PT1888748E - Formação estável e seletiva de triplex e duplex do tipo hoogsteen utilizando ácidos nucléicos torcidos e intercalados (tina) e processo para a preparação de tina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "FORMAÇÃO ESTÁVEL E SELETIVA DE TRIPLEX E DUPLEX DO TIPO HOOGSTEEN UTILIZANDO ÁCIDOS NUCLÉICOS TORCIDOS E INTERCALADOS (TINA) E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE TINA"

Sumário da invenção A invenção refere-se à área dos oligonucleótidos e oligonucleótidos modificados com propriedades melhoradas, tais como a capacidade de formar cadeias triplex e de aptidão para a deteção, diagnóstico e/ou tratamento.

Em particular, a presente invenção proporciona um novo monómero de empilhamento flexível de bases, que pode ser incorporado num oligonucleótido fornecendo oligonucleótidos formadores de triplex (TFOs), cujas sequências são capazes de ligação específica com os ácidos nucléicos alvos de cadeia dupla ou de cadeia simples para formar hélices triplas de elevada estabilidade térmica. Outros aspetos consistem nos métodos para sintetizar os TFOs, bem como a sua utilização na deteção, diagnóstico e tratamento.

Antecedentes da invenção W02005083084 descreve pseudonucleótidos intercalantes susceptíveis de serem incorporados na estrutura principal de um oligonucleótido ou um análogo de oligonucleótido. Os oligonucleótidos que compreendem os pseudonucleótidos intercalantes tem uma capacidade reduzida de formação de triplex, no entanto tem a capacidade de discriminar entre ADN e ARN, ou seja, formam complexos mais estáveis com o ADN do que com o ARN. 2

Malakhov et al, 2004 (Eur. J. Org. Chem. Chem. 2004, 1298-1307) revelou um monómero para incorporação num oligonucleótido ou um oligonucleótido. O objetivo do estudo foi o de fornecer uma base natural, ou seja, uma base adaptável que pudesse ser encaixada numa hélice de Watson-Crick, do lado oposto a qualquer base de ocorrência natural. Não foram relatados estudos sobre formação triplex. O reconhecimento especifico da sequência do ADN de cadeia dupla (dsADN) é um tema de grande interesse no desenvolvimento de ferramentas baseadas em oligonucleotidos em biologia molecular, terapêutica e bionanotecnologia. As hélices triplas são formadas quando um oligonucleótido formador de cadeia triplex de cadeia simples (TFO) liga-se ao dsADN através de interações especificas da ondulação principal e isso tem sido objeto de intensa pesquisa direcionada para os genes. Esta abordagem permite o controlo transcricional, gene knock-out e tratamento seletivo de sequências do ADN genómico, visando os genes mutantes ou recombinantes. A afinidade da terceira cadeia de TFOs pelos seus alvos é geralmente é problemática devido ao seu reconhecimento necessário para sequências homopurina de dsADN e a formação de bases triplas C+.G-C de Hoogsteen, sensíveis a pHem condições fisiológicas, ser desfavorecida no motivo de ligação em paralelo (pirimidina). Durante a última década, muitos esforços têm sido dedicados para modificar TFOs para melhorar a afinidade de ligação pelos seus alvos e além da construção triplex de nucleobases que poderia abrandar a restrição imposta pela sequência de dsADN. Os oligonucleotidos que possuem ácidos nucléicos modificados, tais como os ácidos nucléicos peptídicos (PNA), ácidos 3 nucléicos fechados (LNA), 2'-amino-etil-oligorribonucleótidos (2'-AE-ARN) e N3'^P5 ' fosforamidatos que induzem o aumento da afinidade de ligação estão entre os TFOs que foram quimicamente modificados com mais êxito. A estabilização das estruturas triplex foi também observada após a adição de compostos heterociclicos (intercalantes) , por vezes, possuindo uma cadeia lateral carregada positivamente em relação à solução aquosa contendo todas as três sequências de oligonucleótidos. Foi também demonstrado que um intercalante, ligado de forma covalente à extremidade 3'- ou 5'- de um TFO, levou à estabilização térmica dos triplex paralelos num intervalo que variou de +3,0 a +16,1°C, dependendo do comprimento do ligante e do tipo de intercalante. No entanto, tem havido pouca atenção aos intercalantes ligados covalentemente, inseridos como uma saliência no meio de TFO.

Esta construção pode ter várias vantagens. Em primeiro lugar, é apenas necessário a sintese de um único fosforamidato de pseudo-nucleótidos intercalantes em comparação com a sintese de pelo menos quatro monómeros de nucleótidos necessários para ácidos nucléicos modificados de açúcares. Em segundo lugar, várias inserções salientes na sequência de um monómero intercalante susceptiveis de aumentar consideravelmente a estabilidade do duplex e triplex, em comparação com a única inserção. Além disso, a diferença estrutural entre os tipos de ligação de Watson-Crick e Hoogsteen, juntamente com a ausência ou presença de 2'-OH no ADN e ARN dão origem a propriedades diferentes para os diversos tipos de hélices. Portanto, as inserções salientes de um ligante e a quebra da hélice por intercalantes possivelmente resultaram em propriedades únicas para hélices adequadamente escolhidas. Tal levou a oligonucleótidos quimicamente modificados que podem fazer a 4 distinção entre os diferentes tipos de ácidos nucléicos de cadeia simples.

Christensen et al. (Nucleic acids research, vol. 30, n. 22, 15 de novembro de 2002, páginas 4918-25) e W003/051901 divulgam o pseudo-nucleótido intercalante fosforamidato (IPN) de (S)-1-0-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-3-0-(1-pirenilmetil)glicerol, que é inserido nos oligonucleótidos para gerar ácidos nucléicos intercalantes (INA).

Adicionalmente, Christensen et al. (Nucleic acids research, vol. 30, n. 22, 15 de novembro de 2002, páginas 4918-25) descreve um método para a preparação de tais IPNs e WO03/051901 descreve que tais compostos podem ser utilizados como moduladores da transcrição.

Descrição detalhada da invenção

Inserções salientes de (R)-1-0-[4-(1-pireniletinil) fenilmetil]glicerol no meio de oligodesoxinucleótidos de homopirimidina (ácidos nucléicos intercalantes retorcidos, TINA), obtidos através da reação de acoplamento pós-sintética de Sonogashira permitiram que duplexes de triplexes do tipo de Hoogsteen atingissem uma alta estabilidade térmica extraordinária, enquanto que duplexes do tipo Watson-Crick, com o mesmo conteúdo de nucleótidos, não se estabilizaram.

Num primeiro aspeto, a presente invenção proporciona um monómero de empilhamento flexível de bases com a estrutura geral: X-L-Ii-C-I2 5 em que X é uma estrutura constituída por unidades de monómero que pode ser incorporada à estrutura principal de um oligonucleótido ou de um análogo de oligonucleótido, ou PNA, ou análogos de PNA, L representa um ligante, li é um primeiro intercalante que compreende pelo menos um sistema conjugado essencialmente plano, capaz de co-empilhamento com nucleobases de ADN, ARN ou seus análogos, C é um agente de conjugação e I2 é um segundo intercalante, compreendendo pelo menos um sistema conjugado essencialmente plano, que é capaz de co-empilhamento com nucleobases de ADN, ARN ou seus análogos.

Um monómero de empilhamento flexível de bases consiste em pelo menos dois sistemas intercalentes li e I2, que são ligados por um agente de conjugação C, que proporciona a rigidez estrutural necessária e flexibilidade de torção. Esta última é considerada importante para ajudar intercalantes a se ajustarem a uma posição apropriada no interior da hélice do ácido nucléico.

Numa forma de realização preferida, a estrutura principal X é capaz de ser incorporada num oligonucleótido de ADN, ARN, HNA, MNA, ANA, LNA, CAN, INA, CeNA, TNA, (2'-NH)-TNA, (3'-NH)-TNA, a-L-Ribo-LNA, a-L-Xilo-LNA, β-D-Ribo-LNA, β-D-Xilo-LNA, [3.2.1]-LNA, biciclo-ADN, 6-amino-biciclo-ADN, 5-epi-biciclo-ADN, α-biciclo-ADN, ADN-triciclo, biciclo[4.3.0]-ADN, biciclo[3.2.1]-ADN, biciclo[4.3.0]amida-ADN, β D-ribopiranosil-NA, a-L-Lixopiranosil-NA,, 2'-R-ARN, 2'-OR-ARN, 2'-AE-ARN, a-L-ARN, β-D-ARN e combinações e modificações destes.

Os ácidos nucléicos e seus análogos fornecem um oligonucleótido que é capaz de ligar-se a ácidos nucléicos complementares, através de emparelhamento de bases do tipo Watson-Crick ou de Hoogsteen ou Hoogsteen reverso. X pode 6 ser incorporado na extremidade 3' e/ou na extremidade 5' e/ou no meio das sequências. As nucleobases modificadas, hidratos de carbono, cadeias peptídicas, partículas magnéticas, partículas de agarose, partículas de sefarose, vidro, superfícies de plástico, superfícies de metais pesados e de chips são considerados, quando utilizadas, como modificações adicionais de ácidos nucléicos.

Numa outra forma de realização, a unidade monomérica da estrutura principal X compreende um alquileno-diol, tais como etilenoglicol ou 1-0-metileno-glicerol, que opcionalmente tem o alquileno-diol parcialmente composto por um sistema de anel, tal como uam glicona. Por exemplo, o monómero da estrutura principal X pode ser parte de anéis de quatro, cinco ou seis membros, que eventualmente têm heteroátomos selecionados de entre azoto, enxofre, fósforo e oxigénio.

Numa forma de realização, o ligante L do monómero de empilhamento flexível de bases compreende 0-60 átomos.

Numa outra concretização, L compreende uma cadeia ou um anel ou uma combinação destes e/ou substituições dos mesmos.

Ainda em outra forma de realização, L compreende uma cadeia alquilo, uma cadeia oxalquilo, uma cadeia azalquilo ou uma cadeia tialquilo ou um grupo carboxamida, um grupo tiocarboxamida, um grupo sulfonamida ou as suas combinações. A combinação de X e L proporciona um sistema que coloca o sistema intercalante de Ii-C-I2 no núcleo das hélices de ácidos nucléicos com a capacidade de empilhar com bases de ácido nucléico. 7 li do monómero de empilhamento flexível de bases da invenção é um primeiro intercalante, que compreende pelo menos um sistema de conjugação essencialmente plano, que é capaz de co-empilhamento com nucleobases de ADN, ARN ou seus análogos.

Numa forma de realização preferida, li é um sistema aromático em anel, monocíclico ou policíclico, opcionalmente selecionado de entre o grupo composto por benzeno, naftaleno, azuleno, sistemas de anéis heteroaromáticos biciclicos e substituições destes. C do monómero de empilhamento flexível de bases da invenção é um agente de conjugação. Numa concretização preferida, C é selecionado a partir do grupo composto por um grupo alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, alcenilo de 2 a 12 átomos de carbono, alcinilo 2 a 25 átomos de carbono ou diazóico ou suas combinações, com um comprimento de não mais do que 25 átomos de carbono e/ou átomos de azoto.

Numa outra forma de realização, C é selecionado de entre o grupo consistindo em anéis aromáticos de cadeia linear ou de cadeia ramificada ou monocíclico e suas substituições, que eventualmente têm heteroátomos selecionados de entre azoto, enxofre, fósforo e oxigénio.

Ainda numa outra forma de realização, o alquenilo de C é um acetileno ou acetilenos repetidos.

Numa forma de realização preferida, o comprimento da de uma unidade monómerica da estrutura principal X, incluindo um átomo de fósforo, é inferior a 6 átomos, em que o comprimento da unidade da estrutura principal é a distância mais curta a partir de um monómero para o outro. 8

Numa forma de realização preferida, a porção de ligação L tem um comprimento de pelo menos 2 átomos de carbono e, eventualmente, possui heteroátomos selecionados a partir de azoto, enxofre, fósforo e oxigénio. I2 do monómero de empilhamento flexível de bases é um segundo intercalante, compreendendo pelo menos um sistema conjugado essencialmente plano, que é capaz de co-empilhamento com nucleobases de ADN, ARN ou seus análogos.

Numa forma de realização preferida, I2 é selecionado de entre o grupo composto por sistemas em anel aromático bicíclicos, sistemas em anel aromático tricíclicos, sistemas em anel aromático tetracíclicos, sistemas em anel aromático pentacíclicos e análogos heteroaromáticos dos mesmos ou substituições destes.

Numa forma de realização preferida, o monómero de empilhamento flexível de bases faz parte de um oligonucleótido ou análogo de oligonucleótido.

Numa outra forma de realização preferida, o monómero de empilhamento flexível de bases está adaptado para incorporação num oligonucleótido.

Numa forma de realização preferida, o monómero de empilhamento flexível de bases para incorporação num oligonucleótido é selecionado a partir do grupo de uma fosforamidite, um fosforodiamidato, um fosforodiéter, um fosforotriéster, um fosfonato, um H-fosfonato, um fosfito, um clorofosfito, um clorofosforoamidato, um fosfonamidato, um fosfonocloridato, um trifosfato e um difosfato. 9

Ainda em outra forma de realização, o monómero de empilhamento flexivel de bases da invenção pode ser descrito pela fórmula: 9

O i 0= p-cr em que R é selecionado a partir do grupo de ariletinila.

Um outro aspeto da presente invenção é um oligonucleótido que compreende o monómero de empilhamento flexivel de bases da invenção. 0 oligonucleótido pode ser qualquer oligonucleótido que é capaz de efetuar o emparelhamento de bases de Watson-Crick e o emparelhamento de bases de Hoogstein e o emparelhamento inverso de bases de Hoogstein. 0 ponto importante, em ralção aos oligonucleótidos da presente invenção é que eles são capazes de emparelhamento de bases de Watson-Crick, o emparelhamento de bases de Hoogstein e emparelhamento inverso de bases de Hoogstein. Portanto, quando o monómero de empilhamento flexivel de bases da invenção é incorporado num oligonucleótido, o oligonucleótido toARN-se capaz de formação de triplex.

