainda com mais preferência, BNA ou 2’-O-metll nucleotideo, ainda com mais preferência, LNA contendo uma estrutura parcial representada pela seguinte fórmula (II) ou 2’-O~metil nucleotideo e, particularmente preferencialmente, LNA. Isto aplica-se similarmente a um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado ligados adjacentes ao lado 3’ de uma porção de sequência antissenso bem como um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado ligados adjacentes ao lado 5’ da porção de sequência antissenso.
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50/259 [00252] Na fórmula acima, Base representa uma porção de base e é um grupo purin-9-ila ou grupo 2-oxopirímidin-1-ila, e o grupo purin-9ila e 2-oxopirimidin-1-ila podem ou não ser modificados. Neste pedido, o grupo 2-oxopirimidin-1 -Ha tem o mesmo significado que um grupo 2oxo-1 H-pirimídin-1-ila. Além disso, o grupo purin-9-ila e o grupo 2oxopirimidin-l-ila incluem respectivamente os tautômeros dos mesmos. [00253] Os tipos, números e localizações de nucleotídeos, desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos com açúcar modificado na porção da sequência antissenso podem ter um efeito no efeito antissenso e similares, demonstrado pelo ollgonucleotídeo de fita simples revelado neste pedido. Embora os tipos, números e localizações dos mesmos não possam ser definidos incondicionalmente, uma vez que diferem de acordo com a sequência e assim por diante do RNA alvo, um versado na técnica é capaz de determinar um aspecto preferencial dos mesmos ao referir-se às descrições mencionadas acima na literatura em relação a métodos antissenso. Além disso, se o efeito antissenso demonstrado pelo oligonucleotídeo de fita simples após a modificação de uma porção de base, porção açúcar ou porção de ligação fosfodiéster é medido e o valor medido resultante não é signifícativamente menor do que o do oligonucleotídeo de fita simples antes da modificação (como se o valor medido do oligonucleotídeo de fita simples após modificação fosse 30% ou mais do valor medido do oligonucleotídeo de fita simples antes da modificação), então essa modificação pode ser avaliada como um aspecto preferencial. Como indicado, por exemplo, nos exemplos a serem descritos subsequentemente, a medição do efeito antissenso pode ser realizada por introdução de um oligonucleotídeo de teste em uma célula e similares e medição do nível de expressão do RNA alvo, nível de expressão do DNAc associado ao RNA alvo ou a quantidade de uma proteína associada ao RNA alvo, que é controlada pelo efeito antissenso demonstrado pelo oligonucleotídeo
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51/259 de teste, opcionalmente utilizando uma técnica conhecida, como northern blotting, PCR quantitativa ou western blotting. Isto aplica-se similarmente a um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado ligados adjacentemente ao lado 3’ da porção de sequência antissenso, desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos contidos entre a pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado, um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificados ligados adjacentemente ao lado 5’ da porção da sequência antissenso, e desoximbonucleotídeos e ribonucleotídeos contidos entre a pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado.
[00254] Dois nucleotídeos pelo menos em um lado do lado 3’ e lado 5’ da porção da sequência antissenso que contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos são, de preferência, nucleotídeos com açúcar modificado, e os nucleotídeos com açúcar modificado são, de preferência, nucleotídeos em ponte e particularmente de preferência LNA. Quando dois nucleotídeos no lado 3’ da porção da sequência antissenso são nucleotídeos com açúcar modificado, dois ou mais dos três nucleotídeos no lado 5’ são, de preferência, nucleotídeos com açúcar modificado e são, de preferência, acoplados em qualquer ordem indicada abaixo em uma ordem começando de um lado da extremidade da porção de sequência antissenso. Quando dois nucleotídeos no lado 5’ da porção da sequência antissenso são nucleotídeos com açúcar modificado, dois ou mais dos três nucleotídeos no lado 3’ são, de preferência, nucleotídeos com açúcar modificado e são, de preferência, acoplados em qualquer ordem indicada abaixo em uma ordem começando de um lado da extremidade da porção de sequência antissenso. Além disso, nestas ordens, o lado esquerdo indica o lado final da parte da sequência antissenso, enquanto o lado direito indica o interior da parte da sequência
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52/259 antissenso. O nucleotídeo com açúcar modificado é, de preferência, um nucleotídeo em ponte e, particularmente preferencialmente, LNA.
[00255] Nucleotídeo com açúcar modificado - nucleotídeo com açúcar modificado - nucleotídeo com açúcar modificado [00256] Nucleotídeo com açúcar modificado - nucleotídeo com açúcar modificado - desoxirribonucleotídeo [00257] Nucleotídeo com açúcar modificado - desoxirribonucleotídeo - nucleotídeo com açúcar modificado [00258] No caso, um oligonucleotide© de fita simples contém uma porção de sequência nucleotídica que se hibridiza com a porção da sequência antissenso mencionada acima em uma molécula da mesma, o tipo, número e localização modificada dos nucleotideos, desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos com açúcar modificado na porção de sequência nucleotídica que se hibridiza com uma porção de sequência antissenso em uma sua molécula mencionada acima pode ter um efeito no efeito antissenso e similares demonstrado pelo oligonucleotídeo de fita simples. Embora os seus aspectos preferenciais sejam incapazes de ser incondicionalmente definidos, uma vez que diferem de acordo com os tipos, sequências e similares de nucleotideos direcionados para modificação, os aspectos preferenciais podem ser especificados medindo os efeitos antissenso trazidos por um oligonucleotídeo de fita simples após a modificação da mesma maneira como a porção de sequência antissenso mencionada acima. Do ponto de vista da porção da sequência nucleotídica que se hibridiza com uma porção de sequência antissenso em uma molécula da mesma sendo degradada por uma nuclease como a RNase H em uma célula específica resultando na formação de um oligonucleotide© contendo uma porção de sequência antissenso e facilitando a demonstração de um efeito antissenso, a porção da sequência nucleotídica que se hibridiza com uma porção da sequência antissenso em uma molécula da mes
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53/259 ma contém, de preferência, pelo menos quatro nucleotídeos contíguos clivados pela RNase H e, com mais preferência, contém pelo menos um ribonucleotídeo. Além disso, contém de preferência um oligorribonucleotídeo e, com mais preferência, contém RNA. Os nucleotídeos contíguos são, com mais preferência, selecionados independentemente dos ribonucleotídeos. Além disso, os nucleotídeos contíguos ainda são, de preferência, acoplados mutuamente através de uma ligação fosfodiéster. Estes nucleotídeos contíguos podem ser iguais ou diferentes.
[00259] A complementaridade entre a porção da sequência antissenso mencionada acima e a porção da sequência nucleotídica que se hibridiza com uma porção da sequência antissenso em uma molécula da mesma mencionada acima é, de preferência, 70% ou mais, com mais preferência, 80% ou mais, e ainda com mais preferência, 90% ou mais (como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais). Embora não seja necessário que estas sequências sejam completamente complementares para que a porção da sequência antissenso e a porção da sequência nucleotídica que se hibridiza com uma porção da sequência antissenso em uma molécula da mesma se hibridizem, podem ser completamente complementares. Além disso, toda a porção da sequência nucleotídica que se hibridiza com uma porção da sequência antissenso em uma molécula da mesma não é necessária para se hibridizar com a porção da sequência antissenso, uma porção pode não se hibridizar, mas a sequência completa pode hibridizar.
[00260] A porção da sequência nucleotídica que se hibridiza com uma porção da sequência antissenso em uma molécula da mesma pode parcialmente se hibridizar com a porção da sequência antissenso, e o número de nucleotídeos que hibridizam-se parcialmente é normaimente selecionado correspondente à estabilidade das estruturas que se hibridizam em uma molécula da mesma, a intensidade do efeito
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54/259 antissenso no RNA alvo mencionado acima, custos, rendimento de síntese e outros fatores.
[00261] Em seguida, é fornecida uma explicação da molécula de oligonucleotídeo de fita simples na presente invenção. O oligonucieotídeo de fita simples da presente invenção contém X, Y e L. Exemplos da modalidade dos oligonucleotídeos de fita simples da presente invenção incluem [00262] uma modalidade em que Xz e Lx, Yz e Ly não estão contidos (na fórmula (I) mencionada acima, m é 0 e n é 0), [00263] uma modalidade em que Xz e Lx não estão contidos e Yz e Ly estão contidos (nafórmula (I) mencionada acima, méOenél), [00264] uma modalidade em que Xz e Lx estão contidos e Yz e Ly não estão contidos (na fórmula (I) mencionada acima, m é 1 e n é 0), e [00265] uma modalidade em que ambos Xz e Lx, Yz e Ly estão contidos (na fórmula (I) mencionada acima, m é 1 e n é 1).
[00266] O que se segue fornece uma explicação de X, Y, Xz e Yz na presente invenção. Embora a presente invenção tenha várias modalidades, uma explicação é primeiro fornecida de semelhanças entre elas.
[00267] X representa um grupo derivado de um primeiro oligonucleotídeo composto por 7 a 100 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, e os desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado são respectivamente e independentemente não modificados, ou modificados em pelo menos uma de uma porção de base e porção de fosfato. O primeiro oligonucleotídeo contém pelo menos um nucleotídeo do qual pelo menos uma porção de açúcar, porção da base e porção de fosfato foi modificada. O primeiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica X, e a sequência nucleotídica X contém uma primeira sequência nucleotídica
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55/259 que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do segundo oligonucleotídeo.
[00268] A sequência nucleotidica X é uma sequência de bases de nucleotídeos que compõem o primeiro oligonucleotídeo e contém a primeira sequência nucleotidica. A primeira sequência nucleotidica é uma sequência de bases de nucleotídeos que compõem uma primeira porção da sequência nucleotidica.
[00269] O número de nucleotídeos contidos em X é de 7 a 100, de preferência, 10 a 50, com mais preferência 10 a 35, ainda com mais preferência, 12 a 25, ainda com mais preferência 13 a 20, e particularmente preferenciaimente 13 a 14. O número de nucleotídeos contidos em X é normalmente selecionado dependendo dos outros fatores como a força do efeito antissenso no RNA alvo mencionado acima, estabilidade da estrutura hibridizada dentro de uma molécula do mesmo, custos e rendimento da síntese.
[00270] Y representa um grupo derivado de um segundo oligonucleotídeo composto por 4 a 100 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxírribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, e os desoxírribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado são respectivamente e independentemente não modificados, ou modificados em pelo menos ums de uma porção de base e porção de fosfato. O segundo oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotidica Y, e a sequência nucleotídica Y contém uma segunda sequência nucleotidica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do primeiro oligonucleotídeo mencionado acima.
[00271] A sequência nucleotidica Y é uma sequência de bases de nucleotídeos que compõe o segundo oligonucleotídeo e contém uma segunda sequência nucleotidica. A segunda sequência nucleotidica é uma sequência de bases de nucleotídeos que compõem uma segunda
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56/259 porção da sequência nucleotidica.
[00272] O número de nucleotídeos contidos em Y é de 4 a 100 e, de preferência, de 4 a 50. O número de nucleotídeos contidos em Y pode ser o mesmo ou diferente do número de nucleotídeos contidos em X. O número de nucleotídeos contidos em Y é normalmente selecionado dependendo dos outros fatores como a força do efeito antissenso no RNA alvo mencionado acima, estabilidade da estrutura hibridizada dentro de uma molécula do mesmo, custos e rendimento da síntese. A diferença no número dos nucleotídeos contidos em Y e o número dos nucleotídeos contidos em X é, de preferência, de 10, com mais preferência, de 5, ainda com mais preferência, de 4, ainda com mais preferência, de 2, e particularmente preferencialmente 0.
[00273] Xz representa um grupo derivado de um terceiro oligonucleotídeo composto por 7 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, os desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado são respectivamente e independentemente não modificados ou modificados pelo menos em uma de uma porção de base e uma porção de fosfato. O terceiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotidica Xz.
[00274] A sequência nucleotidica Xz é uma sequência de bases de nucleotídeos que constituem um terceiro oHgonucleotídeo. A sequência nucleotidica Xz pode ou não conter uma terceira sequência nucleotidica que seja capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do quarto oHgonucleotídeo. A terceira sequência nucleotidica mencionada acima é uma sequência de bases de nucleotídeos que compõem a terceira porção da sequência nucleotidica.
[00275] O número de nucleotídeos contidos em Xz é de 7 a 100, de preferência, de 10 a 50, com mais preferência, de 10 a 30, ainda com mais preferência, de 12 a 20 bases, particularmente preferencialmen
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57/259 te, de 13 a 14 bases. O número de nucleotídeos contidos em Xz é normalmente selecionado dependendo dos outros fatores como a força do efeito antissenso no RNA alvo mencionado acima, estabilidade da estrutura hibridizada dentro de uma molécula do mesmo, custos e rendimento da síntese.
[00276] Yz é um grupo derivado de um quarto oligonucleotídeo composto por 7 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonucieotideos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, e os desoxirribonucieotideos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado são respectivamente e independentemente não modificados ou modificados pelo menos em uma de uma porção de base e uma porção de fosfato. O quarto oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotidica Yz.
[00277] A sequência nucleotidica Yz é uma sequência de bases de nucleotídeos que compõem um quarto oligonucleotídeo. A sequência nucleotidica Yz pode ou não conter a quarta sequência nucleotidica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do terceiro oligonucleotídeo. A quarta sequência nucleotidica é uma sequência de bases de nucleotídeos que compõem a quarta porção da sequência nucleotidica.
[00278] O número preferencial de nucleotídeos contidos em Yz é o mesmo que o de Xz.
[00279] X e Y se hibridizam dentro de uma molécula pela primeira porção da sequência nucleotidica e pela segunda porção da sequência nucleotidica.
[00280] Quando o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção contém ambos Xz e Yz, Xz e Yz, eles podem ou não se hibridizar dentro de uma molécula pela terceira porção da sequência nucleotidica e pela quarta porção da sequência nucleotidica.
[00281] Embora não seja necessário que a primeira sequência nu
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58/259 cleotídica e a segunda sequênda nudeotídica sejam completamente complementares para que a primeira porção da sequência nucleotídica e a segunda porção da sequênda nudeotídica se hibridizem, a complementaridade é, de preferência, de 70% ou mais, com mais preferência, de 80% ou mais e, ainda com mais preferência, 90% ou mais (como 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais). A primeira sequênda nucleotídica e a segunda sequênda nudeotídica também podem ser completamente complementares.
[00282] A terceira sequênda nudeotídica e a quarta sequência nucleotídica são as mesmas.
[00283] Embora não seja necessário que a sequência nudeotídica X e a sequência nudeotídica Y sejam completamente complementares para que X e Y se hibridizem, a complementaridade é, de preferência, 70% ou mais, com mais preferência, 80% ou mais e, ainda com mais preferência, 90% ou mais (como 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais). A sequência nucleotídica X e a sequência nudeotídica Y também podem ser completamente complementares.
[00284] A sequênda nudeotídica Xz e a sequência nucleotídica Yz são as mesmas.
[00285] A primeira sequência nudeotídica contém, de preferência, 4 a 25 nudeotídeos contíguos. A primeira sequênda de nudeotídeos é, de preferência, uma sequênda Independentemente selecionada de desoxirribonucleotídeos e nudeotídeos com açúcar modificado, com mais preferência, uma sequênda contendo pelo menos quatro nucleotídeos reconhecidos pela RNase H, ainda com mais preferência, uma sequênda na qual os desoxirribonucleotídeos são contíguos. Em outro aspecto do mesmo, a primeira sequênda nudeotídica é uma sequência que contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, mas não contém um oligonucleotídeo composto por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos. Os nudeotídeos contíguos podem ser
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59/259 iguais ou diferentes. Além disso, a primeira sequência nucleotídica pode ser ou não uma sequência antissenso.
[00286] Além disso, pelo menos um nucleotídeo entre a primeira porção da sequência nucleotídica é, de preferência, fosforotioado do ponto de vista da farmacocinética superior. Pelo menos um dos nucleotídeos no lado 3’ e no lado 5’ da primeira porção da sequência nucleotídica é, com mais preferência, fosforotioado. Entre a primeira porção da sequência nucleotídica, 80% dos nucleotídeos são, com mais preferência, fosforotioados, e 90% dos nucleotídeos são, ainda com mais preferência, fosforotioados. É particularmente preferencial que os nucleotídeos contidos na primeira porção da sequência nucleotídica sejam acoplados pela ligação fosforotioato entre si. Detalhes dos mesmos são descritos subsequentemente.
[00287] A segunda sequência nucleotídica contém, de preferência, pelo menos quatro nucleotídeos contíguos clivados pela RNase H, e, com mais preferência, contém 4 a 25 nucleotídeos contíguos. Estes nucleotídeos contíguos podem ser iguais ou diferentes. A segunda porção da sequência nucleotídica contém, de preferência, oligorribonucleotídeos e, com mais preferência, contém RNA. É particularmente preferencial que os nucleotídeos contidos na primeira porção da sequência nucleotídica sejam acoplados pela ligação fosfodiéster entre si. Detalhes dos mesmos são descritos subsequentemente.
[00288] Pelo menos uma das sequências nucleotídicas X, a sequência nucleotídica Xz e a sequência nucleotídica Yz contêm uma sequência antissenso capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção de um RNA alvo.
[00289] O tipo, número e localização modificada de nucleotídeos, desoxirribonucleotideos e ribonucleotídeos com açúcar modificado em X pode ter um efeito no efeito antissenso demonstrado pelo oligonucleotídeo de fita simples. Embora os seus aspectos preferenciais se
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60/259 jam incapazes de ser incondicionalmente definidos, uma vez que diferem de acordo com os tipos, sequências e similares de nucleotideos direcionados para modificação, os aspectos preferenciais podem ser especificados medindo os efeitos antissenso trazidos por um oligonucleotídeo de fita simples após a modificação da mesma maneira como a porção de sequência antissenso mencionada acima. Y, Xz e Yz são iguais aos em X.
[00290] No caso, dois ou mais de X, Xz e Yz se hibridizam com o mesmo RNA alvo, as sequências antissenso assim trazidas podem ser iguais ou diferentes. X, Xz e Yz podem, cada um, hibridizar-se separadamente com o RNA alvo diferente.
[00291] As sequências antissenso mencionadas acima são, de preferência, independentemente, uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo, ou uma sequência que contém pelo menos um nudeotídeo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00292] No caso, a porção da sequência antissenso mencionada acima hibridiza~se dentro de uma molécula da maneira descrita abaixo, a porção da sequência antissenso contém preferencialmente pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo do ponto de vista de facilitar a formação de um oligonucleotídeo contendo uma porção de sequência antissenso e demonstrando um efeito antissenso como resultado da parte da sequência antissenso sendo reconhecida por uma nuclease como a RNase H dentro de uma célula específica e uma porção de sequência nudeotídica que se hibridiza com a porção da sequência antissenso dentro de uma molécula da mesma sendo degradada.
[00293] Quando a sequência nudeotídica X contém uma sequência
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61/259 antissenso, Y pode conter a porção da sequência nucleotídica que se híbridiza com uma porção da sequência antissenso em uma molécula da mesma. Quando a primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso, a porção da sequência antissenso (a primeira porção da sequência nucleotídica) se híbridiza com a segunda porção da sequência nucleotídica.
[00294] No caso, a sequência nucleotídica Xz ter uma sequência antissenso, Yz pode conter uma porção da sequência nucleotídica que se hibridiza com uma porção de sequência antissenso em uma molécula da mesma. Ou seja, a porção de sequência antissenso contida em Xz pode ser uma terceira porção de sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção de um quarto oligonucleotídeo (uma quarta porção da sequência nucleotídica).
[00295] No caso, a sequência nucleotídica Yz tem uma sequência antissenso, Xz pode conter uma porção da sequência nucleotídica que se hibridiza com uma porção da sequência antissenso em uma molécula da mesma. Ou seja, a porção de sequência antissenso contida em Yz pode ser uma quarta porção de sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção de um terceiro oligonucleotídeo (uma terceira porção de sequência nucleotídica).
[00296] Em seguida, são fornecidas explicações, respectivamente, de [A] o caso da sequência nucleotídica X contendo uma sequência antissenso, [Β] o caso da sequência nucleotídica Xz contendo uma sequência antissenso e [C] o caso da sequência nucleotídica Yz contendo uma sequência antissenso a ser descrita subseqüentemente.
[A] Caso da Sequência Nucleotídica X Contendo Sequência Antissenso [00297] No caso, a sequência nucleotídica X conter uma sequência antissenso, m é 0 ou 1 e n é 0 ou 1.
[00298] No caso, a sequência nucleotídica X conter uma sequência antissenso, a primeira sequência nucleotídica é de preferência uma
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62/259 sequência antissenso. Embora o que se segue forneça uma explicação em detalhes, as modalidades da presente invenção não se limitam a elas, mas, por exemplo, a primeira sequência nucleotídica pode sobrepor-se parcialmente à sequência antissenso mencionada acima ou pode não se sobrepor na totalidade.
[00299] No caso, a primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso, a primeira sequência nucleotídica que é a sequência antissenso mencionada acima é, de preferência, uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo, ou uma sequência que contém pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta de quatro desoxirribonucleotídeos contíguos. Do ponto de vista de facilitar a demonstração de um efeito antissenso, pela formação de um oligonucleotídeo contendo uma porção de sequência antissenso como resultado da porção de sequência antissenso ser reconhecida por uma nuclease, como RNase H, dentro de uma célula específica e uma porção de sequência nucleotídica que se hibridiza com uma porção de sequência antissenso em uma molécula da mesma sendo degradada, a primeira sequência nucleotídica que a sequência antissenso mencionada acima preferivelmente uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo.
[00300] Neste caso, os aspectos preferenciais da primeira sequência nucleotídica e da primeira porção da sequência nucleotídica são os mesmos que a sequência que contém pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo descritos na sequência antissenso e a porção da sequência antissenso. Além disso, 1 a 10 nucleotideos com açúcar modificado são, de preferência, ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da primeira parte da sequência nucleotídica, e este ou uma
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63/259 pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado são os mesmos como um nucleotideo ou uma pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado adjacentes a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ de pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo (porção de sequência antissenso).
[00301] No caso, a primeira sequência nucleotídica é uma sequência que contém pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos, os aspectos preferenciais da primeira sequência nucleotídica e da primeira porção da sequência nucleotídica são os mesmos como a sequência que contém pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado, mas que não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos descritos na sequência antissenso e na porção da sequência antissenso. Além disso, 1 a 10 nucleotideos com açúcar modificado podem ou não estar ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da primeira parte da sequência nucleotídica, e este ou uma pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado são os mesmos como um nucleotideo ou uma pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado adjacentes a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ de pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo mencionados acima (porção de sequência antissenso).
[00302] Além das características anteriormente descritas como semelhanças, a primeira sequência nucleotídica contém, de preferência, 4 a 20 nucleotideos contíguos, com mais preferência, contém 5 a 16 nucleotideos contíguos, ainda com mais preferência, contém 6 a 12 nucleotideos contíguos, ainda com mais preferência, contém 8 a 10 nucleotideos contíguos, e particularmente preferencialmente, contém 8 a 10 desoxirribonucleotídeos contíguos.
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64/259 [00303] Quando n é 0, além das características anteriormente descritas como semelhanças, a segunda sequência nucleotídica contém, de preferência, 4 a 25 nucleotídeos contíguos, com mais preferência, contém 6 a 20 nucleotídeos contíguos, ainda com mais preferência, contém 8 a 15 nucleotídeos contíguos, e particularmente preferencialmente contém 10 a 13 nucleotídeos contíguos.
[00304] Quando n é 0, do ponto de vista de facilitar a demonstração de um efeito antissenso através da formação de um oligonucleotídeo que é pelo menos uma porção do primeiro oligonucleotídeo e contém a porção de sequência antissenso mencionada acima como resultado da degradação por RNA nucleases como a RNase A sendo suprimida até que o oligonucleotídeo de fita simples seja entregue ao núcleo de uma célula específica juntamente com um grupo derivado do segundo oligonucleotídeo a ser degradado por nucleases, como RNase H em uma célula específica, pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica está, de preferência, acoplado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação fosforotloato. No caso de Y se ligar a L no lado 5’, o lado 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica está, com mais preferência, acoplado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato, enquanto no caso de Y se ligar a L no lado 3’, o lado 5’ da segunda porção da sequência nucleotídica está, com mais preferência, acoplado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato. Adicionalmente, do ponto de vista de suprimir a degradação por enzimas como RNA nucleases, 1 a 10 nucleotídeos com açúcar modificado são, de preferência, ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica. No caso, as ligações Y a L no lado 5’, 1 a 7 nucleotídeos com açúcar modificado são, com mais preferência, ligados adjacentemente ao lado 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica, 2 a 5 nucleotídeos com açúcar modificado, são ainda com
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65/259 mais preferência, ligados, e 2 ou 3 nucleotídeos com açúcar modificado são, ainda com mais preferência, ligados. No caso das ligações Y a L no lado 3’, 1 a 7 nucleotídeos com açúcar modificado são, com mais preferência, ligados adjacentemente ao lado 5’ da segunda porção da sequência nucleotídica, 2 a 5 nucleotídeos com açúcar modificado, são ainda com mais preferência, ligados, e 2 ou 3 nucleotídeos com açúcar modificado são, ainda com mais preferência, ligados. Neste pedido, embora uma pluralidade de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou ambos possam estar contidos entre a pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado em pelo menos um dos lados 3’ e 5’, a pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado são, de preferência, contíguos. No caso de uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado estar ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da segunda porção da sequência nucleotídica, uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado está ligada a referese à pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado e uma fita de oligonucleotídeos composta por desoximbonucleotídeos e ribonucleotídeos contidos entre a pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado sendo ligados adjacentemente. No caso, uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado está ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da segunda porção da sequência nucleotídica, cada nucleotídeo com açúcar modificado pode ser o mesmo ou diferente.
[00305] Quando n é 0, embora a porção de nucleotídeo com açúcar modificado ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da porção da segunda sequência nucleotídica mencionada acima possa ou não se hibridizar com uma porção do primeiro oligonucleotídeo, de preferência, se hibridiza com uma porção do primeiro oligonucleotídeo.
[00306] Quando n é 0, o nucleotídeo com açúcar modificado ligado
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66/259 adjacentemente a peto menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica mencionada acima é, de preferência, um 2’O-metii nucleotídeo, 2’-O-metoxietil nucleotídeo (2’~MOE), 2’-O-aminopropii nucleotídeo (2’-AP), 2’-fluoronucleotídeo, 2’-F-arabinonucleotídeo (2’-F-ANA), nucleotídeo em ponte (BNA (Ácido Nucleico em Ponte)) ou 2’-O~metilcarbamoiletil nucleotídeo (2’-MCE), e, com mais preferência, BNA, 2’-O-metil nucleotídeo, 2’-MOE nucleotídeo ou 2!-MCE nucleotídeo, ainda com mais preferência, LNA contendo uma estrutura parcial representada pela seguinte fórmula (II) ou 2’-O-metil nucleotídeo, e particuiarmente preferencialmente um 2’-O-metil nucleotídeo.
Figure BR112019014547A2_D0013
[00307] Na fórmula acima, Base representa uma porção de base e é um grupo purin-9-ila ou um grupo 2-oxopirimidin-1 -ila, e o grupo purin-9-ila e o grupo 2-oxopirimidin-1 -ila podem não ser modificados ou podem ser modificados.
[00308] Quando n é 0, embora o número de nucleotídeos do oligonucleotídeo adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica possa ser o mesmo ou diferente do número de nucleotídeos adjacentes a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da primeira porção de sequência nucleotídica (como uma porção de sequência antissenso hibridizada pela segunda porção da sequência nucleotídica), essa diferença é, de preferência, de 3, com mais preferência, de 1, e, particularmente preferencialmente, a mesma. No caso de uma fita oligonucleotídlca contendo uma ou uma pluralidade das ligações de nucleotídeos com açúcar modificado mencionadas acima adjacentes ao lado 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica, embora o número de nucleotídeos dessa fita oligonucleotídlca possa
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67/259 ser o mesmo ou diferente do número de nucleotídeos de uma fita oil· gonucleotídica contendo um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado ligados adjacentemente ao lado 5’ da primeira porção da sequência nucleotídica, essa diferença é, de preferência, de 3, com mais preferência, de 1, e, particularmente preferencialmente, a mesma. No caso de uma fita oligonucleotídica contendo uma ou uma pluralidade das ligações de nucleotídeos com açúcar modificado mencionadas acima adjacentes ao lado 5’ da segunda porção da sequência nucleotídica, embora o número de nucleotídeos da fita oligonucleotídica possa ser o mesmo ou diferente do número de nucleotídeos de uma fita oligonucleotídica contendo um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado ligados adjacentemente ao lado 3’ da primeira porção da sequência nucleotídica, essa diferença é, de preferência, de 3, com mais preferência, de 1, e, particularmente preferencialmente, a mesma.
[00309] Quando n é 0, e um grupo derivado de uma molécula funcional a ser subsequentemente descrita é ligado ao segundo oligonucleotídeo direta ou indiretamente através de um grupo de ligação, além da explicação dos pontos em comum mencionados acima e do exemplo preferencial mencionado acima quando n é 0, o lado 5’ e o lado 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica estão, de preferência, ligados aos grupos adjacentes por uma ligação fosfodiéster. Neste caso, a segunda sequência nucleotídica contém, de preferência, 4 a 30 nucleotídeos contíguos, com mais preferência, contém 8 a 25 nucleotídeos contíguos, ainda com mais preferência, 10 a 20 nucleotídeos contíguos, e particularmente preferencialmente contém 12 a 16 nucleotídeos contíguos.
[00310] Quando n é 1, além da segunda sequência nucleotídica descrita nas semelhanças mencionadas acima, a segunda sequência nucleotídica é similar à segunda sequência nucleotídica no [C] caso da
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68/259 sequência nucleotidica Yz contendo uma sequência antissenso a ser posteríormente descrita. Quando a primeira sequência nucleotidica é uma sequência antissenso e a sequência nucleotidica Yz contém uma sequência antissenso, a segunda sequência nucleotidica contém, de preferência, 4 a 30 nucleotídeos contíguos, com mais preferência, contém 8 a 25 nucleotídeos contíguos, ainda com mais preferência 10 a 20 nucleotídeos contíguos e particularmente preferencialmente contém 12 a 16 nucleotídeos contíguos.
[00311] Quando n é 1, um aspecto de um nucleotídeo ligado adjacentemente à segunda porção da sequência de nucleotídeos, e a ligação com esse nucleotídeo é similar ao [C] caso da sequência de nucleotídeos Yz contendo uma sequência antissenso a ser descrita subsequentemente.
[00312] Quando n é 1 e m é 1, Xz e Yz são, de preferência, hibridizados pela terceira porção da sequência nucleotidica contida em Xz e a quarta porção da sequência nucleotidica contida em Yz.
[00313] Quando a sequência nucleotidica Xz contém ainda uma sequência antissenso, um aspecto preferencial de Xz é similar a [Β] o caso da sequência nucleotidica Xz contendo uma sequência antissenso a ser subsequentemente descrita. Neste caso, m é 1 e n é 0 ou 1. Quando n é 1, a porção da sequência antissenso (a terceira porção da sequência nucleotidica) contida em Xz pode ser hibridízada com a quarta porção da sequência nucleotidica contida em Yz, e um aspecto preferencial da Yz é similar ao [B] caso da sequência nucleotidica Xz contendo uma sequência antissenso para ser subsequentemente descrita.
[00314] Quando a sequência nucleotidica Yz contém ainda uma sequência antissenso, um aspecto preferencial de Yz é similar a [C] o caso da sequência nucleotidica Yz contendo uma sequência antissenso a ser subsequentemente descrita. Nesse caso, m é 0 ou 1 e n é 1.
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Quando m é 1, a porção da sequência antissenso (a quarta porção da sequência nucleotidica) contida em Yz pode ser hibridizada com a terceira porção da sequência nucleotidica contida em Xz, e um aspecto preferencial do Xz é similar ao [C] caso da sequência nucleotidica Yz contendo uma sequência antissenso para ser subsequentemente descrita.
[BI Caso da Sequência Nucleotidica Xz Contendo Sequência Antissenso [00315] No caso, a sequência nucleotidica Xz conter uma sequência antissenso, m é 1 e n é 0 ou 1.
[00316] Quando a sequência nucleotidica Xz contém uma sequência antissenso, n é 1, e a terceira sequência nucleotidica e a quarta sequência nucleotidica são hibridizadas, a terceira sequência nucieotidica é, de preferência, uma sequência antissenso. A explicação detalhada será feita a seguir, mas a modalidade da presente invenção não é limitada por estas e, por exemplo, a terceira sequência nucleotidica pode sobrepor-se parcialmente à sequência antissenso mencionada acima, ou pode não se sobrepor na totalidade.
[00317] A porção da sequência antissenso contida no Xz pode ser uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo ou uma sequência que contém pelo menos um nucieotídeo com açúcar modificado, mas não contém um fita oligonucleotica composta por quatro desoxirribonucieotideos contíguos e a sequência antissenso é, de preferência, uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo. Um aspecto preferenciai e assim sucessivamente da sequência é semelhante ao da explicação da porção de sequência antissenso e da sequência antissenso mencionada acima, e similar a um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado ligados adjacentemente
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70/259 ao lado 3’ de um porção de sequência antissenso bem como um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado ligados adjacentemente ao lado 5’ de uma porção de sequência antissenso.
[00318] Pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado pode estar ligado adjacentemente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da primeira porção da sequência nucleotidica, ou pode não estar ligado. Quando pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado está ligado a pelo menos um lado dos lados 5’ e 3’ da primeira porção da sequência nucleotidica, no caso X está ligado a L no lado 5’, pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado está, com mais preferência, ligado adjacentemente ao lado 3’ da primeira porção da sequência nucleotidica, e no caso X está ligado a L no lado 3’, pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado está, com mais preferência, ligado adjacentemente ao lado 5’ da primeira porção da sequência nucleotidica.
[00319] Um aspecto preferencial da primeira sequência nucleotidica é similar à primeira sequência nucleotidica descrita nas semelhanças mencionadas acima, e entre estas, é de 4 a 20 nucleotídeos contíguos, de preferência, 6 a 20 nucleotídeos contíguos, com mais preferência, 8 a 16 contíguos nucleotídeos, e, particularmente preferencialmente, 9 a 15 desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00320] Além disso, quando a primeira sequência nucleotidica é uma sequência antissenso, um aspecto preferencial da primeira sequência nucleotidica é similar ao [A] caso da sequência nucleotidica de X contendo uma sequência antissenso.
[00321] Quando né0,Y (incluindo a segunda sequência nucleotidica) é similar ao caso de n ser 0 no caso [A] mencionado acima da sequência nucleotidica X contendo uma sequência antissenso.
[00322] Quando n é 1, Y (incluindo a segunda sequência nucleotidica) é similar ao caso de n ser 1 no caso [A] mencionado acima da se
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71/259 quência nucleotídica X contendo uma sequência antissenso.
[00323] Quando n é 1, a porção da sequência antissenso (a terceira porção da sequência nucleotídica) contida em Xz se hibridiza, de preferência, com uma quarta porção da sequência nucleotídica contida em Yz, e um aspecto preferencial da quarta porção da sequência nucleotídica é similar à porção de sequência de nucleotideos que hibridiza com uma porção de sequência antissenso em uma molécula da mesma mencionada acima. Entre elas, a quarta sequência nucleotídica contém de preferência 9 a 20 nucleotideos, com mais preferência, contém 9 a 14 nucleotideos.
[00324] Um aspecto preferencial da quarta porção da sequência nucleotídica mencionada acima é similar à porção da sequência nucleotídica mencionada acima que se hibridiza com uma porção de sequência antissenso em uma molécula da mesma e similar à segunda parte da sequência nucleotídica mencionada acima do[A] caso da sequência nucleotídica X contendo uma sequência antissenso em que n éO.
[00325] Um aspecto da porção de nucleotídeo com açúcar modificado ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da porção da quarta sequência nucleotídica mencionada acima é similar à porção de nucleotídeo com açúcar modificado ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da segunda porção da sequência nucleotídica no caso de n ser 0 no [A] caso mencionado acima da sequência nucleotídica X contendo uma sequência antissenso.
[00326] A porção de nucleotídeo com açúcar modificado ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da quarta porção da sequência nucleotídica pode se hibridizar com uma porção de um terceiro oligonucleotídeo ou pode não, e de preferência, se hibridizar com uma porção do terceiro oligonucleotídeo. Embora o número de nucieotídeos da fita oligonucleotídica contendo um ou uma pluralidade de nu
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72/259 cleotídeos com açúcar modificado adjacentes a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da quarta porção da sequência nucleotidica possa ser o mesmo ou diferente do número de nucleotídeos da fita oligonucleotídica contendo um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado adjacentes a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da porção sequencial antissenso contida no Xz mencionado acima, essa diferença é de preferência, de 3, com mais preferência, de 1, e particularmente preferencialmente a mesma. No caso de uma fita oligonucleotídica contendo um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado mencionados acima ligados adjacentemente ao lado 3’ da quarta porção da sequência nucleotidica, embora o número de nucleotídeos possa ser o mesmo ou diferente do número de nucleotídeos de uma fita oligonucleotídica contendo um ou uma pluralidade de ligações de nucleotídeos com açúcar modificado adjacentes ao lado 5’ da porção da sequência antissenso contida no Xz mencionado acima, essa diferença é, de preferência, de 3, com mais preferência, de 1, e particularmente preferencialmente, a mesma. No caso de uma fita oligonucleotídica contendo um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado mencionados acima ligados adjacentemente ao lado 5’ da quarta porção da sequência nucleotidica, embora o número de nucleotídeos possa ser o mesmo ou diferente do número de nucleotideo de uma fita oligonucleotídica contendo uma ou uma pluralidade de ligações nucleotídicas com açúcar modificado adjacentes ao lado 3’ da porção sequencial antissenso contida no Xz mencionado acima, essa diferença é, de preferência, de 3, com mais preferência, de 1 e particularmente preferencialmente a mesma.