Outro aspeto da invenção é um método para a preparação de um monómero de empilhamento flexivel de bases, compreendendo os passos de: a) Fornecimento de um precursor de um monómero de empilhamento flexivel de bases, em que o referido precursor 10 é um monómero de empilhamento flexível de bases compreendendo li substituído com um átomo de halogénio ou substituído por C ou substituo com azida. b) A substituição do halogénio ou do substituinte C, ou do substituinte de azida do precursor do passo com o C-I2. c) A adaptação do precursor substituído com C-I2 de um monómero de empilhamento flexível de bases para incorporação num oligonucleótido.

Ainda outro aspeto da invenção é um método para a preparação de um oligonucleótido que compreende um monómero de empilhamento flexível de bases compreendendo os passos de: a) O fornecimento de um monómero de empilhamento flexível de bases adaptado para incorporação num oligonucleótido; b) O fornecimento de reagentes padrão para a síntese de oligonucleótidos; c) Durante a síntese de oligonucleótidos, a incorporação de um ou mais monómeros de empilhamento flexível de bases no oligonucleótido.

Gerando assim um oligonucleótido que compreende um monómero de empilhamento flexível de estrutura principal.

Ainda outro aspeto é um método para a preparação de um oligonucleótido que compreende um monómero de empilhamento flexível de bases compreendendo os passos de: a) 0 fornecimento de um precursor de um monómero flexível adaptado para incorporação num oligonucleótido, em que o referido precursor é um monómero de empilhamento flexível de bases, compreendendo li substituído com um halogénio ou substituído por C ou substituído com azida. b) O fornecimento de reagentes convencionais para a síntese de oligonucleótidos. 11 c) Durante a síntese de oligonucleotidos, a incorporação de um ou mais precursores dos monómeros de empilhamento flexível de bases no oligonucleótido. d) Após a síntese do oligonucleótido, o substituinte halogénio ou o substituinte C, ou o substituinte azida, no li, é substituído com C-I2.

Gerando assim um oligonucleotídeo compreendendo um monómero de empilhamento flexível de bases.

Um aspeto adicional da presente invenção é a utilização de um oligonucleótido que compreende o monómero de empilhamento flexível de bases para a formação de uma estrutura triplex de ácido nucléico. Em comparação com a tradicional deteção, por hibridação, a deteção de TFOs não requer um passo de desnaturação.

Assim, um outro aspeto da presente invenção é um método de formação de ácidos nucléicos duplex ou triplex compreendendo os passos de: a) 0 fornecimento de um oligonucleótido de acordo com a reivindicação 16, b) 0 fornecimento de um ácido nucléico alvo de cadeia simples ou cadeia dupla. c) A incubação do oligonucleótido do passo a) com o ácido nucléico alvo de cadeia simples ou ácido nucléico alvo de cadeia dupla do passo b) , em condições de formação duplex ou triplex. d) Formando, assim, um ácido nucléico em cadeia dupla ou ácido nucléico em estrutura triplex. É importante o facto de TFO da presente invenção ser capaz de formação de triplex, a um pHde cerca de 7, tal como será evidente a partir da seção dos exemplos. Esta característica é muito importante para diversas aplicações, como por exemplo para utilização como um medicamento. 12

Numa forma de realização preferida, a formação de um ácido nucléico triplex é utilizada para a modulação de uam sequência especifica da atividade de um ácido nucléico alvo.

Em formas de realização preferidas, o ácido nucléico alvo é selecionado de entre o grupo composto por um gene cromossómico, um mARN, um rARN, um tARN e microARNs ou quaisquer seus precursores. Assim, a estrutura triplex do ácido nucléico pode inibir a tradução de um mARN, a função de um rARN ou de um tARN ou uma transformação de um pré-miARN a um microARNs maduros.

Em outras formas de realização preferidas, a formação de um ácido nucléico em estrutura triplex é utilizada para a deteção de uma sequência especifica do ácido nucléico alvo.

Deste modo, poderia ser a deteção de um determinado precursor microARN ou a deteção de um alelo particular de um gene. Tais métodos de deteção são de interesse, por exemplo, para fins de diagnóstico.

Numa outra concretização, o oligonucleótido que compreende um monómero de empilhamento flexivel de bases é utilizado como um medicamento. 0 mecanismo de ação de um tal medicamento pode ser a inibição da expressão de um determinado gene, ou seja, através de um mecanismo antigénico. Também poderá ser a inibição ao nível de um ARNm ou microARNs.

Assim, os oligonucleótidos da invenção podem ser utilizados para a preparação de um medicamento.

Itens: 13 1. Um oligonucleótido intercalante para estabilização do ADN e ARN naturais ou modificados e triplexes, duplexes e seus híbridos com a estrutura geral de fórmula 1.

Fórmula 1 em que

Ri, R2 e R3 são, independentemente uns dos outros, um sistema de anel aromático monocíclico ou policíclico;

Ri, R2 e R3 podem ser, independentemente um do outro, substituídos

Oligo é um oligonucleótido que consiste em subunidades de ADN, ARN, PNA, HNA, MNA, ANA, LNA, CAN, INA, CeNA, TNA, (2'-NH)-TNA, (3'-NH)-TNA, α-L-Ribo-LNA, a-L-Xilo-LNA, β-D-Ribo-LNA, β-D-Xilo-LNA, [3.2.1]-LNA, biciclo-ADN, 6-Amino-biciclo-ADN, 5-epi-biciclo-ADN, a-biciclo-ADN, ADN-triciclo, biciclo[4.3.0]-ADN, biciclo [3.2.1J-ADN, biciclo [4.3.0]-amida-ADN, β-D-ribopiranosil-NA, cx-L-Lixopiranosil-NA, 2'-R-ARN, 2'-OR-ARN, 2'-AE-ARN, oí-L-ARN, β-D-ARN e modificações dos mesmos. As subunidades podem conter nucleobases modificadas, hidratos de carbono, cadeia de peptídeos. A estrutura principal do oligonucleótido pode ser modificada. 14 0 ligante compreende de 1-60 átomos de carbono e que pode conter regiões cíclicss não aromáticas, em que o oligo está ligado através da ligação do ligante ao sistema de anel aromático Ri, que por sua vez está ligado através do agente de conjugação 1, o qual define um sistema conjugado, que compreende um sistema anel aromático monociclico e/ou policiclico e/ou alquilo, alcenilo e/ou alcinilo, com o sistema de anel aromático R2, que por sua vez está ligado através do agente de conjugação 2, o qul define um sistema conjugado, que compreende um sistema em anel aromático monociclico e/ou policiclico e/ou alquilo, alcenilo e/ou alcinilo, com os sistemas de anel aromático R3, onde o ligante é uma unidade de monomérica da estrutura principal, capaz de ser inserido na estrutura principal de um ácido nucléico ou análogo de ácido nucléico, através de um grupo fosfato ou de grupos de açúcares ou nucleobases ou uma estrutura principal de oligonucleótidos modificados. O sistema conjugado composto por Ri, o agente de conjugação 1, R2, o agente de conjugação 2 e R3 pode adotar um sistema não-planar.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com a reivindicação 1, em que os agentes de conjugação 1 e 2 são, independentementes um do outro. O agente de conjugação 1 consiste num grupo arilo, R4, ligado a Ri através de x ligações simples, n ligações duplas e/ou m ligações triplas e ligado a R2 através de i ligações simples, k ligações duplas e/ou 1 ligações triplas, em que k, 1, m, n, x e i são, independentemente um do outro, números inteiros de 0-5. O agente de conjugação 2 consiste num grupo arilo, R5, ligado a R2 através de z ligações simples, p ligações duplas e/ou r ligações triplas e ligado a R3 por v ligações simples, s ligações duplas e/ou t ligações triplas, em que p, r, s, t, v e z são independentemente um do outro, 15 números inteiros de 0-5. O sistema conjugado assim formado pode formar um sistema não-planar.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com o item 2, em que o arilo contém heteroátomos.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com qualquer um dos itens 2 ou 3, em que R3 foi substituído por um único átomo, tal como descrito na fórmula 2. 0 sistema conjugado compreendendo Ri, o agente de conjugação 1, R2 e agente de conjugação 2 pode adotar um sistema não-planar.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com qualquer um dos itens 2 a 4, em que o agente de conjugação 1 e/ou o agente de conjugação 2 são selecionados, independentemente, do grupo que consiste em alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, alcenilo de 2 a 12 átomos de carbono, alcinilo de 2 a 25 átomos de carbono e suas combinações.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com qualquer um dos itens 2 a 5, em que o grupo alquinilo é composto pelos acetilenos repetitivos.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com qualquer um dos itens 2 a 5, em que o grupo alcinilo é acetileno. 16

Um oligonucleótido intercalante de acordo com qualquer um dos itens 2 a 7, não contendo R3 e o agente de conjugação 2, de acordo com fórmula 3.

Fórmula 3

Um oligonucleótido intercalante de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que o ligante é selecionado a partir do grupo constituído por grupos de cadeia linear ou cadeira ramificada ou grupos cíclicos.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com o item 9, em que o grupo de cadeia linear ou de cadeia ramificada ou o grupo cíclico tem heteroátomos selecionados a partir de azoto, enxofre, fósforo e oxigénio.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que o monómero de estrutura principal compreende etilenoglicol (fórmula 4): 17

Ο pOiigoniKSgõtÍOec Fórmula 4 em que X consiste em grupos de cadeia linear ou de cadeia ramificada ou grupos ciclicos e o oligonucleótido 1 e o oligonucleótido 2 são definidos, independentemente um do outro, como Oligo no item 1.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com o item 11, em que os grupos de cadeia linear ou de cadeia ramificada ou grupo ciclico possuem heteroátomos selecionados a partir de azoto, enxofre, fósforo e oxigénio.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que o monómero da estrutura principal compreende um 1-0-metileno-glicerol (fórmula 5):

| Oligonucfeotídea 2 Fórmula 5

Um oligonucleótido intercalante de acordo com o item 13, em que Ri consiste em anel fenilo meta-, orto-ou para-substituído (fórmula 6): 18

r~~ { Ο Otiaofluoleoíidee 2 Fórmula 6

Um oligonucleótido intercalante de acordo com o item 14, em que R2 é um pireno se conter R3 e o agente de conjugação 2, de acordo com fórmula 7.

GligorcudeoEidao S Fórmula 7

Um oligonucleótido intercalante de acordo com o item 15, em que o agente de conjugação 1 consiste em acetilenos repetidos ou acetileno ou arilo. 19

Um oligonucleótido intercalante de acordo com o item 16, em que o arilo contém heteroátomos.

Um oligonucleótido intercalante de acordo com qualquer um dos itens 11 a 17, em que o etilenoglicol substituído é um estereoisómero puro (R) ou (S) . 0 oligonucleótido intercalante definido na fórmula 8, em que o oligonucleótido 1 e o oligonucleótido 2 são definidos, independentemente un do outro, como Oligo no item 1.

/

0

Fórmula 8

Um oligonucleótido intercalante de acordo com qualquer um dos itens 1 a 19, onde o oligonucleótido 1 e o 20 oligonucleótido 2 são oligodesoxinucleótidos de cadeia simples rico ou pirimidina ou oligorribonucleótidos. O agente de conjugação 1 e/ou o agente de conjugação 2, oligonucleótido intercalante, de acordo com os itens 1 a 20, são reunidos por síntese pós-sintética do oligonucleótido que possui apenas uma parte do sistema conjugado final (precursor do oligonucleótido intercalante) , por exemplo, por reação de acoplamento de Sonogashira (reação entre arilos com acetilenos terminais e halogéneo-arilo, na presença de catalizador Pd e/ou Cul) , ou por reação Glazer (reação entre arilos com acetilenos terminais na presença de iões de cobre) ou pela técnica click-chemistri (reação entre azidas orgânicas e moléculas orgânicas com acetilenos terminais na presença de iões de cobre) . A síntese de acordo com o item 21 é executada no precursor oligonucleótido intercalante, o qual possui um grupo de proteção lábial ácido e/ou básico. A síntese de acordo com o item 21 pode ser realizada no precursor do oligonucleótido intercalente desprotegido. O precursor do oligonucleótido intercalante, de acordo com os itens 22 e 23 está ligado ao suporte sólido.

Um método de acordo com o item 24, em que o suporte sólido é uma superfície ativada.

Um método de acordo com o item 24, em que o suporte sólido é selecionado de entre o grupo consistindo em partículas magnéticas, partículas de agarose, partículas de sefarose, vidro, superfícies de plástico, superfícies com metais pesados ou chips. 21 0 oligonucleótido intercalante dos itens 1 a 20 é obtido por sintese em etapas de oligonucleótidos, utilizando o monómero de ligante ligado ao sistema conjugado final a uma parte do sistema conjugado final. O ligante possui pelo menos dois grupos reativos, os referidos grupos reativos podem reagir opcionalmente com a cadeia em crescimento do oligonucleótido ou do análogo do oligonucleótido. O referido monómero é capaz de reagir com uma cadeia em crescimento de um nucleótido, oligonucleótido, análogo de nucleótido ou análogo de oligonucleótido preso a um suporte e, opcionalmente, alongando o referido oligonucleótido ou análogo de oligonucleótido pela adição de um ou mais nucleótidos, análogos de nucleótidos ao análogo de oligonucleótido, numa desejada sequência, e realizando a clivagem do referido oligonucleótido ou análogo de oligonucleótido a partir do referido suporte sólido, e realizando a clivagem de grupos ácido/básico de proteção lábil e obtendo-se assim o oligonucleótido intercalante. 0 oligonucleótido intercalante dos itens 1 a 20 é capaz de formar triplex de Hoogsteen ou triplex reverso de Hoogsteen com uma das cadeias duplex, o duplex sendo um duplex de ADN, duplex de ARN ou seus híbridos. As partes Oligo do oligonucleótido intercalante do item 1 a 20 são capazes de formar duplex de Hoogsteen ou duplex reverso de Hoogsteen ou ainda dúplex de Watson-Crick com uma das cadeias simples, sendo a cadeia simples um ADN, ARN ou seus híbridos.

Triplexes e duplexes de Hoogsteen mostram um aumento da estabilidade térmica, quando o monómero compreendendo Ri, o agente de conjugação 1 e R2 e, eventualmente, o agente de conjugação 2 e R3, de acordo com os itens 1 a 20, formam uma protuberância. 22

Os oligonucleótidos intercalantes dos itens 1 a 20 são conjugados a agentes reativos com ADN. Os agentes reativos a ADN são agentes mutagénicos capazes de dirigir a mutagénese ou agentes reticulado, induzidos pela luz, ou são agentes radioativos, ou são grupos de alquilação, ou são moléculas que podem recrutar enzimas celulares que danificam o ADN.

Uma composição farmacêutica adequada para a utilização em terapia anti-sentido e terapia antigenética, composição esta que contém, como oligonucleótidos intercalantes conforme os dos itens 1 a 20.

Um método para o tratamento de doenças ou condições mediadas pela presença de oligonucleótidos duplex indesejáveis, método este que compreende a administração a um sujeito em necessidade de tal tratamento de uma quantidade eficaz do oligonucleótido dos itens 1 a 20 ou de uma composição farmacêutica dos mesmos.

Um método para realizar a ligação quimiosseletiva utilizando os oligonucleótidos intercalantes dos itens 1 a 20 conjugados com grupos reativos de ADN numa versão que compreende um ADN, ARN ou os seus híbridos. Os grupos reativos de ADN são grupos químicos capazes de reagir com outros grupos químicos, em condições adequadas.

Um método de acordo com o item 33, em que a ligação quimiosseletiva é bioortogonal.

Um método de acordo com o item 34, em que um dos grupos reativos de ADN é azida ou acetileno terminal ou fosfano. 23 0 oligonucleótido intercalante dos itens 1 a 20 pode ser utilizado para a purificação de plasmideos de ADN (ADN de cadeia dupla). O oligonucleótido intercalante dos itens 1 a 20 pode inibir a transcrição. O oligonucleótido intercalante dos itens 1 a 20 pode ser utilizado para hibridação in situ fluorescente (FISH) e análogos deste método, por exemplo, hibridação multiplex (multicolor) in situ fluorescente (M-FISH), FISH convencional, COMBO-FISH etc. O oligonucleótido intercalante dos itens 1 a 20 pode ser utilizado para a reparação genética. O oligonucleótido intercalante dos itens 1 a 20 pode ser utilizado em nanomáquina de ácidos nucléicos, baseado em transição duplex-triplex, em que os ácidos nucléicos são definidos como Oligo no item 1. 0 oligonucleótido intercalante dos itens 1 a 20 pode ser utilizado em nanomáquina de ácidos nucléicos baseado numa transição paralela duplex-antiparalela duplex, em que os ácidos nucléicos são definidos como Oligo no item 1. 0 oligonucleótido intercalante dos itens 1-20, em que as propriedades de fluorescência são alteradas após hibridação com um ADN, ARN ou seus análogos correspondentes.

Um sistema no qual o oligonucleótido intercalante dos itens 1 a 20 está ligado ao suporte sólido.

Um sistema de acordo com o item 43, em que o suporte sólido é uma superfície ativada. 24

Um sistema de acordo com o item 43, em que o suporte sólido é selecionado de entre o grupo consistindo em partículas magnéticas, partículas de agarose, partículas de sefarose, vidro, superfícies de plástico, superfícies com metais pesados e chips.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1

Os primeiros gráficos dos derivados da fusão triplex registados a 260 nm versus o aumento de temperatura (l°C/min) em 20 mM de cacodilato de sódio, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, pH7,2.

Figuras 2 a 6

Os espectros de fluorescência de duplex de cadeias simples, antiparalelo e paralelo e triplex paralelos. As condições de medição: 1 μΜ de cada cadeia em tampão a 10°C (20 mM de cacodilato de sódio, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, pH 6,0), a excitação: 373nm (fenda de excitação. 4,0 nm) , a emissão: 380-600 nm (fenda de emissão: 2,5 nm, para A, B, E, e 0,0 nm para C e D) . ON6 e ON12 foram utilizados como referências, no espectro registrado em diferentes condições.

Exemplos

Exemplo 1

Recentemente, relatou-se a síntese e as propriedades de vários ácidos nucleicos intercalantes, concebidos para duplexes do tipo Watson-Crick (Esquema 1)[9]. As inserções 25 salientes de (R)-1-0-(1-pirenilmetil)glicerol, no meio das oligodeoxinucleótidos (INA®) resultaram num aumento significativo de afinidades por ssADN complementar, enquanto que duplex INA/ARN e triplex e duplex do tipo Hoogsteen perderam a estabilidade[9a,e] . Foi também mencionado que esta sensibilidade divergente na formação de duplex foi mantida na inserção saliente de agentes intercalantes nas oligodesoxinucleótidos[9bl . A combinação única do ligante flexível e curto, derivado de glicerol, que distorceu a estrutura principal de fosfato e o agente intercalante adequado, que estabilizou o duplex INA/ADN, por dessolvatação e pelo empilhamento com nucleobases levou a uma molécula valiosa que é utilizada atualmente em biologia química de ácidos nucleicos.

Decidiu-se explorar este tipo de intercalantes para o desenho de TFO. De modo a melhorar a estabilidade do TFO, utilizando um ligante curto e flexível, a estrutura aromática de intercalantes deve ser longa o suficiente para colocar um intercalante na parte de dsADN da tripla hélice. Portanto, (R)-1-0-(4-poliaril-fenil)metilglicerol poderia ser uma boa escolha, pois o fenilo também pode imitar uma nucleobase na parte do TFO da tripla hélice. 0 intercalante poliarila também pode ser anexado a este fenil através de uma ponte de acetileno que proporciona a rigidez estrutural necessária e flexibilidade de torção, ainda unindo as estruturas aromáticas. Acredita-se que a própria ligação com acetileno melhora as propriedades de intercalação. De acordo com a modelação molecular de (R)-1-0-[4-(1-pireniletinil)-fenilmetil]glicerol, por MacroModel 8,0, os resíduos de 1-pirenilo e fenil retorcem-se em torno da ligação tripla com um ângulo de torção de 15,3. Acredita-se que esta capacidade de torção pode ajudar o intercalante a se ajustar a uma posição apropriada dentro do dsADN. Assim, referimo-nos a este tipo de ácidos nucleicos como ácidos 26 nucleicos intercalantes retorcidos (TINA, Esquema 1). Assim, relatou-se a derivação pós-sintética em coluna do tipo Sonogashira de oligodesoxinucleótidos levando a diferentes TINAS, que foi constatado, possuírem afinidades extraordinariamente altas em duplex e triplex do tipo Hoogsteen. Apresentam-se também estudos de estabilidade térmica e de fluorescência das hélices de ácidos nucleicos, com a inserção de TINA, como uma saliência de acordo com qualquer um dos modos de ligação de Watson-Crick ou como de Hoogsteen. 26

IMA. Monómero 0

ΤΙΜΑ miiósieros: 0 o=p-a i o 2:R = 3-e t in.il-l-fenile tini io 3:R = bAfenil-4-etinilo; 4:R = naftaleno-1-iletinilo; 5:R = piren-l-ilefcinilo. 27

Esquema 1: Estruturas químicas de monómeros de ácido nucleico intercalente (INA) e ácido nucleico intercalante retorcido (TINA). A modificação pós-sintética do oligonucleótido é a melhor alteARNtiva para a preparação de rotina e lenta de vários pseudonucleósidos fosforamidatos, que são necessários para a seleção do candidato adequado para TINA. Existem vários relatos dedicados à modificação, catalisada pelo paládio (0), de oligonucleótidos durante a síntese em fase sólida. Foi constatado que as condições de acoplamento de Sonogashira eram compatíveis com a síntese de ADN e não foram observadas reações secundárias de nucleobases com grupos protetores. De acordo com os protocolos conhecidos, a síntese de ADN é interrompida após a incorporação de 5'-O-DMT-2'-desoxi-5-iodouridina na extremidade 5' da sequência, seguida de tratamento do suporte de oligonucleótido em condições de Sonogashira. Posteriormente, a síntese de oligo é continuada até o final. No entanto, nem todos os grupos funcionais podem sobreviver após inserções durante a continuação da síntese de oligonucleótidos. Existe o risco de que a eficiência de acoplamento, para os fosforamidatos convencionais, sofra uma queda após a derivação em coluna, facto que também foi observado nas experiências descritas abaixo. Apesar de alguns acoplamentos organometálicos terem sido aplicados para a modificação pós-sintética de oligonucleótidos, foram relatadas que as reações pós-sintéticas de tipo Sonogoshira no nucleosídeo conversível 2'-desoxi-5-iodouridina, localizado no meio da sequência, não obtiveram êxito. Em vez deste, tentou-se a utilização de (R)-1-0-(4-iodobenzilo)glicerol nas reações do tipo Sonogoshira, após a sua incorporação no meio dos oligos. Algumas estruturas aromáticas com a ligação tripla terminal (2-5) foram utilizadas neste contexto (Esquema 1). 28 0 fosforamidito 8 necessário foi sintetizado em quatro fases, a partir de brometo de 4-iodobenzilo e (S)-( + )-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol com rendimento total de 47% (Esquema 2, ver folheto informativo para detalhes experimentais). A eficiência de acoplamento do composto 8, durante a sintese de ADN em escala de 0,2 ymol, utilizando condições convencionais de acoplamento de nucleótidos (2 min de acoplamento, 4,5-dicianoimidazol como ativador) e aumento do tempo sem proteção (100 s), foi estimada em mais de 99 %. Após a sintese do ADN, o suporte CPG com DMT em oligonucleótidos possuindo porções 4-iodofenil foram tratados com uma mistura de reagente de acoplamento de Sonogashira, contendo Pd(PF3)4 ou Pd(PF3)2Cl2 (7,5 mM) , uma estrutura aromática possuindo um acetileno terminal (22,5 mM) e Cul (7,5 mM) em DMF/Et3N seco (3,5/1,5; 500 yL) em seringas de 1 mL sob condições secas à temperatura ambiente. Foi importante lavar os suportes e seringas com árgon, em vez de azoto, antes da reação de acoplamento, para evitar a dimerização oxidativa Glazer. Foi constatado que a conversão foi melhor quando a mistura de reação de Sonogashira era preparada diretamente na seringa de plástico para cada oligo individual, em vez de preparação da mistura de reação de Sonogashira a granel para várias reações de acoplamento. Após a reação de acoplamento (3-4 h) , o CPG foi lavado com DMF (2 x 0,5 mL) e CH3CN (2x1 mL), e secados. Em seguida, os oligonucleótidos foram clivados, sendo separados do suporte de CPG com 32% de NH4OH (2 h) e deixados sem proteção a 55°C (durante a noite). Devido às diferentes capacidades lipofílicas, a separação de oligómeros que não reagiram e o TINA pretendido foi efetuada por HPLC semi-preparativa numa coluna de Ci8. Foi aplicado um programa mais longo de HPLC quando eram constatados picos sobrepostos (estrutura 2) (ver Folheto Informativo). Após a primeira separação, os 29 oligonucleótidos em DMT foram tratados com AcOH a 10%, novamente purificados por HPLC e precipitados em etanol. Foi constatado que a pureza dos TFOS finais era acima de 90% para oligodesoxinucleótidos contendo pirimidina pura e 85-88% para oligodesoxinucleótidos com purinas, conforme determinado por HPLC por troca iónica. A composição foi verificada por MALDI-TOF.

Esquema 2; Síntese de fosdoroamidato 8. Reagentes e condições: (a) brometo de 4-iodobenzila, KOH, tolueno; (b) CF3COOH aquoso a 80%, temperatura ambiente, 100% em duas etapas; (c) DMTCI, piridina, temperatura ambiente, 70%; (d)

NC (CH2) 2OP (NPr12) 2, diisopropil amino tetrazol, CH2C12, 0°C até temperatura ambiente, durante a noite, 67%. A conversão, durante o acoplamento de Sonogashira dependeu da reatividade dos acetilenos e da sequência de oligo. Tal como pode ser determinado a partir de algumas experiências com 1-etinilpireno, um tratamento a mais com a mistura de reação fresca foi mais eficiente do que o tempo prolongado de reação (4-16 h) . Uma menor quantidade de subprodutos moderadamente solúveis de Glazer, foi formada e uma melhor 30 derivação do oligo foi observada para o Pd(PF3)4 do que o Pd(PF3)2Cl2, como catalisador, no caso de 1-etinilpireno. A presença de purinas na sequência resultou numa menor conversão (50-60%) para o TINA pretendido, mesmo após o tratamento duplo do suporte com o oligonucleótido pela mistura de reagentes de acoplamento de Sonogashira, contendo 1-etinilpireno, quando comparado com as sequências de homopirimidina (80-85%), após um único tratamento. Isto também parece ser verdadeiro para outros acetilenos aromáticos, porque numa sequência de purinas não foram obtidos os oligonucleótidos pretendidos 4-etinilvifenila, considerando o menos reativo dos compostos entre os acetilenos testados. Na sintese dos ON14, observou-se que o tratamento de um oligonucleótido completo com uma mistura de reação de Sonogashira com 1-etinilpireno forneceu um oligómero mais puro do que a interrupção da sintese de ADN após a segunda inserção do composto 8, seguida por reação de Sonogashira e continuação da síntese de ADN. No último caso, os oligómeros curtos que possuíam pirenos contaminaram o TINA final, conforme determinado por HPLC de permuta iónica.

Foi relatada recentemente uma reação de acoplamento de Sonogashira sem cobre e com PdCl2 em água, na presença de pirrolidina. A compatibilidade com a água, as condições aeróbicas e vestígios de produtos homo-acoplamento são as grandes vantagens deste método. Foram aplicadas condições análogas sobre ο ON2 totalmente desprotegido. No entanto, após tratamento do ON2 com 1-etinilnaftaleno e PdCl2 em água/pirrolidina (1:1) a 50°C ou 20°C durante a noite, foi observada a ausência dos ácidos nucleicos desejados após purificação por HPLC. A estabilidade térmica de triplex, ADN/ADN e ADN/ARN duplexes com os oligonucleótidos sintetizados foi analisada 31 através de experiências de desnaturação térmica. As temperaturas de fusão (Tm, °C) , determinadas a partir dos primeiros derivados de curvas de fusão, estão listadas nas Tabelas 1-4. As sequências com TINAs diferentes foram estudadas emparelhamento de bases do tipo de Hoogsteen, em função do f, tanto em triplex paralelo para duplex como em dsADN paralelo para 0N15 (Tabela 1) . As mesmas sequências (0N1-14) foram utilizadas de duplex antiparalelo ADN/ADN de Watson-Crick para 0N16. Para este último tipo de duplex, sequências mistas de pirimidina/purina, semelhantes às descritas anteriormente para INA foram também utilizadas para olgonucleótidos de TINA para hibridação com ssADN e ssARN (Tabela 4).