[Cl Caso da Sequência Nucleotidica Yz Contendo Sequência Antissenso [00327] No caso, a sequência nucleotidica Yz conter uma sequência antissenso, m é 0 ou 1 e n é 1.
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73/259 [00328] Quando a sequência nucleotídica Yz contém uma sequência antissenso, m é 1, e a quarta sequência nucleotídica e a terceira sequência nucleotídica são hibridizadas, a quarta sequência nucleotídica é, de preferência, uma sequência antissenso. A explicação detalhada será feita a seguir, mas a modalidade da presente invenção não é limitada por estas e, por exemplo, a quarta sequência nucleotídica pode sobrepor-se parcialmente à sequência antissenso mencionada acima, ou pode não se sobrepor completamente.
[00329] A sequência antissenso contida no Yz é, de preferência, uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo ou uma sequência que contém pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado, mas não contém um fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos e a sequência antissenso é, com mais preferência, uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H ao se hibridizar com o RNA alvo. Um aspecto preferencial da sequência é semelhante à explicação da porção de sequência antissenso e da sequência antissenso mencionada acima, e também similar a um ou uma pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado ligados adjacentemente ao lado 3’ de um porção de sequência antissenso e um nucleotideo ou uma pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado ligados adjacentemente ao lado 5’ de uma porção de sequência antissenso.
[00330] Do ponto de vista de facilitar a demonstração de um efeito antissenso através da formação de um oligonucleotídeo que é uma porção do quarto oligonucleotídeo e contém a porção de sequência antissenso mencionada acima como resultado da degradação por RNA nucleases como a RNase A sendo suprimida até que o oligonucleotídeo de fita simples seja entregue ao núcleo de uma célula específica juntamente com um grupo derivado do segundo oligonucleotídeo
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74/259 a ser degradado por RNase H em uma célula específica, o lado 5’ e o lado 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica está, de preferência, acoplado a um grupo adjacente através de uma ligação fosfodiéster.
[00331] Além disso, pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequência de nucleotideos pode ou não estar ligado adjacentemente a pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado. Quando pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado está ligado adjacentemente, no caso Y está ligado a L no lado 5’, pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado é, com mais preferência, ligado adjacente ao lado 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica, e no caso Y está ligado a L no lado 3’, pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado é, com mais preferência, ligado adjacentemente ao lado 5’ da segunda porção da sequência nucleotídica.
[00332] Além de um aspecto da segunda sequência nucleotídica descrito nas semelhanças mencionadas acima, a segunda sequência nucleotídica contém, de preferência, 4 a 25 nucleotideos contíguos, com mais preferência, contém 10 a 22 nucleotideos contíguos, ainda com mais preferência, contém 10 a 16 contíguos nucleotideos, e particularmente contém 12 a 13 ribonucleotídeos contíguos.
[00333] Um aspecto da primeira sequência nucleotídica é similar à primeira sequência nucleotídica descrita nas semelhanças mencionadas acima, e entre elas, é de 4 a 20 nucleotideos contíguos, de preferência, 6 a 20 nucleotideos contíguos, com mais preferência, 8 a 16 contíguos nucleotideos, e, particularmente preferencialmente, 9 a 15 desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00334] Além disso, quando a primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso, um aspecto preferencial da primeira sequência nucleotídica é similar à [A] sequência nucleotídica do caso X contendo uma sequência antissenso.
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75/259 [00335] Similarmente ao anterior, do ponto de vista de facilitar a demonstração de um efeito antissenso através da formação de um oligonucleotídeo que é pelo menos uma porção do quarto oligonucleotídeo e contém a porção de sequência antissenso mencionada acima como resultado da degradação por RNA nucleases como a RNase A sendo suprimida até que o oligonucleotídeo de fita simples seja entregue ao núcleo de uma célula específica juntamente com um grupo derivado do segundo oligonucleotídeo a ser degradado por nucleases, como RNase H em uma célula específica, pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da primeira porção da sequência nudeotídica está, de preferênda, acoplado a um nudeotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato. No caso de Y se ligar a L no lado 5’, o lado 3’ da primeira da sequência nudeotídica está, com mais preferênda, acoplado a um nudeotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato, enquanto no caso de Y se ligar a L no lado 3’, o lado 5’ da primeira porção da sequência nudeotídica está, com mais preferênda, acoplado a um nudeotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato.
[00336] Adidonalmente, quando m é 0, do ponto de vista de suprimir a degradação por enzimas como RNA nucleases, 1 a 10 nucleotídeos com açúcar modificado são, de preferência, ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da primeira porção da sequência nudeotídica. No caso das ligações X a L no lado 5’, 1 a 7 nucleotídeos com açúcar modificado são, com mais preferência, ligados adjacentemente ao lado 3’ da primeira porção da sequênda nudeotídica, 2 a 5 nucleotideos com açúcar modificado são, ainda com mais preferência, ligados, e 2 ou 3 nucleotideos com açúcar modificado são, ainda com mais preferênda, ligados. No caso das ligações X a L no lado 3’, 1 a 7 nucleotideos com açúcar modificado são, com mais preferência, ligados adjacentemente ao lado 5’ da primeira porção da sequênda nudeotídica, 2 a 5 nucleotideos com açúcar modificado são,
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76/259 ainda com mais preferência, ligados, e 2 ou 3 nudeotídeos com açúcar modificado são, ainda com mais preferência, ligados. Neste pedido, embora uma pluralidade de desoxirribonudeotídeos, ribonucleotídeos ou ambos possam estar contidos entre a pluralidade de nudeotídeos com açúcar modificado em pelo menos um dos lados 3’ e 5’, a pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado são, de preferência, contíguos. No caso de uma pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado estar ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da primeira porção da sequência nucleotídica, uma pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado está ligada a refere-se à pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado e uma fita de oligonucleotídeos composta por desoxirribonudeotídeos e ribonucleotídeos contidos entre a pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado sendo ligados adjacentemente. No caso de uma pluralidade de nucleotideos com açúcar modificado estar ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da primeira porção da sequênda nucleotídica, cada nucleotídeo com açúcar modificado pode ser o mesmo ou diferente.
[00337] Embora a porção do nucleotídeo com açúcar modificado mencionada acima ligue-se adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da primeira porção da sequência nucleotídica, quando m é 0, pode ou não se hibridizar com uma porção do segundo oligonucleotídeo, de preferência se hibridiza com uma porção do segundo oligonucleotídeo.
[00338] A porção do nucleotídeo com açúcar modificado mencionado acima ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da primeira porção da sequência nucleotídica, quando m é 0, é igual a porção de nucleotídeo com açúcar modificado ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da segunda sequência nucleotídica, quando n é 0, no [A] caso mencionado acima da sequência nucleotídica X contendo uma sequência antissenso.
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77/259 [00339] Quando m é 1, a porção da sequência antissenso (a quarta porção da sequência nudeotídica) contida em Yz se hibridiza, de preferência, com a terceira porção da sequênda nudeotídica contida em Xz, e um aspecto preferencial da terceira porção da sequênda nudeotídica por isso é similar à porção de sequência de nudeotídeos que se hibridiza com uma porção de sequência antissenso em uma molécula da mesma mencionada acima. Entre elas, a terceira sequência nudeotídica contém, de preferência, 9 a 20 nudeotídeos, com mais preferência, contém 9 a 14 nudeotídeos.
[00340] Na terceira porção da sequênda nudeotídica contida em Xz, do ponto de vista de facilitar a demonstração de um efeito antissenso, formando um oligonudeotídeo que é pelo menos uma porção do quarto oligonudeotídeo e contém uma porção de sequênda antissenso contida em Yz mencionado acima como resultado da degradação por RNA nucleases, como a RNase A sendo suprimida até que o oligonudeotídeo de fita simples seja entregue ao núcleo de uma célula específica juntamente com um grupo derivado do terceiro oligonucleotídeo sendo degradado por nucleases como a RNase H em uma célula específica, pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da terceira porção da sequênda nucleotídica é, de preferência, acoplado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato. No caso de X liga-ser a L no lado 5’, o lado 3’ da terceira da sequência nudeotídica está, com mais preferência, acoplado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato, enquanto no caso de X liga-ser a L no lado 3’, o lado 5’ da terceira porção da sequência nudeotídica está, com mais preferência, acoplado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato. Adlcionalmente, do ponto de vista de suprimir a degradação por enzimas como RNA nucleases, 1 a 10 nucleotídeos com açúcar modificado são, de preferência, ligados adjacentemente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da terceira porção da se
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78/259 quência nucleotídica. No caso das ligações X a L no lado 5’, 1 a 7 nucleotídeos com açúcar modificado são, com mais preferência, ligados adjacentemente ao lado 3’ da terceira porção da sequência nucleotídica, 2 a 5 nucleotídeos com açúcar modificado são, ainda com mais preferência, ligados, e 2 ou 3 nucleotídeos com açúcar modificado são, ainda com mais preferência, ligados. No caso das ligações X a L no lado 3’, 1 a 7 nucleotídeos com açúcar modificado são, com mais preferência, ligados adjacentemente ao lado 5’ da terceira porção da sequência nucleotídica, 2 a 5 nucleotídeos com açúcar modificado são, ainda com mais preferência, ligados, e 2 ou 3 nucleotídeos com açúcar modificado são, ainda com mais preferência, ligados. Além disso, no caso da sequência nucleotídica X conter ainda uma sequência antissenso, do ponto de vista de facilitar a demonstração de um efeito antissenso, formando um oligonucleotídeo que é pelo menos, uma porção do primeiro oligonucleotídeo e contém a porção da sequência antissenso mencionada acima, Xz é de preferência os aspectos mencionados acima. Neste pedido, embora uma pluralidade de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou ambos possam estar contidos entre a pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado em pelo menos um dos lados 3’ e 5’, a pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado são, de preferência, contíguos. No caso de uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado estar ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da terceira porção da sequência nucleotídica, uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado está ligada a refere-se à pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado e uma fita de oligonucleotídeos composta por desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos contidos entre a pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado sendo ligados adjacentemente. No caso de uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado estar ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da terceira por
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79/259 ção da sequência nucleotídica, cada nucieotídeo com açúcar modificado pode ser o mesmo ou diferente.
[00341] Embora a porção nucleotídica modificada em açúcar ligada a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da terceira porção da sequência nucleotídica mencionada acima possa ou não se hibridizar com uma porção do quarto oligonucleotídeo, de preferência se hibridiza com uma porção do quarto oligonucleotídeo.
[00342] O número de nucleotídeos do oligonucleotídeo adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da terceira porção da sequência nucleotídica pode ser o mesmo ou diferente do número de nucleotídeos do oligonucleotídeo adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da porção de sequência antissenso contida em Yz mencionado acima, e a diferença dos mesmos é, de preferência, de 3, com mais preferência, de 1, e particularmente preferencialmente a mesma. No caso de uma fita oligonucleotídica contendo o mencionado acima ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado estar ligada adjacentemente ao lado 3’ da terceira porção da sequência nucleotídica, o número de nucleotídeos pode ser o mesmo ou diferente do número de nucleotídeos da fita oligonucleotídica contendo um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado que estão ligados adjacentemente ao lado 5’ da porção da sequência antissenso contida em Yz, e a diferença dos mesmos é, de preferência, de 3, com mais preferência, de 1, e particularmente preferencialmente, a mesma. No caso de uma fita oligonucleotídica contendo o mencionado acima ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado estar ligada adjacentemente ao lado 5’ da terceira porção da sequência nucleotídica, o número de nucleotídeos pode ser o mesmo ou diferente do número de nucleotídeos da fita oligonucleotídica contendo um ou uma pluralidade de nucleotídeos com açúcar modificado que estão ligados adjacentemente ao lado 3’ da porção da sequência antissenso contida em Yz, e a diferença
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80/259 dos mesmos é, de preferência, de 3, com mais preferência, de 1, e particularmente preferencialmente, a mesma.
[00343] Um aspecto da porção de nucleotídeo com açúcar modificado ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da porção da terceira sequência nucleotídica mencionada acima é similar à porção de nucleotídeo com açúcar modificado ligada adjacentemente a pelo menos um dos lados 3’ e 5’ da segunda porção da sequência nucleotídica no caso de n ser 0 no [A] caso da sequência nucleotídica X contendo uma sequência antissenso.
[00344] Em seguida, o que se segue fornece uma explicação de L, Lx, Ly e uma molécula funcional. O seguinte é comum nos aspectos mencionados acima.
[00345] L representa um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
„p5„y^5„p5_ (em que, cada P5 representa, independentemente, -P(=O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, W5 representa um grupo derivado de um quinto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos, independentemente, selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonudeotideos e nucleotídeos com açúcar modificado, que é um ligante para acoplar com os X e Y mencionados acima. L acopla-se com os X e Y mencionados acima na ordem de X-L-Y.
[00346] Lx representa -P(=O)(OH)-, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
„ρ6„^_ρ6_ em que, cada P6 representa, independentemente, -P(=O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, W6 representa um grupo derivado de um sétimo oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonudeotideos e nucleotídeos
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81/259 com açúcar modificado, e é um ligante que acopla os X e Xz mencionados acima. Lx acopla-se com ο X e o Xz mencionados acima na ordem de Xz-Lx~X. Quando Lx é -P(-O)(OH)~, Xz e X são diretamente acoplados através da ligação fosfodiéster do nucleotídeo.
[00347] Ly representa um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
...p7..W7-P7(em que, cada P7 representa independentemente -P(™O)(OH)- ou [00348] -P(=O)(SH)-, W7 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo Ly que é composto de 1 a 50 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, e é um ligante que acopla-se com Y e Yz mencionados acima. Ly acopla-se com o Y e o Yz mencionados acima na ordem de Y-Ly~Yz. Quando Ly é [00349] -P(=O)(OH)-, Y e Yz são diretamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster do nucleotídeo.
[00350] Pelo menos um de L, Lx e Ly é o grupo de ligação mencionado acima que contém uma estrutura não nucleotídica. Quando o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção tem dois ou mais grupos de ligação contendo a estrutura não nucleotídica, cada grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica pode ser igual ou diferente.
[00351] Quando méOenéO, Léo grupo de ligação mencionado acima que contém uma estrutura não nucleotídica.
[00352] Quando m é 1 e n é 0, pelo menos um de L e Lx é o grupo de ligação mencionado acima que contém uma estrutura não nucleotídica.
[00353] Quando m é 0 e n é 1, pelo menos um de L e Ly é o grupo de ligação mencionado acima que contém uma estrutura não nucleotídica.
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82/259 [00354] Quando m é 1 e n é 1, peto menos um de L, Lx e Ly é o grupo de ligação mencionado acima que contém uma estrutura não nucleotídica.
[00355] O grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica é um grupo de ligação tendo pelo menos um de uma estrutura não nucleotídica como uma unidade estrutural. A estrutura não nucleotídica pode ser mencionada, por exemplo, uma estrutura sem base. O grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica pode conter um nucleotídeo (como um grupo desoxirribonucleosídeo e um grupo ribonucleosídeo), ou pode não conter o mesmo. O grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica pode ser mencionado, por exemplo, nos seguintes grupos.
[00356] Em uma certa modalidade, o grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica pode ser mencionado como o grupo representado pela seguinte fórmula:
-- L P 1 1 - ( - O - V ! 1 -) q , , -- O -- J q , 2 - P 1 1 {em que, V11 representa [00357] um grupo alquileno C2-50 [00358] (0 grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados do grupo substitute Va), [00359] um grupo selecionado das seguintes fórmulas (XI11-1) a (XIII-11):
RO
NH
O u * 'o’ H ü 1 'θ’ n Q O MU”0 ... K ' ·'*’ H > sM A íA M' ‘ 'V £ il '' Λρ* Q x í vita o· H » -p-
ξ MM ) (3)
.....
(XíM} (X111--5)
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83/259
Ο
Η ξΧ«)
Re w
o1 f>'; (x 11 · ·»)
Q H
Η ,^ν>'··ίΥ * O — Ww (W) ( ΧίίΜβ } •Rbl
Sc H.
30, ρ1 é um número inteiro de (em que, ο1 é um número inteiro de 0 a 30, d1 é um número inteiro de 1 a 10, w é um número inteiro de 0 a
3, Rb representa um átomo de haiogêneo, um grupo hidroxila, um grupo amino, um grupo alcóxi Ci-6, um grupo alcóxi C1-6 substituído por um grupo alcóxi Ci-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilamino Ci-β, um grupo dialqullamino C1-6 ou um grupo alquila C1-6, Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila Ci-β, um grupo halo-alquila Ci-6, um grupo alquilcarbonila C1-6, um grupo halo-alquilcarbonila Ci-β, um grupo alcoxicarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonlla C1-6 substituído por um grupo alcoxila Ci-β ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaminocarbonila Ci-6, um grupo dialquilaminocarbonlla C1-6, um grupo alquilsulfonila C1-6, um grupo halo-alqullsulfonlla Ci-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi Ci-β ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaminossulfonila C1-6 ou um grupo dialquilaminossulfonila Ci-δ), [00360] um grupo ribonucleosídeo ou [00361] um grupo desoxlrrlbonucleosídeo, [00362] pelo menos um de V11 representa um grupo alquileno C2-50 (0 grupo alquileno C2 50 é não substituído, ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados de um grupo substitute Va), ou um grupo selecionado das fórmulas mencionadas acima (XIII-1) a (XIII-11), [00363] 0 grupo substitulnte Va significa um grupo substituinte constituído por um grupo hidroxila, um átomo de haiogêneo, um grupo cia
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84/259 no, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo carbamoíla, um grupo sulfamoíla, um grupo fosfono, um grupo sulfo, um grupo tetrazolila e um grupo formila, [00364] cada P11 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, [00365] pelo menos um P11 representa -P(=O)(OH)-, [00366] qn é um número inteiro de 1 a 10, qi2 é um número inteiro de 1 a 20, e quando pelo menos um de qn e qi2 é 2 ou mais, V11 é igual ou diferente}.
[00367] Neste pedido, o1 é, de preferência, um número inteiro de 1 a 30, e p1 é, de preferência, um número inteiro de 1 a 30. qn é, de preferência, um número inteiro de 1 a 6 e, com mais preferência, um número inteiro de 1 a 3. qi2 é, de preferência, um número inteiro de 1 a 6 e, com mais preferência, um número inteiro de 1 a 3. P11 é, de preferência, -P(=O)(OH)-.
[00368] Em uma certa modalidade, o grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica pode ser mencionado como o grupo representado pela seguinte fórmula:
.... Γ p I .... ( .... Q .... v 1 ....) q 3 .... O .... J q 4 .... p 1 ....
{em que, V1 representa [00369] um grupo alquileno C2-50 [00370] (0 grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados do grupo substituinte Va), [00371] um grupo selecionado do grupo consistindo nas seguintes fórmulas (XI-1) a (XI-10):
Q H o
VL· N Y Μ,ί ·. : “ ' „ t
9' H â :·'ν H g P W M s p· M O
íX42 ) (XS-3·)
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85/259 o
Ά..
H (XM )
Η
Ν<
Η:
Μ.
,Ν ,ο 'Pd5 hn' 'O ,ο.
< Xi-10) (em que, o1 é um número inteiro de 0 a 30, p1 é um número inteiro de 0 a 30, d1 é um número inteiro de 1 a 10, w é um número inteiro de 0 a 3, Rb representa um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo amino, um grupo alcóxi Ci-e, um grupo alcóxi C1-6 substituído por alcóxi Ci-β ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaum grupo dialquilamino C1-6 ou um grupo alquila Ci-e), um grupo ribonucleosídeo ou um grupo desoxirribonucleosídeo, pelo menos um de V1 representa um grupo seledonado de um grupo mino C1-6, [00372] [00373] [00374] um grupo alquileno C2 50 (0 grupo alquileno C2 50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados de um grupo substituinte Va), ou as fórmulas mencionadas acima (XI-1) a (XI-10), [00375] 0 grupo substituinte Va significa um grupo substituinte constituído por um grupo hidroxila, um átomo de halogêneo, um grupo ciano, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo carbamoíla, um grupo sulfamoíla, um grupo fosfono, um grupo sulfo, um grupo tetrazolila e um grupo formila, [00376] cada P1 representa independentemente -Ρί-ΟχΌΗ)·· ou P(=O)(SH)-, [00377] pelo menos um P1 representa -P(=O)(OH)-,
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86/259 [00378] qs é um número inteiro de 1 a 10, q4 é um número inteiro de 1 a 20, e quando pelo menos um de qs e q4 é 2 ou mais, e V1 é igual ou diferente.
[00379] Neste pedido, o1 é, de preferência, um número inteiro de 1 a 30, p1 é, de preferência, um número inteiro de 1 a 30. qs é, de preferência, um número inteiro de 1 a 6 e, com mais preferência, um número inteiro de 1 a 3. q4 é, de preferência, um número inteiro de 1 a 6 e, com mais preferência, um número inteiro de 1 a 3. P1 é, de preferência, -P(=O)(OH)-.
[00380] Em uma determinada modalidade, o grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica pode ser um grupo mencionado representado pela seguinte fórmula:
- LP (OH) -- (- O -- V 15 --) qr-O-J P %O) (OH) {em que, Vo representa [00381] um grupo alquileno C2-50 [00382] (o grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados do grupo substituinte Va), [00383] um grupo selecionado do grupo consistindo nas seguintes fórmulas (X-1) a (X-9):
Figure BR112019014547A2_D0014
Figure BR112019014547A2_D0015
Figure BR112019014547A2_D0016
h PÓ Η , s h a p (>•-3 >
Figure BR112019014547A2_D0017
(X-4)
Figure BR112019014547A2_D0018
Figure BR112019014547A2_D0019
Figure BR112019014547A2_D0020
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87/259
Figure BR112019014547A2_D0021
Figure BR112019014547A2_D0022
(Χ-β)
Α.
(Χ*8) (em que ο é um número inteiro de 0 a 30 e p é um número inteiro de 1 a 30.) [00384] um grupo ribonucieosídeo ou [00385] um grupo desoxirribonucleosídeo, [00386] pelo menos um de Vo representa um grupo selecionado de um grupo alquileno C2-50 (0 grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados de um grupo substituinte Va), ou as fórmulas mencionadas acima (X-1) a (X-9), [00387] 0 grupo substituinte Va significa um grupo substituinte constituído por um grupo hidroxila, um átomo de halogêneo, um grupo ciano, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo oarbamoíla, um grupo sulfamoíla, um grupo fosfono, um grupo suifo, um grupo tetrazolila e um grupo formila, [00388] qi é um número inteiro de 1 a 10, qz é um número inteiro de 1 a 20, e quando pelo menos um de qi e qz é 2 ou mais, Vo é igual ou diferente}.
[00389] Neste pedido, 0 é, de preferência, um número inteiro de 1 a 30, p é, de preferência, um número inteiro de 1 a 30. qi é, de preferência, um número inteiro de 1 a 6 e, com mais preferência, um número inteiro de 1 a 3. qz é, de preferência, um número inteiro de 1 a 6 e, com mais preferência, um número inteiro de 1 a 3.
[00390] L e X são, de preferência, acoplados através de uma ligação covalente e, por exemplo, um átomo de oxigênio no qual um átomo de hidrogênio é removido de um grupo hidroxila de porções de açúcar (no nucieotídeo com açúcar modificado, inclui uma estrutura
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88/259 parcial substituída por um esqueleto de açúcar) do nucleotideo terminal de X é, de preferência, acoplado com L. L e Y são, de preferência, acoplados através de uma ligação covalente e, por exemplo, um átomo de oxigênio em que um átomo de hidrogênio é removido de um grupo hidroxila de porções de açúcar (no nucleotideo com açúcar modificado, inclui uma estrutura parcial substituída por um esqueleto de açúcar) do nucleotideo terminal de Y é, de preferência, acoplado com L.
[00391] Também, similarmente, Lx e X são, de preferência, acoplados nas porções de açúcar do nucleotideo terminal de X, e Lx e Xz são, de preferência, acoplados nas porções de açúcar do nucleotideo terminal de Xz. Similarmente, Ly e Y são, de preferência, acoplados nas porções de açúcar do nucleotideo terminal de Y, e Ly e Yz são, de preferência, acoplados nas porções de açúcar do nucleotideo terminal de Yz. Quando o nucleotideo terminal mencionado acima é um nucleotideo com açúcar modificado, as porções de açúcar acima mencionadas contêm uma estrutura parcial substituída de um esqueleto de açúcar.
[00392] Quando X é acoplado a L no lado 3’, Y é acoplado a L no lado 5’. Além disso, quando m é 1, X é acoplado a Lx no lado 5’, e Xz é acoplado a Lx no lado 3’. Além disso, quando n é 1, Y é acoplado a Ly no lado 3’, e Yz é acoplado a Ly no lado 5’.
[00393] Quando X é acoplado a L no lado 5’, Y é acoplado a L no lado 3’. Além disso, quando m é 1, X é acoplado a Lx no lado 3’, e Xz é acoplado a Lx no lado 5!. Além disso, quando n é 1, Y é acoplado a Ly no lado 5’, e Yz é acoplado a Ly no lado 3’.
[00394] L é desejavelmente decomposto rapidamente do que a porção da sequência antissenso mencionada acima. Lx e Ly são os mesmos.
[00395] O grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica em L é, de preferência, um grupo representado pela seguinte fórPetição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 124/357
89/259 mula:
- L P 3 ” (“Ο-V3-) q <) q 6 - P 3 ~ {em que, V3 representa [00396] um grupo alquileno C2-20 (0 grupo alquileno C220 é não substituído ou substituído por um ou mais substitutes independentemente selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxila, um grupo amino e um grupo oxo), [00397] um grupo selecionado do grupo consistindo nas seguintes fórmulas (XIV-1) a (XIV-11):
Figure BR112019014547A2_D0023
(XIV-1 )
Figure BR112019014547A2_D0024
Figure BR112019014547A2_D0025
(XIV-3 )
Figure BR112019014547A2_D0026
(XIV-4 )
Figure BR112019014547A2_D0027
(XIV-5 )
Figure BR112019014547A2_D0028
(XIV-6 )
Figure BR112019014547A2_D0029
(XIV-7 )
Figure BR112019014547A2_D0030
(XIV-8 )
Figure BR112019014547A2_D0031
Rc
Figure BR112019014547A2_D0032
(XIV-10 ) (XIV-11 ) (em que, o1 é um número inteiro de 0 a 10, p1 é um número inteiro de 0 a 10, d1 é um número inteiro de 1 a 10, w é um número inteiro de 0 a 2, Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6, um grupo halo-alquila C1-6, um grupo alquilcarboniia C1-6, um grupo haloalquiicarbonila C1-6, um grupo alcoxicarboniia C1-6, um grupo alcoxicarboniia C1.6 substituído por um grupo alcóxi C1.6 ou um grupo carbamoíPetição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 125/357
90/259
Ia, um grupo monoalquilaminocarbonila C1-6, um grupo dialquilaminocarbonila C1-6, um grupo alquilsulfonila C1-6, um grupo halo-alquilsulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6 substituído por um grupo aicóxi C1-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilamino C1-6 ou um grupo dialquilamino Ci-e), [00398] um grupo ribonucleosídeo ou [00399] um grupo desoxirribonucleosídeo, [00400] pelo menos um de V3 representa um grupo alquileno C2-20 (0 grupo alquileno C2 20 é não substituído, ou substituído por um ou mais substituintes selecionados independentemente do grupo que consiste em um grupo hidroxila, um grupo amino e um grupo oxo), ou um grupo selecionado das fórmulas acima mencionadas (XIV-1) a (XIV-11), [00401] cada P3 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, [00402] pelo menos um P3 representa -P(=O)(OH)-, [00403] qs é um número inteiro de 1 a 10, qe é um número inteiro de 1 a 20, e quando pelo menos um de qs e qs é 2 ou mais, V3 é igual ou diferente.
[00404] O grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica em L é, com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (-O) (OH) -O (CH,) r—O —P (-O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 2 a 20).
[00405] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
--P (—O) (OH) -- (OCH2CH2) S--O--P ú-O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 1 a 10).
[00406] O grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica em L é, com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
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91/259
--P (= O) (OH) O (CH2) r-O-p (= O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00407] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (=O) (OH) - (OCH..CH,) C) P (=O) (OH) - (em que, s é um número inteiro de 3 a 6).
[00408] Em um outro aspecto do mesmo, o grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica em L é, de preferência, um grupo representado peia seguinte formula:
P' L (OCH2CH,) s1- O- P2- J s2_ (em que, cada P2 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou [00409] -P(“O)(SH)··, pelo menos um P2 representa -P(=O)(OH)-, s1 é um número inteiro de 1 a 10 e s2 é um número inteiro de 1 a 6), [00410] com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (= O) (OH) - L (O C H 2 C H 2) s 1 - O - P 2 - J s 2 2 - (OCH, C
H2) s 1 -O-P (=O) (OH) (em que, cada P2 representa independentemente ~P(™O)(OH)~ ou [00411] “P(=O)(SH)-, s1 é um número inteiro de 1 a 10 e s22 é um número inteiro de 0 a 5), [00412] com ainda mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) - L (OCH2CH2) s · O !' ( = O) (OH) - J s2(em que, s1 é um número inteiro de 1 a 10 e s2 é um número inteiro de 1 a 6).
[00413] O s1 mencionado acima é, de preferência, um número inteiro de 1 a 6, ainda com mais preferência, um número inteiro de 3 a 6. O s2 mencionado acima é, de preferência, um número inteiro de 1 a 5, ainda com mais preferência, um número inteiro de 1 a 3. O s22 mencionado acima é, de preferência, um número inteiro de 0 a 4, com ainda
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92/259 mais preferência, um número inteiro de 0 a 2.
[00414] Em um outro aspecto do mesmo, o grupo de ligação contendo a estrutura não nucleotídica em L é, de preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (=0) (OH) -O-V2-O-P (=O) (OH) {em que, V2 representa um grupo representado pela seguinte fórmula (XII-1), (XII-3), (XII-7) ou (XII-8):
Figure BR112019014547A2_D0033
(Xii-1) (XII-3)
Figure BR112019014547A2_D0034
(XII-7) {XII-8 ) (em que, o2 é um número inteiro de 1 a 6, p2 é um número inteiro de 1 a 6, d2 é um número inteiro de 1 a 6)}. Entre eles, é, com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
--P (~O) (OH) Ο V O P O O) (OH) {em que, V2 representa um grupo representado pela seguinte fórmula (XII-1), (XII-3), (XII-7) ou (XII-8):
Figure BR112019014547A2_D0035
( XII-1 ) ( XII-3 )
Figure BR112019014547A2_D0036
(Xll-7)
Figure BR112019014547A2_D0037
(XII-8 ) (em que, o2 é um número inteiro de 3 a 5, p2 é um número inteiro de 3 a 5 e d 2 é 4)},
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93/259 [00415] Em outro aspecto do mesmo, o grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica em L é, de preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-- P 14 -- r o -- v14 -- o -- P : 4 -- J < -- o -- V 14 -- o -- P 14 -{em que, cada V14 representa, independentemente, um grupo representado pela seguinte fórmula (XIV-10) ou (XIV-11):
Rc
Figure BR112019014547A2_D0038
(XIV-10) (XIV-11) (em que, w é 0 ou 1, Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6, um grupo halo-alquila C1-6, um grupo alquilcarbonlla C1-6, um grupo halo-alquilcarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi C1-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaminocarbonlla C1-6, um grupo dialquilaminocarbonila C1-6, um grupo alquilsuifonila Ci e, um grupo halo-alquilsulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi C1-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilamino C1-6 ou um grupo dialquilamino Ci-6), [00416] um grupo ribonucleosídeo ou [00417] um grupo desoxirribonucleosídeo), [00418] pelo menos um dos V14 é um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XIV-10) ou (XIV-11), [00419] cada P14 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, [00420] pelo menos um P14 representa -P(=O)(OH)-, [00421] s14 é um número inteiro de 0 a 9, e quando s14 é 1 ou mais,
V14 é igual ou diferente}, [00422] P14 é, de preferência, -P(=O)(OH)-.
[00423] s14 é, de preferência, um número inteiro de 2 a 6, com mais
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94/259 preferência, 3 ou 4.
[00424] O grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica em L é, com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P 4 - Γ O - V 4 - O - P 4 - J s 4 (em que, cada P4 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou [00425] -P(=O)(SH)-, pelo menos um P4 representa -P(=O)(OH)-, s4 é um número inteiro de 1 a 10, cada V4 representa, independentemente, a seguinte fórmula (XIV-10) (XIV-10) (em que, W é 0 ou 1), um grupo de ribonucleosideo ou um grupo de desoxirribonucleosídeo, pelo menos um de V4 é um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XIV-10)), [00426] com ainda mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (O) (OH) - [ O - V 4 - O - P 4 - Ί s 4 4 - O - V 4 - O - P (O) ( OH) (em que, cada P4 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou [00427] -P(=O)(SH)-, s44 é um número inteiro de 0 a 9, cada V4 representa, independentemente, a seguinte fórmula (XIV-10) (XIV-10 ) (em que, W é 0 ou 1), um grupo de ribonucleosideo ou um grupo de desoxirribonucleosídeo, pelo menos um de V4 é um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XIV-10)), [00428] ainda com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (== O) (OH) - Γ O - V 4 - O - P (- O) (OH) - J s 4 Petição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 130/357
95/259 (em que, s4 é um número inteiro de 1 a 10, cada V4 representa independentemente um grupo representado pela seguinte fórmula (XIV-10)
Figure BR112019014547A2_D0039
(XIV-10) (em que, W é 0 ou 1), um grupo de ribonucleosideo ou um grupo de desoxirribonucleosídeo, pelo menos um de V4 é um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XIV-10)). s4 é, de preferência, um número inteiro de 3 a 7, com mais preferência, 4 ou 5. s44 é, de preferência, um número inteiro de 2 a 6, com mais preferência, 3 ou 4.
[00429] V4 é, de preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula (XV-10):
Figure BR112019014547A2_D0040
(XV-10) (em que, wéOou 1), um grupo de ribonucleosideo ou grupo de desoxirribonucleosídeo, e pelo menos um de V4 é um grupo representado peia fórmula mencionada acima (XV-10), com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula (XVI-10):
(XVI-10) (em que, wéOou 1), um grupo de ribonucleosideo ou grupo de desoxirribonucleosídeo, pelo menos um de V4 é um grupo representado peia fórmula mencionada acima (XVI-10), ainda com mais preferência, um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XVI-10), particularmente preferencialmente, um grupo representado pela seguinte fórmula (XII-10):
( ΧΙΙ-10 } [00430] Com relação às fórmulas mencionadas acima (XII-10), (XV
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10) e (XVI-10), quando dois ou mais 2-metil-tetra-hidrofuranos são acoplados através de uma ligação fosfodiéster ou uma ligação fosforotioato, a ligação fosfodiéster acopla preferencialmente a posição 3 de um dos anéis de tetra-hidrofurano e um grupo metila ligado na posição 2 de outro anel de tetra-hidrofurano.