Como pode ser visto a partir dos dados de Tm na Tabela 1, foi observada uma desestabilização considerável do triplex e dúplex do tipo de Hoogsteen para 0N2 com (R)-1-0-(4-iodofenilmetil)glicerol, sob a forma de saliência no centro da sequência, comparado com os complexos do tipo selvagem, a pH 6,0 (0N1 para Dl e ON15). A substituição do iodo por substituintes arilo forneceu triplexes mais estáveis (ON3-ON6 para Dl, pH 6,0) . O maior valor de Tm 46,0°C, foi observado para o substituinte 1-pireniletinil a pH 6,0, o que correspondeu a ATm = 19,0°C, quando comparado com o triplex do tipo selvagem. Mesmo a um pH de 7,2 uma única incorporação de 5 levou a uma estabilização considerável do triplex (ON6/D1), apesar do elevado teor de citosina (36%). A este f, a hibridação pode não ser detetada para o triplex do tipo selvagem (Figura 1). Para os duplexes paralelos a pH 6,0 a estabilização de 3,0°C e 14,5°C por alteração foi detetada para 1-naftaleniletinila (ON5) e 1-pireniletinil (ON6), respectivamente. Como esperado, a baixo pH (pH=5,0) foi constatado que duplexes paralelos eram mais estáveis devido à protonação de citosina. Pode-se concluir que a fixação das estruturas aromáticas na posição 4 do anel de 32 fenilo em (R)-1-0-(fenilmetil)glicerol resultou num aumento de afinidade de hibridização em hélices do tipo de Hoogsteen. Curiosamente, os anéis de naftaleno e pireno proporcionaram melhor estabilização do que 4-bifenilo e benzeno. Tal apoia a ideia de que é preferível utilizar as estruturas aromáticas com uma grande superfície, tal como pireno, para a ligação ao (R)-1-0-(4-fenilmetil substituído)glicerol do que pequenas estruturas aromáticas para conseguir uma boa ligação em hélices do tipo de Hoogsteen. A desestabilização de dsADN antiparalelo foi observada para todos os oligodesoxinucleótidos modificados estudados, exceto quando o intercalante 5 foi colocado na extremidade 5'-(ON10/ON16), em comparação com o dsADN do tipo selvagem (0N1/0N16, Tabela 1). 0 efeito estabilizador no último caso pode ser atribuído ao empilhamento de um sistema policiclico aromático na nucleobase adjacente (o efeito semelhante ao de uma prateleira) , enquanto que o efeito do ligante aciclico é marginal. A afinidade de hibridação é também dependente da estrutura de TINA. Os duplexes menos desestabilizados foram formados com 4 e 5, enquanto que a desestabilização do sADN foi maior para as estruturas 1-3, incorporadas como uma protuberância no meio da sequência. Já nesta fase, pode concluir-se que o TINA incorporado às hélices como uma protuberância melhora a estabilidade das hélices do tipo Hoogsteen e não duplexes do tipo Watson-Crick. Assim, uma única inserção de (R)-1-0-[4-(1-pireniletinil)fenilmetil]glicerol como uma protuberância, num triplex paralelo menos estável (0N6/D1), a pH 6,0, estabilizou o triplex com o nivel de um duplex Watson-Crick (ON6/ON16), com o mesmo teor de nucleotideos. A estabilidade térmica de diferentes TINAS, levou-nos a investigar mais atentamente as propriedades da TINA contendo 1-pireniletinil. 33

Foi observado um nível de flutuação da estabilidade térmica do triplex e duplex de Hoogsteen quando a 1-pireniletinil foi colocada em diferentes posições no TFO. Quando a citosina encontrava-se ao lado das extremidades 5'-ou 3'-lados (ON7-ON9), tanto o triplex paralelo como o duplex paralelo ficaram menos estáveis do que quando o 5 foi colocado entre duas timidinas a pH 6,0 (ON6). Tal pode ser um resultado da interação da estrutura aromática com o par carregado positivamente C+.G. Curiosamente, a pH 7,2, quando a citosina não estava protonada, foi detetada uma menor afinidade de hibridização de triplex, para TFO com 5 na extremidade 5'-flutuante (ONIO) entre os TFOs testados com única inserção de 1-pireniletinil (ON6-ON10). Foi surpreendentemente que o efeito de prateleira não tivesse ocorrido neste caso. Tal poderia ser uma consequência da menor estabilidade das regiões ricas em C do TFO com o dsADN alvo em condições fisiológicas. No entanto, é importante observar que a afinidade de hibridização eficiente pode ser conseguida através da colocação de 5 no meio da região rica em C (ON9) em meio neutro. Pode-se especular se a intercalação fará com que a protonação seja mais provável na estrutura triplex em pH fisiológico, uma vez que o intercalante está separando duas estruturas triplas carregadas positivamente. A dependência da distância entre inserções salientes múltiplas do intercalante pireno 5 sobre a estabilidade térmica foi investigada utilizando ON11-ON14 (Tabela 1). Em caso de operações de sobreposição de triplex e duplex, as experiências de fusão foram realizadas em 373 nm. No entanto, algumas vezes não foram observadas operações bem definidas em 373 nm. Nestes casos, as supostas temperaturas de fusão a pH 6,0 dos triplexes a temperaturas próximas daquelas dos duplexes utilizaram como base a comparação com 34 fusões a pH 7,2, que foram medidas a 260 nm. Quando o intercalante 5 foi inserido, como vizinho mais próximo (ON12), o duplex e o triplex do tipo Hoogsteen foram estabilizados em relação ao ON1 sem modificações a pH 6,0. No entanto, as estabilidades em ambos os casos eram inferiores do que a inserção única de 5 (ON6) e não foi observada a formação de triplex a um pH de 7,2. Tal pode ser devido à grande interrupção das hélices duplas e triplas por dois ligantes (R)-1-O-metilglicerol salientes, posicionados muito próximo um do outro. Quando as duas inserções de 5 foram separadas por duas ou três nucleobases (ON13 e ON14, respetivamente), os complexos com Dl e ON15 foram mais estáveis do que aqueles com inserções individuais. A pH 7,2 a Tm para o triplex foi ainda mais elevada do que a temperatura fisiológica de 37°C (consultar ON14/D1 na Figura 1). Da mesma forma de inserções duplas de 5 no meio, inserções duplas com uma inserção na extremidade 5'-com seis de pares de bases entre as inserções (ON11) estabilizaram consideravelmente duplex e triplex do tipo Hoogsteen em pH 6,0. Ao contrário das hélices do tipo Hoogsteen, duplexes antiparalelos com inserções duplas de 5 (ON12-14/ON16) mostraram uma estabilidade menor quando comparados com o duplex de tipo selvagem ON1/ON16, especialmente quando uma ou três nucleobases estavam entre as duas inserções. Ao comparar a estabilidade térmica de duplexes paralelo e antiparalelo com inserções duplas de 5 a pH 5,0, e duplexes do tipo Hoogsteen ON11/ON15 e ON14/ON15 foram ainda mais estáveis do que os correspondentes duplexes do tipo Watson-Crick (ON11/ON16 e ON14/ON16). A estabilização do triplexes paralelos e duplexes paralelos mediante adição de um intercalante foi relatada pela primeira vez para derivados de benzopiridoindole (BPI). A reorganização de duplex de ADN do tipo Watson-Crick com pares se, combinação perfeita em duplex de ADN de Hoogsteen com pares perfeitamente 35 combinados foi detetada quando BPI foi adicionado à solução aquosa dos oligodesoxinucleótidos. Um efeito favorável similar é previsto para duplex paralelo inteiramente combinado em inserções de 5 em oligodesoxinucleótidos. A estabilização extraordinária de triplexes paralelos foi observada a um pH de 5,0. O alto teor de citocinas, no TFO, mudou o ponto de fusão do triplex não modificado (Tm = 55,0°C) para próximo do ponto de fusão do duplex. No entanto, este valor foi ainda menor do que o ponto de fusão do duplex a pH 5.0 (Tm (Di > = 56,5°C). Uma única inserção saliente de um derivado de 4 de 1-naftaleniletinilo no TFO aumentou ligeiramente a estabilidade do triplex (ATm (ons/di-oNi/di) = 2,0°C). No entanto, a inserção saliente de 5 levou, em todos os casos, à dissociação do complexo total, a temperaturas que eram mais elevados do que a Tm para dsADN (Dl). O estado evidente de transição para ON11 foi observado a 373 nm, com a mesma temperatura que a 260 nm, o que confirmou que o duplex e o triplex fundiam juntos. Foi observada a mesma dependência de estabilidade térmica para a inserção dupla de 5 em TFO, a pH 6,0 e a pH de 5,0. Assim, a dupla inserção de 5, como o vizinho mais próximo (ON12) e inserções de 5 no meio e na extremidade 5 (ON11) foram os triplexes menos e mais estabilizados, respetivamente. A pH 5,0, o triplex ON14/D1 foi mais estável a 16,5°C e 20,5°C do que os duplexes correspondentes paralelo e antiparalelo, respetivamente. É importante notar que, mesmo a um pH de 7,2, o oligonucleótido ON14 forma triplex do tipo de Hoogsteen mais estável (Tm = 43,0°C, ON14/D1) do que o correspondente dsADN Watson Crick (Tm = 38,0°C, ON14/ON16) . A pH 7,2 a temperatura de fusão do dúplex paralelo (ON14/ON15) supõe ser inferior a 38,0°C, observada a pH 6,0, uma vez que este duplex é sensivel ao f. Estes dados demonstram claramente a capacidade dos oligonucleótidos com várias inserções de 5 36 no meio da sequência, separadas por três bases, para assim discriminar entre dsADN e ssADN. A sensibilidade a combinações imperfeitas foi estudada para triplex e duplexes paralelos com inserção saliente de 5 no meio e na extremidade 5' da sequência (Tabela 2). Em caso de triplexes, a sensibilidade a combinações imperfeitas foi dependente do local de inserção do intercalante. 0 menor valor de ATm = 11,5°C entre triplexes combinados e não combinados foi detetado quando a adenina foi substituída por guanina na cadeia de purina, no local 3' do intercalante (ON6/D3 e 0N11/D3, Tabela 2) . Em todos os outros casos, a queda de Tm ocorreu no intervalo de 14,0-22,0°C. Duplexes paralelos com combinação imperfeita e uma única inserção de 5 foram desestabilizados no intervalo de 8,0-13,0°C, sendo este intervalo mesmo de duplexes paralelos do tipo selvagem de combinação imperfeita. Para efeito de comparação, o duplex não modificado de combinação imperfeita menos sensível mostrou um ATm de 9°C em pH 6,0 ( Tm (ONl / ON15 ) — Tm (ON1 / ON1 8 ) ) ·

Foram estudadas as características luminescentes do TFO com (R)-1-0-[4-(1-pireniletinil)fenilmetil]glicerol (5), sendo que este o TINA mais eficaz para formar triplex e para discriminar combinações imperfeitas em relação ao duplex. A introdução de 5 em oligonucleótidos resultou num espectro de fluorescência caracteristico monomérica, com máximo a 400 e 421 nm, após a excitação a 373 nm (figura 2, curva preta), o que foi semelhante para os dados previamente publicados para 4-[4-(1-pireniletinil)fenil]-1,3-butanodiol inserido no ADN.[18] Em todos os casos foi detetado um deslocamento de 4 nm da fluorescência monomérica após formação de triplex ou duplex. A formação do triplex totalmente combinado levou a um aumento de fluorescência monomérica de aproximadamente 1,5 vezes (Figura 2, ON6/D1) 37 em relação ao 0N6de cadeia simples. Em relação ao triplex não perfeitamente combinados, a intensidade de fluorescência dependeu da sequência do dsADN. Assim, foi detetado um aumento de quase duas vezes para um local de TA (ON6/D2) em comparação com 0N6. Pelo contrário, quando uma base de citosina ou de quanina está mal combinada no dsADN, em relação ao TFO próximo da inserção de 5 (D3 e D4), foi observada uma diminuição de fluorescência monomérica em comparação com o triplex perfeitamente combinado (Fiqura 2) . Especialmente, a guanina deu um grande efeito com intensidade de fluorescência duas vezes inferior para o triplex imperfeitamente combinado ON6/D3. É interessante notar que, foi detetado um aumento considerável no fluorescência monómerica na formação do duplex antiparalelo (ON6/ON16, Figura 4), enquanto que a formação do duplex paralelo (ON6/ON15) resultou em apenas um ligeiro aumento de fluorescência quando comparada com a fluorescência da cadeia única (Figura 4). Quando um segundo resíduo 4-(1-pireniletinil)fenilo apareceu como um vizinho mais próximo em 0N12, a fluorescência monomérica da cadeia única diminuiu aproximadamente três vezes (Figura 4, comparação de 0N6 e 0N12), e uma fluorescência de excimero com um máximo a 50 0 nm e com metade da intensidade da que poderia ser observada para o monómero (Figura 3) . Uma diminuição considerável da fluorescência monomérica e desaparecimento da faixa de excimero foi observada para o mesmo oligo num triplex combinado (Figura 3, ON12/D1). Tal significa que as porções pireno não podiam comunicar umas com as outras, após a ligação ao dsADN no ambiente da hélice tripla. Similarmente, a faixa de excimero desapareceu quando ON12 formou uma dsADN de emparelhamento do tipo Hoogsteen com ON15 (Figura 3). Pelo contrário, foi observada uma intensidade muito alta de fluorescência monomérica e aumento da fluorescência de excimero para o 38 duplex antiparalelo (ON12/ON16), quando comparado com as intensidades de fluorescência de 0N12 de cadeia simples (Figura 4). Tal indica que o contacto entre os dois pirenilas na mesma cadeia foi ainda muito próximo após a formação do dsADN do tipo Watson-Crick, embora este não pareça ser o caso do dsADN do tipo de Hoogsteen. Deste modo, as diferentes propriedades do TINA hélices de tipo Watson-Crick e Hoogsteen reflectiram tanto as propriedades de hibridação como as propriedades de fluorescência. Além disso, os dados de fluorescência para (R)-1-0-[4-(1- pireniletinil)fenilmetil]glicerol (5), como vizinho mais próximo na cadeia rica em pirimidina podem ser resumidos como se segue: 0N12 de cadeia simples: fluorescência média de monómero em 400 e 421 nm e faixa de excímero a 500 nm; 0N12/D1 de triplex paralelo: baixa fluorescência de monómero e sem faixa de excímero; ON12/ON15 de duplex paralelo: fluorescência média de monómero e nenhuma faixa de excímero; ON12/ON16 de duplex antiparalelo: fluorescência alta de monómero e faixa de excímero. A capacidade da estrutura 5 para afetar a estabilidade da hélice tripla paralela ao ser incorporada na parte dúplex de Watson-Crick do triplex é apresentada na Tabela 3. O triplex foi estabilizado em todos os casos quando 5 foi inserido, sob a forma de saliência, na cadeia de pirimidina do duplex (ON1, ON6 e ON9 para D5) quando comparado com o triplex inalterado (ON1/D1). Foram detetados dois estados de transição (Tm = 36,5°C e 55,5°C) para o triplex ON1/D1, na experiência de desnaturação térmica a 373 nm [Xmax de 5], o que correspondeu às fusões do triplex e do duplex, respetivamente. A deteção da fusão por absorvância a 373 nm, indicou que o intercalante estava envolvido tanto na formação do duplex como na do triplex. A inserção de 5, sob a forma de saliências, cadeias de pirimidina Watson-Crick e Hoogsteen, opostos uns aos outros (ON6/D5), não alterou a 39 fusão do triplex quando comparado com um triplex com um intercalante apenas na parte duplex do triplex (0N1/D5). Quando duas porções pireno 5, uma em cada um das cadeias de pirimidina, foram colocados como protuberâncias separadas por três de pares de bases (ON9/D5) , a fusão triplex foi muito próxima do estado de transição do duplex, que também foi observado anteriormente para a incorporação dupla de 5 em TFO. A diminuição da estabilidade triplex e duplex paralelo, em comparação com os complexos não modificados foi observada quando o composto 5 foi inserido na cadeia de purina como uma protuberância (0N1 para D6 e para 0N21).

Estudou-se também a afinidade de hibridização do TINA possuindo 5 para sequências mistas de purina/pirimidina de ssADN e ssARN em duplex do tipo Watson-Crick (Tabela 4), utilizando a mesma sequência e as condições, como foram descritas para INA. Foi observada uma desestabilização considerável de TINA/ADN (ATm na gama de-8,0°C a-15,5°C) e TINA/ARN (ATm =-10,0°C) para 5, como uma protuberância no meio da sequência, quando comparado com as hélices duplas de tipo selvagem. A inserção do segundo intercalante 5, como um vizinho mais próximo no ADN (ON24) levou a uma maior desestabilização do duplex (ON24/ON25 e ON24/ON27). A incorporação de 5 em lados opostos em duas cadeias complementares mistas de purina-pirimidina, como o complexo ON23/ON26, resultou num valor Tm de 36,0°C, que foi o mesmo nivel observado para duplexes de TINA/ADN duplexes (ON23/ON25 e ON22/ON26). No entanto, quando INA foi inserido nas mesmas posições nos duplexes de INA/INA, foram menos estáveis (Tm = 43,6°C) do que INA/ADN (Tm = 51,5°C).

As propriedades de fluorescência dos complexos com a porção 4-(1-pireniletinil)fenilo no dsADN de Watson-Crick, como um duplex único ou como parte do triplex, são mostrados nas Figuras 4 a 6. A fluorescência do monómero aumentou 40 consideravelmente quando 5 foi inserido na cadeia de purinas (ssON21), em comparação com a inserção na cadeia de pirimidina (ssON6, Figura 5) . Foi observada uma ligeira diminuição da intensidade de fluorescência quando foram reunidos os triplexes e duplexes com ADN e ssON21 não modificados (dados não apresentados). Foi uma descoberta surpreendente de que a forte sensibilidade da fluorescência de monómeros de 4-(1-pireniletinil)fenilo, em sequências de homopirimidina, mediante a formação de hélices duplas antiparalelas, desapareceu completamente para as sequências mistas (ON23/ON25, ON23/ON27 Figura 6). Isto difere também dos resultados anteriores relatados para inserções salientes de (R)-1-0-(1-pirenilmetil)glicerol, utilizando as mesmas sequências.

Quando dois intercalantes pirenilo 5 foram separados por um par de bases, uma faixa de excimero observada para o ssON24 (Figura 6), não desapareceu após a formação do duplex antiparalelo (ON24/ON25 ON24/ON27 e Figura 6). Esta observação é contrária às observações acima para triplex paralelo e duplex paralelo com a TINA e também é contrário aos resultados previamente obtidos para INA. [9bl A presença da faixa de excimero após formação do duplex antiparalelo tanto nas cadeias de homopirimidina como nas misturas pirimidina/purinas (ON12/ON16 e ON24/ON25, respectivamente), com 5 saliente como vizinhos mais próximos, indica que dois residuos pirenilo foram posicionados muito perto e se comunicam e não foram totalmente incorporados nas interações de empilhamento com pares de base vizinhos do tipo Watson-Crick. Tal também pode explicar a diminuição da estabilidade do duplex antiparalelo na incorporação de 5 sob a forma de uma protuberância. 41

Em seguida, foi verificado se uma ligação de excimero poderia ser formada para os duplex e triplex se dois ou três corantes fossem colocados em posições opostas, em cada cadeia complementar correspondente. Nenhuma faixa de excimero foi observada em ambos os duplex paralelo ON21/ON6 (figura 5) ou duplexes antiparalelos ON20/ON21 (Figura 5) e ON23/ON26 (Figura 6). Este resultado correlaciona-se com o trabalho que mostra que, quando 4-[4-(1-pireniletinil) fenil]-1,3-butanodiol foi posicionado em lados opostos nas cadeias complementares de dsADN antiparalelo com sequências mistas. Apenas foi detetada uma fraca faixa de excimero a 500 nm para o triplex com três porções de 4-(l-pireniletinil)fenilo, colocados em lados opostos em todos os três componentes (ON6/D7, Figura 5). A conclusão é que a comunicação das porções 4-(1-pireniletinil)fenilo, posicionadas em diferentes cadeias dos duplexes paralelos e antiparalelos e triplex paralelo, é inibida, fazendo com que o fechamento de intercalantes juntamente com a formação excimero improvável, ao contrário do que foi encontrado para INA. Assim, o fechamento de duas porções de pireno do INA, situados em lados opostos em um duplex foi observado em uma estrutura de RMN, e esta estrutura duplex levou à formação de uma faixa de excimero a 480 nm, num espectro de fluorescência no estado estacionário após excitação a 343 nm (dados não publicados).

As diferenças nos espectros de fluorescência e propriedades de hibridação dos dois pireno diferentes que intercalam ácidos nucleicos INA e TINA, em duplexes do tipo Watson-Crick, ilustram claramente a consequência da adição de uma porção extra de 1-feniletinil à parte aromática de (R)-l-O-(1-pirenilmetil)glicerol (INA). Por esse trabalho, demonstrou-se também que o significado comum da pobre afinidade do pireno por triplex não é uma caracteristica geral, porque conseguiu-se posicionar adequadamente o 42 pireno no triplex do tipo de Hoogsteen. É conhecida a capacidade dos intercalantes para estabilizar estruturas triplex paralelas com apenas pouca influência sobre a estabilidade do dsADN. Assim, a adição de 2-(2-naftil)-quinolin-4-amina e os seus análogos conduzem a uma estabilização considerável de ADN triplex [ATm = 35,6°C para 2-(2-naftil)-quinolin-4-amina], com apenas um pequeno aumento da afinidade de hibridação do ADN duplex (ATm = 5,5°C). Um trabalho semelhante relatou a síntese e propriedades de hibridação de oligodesoxinucleótidos com perileno acoplado diretamente ou através de um ligante propilo na posição anomérica de um resíduo de 2’-desoxirribose. Uma das vantagens da TINA com porções policíclicas sobre triplex monomérico intercalantes específicos é que TINA pode ser inserido várias vezes para as posições desejadas da sequência em vez de utilizar o excesso de intercalante na solução. Além disso, a elevada estabilização de triplex e duplex paralelo, em conjunto com a desestabilização de cadeias duplas antiparalelas, como descrito aqui para TINA, nunca foi observado para outros sistemas de intercalação covalentemente ligados aos oligodesoxinucleótidos. Neste contexto, TINA quando incorporado como inserções salientes múltiplas em oligodesoxinucleótidos, é uma molécula única com a capacidade de discriminar dsADN e ssADN. Esta caracteristica é claramente evidente para 0N13 e 0N14 quando a estabilidade de seus triplex e duplex antiparalelo é comparada em pH 6,0 e pH 5,0 (Tabela 1) . Isto abre a possibilidade de reduzir o número de falsos positivos provenientes da formação de dúplex em que a formação triplex paralelo deve ser detetada. Tal poderia, por exemplo, ser o caso para a hibridação por fluorescência in situ (FISH) em genomas, em condições não desnaturantes e para a purificação de ADN de plasmídeo utilizando cromatografia de afinidade de hélice tripla ou precipitação 43 de afinidade de hélice tripla, que podem ser realizados a pH 6,0, ou pH 5.0. Este tipo de discriminação de formação de triplex paralela sobre a formação de duplex não pode ser conseguida com triplex formando os oligos, como PNA, LNA ou Ν3'^·Ρ5' f osf oramidatos que também são conhecidos por estabilizar os duplexes antiparalelos.

Utilizando a modificação pós-sintética do tipo Sonogoshira de oligonucleótidos que possuem (R)-1-0-(4-iodofenil) metilglicerol, analisou-se vários ácidos nucleicos intercalantes retorcidos (TINA), quanto à sua capacidade para aumentar a estabilidade térmica de duplexes triplexes com pares do tipo Hoogsteen. Foi constatado que a inserção de (R)-1-0-[4-(1-pireniletinil)fenilmetil]glicerol (5), como uma protuberância, em oligodesoxinucleótidos dava origem ao TINA mais eficaz com boas propriedades de discriminar entre as sequências combinadas e desencontradas. Os duplexes ADN/ADN e ADN/ARN do tipo Watson-Crick desestabilizaram-se quando o TINA foi inserido no meio da sequência, em comparação com duplexes nativos. Acreditou-se que o TINA é o primeiro sistema de intercalação covalentemente ligado a oligodesoxinucleótidos, como uma protuberância, mostrando um aumento de afinidade para emparelhamento de bases do tipo de Hoogsteen e diminuição da afinidade para hélices de tipo Watson-Crick. A via sintética curta para o fosforamidito 8 e a modificação pós-sintética Sonogashira de oligonucleótidos são vantagens competitivas de TINA em relação a outros ácidos nucléicos que estabilizam triplexes. A partir do estudo de inserções duplas de TINA (5) em uma cadeia, concluiu-se que a colocação de três nucleobases entre os dois (R)-1-0-[4-(1-pireniletinil)fenilmetil]glicerol salientes pode ser ideal para uma elevada estabilidade térmica de hélices de ADN do tipo Hoogsteen. Por outro lado, as diferentes propriedades 44 de luminescência (formação da faixa de excimero), na inserção de 5, como os vizinhos mais próximos da saliência na sequência de ADN de pirimidina, poderiam ser utilizadas para a deteção de formação de triplex paralelo, dsADN paralelo e dsADN antiparalelo. 0 aumento da estabilidade térmica no intervalo de 12-19°C para TINA com uma única inserção saliente 5 pode ser aplicado para reduzir o comprimento requerido do TFO. Por outro lado, a boa estabilidade térmica para duplexes e triplexes do tipo de Hoogsteen pode ser obtida a pH 7,0, mesmo na presença de várias citocinas na sequência (até 36% no presente trabalho). As inserções múltiplas de 5 podem ser utilizadas para aumentar a temperatura de fusão dos duplexes de Hoogsteen menos estáveis para o nivel de duplexes de Watson-Crick com o mesmo comprimento, em condições adequadas (sequência, f, concentração de sal, etc.) Considerando o desenvolvimento de bases nucléicas modificadas com alta afinidade para locais de inversão de C-G e A-T em dsADN, juntamente com triplexes de cadeias alternadas, acredita-se que tais melhorias de formação triplex vão expandir a aplicabilidade de TINA. A capacidade para estabilizar o triplex na inserção de 5 para as cadeias da pirimidina de oligodesoxinucleótidos circulares ou fixação de ssADN e ssARN alvo é também uma possibilidade óbvia. Como um próximo passo, os estudos são dedicados à influência da inserção de TINA e INA na estabilidade de hélices de ácidos nucleicos diferentes dos complexos clássicos de Watson-Crick e Hoogsteen. Assim, ainda há uma disponibilidade limitada de análogos de ácidos nucleicos que podem estabilizar o emparelhamento reverso de bases do tipo Hoogsteen, i-motivo (pares de bases C-C+) ou quadruplexes (sequências ricas em G) . Acreditamos que a capacidade de TINA para estabilizar triplex e duplexes paralelos, juntamente com a discriminação de hélices de ácidos nucléicos do tipo Hoogsteen sobre as do tipo Watson- 45

Crick podem tornar o TINA muito útil na construção de ferramentas baseadas em ADN em bio e nanotecnologia, onde um reconhecimento especifico, a elevada estabilidade térmica e auto-organização ou reorganização são vitais.