[00431] Em outro aspecto do mesmo, o grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica em L é, de preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P 8 - L O - V 8 - O - P 8 - Ί s 8 {em que, V8 representa [00432] ou um grupo representado pela seguinte fórmula (XV-11):
Figure BR112019014547A2_D0041
(XV-11 ) (em que, Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6, um grupo halo-alquila C1-6, um grupo alquilcarbonila Ci-β, um grupo halo-alquilcarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila Ci-6, um grupo alcoxicarbonila C1-6 substituído por um grupo alcóxí Cue ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaminocarbonila C1-6, um grupo dialquilaminocarbonila C1-6, um grupo alquilsulfonila C1-6, um grupo haloalquilsulfonlla C1-6, um grupo alcoxissulfonila Ci-e, um grupo alcoxíssulfonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi Ci-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilamino C1-6 ou um grupo dialquilamino Ci-e), [00433] um grupo ribonucleosídeo ou [00434] um grupo desoxirribonucleosídeo), [00435] pelo menos um dos V8 é um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XV-11), [00436] cada P8 representa independentemente -P(~O)(OH)- ou P(=O)(SH)-,
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97/259 [00437] peto menos um P8 representa -P(=O)(OH)-, [00438] s8 é um número inteiro de 1 a 10, e quando s8 é 2 ou mais, V8 é igual ou diferente}, [00439] com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (=== O) (OH) - [ O - V 9 - O -- P 9 - J s 9 9 - O - V 9 - O - P (=== O) (
OH) {em que, V9 representa [00440] ou um grupo representado pela seguinte fórmula (XVI-11):
Rc (XVI-11 ) (em que, Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6, um halo-alquila C1-6, um grupo alquilcarbonila C1-6, um grupo haloalquilcarbonila Coe, um grupo alcoxicarbonila C1-6, um grupo monoalquilaminocarbonila Ci-6, um grupo dialquilaminocarbonila C1-6, um grupo alquilsulfonila C1-6, um grupo halo-alquilsulfonila C1-6, um grupo alcoxisulfonila Ci-6, um grupo monoalquilaminossulfonila C1-6, ou um grupo dialquilaminossulfonila Ci-s), [00441] [00442] [00443] mula mencionada acima (XVI-11), [00444] cada P9 representa independentemente -P(=O)(OH)~ ou P(=O)(SH)-, [00445] s99 é um número inteiro de 0 a 9, e quando s99 é 1 ou mais,
V9 é igual ou diferente}, [00446] com ainda mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
um grupo ribonucleosídeo ou um grupo desoxirribonucleosídeo), peto menos um dos V9 é um grupo representado pela fórPetição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 133/357
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- P (- Ο) (Ο Η) - Lο - V 1 0 - Ο - Ρ (~ Ο) (Ο Η) -Ί s 1 0 {em que, V10 representa [00447] um grupo representado pela seguinte fórmula (XVII-11):
Rc
VK/N.
(XVII-11 ) (em que, Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6, um grupo halo-alquila C-i-6, um grupo alquilcarbonila C1-6, um grupo halo-alquilcarbonila C1-6 ou um grupo alcoxicarbonila Ci-e), [00448] ou um grupo ribonucleosídeo), [00449] pelo menos um dos V10 é um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XVII-11), [00450] s10 é um número inteiro de 1 a 10, e quando s10 é 2 ou mais, V10 é igual ou diferente}, s10 é, de preferência, um número inteiro de 3 a 7, com mais preferência, 4 ou 5.
[00451] O grupo de ligação preferencial que contém uma estrutura não nucleotídica em Lx e o grupo de ligação preferencial que contém uma estrutura não nucleotídica em Ly são os mesmos que o grupo de ligação preferencial mencionado acima que contém uma estrutura não nucleotídica em L.
[00452] Quando L é um grupo representado pela fórmula: -P5-W5-P5(em que, cada P5 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou [00453] -P(=O)(SH)-, W5 representa um grupo derivado de um quinto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado), o quinto oligonucleotídeo é, de preferência, um oligonucleotídeo que é degradado em condições fisiológicas. P5 é, de preferência,
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99/259 [00454] -P(=O)(OH)-.
[00455] Quando Lx é um grupo representado pela seguinte fórmula: _p6_w®-P6(em que, cada P6 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou [00456] -P(=O)(SH)-, W6 representa um grupo derivado de um sexto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonudeotideos e nudeotídeos com açúcar modificado), o sexto oligonucleotídeo é, de preferência, um oligonucleotídeo que é degradado em condições fisiológicas. P6 é, de preferência, -Ρί-ΟχΌΗ)··.
[00457] Quando Ly é um grupo representado pela seguinte fórmula: -P7-W7-P7(em que, cada P7 representa, independentemente, -P(=O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, W7representa um grupo derivado de um sétimo oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonudeotideos, ribonudeotideos e nucleotídeos com açúcar modificado), o sétimo oligonucleotídeo é, de preferência, um oligonucleotídeo que é degradado sob condições fisiológicas. P7 é, de preferência, -P(-O)(OH)~.
[00458] Neste pedido, um oligonucleotídeo degradado sob condições fisiológicas pode ser qualquer oligonucleotídeo que seja degradado por enzimas como várias DNase (desoxirribonuclease) e RNase (ribonuclease) sob condições fisiológicas, e uma porção de base, porção de açúcar ou ligação de fosfato podem ou podem não ser quimicamente modificadas na totalidade ou em uma parte dos nucleotídeos que compõem o oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo degradado sob condições fisiológicas contém, por exemplo, pelo menos uma ligação fosfodiéster.
[00459] O quinto oligonucleotídeo tem grupos hidroxila na extremidade 3’ e na extremidade 5!, e um grupo derivado do quinto oligonu
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100/259 cleotídeo é um grupo no qual um átomo de hidrogênio é removido dos grupos hidroxila na extremidade 3’ e na extremidade 5’, respectivamente. O sexto oligonucleotídeo e o sétimo oligonucleotídeo são os mesmos que o quinto oligonucleotídeo.
[00460] O quinto oligonucleotídeo é, de preferência, um oligonucleotídeo acoplado a uma ligação fosfodiéster, com mais preferência, oligodesoxirribonucleotídeo ou oligorribonucleotídeo, ainda com mais preferência, DNA ou RNA, e, ainda com mais preferência, RNA. O sexto oligonucleotídeo e o sétimo oligonucleotídeo são os mesmos que o quinto oligonucleotídeo.
[00461] O quinto oligonucleotídeo pode ou não conter uma sequência parcialmente complementar no quinto oligonucleotídeo, e o quinto oligonucleotídeo é, de preferência, um oligonucleotídeo que não contém uma sequência parcialmente complementar no quinto oligonucleotídeo. Exemplos de grupos derivados de tal oligonucleotídeo Incluem (N)k (cada N representa independentemente adenosina, uridina, citidina, guanosina, 2’-desoxiadenosina, timidina, 2’-desoxicitidina ou 2’~ desoxiguanoslna, e k é um número inteiro de 1 a 40 (um número de repetição)) acoplado através de ligação fosfodiéster. Entre eles, k é de preferência 3 a 20, com mais preferência, 4 a 10, ainda com mais preferência, 4 a 7, ainda com mais preferência, 4 ou 5, e particularmente preferencialmente 4. O sexto oligonucleotídeo e o sétimo oligonucleotídeo são os mesmos que o quinto oligonucleotídeo. Em relação ao sexto oligonucleotídeo e ao sétimo oligonucleotídeo, em outro aspecto do mesmo, k é de preferência 2 a 5, com mais preferência, 2 a 4.
[00462] Quando o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção tem um grupo derivado do quinto oligonucleotídeo e um grupo derivado do sexto oligonucleotídeo, o quinto oligonucleotídeo pode ter a mesma sequência que o sexto oligonucleotídeo, ou uma sequência diferente.
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101/259 [00463] Quando o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção tem um grupo derivado do quinto oligonucleotídeo e um grupo derivado do sétimo oligonucleotídeo, o quinto oligonucleotídeo pode ser a mesma sequência que o sétimo oligonucleotídeo, ou uma sequência diferente.
[00464] Quando o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção tem um grupo derivado do sexto oligonucleotídeo e um grupo derivado do sétimo oligonucleotídeo, o sexto oligonucleotídeo pode ser a mesma sequência que o sétimo oligonucleotídeo, ou uma sequência diferente. Além disso, o sexto oligonucleotídeo e o sétimo oligonucleotídeo podem ou não se hibridizar na molécula e, de preferência, se hi~ bridizar na molécula.
[00465] Uma molécula funcional pode estar ligada direta ou indiretamente a X, Y, Xz, Yz, L, Lx e Ly. No caso de pelo menos um de X (um grupo derivado do primeiro oligonucleotídeo) e Xz (um grupo derivado do terceiro oligonucleotídeo) contiver uma porção de sequência antissenso, a molécula funcional é, de preferência, ligada ao segundo oligonucleotídeo ou ao quarto oligonucleotídeo. A ligação entre a molécula funcional e o segundo oligonucleotídeo ou o quarto oligonucleotídeo pode ser direta ou indiretamente através da outra substância, e o segundo oligonucleotídeo ou o quarto oligonucleotídeo e uma molécula funcional são, de preferência, ligados através de uma ligação covalente, uma ligação iônica ou uma ligação de hidrogênio. Do ponto de vista da estabilidade de ligação elevada, estão, com mais preferência, ligados diretamente através de uma ligação covalente ou ligados a um ligante (um grupo de ligação) através de uma ligação covalente. No caso de Yz (o quarto oligonucleotídeo) conter uma porção de sequência antissenso, a molécula funcional é, de preferência, ligada ao primeiro oligonucleotídeo ou ao terceiro oligonucleotídeo. A ligação entre a molécula funcional e o primeiro oligonucleotídeo ou o terceiro olígo
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102/259 nucleotídeo é a mesma, conforme a ligação entre a molécula funcional e o segundo oligonudeotídeo ou o quarto oligonudeotídeo. No caso de o primeiro oligonudeotídeo e o quarto oligonudeotídeo possuírem, cada um, uma porção de sequência antissenso, a molécula funcional é, de preferência, ligada ao terceiro oligonudeotídeo. A ligação entre a molécula funcional e o primeiro oligonudeotídeo ao quarto oligonucleotídeo é a mesma descrita anteriormente.
[00466] No caso de a molécula funcional mencionada acima estar ligada ao oligonudeotídeo de fita simples por uma ligação covalente, a molécula funcional mencionada acima é, de preferência, ligada direta ou indiretamente à extremidade 3’ ou extremidade 5’ da molécula oilgonudeotídica de fita simples. A ligação entre o ligante mencionado acima ou uma molécula funcional e o nucleotídeo terminal da molécula de oligonudeotídeo de fita simples é selecionada de acordo com a molécula fundonal.
[00467] O ligante mencionado acima ou molécula funcional e o nucleotídeo terminal da molécula de oligonudeotídeo de fita simples são, de preferência, acoplados através de uma ligação fosfodiéster ou uma ligação fosfoditéster modificada e, com mais preferência, acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00468] O ligante mencionado adma ou molécula funcional podem ser diretamente acoplados a um átomo de oxigênio na posição 3’ trazido pelo nucleotídeo na extremidade 3’ da molécula de oligonucleotídeo de fita simples ou um átomo de oxigênio na extremidade 5 trazido pelo nucleotídeo na posição 5’.
[00469] Em um outro aspecto da mesma, a molécula funcional mencionada acima é, de preferência, ligada a L direta ou indiretamente. Neste caso, L é, de preferência, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica e, entre estes, de preferência um grupo representado pela seguinte fórmula:
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- : P 1 2 -- (- Ο - V 1 2 -) q 7 - O - ] q s - P 1 2 {em que, V12 representa [00470] um grupo alquileno C2-20 (0 grupo alquileno C2-20 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxila e um grupo amino), [00471] um grupo selecionado do grupo que consiste nas seguintes fórmulas (VIII-2, 3, 9 ou 11):
Figure BR112019014547A2_D0042
(VIII-2) (VIII-3)
Figure BR112019014547A2_D0043
(VIII-9) (VIII-11) (em que, o1 é um número inteiro de 0 a 10, p1 é um número inteiro de 0 a 10, d1 é um número inteiro de 1 a 10) [00472] um grupo ribonucleosídeo ou [00473] um grupo desoxirribonucleosídeo, [00474] pelo menos um de V12 é um grupo selecionado de um grupo alquileno C2-20 (0 grupo alquileno C2-20 substituído por um ou mais substituintes selecionados do grupo que consiste em um grupo hidróxiIa e um grupo amino), ou as fórmulas mencionadas acima (VIII-2, 3, 9 ou 11), [00475] cada P12 representa independentemente -P(~O)(OH)~ ou P(=O)(SH)-, [00476] pelo menos um P12 representa -P(=O)(OH)-, [00477] q? é um número inteiro de 1 a 10, qs é um número inteiro de 1 a 6, e quando pelo menos um de q? e qs é 2 ou mais, V12 é 0 mesmo
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104/259 ou diferente, com mais preferência um grupo representado pela seguinte fórmula:
-- P (= O) (OH) -- (O C H 2 C H 2) s - O - P (- O) (O H) - O C H 2 C H (NH2) OH,) -OP (~~O) (OH) - (OCH2CH2) s - O - P p-O) ( OH) (em que, cada s é independentemente um número inteiro de 1 a 10) e, particularmente preferencialmente, um grupo representado pela seguinte fórmula:
p ( = o) (oh) - (och2ch2) o -p ( = o) (oh) -och2c H (N H 2) C H 2) - O P ( - O) (OH) - (O C 11 2 C II 2) 2 - O - P ( - O) ( OH) [00478] O grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica de L quando a molécula funcional está ligada a L é, em outro aspecto do mesmo, [00479] com mais preferência representado pela seguinte fórmula:
..... | p 1 2 .... ( .... Q .... V 1 2 .... ) q 7 .... Q .... J q 8 .... p 1 2 ....
{em que, V12 representa [00480] ou um grupo representado pela seguinte fórmula (XVI11-11):
(XVIII-11 ) um grupo ribonucleosídeo ou [00481] um grupo desoxirribonucleosídeo, [00482] pelo menos um dos V12 é um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XVIII-11), [00483] cada P12 representa independentemente -P(~O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, [00484] pelo menos um P12 representa -P(=O)(OH)-, [00485] q7 é 1, qs é um número inteiro de 1 a 6, e quando qs é 2 ou
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105/259 mais, V12 é o mesmo ou diferente}, [00486] com ainda mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
- Γ P 1 2 “ (“ O - V 1 2 -) q - - O - J q 8 - P 12 {em que, V12 representa [00487] ou um grupo representado pela seguinte fórmula (XVI11-12):
(XVIII-12) um grupo ribonucleosideo ou [00488] um grupo desoximbonucleosídeo, [00489] pelo menos um dos V12 é um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XVIII-12), [00490] cada P12 representa independentemente -P(=:O)(OH)- ou P(O)(SH)-, [00491] pelo menos um P12 representa -P(-O)(OH)-, [00492] q? é 1, qs é um número inteiro de 1 a 6, e quando qs é 2 ou mais, V12 é o mesmo ou diferente}, [00493] ainda preferencialmente representado pela seguinte fórmula:
- LP (~O) (OH) - (--O--V12) O q 8 - P (~O) (OH) {em que, V12 representa [00494] ou um grupo representado pela seguinte fórmula (XVI11-12):
(XVIII-12) [00495] um grupo ribonucleosideo ou [00496] um grupo desoxirribonucleosídeo, [00497] pelo menos um dos V12 é um grupo representado pela fór
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106/259 mula mencionada acima (XVIII-12), [00498] qs é um número inteiro de 1 a 6, e quando qe é 2 ou mais, V12 é o mesmo ou diferente}, [00499] Quando a molécula funcional está ligada direta ou indiretamente a L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica, a molécula funcional pode ligar-se direta ou indiretamente ao correspondente átomo de carbono, átomo de nitrogênio, átomo de oxigênio e similares por substituição do átomo de hidrogênio em qualquer porção do grupo de ligação mencionado acima que contém uma estrutura não nucleotídica. Por exemplo, quando o grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica é um grupo representado pela fórmula mencionada acima:
- LP12- (-O-Vi2-) q7-O-l q8-P1?a molécula funcional pode ligar-se ao Rc da fórmula mencionada acima (XIII-2, 3, 9 ou 11), ou um grupo de ligação mencionado posteriormente pode ligar-se ao Rc mencionado acima e a molécula funcional pode ligar-se ao grupo de ligação. Adicionalmente, a molécula funcional pode ligar-se a um grupo alquileno, um grupo ribonucleosídeo, um grupo desoxirribonucleosídeo e similares, através ou não através do grupo de ligação. Quando L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica tem um grupo amino ou um grupo hidroxila, a molécula funcional liga-se preferencialmente a um átomo de nitrogênio de um grupo amino [00500] (-NH2, -NH-, etc.) ou um átomo de oxigênio de um grupo hidroxila do grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica, diretamente ou ainda indiretamente através de um grupo de ligação.
[00501] Não há limitações particulares na estrutura da molécula funcional, e uma função desejada é conferida ao nucleotideo de fita simples como resultado da ligação com 0 mesmo. Exemplos de fun
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107/259 ções desejadas incluem uma função de marcação, função de purificação e função de entrega a um sítio alvo. Exemplos de moléculas que conferem uma função de marcação incluem proteínas fluorescentes e compostos como a luciferase. Exemplos de moléculas que conferem uma função purificadora incluem compostos como biotina, avidina, peptídeo com marcador His, peptídeo com marcador GST ou peptídeo com marcador FLAG.
[00502] Além disso, do ponto de vista da entrega eficiente de um oligonucleotídeo de fita simples a um sítio alvo (como uma célula alvo) com alta especificidade e suprimindo de forma extremamente eficaz um gene alvo com esse oligonucleotídeo de fita simples, uma molécula tendo uma função que faz com que o oligonucleotídeo de fita simples seja entregue a um sítio alvo é, de preferência, ligado como uma molécula funcional. Publicações como European Journal of Pharmaceuticals and Biopharmaceutics, Vol. 107, pp. 321 a 340 (2016), Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 104, pp. 78 a 92 (2016), Expert Opinion on Drug Delivery, Vol. 11, pp. 791 a 822 (2014) podem ser referidas em relação a moléculas que possuem essa função de entrega.
[00503] Exemplos de moléculas que conferem uma função de entrega ao RNA alvo incluem lipídios e açúcares do ponto de vista de, por exemplo, serem capazes de distribuir eficientemente um oligonucleotídeo de fita simples ao fígado e similares com alta especificidade. Exemplos de tais lipídios incluem colesterol; ácidos graxos; vitaminas lipossolúveis, como vitamina E (tocoferóís, tocotríenóis), vitamina A, vitamina D e vitamina K; metabólitos intermediários, como acilcarnitina e acil-CoA; glicolipídios; glicerídeos; e derivados dos mesmos. Entre estes, colesterol e vitamina E (tocoferóís, tocotríenóis) são preferenciais do ponto de vista de maior segurança. Entre estes, tocoferóís são ainda mais preferenciais, tocoferol é ainda mais preferencial, e □tocoferol é particularmente preferencial. Exemplos de açúcares ínciu
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108/259 em derivados de açúcar que interagem com receptores de asialoglicoproteínas.
[00504] Os receptores de asialoglicoproteínas estão presentes na superfície das células do fígado e têm uma ação que reconhece um resíduo de galactose de uma asialoglicoproteína e incorpora as moléculas na célula onde elas são degradadas. Derivados de açúcar que interagem com receptores de asialoglicoproteínas são, de preferência, compostos que têm uma estrutura que se assemelha a um resíduo de galactose e são incorporados nas células devido à interação com receptores de asialoglicoproteínas, e exemplos dos mesmos incluem derivados de GaINac (N-acetilgalactosamina), derivados de galactose e derivados de lactose. Além disso, do ponto de vista de ser capaz de entregar eficíentemente o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção ao cérebro com alta especificidade, exemplos das moléculas funcionais incluem açúcares (como glicose e sacarose). Além disso, do ponto de vista da capacidade de distribuir eficientemente o oligonucleotídeo de fita simples a vários órgãos com alta especificidade interagindo com várias proteínas na superfície celular desses órgãos, exemplos de moléculas funcionais incluem ligantes de receptores, anticorpos e peptídeos ou proteínas de fragmentos dos mesmos.
[00505] Uma vez que o ligante utilizado para intermediar a ligação entre uma molécula funcional e X, Y, Xz, Yz, L, Lx ou Ly é apenas necessário para ser capaz de demonstrar a função trazida pela molécula funcional como um oligonucleotídeo de fita simples, não existem limitações particulares no ligante desde que ligue estavelmente a molécula funcional e o oligonucleotídeo. Exemplos do ligante incluem um grupo derivado de oligonucleotídeos tendo um número de nucleotídeos de 2 a 20, um grupo derivado de polipeptídeos possuindo um número de aminoácidos de 2 a 20, um grupo alquileno tendo 2 a 20 átomos de carbono e um grupo alquenileno com 2 a 20 átomos de carbono. O
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109/259 grupo mencionado acima derivado de oligonucleotídeos tendo um número de nucleotídeos de 2 a 20 é um grupo no qual um grupo hidroxila ou um átomo de hidrogênio é removido dos oligonucleotídeos tendo um número de nucleotídeos de 2 a 20. O grupo mencionado acima derivado de polipeptídeos possuindo um número de aminoácidos de 2 a 20 é um grupo no qual um grupo hidroxila, um átomo de hidrogênio ou um grupo amino é removido dos polipeptídeos tendo um número de aminoácidos de 2 a 20. Além disso, publicações como European Journal of Pharmaceuticals and Biopharmaceutics, Vol. 107, pp. 321 a 340 (2016), Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 104, pp. 78 a 92 (2016), Expert Opinion on Drug Delivery, Vol. 11, pp. 791 a 822 (2014), e Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 59, p. 2718 (2016) e os materiais indexados nas publicações podem ser referidos em relação à estrutura do ligante.
[00506] O ligante é, de preferência, um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenlleno C2-20 (grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenlleno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou dois substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, ~NRB~ (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-β), -S-, -8(=0)- ou S(=O)2-). Neste pedido, através da combinação das substituições e permutações mencionadas acima, 0 ligante pode também conter um grupo representado por-C(=O)-O-, -O-C(=O)-NR1- (R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila C1.6), -C(=O)-NR1- (R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-β), -C(=S)-NR1- (R1 representa
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110/259 um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo haloalquila Cue) ou -NF<LC(-O)-NR1- (R1 representa cada um independentemente um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-e).
[00507] O ligante é, com mais preferência, um grupo alquileno C2-20 (grupos metlleno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos, ou substituídos por -O. Os grupos metileno não substituídos são, cada um, independentemente não substituídos, ou substituídos por um grupo hidroxila ou um grupo hidroxila protegido), ainda com mais preferência um grupo alquileno C8-12 (grupos metileno do grupo alquileno são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por - O-. Os grupos metileno não substituídos são, cada um, independentemente não substituídos, ou substituídos por um grupo hidroxila) e, particularmente preferencialmente, um grupo 1,8-octileno. Além disso, como outro aspecto do mesmo, 0 ligante é particularmente preferencialmente um grupo representado pela seguinte fórmula (III).
*
Figure BR112019014547A2_D0044
[00508] Na fórmula, um asterisco (*) representa um sítio de ligação (um átomo que compõe um nucleotídeo) com um grupo derivado de um oligonucleotídeo, enquanto 0 outro asterisco (*) representa um sítio de ligação (um átomo que compõe um grupo derivado de uma molécula funcional) com um grupo derivado de uma molécula funcional.
[00509] Como outro aspecto do mesmo, 0 ligante é, com mais preferência, um grupo alquileno C2-20 (grupos metileno do grupo alquileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O- ou -NRB- (RB é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila Ci-β). Os grupos metileno não substituídos são, cada um, independentemente não substituídos, ou substituídos por um grupo oxo), e
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111/259 ainda com mais preferência um grupo representado pela seguinte fórmula:
-~N (H) C ( = O) ~ (CH2) c-N (H) C ( = O) - (CH2) c - C ( = O ) (em que, cada e representa independentemente um número inteiro de 1 a 6) e, particularmente preferencialmente, um grupo representado pela seguinte fórmula:
— N (H) C (-O) - (CH2) 2 -N (H) C - ÍCH,) 2 C ' (>
) [00510] Como outro aspecto do mesmo, o ligante é, ainda com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
c (-o) - (ch2) e2(em que, e2 é um número inteiro de 1 a 20), ainda com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-c í —o) - (ch2) e2(em que, e2 é um número inteiro de 2 a 10) e, particularmente preferencialmente, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-c O o) - (ch2) « [00511] Como outro aspecto do mesmo, o ligante é, com mais preferência, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-c (~o) - (ch2) e4-~ (och2ch2) e5-(em que, e4 é um número inteiro de 1 a 20 e e5 é um número inteiro de 0 a 10) ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
C (=::O) - (ch2) e6- (och2ch2) e7 och2ch (ch2oh) -(em que, e6 é um número inteiro de 1 a 20 e e7 é um número inteiro deOa 10).
[00512] Um grupo protetor do grupo hidroxila protegido mencionado acima não é particularmente limitado, uma vez que pode ser estável no momento da ligação da molécula funcional e do oligonucleotí
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112/259 deo. O ligante não é particularmente limitado e pode ser mencionado um grupo protetor opcional descrito, por exemplo, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS), 3rd Edition, publicado por JOHN WILLY & SONS (1999) e similares. Especificamente, pode ser mencionado o grupo metila, um grupo benzila, um grupo p-metoxibenzila, um grupo t-butila, um grupo metoximetila, um grupo metoxietila, um grupo 2-tetra-hidropiranila, um grupo etoxietila, um grupo cianoetila, um grupo cianoetoximetila, um grupo fenilcarbamoíla, um grupo 1,1dioxotiomorfolin-4-tiocarbamoíla, um grupo acetila, um grupo pivaloíla, um grupo benzoíla, um grupo trimetilsilila, um grupo trietilsilila, um grupo tri-isopropilsilila, um grupo t-butildimetilsilila, um grupo [(triisopropHsilil)óxi]metila (grupo Tom), um grupo 1-(4-clorofenil)-4etoxipiperidin-4-ila (grupo Cpep), um grupo trifenilmetila (grupo tritila), um grupo monometoxitritila, um grupo dimetoxitritila (grupo DMTr), um grupo trimetoxitritila, um grupo 9-fenilxanten-9-ila (grupo Pixila), um grupo 9- (p-metoxifenil)xanten-9-ila (grupo MOX) e similares. Um grupo protetor do grupo hidroxila protegido é, de preferência, um grupo benzoíla, um grupo trimetilsilila, um grupo trietilsilila, um grupo triisopropilsilila, um grupo t-butildimetilsilila, um grupo trifenilmetila, um grupo monometoxitritila, um grupo dimetoxitritila, um grupo trimetoxitritila, um grupo 9-fenilxanten-9-ila ou grupo 9- (p-metoxifenil)xanten-9ila, com mais preferência, um grupo monometoxitritila, um grupo dimetoxitritila ou um grupo trimetoxitritila, ainda com mais preferência, um grupo dimetoxitritila.
[00513] A ligação de um grupo derivado da molécula funcional mencionada acima e do ligante é, de preferência, uma ligação covalente, e com mais preferência, estes estão ligados com uma ligação éter ou uma ligação amida.
[00514] A ligação éter pode ser formada por reação, por exemplo, de um grupo hidroxila de um grupo derivado de uma molécula funcio
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113/259 nal e de urn ligante que possui um grupo de saída. Exemplos do grupo separável incluem acetato, p-nitrobenzoato, sulfonato (por exemplo, metanossulfonato, p-toluenossulfonato, p~bromobenzenossulfonato, p-nitrobenzenossulfonato, fluorometanossulfonato, difluorometanossulfonato, trifluorometanossulfonato e etanossulfonato e similares), amino, éster halogenado, e um íon de halogêneo (por exemplo, l·, Br,Cl ) e hidroxila, e similares, mas não está limitado por estes. Dependendo da estrutura do grupo de saída, uma base pode ser opcionalmente adicionada. A base a ser adicionada não é particularmente limitada. Por exemplo, exemplos da base incluem uma base orgânica como trietilamina, tributilamina, Ν,Ν-dHSopropiletilamina, piridina, DBU, uma base inorgânica como carbonato de potássio, carbonato de césio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e um composto de metal orgânico como butillítio, fenil-lítio.
[00515] A ligação amida pode ser formada, por exempio, reagindo um grupo amino do grupo derivado de uma molécula funcional e um ligante tendo um ácido carboxílico, um éster, um éster ativo (N-hidro~ xissuccinimidação, e similares), um cloreto de ácido, um diéster de ácido carboxílico ativado (diéster de ácido carboxílico 4-nitrofenilado e similares), isocianato e similares.
[00516] Condições de reação específicas da formação de ligação éter mencionada acima e da formação de ligação amida podem ser referidas, por exemplo, Comprehensive Organic Transformations Second Edition, 1999, John Wiley & Sons, INC. e similares. Um conjugado de um grupo funcional e urn ligante podem ser sintetizados combinando os métodos descritos nestes documentos conhecidos, métodos de acordo com os mesmos, ou estes e métodos convencionais. Além disso, publicações como European Journal of Pharmaceuticals and Biopharmaceutics, Vol. 107, pp. 321 a 340 (2016), Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 104, pp. 78 a 92 (2016), Expert Opinion on
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Drug Delivery, Vol. 11, pp. 791 a 822 (2014), e Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 59, p. 2718 (2016) e os materiais indexados nas publicações podem ser referidos em relação ao método de ligação do grupo funcional e do ligante como outro aspecto do mesmo.
[00517] As seguintes listas mostram exemplos de oligonucleotídeos de fita simples preferenciais utilizados em produtos farmacêuticos de ácidos nucleicos.
[00518] Um oligonucleotídeo de fita simples representado pela seguinte fórmula (I):
fXz“Lx^X“L““YíLy—Yz 1 ( I ) {em que, X representa [00519] um grupo derivado de um primeiro oligonucleotídeo composto por 7 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e que contêm pelo menos um nucleotideo do qual pelo menos uma de uma porção de açúcar, porção de base e porção de fosfato foi modificada [00520] Y representa [00521] um grupo derivado de um segundo oligonucleotídeo composto por 4 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e [00522] que contém pelo menos um ribonucleotídeo, [00523] Xz representa [00524] um grupo derivado de um terceiro oligonucleotídeo composto por 7 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e um grupo derivado de um terceiro oligonucleotídeo contendo pelo menos um nucleotideo do qual pelo menos uma de uma porção de açúcar, porção de base e porção de fosfato foi modificada,
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115/259 [00525] Yz representa [00526] um grupo derivado de um quarto oligonucleotídeo composto por 7 a 100 nucleotideos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e um grupo derivado de um quarto oligonucleotídeo contendo pelo menos um nucleotídeo do qual pelo menos uma de uma porção de açúcar, porção de base e porção de fosfato foi modificada, [00527] L representa, [00528] um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (==O) (OH) ~-W5--P ( = O) (OH) (em que, W5 representa um grupo derivado de um quinto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotideos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado), [00529] Lx representa -P(=O)(OH)-, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (=O) (OH) -W6-P ( = O) (OH) (em que, W6 representa um grupo derivado de um sexto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotideos que são selecionados, independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado), [00530] Ly representa ~P(™O)(OH)~, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (=O) (OH) -W7-P (=O) (OH) (em que, W7 representa um grupo derivado de um sétimo oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotideos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e núcleo
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116/259 tídeos com açúcar modificado), [00531] pelo menos um de L, Lx e Ly é um grupo de ligação contendo a estrutura não nucleotídica, [00532] L é, respectivamente, ligado covalentemente ao primeiro oligonucleotídeo e ao segundo oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, [00533] Lx é, respectivamente, ligado covalentemente ao primeiro oligonucleotídeo e ao terceiro oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, [00534] Ly é, respectivamente, ligado covalentemente ao segundo oligonucleotídeo e ao quarto oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, [00535] men representam respectiva e independentemente 0 ou 1; [00536] o primeiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica X, o segundo oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Y, o terceiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Xz e o quarto oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Yz, [00537] a sequência nucleotídica X contém uma primeira sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do segundo oligonucleotídeo, [00538] a sequência nucleotídica Y contém uma segunda sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do primeiro oligonucleotídeo e contém pelo menos um ribonucleotídeo, [00539] pelo menos uma da sequência nucleotídica X, da sequência nucleotídica Xz e da sequência nucleotídica Yz contém uma sequência antissenso capaz de se hibridizar com um RNA alvo, e [00540] no caso de ter duas ou mais sequências antissenso, o RNA alvo hibrldizado por cada porção de sequência antissenso pode ser igual ou diferente} [00541] em que X e Y se hibridizam pela primeira porção da se
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117/259 quência nucleotidica e pela segunda porção da sequência nucleotídica.
[00542] 2) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1), em que
X liga-se a L no lado 3’ e Y liga-se a L no lado 5’.
[00543] 3) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1), em que
X liga-se a L no lado 5’ e Y liga-se a L no lado 3’.
[00544] 4) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em quaiquer um de 1) a 3), em que a complementaridade entre a sequência antissenso mencionada acima e a sequência de RNA alvo é de 70% ou mais.
[00545] 5) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 4), em que a complementaridade entre a primeira sequência nucleotidica e a segunda sequência nucleotidica é de 70% ou mais.
[00546] 6) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 5), em que cada nucieotídeo contido em X está mutuamente acoplado através de pelo menos um tipo de ligação independentemente selecionado do grupo que consiste em uma ligação fosfodiéster, iigaçâo fosforotioato, ligação metilfosfonato, ligação metiltiofosfonato, ligação fosforoditioato e ligação fosforamidato, cada nucieotídeo contido em Y é mutuamente acoplado através de pelo menos um tipo de ligação independentemente selecionado do grupo consistindo em uma ligação fosfodiéster, ligação fosforotioato, ligação metilfosfonato, ligação metiltiofosfonato, ligação fosforoditioato e ligação fosforamidato, cada nucieotídeo contido em Xz é mutuamente acoplado através de pelo menos um tipo de ligação independentemente selecionado do grupo consistindo em uma ligação fosfodiéster, ligação fosforotioato, ligação metilfosfonato, ligação metiltiofosfonato, ligação fosforoditioato e ligação fosforamidato, e cada nucieotídeo contido em Yz é mutuamente acoplado através de pelo menos um tipo de ligação indepen
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118/259 dentemente selecionado do grupo que consiste em uma ligação fosfodiéster, ligação fosforotioato, ligação metilfosfonato, ligação metiltiofosfonato, ligação fosforoditioato e ligação fosforamidato.
[00547] 7) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 6), em que cada nucleotideo contido em X está mutuamente acoplado através de pelo menos um tipo de ligação independentemente selecionado de uma ligação fosfodiéster e ligação fosforotioato, cada nucleotideo contido em Y é mutuamente acoplado através de pelo menos um tipo de ligação independentemente selecionado de uma ligação fosfodiéster e uma ligação fosforotioato, cada nucleotideo contido em Xz é mutuamente acoplado através de pelo menos um tipo de ligação independentemente selecionado de uma ligação fosfodiéster e fosforotioato, e cada nucleotideo contido em Yz é mutuamente acoplado através de pelo menos um tipo de ligação independentemente selecionado a partir de uma ligação fosfodiéster e ligação fosforotioato.
[00548] 8) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 7), em que o primeiro oligonucleotídeo contém um nucleotideo com açúcar modificado ligado adjacentemente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da primeira porção da sequência nucleotídica.
[00549] 9) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 8), em que o primeiro oligonucleotídeo contém uma ligação fosforotioato.
[00550] 10) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 9), em que a primeira sequência nucleotídica é uma sequência contendo nucleotídeos mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato.
[00551] 11)0 oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 10), em que os nucleotídeos contidos no primeiro oligonucleotídeo são mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato.
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119/259 [00552] 12) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 11), em que a primeira sequência nucleotídica é uma sequência composta por 4 a 30 nucleotideos que são independentemente selecionados de nucleotideos e desoxirribonucleotídeos com açúcar modificado.
[00553] 13) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 12), em que a primeira sequência nucleotídica é uma sequência composta por 4 a 20 nucleotideos incluindo pelo menos um desoximbonucleotídeo.
[00554] 14) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 13), em que a primeira sequência nucleotídica é uma sequência composta por 4 a 20 desoxirribonucleotídeos.
[00555] 15) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 14), em que a primeira sequência nucleotídica é uma sequência que contém pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H.
[00556] 16) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 15), em que a primeira sequência nucleotídica uma sequência que contém pelo menos quatro nucleotideos contíguos reconhecidos pela RNase H quando hibridizam com o RNA alvo.
[00557] 17) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 13), em que a primeira porção da sequência nucleotídica contém pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00558] 18) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 17), em que pelo menos um dos nucleotideos do lado 3’ e o nucleotideo do lado 5’ da primeira porção da sequência nucleotídica é um nucleotideo com açúcar modificado.
[00559] 19) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 17) ou
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18), em que o nucleotídeo do lado 3’ e o nucleotídeo do lado 5’ da primeira porção da sequência nucleotídica são nucleotideos com açúcar modificado.
[00560] 20) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 12), em que a primeira sequência nucleotídica é uma sequência composta por 4 a 30 nucleotideos com açúcar modificado.
[00561] 21) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 20), em que o primeiro oligonucleotídeo contém um nucleotídeo com açúcar modificado adjacente ao lado 5’ e ao lado 3’ da primeira porção da sequência nucleotídica.
[00562] 22) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 21), em que X contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado.
[00563] 23) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 22), em que a segunda sequência nucleotídica é uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotideos contíguos clivados por RNase H.
[00564] 24) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 23), em que a segunda sequência nucleotídica é uma sequência composta por 4 a 25 ribonucleotídeos.
[00565] 25) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 24), em que o segundo oligonucleotídeo contém um nucleotídeo com açúcar modificado adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica.
[00566] 26) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 25), em que o segundo oligonucleotídeo contém uma ligação fosfodiéster.
[00567] 27) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 26), em que pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica é acoplado com o nucleotídeo adja
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121/259 cente através de uma ligação fosfodiéster.
[00568] 28) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 27), em que a segunda sequência nudeotídica é uma sequência contendo nucleotideos cada um acoplado através de uma ligação fosfodiéster.
[00569] 29) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 28), em que a sequência nudeotídica X contém pelo menos uma sequênda antissenso e a primeira sequência nudeotídica é a sequência antissenso mencionada acima.