Tabela 1: Dados de Tm [°C] para a fusão de triplex e duplex, retirados a partir de curvas de UV-fusão (λ = 260 nm) 7° Triplex3 Duplex Paralelo13 jDuplex Antiparalelo0 3'-CTGCCCCTTTCTTTTTT 5'- 7'-GGGGAAAGAAAAAA 5'-GACGGGGAAAGAAAAAA (Dl) GACGGGGAAAGAAAAAA :j (ΟΝ 1 6) (ON15) | | pH 5, 0 pH 6, 0 17,2 pH ijpH 5,0 ! 6, 0 |pH |pH ilpH 7,2 15, 0 | 6, 0 | íONI 5'- | CCCCTTTCTTTTTT 55, 0e 27, 0 |<57o 2 9, 5 119 j47, 0 148,Õ!47,0 |ON2 15 ' - jcCCCTTITCTTTTTT _1 15,0 [<57θ -1 |<5,0 P 14 0,5 p | ON3f j 5 ' - |CCCCTT2TCTTTTTT "~Z 26, 0 |<5, 0 I-1 142,0(-1 |ON4 ' 5'- fCCCCTT3TCTTTTTT 26, 0 |<5, 0 -1 17,0 I-1 (40,01-1 |0N5f 15 ' - |CCCCTT4TCTTTTTT 57,0 35, 0 j-·— 33 , 5 (22,0 |44,5|45, 0(46,0 ON6 |5' -

ÍCCCCTT5TCTTTTTT 59, 0e |28,0 42,0 45, 5 f,g

SCCCCTT'TC5TTTTTT

SCCCCTTT5CTTTTTT ON9g 15'·

ICCC5CTTTCTTTTTT ON10f ON1 lg ΟΝ12λI5'— |CCCCTT5T5CTTTTTT ΟΝ13λ \ 5'-

j 5 ' - ! SCCCCTTTCTTTTTT

5'- 5CCCCTT5TCTTTTTT 61,0 65, 5e 55, 5e 59, 5é 46, 0 3 9, 5 4 2,5 4 1,0 4 4,5 57, 0d 40, 0 56, 5e 121,5 |26, 0 |24, Õ 12 Õ, 5 13 5, 5 |<5, 0 14 0, 0 46, 0 53, 5 37,0 4lTo 33, 5 30, Õ 2 8,0 31,5 36, 0 45, 5 |44,0 |46, 5 |44,5 (45” 0 14 5, b M97b|53”o ]46, 5 j47,0 26, 5 137,5 |41,0 38,0 Í44,5 [liTÕ 52,0 4 6, 5 41, 04277 46 46 )N° |Triplexa ÍDuplex Paralelo^ iDuplex Antiparaleloc | |CCCCT5TT5CTTTTTT1 | | 1 j | | j IΟΝ 14* 15 ' - .................................í 63^ 0' Ts6^ 5;' í43, "Õ'jj 4 5™ 5 ]3870']4275 [4 ΐ^ο'[3 g ^ q ÍCCCCTT5TCT5TTTTT! | I ) j I I j [a] c = 1,5 μΜ de ON1-14 e 1,0 μΜ de cada cadeia de dsADN (Dl) em cacodilato de sódio 20 mM, NaCl a 100 mM , MgCl2 a 10 mM, pH 6,0 e 7,2; duplex Tm = 5 6,5 (pH 5,0), 58,5°C (pH 6,0) e 57,0°C (pH 7,2); [b] c = 1,0 μΜ de cada cadeia em cacodilato de sódio a 20 mM, NaCl a 100 mM , MgCl2 a 10 mM, pH 6,0 ou pH 5,0; [c] c = 1,0 μΜ de cada cadeia em cacodilato de sódio a 20 mM , NaCl a 100 mM, MgCl2 a 10 mM, pH 6,0 ou pH 5,0; [d] terceira cadeia e fusão de duplex sobreposto. O estado de transição com Tm = 54,5°C foi determinado em 373 nm; [e] A terceira cedeia e fusão de duplex sobreposto; [f] Preparado por mistura de reação Sonogashira: Pd(PF3)2Cl2 (7,5 mM) , o acetileno correspondente (22,5 mM) , Cul (7,5 mM) , DMF/Et3N seco (3,5/1,5; 500 pL) , 3h; [g] Preparado por mistura de reação

Sonogashira: Pd(PF3)4 (7,5 mM) , o acetileno correspondente (22,5 mM) , Cul (7,5 mM) , DMF/Et3N seco (3, 5/1,5, 500 pL) , 3h; [k] Preparado por tratamento duplo com mistura de reação de Sonogashira: Pd(PF3)4 (7,5 mM) , 1-etinilpireno (22,5 mM) , Cul (7,5 mM) , DMF/Et3N seco (3,5/1,5, 500 pL) , 3h; [I] não determinado.

Tabela 2: Dados de Tm [°C] para fusão de triplex paralelo mal combinado [a] e duplex paralelo[b], retirados de curvas de UV-fusão (λ = 260 nm), pH 6,0. j Seguência i3'-CTGCCCCTTXCTTTTTT ÍD1: | D2 : ÍD3: ;D4: | i 5'-GACGGGGAAYGAAAAAA jx · Y= T-A |X-Y= A-T ;c -G G -c j 0N1 TF· 1 -CCCCTTTCTTTTTT 12 7,0 |<5, 0 |<5,0 i<5,0 ! |0N6 J5' -CCCCTT5TCTTTTTT 27,"c j 0N8 i 5 ' -CCCCTTT5CTTTTTT |42,5 2 8,5 Ϊ26, 5 26, 5 | ÍON10 ] 5' -5CCCCTTTCTTTTTT 14 4,5 : 2 2,5 í 2 7, 0.....Í2 8, 0 ! 47 47 Sequência fONll [ 5 -5CCCCTT5TCTTTTTT 57,0 LO O ] 4 5, 5 O Cs] ON15 |0N17 [0N18 |θΝ19 |5'-GACGGGGAAYGAAAAAA Y=A |t [g jc fONl [ 5 -CCCCTTTCTTTTTT 19, 0 i<5, 0 110,0 j<5, 0 ]ON6 Ί5' -CCCCTT5TCTTTTTT 33,5 ~~ 121,5 [20,5 (20,5 |ON8 [5 -CCCCTTT5CTTTTTT 28,0 (2:0,0 ~ 118,5 (2:0,0 [a] c = ϊ,5 μΜ de 0ΝΪ-Ϊ4 e 1,0 mM de cada cadeia de dsADN em cacodilato de sódio a 20 mM, NaCl a 100 mM, MgCl2 a 10 mM, pH 6,0; [b] c = 1,0 μΜ de ON1-14 e 1,0 μΜ da cadeia de purina.

Tabela 3: Dados de Tm [°C] para fusão de triplex paralelo[al, para inserções de 5 na sequência do duplex de Watson-Crick, retirados a partir de curvas de UV-fusão (λ = 260 nm) , pH 6,0. As fusões também são fornecidas para duplexes paralelos[b], com a inserção de 5 na cadeia de purina.

[Sequência [Triplex Duplex [ Paralelo [ ! Dl | D5 : ί D6 : [1)7 : ON15 ON21 ! [3'- i Ictgccccttstctt | |ΤΤΤΤ (ON20) [c] 3'- CTGCCCCTTTCT T T T T T ON20/O \ [ j :¾ 5'- GACGGGGAA5AG AAAAAA (0N21) [d] N21 \ [ ! 15' - i ígacggggaaagaaa [ AAA | i |0N1 5'- [27, [38,0 CCCCTTTCT[0 | T T T T T * ' 24,0 27,0 19,0 [14,0 [0N6 5'- [46, [38,0 CCCCTT5TC [ 0 | TTTTTT s ' 27,5 31,5 33,5 [26,5 Í0N9 5 ' - [41 , j52,5 ; CCCSCTTTCÍ0 | T T T T T : ^ 41,5 [43,5 31,5 [29, 0 [ 48 [a] c = 1,5 mM de 0N1, 0N6, 0N9 e 1,0 μΜ de cada cadeia de dsADN em cacodilato de sódio a 20 mM, NaCl a 100 mM, MgCl2 a 10 mM, pH 6,0, duplex TM = 55,0°C (D5) , 56,0°C (D6) , 57,0 °C (D7) ; [b] c = 1,0 μΜ de ON1, ON6, ON9, ON15 e ON21 em cacodilato de sódio a 20 mM, NaCl a 100 mM, MgCl2 a 10 mM, pH 6,0; [c] Preparado por mistura de reação

Sonogashira: Pd(PF3)4 (7,5 mM) , 1-etinilpireno (22,5 mM) ,

Cul (7,5 mM) , DMF/Et3N seco (3,5/1,5, 500 pL) , 3h; [d]

Preparado por tratamento duplo com mistura de reação de Sonogashira: Pd(PF3)4 (7,5 mM) , 1-etinilpireno (22,5 mM) ,

Cul (7,5 mM) , DMF/Et3N seco (3,5/1,5, 500 pL) , 3h; [d] terceira cadeia e fusão de duplex sobreposto.

Tabela 4: Dados de Tm [°C] para fusão de duplex antiparalelo[a], retirados a partir de curvas de UV-fusão (λ = 260 nm). !n° ] ÍON25 ON2 6[bl ÍON27 : í ADN ADN ÍARN ; | 15' — íAGCTTGCTTGAG 5'- AGCTTG5CTTGAG ! 5' — jAGCUUGCUUGAG ON22 13'-j Itcgaacgaactc LO 1> 32,0 LO O |ON23[b] 13 ' - ! |tcgaacsgaactc !3 9, 5 36, 0 13 0,5 ON24 |3'- ! 1TCGAAC5G5AACTC Ϊ34, 0 22,5 ] 2 5, 0 j[a] c = 1,0 μΜ de cada oligonucleótido em NaCl a 140 mM, \ jtampão de fosfato de sódio a 10 mM, EDTA a lmM, pH 7,0; [b] \ iMistura de reação Sonogashira: Pd(PF3)4 (7,5 mM), 1- \ ietinilpireno (22,5 mM), Cul (7,5 mM), DMF/Et3N seco \ |(3,5/1,5, 500 pL), 3h; [c] O tratamento duplo com mistura de \ jreação de Sonogashira: Pd(PF3)4 (7,5 mM), 1-etinilpireno j 1(22,5 mM ), Cul (7,5 mM) , DMF/Et3N seco (3, 5/1,5, 500 pL) , j ! 3h. | 0 espectro de RMN foi registado num espectrómetro Varian Gemini 2000 a 300 MHz para o 1H e 75 MHz para 13C padrões internos, usados em espectros de 1H RMN, sendo TMS (5:0,00) para CDC13; em 13C RMN, sendo CDC13 (5:77,0) . As 49 determinações precisas da massa de iónica foram realizadas utilizando o espectrómetro de massa 4.7 Tesla Ultima Fourier transform (FT) (Ion Spec, Irvine, CA). Os picos dos iões [M + Na]+ foram combinados utilizando iões derivados da matriz de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico. Foram conduzidas análises de cromatografia de camada fina (TLC), com a utilização de placas de TLC de 60 F254 adquiridas da Merck e foram visualizadas sob uma luz UV (254 nm). O gel de silica (0,040-0,063 mm) utilizado para a cromatografia de coluna foi adquirido da Merck. Os solventes utilizados para a cromatografia em coluna foram destilados antes da sua utilização, enquanto que os reagentes foram utilizados tal como adquiridos.

Exemplo 2

Preparação de (S)-1-(4,4'-dimethoxitrifenilmetiloxi)-3-(4-iodobenziloxi)-propan-2-ol (S)-(+)-2,2-Dimetil-l,3-dioxolano-4-metanol (6; 1,17 g, 8,9 inmol) e brometo de 4-iodobenzil (2,5 g; 8,4 mmol) foram submetidos a refluxo em condições de Dean-Stark em tolueno (80 mL) na presença de KOH (8,8 g, 154,0 mmol) durante 12 h. A mistura de reação foi deixada a arrefecer e foi adicionada H20 (30 mL). Depois da separação das fases, a fase aquosa foi lavada com tolueno (2 x 15 mL) . As fases orgânicas combinadas foram lavadas com H20 (30 mL) e concentradas em vácuo. O resíduo foi tratado com AcOH a 80% aq. (25 mL) durante 48 h à temperatura ambiente. O solvente foi removido em vácuo e o resíduo foi co-evaporado duas vezes com tolueno/EtOH (30 mL, 5:1, v/v) . O resíduo foi seco sob pressão reduzida para se obter (R)-3-(4-iodobenziloxi)propano-1,2-diol (7, 100%; 2,3 g) como um óleo amarelado que foi utilizado no passo seguinte sem purificação adicional. 50

Este óleo (2,3 g; 8,4 mmol) foi dissolvido em piridina anidro (25 mL) e cloreto 4,4'-dimetoxitritilo (3,5 g; 10,4 mmol) foi adicionado sob azoto. Após 24 h, MeOH (2 mL) seguido por EtOAc (150 mL) foram adicionados e a mistura foi extraída com NaHC03 aquoso saturado (40 mL x 2). A fase aquosa foi extraída com EtOAc (20 mL x 2) . As camadas orgânicas combinadas foram secas (Na2S04), filtrou-se e evaporou-se sob pressão reduzida. O resíduo foi co-evaporado duas vezes com tolueno/EtOH (25 mL, 1:1, v/v) . O resíduo foi adsorvido em gel de sílica (1,5 g) a partir de EtOAc (30 mL) e purificado utilizando cromatografia a vácuo em coluna seca com EtOAc (0-30 % /v) em éter de petróleo para se obter o composto (S)—l—(4,4'— dimetoxitrifenilmetiloxi)-3-(4-iodobenziloxi)propano-2-ol (70%, 3,6 g) como uma espuma amarela. 1H RMN (CDC13) δ 2,42 (br. s. , 1H, OH); 3,20 (m, 2H, CH (OH) CH2OCH2) ; 3,56 (m, 2H, CH20DMT) ; 3,78 (s, 6H, 2 x 0CH3) ; 3,97 (m, 1H, CHOH) ; 4,43 (s, 2H, CH2Ar) ; 6,78 (d, 4H, J = 8,5 Hz, DMT) ; 7,00 (d, 2H, J = 8,0 Hz, iodofenil) ; 7,30-7,45 (m, 9H, DMT); 7,63 (d, 2H, J = 8,0 Hz, iodofenil); 13C RMN (CDC13) 55,2 (OCH3) ; 62,2 (CH2ODMT) ; 69,9 (CH (OH) CH2OCH2) ; 71,6 (CHOH); 72,6 (CH2-iodofenil) ; 86,1 [C(Ar)3]; 93,1; 129,4; 137,4; 137,7 (iodofenil); 113,1; 126,7; 127,8; 128,1; 130,0; 135,9; 144,7; 158,5 (DMT). HR-MALDI-MS calculado para C3iH3iI05Na [M + Na]+ m/z 633,1108, encontrado m/z 633,1116.