[00570] 30) O oligonucleotídeo de fita simpies descrito em 29), em que m é 0 e n é 0.
[00571] 31) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 30), em que pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequênda nudeotídica é acoplado com o nudeotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato.
[00572] 32) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 29), em que m é 1, e a sequência nudeotídica Xz contém pelo menos uma da sequênda antissenso.
[00573] 33) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32), em que a porção de sequência antissenso contida no Xz mencionado acima contém uma ligação fosforotioato.
[00574] 34) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em 32) ou
33), em que a sequência antissenso contida na sequência nudeotídica Xz mencionada acima é uma sequênda contendo nucleotideos, cada um acoplado através de uma ligação fosforotioato.
[00575] 35) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 34), em que os nudeotídeos contidos no terceiro oligonudeotídeo são cada um acoplados através de uma ligação fosforotioato. [00576] 36) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 35), em que o terceiro oligonucleotídeo contém um nucle
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122/259 otídeo com açúcar modificado ligado adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ das porções de sequência antissenso contidas em Xz mencionado acima.
[00577] 37) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 36), em que o terceiro oligonucleotídeo contém um nucleotídeo com açúcar modificado adjacente ao lado 5’ e lado 3’ das porções de sequência antissenso contidas em Xz mencionado acima.
[00578] 38) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 36) ou
37), em que o nucleotídeo com açúcar modificado ligado adjacentemente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ das porções de sequência antissenso contidas em Xz mencionado acima está acoplado a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ das porções de sequência antissenso contidas em Xz mencionado acima através de uma ligação fosforotioato.
[00579] 38) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 37), em que a sequência antissenso contida na sequência nucleotídica Xz mencionada acima é uma sequência composta por 4 a 30 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado e desoxirribonucleotídeos.
[00580] 39) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 38), em que a sequência antissenso contida na sequência nucleotídica Xz mencionada acima é uma sequência composta por 4 a 20 nucleotídeos contendo pelo menos um desoxirribonucleotídeo.
[00581] 40) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 39), em que a sequência antissenso contida na sequência nucleotídica Xz mencionada acima é uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H quando hibridizada com um RNA alvo.
[00582] 41) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 40), em que a sequência antissenso contida na sequência nucleotídica Xz mencionada acima é uma sequência composta por 4 a
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123/259 desoxirribonucleotideos.
[00583] 42) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 39), em que a porção de sequência antissenso contida em Xz mencionado acima contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonudeotídeos contíguos.
[00584] 43) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 42), em que pelo menos um dos nucleotídeos do lado 3’ e o nucleotídeo do lado 5’ da porção da sequência antissenso contida em Xz mencionado acima é um nucleotídeo com açúcar modificado.
[00585] 44) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 42) ou
43), em que o nucleotídeo do lado 3’ e o nucleotídeo do lado 5’ da porção da sequência antissenso contida no Xz mencionado acima são nucleotídeos com açúcar modificado.
[00586] 45) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 38), em que a sequência antissenso contida na sequência nucleotídica Xz mencionada acima é uma sequência composta por 4 a 30 nucleotídeos com açúcar modificado.
[00587] 46) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 45), em que Lx e L representam, respectivamente, independentemente, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
[00588] 47) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 45), em que Lx é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica e [00589] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (==O) (OH) VV ' P (===O) (OH) (em que, W5 representa um grupo derivado de um quinto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonudeotídeos, ribonucleotídeos e nucleo
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124/259 tídeos com açúcar modificado).
[00590] 48) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 45), em que X e Xz são diretamente ligados através de uma ligação fosfodiéster e [00591] L é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
[00592] 49) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 45), em que Lx é um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P ( = O) (OH) -Vv^-P ( = O) (OH) ~ (em que, W6 representa um grupo derivado de um sexto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados, independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado), e [00593] L é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
[00594] 50) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 49), em que n é 0.
[00595] 51) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 50), em que pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica é acoplado com um nucleotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato.
[00596] 52) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 32) a 49), em que n é 1, a sequência nucleotídica Yz contém uma quarta sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção da porção de sequência antissenso contida em Xz e a quarta sequência nucleotídica é uma sequência que contém pelo menos um rlbonucleotídeo.
[00597] 53) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 52), em que o lado 5’ e o lado 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica
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125/259 são acoplados com grupos adjacentes através de uma ligação fosfodléster.
[00598] 54) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 52) ou
53), em que a quarta sequência nucleotídica contém uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotídeos contíguos clivados por RNase H.
[00599] 55) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 52) a 54), em que a quarta sequência nucleotídica é uma sequência composta por 4 a 20 ribonucleotídeos, [00600] 56) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 52) a 55), em que o quarto oligonucleotídeo contém um núcleotídeo com açúcar modificado adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da quarta porção da sequência nucleotídica.
[00601] 57) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 52) a 56), em que pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da quarta porção da sequência nucleotídica é acoplado com o nucleotídeo adjacente através de uma ligação fosforotioato.
[00602] 58) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 52) a 57), em que Y e Yz são diretamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00603] 59) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 52) a 57), em que Ly é um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (- O) (OH) - W7 - P (O) (OH) (em que, W7 representa um grupo derivado de um sétimo oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados, independentemente, de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado).
[00604] 60) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 52) a 57), em que Ly um grupo de ligação que contém uma es
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126/259 trutura não nucleotidica.
[00605] 61) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 29), em que n é 1, a sequência nucleotidica Yz mencionada acima contém pelo menos uma de uma sequência antissenso.
[00606] 62) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 61), em que o lado 5’ e o lado 3’ da segunda porção da sequência nucleotidica são acoplados com os grupos adjacentes através de uma ligação fosfodiéster.
[00607] 63) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 61) ou
62), em que a porção de sequência antissenso contida na mencionada acima Yz contém uma ligação fosforotioato.
[00608] 64) O oHgonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 63), em que a porção de sequência antissenso contida em Yz mencionado acima é uma sequência contendo nucleotídeos cada um acoplado através de uma ligação fosforotioato.
[00609] 65) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 64), em que os nucleotídeos contidos no quarto oHgonucleotídeo são, cada um, acoplados através de uma ligação fosforotioato.
[00610] 66) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 65), em que o quarto oHgonucleotídeo contém um nucleotídeo com açúcar modificado Hgado adjacentemente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da porção da sequência antissenso contida no Yz mencionado acima.
[00611] 67) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 66), em que o quarto oligonucleotídeo contém um nucleotídeo com açúcar modificado Hgado adjacentemente ao lado 5’ e lado 3’ da porção de sequência antissenso contida em Yz mencionado acima.
[00612] 68) O oHgonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer
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127/259 um de 66) ou 67), em que o nucleotideo com açúcar modificado ligado adjacentemente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da porção de sequência antissenso contida em Yz mencionado acima está acoplado a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da porção de sequência antissenso contida em Yz mencionado acima através de uma ligação fosforotioato.
[00613] 68) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 67), em que a sequência antissenso contida na sequência nucleotidica em Yz mencionado acima é uma sequência composta por 4 a 30 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado e desoxirribonucleotídeos.
[00614] 69) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 68), em que a sequência antissenso contida em Yz mencionado acima é uma sequência composta por 4 a 20 nucleotídeos contendo pelo menos um desoxirribonucleotídeo.
[00615] 70) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 69), em que a sequência antissenso contida na sequência nucleotidica Yz é uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H quando se hibridiza com um RNA alvo .
[00616] 71) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 70), em que a sequência antissenso contida em Yz mencionado acima é uma sequência composta por 4 a 20 desoxirribonucleotídeos.
[00617] 72) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 69), em que a porção de sequência antissenso contida em Yz mencionado acima contém pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado, mas não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00618] 73) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 72), em
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128/259 que pelo menos um dos nucleotídeos do lado 3’ e o nucieotídeo do lado 5’ da porção da sequência antissenso contida em Yz mencionado acima é um nucieotídeo com açúcar modificado.
[00619] 74) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 72) ou
73), em que o nucieotídeo do lado 3’ eo nucieotídeo do lado 5’ da porção da sequência antissenso contida em Yz mencionado acima é um nucieotídeo com açúcar modificado.
[00620] 75) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 68), em que a sequência antissenso contida na sequência de nucleotídeos mencionada acima Yz é uma sequência composta por 4 a 30 nucleotídeos com açúcar modificado.
[00621] 76) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 75), em que Ly e L representam respectivamente e independentemente um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica.
[00622] 77) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 75), em que Ly é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica e [00623] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
“P ( = o) (oh) --W p ( = o) (oh) -(em que, W5 representa um grupo derivado de um quinto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonucieotideos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado).
[00624] 78) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 75), em que Y e Yz estão diretamente ligados através de uma ligação fosfodiéster e [00625] L é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica.
[00626] 79) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer
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129/259 um de 61) a 75), em que Ly é um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (===O) (OH) ~W7“-P (====O) (OH) em que, W7 representa um grupo derivado de um sétimo oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonudeotideos e nucleotídeos com açúcar modificado, e [00627] L é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
[00628] 80) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 79), em que m é 0.
[00629] 81) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 61) a 79), em que m é 1, a sequência nucleotídica Xz contém uma terceira sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção da porção de sequência antissenso contida em Yz e a terceira sequência nucleotídica uma sequência que contém pelo menos um ribonucleotídeo.
[00630] 82) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 81), em que a terceira sequência nucleotídica é uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotídeos contíguos clivados por RNase H.
[00631] 83) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 81) ou
82), em que a terceira sequência nucleotídica é uma sequência composta por 4 a 20 ribonudeotideos.
[00632] 84) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 81) a 83), em que o terceiro oligonucleotídeo contém um nucleotídeo com açúcar modificado adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da terceira porção da sequência nucleotídica.
[00633] 85) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 81) a 84), em que pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da terceira porção da sequência nucleotídica é acoplado ao nucleotídeo adjacente
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130/259 através de uma ligação fosforotioato.
[00634] 86) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 81) a 85), em que Y e Yz estão diretamente ligados através de uma ligação fosfodiéster.
[00635] 87) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 81) a 85), em que Lx é um grupo representado pela seguinte fórmula:
-- P (== O) (O H) --- W6 P (== O) (OH) - (em que, W6 representa um grupo derivado de um sexto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotideos que são selecionados, independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado).
[00636] 88) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 81) a 85), em que Lx é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
[00637] 89) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 88), em que cada grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica representa independentemente um grupo representado pela seguinte fórmula:
- LP ( = O) (OH) - ( —O —Vü—) qj-O-] q2-P (=O) (OH) {em que, Vo representa [00638] um grupo alquileno C2-50 (0 grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados de um grupo substituinte Va), [00639] 0 grupo substituinte Va significa um grupo substituinte constituído por um grupo hidroxila, um átomo de halogêneo, um grupo ciano, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo carbamoíla, um grupo sulfamoíla, um grupo fosfono, um grupo sulfo, um grupo tetrazolila e um grupo formila, [00640] qi é um número inteiro de 1 a 10, qz é um número inteiro de
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131/259 a 20, e quando pelo menos um de qi e q2 é 2 ou mais, Vo é igual ou diferente}.
[00641] 90) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 29), em que o quinto oligonucleotídeo contém uma ligação fosfodiéster.
[00642] 91) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 90), em que os nucleotídeos contidos no quinto oligonucleotídeo estão acoplados um ao outro através de uma ligação fosfodiéster.
[00643] 92) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 90) ou
91), em que o quinto oligonucleotídeo é composto por 3 a 10 nucleotídeos selecionados independentemente do grupo que consiste em desoxírríbonucleotídeos e ribonucleotídeos.
[00644] 93) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 90) a 92), em que o quinto oligonucleotídeo é composto por 4 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente do grupo que consiste em desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos.
[00645] 94) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 90) a 93), em que o quinto oligonucleotídeo é oligodesoxirribonucleotídeo ou oligorribonucleotídeo.
[00646] 95) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 90) a 94), em que o quinto oligonucleotídeo é DNA ou RNA.
[00647] 96) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 90) a 95), em que o quinto oligonucleotídeo é RNA.
[00648] 97) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 29), em que o sexto oligonucleotídeo contém uma ligação fosfodiéster.
[00649] 98) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 97), em que os nucleotídeos contidos no sexto oligonucleotídeo são acoplados um ao outro através de uma ligação fosfodiéster.
[00650] 99) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer
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132/259 um de 97) ou 98), em que o sexto oligonucleotídeo é composto por 3 a 10 nucleotideos selecionados índependentemente do grupo que consiste em desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos.
[00651] 100) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 97) a 99), em que o sexto oligonucleotídeo é composto por 4 a 7 nucleotideos selecionados independentemente do grupo que consiste em desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos.
[00652] 101) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 97) a 100), em que o sexto oligonucleotídeo é oligodesoxirribonucleotídeo ou oligombonucleotídeo.
[00653] 102) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 97) a 101), em que o sexto oligonucleotídeo é DNA ou RNA.
[00654] 103) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 97) a 102), em que o sexto oligonucleotídeo é RNA.
[00655] 104) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 29), em que o sétimo oligonucleotídeo contém uma ligação fosfodiéster.
[00656] 105) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 104), em que os nucleotideos contidos no sétimo oligonucleotídeo estão acoplados um ao outro através de uma ligação fosfodiéster.
[00657] 107) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 104) ou
105), em que o sétimo oligonucleotídeo é composto por 3 a 10 nucleotideos selecionados independentemente do grupo que consiste em desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos.
[00658] 108) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 104) a 107), em que o sétimo oligonucleotídeo é composto por 4 a 7 nucleotideos selecionados independentemente do grupo que consiste em desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos.
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133/259 [00659] 109) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 104) a 108), em que o sétimo oligonucleotídeo é oligodesoxirribonucleotídeo ou oligorribonucleotídeo.
[00660] 110) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 104) a 109), em que o sétimo oligonucleotídeo é DNA ou RNA.
[00661] 111) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 104) a 110), em que o sétimo oligonucleotídeo é RNA.
[00662] 112) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 111), em que cada nucleotídeo com açúcar modificado representa independentemente 2’-O~metil nucleotídeo, 2’-O-meto~ xietil nucleotídeo, 2’-O- aminopropil nucleotídeo, 2’-fluoronucleotídeo, 2’-F-arabinonucleotídeo, nucleotídeo em ponte ou 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeo.
[00663] 113) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 112), em que cada nucleotídeo com açúcar modificado representa independentemente um 2’-O-metil nucleotídeo, 2’-O~ metilcarbamoiletil nucleotídeo ou LNA.
[00664] 114) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 113), em que cada nucleotídeo com açúcar modificado representa independentemente um 2’-O-metil nucleotídeo ou LNA.
[00665] 115) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 114), que contém ainda um grupo derivado de uma molécula funcional tendo pelo menos uma função selecionada do grupo consistindo em uma função de marcação, uma função puriflcadora ou função de entrega para um RNA alvo.
[00666] 116) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que o grupo mencionado acima derivado de uma molécula funcional está direta ou indiretamente ligado ao nucleotídeo na extremidade 5’ do oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I).
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134/259 [00667] 117) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que o grupo mencionado acima derivado de uma molécula funcional está direta ou indiretamente ligado ao nucleotídeo na extremidade 3’ do oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I).
[00668] 118) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que o grupo mencionado acima derivado de uma molécula funcional está direta ou indiretamente ligado a L [00669] 119) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 115) a 118), em que o grupo mencionado acima derivado de uma molécula funcional está ligado ao oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I) através de um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila C1-6), -S-, S(“O)- ou -S(=O)2-), ou por uma ligação covalente diretamente.
[00670] 120) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 115) a 117), em que 0 grupo alquileno C2-20 ou 0 grupo alquenileno C2-20 acoplado ao grupo mencionado acima derivado de uma molécula funcional e 0 nucleotídeo na extremidade 5’ ou a extremidade 3’ do oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I) são acoplados através de uma ligação fosfodiéster ou de uma ligação fosfodiéster modificada.
[00671] 121) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 115) a 117), em que 0 grupo alquileno C2-20 ou 0 grupo al
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135/259 quenileno C2 20 acoplado ao grupo mencionado acima derivado de uma molécula funcional e 0 nudeotídeo na extremidade 5’ ou a extremidade 3’ do oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I) são acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00672] 122) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 115) a 121), em que a molécula funcional mencionada acima é selecionada do grupo consistindo em açúcares, lipídios, peptídeos, proteínas e derivados dos mesmos.
[00673] 123) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 115) a 122), em que a molécula funcional mencionada acima é um lipídio selecionado do grupo que consiste em colesterol, ácidos graxos, vitaminas lipossolúveis, glicolípidos e glicerídeos.
[00674] 124) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 115) a 123), em que a molécula funcional é um lipídio selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol e tocotrienol.
[00675] 125) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 115) a 117), em que a molécula funcional mencionada acima é um tocoferol e 0 grupo hidroxila do tocoferol está ligado ao nudeotídeo na extremidade 5’ ou na extremidade 3’ do oligonudeotídeo de fita simples representado pela fórmula (I) através de um grupo alquileno C2-20 (grupos metileno do grupo alquileno são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por -O-. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila).
[00676] 126) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 115) a 117), em que 0 grupo hidroxila do tocoferol está acoplado com 0 nudeotídeo na extremidade 5’ ou na extremidade 3’ do oligonudeotídeo de fita simples representado pelo fórmula (I) através de um grupo representado pela seguinte fórmula (III)
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(em que, um asterisco (*) representa um sítio de ligação (um átomo que compõe um nucleotídeo) com um grupo derivado de um oligonucleotídeo, enquanto o outro asterisco (*) representa um sítio de ligação (um átomo que compõe um grupo derivado de uma molécula funcional) com um grupo derivado de uma molécula funcional.
[00677] 127) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115) ou
118), em que a molécula funcional mencionada acima é um tocoferol e o grupo hidroxila do tocoferol está ligado ao grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica do oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I) através de um grupo alquileno C2-20 (grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos ou substituídos por -O-. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila ou um grupo oxo).
[00678] 128) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115) ou
118), em que 0 grupo hidroxila do tocoferol está ligado ao grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica do oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I) através de um grupo alquileno C2-20 (grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos ou substituídos por um grupo oxo).
[00679] 129) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115),
118), 127) ou 128), em que 0 grupo de ligação mencionado acima que contém uma estrutura não nucleotídica tem um grupo -NH-, e 0 grupo mencionado acima derivado de uma molécula funcional está indiretamente ligado ao átomo de nitrogênio.
[00680] 130) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 115) a 122), em que a molécula funcional é um derivado
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137/259 de açúcar que interage com um receptor de asialogiicoproteína.
[00681] 131) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 115) a 122), em que a molécula funcional é um peptideo ou proteína selecionada do grupo consistindo em ligantes de receptores e anticorpos.
[00682] B-1) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 24), em que o primeiro oligonucleotídeo é representado pela seguinte fórmula:
X 1 - X 2 - X 5 (em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 10 nucleotideos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e inclui pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, [00683] X2 representa uma primeira porção da sequência nucleotídica e a primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso, [00684] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 10 nucleotideos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e inclui pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, e o oligonucleotídeo liga-se covalentemente com L).
[00685] B-2) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-1), em que X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotideos selecionados independentemente de nucleotideos com açúcar modificado, X2 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 12 desoxirribonucleotídeos, e X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotideos selecionados independentemente de nucleotideos com açúcar modificado.
[00686] B-3) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-1),
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138/259 em que X1 representa um grupo derivado de oHgonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado, X2 representa um grupo derivado de oligonucleotideos que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e X3 representa um grupo derivado de 2 ou 3 oligonucleotideos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado.
[00687] B-4) O oHgonucleotídeo de fita simples descrito em B-1), em que X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado, X2 representa um grupo derivado a partir de um oHgonucleotídeo que é composto por 9 a 11 desoxirribonucleotídeos, e X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado.
[00688] B-5) O oHgonucleotídeo de fita simples descrito em B-1) ou
B-2), em que X1 representa um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de LNA, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos e 2’-O~metilcarbamoiletil nucleotídeos, e X3 representa um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos independentemente selecionados de LNA, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-Ometoxietil nucleotídeos e 2’-O-metilcarbamoHetil nucleotídeos.
[00689] B-6) O oHgonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-1) a B-3) e B-5), em que X1 representa um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de LNA, 2!-O-metil nucleotídeos, 2’O-metoxietil nucleotídeos e 2’-O-metilcarbamoHetil nucleotídeos, e X3 representa um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos independentemente selecionados de LNA, 2’
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O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos e 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos.
[00690] B-7) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-1) a B-3), B-5) e B-6), em que X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 2 ou 3 LNA, e X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 2 ou 3 LNA.
[00691] B-8) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-1) ou
B-2), em que X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de quatro a seis 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos, e X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por quatro a seis 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos.
[00692] B-9) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 24), em que o primeiro oligonucleotídeo é composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeo e nucleotídeo com açúcar modificado e [00693] X representa uma porção de sequência antissenso, o nucleotídeo do lado 3’ e o nucleotídeo do lado 5’ da porção de sequência antissenso são nucleotídeos com açúcar modificado, mas não contêm uma fita oligonucleotídlca composta por 4 desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00694] B-10) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-9), em que o nucleotídeo com açúcar modificado contido no primeiro oligonucleotídeo é independentemente selecionado de LNA, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil e 2-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos.
[00695] B-11) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-10), em que o nucleotídeo com açúcar modificado contido no primeiro oligonucleotídeo é independentemente selecionado de LNA e de 2’-Ometilcarbamoiletil nucleotídeo.
[00696] B-12) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-11),
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140/259 em que o primeiro oligonucleotídeo composto por 14 a 16 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotideos e LNA. [00697] B-13) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 24), em que pelo menos uma da sequência nucleotídica Xz e a sequência nucleotídica Yz contém uma sequência antissenso, e o primeiro oligonucleotídeo é representado pela sequência seguinte fórmula:
x! -- x2 (em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 10 nucleotídeos selecionados Independentemente de desoxirribonucleotideos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, [00698] X2 representa uma primeira porção de sequência nucleotídica e ligações covalentes com L).
[00699] B-14) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-13), em que X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado, X2 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 12 desoxirribonucleotideos.
[00700] B-15) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-13) ou B-14), em que X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de LNA, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxletil nucleotídeos e 2!-O-metilcarbamo!letil nucleotídeos.
[00701] B-16) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-13) a B-15), em que X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotídeos.
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141/259 [00702] B-17) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 24) e B-1) a B-16), em que o segundo oligonucleotídeo é representado pela seguinte fórmula:
Y 2 .... V 1 (em que, Y2 representa uma segunda porção de sequência nudeotídica, representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto de 4 a 20 nudeotídeos selecionados independentemente de desoximbonucleotídeos, ribonudeotídeos e nudeotídeos com açúcar modificado, contém pelo menos um ribonucleotídeo, e o oligonudeotídeo liga-se covalentemente com L e [00703] Y1 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto de 1 a 10 nudeotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonudeotídeos e nudeotídeos com açúcar modificado e contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, [00704] B-18) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em B-17), em que Y2 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 10 a 13 ribonudeotídeos, e Y1 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por dois ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de nudeotídeos com açúcar modificado.
[00705] B-19) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em B-17) ou B-18), em que Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nudeotídeos selecionados independentemente de LNA, 2’-O-metil nudeotídeos, 2’-O-metoxietil nudeotídeos e 2’-O-metilcarbamoiletil nudeotídeos.
[00706] B-20) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-17) a B-19), em que Y1 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nudeotídeos.
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142/259 [00707] B-21) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 24) e B-1) a B-16), em que o segundo oligonucleotide© é representado pela seguinte fórmula:
y 0 (em que, Y° representa uma segunda porção de sequência nucleotídica, e liga-se covalentemente com L).
[00708] B-22) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 24) e B-1) a B-16), em que o segundo oligonucleotídeo é representado pela seguinte fórmula:
y° (em que, Y° representa uma segunda porção de sequência nucleotídica, e liga-se covalentemente com L e Ly).
[00709] B-23) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-21) ou B-22), em que Y° representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 22 ribonucleotídeos.
[00710] B-24) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-1) a B-23), em que o terceiro oligonucleotídeo é representado pela seguinte fórmula:
(em que, Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 10 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e inclui pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, [00711] Xz2 representa uma porção da sequência antissenso contida em Xz, [00712] Xz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 10 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e inclui pelo menos um nucleotídeo com açú
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143/259 car modificado, e liga-se covalentemente com Lx).
[00713] B-25) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-24), em que Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado, Xz2 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 12 desoxirribonucleotídeos, e Xz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado.
[00714] B-26) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-24) ou B-25), em que Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado, Xz2 representa um grupo derivado a partir de um oligonucleotídeo que é composto por a 10 desoxirribonudeotideos, e Xz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado.
[00715] B-27) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-24) ou B-25), em que Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado, Xz2 representa um grupo derivado a partir de um oligonucleotídeo que é composto por a 11 desoxirribonucleotídeos, e Xz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado.
[00716] B-28) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-24) a B-26), em que Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de LNA, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-Ometoxietil nucleotídeos e 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos, e Xz3
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144/259 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos independentemente selecionados de LNA, 2’-Ometil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos e 2!-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos.
[00717] B-29) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-24) a B-26) e B-28), em que Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de LNA, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos e 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos, e Xz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de LNA, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos e 2’-Ometilcarbamoiletil nucleotídeos.
[00718] B-30) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-24) a B-26), B-28) e B-29), em que Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou 3 LNA, e Xz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que composto por 2 ou 3 LNA.
[00719] B-31) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um dos B-24), B-25), B-27) e B-28), em que Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por quatro a seis 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos, e Xz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de quatro a seis 2’O-metilcarbamoiletil nucleotídeos.
[00720] B-32) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-1) a B-23), em que o terceiro oligonucleotídeo é composto por 10 a 20 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, [00721] Xz representa uma porção de sequência antissenso, o nucleotideo do lado 3’ e o nucleotideo do lado 5’ da porção de sequência
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145/259 antissenso são nucleotídeos com açúcar modificado, e não contêm uma fita oligonucleotídica composta por 4 desoximbonucleotídeos contíguos.
[00722] B-33) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-32), em que o nucleotideo com açúcar modificado contido no terceiro oil· gonucleotídeo é independentemente selecionado de LNA, 2’-O~metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietíl e 2-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos.
[00723] B-34) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-33), em que o nucleotideo com açúcar modificado contido no terceiro oll· gonucleotídeo é independentemente selecionado de LNA e de 2’-Ometücarbamoileti! nucleotideo.
[00724] B-35) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-34), em que o terceiro oligonucleotídeo composto por 14 a 16 nucleotídeos independentemente selecionados de desoximbonucleotídeos e LNA.
[00725] B-36) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-1) a B-23), em que o terceiro oligonucleotídeo é representado pela seguinte fórmula:
xU-xz 2 (em que, Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 10 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e inclui pelo menos um nucleotideo com açúcar modificado, [00726] Xz2 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 4 a 20 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e contém pelo menos um ribonucleotídeo, e liga-se covalentemente com Lx).
[00727] B-37) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-36), em que Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que
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146/259 é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado, e Xz2 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos.
[00728] B-38) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-36) ou B-37), em que Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de LNA, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxletil nucleotídeos e 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos.
[00729] B-39) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-36) a B-38), em que Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotídeos.
[00730] B-40) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-1) a B-39), em que o quarto oligonucleotídeo é representado pela seguinte fórmula:
Yz3- Yz2 - Yz1 (em que, Yz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 10 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucieotideos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e inclui pelo menos um nucieotídeo com açúcar modificado, e liga-se covaientemente com Ly, [00731] Yz2 representa uma porção de sequência antissenso contida em Yz, e [00732] Yz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 10 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucieotideos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e inclui pelo menos um nucieotídeo com açúcar modificado), [00733] B-41) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-40),
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147/259 em que Yz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado, Yz2 representa um grupo derivado a partir de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 12 desoxirribonucleotídeos, e Yz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado.
[00734] B-42) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-40) ou B-41), em que Yz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado, Yz2 representa um grupo derivado a partir de um oligonucleotídeo que é composto por a 10 desoxírribonucleotídeos, e Yz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado.
[00735] B-43) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-40) ou B-41), em que Yz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado, Yz2 representa um grupo derivado a partir de um oligonucleotídeo que é composto por a 11 desoxirribonucleotídeos, e Yz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de nucleotídeos com açúcar modificado.
[00736] B-44) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-40) ou B-41), em que Yz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de LNA, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos e 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos, e Yz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos independentemente selecionados de LNA, 2’-O-metil nucleotí
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148/259 decs, 2’-O-metoxietil nucleotideos e 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotideos.
[00737] B-45) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-40) em B-42) e B-44), em que Yz1 representa um grupo derivado de urn oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotideos selecionados independentemente de LNA, 2’-O~metil nucleotideos, 2’-O~metoxietil nucleotideos e 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotideos, e Yz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotideos selecionados independentemente de LNA, 2’-O-metil nucleotideos, 2’-O-metoxietil nucleotideos e 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotideos.
[00738] B-46) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-40) a B-42), B-44) e B-45), em que Yz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou 3 LNA, e Yz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que composto por 2 ou 3 LNA.
[00739] B-47) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-40), B-41), B-43) e B-44), em que Yz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por quatro a seis nucleotideos 2!-O-metilcarbamoiletil, e Yz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de quatro a seis 2’-ometilcarbamoiletil nucleotideos.
[00740] B-48) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-1) a B-39), em que o quarto oligonucleotídeo é composto por 10 a 20 nucleotideos selecionados independentemente de desoximbonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado, [00741] Yz representa uma porção de sequência antissenso, o nucleotideo do lado 3’ e o nucleotideo do lado 5’ da porção de sequência antissenso é um nucleotideo com açúcar modificado e não contém fita oligonucleotídica composta por 4 desoxirribonucleotídeos contíguos.
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149/259 [00742] B-49) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-48), em que os nucleotídeos com açúcar modificado contidos no quarto oil· gonucleotídeo são independentemente selecionados de LNA, 2’-Ometil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos e 2-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos.
[00743] B-50) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-49), em que os nucleotídeos com açúcar modificado contidos no terceiro oligonucleotídeo são independentemente selecionados de LNA e nucleotídeos de 2!-O-metilcarbamoiletilo.
[00744] B-51) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-50), em que o terceiro oligonucleotídeo composto por 14 a 16 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos e LNA. [00745] B-52) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-1) a B-39), em que o quarto oligonucleotídeo é representado pela seguinte fórmula:
Y z 2 - Y z 1 (em que, Yz2 representa uma segunda porção de sequência nucleotídica, representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 4 a 20 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotideos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, contém pelo menos um ribonucleotídeo, e o oligonucleotídeo liga-se covalentemente com Ly e [00746] Yz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de 1 a 10 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado, [00747] B-53) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em B-52), em que Yz2 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, e Yz1 representa um grupo
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150/259 derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotideos selecionados independentemente de nucleotideos com açúcar modificado.
[00748] B-54) O oligonucleotídeo de fita simpies descrito em B-52) ou B-53), em que Yz1 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotideos selecionados independentemente de LNA, 2!-O-metil nucleotideos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos e 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotideos.
[00749] B-55) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-52) a B-54), em que Yz1 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nudeotídeos.
[00750] B-56) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-13) a B-16), em que o grupo derivado de uma molécula funcional liga-se direta ou indiretamente ao nudeotídeo terminal de X1. [00751] B-57) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-17) a B-20), em que o grupo derivado de uma molécula funcional liga-se direta ou indiretamente ao nudeotídeo terminal de Y1. [00752] B-58) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-21) a B-23), em que o grupo derivado de uma molécula funcional liga-se direta ou indiretamente ao nudeotídeo terminal de Y°. [00753] B-59) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-36) a B-39), em que o grupo derivado de uma molécula funcional liga-se direta ou indiretamente ao nudeotídeo terminal de Xz1.
[00754] B-60) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-52) a B-55), em que o grupo derivado de uma molécula funcional liga-se direta ou indiretamente ao nudeotídeo terminal de Y1. [00755] B-61) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de B-1) a B-55), em que o grupo derivado de uma molécula
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151/259 funcional liga-se direta ou indiretamente a L.
[00756] C-1) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1), em que a seguinte fórmula:
X 1 -- X 2 --- X 3 --- L - Y 2 - Y 1 {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [00757] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica, representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotídica que é uma sequência antissenso, [00758] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00759] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) -O (CH2) r-O-P (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00760] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P ( = O) (OH) ~ (OCH2CH2) S-O-P ( = O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00761] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, [00762] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotideos}.
[00763] C-2) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que a seguinte fórmula:
XI — X2 — X3 — L—Y? — Y1 — B — A {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [00764] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica, representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por
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152/259 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucieotídica que é uma sequência antissenso, [00765] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00766] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) “O (CHJ r-o-p ( = O) (OH) (em que, ré um número inteiro de 0 a 15).
[00767] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-p (=O) (OH) - (OCH2CH3) S--O--P ( = O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00768] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, [00769] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O~metil nucleotideos, [00770] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo aiquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-β), -S-, -S(=O)- ou -5(-0)2-), [00771] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
[00772] C-3) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-2), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não subs
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153/259 tituídos, ou substituídos por -O-. Os grupos metileno não substituídos sâo respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila), e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[00773] C-4) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-2) ou
C-3), em que B é acoplado com o nucleotídeo terminal de Y1 através de uma ligação fosfodiéster.
[00774] C-5) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-1) a
C-4), em que os nucleotídeos contidos em X1, X2, X3 e Y1estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato, e o nucleotídeos contidos em Y2 são mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00775] C-6) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-1) a C-5), em que os respectivos nucleotídeos terminais de X1 e X2, X2 e X3 e Y2 e Y1 são acoplados através de uma ligação fosforotioato.
[00776] C-7) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1), em que é representado pela seguinte fórmula:
X z - L x - X 1 - X 2 - X 3 - L - Y 2 - Y 1 {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [00777] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica, representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotídica que é uma sequência antissenso, [00778] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00779] Xz representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos e LNA, con
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154/259 tém uma porção de sequência antissenso e tem pelo menos um de 2’~ O-metil nucleotideos e LNA, [00780] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
P (=O) (OH) -W5-P ( = O) (OH) -(em que, W5 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 7 nucleotideos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), um grupo representado pela seguinte fórmula:
-- P (===: O) (O H) - O ( C H 2) r - O - P (-= O) (OH) -(em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00781] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P ( = O) (OH) - (OCH2CH2) s-O-P ( = O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00782] Lx representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-- P (O) (OH) - W “ - P (O) (OH) (em que, W6 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotideos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [00783] -P(=O)(OH)-, um grupo representado pela seguinte fórmula:
--P (-O) (OH) -O (CH2) r -O - P (-O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00784] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
--P o O) (OH) - (OCH2CH2) S--O--P (-O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00785] Y2 representa uma segunda porção de sequência nucleotídica, e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, e [00786] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo
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155/259 que é composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotídeos}.
[00787] C-8) O oHgonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que é representado pela seguinte fórmula:
X z -- L x -- X ! -- X 2 -- X 3 -- L - Y 2 - Y 1 - B -- A (em que, X1 representa um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00788] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotidica, representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotidica que é uma sequência antissenso, [00789] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00790] Xz representa um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos e LNA, contém uma porção de sequência antissenso e tem pelo menos um de 2’O-metil nucleotídeos e LNA, [00791] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P Oo) (OH) -W5--P ( = O) (OH) ~ (em que, W5 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) -O (CH2) r-O-P (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00792] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-p ( = O) (OH) - (OCH2CH2) s-O-P (=O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00793] Lx representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
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156/259
P (~O) (OH) -We-P (~O) (OH) (em que, W6 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonudeotídeos e ribonucleotídeos), [00794] -P(=O)(OH)-, um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (=O) (OH) -O (CHj r-O-P (=O) (OH) - (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00795] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (=-0) (OH) - (OCH2CH2) ... í) P (-=O) (OH) - (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00796] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, [00797] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotídeos, [00798] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenlleno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituirdes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, ~NRB~ (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-β), -S-, -S(=O)- ou -S(=O)2-), e [00799] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
[00800] C-9) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-8), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não subs
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157/259 tituídos, ou substituídos por -O-. Os grupos metlleno não substituídos sâo respectivamente e índependentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila), e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[00801] C-10) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-8) ou C-9), em que B é acoplado com o nucleotídeo terminal de Y1 através de uma ligação fosfodiéster.
[00802] C-11) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-7) a C-10), em que os nucleotídeos contidos em X1, X2, X3, Xz e Y1 estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato, e o nucleotídeos contidos em Y2 são mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00803] C-12) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-7) a C-11), em que os respectivos nucleotídeos terminais de X1 e X2, X2 e X3 e Y2 e Y1 são acoplados através de uma ligação fosforotioato.
[00804] C-13) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-7) a C-12), em que Xz não contém fita oligonucleotídica composta por 4 desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00805] C-14) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-13), em que pelo menos um dos nucleotídeos no lado 3’ e no lado 5’ de Xz é um nucleotídeo selecionado independentemente de 2’-O-metil nucleotídeos e LNA.
[00806] C-15) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-13) ou C-14), em que os nucleotídeos no lado 3’ e no lado 5’ de Xz são nucleotídeos selecionados índependentemente de 2’-O-metil nucleotídeos e LNA.
[00807] C-16) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-13) a C-15), em que Xz representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo composto por nucleotídeos independentemen
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158/259 te selecionados de 2’-O-metil nucleotídeos e LNA.
[00808] C-17) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-7) a
C-12), em que a estrutura parcial representada pela fórmula Xz- é representada pela fórmula Xz1-Xz2-Xz3-, [00809] Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo composto por 2 ou 3 LNA, [00810] Xz2 é uma porção de sequência antissenso contida em Xz, e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e [00811] Xz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA.
[00812] C-18) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-7) a C-17), em que L e Lx, respectivamente, representam, independentemente, um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (=O) (OH) -O (CH2) r-O-P (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00813] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
P ( = O) (OH) ” (OCH2CH2) S--O--p (=O) (OH) ~ (em que, s é um número inteiro de 3 a 6).
[00814] C-19) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-7) a C-17), em que L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) -O (CH2) r-O-P ( = O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00815] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-- P ( - O) (OH) -- (O C H 2 C H 2) s -- O ~ P (- O) (OH) ~ (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00816] Lx representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
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P (~O) (OH) -We-P (~O) (OH) -(em que, W6 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos) ou [00817] -P(=O)(OH)-.
[00818] C-20) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-19), em que os nucleotídeos contidos em Lx estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00819] C-21) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 07) a 017), em que L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-p (—O) (oh) -w5--p oo) (oh) (em que, W5 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [00820] Lx representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (=O) (OH) -O (CHÒ r-O-P (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00821] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
P ( = O) (OII) (OCII2CII2) s O P (~O) (OI!) (em que, s é um número inteiro de 3 a 6).
[00822] C-22) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-21), em que os nucleotídeos contidos em L estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00823] C-23) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-1) a C-22), em que X1 e Y1 se hlbridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00824] C-24) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-1) a C-23), em que a complementaridade da sequência
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160/259 de bases de nucleotídeos que compõem X1, e a sequência de bases de nucleotídeos que compõem Y1 é de 70% ou mais.
[00825] 025) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-1) a 024), em que X3 e Y2 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00826] 026) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-1) a 025), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotídeos que compõem a estrutura parcial representada pela fórmula X2-X3 e a sequência de bases de nucleotídeos que compõem Y2 é de 70% ou mais.
[00827] 027) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-1) a 026), em que Y2 representa um grupo derivado de RNA, que é composto de 10 a 13 ribonucleotídeos.
[00828] 028) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1), em que é representado pela seguinte fórmula:
X’-X’-L-Y’-Ly-Yz (em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de 2’-0-metíl nucleotídeos e LNA, [00829] X2 é uma primeira porção da sequência nucleotidica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 12 desoxirribonucieotideos, [00830] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P 'O' (OH) --W5--P (”O) (oh) -(em que, W5 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucieotideos e ribonucleotídeos), um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P ( = O) (OH) -O (CH2) r-O-P (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
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161/259 [00831] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (-O) (OH) - (OCH2CH2) S--O--P (-O) (OH) -(em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00832] Y° é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 15 ribonucleotídeos, [00833] Ly representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
— p (-O) (OH) w7p (^o) (OH) -(em que, W7 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos) ou [00834] -P(=O)(OH)-, um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (=O) (OH) -O (CH2) r-O-P (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00835] um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (—O) (OH) ---- (OCH,CH,) S--O-P o O) (OH) (em que s é um número inteiro de 3 a 6) e [00836] Yz representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que contém uma porção de sequência antissenso, tem, pelo menos, um de um 2’-O-metll nucieotídeo e LNA, e é composto por 10 a 20 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídecs, 2’-O-metil nucleotídeos e LNA}.
[00837] 029) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que é representado pela seguinte fórmula:
A - B - X 1 - X 2 - L - Y 0 - L y - ¥ z {em que, A representa um grupo derivado de uma molécula funcional, [00838] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-2o (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo
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162/259 alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substitutes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxiia, um grupo hidroxiia protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e o grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-β), -S-, -8(-0)- ou -S(=O)2-), [00839] X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados independentemente de 2’-O~metil nucleotídeos e LNA, [00840] X2 é uma primeira porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 12 desoxirribonucleotídeos, [00841] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula: -P (=O) (OH) _W5~P ( = O) (OH) (em que, W5 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (~O) (OH! ~O (CHJ Γ--Ο-Ρ (~O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00842] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (=O) (OH) - (OCHoCHo) s-O-P (=O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00843] Y° é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 15 ribonucleotídeos, [00844] Ly representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
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163/259 — P (= O) (OH) W I’ ( = O) (OH) -(em que, W7 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [00845] -P(“O)(OH)··, um grupo representado pela seguinte fórmula:
--P ( = O) (OH) ~O (CH,) r-O-P (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00846] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (=O) (OH) - (OCH,CH,) s—O —P ( = O) (OH) (em que s é um número inteiro de 3 a 6) e [00847] Yz representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que contém uma porção de sequência antissenso, tem, pelo menos, um de um 2’-O-metil nucleotídeo e LNA, e é composto por 10 a 20 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos e LNA}.
[00848] C-30) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-29), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos, ou substituídos por -O-. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila), e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[00849] C-31) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-29) ou C-30), em que B é acoplado com 0 nucleotídeo terminal de X1 através de uma ligação fosfodiéster.
[00850] C-32) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-28) a C-31), em que os nucleotídeos contidos em X1, X2 e Yz estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato, e os nucleotídeos contidos em Y° são mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
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164/259 [00851] 033) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 028) a 032), em que os respectivos nudeotídeos terminais de X1 e X2 estão acoplados através de uma ligação fosforotioato.
[00852] 034) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 028) a 033), em que X2 e Y° se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00853] 035) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 028) a 034), em que a complementaridade da sequência de bases de nudeotídeos que compõem a estrutura parcial representada pela fórmula X1-X2 e a sequência de bases de nudeotídeos que compõem Y° é de 70% ou mais.
[00854] 036) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 028) a 035), em que Y° representa um grupo derivado de RNA, que é composto de 10 a 15 ribonudeotídeos.
[00855] 037) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em 1), em que é representado pela seguinte fórmula:
X ~ X 2 ~ X 3 ~ L -- Y 0 -- L y -- Y z {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por dois ou três LNA, [00856] X2 é uma primeira porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, [00857] X3 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00858] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (”O) (OH) -W5-P (“O) (OH) -(em que, W5 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 4 a 7 nudeotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonudeotídeos), um grupo representado pela seguinte fórmula:
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165/259
-P (=O) (OH) ”O (CH2) r - O - P %O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00859] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (=O) (OH) ~ (OCH,CH,) s-O-P (=O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00860] Y° é uma segunda porção da sequência nucleotidica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 12 a 16 ribonucleotídeos, [00861] Ly representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) -W7-P ( = O) (OH) (em que, W7 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [00862] -P(=O)(OH)-, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) -O (CH,) r-O-P ( = O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00863] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-p (~O) (OH) - (OCH2CH2) S--O--P (“O) (OH) (em que s é um número inteiro de 3 a 6) e [00864] Yz representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que contém uma porção de sequência antissenso, tem, pelo menos, um de um 2’-O-metil nucleotideo e LNA, e é composto por 10 a 20 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, 2’-O~metil nucleotídeos e LNA}.
[00865] C-38) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-37), em que a primeira sequência nucleotidica é uma sequência antissenso.
[00866] C-39) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-37)
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166/259 a C-38), em que os nucleotideos contidos em X1, X2, X3 e Yi estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato, e os nucleotideos contidos em Y2 são mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00867] C-40) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-37) a C-39), em que os respectivos nucleotideos terminais de X1 e X2, e X2 e X3 são acoplados através de uma ligação fosforotioato.
[00868] C-41) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-37) a C-40), em que X2 e Y° se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00869] C-42) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-37) a C-41), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotideos que compõem a estrutura parcial representada pela fórmula X1-X2-X3 e a sequência de bases de nucleotideos que compõem Y° é 70% ou mais.
[00870] C-43) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-37) a C-42), em que Y° representa um grupo derivado de RNA, que é composto de 12 a 16 ribonucleotídeos.
[00871] C-44) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-37) a C-43), em que a estrutura parcial representada pela fórmula -Yz é representado pela fórmula -Yz3-Yz2-Yz1, [00872] Yz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA.
[00873] Yz2 é uma porção de sequência antissenso contida em Yz, e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e [00874] Yz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA.
[00875] C-45) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qual
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167/259 quer um de 037) a 043), em que Yz não contém fita oligonucleotídica composta por 4 desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00876] 046) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 045), em que pelo menos um dos nucleotídeos no lado 3’ e no lado 5’ de Yz é um nucleotídeo selecionado independentemente de 2’-0-metil nucleotídeos e LNA.
[00877] 047) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 045) ou 046), em que os nucleotídeos no lado 3’ e no lado 5’ de Yz são nucleotídeos selecionados independentemente de 2’-0-metil nucleotídeos e LNA.
[00878] 048) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 045) a 047), em que Yz representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por nucleotídeos independentemente selecionados de 2’-0~metil nucleotídeos e LNA.
[00879] 049) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 037) a 048), em que L e Ly, respectivamente, representam, independentemente, um grupo representado pela seguinte fórmula:
P O O) (OH) O (CHJ r O P O O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00880] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P ( = O) (OH) - (OCH2CH2) s-O-P ( = O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 3 a 6).
[00881] 050) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 037) a 048), em que L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (= O) (OH) -o (CH2) Γ--Ο--Ρ Oo) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00882] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P ó-o) (OH) - (OCH2CH2) S--O--P (-O) (OH) Petição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 203/357
168/259 (em que s é um número inteiro de 3 a 6) e [00883] Ly representa -P(=O)(OH)-.
[00884] C-51) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 037) a 048), em que L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (”O) (OH) O (CH2) r -O - P (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00885] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
P (“O) (OH) - (OCH2CHs) S--O-P (~O) (OH) (em que s é um número inteiro de 3 a 6) e [00886] Ly representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (—O) (OH) V\' l-! ( = o) (OH) (em que, W7 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos).
[00887] C-52) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-51), em que os nucleotídeos contidos em Ly estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00888] C-53) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-37) a C-48), em que L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-p (=o) (oh) -w5-P ( — O) (oh) (em que, W5 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [00889] Ly representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) -o (CH2) Γ-Ο-Ρ (=O) (OH) Petição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 204/357
169/259 (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00890] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
~P (:=-O) (OH) - (OCHjCHJ S--O-P (==O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 3 a 6).
[00891] C-54) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-53), em que os nucleotideos contidos em L estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00892] 055) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1), em que é representado pela seguinte fórmula:
X z 1 _ X z 2 ~ L x _ X 1 ~ X 2 ~ X 3 _ L _ Y 0 _ L y _ Y z {em que, Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O~metil nucleotideos, [00893] Xz2 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, [00894] Lx representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-- P (O) (OH) -- W3 -- P (O) (OH) - (em que, W6 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotideos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [00895] -P(=O)(OH)-, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (=O) (OH) -o (CH2) r-o-p (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00896] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) ” (OCH2CH2) S-O-P ( = O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00897] X1 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00898] X2 é uma primeira porção da sequência nudeotídica e re
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170/259 presents um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, [00899] X3 representa um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00900] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-p (=o) (oh) -w5-P ( — O) (oh) (em que, W5 representa um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 4 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (-O) (OH) --O (CH2) r--O-P Ó-O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00901] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (=O) (OH) ~ (OCH2CHa) S-O-P (=O) (OH) - (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00902] Y° é uma segunda porção da sequência nucleotidica e representa um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 12 a 16 ribonucleotídeos, [00903] Ly representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (=O) (OH) \\ P ( = O) (OH) ~ (em que, W7 representa um grupo derivado de um oHgonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos) ou [00904] -P(=O)(OH)-, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (”O) (OH) -O (CHj i O -P (~O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00905] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) - (OCH2CH2) s-O-P (=O) (OH) Petição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 206/357
171/259 (em que s é um número inteiro de 3 a 6) e [00906] Yz representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que contém uma porção de sequência antissenso, tem, pelo menos, um de um 2’-O-metil nucleotideo e LNA, e é composto por 10 a 20 nucleotídeos selecionados independentemente de desoximbonucleotídeos, 2’-O~metil nucleotideos e LNA}.
[00907] C-56) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-55), em que a primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso.
[00908] C-57) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que é representado pela seguinte fórmula:
A - B - X z 1 - X z 2 -- L x - X 1 - X 2 -- X 3 -- L - Y 0 - L y - Y z {em que, A representa um grupo derivado de uma molécula funcional, [00909] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente nâo substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-θ), -S-, -S(=O)- ou -S(=O)2-).
[00910] Xz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto de dois ou três 2’-O-metil nucleotideos, [00911] Xz2 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, [00912] Lx representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P ( = O) (OH) -W3--? ( = O) (OH) ~ (em que, W6 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo
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172/259 que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [00913] ~P(™O)(OH)~, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (~O) (OH) ~O (CH2) r~ O P (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00914] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) - (OCH2CH2) S-O-P ( = O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00915] X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00916] X2 é uma primeira porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, [00917] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00918] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (O) (OH) - W5 - P (O) (OH) -(em que, W5 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 7 nucleotídeos selecionados Independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P ( = O) (OH) -O (CH,) r O í; (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00919] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (-O) (OH) ---- (OCH2CH2) S--O-P %O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00920] Y° é uma segunda porção de sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 12 a 16 ribonucleotídeos, e
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173/259 [00921 ] Ly representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P ( = O) (OH) — W7 — P ( = O) (OH) (em que, W7 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotideos selecionados Independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [00922] -P(=O)(OH)-, um grupo representado pela seguinte fórmula:
“P (=O) (OH) O (CHa) r-Ο-Ρ (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00923] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
--P (:-~O) (OH) -- (OCHjCH,) s-O-P OO) (OH) (em que s é um número inteiro de 3 a 6) e [00924] Yz representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que contém uma porção de sequência antissenso, tem, pelo menos, um de um 2’-O-metil nucleotídeo e LNA, e é composto por 10 a 20 nucleotideos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, 2’-O~metil nucleotideos e LNA}.
[00925] 058) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 057), em que a primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso.
[00926] 059) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 057) ou 058), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos ou substituídos por - O-. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila), e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[00927] 060) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 057) a 059), em que B é acoplado com 0 nucleotídeo terminal de Xz1 através de uma ligação fosfodiéster.
[00928] 061) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 055) a 060), em que os nucleotideos contidos em Xz1,
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X1, X2, X3 e Yz estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato, e os nucleotídeos contidos em Xz2 e Y° são mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00929] C-62) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 055) a 061), em que os respectivos nucleotídeos terminais de Xz1 e Xz2, X1 e X2, e X2 e X3 estão acoplados através de uma ligação fosforotioato, e os respectivos nucleotídeos terminais de Xz2 e X1, e Y° e Yz estão acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00930] C-63) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-62), em que X2 e Y° se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00931] C-64) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-63), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotídeos que compõem uma estrutura parcial representada pela fórmula Χ1-χ2-χ3, e a sequência de bases de nucleotídeos que compõem Y° é 70% ou mais.
[00932] C-65) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-64), em que Xz2 e Yz se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00933] C-66) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-65), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotídeos que compõem Xz2, e a sequência de bases de nucleotídeos que compõem Yz é de 70% ou mais.
[00934] C-67) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-66), em que Xz1 e Yz se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00935] C-68) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-67), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotídeos que compõem Xz1, e a sequência de bases de nucleotídeos que compõem Yz é de 70% ou mais.
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175/259 [00936] 069) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 055) a 068), em que a estrutura parcial representada pela fórmula -Yz é representada pela fórmula -Yz3~Yz2-Yz1, [00937] Yz1 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo composto de 2 ou 3 LNA, [00938] Yz2 é uma porção de sequência antissenso contida em Yz e representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, [00939] Yz3 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA.
[00940] C-70) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em C-69), em que Xz2 e a estrutura parcial representada pela fórmula Yz2-Yz3 hibridizam-se dentro de uma molécula do mesmo.
[00941] C-71) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em C-69) ou C-70), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotídeos que compõem Xz2, e a sequência de bases de nudeotídeos que compõem a estrutura parcial representada pela fórmula Yz2-Yz3 é 70% ou mais.
[00942] C-72) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-69) a C-71), em que Xz1 e Yz1 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[00943] C-73) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-69) a C-72), em que a complementaridade da sequência de bases de nudeotídeos que compõem Xz1, e a sequência de bases de nudeotídeos que compõem Yz1 é de 70% ou mais.
[00944] C-74) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-68), em que Yz não contém fita oligonucleotídica composta por 4 desoxirribonucleotídeos contíguos.
[00945] C-75) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em C-74), em que pelo menos um dos nudeotídeos no lado 3’ e no lado 5’ de Yz
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176/259 é um nucleotideo selecionado independentemente de 2’-O-metil nucleotideos e LNA.
[00946] C-76) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-74) ou C-75), em que os nucleotideos no lado 3’ e no lado 5’ do Yz são nucleotideos selecionados independentemente de 2’-O-metil nucleotideos e LNA.
[00947] C-77) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-74) a C-76), em que Yz representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo selecionado independentemente de 2’-O-metil nucleotideos e LNA.
[00948] C-78) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-77), em que L, Lx e Ly representam, respectivamente, independentemente, um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (”O) (OH) -o (CH,) : O P (~O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00949] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P ó-o) (OH) - (OCH2CH2) S--O--P G-O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 3 a 6).
[00950] C-79) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-77), em que L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P ( = O) (OH) -O (CH2) r-o-p (= O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00951] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
P (:=:O) (OH) -- (OCH2CH2) s --O--P (—O) (OH) (em que s é um número Inteiro de 3 a 6) e [00952] Lx e Ly representam -P(=O)(OH)-.
[00953] C-80) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-77), em que L representa um grupo representa
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177/259 do pela seguinte fórmula:
— P ( = O) (OH) ~O (CH2) r-O-P (=O) (OH) (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00954] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (=O) (OH) - (OCH,CHa) s--O-~P (=O) (OH) - (em que, s é um número inteiro de 0 a 6).
[00955] Lx representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-- P (O) (OH) - We - P (O) (OH) -(em que, W6 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [00956] Ly representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-- P (- O) (OH) - W 7 - P ( - O) (OH) (em que, W7 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos).
[00957] C-81) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-80), em que os nucleotídeos contidos em Lx e Ly são mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00958] C-82) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-55) a C-77), em que L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (=== O) (O H) ~ W5 - P (== O) (O H) (em que, W5 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 4 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [00959] Lx e Ly respectivamente e independentemente representam um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P (=O) (OH) ~O (CHa) r-O-P (=O) (OH) -
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178/259 (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[00960] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P OO) (OH) - (OCH2CH2) S-O--P (===O) (OH) (em que, s é um número inteiro de 3 a 6).
[00961] 083) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 082), em que os nucleotídeos contidos em L estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[00962] 084) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 055) a 083), em que Xz2 é um grupo derivado de RNA, que é composto de 10 a 13 ribonucleotídeos.
[00963] 085) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 037) a 083), em que Y° representa um grupo derivado de RNA, que é composto de 12 a 16 ribonucleotídeos.
[00964] 086) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1), em que é representado pela seguinte fórmula:
X 1 - X 2 - X 3 - L - Y 2 - Y 1 {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [00965] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotídica que é uma sequência antissenso, [00966] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00967] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-p ( = O) (OH) - L (OCH2CH2) s‘-O-P2-] s 2 2 _ (OCH2C
H2) s7-O--P ( = O) (OH) (em que, cada P2 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou [00968] -P(=O)(SH)-, s1 é um número inteiro de 1 a 10 e s22 é um número inteiro de 0 a 4),
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179/259 [00969] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonudeotideos, [00970] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotídeos}.
[00971] C-87) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-86), em que P2 representa -P(=O)(OH)-.
[00972] C-88) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1), em que é representado pela seguinte fórmula:
X 1 - X 2 - X 3 - L - ¥ 2 - Y 1 {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [00973] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonudeotideos, e tem uma primeira sequência nucleotídica que é uma sequência antissenso, [00974] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00975] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
P (~O) (OH) --o - V 2 - O - P (~O) (OH) --{em que, V2 representa um grupo representado pela seguinte fórmula (XII-1), (XII-3), (XII-7) ou (XII-8):
Figure BR112019014547A2_D0046
(XII-1 )
Figure BR112019014547A2_D0047
( XII-3 )
Figure BR112019014547A2_D0048
(em que, o2 é um número inteiro de 1 a 6, p2 é um número inteiro de 1
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180/259 a 6 e d2 é um número inteiro de 1 a 6) [00976] Y2 representa uma segunda porção de sequência nucleotidica, e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, e [00977] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O~metil nucleotídeos}.
[00978] C-89) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1), em que é representado pela seguinte fórmula:
X 1 -- X 2 - X 3 - L - Y 2 - Y 1 {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [00979] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotidica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxírribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotidica que é uma sequência antissenso, [00980] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00981] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (=O) (OH) - [O - V 4 - O - P 4 -J s 44--O--V4--O--P (=O)
OH) (em que, cada P4 representa independentemente -P(-O)(OH)~ ou [00982] -P(=O)(SH)-, s44 é um inteiro de 0 a 9, V4 representa um grupo representado pela seguinte fórmula (XI1-10)
Figure BR112019014547A2_D0049
(XII-10 ) [00983] Y2 representa uma segunda porção de sequência nucleotidica, e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, e [00984] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo
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181/259 que é composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotídeos}.
[00985] 090) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 089), em que P4 representa ~P(=O)(OH)~.
[00986] 091) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que é representado pela seguinte fórmula:
X 1 — X 2 — X 3 — L — Y 2 — Y 1 {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [00987] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonudeotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotídica que é uma sequência antissenso, [00988] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [00989] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
P 2 LO-V1 4-o- P 1 4~j - ; \ 1 Íj p * {em que, cada V14 representa, independentemente, um grupo representado pela seguinte fórmula (XIV-10) ou (XIV-11):
Figure BR112019014547A2_D0050
(XIV-10)
Figure BR112019014547A2_D0051
(em que, w é 0 ou 1, Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila Ci-β, um grupo halo-alquila Ci-β, um grupo alquilcarbonila C1-6, um grupo halo-alquilcarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila Ci 6 substituído por um grupo alcóxi C-i-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaminocarbonila C1-6, um grupo dialquilaminocarbonila C1-6, um grupo alquilsulfonila C1-6, um grupo halo-alquilsulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila Ci-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi C1-6 ou um grupo car
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182/259 bamoíla, um grupo monoalquilamino C1-6 ou um grupo dialquilamino Ci-6), [00990] um grupo ribonucleosídeo ou [00991] um grupo desoxirribonudeosídeo), [00992] pelo menos um dos Vu é um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XIV-10) ou (XIV-11), [00993] cada P14 representa independentemente -Ρί-ΟχΟΗ)- ou P(=O)(SH)-, [00994] pelo menos um P14 representa -P(=O)(OH)-, [00995] s14 é um número inteiro de 1 a 9, e quando s14 é 1 ou mais,
V14 é igual ou diferente}, [00996] Y2 representa uma segunda porção de sequência nudeotídica, e representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, e [00997] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotídeos}.
[00998] C-92) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em C-91), em que P14 representa -P(=O)(OH)-.
[00999] 093) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em 115), em que é representado pela seguinte fórmula:
X1 — X2 — X3 — L — Y2 — Y!—B — A {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [001000] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotídica que é uma sequência antissenso, [001001] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [001002] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
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183/259
Ρ ( = Ο) (Ο Η) -- L (OCILCHj s ί ;· P s 2 2 - - (OCH2C η2) s^-O -P ( = Ο) (ΟΗ) (em que, cada Ρ2 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou [001003] -P(=O)(SH)-, s1 é um número inteiro de 1 a 10 e s22 é um número inteiro de 0 a 4), [001004] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, [001005] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2!-O-metil nucleotideos, [001006] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxlla, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-δ), -S-, -8(-0)- ou -S(=O)2-), e [001007] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
[001008] C-94) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-93), em que P2 representa -P(~O)(OH)~.
[001009] C-95) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que a seguinte fórmula:
X 1 ---- X 2 - X 3 - L --- Y 2 -- Y 1 ---- B - A {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [001010] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica e re~
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184/259 presents um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucieotideos, e tem uma primeira sequência nucleotidica que é uma sequência antissenso, [001011] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [001012] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
-P (-“O) (OH) -O---V <; -P (:---O) (OH) {em que, V2 representa um grupo representado pela seguinte fórmula (XII-1), (XII-3), (XII-7) ou (XII-8):
Figure BR112019014547A2_D0052
(XII-7) (Xii-8) (em que, o2 é um número inteiro de 1 a 6, p2 é um número inteiro de 1 a 6, d2 é um número inteiro de 1 a 6)}.
[001013] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotidica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, [001014] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metíl nucleotídeos, [001015] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso,
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185/259 os grupos metileno do grupo alquileno e o grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila Ci-β ou um grupo halo-alquila Ci-β), -S-, -8(=0)- ou -8(=0)2-), e [001016] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
[001017] C-96) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que é representado pela seguinte fórmula:
X1-Xz-X3-L-Y3-Y’-B-A {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [001018] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotídica que é uma sequência antissenso, [001019] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [001020] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (O) (OH) - : O V 4 - O - P 4 - J s 4 4 O - V 4 O - P (O) (
OH) -(em que, cada P4 representa independentemente -P(=O)(OH)~ ou [001021] -P(=O)(SH)-, s44 é um inteiro de 0 a 9, V4 representa um grupo representado pela seguinte fórmula (XI1-10) (Xil-10 ) [001022] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos,
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186/259 [001023] Y1 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotideos, [001024] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O~, ~NRB~ (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-β), -S-, -S(=O)- ou -S(=O)2-), e [001025] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
[001026] C-97) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-89), em que P4 representa -P(=O)(OH)-.
[001027] C-98) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que é representado pela seguinte fórmula:
X 1 -- X 2 - X 3 -- L -- Y 2 -- Y 1 -- B -- A {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [001028] X2 é uma primeira porção de sequência nudeotídica, representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nudeotídica que é uma sequência antissenso, [001029] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [001030] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
— p 1 4 — LO-V14-O-P,4-J s14 —Ο —V’4 —O —P,4~ {em que, cada V14 representa, independentemente, um grupo repre
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187/259 sentado pela seguinte fórmula (XIV-10) ou (XIV-11):
Rc
I
Figure BR112019014547A2_D0053
(XIV-10) (XIV-11) (em que, w é 0 ou 1, e Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6, um grupo halo-alquila C1-6, um grupo alquilcarbonila C1-6, um grupo halo-alquilcarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi Ci-β ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaminocarbonila C1-6, um grupo dialquilaminocarbonila C1-6, um grupo alquilsulfonila Ci-6, um grupo halo-alquilsulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi C1-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilamino C1-6 ou um grupo dialquilamino Ci-6), [001031] um grupo ribonucleosídeo ou [001032] um grupo desoxirribonucleosídeo), [001033] pelo menos um dos V14 é um grupo representado pela fórmula mencionada acima (XIV-10) ou (XIV-11), [001034] cada P14 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, [001035] pelo menos um P14 representa -P(=O)(OH)-, [001036] s14 é um número inteiro de 1 a 9, e quando s14 é 1 ou mais, Vu é igual ou diferente}, [001037] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotidica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, [001038] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotídeos, [001039] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alqueni
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188/259 leno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-β), -S-, -S(=O)- ou -S(=O)2-), e [001040] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
[001041] C-99) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-98), em que P14 representa -P(=O)(OH)-.
[001042] C-100) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-93) a C-99), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno sâo respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por -O~. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila), e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[001043] C-101) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-93) a C-100), em que B é acoplado com 0 nucleotídeo terminal de Y1 através de uma ligação fosfodiéster.
[001044] C-102) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-93) a C-99), em que a seguinte fórmula:
X-X?-X::-L-Y-Y'
B
A {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA,
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189/259 [001045] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotídica que é uma sequência antissenso, [001046] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [001047] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- L P 1 2 — í ~ O - V 1 2 -) q () q 8 — P ’ 2 — {em que, V12 representa [001048] um grupo alquileno C2-20 (0 grupo alquileno C2-20 é não substituído, ou é substituído por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxila e um grupo amino), [001049] um grupo selecionado do grupo que consiste nas seguintes fórmulas (VIII-2, 3, 9 ou 11):
Figure BR112019014547A2_D0054
(VIII-2) (VIII-3)
Figure BR112019014547A2_D0055
Figure BR112019014547A2_D0056
(Vlli-9)
Figure BR112019014547A2_D0057
(VIII-11 ) (em que, o1 é um número inteiro de 0 a 10, p1 é um número inteiro de 0 a 10 e d1 é um número inteiro de 1 a 10) [001050] um grupo ribonucleosídeo ou [001051] um grupo desoxirribonucleosídeo, [001052] pelo menos um de V12 representa um grupo alquileno C2-20 (0 grupo alquileno C2-20 é substituído por um ou mais substituintes selecionados do grupo que consiste em um grupo hidroxila e um grupo
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190/259 amino), ou a fórmula mencionada acima (VIII-2, 3, 9 ou 11), [001053] cada P12 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou P(O)(SH)-, [001054] pelo menos um P12 representa -P(=O)(OH)-, [001055] q? é um número inteiro de 1 a 10, qs é um número inteiro de 1 a 6, e quando pelo menos um de q? e qg é 2 ou mais, V12 é igual ou diferente.
[001056] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por 10 a 13 ribonudeotídeos, [001057] Y1 representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo que é composto por dois ou três 2’-O-metil nudeotídeos, [001058] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substitutes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila C1-6), -S-, -S(=O)- ou -S(=O)2-), e [001059] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
[001060] 0103) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em ΟΙ 02), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos, ou substituídos por -O-. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila, um grupo amino ou um grupo oxo)
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191/259 e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[001061] C-104) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em ΟΙ 02) ou C-103), em que B é acoplado com a porção na qual um átomo de hidrogênio é removido de um grupo amino de L.
[001062] C-105) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-102) a C-104), em que P12 representa -P(=O)(OH)-.
[001063] C-106) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-86) a C-105), em que os nucleotídeos contidos em X 1 , X 2, X 3 e Y 1 estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato, e os nucleotídeos contidos em Y 2 são mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster).
[001064] C-107) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-86) a C-102), em que os respectivos nucleotídeos terminais de X1 e X2, X2 e X3 e Y2 e Y1 são acoplados através de uma ligação fosforotioato.
[001065] C-108) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-86) a C-107), em que X1 e Y1 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[001066] C-109) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-86) a C-108), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotídeos que compõem X1, e a sequência de bases de nucleotídeos que compõem Y1 é de 70% ou mais.
[001067] C-110) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-86) a C-109), em que X3 e Y2 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[001068] C-111) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-86) a C-110), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotídeos que compõem a estrutura parcial representada pela fórmula X2-X3, e a base de sequência de nucleotídeos que compõem Y2 é de 70% ou mais.
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192/259 [001069] C-112) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-86) a C-111), em que Y2 representa um grupo derivado de RNA, que é composto de 10 a 13 ribonucleotídeos.
[001070] C-113) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que é representado pela seguinte fórmula:
X’-X2-X3-L-YI!-B-A {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois ou três LNA, [001071] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotídica que é uma sequência antissenso, [001072] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [001073] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
— P ( = O) (OH) -O (CH2) r-O-P (=O) (OH) - (em que, r é um número inteiro de 0 a 15).
[001074] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (~~O) (OH) -- L (OCH2CHj s O P: s 2 2 - (OCH,C
H2) s1 O P (---0) (OH) (em que, cada P2 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, s1 é um número inteiro de 1 a 10es22éum número inteiro de 0 a 4 ), [001075] ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
-p (==O) (OH) Ο V2 O P (==O) (OH) {em que, V2 representa um grupo representado pela seguinte fórmula (XII-1), (XII-3), (XII-7) ou (XII-8):
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193/259
Figure BR112019014547A2_D0058
( XII-1 ) ( XII-3 )
Figure BR112019014547A2_D0059
(XII-7)
Figure BR112019014547A2_D0060
(em que, o2 é um inteiro de 1 a 6, p2 é um inteiro de 1 a 6 e d2 é um número inteiro de 1 a 6)}, ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
— p 1 4 — () Y ; o P 14-J s 1 4 — O — V 1 4 — O — P 1 4— {em que, cada V14 representa, independentemente, um grupo representado pela seguinte fórmula (XIV-10) ou (XIV-11):
Figure BR112019014547A2_D0061
(XIV-10)
Figure BR112019014547A2_D0062
w (em que, w é 0 ou 1, Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila Ci-β, um grupo halo-alquila Ci-β, um grupo alquilcarbonila C1-6, um grupo halo-alquilcarbonila Ci-β, um grupo alcoxicarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi Ci-β ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaminocarbonila C1-6, um grupo dialquilaminocarbonila Ci-β, um grupo alquilsulfonila C1-6, um grupo halo-alquilsulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi C1-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalqullamino C1-6 ou um grupo dialquilamino Cl-6), [001076] um grupo ribonucleosídeo ou [001077] um grupo desoxirribonucleosídeo),
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194/259 [001078] pelo menos um de V14 representa um grupo representado pela fórmula geral mencionada acima (XIV-10) ou (XIV-11), [001079] cada P14 representa independentemente -P(~O)(OH)~ ou P(=O)(SH)-, [001080] pelo menos um P14 representa -P(=O)(OH)-, [001081] s14 é um número inteiro de 1 a 9, e quando s14 é 1 ou mais, V14 é igual ou diferente}, [001082] Y° é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 12 a 16 ribonucleotídeos, [001083] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-β), -S-, -S(-O)- ou -S(=O)2~), e [001084] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
[001085] C-114) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em Ο113), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos, ou substituídos por -O-. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila), e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[001086] C-115) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C
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113) ou C-114), em que B é acoplado com o nucleotídeo terminal de Y° através de uma ligação fosfodiéster.
[001087] C-116) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-113) a C-115), em que P2 e P14 representam -P(=O) (OH)-.
[001088] C-117) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-113) a C-116), em que os nucleotídeos contidos em X1, X2 e X3 estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato e os nucleotídeos contidos em Y° são mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[001089] C-118) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-113) a C-117), em que os respectivos nucleotídeos terminais de Xs e X2, e X2 e X3 são acoplados através de uma ligação de fosforotioato.
[001090] C-119) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-113) a C-118), em que X2 e Y° se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[001091] C-120) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-113) a C-119), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotídeos que compõem X2, e a sequência de bases de nucleotídeos que compõem Y° é de 70% ou mais.
[001092] C-121) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-113) a C-120), em que X1 e X3 se hibridizam com Y° dentro de uma molécula do mesmo.
[001093] C-122) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-113) a C-121), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotídeos que compõem a estrutura parcial representada pela fórmula X1-X2-X3, e a sequência de bases de nucleotídeos que compõem Y° é 70% ou mais.
[001094] C-123) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 1),
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196/259 em que é representado pela seguinte fórmula:
X - L - Y 2 - Y 1 {em que, X representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo tendo pelo menos um tipo selecionado de 2’-0-metil nucleotideo, 2’-Ometoxietil nucleotideo, 2’-O-metílcarbamoiletíl nucleotideo e LNA, é composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoximbonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos, 2’-O-metilcarbamoíletil nucleotídeos e LNA, contém uma porção de sequência antissenso e não contém fita oligonucleotídica composta por 4 desoximbonucleotídeos contíguos, [001095] Léo mesmo que a definição de L no C-113 mencionado acima, [001096] Y2 representa uma segunda porção de sequência nucleotídica, e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 15 ribonucleotídeos, e [001097] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois a cinco 2’-O-metila nucleotídeos}.
[001098] C-124) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que a seguinte fórmula:
X L Y \ i I Δ {em que, X representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo tendo pelo menos um tipo selecionado de 2!-O-metíl nucleotideo, 2’-Ometoxietil nucleotideo, 2’-O-metílcarbamoiletíl nucleotideo e LNA, é composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos, 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos e LNA, contém uma porção de sequência antissenso e não contém fita oligonucleotídica composta por 4 desoxirribonucleotídeos contíguos, [001099] Léo mesmo que a definição de L no C-113 mencionado acima,
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197/259 [001100] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotidica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 15 ribonucleotídeos, [001101] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois a cinco 2’-O-metil nucleotídeos, [001102] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de haiogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, ~NRB~ (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila O-β), -S-, -S(=O)- ou -S(=O)2-), e [001103] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
[001104] C-125) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em ΟΙ 24), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos, ou substituídos por -O-. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e Independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila), e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[001105] 0126) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em ΟΙ 24) ou 0125), em que B é acoplado com 0 nucleotídeo terminal de Y1 através de uma ligação fosfodiéster.
[001106] 0127) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 0123) a 0126), em que P2 e P14 representam -P(=O) (OH)-.