Exemplo 3

Preparação de (S)-2-0-[2-cianoetoxi(diisopropilamino) fosfina]-l-0-(4,4'-dimetiltrifenilmetil)-3-0-(4-iodobenzil)glicerol (composto 8 no esquema 2) (S)-1-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetiloxi)-3-(4-iodobenziloxi) propano-2-ol (2,0 g, 3,3 mmol) foi dissolvido sob azoto em 51 CH2C12 anidro (50 mL) . N,N-diisopropilamónio tetrazol (0,850 g, 5,0 mmol) foi adicionado, seguido pela adição gota a gota de tetraisopropilfosfordiamidato 2-cianoetil (1,1 g, 3,7 mmol) sob arrefecimento externo com banho de gelo. Após 16 h, a análise por TLC mostrou não haver mais nenhum material de partida e a reação foi extinta com H20 (30 mL) . As camadas foram separadas e a fase orgânica foi lavada com H20 (30 mL) . As camadas aquosas combinadas foram lavadas com CH2C12 (25 mL) . A fase orgânica foi seca (Na2S04) , filtrada, gel de silica (1,5 g) e piridina (0,5 mL) foram adicionados e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado utilizando cromatografia de gel de sílica a vácuo em coluna seca com NEt3 (0,5%, v/v)/EtOAc (0-25%)/éter de petróleo. As frações combinadas de UV-ativos foram evaporadas em vácuo para se obter o composto final 8 (1,8 g, 67%) como uma espuma que foi utilizada na síntese de ODN. 32P RMN (CDC13) δ 149,8, 149,9, em proporção de 1:1. HR-ESI-MS calculado para C4oH46l06N2PLi [M + Li]+ m/z 817,2449, encontrado m/z 817,2447.

Exemplo 4

Preparação de (R)-1-0-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-3-0-[4-(1-pireniletinil)fenilmetil]glicerol À solução de (R)-3-(4-iodobenziloxi)propano-1,2-diol (4,2 mmol) em DMF (40 mL), Et3N (5,8 mL) foi adicionado e efetuada a passagem de Ar através da solução durante 30 min. Em seguida, 1-etinilpireno (1,05 g, 4,65 mmol) foi dissolvido, sob Ar e Cul (56 mg, 0,3 mmol) e Pd(PF3)4 (125 mg, 0,11 mmol) foi adicionado à solução. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente, sob Ar, durante a noite, seguido por adição de CH2C12 (150 mL) e a extracção com solução aquosa a 0,3 M de sal de amónia de 52 EDTA (2x75mL). A camada orgânica foi lavada com H20 (3 x 75 mL) , seca (Na2S04) , filtrada e evaporada em vácuo até à secura. 0 residuo foi co-evaporado duas vezes com tolueno/EtOH (30 mL, 1:1, v/v), originando 1 — 0— [4— (1 — pireniletinil)fenilmetil]glicerol como um óleo (3,1 g) . 0 óleo foi co-evaporado com piridina (20 mL) e depois dissolvido em piridina anidro (50 mL), arrefecido em banho de gelo e foi adicionado cloreto de 4,4'-dimetoxitritilo (1,45 g, 4,41 mmol) , sob Ar. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas e depois uma porção adicional de cloreto de 4,4'-dimetoxitritilo (0,5 g, 1,5 mmol) foi adicionado. Após 24 horas, a TLC não mostrou a presença de material de partida e a mistura de reação foi arrefecida por meio de MeOH (2 mL), diluida com EtOAc (150 mL) e extraida com NaHC03 aquoso saturado (100 mL x 2). A fase aquosa foi extraida com EtOAc (50 mL x 2). As camadas orgânicas combinadas foram secas (Na2S04) , filtradas e evaporadas sob pressão reduzida. O residuo foi co-evaporado duas vezes com tolueno/EtOH (25 mL, 1:1, v/v). O residuo foi adsorvido em gel de silica (2,0 g) a partir de EtOAc (50 mL) e purificado por cromatografia a vácuo em coluna seca com EtOAc (0-100 %, v/v) e ciclo-hexano, para se obter (S)-1-0-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-3-0-[4-(1-pireniletinil)fenilmetil]glicerol. (60%, 1,75 g) como uma espuma amarela. 2Η RMN (CDC13) δ 2,48 (d, 1H, J = 5,0 Hz, OH), 3,24 (m, 2H, CH (OH) CH2OCH2) , 3,31 (m, 2H, CH2ODMT) , 3,78 (s, 6H, 2 x OCH3) , 4,00 (m, 1H, CHOH) , 4,58 (s, 2H, CH2Ar) , 6,80 (d, 4H, J = 8,5 Hz, DMT) , 7,10-7,45 (m, 11H, DMT), 7,72 (d, 2H, J = 8,0 Hz, fenilo), 8,00-8,30 (m, 9H, pireno-l-il) , 13C RMN (CDC13) 55,2 (OCH3) , 64,3 (CH2ODMT) , 70,0 (CH(OH)CH2OCH2) 71,7 (CHOH), 72,9 (CH2-fenilo) , 86,1 [C (Ar) 3] , 88,7, 94, 9 (C=C) , 117,7, 127,7, 138,5, 139,4 (fenilo), 113,1, 124,5-131,8, 136,0, 144,8, 158,5 (DMT, pirenl-il) . HR-MALDI-MS: m/z calculado para C49H4oNa+05 [M + Na]+ 731,2768, encontrado 731,2739. 53

Exemplo 5

Preparação de (R)-2-0-[2- cianoetoxi(diisopropilamino)fosfino]-1-0-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-3-0-[4-(1-pireniletinil)fenil-metil] glicerol 0 composto foi preparado utilizando o mesmo procedimento como para o composto 8, utilizando (R)-1-0-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-3-0-[4-(1- pireniletinil)fenilmetil]glicerol (1,7 g, 2,4 mmol), N,N-diisopropilamónio tetrazol (0,620g, 3,6 mmol), 2-cianoetilo tetraisopropilfosfoamidato (1,150 g, 3,8 mmol), CH2CI2 anidro (50 mL) durante 24 h. 0 composto final foi obtido (1,8 g, 83%) como uma espuma que foi utilizada na sintese de 0DN. 32P RMN (CDC13) δ 150,3, 150,5, em proporção de 3:2. HR-MALDI-MS: m/z calculado para C58H57N2Na+06P [M + Na] + 931,3846, encontrado 931,3814.

Exemplo 6

Sintese e purificação de TINAS utilizando abordagem pós-sintética ODNS foram sintetizados num sistema de sintese de Ácido Nucleico Expedite Modelo 8909 da Applied Biosistems, utilizando 4,5-dicianoimidazol como um ativador e um tempo aumentado sem proteção (100 segundos) e o tempo de acoplamento (2 min) para a solução de 0,075 M fosforamidato 8 numa mistura 1:1 de MeCN/CH2Cl2 seco. Após a sintese de ADN, as colunas com suportes de CPG e oligonucleótidos em DMT, possuindo porções 4-iodofenil foram lavados com árgon (2 min) antes da reação de acoplamento. A mistura do 54 reagente de acoplamento de Sonogashira, contendo Pd(PF3)4 ou Pd(PF3)2Cl2 (7,5 mM) , uma estrutura aromática possuindo um acetileno terminal (22,5 mM), e Cul (7,5 mM) em DMF/Et3N seco (3,5/1,5, 500 mL) foi preparada em 1 mL de seringa de plástica em condições secas à temperatura ambiente. As seringas foram também lavadas com árgon antes da utilização. A seringa com uma mistura de reagente de acoplamento de Sonogashira foi ligada à coluna com o CPG e outra seringa vazia foi ligada a partir de outro lado da coluna. O suporte de CPG, com oligonucleótido modificado foi lavado com a mistura de reação várias vezes, através de seringas. Após cada 45 min, a última operação foi repetida. Após 3-4 h, a mistura de reação foi removida do suporte e as colunas foram lavadas com DMF (2 x 0,5 mL) e CH3CN (2 x 1 mL) e secas. Em casos de ON12-ON14, ON21 e 0N24, os suportes de CPG foram tratados mais uma vez com mistura de reação de acoplamento de Sonogashira recém preparada. Depois, os oligonucleótidos em DMT na 5' foram clivados e separados do suporte sólido (temperatura ambiente, 2h) e mantido sem proteção (55°C, durante a noite) utilizando amónia aquosa a 32%. A purificação de TINAS em 5'-O-DMT foi realizada utilizando um HPLC em fase reversa semipreparativa em coluna Xterra™ MS Ci8 da Waters. A prteção, conferida por DMT, foi retirada dos ODNs com 100 pL de ácido acético aquoso a 10% (30 min), diluida com amónia aquosa a 32% (1 mL) e purificado de novo por HPLC. As frações correspondentes a ODNs foram evaporadas, diluídas com NaOAc aquoso a 1M (150 mL) , e os ODNs foram precipitados a partir de etanol (550 pL). Os ODNs alterados foram confirmados por análise de MALDI-TOF em Voyager Elite Biospectrometry Research Station da PerSeptive Biosistems. A pureza dos TFOS finais foi verificada por cromatografia de permuta iónica, utilizando o sistema LaChrom da Merck Hitachi em coluna GenPak-Fax (Waters). 55

Exemplo 7 Síntese e purificação de TINAs utilizando (R)-2-0-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfino]-1-0-(4,4 ' -metiltrifenilmetil)-3-0-[4-(1-pireniletinil)fenil-metil]glicerol

Os ODNs foram sintetizados num sistema para a síntese de Ácido Nucleico Expedite™ Modelo 8909 da Applied Biosistems, utilizando 4,5-dicianoimidazol como um ativador e um tempo sem proteção aumentado (100 segundos) e o tempo de acoplamento (2,5 min) para uma solução a 0,075 M do referido fosforoamidato nuam mistura 1:1 de MeCN/CH2Cl2 seco. Depois de concluída a síntese de ADN, os oligonucleótidos em DMT em 5' foram clivados e separados do suporte sólido (temperatura ambiente, 2h) e mantidos sem proteção (55°C, durante a noite) utilizando amónia aquosa a 32%. A purificação de TINAs em 5'-O-DMT foi realizada utilizando um HPLC de fase reversa semi-preparativo em coluna Xterra™ MS C18 da Waters. A proteção conferida por DMT foi retirada dos ODNs em 100 mL de ácido acético aquoso a 80% (30 min), diluído com NaOAc 1M aq. (150 yL) e precipitados a partir de etanol (550 yL). Os ODNs alterados foram confirmados por análise de MALDI-TOF num Voyager Elite Biospectrometry Research Station de PerSeptive Biosystems. A pureza dos TFOS finais foi verificada por cromatografia de permuta iónica utilizando o sistema LaChrom da Merck Hitachi em coluna GenPak-Fax (Waters).

Exemplo 8

Medições da temperatura de fusão

As medições da temperatura de fusão foram realizadas num espectrómetro UV/VIS Lambda 35 da Perkin-Elmer, equipado 56 com um programador de temperatura 6-PTP. Os triplex foram formados misturando primeiro as duas cadeias do duplex de Watson-Crick, cada uma a uma concentração de 1,0 μΜ em solução tampão correspondente. A solução foi aquecida a 80°C durante 5 min, arrefecida até à temperatura ambiente e a terceira cadeia (TFO) foi adicionada e, em seguida, mantida a 15°C durante 30 min. Os duplexes foram formados por mistura das duas cadeias, cada uma a uma concentração de 1,0 μΜ em solução tampão correspondente, seguido por aquecimento a 70°C durante 5 minutos e depois arrefecer até à temperatura ambiente. A temperatura de fusão (Tm, °C) foi determinada como o máximo dos gráficos do primeiro derivado das curvas de fusão, obtidas através da medição da absorvância a 260 nm contra o aumento da temperatura (1,0°C por 1 min.) 0 aumento da temperatura mais lento de (0,5°C por 1 min) resultou nas mesmas curvas. As experiências também foram realizadas em 373 nm. Todas as temperaturas de fusão estão dentro da incerteza de ± 1,0°C, conforme determinado por experiências repetitivas.

Exemplo 9

Medições de fluorescência

As medições de fluorescência foram realizadas num espectrómetro de luminescência LS-55 de Perkin-Elmer, equipado com um controlador de temperatura Julabo F25. Os triplexes e duplexes foram formados da mesma maneira como para as medições de Tm excepto que, em todos os casos, apenas 1,0 μΜ de TFOS foi usado. Os espectros foram registados a 10°C no tampão de cacodilato de sódio a 20 mM, NaCl a 100 mM, MgCl2 a 10 mM a pH 6,0.