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198/259 [001107] 0128) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que é representado pela seguinte fórmula:
X-L-Y2-Y1
B
A {em que, X representa um grupo derivado de um oligonucleotide© tendo pelo menos um tipo selecionado de 2’0~metil nucleotídeo, 2’-0 metoxietil nucleotídeo, 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeo e LNA, é composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O~metoxietn nucleotídeos, 2,“O-metilcarbamoiletil nucleotídeos e LNA, contém uma porção de sequência antissenso e não contém fita oligonucleotídica composta por 4 desoxirribonucleotídeos contíguos, [001108] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
.... Γρ12,„. ( Q v 1 2,...) q . () q8....pl2..„ {em que, V12 representa [001109] um grupo alquileno C2-20 (0 grupo alquileno C2-20 é não substituído ou substituído por um ou mais substítuintes selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxila e um grupo amino), [001110] um grupo selecionado do grupo que consiste nas seguintes fórmulas (VIII-2, 3, 9 ou 11):
Figure BR112019014547A2_D0063
(VIII-2) (VIII-3)
Figure BR112019014547A2_D0064
(VIII-9 )
Figure BR112019014547A2_D0065
(Vlil-11 ) (em que, o1 é um número inteiro de 0 a 10, p1 é um número inteiro de
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199/259 a 10, d1 é um número inteiro de 1 a 10) [001111] um grupo ribonucleoside© ou [001112] um grupo desoxirribonucleosídeo, [001113] pelo menos um de V12 representa um grupo selecionado de um grupo alquileno C2-20 (0 grupo alquileno C2-20 é substituído por um ou mais substitutes selecionados do grupo que consiste em um grupo hidroxila e um grupo amino), ou as fórmulas mencionadas acima (VIII-2, 3, 9 ou 11), [001114] cada P12 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, [001115] pelo menos um P12 representa -P(=O)(OH)-, [001116] q? é um número inteiro de 1 a 10, qs é um número inteiro de 1 a 6, e quando pelo menos um de q? e qs é 2 ou mais, V12 é igual ou diferente.
[001117] Y2 é uma segunda porção da sequência nucleotidica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 15 ribonucleotídeos, [001118] Y1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por dois a cinco 2’-O-metll nucleotídeos, [001119] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1.6 ou um grupo halo-alquila C1-6), -S-, -S(=O)- ou -S(=O)2-), e [001120] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
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200/259 [001121] C-129) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em ΟΙ 28), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos ou substituídos por -O-. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila, um grupo amino ou um grupo oxo) e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[001122] C-130) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em ΟΙ 28) ou C-129), em que B é acoplado com a porção na qual um átomo de hidrogênio é removido de um grupo amino de L.
[001123] C-131) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-128) a C-130), em que P12 representa -P(=O)(OH)-.
[001124] C-132) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-123) a C-131), em que os nucleotideos contidos em X e Y1 são mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato e os nucleotideos contidos em Y2 são mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[001125] C-133) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-123) a C-132), em que os nucleotideos terminais de Y2 e Y1 são acoplados através de uma ligação fosforotioato.
[001126] C-134) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-123) a C-133), em que X e Y2 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[001127] C-135) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-123) a C-134), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotideos que compõem X, e a sequência de bases de nucleotideos que compõem Y2 é de 70% ou mais.
[001128] C-136) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-123) a C-135), em que XeY1 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
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201/259 [001129] 0137) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-123) a C-136), em que a complementaridade da sequência de bases dos nucleotídeos que compõem X, e a sequência básica de nucleotídeos que compõem a estrutura parcial representada pela fórmula Y2-Y1 θ de 70% ou mais.
[001130] C-138) O oligonudeotídeo de fita simples descrito em 115), em que a seguinte fórmula:
X .... [ .... Y 0 ..... B ..... A {em que, X representa um grupo derivado de um oligonudeotídeo tendo pelo menos um tipo seledonado de 2’-O-metil nucleotídeo, 2!-Ometoxietil nucleotídeo, 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeo e LNA, é composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonudeotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos, 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos e LNA, contém uma porção de sequência antissenso e não contém fita oligonucleotídica composta por 4 desoxirribonucleotídeos contíguos, [001131] Léo mesmo que a definição de L no C-113 mencionado acima, [001132] Y° é uma segunda porção da sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 20 ribonucleotídeos, [001133] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e 0 grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo al
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202/259 quila Ci-6 ou um grupo halo-alquila Ci-δ), -S-, -S(=O)- ou -S(=O)2-), e [001134] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}. [001135] C-139) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-138), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos ou substituídos por -O~. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila), e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[001136] C-140) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-138) ou C-139), em que B é acoplado com 0 nucleotideo terminal de Y° através de uma ligação fosfodiéster.
[001137] C-141) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-138) a C-140), em que P2 e P14 representam -P(=O) (OH)-. [001138] C-142) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-138) a C-141), em que os nucleotideos contidos em X estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato e os nucleotideos contidos em Y° estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster).
[001139] C-143) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-138) a C-142), em que X e Y° se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[001140] C-144) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-138) a C-143), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotideos que compõem X, e a sequência de bases de nucleotideos que compõem Y° é de 70% ou mais.
[001141] C-145) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em 115), em que a seguinte fórmula:
X 1 -· X 2 - X 3 -· L -· Y ü ··· L y · Y z
B
A {em que, X1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que
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203/259 é composto por 2 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos, 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos e LNA, [001142] X2 é uma primeira porção de sequência nucleotídica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tem uma primeira sequência nucleotídica que é uma sequência antissenso, [001143] X3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 a 6 nucleotídeos selecionados independentemente de 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos, 2’-Ometilcarbamoiletil nucleotídeos e LNA, [001144] L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- LP12- (-O-V12-) Q--O-J q8-P12{em que, V12 representa [001145] um grupo alquileno C2-20 (0 grupo alquileno C2-20 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxila e um grupo amino), [001146] um grupo selecionado do grupo que consiste nas seguintes fórmulas (VIII-2, 3, 9 ou 11):
nh2
Figure BR112019014547A2_D0066
(Viii-2) (VIII-3 )
Figure BR112019014547A2_D0067
(VIII-9) (VIII-11) [001147] (em que, o1 é um número inteiro de 0 a 10, p1 é um número inteiro de 0 a 10, d1 é um número inteiro de 1 a 10) [001148] um grupo ribonucleosídeo ou [001149] um grupo desoxirribonucleosídeo,
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204/259 [001150] peto menos um de V12 representa um grupo alquileno 62-20 (0 grupo alquileno C2-20 é substituído por um ou mais substitutes selecionados do grupo que consiste em um grupo hidroxila e um grupo amino), ou um grupo selecionado da fórmula mencionada acima (VIII2, 3, 9 ou 11), [001151] cada P12 representa independentemente -P(~O)(OH)~ ou P(=O)(SH)-, [001152] pelo menos um P12 representa -P(=O)(OH)-, [001153] q? é um número inteiro de 1 a 10, qs é um número inteiro de 1 a 6, e quando pelo menos um de q? e qs é 2 ou mais, V12 é igual ou diferente.
[001154] Y° é uma segunda porção da sequência nucleotidica e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 12 a 22 ribonucleotídeos, [001155] Ly representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
- P (O) (OH) -- W7 -- P ( = O) (OH) -(em que, W7 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 1 a 7 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), [001156] ou-P(=O)(OH)-, [001157] Yz representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que contém uma porção de sequência antissenso, tem, pelo menos, um tipo selecionado de: 2’-O-metil nucleotídeo, 2’-O-metoxietil nucleotídeo, 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeo e LNA, e é composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeo, 2’-O-metil nucleotídeo, 2’-O-metoxietil nucleotídeo, 2’-Ometilcarbamoiletil nucleotídeo e LNA, [001158] B representa um grupo alquileno C2-20 ou um grupo alquenileno C2-20 (os grupos metileno contidos no grupo alquileno e no grupo
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205/259 alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo hidroxila protegido, um grupo oxo e um grupo tioxo. Além disso, os grupos metileno do grupo alquileno e o grupo alquenileno são respectivamente e independentemente não substituídos, ou substituídos por -O-, -NRB- (RB representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6 ou um grupo halo-alquila Ci-β), -S-, -8(=0)- ou -S(=O)2-), e [001159] A representa um grupo derivado de uma molécula funcional}.
[001160] C-146) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em C~ 145), em que B representa um grupo alquileno C2 20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos ou substituídos por -O-. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila, um grupo amino ou um grupo oxo) e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[001161] C-147) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em ΟΙ 45) ou C-146), em que B é acoplado com a porção na qual um átomo de hidrogênio é removido de um grupo amino de L.
[001162] C-148) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-145) a C-147), em que P12 representa -P(=O)(OH)-. [001163] C-149) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em ΟΙ 45) a C-148), em que os nucleotídeos contidos em X1, X2, X3 e Y1 estão mutuamente acoplados através de uma ligação fosforotioato, e os nucleotídeos contidos em Y2 são mutuamente acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
[001164] C-150) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-145) a C-149), em que os respectivos nucleotídeos terminais de X1 e X2, X2 e X3 e Y2 e Y1 são acoplados através de uma liPetição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 241/357
206/259 gação fosforotioato.
[001165] 0151) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 0145) a 0150), em que X1 e Y1 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[001166] 0152) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 0145) a 0151), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotideos que compõem X1, e a sequência de bases de nucleotideos que compõem Y1 é de 70% ou mais.
[001167] 0153) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 0145) a 0152), em que X3 e Y2 se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[001168] 0154) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 0145) a 0153), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotideos que compõem a estrutura parcial representada pela fórmula X2-X3, e a base de sequência de nucleotideos que compõem Y2 é de 70% ou mais.
[001169] 0155) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 0145) a 0154), em que Y2 representa um grupo derivado de RNA, que é composto de 10 a 13 ribonucleotídeos.
[001170] C-156) A seguinte fórmula:
X-L~Y8”Ly -Ύ z
B
A {em que, X representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo tendo pelo menos um tipo selecionado de 2’-0-metil nucleotídeo, 2’-0metoxietil nucleotídeo, 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeo e LNA, é composto por 10 a 20 nucleotideos independentemente selecionados de desoximbonucleotídeos, 2’-0-metil nucleotideos, 2’-O-metoxietil nucleotideos, 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotideos e LNA, contém uma porção de sequência antissenso e não contém fita oligonucleotídica
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207/259 composta por 4 desoxirribonudeotídeos contíguos, e [001171] L, Y°, Ly, Yz, B e A são, cada um, o mesmo que a definição de L no 0155 supracitado).} [001172] 0157) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em ΟΙ 56), em que B representa um grupo alquileno C2-20 (os grupos metileno do grupo alquileno são, respectivamente e independentemente, não substituídos ou substituídos por -0-. Os grupos metileno não substituídos são respectivamente e independentemente não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxila, um grupo amino ou um grupo oxo) e A é um grupo derivado de um tocoferol.
[001173] C-158) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em ΟΙ 56) ou C-157), em que B é acoplado com a porção na qual um átomo de hidrogênio é removido de um grupo amino de L.
[001174] C-159) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-156) a C-158), em que P12 representa -P(=O)(OH)-.
[001175] C-160) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-156) a C-159), em que X e Y° se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo.
[001176] C-161) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-156) a C-160), em que a complementaridade da sequência de bases de nucleotídeos que compõem X, e a sequência de bases de nucleotídeos que compõem Y° é de 70% ou mais.
[001177] C-162) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-145) a C-161), em que a estrutura parcial representada pela fórmula -Yz é representada pela fórmula -Yz3-Yz2-Yz1, [001178] Yz1 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo composto de 2 ou 3 LNA, [001179] Yz2 é uma porção de sequência antissenso contida em Yz e representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 8 a 10 desoxirribonudeotídeos,
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208/259 [001180] Yz3 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA.
[001181] C-163) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-145) a 0162), em que Yz nâo contém fita oligonucleotídica composta por 4 desoxirribonucleotídeos contíguos.
[001182] Nos oligonucleotídeos de fita simples preferenciais descritos em C-1) a C-112) mencionados acima, os oligonucleotídeos de fita simples em que o tipo e o número dos nucleotídeos com açúcar modificado de X foram alterados como se segue também são preferenciais. [001183] C-164) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-1) a C-27) e C-86) a C-112), em que, em C-1) a C-27) e C-86) a C-112), X1 e X3 representam um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por quatro a seis 2,-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos em lugar de um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [001184] Y2 representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 12 a 16 ribonucleotídeos em lugar de um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 10 a 13 ribonucleotídeos, e os outros símbolos são os mesmos que qualquer uma das combinações em C-1 ) a C-27) e C-86) a C-112).
[001185] C-165) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de C-37) a C-85), em que, em C-37) a C-85), X1 e X3 representam um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por quatro a seis 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotídeos em vez de um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 2 ou 3 LNA, [001186] Y° representa um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 16 a 22 ribonucleotídeos em lugar de um grupo derivado de um oligonucleotídeo que é composto por 12 a 16 ribonucleotídeos, e os outros símbolos são os mesmos que qualquer uma
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209/259 das combinações em 037) a 085).
[001187] 0166) O oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 131), B-1) a B-61) e C-1) a 0165), em que a porção de base de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado é pelo menos um tipo selecionado do grupo consistindo em adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C), uracila (U) e 5-metilcitosina (5-me-C).
[001188] D-1) Um fármaco contendo como ingrediente ativo como o oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 131), B-1) a B-61) e C-1) a C-166).
[001189] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-1), C-86), C-88), C-89) e C-91), em que uma primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, mostrada na Figura 1. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 1, X1 composto por 2 ou 3 LNA, X2 composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos e tendo a primeira sequência nucleotídica, X3 composto por 2 ou 3 LNA, L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica, Y2 composto por 10 a 13 ribonucleotídeos e tendo a segunda sequência nucleotídica, e Y1 composto por dois ou três 2’-0-metil nucleotídeos, estão ligados nesta ordem. A direção de ligação de X1 a Y1 pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. Na Figura 1, X2 tendo a primeira sequência nucleotídica e Y2 tendo a segunda sequência nucleotídica formando uma fita dupla. Embora X1 e Y1 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla. Embora X3 e Y2 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferenclalmente formam uma fita dupla.
[001190] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-2), C-93), C-95), C-96) e C-98), em que uma primeira
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210/259 sequência nucleotídica é uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 2. No oligonudeotídeo de fita simples mostrado na Figura 2, X1 composto por 2 ou 3 LNA, X2 composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos e tendo a primeira sequênda nucleotídica, X3 composto por 2 ou 3 LNA, L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica, Y2 composto por 10 a 13 ribonudeotídeos e com a segunda sequência nudeotídica, Y1 composto por dois ou três 2’-O-metil nudeotídeos, B sob a forma de um grupo alquileno C2-20 e similares, e A sob a forma de um grupo derivado de uma molécula funcional, estão ligados nesta ordem. A direção de ligação de X1 a Y1 pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. Na Figura 2, X2 tendo a primeira sequência nudeotídica e Y2 tendo a segunda sequência nucleotídica formando uma fita dupla. Embora X1 e Y1 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla. Embora X3 e Y2 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
[001191] Um diagrama conceituai do oligonudeotídeo de fita simples descrito em C-7), em que uma primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nudeotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 3. No oligonudeotídeo de fita simples mostrado na Figura 3, Xz composto por 10 a 20 nudeotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nudeotídeos e LNA e tendo pelo menos um dos nudeotídeos 2’-O-metil e LNA, Lx que é um grupo de ligação, X1 composto por 2 ou 3 LNA, X2 composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos e tendo a primeira sequência nudeotídica, X3 composto por 2 ou 3 LNA, L que é um grupo de ligação, Y2 composto por 10 a 13 ribonucle
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211/259 otídeos e tendo a segunda sequênda nudeotídica e Y1 composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotideos, estão ligados nesta ordem. A direção de ligação de Xz a Y1 pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. Na Figura 3, X2 tendo a primeira sequência nudeotídica e Y2 tendo a segunda sequência nudeotídica formando uma fita dupla. Embora X1 e Y1 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferenciaimente formam uma fita dupla. Embora X3 e Y2 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
[001192] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-8), em que uma primeira sequência nudeotídica é uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequênda nudeotídica e uma segunda porção da sequência nudeotídica se hibridizam dentro de uma moiécula do mesmo, é mostrado na Figura 4. No oligonudeotídeo de fita simples mostrado na Figura 4, Xz composto por 10 a 20 nucleotideos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotideos e LNA e possuindo pelo menos um de 2’-O~metil nucleotideos e LNA, Lx que é um grupo de ligação, X1 composto por 2 ou 3 LNA, X2 composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos e tendo a primeira sequênda nudeotídica, X3 composto por 2 ou 3 LNA, L que é um grupo de ligação, Y2 composto por 10 a 13 ribonucleotídeos e tendo a segunda sequência nudeotídica, Y1 composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotideos, B na forma de um grupo alquileno C2-20, e similares, e A sob a forma de um grupo derivado de uma molécula funcional, estão ligados nesta ordem. A direção de ligação de Xz a Y1 pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. Na Figura 4, X2 tendo a primeira sequência nudeotídica e Y2 tendo a segunda sequência nudeotídica formando uma fita dupla. Embora X1 e Y1 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla. Embora X3 e Y2 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
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212/259 [001193] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-28), em que uma sequência nucleotídica Y contém uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 5. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 5, X1 composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados de 2’-O-metil nucleotídeos e LNA, X2 composto por 8 a 12 desoxirribonucleotídeos e tendo uma primeira sequência nucleotídica, L que é um grupo de ligação, Y° composto por 10 a 15 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência nucleotídica, Ly que é um grupo de ligação e Yz composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos e LNA, tendo pelo menos um de 2’-O-metil nucleotídeos e LNA, e contém uma porção de sequência antissenso, estão ligados nesta ordem. A direção de ligação de X1 a Yz pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. Na Figura 5, X2 tendo a primeira sequência nucleotídica e Y2 tendo a segunda sequência nucleotídica formando uma fita dupla. Embora X1 e Y° possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
[001194] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-29), em que uma sequência nucleotídica Y contém uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 6. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 6, A sob forma de um grupo derivado de uma molécula funcional, B na forma de um grupo alquileno C2-20 e similares, X1 composto por 2 ou 3 nucleotídeos selecionados a partir de 2’-O-metil nucleotídeos e LNA, X2 composto de 8 a 12 desoxirribonucleotídeos e tendo uma primeira sequência nucleotídica, L que é um grupo de ligação, Y° composto de 10 a 15 ribonucleotídeos e
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213/259 tendo uma segunda sequência nucleotídica, Ly que é um grupo de ligação, e Yz composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, 2’-O~metil nucleotídeos e LNA, tendo pelo menos um de 2’-O-metil nucleotídeos e LNA, e contendo porção sequencial antissenso, são ligados nesta ordem. A direção de ligação de X1 a Yz pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. Na Figura 6, X2 tendo a primeira sequência nucleotídica e uma porção de Y° tendo a segunda sequência nucleotídica formando uma fita dupla. Embora X1 e Y° possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
[001195] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-37), em que uma sequência nucleotídica Yz contém uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 7. A primeira sequência nucleotídica pode ser uma sequência antissenso. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 7, X1 composto por 2 ou 3 LNA, X2 composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos e tendo uma primeira sequência nucleotídica, X3 composto por 2 ou 3 LNA, L que é um grupo de ligação, Y° composto por 12 a 16 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência nucleotídica, Ly que é um grupo de ligação e Yz composto por 10 a 20 nucleotídeos índependentemente selecionados de desoximbonucleotídeos, 2!~O-metil nucleotídeos e LNA, tendo pelo menos um de 2’-O-metil nucleotídeos e LNA, e contém uma porção de sequência antissenso, estão ligados nesta ordem. A direção de ligação de X1 a Yz pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5!. Na Figura 7, X2 tendo a primeira sequência nucleotídica e Y° tendo a segunda sequência nucleotídica formando uma fita dupla. Apesar de X1 e X3 respectivamente e independentemente poderem ou não formar uma fita dupla com Y°, de preferência, formam uma fita du
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214/259 pia.
[001196] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-55), em que uma sequência nucleotidica Yz contém uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotidica e uma segunda porção da sequência nucleotidica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 8. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 8, Xz1 composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotídeos, Xz2 composto por 10 a 13 ribonucleotídeos e com uma terceira sequência nucleotidica, Lx que é um grupo de ligação, Xs composto por 2 ou 3 LNA, X2 composto de 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tendo uma primeira sequência de nucleotídeos, X3 composto de 2 ou 3 LNA, L que é um grupo de ligação, Y° composto de 12 a 16 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência de nucleotídeos, Ly que é um grupo de ligação, e Yz composto por 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos e LNA e possuindo pelo menos um de 2’-O-metil nucleotídeos e LNA, são ligados nesta ordem. A direção de ligação de Xz1 a Yz pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. A primeira sequência nucleotidica pode ser uma sequência antissenso. Na Figura 8, X2 tendo a primeira sequência nucleotídica e Y° tendo a segunda sequência nucleotidica formando uma fita dupla e Yz contendo uma porção sequencial antissenso e Xz2 tendo a terceira sequência nucleotidica formando uma fita dupla. Apesar de X1 e X3 respectivamente e independentemente poderem ou não formar uma fita dupla com Y°, de preferência, formam uma fita dupla. Embora Xz2 e Yz possam ou não formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla. Embora Xz1 e Yz possam ou não formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla. Lx e Ly podem ou não formar uma fita dupla.
[001197] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples
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215/259 descrito em C-57), em que uma sequência nucleotídica Yz contém uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 9. No oligonucleotideo de fita simples mostrado na Figura 9, A na forma de um grupo derivado de uma molécula funcional, B na forma de um grupo alquileno C2-20 e similares, Xz1 composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotideos, Xz2 composto por 10 a 13 ribonucleotídeos e com uma terceira sequência nucleotídica, Lx que é um grupo de ligação, X1 composto por 2 ou 3 LNA, X2 composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos e com uma primeira sequência nucleotídica, X3 composto por 2 ou 3 LNA, L que é um grupo de ligação, Y° composto de 12 a 16 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência nucleotídica, Ly que é um grupo de ligação, Yz composto por 10 a 20 nucleotideos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotideos e LNA, e tendo pelo menos um de 2!-O-metil nucleotideos e LNA, são ligados nesta ordem. A direção de ligação de A a Yz pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. A primeira sequência nucleotídica pode ser uma sequência antissenso. Na Figura 9, X2 tendo a primeira sequência nucleotídica e Y° tendo a segunda sequência nucleotídica formando uma fita dupla, Yz contendo a porção sequencial antissenso e Xz2 tendo a terceira sequência nucleotídica formando uma fita dupla. Apesar de X1 e X3 respectivamente e independentemente poderem ou não formar uma fita dupla com Y°, de preferência, formam uma fita dupla. Embora Xz2 e Yz possam ou não formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla. Embora Xz1 e Yz possam ou não formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla. Lx e Ly podem ou não formar uma fita dupla.
[001198] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-102), em que uma primeira sequência nucleotídica é
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216/259 uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 10. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 10, X1 composto por 2 ou 3 LNA, X2 composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos e tendo uma primeira sequência nucleotídica, X3 composto por 2 ou 3 LNA, L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica, Y2 composto por 10 a 13 ribonucleotídeos e tendo a segunda sequência nucleotídica, e Y1 composto por dois ou três 2’-O-metil nucleotídeos, estão ligados nesta ordem. B sob a forma de um grupo alquileno C2-20 e as ligações similares a L, e A sob a forma de um grupo derivado de uma molécula funcional se liga a Β. A direção de ligação de X1 a Y1 pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. Na Figura 10, X2 tendo a primeira sequência nucleotídica e Y2 tendo a segunda sequência nucleotídica formando uma fita dupla. Embora X1 e Y1 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla. Embora X3 e Y2 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
[001199] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-113), em que uma primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 11. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 11, X1 composto por 2 ou 3 LNA, X2 composto por 8 a 10 desoxirribonucleotídeos e tendo uma primeira sequência nucleotídica, X3 composto por 2 ou 3 LNA, L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica, Y° composto de 12 a 16 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência nucleotídica, B sob a forma de um grupo alquileno C2-20 e similares, e A sob a forma de um grupo derivado de uma molécula
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217/259 funcional, são ligados nesta ordem. A direção de ligação de X1 a Y° pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. Na Figura 11, X2 tendo a primeira sequência nucleotidica e Y° tendo a segunda sequência nucleotidica formando uma fita dupla. Embora X1 e Y° possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla. Embora X3 e Y° possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
[001200] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-123), e em que uma sequência nucleotidica X contém uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotidica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, mostrado na Figura 12. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 12, X composto por 10 a 20 LNA, desoxirribonucleotídeo e similares e que tem uma sequência nucleotidica X, L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica, Y2 composto por 8 a 15 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência nucleotidica, e Y1 composto por dois a cinco 2’-O-metil nucleotídeos, são ligados nesta ordem. A direção de ligação de X a Y1 pode estar na direção de 5’ a 3’ ou na direção de 3’ a 5’. Na Figura 12, X tendo a sequência de nucleotídeos X e Y2 que tem a segunda sequência nucleotidica formam uma fita dupla. Embora X e Y1 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
[001201] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-124), e em que uma sequência nucleotidica X contém sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotidica e uma segunda porção da sequência nucleotidica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 13. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 13, X composto por 10 a 20 LNA, desoxirribonucleotídeo e similares e que tem uma sequência nu
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218/259 cleotídica X, L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica, Y2 composto por 8 a 15 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência nucleotídica, Y1 composto de dois a cinco 2’O-metil nucleotideos, B sob a forma de um grupo alquileno C2-20 e similares, e A sob a forma de um grupo derivado de uma molécula funcional, são ligados nesta ordem. A direção de ligação de X a Y1 pode estar na direção de 5’ a 3’ ou na direção de 3’ a 5’. Na Figura 13, X tendo a sequência de nucleotideos X e Y2 que tem a segunda sequência nucleotídica formam uma fita dupla. Embora X e Y1 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
[001202] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-128), e em que uma sequência nucleotídica X contém sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 14. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 14, X composto por 10 a 20 LNA, desoxirribonucleotídeo e similares e que tem uma sequência nucleotídica X, L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica, Y2 composto por 8 a 15 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência nucleotídica, e Y1 composto por dois a cinco 2’-O-metil nucleotideos, são ligados nesta ordem. B sob a forma de um grupo alquileno C2-20 e as ligações similares a L, e A sob a forma de um grupo derivado de uma molécula funcional se liga a Β. A direção de ligação de X1 a Y1 pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. Na Figura 14, tendo a sequência nucleotídica X e Y2 que tem a segunda sequência nucleotídica formam uma fita dupla. Embora X e Y1 possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
[001203] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples
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219/259 descrito em C-138), e em que uma sequência nucleotídica X contém uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 15. No oligonucieotídeo de fita simples mostrado na Figura 15, X composto de 10 a 20 LNA, desoxirribonucleotídeo e similares, e tendo uma sequência nucleotídica X, L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica, Y° composto de 10 a 20 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência nucleotídica, B sob a forma de um grupo alquileno C2-20 e similares, e A sob a forma de um grupo derivado de uma molécula funcional, são ligados nesta ordem. A direção de ligação de X a Y° pode estar na direção de 5’ a 3’ ou na direção de 3’ a 5’. Na Figura 15, X tendo a sequência de nucleotideos X e Y° que tem a segunda sequência nucleotídica formam uma fita dupla.
[001204] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-145), em que uma primeira sequência nucleotídica é uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotídica e uma segunda porção da sequência nucleotídica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 16. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 16, X1 composto de dois a seis 2’-O-metil nucleotideos, 2’-O-metoxietil nucleotideos, 2’-Ometilcarbamoiletil nucleotideos, LNA e similares, X2 composto de 8 a 10 desoxirribonucleotídeos, e tendo uma primeira sequência nucleotídica, X3 composto por dois a seis 2’-O-metil nucleotideos, 2’-Ometoxietil nucleotideos, 2’-O-metilcarbamoiletil nucleotideos, LNA e similares, L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica, Y° composto de 12 a 22 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência nucleotídica, Ly que é um grupo de ligação, e Yz composto de 10 a 20 nucleotideos selecionados Independentemente de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotideos, 2’-O-metoxietil
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220/259 nucleotídeos, 2’-O-metilcarbarnoiletil nucleotídeos e LNA e similares, e contendo uma porção de sequência antissenso, estão ligados nesta ordem. B sob a forma de um grupo alquileno C2-20 θ as ligações similares a L, e A sob a forma de um grupo derivado de uma molécula funcional se liga a Β. A direção de ligação de X1 a Yz pode estar na direção 5’ a 3’ ou na direção 3’ a 5’. Na Figura 16, X2 tendo a primeira sequência nucleotidica Y° e tendo a segunda sequência nucleotidica formando uma fita dupla. Embora X1 e Y° possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla. Embora X3 e Y° possam ou não possam formar uma fita dupla, preferencialmente formam uma fita dupla.
[001205] Um diagrama conceituai do oligonucleotídeo de fita simples descrito em C-156), em que uma primeira sequência nucleotidica é uma sequência antissenso, e a primeira porção da sequência nucleotidica e uma segunda porção da sequência nucleotidica se hibridizam dentro de uma molécula do mesmo, é mostrado na Figura 17. No oligonucleotídeo de fita simples mostrado na Figura 17, X composto de 10 a 20 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos, 2’-O~metilcarbamoiletil nucleotídeos e LNA e similares, L que é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica, Y° composto de 12 a 22 ribonucleotídeos e tendo uma segunda sequência nucleotidica, Ly que é um grupo de ligação, e Yz composto de 10 a 20 nucleotídeos selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-O-metoxietil nucleotídeos, 2’-Ometilcarbamoiletil nucleotídeos e LNA e similares e contendo uma porção de sequência antissenso, estão ligados nesta ordem. B sob a forma de um grupo alquileno C2-20 e as ligações similares a L, e A sob a forma de um grupo derivado de uma molécula funcional se liga a B. A direção de ligação de X1 a Yz pode estar na direção 5’ a 3’ ou na dire
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221/259 ção 3’ a 5’. Na Figura 17, X tendo a sequência de nucleotídeos X e Y° que tem a segunda sequência nucleotídica formam uma fita dupla.
[001206] A seguir listam exemplos de métodos preferenciais para utilizar o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção.
[001207] E-1) Um método para controlar uma função de um RNA alvo, compreendendo uma etapa para colocar em contato o nucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 131), B-1) a B-61) e ΟΙ) a C-166) com uma célula.
[001208] E-2) Um método para controlar uma função de um RNA alvo em um mamífero, compreendendo uma etapa para administrar uma composição farmacêutica contendo o oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 131), B-1) a B- 61) e C-1) a C-166) ao mamífero.
[001209] E-3) O método descrito em E-2), em que o mamífero é um ser humano.
[001210] E-4) O método descrito em E-2) ou E-3), em que uma via de administração é enteral.
[001211] E-5) O método descrito em E-2) ou E-3), em que uma via de administração é parenteral.
[001212] E-6) Uma utilização do oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 131), B-1) a B-61) e C-1) a C-166) para controlar uma função de um RNA alvo em um mamífero.
[001213] E-7) Uma utilização do oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 131), B-1) a B-61) e C-1) a C-166) para produzir um fármaco para controlar um RNA alvo em um mamífero.
[001214] E-8) A utilização descrita em E-6) ou E-7), em que o mamífero é um ser humano.
[001215] O controle da função de um RNA alvo na presente invenção refere-se à supressão da tradução ou regulação ou conversão de uma função de processamento como o processamento de éxons que ocorre
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222/259 cobrindo uma porção de um RNA alvo devido à hibridização por uma porção de sequência antissenso, ou suprimindo uma função de um RNA alvo degradando o RNA alvo mencionado acima que é capaz de ocorrer como resultado do reconhecimento de uma porção hibridizada de uma porção de sequência antissenso e uma parte do RNA alvo.
[001216] E-9) Um método para controlar uma expressão de um gene alvo, compreendendo uma etapa para colocar em contato o oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 131), B-1) a B-61) e C-1) para C-166) com uma célula.
[001217] E-10) Um método para controlar uma expressão de um gene alvo em um mamífero, compreendendo uma etapa para administrar uma composição farmacêutica contendo o oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 131), B-1) a B- 61) e C-1) a C-166) ao mamífero.
[001218] E-11) O método descrito em E-10), em que o mamífero é um ser humano.
[001219] E-12) O método descrito em E-10) ou E-11), em que uma via de administração é enteral.
[001220] E-13) O método descrito em E-10) ou E-11), em que uma via de administração é parenteral.
[001221] E-14) Uma utilização do oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 131), B-1) a B-61) e C-1) a C-166) para controlar uma expressão de um gene alvo em um mamífero.
[001222] E-15) Uma utilização do oligonucleotídeo de fita simples descrito em qualquer um de 1) a 131), B-1) a B-61) e C-1) a C-166) para produzir um fármaco para controlar uma expressão de um gene alvo em um mamífero.
[001223] E-16) A utilização descrita em E-14) ou E-15), em que o mamífero é um ser humano.
[001224] Embora o acima forneça uma explicação dos aspectos pre
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223/259 ferenciais dos oligonucleotídeos de fita simples, o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção não está limitado aos aspectos mencionados acima. O oligonucleotídeo de fita simples inclui, por exemplo, o que está incluído, o qual está presente após ter sofrido tautomerismo ou isomerismo geométrico, independentemente de ser endocícllco ou exocíclico, bem como o presente como misturas dos mesmos ou como misturas dos respectivos isômeros dos mesmos. Além disso, no caso da presença de um centro assimétrico ou no caso de gerar um centro assimétrico como resultado da isomerização, o oligonucleotídeo de fita simples inclui o que está presente como respectivos isômeros óticos e misturas de proporções arbitrárias. Além disso, no caso de um composto com dois ou mais centros assimétricos, os diastereisômeros estão também presentes devido aos seus respectivos isômeros óticos. A presente invenção inclui todas estas formas na proporção opcional das mesmas. Além disso, os isômeros óticos podem ser obtidos pelo método bem conhecido para este fim.
[001225] A presente invenção também inclui um sal farmacêuticamente aceitável do nucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I).
[001226] O oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I) também pode ser convertido em um sal farmaceuticamente aceitável ou liberado a partir de um sal formado, conforme necessário. Exemplos do sal farmaceuticamente aceitável do oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I) incluem um sal formado com um metal alcalino (como lítio, sódio e potássio), um metal alcallnoterroso (como magnésio e cálcio), amônio, uma base orgânica (como trietilamina e trimetilamina), um aminoácido (como glicina, lisina e ácido glutâmico), ácidos inorgânicos (como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico e ácido sulfúrico) e um ácido orgânico (como como ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido
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224/259 tartárico, ácido benzenossulfônico, ácido metanossulfônico e ácido ptoluenossulfônico).
[001227] Em particular, uma estrutura parcial representada por P(=O)(OH)- pode ser convertida em uma estrutura parcial aniônlca representada por -P(=O)(O )- para formar um sal com um metal alcalino (como lítio, sódio e potássio), um metal alcalino-terroso (como magnésio e cálcio) ou amônio. Além disso, uma estrutura parcial representada por -P(=O)(SH)-, que forma uma ligação fosforotioato, pode ser convertida em uma estrutura parcial aniônica representada por P(=O)(S )- para formar de forma similar um sal com um metal alcalino, um metal alcalino-terroso ou amônio.
[001228] A presente invenção também inclui um profármaco do oligonucleotídeo de fita simples representado pela fórmula (I).
[001229] Um profármaco refere-se a um derivado de um composto farmacêutico que tem um grupo que pode ser quimicamente ou metabolicamente degradado, e é um composto que é degradado por solvólise ou in vivo sob condições fisiológicas e derivado de um composto farmacêutico farmacologicamente ativo. Métodos adequados para selecionar e produzir derivados de profármacos são descritos, por exemplo, em Design of Prodrugs, (Elsevier, Amsterdam, 1985). No caso da presente invenção, e no caso de se ter um grupo hidroxila, um exemplo do profármaco é um derivado acllóxi produzido pela reação do composto com um haleto de acila adequado, um anidrido ácido adequado ou um composto alquiloxicarbonila halogenado adequado. Exemplos particularmente preferenciais das estruturas do profármaco incluem -O-COC2H5, -O-CO(t-Bu), -O-COC15H31, [001230] -O-CO(m-CO2Na-Ph), -O-COCH2CH2CO2Na-OCOCH(NH2) CH3, -O-COCH2N(CH3)2 ou -O-CH2OC(-O)CH3. No caso do oligonucleotídeo de fita simples que forma a presente invenção tem um grupo amino, exemplos do profármaco incluem os produzidos por reação do
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225/259 composto que tem um grupo amino com um haleto ácido adequado, um anidrido ácido misto adequado ou um composto alquiloxicarbonila haiogenado adequado. Exemplos particularmente preferenciais da estrutura do profármaco incluem -NH-CO(CH2)2oOCH3, -NH-COCH(NH2) CH3, -NH-CH2OC(=O)CH3 e similares.
[001231] Embora o oligonucleotídeo de fita simples indicado na fórmula (I) da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, possa estar presente em uma forma cristalina arbitrária ou hidrato arbitrário de acordo com as condições de produção, estas formas cristalinas, hidratos e misturas dos mesmos estão incluídas no escopo da presente invenção. Além disso, pode também estar presente como um solvato de um solvente orgânico como acetona, etanol, 1propanol, 2-propanol e similares, e todas estas formas estão também incluídas no escopo da presente invenção.
[001232] O oligonucleotídeo de fita simples pode ser produzido selecionando adequadamente um método conhecido entre os versados na técnica. Por exemplo, um versado na técnica é capaz de sintetizar o oHgonucleotídeo de fita simples concebendo a sequência nucleotidica do oligonucleotídeo de fita simples com base nos dados da sequência nucleotidica de um RNA alvo e sintetizando depois o oHgonucleotídeo de fita simples utilizando um sintetizador de ácidos nucléicos automatizado disponível comercialmente (como aquele fabricado pela Applied Biosystems, Beckman ou GeneDesign Inc.). Além disso, também pode ser sintetizado por uma reação usando enzimas. Exemplos das enzimas mencionadas acima incluem, mas não estão limitados a polimerases, ligases e enzimas de restrição. Ou seja, um método para produzir o oHgonucleotídeo de fita simples de acordo com a presente modalidade pode compreender uma etapa para prolongar uma fita nucleotidica na extremidade 3’ ou na extremidade 5’ de um oHgonucleotídeo contendo pelo menos um de X, Y, Xz, Yz, L, Lx e Ly (entre eles, um oligo
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226/259 nucieotídeo contendo pelo menos um de X, Y e L). Adicionalmente, pode conter uma etapa para prolongar uma fita nucleotídica na extremidade 3’ ou na extremidade 5’ de um oligonucleotídeo contendo um grupo de ligação contendo pelo menos uma estrutura não nucleotídica. [001233] O grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica e o oligonucleotídeo pode ser ligado por um método de amidita comum ou por um método de H-fosfonato. Por exemplo, após proteger um dos grupos hidroxila de um composto tendo dois grupos hidroxila, o composto é derivatizado para uma forma de amidita por um reagente de amiditação (por exemplo, éster 2-cianoetilico de ácido oloro(diisopropilamino)fosfinoso, éster 2~cianoetilico de ácido bis(diisopropilami~ no)fosfinoso e similares), ou a uma forma de H-fosfonato por um reagente de H-fosfonato (por exemplo, difenil fosfito, ácido fosforoso e similares), é capaz de se ligar a um oligonucleotídeo e desproteger o grupo hidroxila protegido mencionado acima, e o nucieotídeo pode ser adicionalmente prolongado utilizando um sintetizador automático de ácido nucleico comercialmente disponível. O composto mencionado acima que tem dois grupos hidroxila pode ser sintetizado utilizando reações de proteção e desproteção (por exemplo, pode referir-se a grupos protetores em Organic Synthesis, terceira edição, publicada por John Wiley & Sons, 1999), reação de oxidação, reação de redução, reação de condensação (reação de oxidação, reação de redução e reação de condensação pode ser referida, por exemplo, Comprehensive Organic Transformations, Second Edition, escrito por RC Larock, Wiley-VCH, 1999 e similares) e similares em combinação, que são conhecidos pelos versados na técnica, a partir de materiais de partida, por exemplo, um aminoácido, um ácido carboxílico, um composto diol e similares. Quando um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica tem um grupo funcional (por exemplo, um grupo amino, um grupo hidroxila ou um grupo tiol) diferente dos dois grupos hi
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227/259 droxila mencionados acima, pode ser eficientemente prolongado protegendo-os com um grupo protetor (por exemplo, pode referir-se a Protective Groups in Organic Synthesis, Terceira Edição, John Wiley & Sons, INC., 1999) bem conhecido pelos versados na técnica. Adicionalmente, os documentos WO 2012/017919, WO 2013/103146, WO 2013/133221, WO 2015/099187, WO 2016/104775 e similares podem ser referidos para a síntese de um oligonucleotídeo tendo um grupo de ligação que contém uma estrutura não nudeotídica.
[001234] Além disso, após sintetizar dois oligonucleotídeos separadamente, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nudeotídica é ligado para sintetizar um oligonucleotídeo de fita simples. Um exemplo do método de síntese é mostrado abaixo. Uma estrutura parcial tendo um grupo funcional, como um grupo amino, está ligada à extremidade 5’ do oligonudeotídeo tendo a extremidade 3’ do oligonudeotídeo de fita simples por um método conhecido pelos versados na técnica (por exemplo, 6-(trifluoroacetilamino)hexil-[(2-cianoetil)-(N,N-dl·isopropil)]-fosforamidito ou similar utilizado, e uma estrutura parcial tendo um grupo funcional conforme um grupo amino está ligado à extremidade 3’ do oligonudeotídeo que tem a extremidade 5’ do oligonucleotídeo de fita simples através de um método conhecido pelos versados na técnica (por exemplo, 2-((4,4’-dimetoxitritii)metil)-6fluorenilmetoxicarbonilamino-hexano-succinoil-alquilamino de fita longa-CPG (GLEN RESEARCH, número do produto: 20-2958) e similares são utilizados). Dois grupos funcionais trazidos pelo grupo de ligação que contém uma estrutura não nudeotídica são convertidos em um grupo funcional desejado que reage com o grupo amino mencionado acima e simlares, pelo que dois oligonucleotídeos podem ser ligados. Por exemplo, após a conversão de dois grupos funcionais trazidos pelo grupo de ligação que contém uma estrutura não nudeotídica em um ácido carboxílico, um éster, um éster ativo (N-hidroxissuccinimidação e
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228/259 similares), um cloreto de ácido, um diéster de ácido carboxílico ativado (diéster de ácido carboxílico 4-nitrofenilado e similares), isocianato e similares, e estes podem ser ligados pela reação sob condições de Ncarbonilaçâo conhecidas. As condições de N-carbonilação mencionadas acima podem ser referidas, por exemplo, {Comprehensive Organic Transformations Second Edition, 1999, John Wiley & Sons, INC.} e similares. Os versados na técnica podem proteger um dos dois grupos funcionais mencionados acima, se necessário, e um oligonucleotídeo ligado a um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica e depois desprotegido, após isso outro oligonucleotídeo pode ser ligado de forma similar a um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
[001235] Sâo conhecidos na técnica numerosos métodos para ligar moléculas funcionais ao oligonucleotídeo, e exemplos dos mesmos podem ser referidos, por exemplo, no European Journal of Pharmaceuticals and Biopharmaceutics, Vol. 107, pp. 321-340 (2016), Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 104, pp. 78-92 (2016), ou Expert Opinion on Drug Delivery, Vol. 11, pp. 791-822 (2014). Por exemplo, após ligação de uma molécula funcional e um ligante de acordo com um método conhecido, o material resultante é derivado de um amidito com um reagente de amiditação ou derivado de uma forma de H-fosfonato com um reagente de H-fosfonato seguido de ligação ao oligonucleotídeo.
[001236] Um oligonucleotídeo de fita simples pode ser preparado por purificação do oligonucleotídeo resultante por cromatografia em coluna em fase reversa e similares. Um oligonucleotídeo de fita simples que se hibridizou dentro de uma molécula do mesmo pode ser preparado pela mistura do oligonucleotídeo de fita simples preparado em uma solução tampão adequada e desnaturação durante vários minutos (como 5 minutos) de 90°C a 98°C seguido de hibridização ao longo de
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229/259 a 8 horas de 30°C a 70°C. Há casos em que a etapa de hibrldização intramolecular pode ser omitida.
[001237] O oligonucleotídeo de fita simples é capaz de controlar eficazmente a expressão de um gene alvo. Dessa forma, a presente invenção é capaz de fornecer uma composição contendo o oligonucleotídeo de fita simples como um ingrediente ativo da mesma para, por exemplo, controlar a expressão de um gene alvo com base em um efeito antissenso. Em particular, uma vez que o oligonucleotídeo de fita simples permite a obtenção de elevada eficácia farmacológica por administração a uma concentração baixa, as composições farmacêuticas para o tratamento, prevenção e melhora de doenças como doenças metabólicas, tumores ou infecções associadas à superexpressão de um gene alvo podem também ser fornecidas em diversas modalidades.
[001238] Uma composição contendo o oligonucleotídeo de fita simples pode ser formulada de acordo com um método conhecido de preparação farmacêutica. Por exemplo, uma composição que contém o oligonucleotídeo de fita simples pode ser utilizada enteralmente (por exemplo, oralmente) ou parenteralmente como cápsula, comprimido, pílula, líquido, pó, grânulo, grânulo fino, preparação revestida por filme, pélete, trocisco, preparação sublingual, preparação mastigável, preparação bucal, pasta, xarope, suspensão, elixir, emulsão, preparação revestida, pomada, emplastro, cataplasms, preparação absorvida transcutaneamente, loção, inalante, aerossol, preparação de injeção ou supositório.
[001239] Estas preparações podem ser adequadamente combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável ou um veículo na forma de um alimento ou bebida, exemplos específicos dos quais incluem água estéril ou solução salina fisiológica, óleo vegetal, solvente, base, emulsificante, agente de suspensão, tensoativo, ajustador de pH, es
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230/259 tabilizador, agente aromatizante, fragrância, excipiente, veículo, conservante, aglutinante, diluente, agente isotônico, analgésico, carga, agente de desintegração, tampão, agente de revestimento, lubrificante, corante, edulcorante, agentes espessantes, corretivo, solubilizante e outros aditivos.
[001240] Não existem limitações particulares na forma de administração da composição contendo o oligonucleotídeo de fita simples, e os exemplos das mesmas incluem administração enteral (oral e similares) e parenteral. Com mais preferência, exemplos de formas de administração incluem administração intravenosa, administração intraarterial, administração intraperitoneal, administração subcutânea, administração intradérmica, administração intratraqueal, administração retal, administração intramuscular, administração intratecal, administração intraventricular, administração transnasal e administração intravítrea, e administração por infusão.
[001241] Não existem limitações particulares na doença capaz de ser tratadas, prevenidas ou melhoradas utilizando o oligonucleotídeo de fita simples, e exemplos incluem doenças metabólicas, doenças do aparelho circulatório, tumores, infecções, doenças oftálmicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças raras hereditárias e doenças causadas pela expressão de um gene. Exemplos específicos incluem hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, atrofia muscular espinhal, distrofia muscular (como distrofia muscular de Duchenne, distrofia miotônica, distrofia muscular congênita (como distrofia muscular congênita tipo Fukuyama, distrofia muscular congênita tipo Ullrich, distrofia muscular congênita e deficiente em merosina, deficiência de integrina ou síndrome de Walker Warburg), distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de cinturas, distrofia muscular de Miyoshi ou distrofia muscular facioescapuloumeral), doença de Huntington, doença de Alzheimer, amiloldose por transtirretina, cardiomlopatia amiloide famili
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231/259 ar, esclerose múltipla, doença de Crohn, doença inflamatória intestinal, acromegalia, diabetes tipo 2, nefropatia crônica, infecção pelo vírus RS, febre hemorrágica Ebola, vírus Marburg, HIV, gripe, hepatite B, hepatite C, cirrose, insuficiência cardíaca crônica, fibrose miocárdica, fibrilação atrial, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, câncer pancreático, câncer colorretal, carcinoma das células renais, colangiocarcinoma, câncer do colo do útero, câncer do fígado, câncer do pulmão, leucemia, linfoma não Hodgkin, dermatite atópica, glaucoma e degeneração macular relacionada à idade. O gene que causa a doença mencionada acima pode ser estabelecido para o gene alvo mencionado acima correspondente ao tipo da doença, e a sequência de controle da expressão mencionada acima (como uma sequência antissenso) pode ser adequadamente ajustada correspondendo à sequência do gene alvo mencionado acima.
[001242] Além de primatas como seres humanos, uma variedade de outras doenças de mamíferos pode ser tratada, prevenida, melhorada por composições compreendendo oligonucleotídeos de fita simples. Por exemplo, embora não se limitem a isso, várias doenças de espécies de mamíferos, incluindo vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cães, gatos, porquinhos-da~índia e outros bovinos, ovinos, equinos, caninos, felinos e espécies de roedores como camundongos podem ser tratadas. Adicionalmente, uma composição contendo o oligonudeotídeo de fita simples pode também ser aplicada a outras espécies como aves (como galinhas).
[001243] Quando uma composição contendo um oligonudeotídeo de fita simples é administrada ou alimentada a animais incluindo seres humanos, a dose de administração ou a quantidade ingerida da mesma pode ser adequadamente selecionada dependendo da idade, peso corporal, sintomas ou estado de saúde do indivíduo ou do tipo da composição (produtos farmacêuticos, alimentos e bebidas) e similares,
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232/259 e a dose de administração ou quantidade ingerida é, de preferência, 0,0001 mg/kg/dia a 100 mg/kg/dia conforme a quantidade do oligonucleotide© de fita simples.
[001244] O oligonucleotídeo de fita simples é capaz de controlar a expressão de urn gene alvo de forma extremamente eficaz. Dessa forma, um método para controlar a expressão de um gene alvo por um efeito antissenso pode ser fornecido pela administração do oligonucleotídeo de fita simples a animais, incluindo seres humanos. Além disso, um método para tratar, prevenir ou melhorar vários tipos de doenças associadas à superexpressão de um gene alvo pode também ser fornecido, incluindo o fornecimento de uma composição contendo o oligonucleotide© de fita simples a animais, incluindo seres humanos. EXEMPLOS [001245] Embora o que se segue forneça uma explicação mais detalhada da presente invenção com base nos Exemplos e Exemplos Comparativos, as modalidades da presente invenção não estão limitadas aos Exemplos seguintes.
[001246] Nos Exemplos, RMN refere-se ao espectro de ressonância magnética nuclear, e MS refere-se ao espectro de massa. Quando os dados de 1H-RMN encontram-se descritos, que é medido em 300 MHz (JNM-ECP300; fabricado por JEOL Ltd., ou JNM-ECX300; fabricado por JEOL Ltd.), e um deslocamento químico õ (unidade: ppm) (padrão split, valor integral) do sinal usando tetrametilsilano como padrão interno é mostrado. S refere-se a singleto, d dupleto, T triplet©, m multipleto, brs singleto amplo, e CDCh deuteroclorofórmio.
[001247] Quando os dados de 31P-RMN são descritos, os deslocamentos químicos õ (unidade: ppm) dos sinais medidos por JNMECX300; fabricado pela JEOL Ltd. (JEOL) estão representados.
[001248] Na medição de MS usando a medição MALDI-TOF-MASS, mede-se sob condição dos seguintes.
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233/259 [001249] Dispositivo: Bruker ultrafleXtreme [001250] Matriz: Solução saturada de acetonitrila - ácido 3-hidroxipl·colínico contendo 10 mg/ml de hidrogenocitrato de diamônio [001251] Placa alvo: Placa alvo MTP 384 aço polido BC [001252] Modo de medição: Linear + cátion [001253] Para purificação com cromatografia em coluna de silica gel, foi utilizada coluna Hi-Flash fabricada por Yamazen Corporation, a menos que indicado de outra forma.
[001254] Exemplos (Exemplos 1 a 2 e Exemplos Comparativos 1 a 3) [001255] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 1 foram preparados utilizando o Sintetlzador Automático de Ácidos Nucléicos nS-8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é o Homólogo da Fosfatase e Tensina Deletado no Cromossomo 10 (PTEN) humano. A propósito, nas notações de sequência mostradas na Tabela 1, (L) refere-se ao LNA, (M) refere-se ao 2’-O-metil nucleotideo, alfabetos em letras minúsculas referem-se ao desoxirribonucleotídeo, alfabetos em letras malúsculas (exceto para os alfabetos mencionados acima, ligados com (L) e (M), e S) referem-se ao ribonucleotídeo, G refere-se a uma ligação fosforotioato, 5indica que a base desse nucleotideo é 5-metilcitoslna, [001256] ”S(1) indica que um grupo no qual um átomo de hidrogênio é removido dos respectivos dois grupos hidroxila do trietilenoglicol, cada um forma uma ligação fosfodiéster, e o grupo liga-se aos nucleotideos do lado direito e esquerdo, e S(2) indica que um grupo no qual um átomo de hidrogênio é removido dos respectivos dois grupos hidroxila do 1,12-dodecanodiol cada um forma uma ligação fosfodiéster, e o grupo liga-se aos nucleotideos do lado direito e esquerdo.
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Tabela 1
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5’ e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo 1 (SEQ ID NO: 1) AiMl'WrGOCACUGCiJAAQ Sfl,'S(ÜWY»YeVíYgY«“5e.m) Bases 1-14: Y S(1): L Bases 15-28: X
Exemplo 2 (SEQ ID NO: 2) AíM}'<3>3nR*SCCAGU<3CUAAG SCZ> «UYfDYíYeVtYiíYYSíDYrU Bases 1-14: Y S(2): L Bases 15-28: X
Exemplo Comparativo 1 5 (U T( LA YgcVc (D Tí L)
(SEQ ID NO: 3,4)
Exemplo Comparativo 2 (SEQ ID NO: 5)
Exemplo Comparativo 3 (SEQ ID NO: 6) δ QL)T( O T»“ gWc-T gVc ‘5 (L/T tt)
[001257] Hibridização intramolecular nos Exemplos 1 a 2 e no Exemplo Comparativo 2 e hibridização intermolecular entre dois oligonucleotídeos no Exemplo Comparativo 1 foram realizadas por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamída não desnaturante.
Exemplo de Avaliação 1 [001258] As células de linhagens de células derivadas de hepatoma humano HuH-7 foram semeadas em uma placa de 96 poços de modo a ser 3.000 células/poço, e cultivadas a 37 °C sob 5% de CO 2 durante 24 horas. Cada oligonucleotídeo na Tabela 1 foi adicionado a cada poço utilizando Lipofectamina ® RNAiMax (fabricada por Thermo Fisher Scientific) tal que a concentração final era a concentração definida (transfecção). Após 4 horas, 0 meio foi mudado e, após 20 horas adicionais, as células foram coletadas e 0 RNA total foi extraído das células utilizando 0 kit RNeasy mini (fabricado pela QIAGEN).
[001259] Foi obtido DNAc a partir do RNA total utilizando PrimeScript RT Master Mix (fabricado pela Takara Bio Inc.). Usando 0 cDNA e
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TaqMann Gene Expression ID obtidos (fabricado pela Applied Biosystems), PCR em tempo real foi realizada pelo 7500 Real-Time PCR System (fabricado pela Applied Biosystems) para determinar a quantidade de mRNA de PTEN. Na PCR em tempo real, a quantidade de mRNA de urn gene de manutenção GAPDH (GHceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase) também foi determinada simultaneamente, e a quantidade de mRNA de PTEN relativa à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de PTEN. Células não submetidas ao procedimento de transfecção foram usadas como controle. Os resultados são mostrados na Figura 18.
[001260] A propósito, os iniciadores usados foram o Ensaio de Expressão de Genes TaqMan (fabricado pela Applied Biosystems), e o ID do ensaio foi o seguinte:
[001261] Ensaio de PTEN humano: Hs02621230 [001262] Ensaio de GAPDH humano: Hs99999905jm1 [001263] Como é claro da Figura 18, os oligonucleotídeos de fita simples (Exemplos 1 a 2), de acordo com a presente invenção, foram confirmados para demonstrar um efeito antissenso elevado em comparação com HDO (Exemplo Comparativo 1), o oligonucleotídeo de fita simples não tendo grupo de ligação que contenha um estrutura nucleotidica (Exemplo Comparativo 2) e ASO (Exemplo Comparativo 3). Além disso, o oligonucleotídeo de fita simples não tendo qualquer grupo de ligação que contenha uma estrutura não nucleotidica (Exemplo Comparativo 2) foi também confirmado para demonstrar um efeito antissenso mais elevado em comparação com HDO (Exemplo Comparativo 1).
Exemplo 3 e Exemplo Comparativo 2 [001264] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 2 foram preparados utilizando o Sintetizador Automático de Ácidos Nucleicos nS-8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é o Homólogo da Fosfatase
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236/259 e Tensina Deletado no Cromossomo 10 (PTEN) humano. A propósito, nas notações de sequência mostradas na Tabeia 2, S(3) indica que um grupo no qual um átomo de hidrogênio é removido dos respectivos dois grupos hidroxila de hexaetilenoglicol, cada um forma uma ligação fosfodiéster, e o grupo se liga aos nucleotídeos no lado direito e esquerdo, e as outras notações de sequência são as mesmas da Tabela 1.
Tabela 2
Sequência (o lado esquerdo representa o iado 5’ e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo 3 (SEQ ID NO: 7) ACMHXMrCBXASUQCUAAG «3} ãíUTtDT»'» cVoY«Vc'5(D~KÜ Bases 1-14: Y S(3): L Bases 15-28: X
Exempio Comparativo 2 (SEQ ID NO: 5) AiMlYiMi'QCCASiJGClJAAaWViSiLrrtC'fcYc VcYsftWW
[001265] Hibridização intramolecular no Exemplo 3 e no Exemplo Comparativo 2 foi realizada por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante.
Exemplo de Avaliação 2 [001266] Utilizando o mesmo método de avaliação que no Exemplo de Avaliação 1, a concentração final de cada oligonucleotídeo na Tabela 2 foi feita a 0,1 nM, 1 nM ou 10 nM, e a quantidade de mRNA de PTEN em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de PTEN. Células não submetidas ao procedimento de transfecção foram usadas como controle. Os resultados são mostrados na Figura 19.
[001267] Como é claro da Figura 19, o oligonucleotídeo de fita simples (Exemplo 3), de acordo com a presente invenção, foi confirmado demonstrar um efeito antissenso elevado em comparação com o oligonucleotídeo de fita simples não tendo nenhum grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica (Exemplo Comparativo 2).
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Exemplos Comparativos 4 e 5 [001268] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 3 foram preparados utilizando o Sintetizador Automático de Ácidos Nucléicos nS~8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é o Homólogo da Fosfatase e Tensina Deletado no Cromossomo 10 (PTEN) humano e a apolipoproteína B (ApoB) humana. A propósito, as notações de sequência na Tabela 3 são as mesmas da Tabela 1.
Tabela 3
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5’ e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo Comparativo 4 (SEQ ID NO: 8,9)
G( ü'S(ü VtTrYTs Trtíü ‘lTãí □
Exemplo Comparativo 5 (SEQ ID NO: 10) Bases 1-13: Y Alvo ApoB Bases 31-44: Alvo PTEN
[001269] Hibridização intramoiecular no Exemplo Comparativo 5 e hibridização intermolecular entre dois oligonucleotídeos no Exemplo Comparativo 4 foram realizadas por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante.
Exemplo de Avaliação de Referência 1 [001270] Utilizando o mesmo método de avaliação que no Exemplo de Avaliação 1, a concentração final de cada oligonucleotídeo na Tabela 3 foi feita a 1 nM ou 10 nM, e a quantidade de mRNA de PTEN em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de PTEN. De modo semelhante ao PTEN, a quantidade de mRNA de ApoB em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de ApoB. Células não submetidas ao procedimento de transfecção foram usadas como controle. Os resultados são mostrados na Figura 20 e da Figura 21.
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238/259 [001271] A propósito, o iniciador usado foi o Ensaio de Expressão de Genes TaqMan (fabricado pela Applied Biosystems), e o ID do ensaio foi o seguinte:
[001272] Ensaio de PTEN humano: Hs02621230 [001273] Ensaio de ApoB humana: Hs00181142 [001274] Ensaio de GAPDH humano: Hs99999905_m1 [001275] Como é claro da Figura 20 e da Figura 21, o oligonucleotídeo de fita simples (Exemplo Comparativo 5) não tendo nenhum grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica foi confirmado como tendo um efeito antissenso superior ao de HDO (Exemplo Comparativo 4).
[001276] Exemplos 4 e 5 e Exemplos Comparativos 3, 5 e 6 [001277] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 4 foram preparados utilizando o Sintetlzador Automático de Ácidos Nucleicos nS-8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é o Homólogo da Fosfatase e Tensina Deletado no Cromossomo 10 (PTEN) humano e a apolipoproteína B (ApoB) humana. A propósito, as notações de sequência na
Tabela 4 são as mesmas da Tabela 1.
Tabela 4
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5’ e o lado direito representa o lado 3 j Observações
Exemplo 4 (SEQ ID NO: 11) Bases 1-13: X Alvo ApoB S(3): L Bases 14-26: Y Bases 27-40: Yz Alvo PTEN
Exemplo 5 (SEQ ID NO: 12) Bases 1-13: X Alvo ApoB Bases 14-17: L Bases 18-30: Y S(1): Ly Bases 31-40: Yz Alvo PTEN
Exemplo Comparativo 5 (SEQ ID NO: 10) Bases 1-13: Alvo ApoB Bases 31-44: Alvo PTEN
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Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5' e o lado direito representa o lado 3') Observações
Exemplo Comparativo 3 (SEQ ID NO: 7)
Exemplo Comparativo 6 (SEQ ID NO: 13)
[001278] Hibridização intramolecular nos Exemplos 4 e 5 e no Exemplo Comparativo 5 foram realizadas por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante.
Exemplo de Avaliação 3 [001279] Utilizando o mesmo método de avaliação que no Exemplo de Avaliação 1, a concentração final de cada oligonucleotídeo na Tabela 4 foi feita a 1 nM ou 10 nM, e a quantidade de mRNA de PTEN em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de PTEN. De modo semelhante ao PTEN, a quantidade de mRNA de ApoB em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de ApoB. Células não submetidas ao procedimento de transfecção foram usadas como controle. Os resultados são mostrados na Figura 22 e da Figura 23.
[001280] Como é claro da Figura 22 e da Figura 23, os oligonucleotídeos de fita simples (Exemplos 4 e 5), de acordo com a presente invenção, foram confirmados para demonstrar um efeito antissenso elevado em comparação com o oligonucleotídeo de fita simples não tendo grupo de ligação que contenha um estrutura nucleotídica (Exemplo Comparativo 5) e ASO (Exemplos Comparativos 3 e 6).
Exemplo 6 e Exemplo Comparativo 5 [001281] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 5 foram preparados utilizando o Sintetizador Automático de Ácidos Nucléicos nS-8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é o Homólogo da Fosfatase
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240/259 e Tensina Deletado no Cromossomo 10 (PTEN) humano e a apolipoproteína B (ApoB) humana. A propósito, as notações de sequência na Tabela 5 são as mesmas da Tabela 1 e da Tabela 2.
Tabela 5
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5' e o lado direito representa o lado 3') Observações
Exemplo 6 (SEQ ID NO: 14) SÚJ UíSAAUAGCAWOC XC· Bases 1-13: X Alvo ApoB S(3): L Bases 14-26: Y S(1): Ly Bases 27-40: Yz Alvo PTEN
Exemplo Comparativo 5 (SEQ ID NO: 10) Bases 1-13: Alvo ApoB Bases 31-44: Alvo PTEN
[001282] Hibridização intramolecular no Exemplo 6 e no Exemplo Comparativo 5 foi realizada por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante.
Exemplo de Avaliação 4 [001283] Utilizando o mesmo método de avaliação que no Exemplo de Avaliação 1, a concentração final de cada oligonucleotídeo na Tabela 5 foi feita a 0,1 nM, 1 nM ou 10 nM, e a quantidade de mRNA de PTEN em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de PTEN. De modo semelhante ao PTEN, a quantidade de mRNA de ApoB em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de ApoB. Células não submetidas ao procedimento de transfecção foram usadas como controle. Os resultados são mostrados na Figura 24 e da Figura 25.
[001284] Como é claro da Figura 24 e da Figura 25, o oligonucleotídeo de fita simples (Exemplo 6), de acordo com a presente invenção,
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241/259 foi confirmado demonstrar o mesmo efeito antissenso ou superior em comparação com o oligonucleotídeo de fita simples que não tem grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica (Exemplo Comparativo 5).
Exemplo de Avaliação 5 [001285] Os resultados da eietroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante antes e depois do tratamento de hibridização intramolecular mencionado acima nos Exemplos 1 a 6 são mostrados nas Figuras 26 a 29. Marcadores de tamanho de DNA de fita simples para eietroforese, fabricados por GeneDesign Inc., foram utilizados como marcadores de tamanho do DNA de fita simples. Este contém DNA de fita simples com uma quantidade de nucleotideos de 15, 20, 30, 40, 50, 60 e 80. Marcadores de tamanho de RNA de fita dupla para eietroforese, fabricados por GeneDesign Inc., foram utilizados como marcadores de tamanho do RNA de fita dupla. Este contém RNA de fita dupla com uma quantidade de pares de bases de 17, 21, 25 e 29. Incidentalmente, nas Figuras 26 a 29, Coluna n° indica o número de colunas no teste de eietroforese mencionado acima, Exemplos n°” indica o número de Exemplos, antes indica os resultados antes do tratamento de hibridização mencionado acima, após indica os resultados após o tratamento de hibridização mencionado acima, marcador de tamanho ss-DNA indica marcadores de tamanho do DNA de fita simples, marcador de tamanho ds~RNA indica marcadores de tamanho do RNA de fita dupla, mer indica o número de bases, e bp indica o número de pares de bases.
[001286] Como é claro das Figuras 26 a 29, foi confirmado que o oligonucleotídeo de fita simples de acordo com a presente invenção adota a estrutura de hibridização intramolecular sem passar através de uma etapa de hibridização especial ou por simples operações de aquecimento e resfriamento.
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242/259
Exemplo 7 e Exemplos Comparativos 6 e 7 [001287] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 6 foram preparados utilizando o Sintetizador Automático de Ácidos Nucleicos nS~8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é a apolipoproteína B de camundongo (ApoB). Toc-TEG- de notações de sequência na Tabela 6 indica que uma porção obtida pela remoção de um átomo de hidrogênio do grupo hidroxila do tocoferol representado pela seguinte fórmula (IV) está ligada a um único átomo de oxigênio do grupo fosfato na extremidade 5’ através de um grupo representado pela seguinte fórmula (III-2):
* (em que, um asterisco (*) representa um sítio de ligação com o segundo oligonudeotídeo, enquanto dois asteriscos (**) representam um sítio de ligação com tocoferol).
Figure BR112019014547A2_D0068
e as outras notações são as mesmas que as da Tabela 1 e Tabela 2.
Tabela 6
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5' e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo 7 (SEQ ID NO: 15) Bases 1-13: Y S(3): L Bases 14-26: X
Exemplo Comparativo 7 (SEQ ID NO: 13, 16) A molécula fundonal está ligada
To© - TEG-G(
Exemplo Comparativo 6 (SEQ ID NO: 13)
[001288] Hibridização intramolecular no Exemplo 7 e hibridização intermolecular entre dois oligonucleotídeos no Exemplo Comparativo 7 foram realizadas por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A
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243/259 híbridização foi confirmada por eletroforese em gel de políacrilamida não desnaturante.
Exemplo de Avaliação 6 [001289] Exemplo 7, Exemplo Comparativo 7 e Exemplo Comparativo 6, cada um dissolvido em solução salina fisiológica (Otsuka Normal Saline, Otsuka Pharmaceutical Factory) foram administrados intravenosamente a camundongos C57BL/6J (machos, cinco semanas de idade, Japan Charles River) para que a dosagem por peso corporal de camundongos fosse de 81 nmol/kg em termos da quantidade do oligonucleotídeo antissenso. A administração somente de solução salina fisiológica (Otsuka Normal Saline, Otsuka Pharmaceutical Factory) foi utilizada como um controle. Após a coleta do sangue do plexo venoso orbital, 3 dias após a administração, o tecido hepático foi removido sob anestesia com isoflurano. A extração de RNA do fígado foi realizada utilizando o kit RNeasy Mini (fabricado pela Qiagen) de acordo com o protocolo recomendado pela Qiagen. O DNAc foi obtido de RNA total utilizando a PrimeScript RT Master Mix (fabricada pela Takara Bio Inc.). A PCR em tempo real foi então realizada com o 7500 Real-Time PCR System (fabricado pela Applied Biosystems) usando o cDNA resultante e TaqMan® Gene Expression ID (fabricado pela Applied Biosystems) para determinar a quantidade de mRNA de ApoB. Durante a PCR em tempo real, a quantidade de mRNA de um gene de manutenção na forma de Ciclofilina foi simultaneamente testada, e a quantidade de mRNA de ApoB em relação à quantidade de mRNA de Ciclofilina foi avaliada como o nível de expressão de ApoB. Os resultados são mostrados na Figura 30.
[001290] A propósito, o iniciador usado foi o Ensaio de Expressão de Genes TaqMan (fabricado pela Applied Biosystems), e o ID do ensaio foi o seguinte:
[001291] Ensaio de ApoB de camundongo: Mm01545150__m1
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244/259 [001292] Ensaio de cidofHina de camundongo: Mm0234230_g1 [001293] Além disso, o sangue coletado foi deixado em repouso por 20 minutos em temperatura ambiente, seguido por separação do plasma por centrifugação por 15 minutos a 5000 rpm e 4°C. Os níveis de colesterol total do plasma foram medidos para cada uma das amostras de plasma utilizando o Determinante L TC (fabricado pela Kyowa Medex). 240 pL de Reagente R-1 foram adicionados a 3,2 pL de plasma seguido de aquecimento por 5 minutos a 37°C e, em seguida, adicionando 80 pL de Reagente R-2 e aquecimento por 5 minutos a 37°C e medir a absorbância a 600 nm usando um espectrofotômetro. Os valores foram então calculados usando uma curva de calibração preparada usando reagentes padrão. Os resultados são mostrados na Figura 31. A propósito, na Figura, o colesterol total refere-se aos níveis de colesterol total mencionados acima do plasma.
[001294] Como é claro da Figura 30 e da Figura 31, os oligonucleotídeos de fita simples (Exemplo 7), de acordo com a presente invenção, foram confirmados para demonstrar um efeito antissenso superior em comparação com HDO (Exemplo Comparativo 7) e ASO (Exemplo Comparativo 6).
Exemplos 8 a 13 e Exemplo Comparativo 2 [001295] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 7 foram preparados utilizando o Sintetizador Automático de Ácidos Nucleicos nS-8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é o Homólogo da Fosfatase e Tensina Deletado no Cromossomo 10 (PTEN) humano. A propósito, nas notações de sequência mostradas na Tabela 7, !iS(4) refere-se à seguinte fórmula (V-1)
Figure BR112019014547A2_D0069
(em que, um asterisco (*) representa um sítio de ligação com o primeiPetição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 280/357
245/259 ro oligonucleotídeo, enquanto dois asteriscos (**) representam um sítio de ligação com o segundo oligonucleotídeo), S(5) refere-se à seguinte fórmula (V-2)
Figure BR112019014547A2_D0070
(em que, um asterisco (*) representa um sítio de ligação com o primeiro oligonucleotídeo, enquanto dois asteriscos (**) representam um sítio de ligação com o segundo oligonucleotídeo), S(6) refere-se à seguinte fórmula (VI-1)
Figure BR112019014547A2_D0071
(em que, um asterisco (*) representa um sítio de ligação com o primeiro oligonucleotídeo, enquanto dois asteriscos (**) representam um sítio de ligação com o segundo oligonucleotídeo), S(7) refere-se à seguinte fórmula (VI-2) o Q
Figure BR112019014547A2_D0072
o o (em que, um asterisco (*) representa um sítio de ligação com o primeiro oligonucleotídeo, enquanto dois asteriscos (**) representam um sítio de ligação com o segundo oligonucleotídeo), S(8) refere-se à seguinte fórmula (VI-3)
Figure BR112019014547A2_D0073
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246/259 (em que, um asterisco (*) representa um sítio de ligação com o primeiro oligonucleotídeo, enquanto dois asteriscos (**) representam um sítio de ligação com o segundo oligonucleotídeo), ,SS(9) refere-se à seguinte fórmula (VI-4)
Figure BR112019014547A2_D0074
(em que, um asterisco (*) representa um sítio de ligação com o primeiro oligonucleotídeo, enquanto dois asteriscos (**) representam um sítio de ligação com o segundo oligonucleotídeo), e as outras notações das sequências são as mesmas que as da Tabela 1.
[001296] Os oligonucleotídeos contendo S(6), S(7), S(8) e S(9) foram sintetizados com referência aos documentos W02012/017919, WO2013/103146 e WO2013/133221.
Tabela 7
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5’ e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo 8 (SEQ ID NO: 17) aGAQs AGCCM&GCüaag s(4> Bases 1-14: Y S(4): L Bases 15-28: X
Exemplo 9 (SEQ ID NO: 18) Bases 1-14: Y S(5): L Bases 15-28: X
Exemplo 10 (SEQ ID NO: 19) G'S J S&T7(UTsTfcWfóV5(0 TTO Bases 1-14: Y S(6): L Bases 15-28: X
Exemplo 11 (SEQ ID NO: 20) AtMttoíMrsCCASUGCUÁAG S'7) StQ'WTaYcVeTgTcW'IXO Bases 1-14: Y S(7): L Bases 15-28: X
Exemplo 12 (SEQ ID NO: 21) S{S) S{.L)T\L)s c 'f'g g Bases 1-14: Y S(8): L Bases 15-28: X
Exemplo 13 (SEQ ID NO: 22) iAtwyoSarGOCASUGCÍWWG S<9) Bases 1-14: Y S(9): L Bases 15-28: X
Exemplo Comparativo 2 (SEQ ID NO: 5)
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247/259 [001297] Hibridizações intramoleculares nos Exemplos 8 a 13 e no Exemplo Comparativo 2 foram realizadas por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante.