Exemplo 10 57

Análises por MALDI-TOF MS, HPLC de fase reversa (em DMT) de troca iónica (sem DMT) de oligonucleótidos sintetizados lOligonucleótidos\m/z [m/z [M+H]+, ;RP- [IE-HPLC, ! • : , > . _ . :______ > γη 1 i

j [M+H] ', [encontrado(Da) Ihplc, jpureza[dl j \ calculado \Rt $ Ϊ I (Da) $ i (min) [al [ \ |ON2 14490.8 14489,2 Π 5, 1 190% i 1ON3 14489, 1 [4488, 9 |15,2 / 138, l[b] 190% j j ON4 14541,1 )4541,6 116, 2 ) 95% | |θΝ5 .....4518,2 Ϊ15, 8 195% 1 |ON6 14 5 8 9,2 )4589, 2 h 6, 0 ) 96% | i ON7 ! 4 5 8 9, 2 )4593,0 h 6, 1 |93% | |ON8 J458972 )4588,2 f 16,1 "195% I i ON9 4589,2 )4588,2 f 16, 3 ) 97% I ON10 4589,2 )4589, 2 )18,7 ) 9i% I joNll j 5 0 5 4, 6 {5058,9 118, 6 ) 94% [ ÍON12 15054,6 )5060,1 ) 17,4 / !32, 9[c] ) 93% ΐ ÍON13 )5054,6 ] 5 0 5 8, 6 117, 1 )97% | ÍON14 )5054,6 )5058,2 )17,0 |93% { |ON2 0 )5510,8 5513,1 )16,2 195% 1 ON21 )5802,4 )5799, 7 )27,2[c] ) 8 6% i ÍON2 3 )4081,8 14 0 83,ΐ )16,2 18 8 % i ÍON2 4 ^54973 14 5517 2 )17,4 j 91 % .......) ! ON2 6 14143,8 )4143,9 115, 8 ) 85% ) [a] Sistema de cromatografia Delta Prep 4000 da Waters. Tampão A [950 mL de NH4HCO3 a 0,1 M e 50 mL de CH3CN, (pH = 9,0) ] e tampão B [ 250 ml de NH4HCO3 a 0, 1 e 7 50 mL de CH3CN, (pH =9,0)] . Fluxo de 2,5 mL/min. Gradientes: 4 min 100 % de A, gradiente linear até 100 % de B em 11 min, 100% de B em 5 min, em seguida gradiente linear até 100 % de A em 2 min e 100 % de A em 3 min; [b] Sistema Cromatografia preparativa Delta Prep 4000 da Waters, o mesmo tampão como 58 em [a]. Fluxo de 1,0 mL/min. Gradientes: 5 min 100% de A, gradiente linear até 70% de B em 30 min, 2 min, com 70 % de B, gradiente linear até 100% de B em 8 minutos e, depois, 100% de A em 15 min; [c] Sistema Cromatografia preparativa Delta Prep 4000 da Waters. Tampão A [0,05 M de acetato de amónio de trietilo em H20 (pH =7,0)] e tampão B (75% CH3CN em H20). Fluxo de 2,5 mL/min. Gradientes: 2 min 100 % de A, gradiente linear até 70 % de B em 38 min , gradiente linear até 100 % de B em 7 min, 100 % de B em 3 min, e em seguida 100 % de A em 10 min; [d] sistema LaChrom da Merck Hitachi em coluna GenPak -Fax (Waters) . Tampão A [25 mM Tris-HCl, 10 mM de EDTA em H20 (pH =8,0)] e tampão B (NaCl 1 M em H20). Fluxo 0,75 mL/min. Gradientes: 5 min 97% de A e 3% de B, gradiente linear de 35 % de B em 41 min, gradiente linear de 75% B em 3 min e , em seguida, 10 min 97 % de A e 3 % de B.

Listagem de sequências <110> University of Southern Denmark Filichev, Vyacheslav V. Erik, Bjerregaard Nielsen

<120> Formação estável e seletiva de estruturas triplex e duplex do tipo Hoogsteen utilizando ácidos nucleicos torcidos e intercalados (TINA) e processos para a preparação de TINA <130> 40818PC01 <160> 29 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 14 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético 59 <4 Ο 0> 1 cccctttctt tttt 14 <210> <211> <212> <213> 2 15 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> características variadas (7) . . (7) Agente intercalante 1 <4 0 0> 2 ccccttntct ttttt 15 <210> <211> <212> <213> 3 15 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristicas variadas (7) . . (7) Agente intercalante 2 <4 0 0> 3 ccccttntct ttttt 15 <210> <211> <212> <213> 4 15 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> Agente intercalante (7) . . (7) Agente intercalante 3 <22 0> <221> <222> <223> caracteristica variada (7) . . (7) Agente intercalante 3 <400> 4 ccccttntct ttttt 15 60 <210> <211> <212> <213> 5 15 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristica variada (7) . . (7) Agente intercalante 4 <4 0 0> 5 ccccttntct ttttt 15 <210> <211> <212> <213> 6 15 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristicas variadas (7) . . (7) Agente intercalante 5 <4 0 0> 6 ccccttntct ttttt 15 <210> <211> <212> <213> 7 15 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristicas variadas (9) . . (9) Agente intercalante 5 <4 0 0> 7 cccctttcnt ttttt 15 <210> <211> <212> <213> 8 15 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético 61 <22 0> <221> <222> <223> características variadas (8) . . (8) Agente intercalante 5 <4 0 0> 8 cccctttnct ttttt 15 <210> <211> <212> <213> 9 15 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristica variada (4) . . (4) Agente intercalante 5 <4 0 0> 9 cccnctttct ttttt 15 <210> <211> <212> <213> 10 15 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristicas variadas (D .. (D Agente intercalante 5 <4 0 0> - 10 ncccctttct ttttt 15 <210> <211> <212> <213> 11 16 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristicas variadas (D . · (D Agente intercalante 5 <22 0> <221> caracteristicas variadas 62 <222> <223> (8) . . (8) Agente intercalante 5 <4 0 0> 11 nccccttntc tttttt 16 <210> <211> <212> <213> 12 16 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristicas variadas (7) . . (7) Agente intercalante 5 <22 0> <221> <222> <223> caracteristicas variadas (9) . . (9) Agente intercalante 5 <4 0 0> 12 ccccttntnc tttttt 16 <210> <211> <212> <213> 13 16 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristica variada (6) . . (6) Agente intercalante 5 <22 0> <221> <222> <223> caracteristicas variadas (9) . . (9) Agente intercalante 5 <4 0 0> 13 cccctnttnc tttttt 16 <210> <211> <212> <213> 14 16 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético 63 <22 0> <221> <222> <223> caracteristicas variadas (7) . . (7) Agente intercalante 5 <22 0> <221> <222> <223> caracteristica variada (11) · · dl) Agente intercalante 5 <4 0 0> 14 ccccttntct nttttt 16 <210> <211> <212> <213> 15 17 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 15 gacggggaaa gaaaaaa 17 <210> <211> <212> <213> 16 14 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 16 ggggaaagaa aaaa 14 <210> <211> <212> <213> 17 17 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 17 gacggggaat gaaaaaa 17 <210> <211> <212> <213> 18 17 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético 64 <4 Ο 0> 18 gacggggaag gaaaaaa 17 <210> <211> <212> <213> 19 17 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 19 gacggggaac gaaaaaa 17 <210> <211> <212> <213> 20 18 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristica variada (9) . . (9) Agente intercalante 5 <4 0 0> 20 ttttttctnt tccccgtc 18 <210> <211> <212> <213> 21 18 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> <222> <223> caracteristicas variadas (10) .. (10) Agente intercalante 5 <4 0 0> 21 gacggggaan agaaaaaa 18 <210> <211> <212> <213> 22 12 ADN Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético 65 <4Ο0> 22 ctcaagcaag ct 12 <210> 23 <211> 13 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> característica variada <222> (7) . . (7) <223> Agente intercalante 5 <400> 23 ctcaagncaa gct 13 <210> 24 <211> 14 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> caracteristica variada <222> (6) . . (6) <223> Agente intercalante 5 <22 0> <221> caracteristica variada <222> (8) . . (8) <223> Agente intercalante 5 <4 0 0> 24 ctcaangnca agct 14 <210> 25 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 25 agcttgcttg ag 12 <210> 26 <211> 13 <212> ADN <213> Artificial 66 <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <22 0> <221> caracteristica variada <222> (7) . . (7) <223> Agente intercalante 5 <400> 26 agcttgnctt gag 13 <210> 27 <211> 12 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <400> 27 agcuugcuug ag 12 <210> 28 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <400> 28 gacggggaaa gaaaaaa 17 <210> 29 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <400> 29 ctgccccttt ctttttt 17

Claims (22)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um monómero de empilhamento flexível de bases com a estrutura geral X-L-I1-C-I2 em que - X é uma estrutura principal constituída por unidades de monómero que pode ser incorporada à estrutura principal de um oligonucleótido ou de um análogo de oligonucleótido, ou PNA ou análogos de PNA, e em que X compreende alquilenodiol, - L é um ligante que compreende uma cadeia de alquilo, uma cadeia de oxaalquilo, uma cadeia de azaalquilo, uma cadeia de tiaalquilo, grupo carboxamida, um grupo tiocarboxamida, um grupo sulfonamida ou as suas combinações e compreende entre 0-60 átomos, li é um sistema em anel aromático monocíclico ou policíclico selecionado de entre o grupo constituído por benzeno, naftaleno, azuleno e sistemas de anel heteroaromáticos biciclicos, - C é um agente de conjugação selecionado a partir do grupo de alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, alcenilo de 2 a 12 átomos de carbono, alcinilo de 2 a 25 átomos de carbono ou diazóico ou combinações dos mesmos, com um comprimento de não mais do que 25 átomos de carbono e/ou átomos de azoto, - I2 é selecionado de entre o grupo de sistemas de anel aromáticos biciclicos, sistemas de anel aromáticos 2 tricíclicos, sistemas de anel aromáticos tetraciclicos, sistemas de anel aromáticos pentaciclicos e análogos heteroaromáticos dos mesmos ou substituições destes.

2. 0 monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com a reivindicação 1, em que a unidade de comprimento da estrutura principal da unidade monomérica X, incluindo um átomo de fósforo é inferior a 6 átomos, em que a unidade de comprimento da estrutura principal é a distância mais curta a partir de um monómero para o outro.

3. 0 monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o alquilenodiol de X é etilenoglicol ou 1-0-metileneglicerol que, opcionalmente, tem o alquilenodiol parcialmente compreendido num sistema de anel, tal como uma glicona.

4. 0 monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o alquilenodiol de X é etilenoglicol.

5. 0 monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o alquinilo de C é acetileno ou acetilenos repetitivos.

6. Um monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com a reivindicação 1, em que C é selecionado a partir do grupo constituído por cadeia linear ou cadeia ramificada ou anéis aromáticos monocíclicos e substituições destes. 3

7. Um monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o comprimento L é de, pelo menos, dois átomos.

8. 0 monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que 11 é o benzeno.

9. 0 monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que 12 é o pireno.

10. O monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com qualquer das reivindicações precedentes de a fórmula:

em que R é ariletinil.

11. O monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, adaptado para incorporação num oligonucleótido, o referido monómero ser selecionado do grupo de uma fosforoamidita, um fosforodiamidita, um fosfodiester, um fosfotriester, um fosfonato, um H-fosfonato, um fosfito, um clorofosfito, um clorofosfoamidita, um fosfonoamidita, um fosfonocloridita, um trifosfato, um difosfato. 4

12. Um oligonucleótido que compreende o monómero de empilhamento flexível de bases de qualquer uma das reivindicações anteriores.

13. Um método para a preparação de um monómero de empilhamento flexível de bases de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11 compreendendo os passos de: a. fornecimento de um precursor de um monómero de empilhamento flexível de bases, em que o referido precursor é um monómero de empilhamento flexível de bases compreendendo li substituído com um halogénio ou substituído com C ou substituído com azida, b. substituição do halogénio ou do substituinte C ou do substituinte de azida do precursor du passo a. por C-I2, c. adaptação do precursor C-I2 de um monómero de empilhamento flexível de bases para incorporação num oligonucleótido.

14. Um método para a preparação de um oligonucleótido de acordo com a reivindicação 12, que compreende os passos de: a. fornecimento de um monómero de empilhamento flexível de bases adaptado para incorporação num oligonucleótido, b. fornecimento de reagentes padrão para a síntese de oligonucleótidos, 5 c. durante a síntese de oligonucleótido, incorporação de um ou mais monómeros de empilhamento flexível de bases para o oligonucleótido, d. geração de um oligonucleótido que compreende um monómero de estrutura principal flexivel.

15. Um método para a preparação de um oligonucleótido de acordo com a reivindicação 12, que compreende os passos de: a. fornecimento de um precursor de um monómero flexível adaptado para incorporação num oligonucleótido, em que o referido precursor é um monómero de empilhamento flexível de bases compreendendo li substituído com um halogénio ou substituído com C ou substituído com azida, b. fornecendo de reagentes padrão para a síntese de oligonucleótidos, c. durante a síntese de oligonucleótido, incorporação de um ou mais precursores dos monómeros de empilhamento flexível de bases para o oligonucleótido, d. após a síntese do oligonucleótido, o substituinte halogénio ou o substituinte C ou o substituinte azida em li é substituído com C-I2, e. geração de um oligonucleótido que compreende um monómero de empilhamento flexivel de bases.

16. A utilização do oligonucleótido de acordo com a reivindicação 12 para a formação de um ácido nucleico 6 com estrutura de cadeia dupla ou de um ácido nucleico com estrutura triplex.

17. Um método de formação de ácidos nucleicos de cadeia dupla ou ácidos nucleicos de estrutura triplex compreendendo os passos de: a. proporcionar um oligonucleótido de acordo com a reivindicação 12, b. fornecer um ácido nucleico único de cadeia simples ou cadeia dupla, c. incubar o oligonucleótido do passo a. com o ácido nucleico de cadeia simples ou de cadeia dupla do passo b., em condições de formação de estrutura duplex ou triplex, d. formação de um ácido nucleico de cadeia dupla ou de ácido nucleico de estrutura triplex.

18. Um método de acordo com a reivindicação 17, em que a formação de um ácido nucleico de estrutura duplex ou de estrutura triplex é utilizada para a modulação de uma sequência especifica da atividade de um ácido nucleico alvo.

19. Um método de acordo com a reivindicação 17, em que a formação de ácido nucleico de estrutura duplex ou de estrutura triplex é utilizada para a deteção da sequência especifica do ácido nucleico alvo.

20. Um método de acordo com qualquer das reivindicações 18 e 19, em que o ácido nucleico alvo é selecionado de 7 entre o grupo de um gene cromossómico, um mARN, um rARN, um tARN e um microARN.

21. 0 oligonucleótido da reivindicação 12 para utilização como um medicamento.

22. Utilização do oligonucleótido da reivindicação 12 para a preparação de um medicamento.