Exemplo de Avaliação 7 [001298] Utilizando o mesmo método de avaliação que no Exemplo de Avaliação 1, a concentração final de cada oligonucleotídeo na Tabela 7 foi feita a 1 nM ou 10 nM, e a quantidade de mRNA de PTEN em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de PTEN. Células não submetidas ao procedimento de transfecção foram usadas como controle. Os resultados são mostrados na Figura 32.
[001299] Como é claro da Figura 32, os oligonucleotídeos de fita simples (Exemplos 8 a 13), de acordo com a presente invenção, foram confirmados demonstrar o mesmo efeito antissenso ou superior em comparação com o oligonucleotídeo de fita simples sem qualquer grupo de ligação que contenha uma estrutura não nucleotídica (Exemplo Comparativo 2).
(Exemplo 14 e Exemplos Comparativos 1 a 3) [001300] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 8 foram preparados utilizando o Sintetizador Automático de Ácidos Nucléicos nS-8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é o Homólogo da Fosfatase e Tensina Deletado no Cromossomo 10 (PTEN) humano. A propósito, nas notações de sequência mostradas na Tabela 8, S(10) refere-se à seguinte fórmula (VI-5)
Figure BR112019014547A2_D0075
(em que, um asterisco (*) representa um sítio de ligação com o primeí
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248/259 ro oligonucleotídeo, enquanto dois asteriscos (**) representam um sítio de ligação com o segundo oligonucleotídeo), e as outras notações das sequências são as mesmas que as da Tabela 1.
Tabela 8
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5' e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo 14 (SEQ ID NO: 23) WrW'GCCAGUGCOAAS 3(18! WTfUnTgVe'cT«¥«W*W Bases 1-14: Y S(10): L Bases 15-28: X
Exemplo Comparativo 1 (SEQ ID NO: 4,5) Wife·*5ίϋΤ(Ο
Exemplo Comparativo 2 (SEQ ID NO: 6) AifeS) 'SÍ Ml ‘GCCAOUíSC UAAGAAAA50J “T(L) Ya*g*e 'a V TsY'e 1« OTiÜ Bases 1-14: Y Bases 15-18: L Bases 19-32: X
Exemplo Comparativo 3 (SEQ ID NO: 7) SCUUiOYaVoVYtYgY'SiU'TiU
[001301] Hibridizações intramoleculares no Exemplo 14 e nos Exemplos Comparativos 1 e 2 foram realizadas por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridlzação foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante.
Exemplo de Avaliação 8 [001302] Utilizando o mesmo método de avaliação que no Exemplo de Avaliação 1, a concentração final de cada oligonucleotídeo na Tabela 8 foi feita a 1 nM, e a quantidade de mRNA de PTEN em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de PTEN. Células não submetidas ao procedimento de transfecção foram usadas como controle. Os resultados são mostrados na Figura 33.
[001303] Como é claro da Figura 33, os oligonucleotídeos de fita simples (Exemplo 14), de acordo com a presente invenção, foram confirmados para demonstrar um efeito antissenso superior em comparação com HDO (Exemplo Comparativo 1), o oligonucleotídeo de fita simples não tendo grupo de ligação que contenha um estrutura nucleo
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249/259 tídica (Exemplo Comparativo 2) e ASO (Exemplo Comparativo 3).
Exemplo 15, Exemplos Comparativos 8 a 10 [001304] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 9 foram preparados utilizando o Sintetizador Automático de Ácidos Nucléicos nS-8ll (fabricado pela GeneDesIgn). O RNA alvo é o miRNA-122 humano. A propósito, as notações de sequência na Tabela 9 são as mesmas da Tabela 1 e da Tabela 2.
Tabela 9
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5’ e o lado direito representa o lado 3') Observações
Exemplo 15 (SEQ ID NO: 24) Bases 1-15: Y S(3): L Bases 16-30: X
Exemplo Comparativo 8 (SEQ ID NO: 25)
Exemplo Comparativo 9 (SEQ ID NO: 26) Bases 1-15: Y Bases 16-19: L Bases 20-34: X
Exemplo Comparativo 10 (SEQ ID NO: 25, 27) XO WtXüVttè'o WftWWHJ
[001305] Hibridização intramolecular no Exemplo 15 e Exemplo Comparativo 9 e hibridização intermolecular no Exemplo Comparativo 10 foram realizadas por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrllamida não desnaturante.
Exemplo de Avaliação 9 [001306] As células de linhagens de células derivadas de hepatoma humano HuH~7 foram semeadas em uma placa de 96 poços de modo a ser 3.000 células/poço, e cultivadas a 37 °C sob 5% de CO 2 durante 24 horas. Cada oligonucleotídeo na Tabela 9 foi adicionado a cada poço utilizando Lipofectamina® RNAiMax (fabricada por Thermo Fisher Scientific) tal que a concentração final era de 1 nM (transfecção). Após
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250/259 dias, as células foram recuperadas e o RNA Total foi extraído das células utilizando o kit RNeasy mini (fabricado pela QIAGEN).
[001307] Foi obtido DNAc a partir do RNA total utilizando PrimeScript RT Master Mix (fabricado pela Takara Bio Inc.). Usando o cDNA obtido e TaqMan® Gene Expression ID (fabricado pela Applied Biosystems), PCR em tempo real foi realizada pelo 7500 Real-Time PCR System (fabricado pela Applied Biosystems) para determinar a quantidade de mRNA de Aldolase A, que é o gene alvo do miRNA-122. Na PCR em tempo real, a quantidade de mRNA de um gene de manutenção GAPDH (Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase) também foi determinada simultaneamente. A quantidade de mRNA de Aldolase A em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão da Aldolase A. As células não submetidas ao procedimento de transfecção foram utilizadas como controle. Os resultados são mostrados na Figura 34. Nesse momento, um nível de expressão mais alto de Aldolase A indica um efeito antissenso superior.
[001308] A propósito, o iniciador usado foi o Ensaio de Expressão de Genes TaqMan (fabricado pela Applied Biosystems), e o ID do ensaio foi o seguinte:
[001309] Ensaio de Aldolase A Humana: Hs00605108jg 1 [001310] Ensaio de GAPDH humano: Hs99999905__m1 [001311] Como é claro da Figura 34, os oligonucleotídeos de fita simples (Exemplo 15), de acordo com a presente invenção, foram confirmados para demonstrar um efeito antissenso superior em comparação com HDO (Exemplo Comparativo 10), o oligonucleotídeo de fita simples não tendo grupo de ligação que contenha um estrutura núcleotídica (Exemplo Comparativo 9) e ASO (Exemplo Comparativo 8). [001312] Exemplos 7 e 16 e Exemplos Comparativos 7 e 11 [001313] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 10 foram preparados utilizando o Sintetizador Automático de Ácidos Nucléicos nS~8H
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251/259 (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é a apolipoproteína B de camundongo (ApoB). As notações de sequência na Tabela 10 são as mesmas da Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 6.
Tabela 10
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5' e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo 7 (SEQ ID NO: 15) Tw-reG-WraMS'W'AUACCAMieC SÍS) «'«VeVW'XUW Bases 1-13: Y S(3): L Bases 14-26: X
Exemplo 16 (SEQ ID NO: 28) T<wí-TEe-»QAM««CASJGG M3) «LTKOVtYeYtVtWMTW Bases 1-13: Y S(3): L Bases 14-26: X
Exemplo Comparativo 7 (SEQ ID NO: 13, 16) A molécula fundonal está ligada
Toe. - TE GHXM) WMO ACÕAÀÚWrOM
Exemplo Comparativo 11 (SEQ ID NO: 13, 29) GÉÜYtOVtYgVYsYI&rsCLVXÜ A molécula funcional está ligada
Toc-'TEG“ÜGAAUACG,AAUGC
[001314] Hibridização intramolecular nos Exemplos 7 e 16 e hibridização intermolecular entre dois oligonucleotídeos nos Exemplos Comparativos 7 e 11 foram realizadas por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante.
[001315] Exemplo de Avaliação 10 [001316] O mesmo método de avaliação do Exemplo de Avaliação 6 foi usado. Cada oligonucleotídeo na Tabela 10 foi administrado por via intravenosa de modo a que a dosagem por peso corporal do camundongo fosse 8,1 nmol/kg ou 81 nmol/kg em termos da quantidade dos oligonucleotídeos antissenso. A administração somente de solução salina fisiológica (Otsuka Normal Saline, Otsuka Pharmaceutical Factory) foi utilizada como um controle. A quantidade de mRNA de ApoB em relação à quantidade de mRNA de ciclofilina no tecido do fígado três dias após a administração foi avaliada como o nível de expressão de ApoB. Além disso, o nível de colesterol total no plasma foi determinado usando o sangue coletado. Os resultados são mostrados na Fi
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252/259 gura 35 e da Figura 36.
[001317] Como é claro da Figura 35 e da Figura 36, os oligonucleotl·deos de fita simples (Exemplos 7 e 16), de acordo com a presente invenção, foram confirmados demonstrar um efeito antissenso superior em comparação com HDO (Exemplos Comparativos 7 e 11).
Exemplos Comparativos 1 a 3 e 12 [001318] Os oligonucleotídeos descritos na Tabela 11 foram preparados utilizando o Sintetizador Automático de Ácidos Nucléicos nS-8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é o Homólogo da Fosfatase e Tensina Deletado no Cromossomo 10 (PTEN) humano. A propósito, as notações de sequência na Tabela 11 são as mesmas da Tabela 1 e da Tabela 2.
[001319] A primeira base foi fosforilada, em seguida o composto do Exemplo Comparativo 12 foi sintetizado por ligação intramolecular utilizando T4 RNA Ligase (fabricada pela Promega) e purificado por um método convencional. A estrutura do composto obtido foi confirmada por MALDI-TOF-MS (valor medido do peso molecular (M-H ) 9885,54). O composto do Exemplo Comparativo 12 tem uma estrutura oligonucleotídlca cíclica.
Tabela 11
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5’ e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo Comparativo 12 (SEQ ID NO: 30) Bases 1-7, Bases 22-28: Y S(3): L Bases 8-21: X (a primeira base e a 28a base estão ligadas)
Exemplo Comparativo 1 (SEQ ID NO: 4,5) aeY gg
Exemplo Comparativo 2 (SEQ ID NO: 6) AiMrã(M)'<S0CACUaCLíAACÁÁ4A3(ÜTfLrtaTc'sc'tr88'45'!.)TÍÍJ Bases 1-14: Y Bases 15-18: L Bases 19-32: X
Exemplo Comparativo 3 (SEQ ID NO: 7) s(L) T(UYYg'e'a'c'5(L)T(L)
[001320] Hibridização intermolecular no Exemplo Comparativo 1 e
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253/259 hibridização intramolecular no Exemplo Comparativo 2 foram realizadas por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante. Exemplo de Avaliação de Referência 2 [001321] Utilizando o mesmo método de avaliação que no Exemplo de Avaliação 1, a concentração final de cada oligonucleotídeo na Tabela 11 foi feita a 1 nM, e a quantidade de mRNA de PTEN em relação à quantidade de mRNA de GAPDH foi avaliada como o nível de expressão de PTEN. Células não submetidas ao procedimento de transfecção foram usadas como controle. Os resultados são mostrados na Figura 37.
[001322] Como é claro da Figura 37, o oligonucleotídeo cíclico contendo uma estrutura não nucleotídica (Exemplo Comparativo 12) demonstrou ter um efeito antissenso baixo.
Exemplo 17 e Exemplo Comparativo 13
Exemplo de Síntese 1
Síntese do Composto 4
Figure BR112019014547A2_D0076
Figure BR112019014547A2_D0077
Síntese do Composto 3 [001323] O Composto 1 (sintetizado de acordo com o método des
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254/259 crito na Publicação Internacional n° WO 03/039461) (1,0 g, 1,8 mmol) foi dissolvido em acetonitrile (16 ml) e diclorometano (7 ml). À solução foram adicionados Ν,Ν-dHSopropiletilamina (1,3 mL, 7,3 mmol) e trifluoroacetato de pentafluorofenila (946 mL, 5,5 mmol) e a mistura foi reagida durante 20 minutos a 25°C. Após a reação, o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida, foi adicionado acetato de etila e a camada orgânica foi lavada com uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, nesta ordem. A camada orgânica foi recuperada e o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. O resíduo obtido foi dissolvido em acetonitrila (16 ml) e diclorometano (7,0 ml). À solução foram adicionados o Composto 2 (sintetizado de acordo com o método descrito em Nucleic Acid Research, No. 42, p. 8796 (2014)) (614 mg, 1,5 mmol) e N,N-di~isopropiletilamina (650, 3,7 mmol) e a mistura foi reagida durante 40 minutos a 25°C. Após a reação, o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia em coluna de silica gel (eluente: acetato de etilahexano) para obter o Composto 3 (754 mg, rendimento: 55%).
[001324] 1H RMN (CDCh, 300 MHz): δ 0,84-0,89 (12H, m), 1,05-2,00 (34H, m), 2,08 (3H, s), 2,11 (3H, s), 2,15 (3H, s), 2,19-2,40 (2H, m), 2,57 (2H, t), 3,15-3,77 (7H, m), 3,78 (6H, s), 4,10-4,70 (2H, m), 6,796,84 (4H, m), 7,21-7,38 (9H, m).
Síntese do Composto 4 [001325] O composto 3 (750 mg, 0,8 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (4,0 mL) e diclorometano (2,0 mL). À solução foram adicionados N,N-di-isopropilamina (144 pL, 1,0 mmol), 1H-tetrazol (73 mg, 1,0 mmol) e 2-cianoetil-di-isopropilclorofosforoamidita (404 pL, 1,3 mmol), e a mistura foi reagida por 5 horas à temperatura ambiente. Após a reação, adlcionou-se uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio à mistura e a mistura resultante foi extraída com clorofór
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255/259 mio. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e o solvente foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia em coluna de silica gel (eluente: acetato de etilahexano) para obter o Composto 4 (524 mg, rendimento: 58%). [001326] 31P RMN (CDCh, 202 MHz): õ 148,0, 148,3, 148,5, 148,8. [001327] O oligonucleotídeo descrito na Tabela 12 foi preparado utilizando o Sintetizador Automático de Ácido Nucleico nS-8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é a apolipoproteína B de camundongo (ApoB). A propósito, nas notações de sequência mostradas na Tabela 12, S(11) refere-se à seguinte fórmula (VI-5)
Figure BR112019014547A2_D0078
o [001328] (em que, um asterisco (*) representa um sítio de ligação com o primeiro oligonucleotídeo, enquanto dois asteriscos (**) representam um sítio de ligação com o segundo oligonucleotídeo), e as ou tras notações das sequências são as mesmas que as da Tabela 1 e da
Tabela 6.
Tabela 12
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5’ e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo 17 (SEQ ID NO: 31) U(M)'<XIS»XM}'M)ACCAAliCCAS(in /^.0(1)^(1.///4^//47-.44/1./5(1.)^1.) Bases 1-13' Y 14.. S(111. 15- -6:1. A molécula funcional está ligada Bases 17-29: X
Exemplo Comparativo 13 (SEQ ID NO: 32) Toc-T£G-U(M'40(M)>.(MrAUACCAAUa-WWsG(L)4(L)44ís4-'tVt4(L)'5ÍL)'A(L)
[001329] Hibridização intramolecular no Exemplo 17 e no Exemplo Comparativo 13 foi realizada por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante.
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Exemplo de Avaliação 11 [001330] O mesmo método de avaliação do Exemplo de Avaliação 6 foi usado. Cada oligonucleotídeo na Tabela 12 foi administrado por via intravenosa de modo a que a dosagem por peso corporal do camundongo fosse 8,1 nmol/kg ou 81 nmol/kg em termos da quantidade dos oligonucleotideos antissenso. A administração somente de solução salina fisiológica (Otsuka Normal Saline, Otsuka Pharmaceutical Factory) foi utilizada como um controle. A quantidade de mRNA de ApoB em relação à quantidade de mRNA de ciclofilina no tecido do fígado três dias após a administração foi avaliada como o nível de expressão de ApoB. Além disso, o nível de colesterol total no plasma foi determinado usando o sangue coletado. Os resultados são mostrados na Figura 38 e da Figura 39.
[001331] Como é claro da Figura 38 e da Figura 39, o oligonucleotídeo de fita simples (Exemplo 17), de acordo com a presente invenção, foi confirmado para demonstrar o mesmo efeito antissenso ou superior em comparação com o oHgonucleotídeo de fita simples (Exemplo Comparativo 13).
Exemplo 18 e Exemplos Comparativos 14 e 15 [001332] O oHgonucleotídeo descrito na Tabela 13 foi preparado utilizando o Sintetizador Automático de Ácido Nucleico nS-8ll (fabricado pela GeneDesign). O gene alvo é o receptor Scavenger de camundongo classe B tipo 1 (SRB1). ,!(V)’! das notações de sequência na Tabela 13 referese ao 2’-O-metitoarbamoiletil nucleotídeo (MCE) e as outras notações de sequência são as mesmas que as da Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 6.
Tabela 13
Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5’ e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo 18 (SEQ ID NO: 33) Tec--TEG-AAQGAAQ<tCAUSACvQAAGC SÍ3/ Gt'.O'SiVj'TtV'T-'/i'SCvTiig a c't'TfVj'S'ATSeA'TivrTiV} Bases 1-20: Y Bases 21-40: X
Exemplo Comparativo 14 (SEQ ID NO' 34) <XV)YiV)*T{vrT(V)''5(V)*á'YtYYTf.''a*c't''p:vr5(vr5(VÍ‘'7XV)''T<\0
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Sequência (o lado esquerdo representa o lado 5’ e o lado direito representa o lado 3’) Observações
Exemplo Comparativo 15 (SEQ ID NO: 35)
[001333] Hibridização intramolecular no Exemplo 18 e no Exemplo Comparativo 15 foi realizada por aquecimento durante 5 minutos a 95°C seguido por deixar em repouso por 1 hora a 37°C e uma temperatura normal. A hibridização foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante.
Exemplo de Avaliação 12 [001334] Exemplo 18, Exemplo Comparativo 14 e Exemplo Comparativo 15, cada um dissolvido em solução salina fisiológica (Otsuka Normal Saline, Otsuka Pharmaceutical Factory) foram administrados intravenosamente a camundongos C57BL/6J (machos, 5 semanas de idade, Japan Charles River) de modo que a dosagem por peso corporal de camundongos foi de 0,7 mmol/ kg (Exemplo 18 e Exemplo Comparativo 15) ou 1,4 mmol/kg (Exemplo Comparativo 14) em termos da quantidade do oligonucleotídeo antissenso. A administração somente de solução salina fisiológica (Otsuka Normal Saline, Otsuka Pharmaceutical Factory) foi utilizada como um controle. Três dias após a administração, o tecido hepático foi removido sob anestesia com isoflurano. A extração de RNA do fígado foi realizada utilizando o kit RNeasy Mini (fabricado pela Qiagen) de acordo com o protocolo recomendado pela Qiagen. O DNAc foi obtido de RNA total utilizando a PrimeScript RT Master Mix (fabricada pela Takara Bio Inc.). Utilizando o cDNA obtido e TaqMan® Gene Expression ID (fabricado pela Applied Biosystems), a PCR em tempo real foi realizada pelo 7500 RealTime PCR System (fabricado por Applied Biosystems), foi determinada uma quantidade do mRNA de SRB1. Durante a PCR em tempo real, a quantidade de mRNA de um gene de manutenção na forma de Ciclofilina foi simultaneamente testada, e a quantidade de mRNA de SRB1
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258/259 em relação à quantidade de mRNA de Ciclofilina foi avaliada como o nível de expressão de SRB1. Os resultados são mostrados na Figura 40.
[001335] A propósito, o iniciador usado foi o Ensaio de Expressão de Genes TaqMan (fabricado pela Applied Biosystems), e o ID do ensaio foi o seguinte:
[001336] Ensaio de SRB1 de camundongo: Mm00450234_m1 [001337] Ensaio de ciclofilina de camundongo: Mrn0234230 ..g1 [001338] Como é claro da Figura 40, o oligonucleotídeo de fita simples (Exemplo 18), de acordo com a presente invenção, foi confirmado demonstrar um efeito antissenso superior em comparação com ASO (Exemplo Comparativo 14) e o oligonucleotídeo de fita simples que nâo tem grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica (Exemplo Comparativo 15).
APLICABILIDADE INDUSTRIAL [001339] A utilização do oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção torna possível distribuir eficientemente um ácido nucleico antissenso a um órgão específico (ou célula) com elevada especificidade, controlar eficazmente a função de um RNA alvo com esse ácido nucleico e/ou suprimir eficazmente a expressão de um gene alvo. Além disso, uma vez que o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção é capaz de aplicar várias moléculas, como lipídios (como tocoferol e colesterol), açúcares (como glicose e sacarose), proteínas, peptídeos ou anticorpos como moléculas funcionais para entregar a um órgão específico, para que seja capaz de atingir vários órgãos, tecidos e células. Além disso, uma vez que o efeito antissenso do mesmo não diminua mesmo que o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção seja modificado de modo a conferir resistência à RNase e similares, também pode ser utilizado em aspectos da administração enteral.
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259/259 [001340] Dessa forma, o oligonucleotídeo de fita simples da presente invenção permite a obtenção de elevada eficácia farmacológica através da administração a uma concentração baixa e uma vez que também é superior em termos de redução dos efeitos colaterais adversos como resultado da supressão da distribuição em órgãos que não são o alvo do ácido nucleico antissenso, o oligonucleotídeo de fita simples é útil como uma composição farmacêutica e similares para tratar e prevenir doenças associadas à função de um RNA alvo e/ou superexpressão de um gene alvo, como doenças metabólicas, tumores ou infecções.
[001341] As descrições do pedido de patente japonesa n° 2017019796 (data de depósito: 6 de fevereiro de 2017) e pedido de patente japonesa n° 2017-144822 (data de depósito: 26 de julho de 2017) são incorporadas na presente descrição em sua totalidade por referência. Todos os documentos, pedidos de patente e padrões técnicos descritos na presente descrição são incorporados na presente descrição por referência ao mesmo grau no caso em que a incorporação de cada documento, pedido de patente e padrão técnico por referência é especificamente e individualmente descrito.

Claims (38)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Oligonucleotídeo de fita simples, caracterizado pelo fato de ser representado pela seguinte fórmula (I):
    [Xz-Lx4x- L-Y-ÍLy-Yz ] ( I )
    ΓΠ Π em que, X é um grupo derivado de um primeiro oligonucleotídeo composto de 7 a 100 nucleotideos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e que contenha pelo menos um nudeotídeo do qual pelo menos uma de uma porção do açúcar, porção da base e porção do fosfato tenha sido modificada,
    Y representa um grupo derivado de um segundo oligonudeotídeo composto por 4 a 100 nucleotideos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e que contém pelo menos um ribonudeotídeo,
    Xz representa um grupo derivado de um terceiro oligonudeotídeo composto de 7 a 100 nucleotideos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e
    Yz representa um grupo derivado de um quarto oligonucleotídeo composto de 7 a 100 nucleotideos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e
    L representa um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleo
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  2. 2/14 tídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
    - P s - W 5 - P s - em que, cada P5 representa, independentemente, -P(=O)(OH)- ou P(“O)(SH)··, W5 representa um grupo derivado de um quinto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado,
    Lx representa
    -P(=O)(OH)-, um grupo ligante que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo derivado de um sexto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado,
    Ly representa
    -P(=O)(OH)-, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
    - P 7 - w7 - P 7 - em que, cada P7 representa, independentemente, -P(™O)(OH)~ ou P(=O)(SH)-, W7representa um grupo derivado de um sétimo oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, pelo menos um de L, Lx e Ly é um grupo de ligação contendo a estrutura não nucleotídica,
    L é, respectivamente, ligado covalentemente ao primeiro oligonucleotídeo e ao segundo oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos,
    Lx é, respectivamente, ligado covalentemente ao primeiro oligonucleotídeo e ao terceiro oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos,
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  3. 3/14
    Ly é, respectivamente, ligado covalentemente ao segundo oligonucleotídeo e ao quarto oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, men representam respectiva e independentemente 0 ou 1;
    o primeiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica X, o segundo oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Y, o terceiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Xz e o quarto oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Yz, a sequência nucleotídica X contém uma primeira sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do segundo oligonucleotídeo, a sequência nucleotídica Y contém uma segunda sequência nucleotídica que é capaz de se hibridizar com pelo menos uma porção do primeiro oligonucleotídeo e contém pelo menos um ribonucleotídeo, pelo menos uma da sequência nucleotídica X, da sequência nucleotídica Xz e da sequência nucleotídica Yz contém uma sequência antissenso capaz de se hibridizar com um RNA alvo, e no caso de ter duas ou mais sequências antissenso, o RNA alvo hibridizado por cada porção de sequência antissenso pode ser igual ou diferente, em que X e Y se hibridizam pela primeira porção da sequência nucleotídica e pela segunda porção da sequência nucleotídica.
    2. Oligonucleotídeo de fita simples, caracterizado pelo fato de ser representado pela seguinte fórmula (I):
    [Xz — Lx^X“L~Y~fLy~Yz ] ( I ) v rri em que, X é um grupo derivado de um primeiro oligonucleotídeo composto de 7 a 100 nucleotideos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado e
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  4. 4/14 que contenha pelo menos um nucieotídeo do qual pelo menos uma de uma porção do açúcar, porção da base e porção do fosfato tenha sido modificada,
    Y representa um grupo derivado de um segundo oligonucleotídeo composto por 4 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, e que contém pelo menos um ribonucleotídeo,
    Xz representa um grupo derivado de um terceiro oligonucleotídeo composto de 7 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e
    Yz representa um grupo derivado de um quarto oligonucleotídeo composto de 7 a 100 nucleotídeos que são independentemente selecionados de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado e
    L representa um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
    -P (-O) (OH) _W5~P (-O) (OH) em que, W5 representa um grupo derivado de um quinto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado,
    Lx representa ~P(=O)(OH)~, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
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  5. 5/14
    -P (~O) (OH) -~W6-P (~O) (OH) em que, W6 representa um grupo derivado de um sexto oligonucleotideo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados, independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado,
    Ly representa
    -P(=O)(OH)-, um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica ou um grupo representado pela seguinte fórmula:
    P (~O) (OH) W P (“O) (OH) em que, W7 representa um grupo derivado de um sétimo oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotídeos que são selecionados independentemente de desoximbonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotídeos com açúcar modificado, pelo menos um de L, Lx e Ly é um grupo de ligação contendo a estrutura não nucleotídica,
    L é, respectivamente, ligado covalentemente ao primeiro oligonudeotídeo e ao segundo oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos,
    Lx é, respectivamente, ligado covalentemente ao primeiro oligonucleotídeo e ao terceiro oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos,
    Ly é, respectivamente, ligado covalentemente ao segundo oligonucleotídeo e ao quarto oligonucleotídeo nas duas extremidades dos mesmos, men representam respectiva e independentemente 0 ou 1;
    o primeiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica X, o segundo oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Y, o terceiro oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Xz e o quarto oligonucleotídeo tem uma sequência nucleotídica Yz, a sequência nucleotídica X contém uma primeira sequência
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  6. 6/14 nucleotidica que é capaz de se hibridizar com peto menos uma porção do segundo oligonucleotídeo, a sequência nucleotidica Y contém uma segunda sequência nucleotidica que é capaz de se hibridizar com peto menos uma porção do primeiro oligonucleotídeo e contém pelo menos um ribonucleotídeo, peto menos uma da sequência nucleotidica X, da sequência nucleotidica Xz e da sequência nucleotidica Yz contém uma sequência antissenso capaz de se hibridizar com um RNA alvo, e no caso de ter duas ou mais sequências antissenso, o RNA alvo hibridizado por cada porção de sequência antissenso pode ser igual ou diferente, em que X e Y se hibridizam pela primeira porção da sequência nucleotidica e pela segunda porção da sequência nucleotidica.
    3. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que X liga-se a L no lado 3’ e Y liga-se a L no lado 5’.
    4. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que X liga-se a L no lado 5’ e Y liga-se a L no lado 3’.
    5. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado peto fato de que cada grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotidica representa independentemente um grupo representado pela seguinte fórmula:
    ..... p P 1 1 .... ( .... Q .... V 1 1 .... ) q ] , ..... O ..... J q , 2 .... p 1 1 ....
    em que, V11 representa um grupo alquileno C2-50
    0 grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados do grupo substituinte Va, um grupo selecionado do grupo consistindo nas seguintes
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  7. 7/14 fórmulas (XIII-1) a (XIII-11):
    Figure BR112019014547A2_C0001
    Figure BR112019014547A2_C0002
    em que, o1 é um número inteiro de 0 a 30, p1 é um número inteiro de 0 a 30, d1 é um número inteiro de 1 a 10, w é um número inteiro de 0 a 3, Rb representa um átomo de halogêneo, um grupo hidroxila, um grupo amino, um grupo alcóxi C1-6, um grupo alcóxi C1-6 substituído por um grupo alcóxi Ci-β ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilamino C1-6, um grupo dialquilamino C-i-6 ou um grupo alquila Ci e, Rc representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila C1-6, um grupo halo-alquila Cve, um grupo alquilcarbonila C1-6, um grupo haloalquilcarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila C1-6, um grupo alcoxicarbonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi C1-6 ou um grupo carbamoíla, um grupo monoalquilaminocarbonila Cve, um grupo dialquilaminocarbonila C1-6, um grupo alquilsulfonila C1-6, um grupo haloalquilsulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6, um grupo alcoxissulfonila C1-6 substituído por um grupo alcóxi Ci-β ou um grupo carbamoí
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  8. 8/14
    Ia, um grupo monoalquilaminossulfonila C16 ou um grupo dialquilaminossulfonila C1-6, um grupo ribonucleosídeo ou um grupo desoxirribonucleosídeo, pelo menos um de V11 representa um grupo alquileno C2-50, em que 0 grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituirdes independentemente selecionados de um grupo substituinte Va· ou um grupo selecionado das fórmulas mencionadas acima (XIII-1) a (XIII-11),
    0 grupo substituinte Va significa um grupo substituinte constituído por um grupo hidroxila, um átomo de halogêneo, um grupo ciano, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo carbamoíla, um grupo sulfamoíla, um grupo fosfono, um grupo sulfo, um grupo tetrazolila e um grupo formila, cada P11 representa independentemente -P(=O)(OH)- ou P(=O)(SH)-, pelo menos um P11 representa -P(=O)(OH)-, qn é um número inteiro de 1 a 10, qi2 é um número inteiro de 1 a 20, e quando pelo menos um de qn e qi2 é 2 ou mais, V11 é igual ou diferente.
    6. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que cada grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica representa independentemente um grupo representado pela seguinte fórmula:
    - ΓΡ (~-O) (OH) -- (--(3--Vo--) ςγ-Ο-Ί q2~ P ó-O) (OH) em que, Vo representa um grupo alquileno C2-50
    0 grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados de um gruPetição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 303/357
  9. 9/14 po substituinte Va, um grupo selecionado do grupo consistindo nas seguintes fórmulas (X-1) a (X-9):
    Figure BR112019014547A2_C0003
    em que o é um número inteiro de 0 a 30 e p é um número inteiro de 1 a 30.
    um grupo ribonucleosídeo ou um grupo desoxirribonucleosídeo, pelo menos um de Vo representa um grupo alquileno C2-50, em que 0 grupo alquileno C2-50 é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados de um grupo substituinte Va- ou um grupo selecionado das fórmulas mencionadas acima (X1) a (X-9),
    0 grupo substituinte Va significa um grupo substituinte constituído por um grupo hidroxila, um átomo de halogêneo, um grupo ciano, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo
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  10. 10/14 carbamoíla, um grupo sulfamoíla, um grupo fosfono, um grupo sulfo, um grupo tetrazolila e um grupo formila, qi é um número inteiro de 1 a 10, qs é um número inteiro de 1 a 20, e quando pelo menos um de qi e q2 é 2 ou mais, Vo é igual ou diferente.
    7. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência nudeotídica é uma sequência antissenso.
    8. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que X contém pelo menos um nudeotídeo com açúcar modificado e a primeira sequênda nudeotídica é uma sequência que contém pelo menos quatro nudeotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H.
    9. Oligonudeotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a primeira porção da sequência nudeotídica contém pelo menos um nudeotídeo com açúcar modificado e não contém uma fita oligonucleotídica composta por quatro desoxirribonucleotídeos contíguos.
    10. Oligonudeotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o primeiro oligonudeotídeo contém um nudeotídeo com açúcar modificado adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da primeira porção da sequência nudeotídica.
  11. 11. Oligonudeotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro oligonudeotídeo contém uma ligação fosforotioato.
  12. 12. Oligonudeotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência nudeotídica é uma sequência composta por 4 a 20 nucleotideos incluindo pelo menos um desoxirribonucleotídeo.
    Petição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 305/357
    11/14
  13. 13. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a segunda sequência nucleotídica é uma sequência que contém pelo menos quatro nucleotídeos contíguos clivados por RNase H.
  14. 14. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o segundo oligonucleotídeo contém um nucleotídeo com açúcar modificado adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da segunda porção da sequência nucleotídica.
  15. 15. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que m éO, néOeLéum grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
  16. 16. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que n é 1, o Yz contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado e a sequência nucleotídica Yz contém a sequência antissenso.
  17. 17. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a sequência antissenso contida na sequência nucleotídica Yz é uma sequência contendo pelo menos quatro nucleotídeos contíguos reconhecidos pela RNase H quando se hibridiza com um RNA alvo.
  18. 18. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a porção de sequência antissenso contida na sequência nucleotídica Yz contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado e não contém uma fita de oligonucleotídeos composta por quatro desoxirribonudeotídeos contíguos.
  19. 19. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o
    Petição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 306/357
    12/14 quarto oligonucleotídeo contém um nucleotideo com açúcar modificado adjacente a pelo menos um dos lados 5’ e 3’ da porção de sequência antissenso contida em Yz.
  20. 20. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o quarto oligonucleotídeo contém pelo menos quatro nucleotideos contíguos clivados por RNase H.
  21. 21. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que L é um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica e Y e Yz são acoplados através de uma ligação fosfodiéster.
  22. 22. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que L representa um grupo representado pela seguinte fórmula:
    -P (“--O) (OH) --W I' (-----0) (OH) em que, W5 representa um grupo derivado de um quinto oligonucleotídeo composto por 1 a 50 nucleotideos que são selecionados independentemente de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e nucleotideos com açúcar modificado, e
    Ly representa um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
  23. 23. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que L e Ly, respectivamente, representam independentemente um grupo de ligação que contém uma estrutura não nucleotídica.
  24. 24. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, caracterizado pelo fato de que m éO.
  25. 25. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e 16 a 23, caracterizado pelo fato
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    13/14 de que m é 1 e o Xz contém pelo menos um ribonucleotídeo.
  26. 26. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 a 23 e 25, caracterizado pelo fato de que m é 1 e o Xz contém pelo menos quatro nucleotídeos contíguos clivados por RNase H.
  27. 27. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e 16 a 23, caracterizado pelo fato de que m é 1, o Xz contém pelo menos um nucleotídeo com açúcar modificado e a sequência nucleotídica Xz contém uma sequência antissenso.
  28. 28. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que contém adicionalmente um grupo derivado de uma molécula funcional tendo pelo menos uma função selecionada do grupo consistindo em uma função de marcação, uma função de purificação e uma função de entrega no sítio alvo.
  29. 29. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a molécula funcional é selecionada do grupo consistindo em açúcares, lipídios, peptídeos, proteínas e derivados dos mesmos.
  30. 30. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que a molécula funcional é um lipídio selecionado do grupo consistindo em colesterol, tocoferol e tocotrienol.
  31. 31. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que a molécula funcional é um derivado de açúcar que interage com um receptor de asialoglicoproteína.
  32. 32. Oligonucleotídeo de fita simples, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que a molécula funcio
    Petição 870190066436, de 15/07/2019, pág. 308/357
    14/14 nal é um peptídeo ou proteína selecionados do grupo consistindo em ligantes de receptor e anticorpos.
  33. 33. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de conter o oligonucleotídeo de fita simples, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, e um veículo farmacologicamente aceitável.
  34. 34. Método para controle da função de um RNA alvo, caracterizado pelo fato de incluir uma etapa para colocar o oligonucleotídeo de fita simples, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, em contato com uma célula.
  35. 35. Método para controlar a função de um RNA alvo em um mamífero, caracterizado pelo fato de incluir uma etapa para administrar uma composição farmacêutica contendo o oligonucleotídeo de fita simples como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, ao mamífero.
  36. 36. Método para controlar a expressão de um gene alvo, caracterizado pelo fato de incluir uma etapa para colocar o oligonucleotídeo de fita simples, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, em contato com uma célula.
  37. 37. Método para controlar a expressão de um gene alvo em um mamífero, caracterizado pelo fato de incluir uma etapa para administrar uma composição farmacêutica contendo o oligonucleotídeo de fita simples, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, ao mamífero.
  38. 38. Método para produzir o oligonucleotídeo de fita simples, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de incluir uma etapa para alongar a fita nucleotídica na extremidade 3’ ou na extremidade 5’ de um oligonucleotídeo contendo pelo menos um de X, L e Y.
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