DE69823324T2

DE69823324T2 - Verbesserte chimäre oligonukleotidvektoren

Info

Publication number: DE69823324T2
Application number: DE69823324T
Authority: DE
Inventors: Alex Andrus; G. Robert KUIMELIS
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2005-02-24
Anticipated expiration: 2018-02-20
Also published as: ATE264864T1; DE69823324D1; EP0931090A1; WO1998039353A1; EP0931090B1; AU6659898A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft chimäre Oligonukleotide, die als Mittel zum Bewirken spezifischer genetischer Veränderungen in einer Ziel-Nukleinsäure, die sich in einem lebenden Organismus befindet, verwendbar sind.
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HINTERGRUND
Es wurde kürzlich festgestellt, dass bestimmte DNA/RNA-chimäre Oligonukleotidmoleküle als Mittel wirksam sind, um spezifische Veränderungen in einer Ziel-Nukleinsäuresequenz, die sich in einem lebenden Organismus befindet, zu bewirken (Cole-Strauss, Kmiec, Yoon). Im Allgemeinen bestehen die chimären Oligonukleotide aus einem einzelnen Oligonukleotidstrang, der ein gebrochenes, Doppel-Haarnadelmotiv annimmt, das durch intramolekulare Watson/Crick-Basenpaarung der Nukleotide, die das Oligonukleotid ausmachen, bestimmt wird. Es wird angenommen, dass das gefaltete Duplexmolekül eine gerichtete Genkorrektur mittels homologer Rekombination und endogene Reparaturmechanismen induziert, wobei die genauen Details davon bis jetzt noch nicht vollständig aufgeklärt wurden (Blackburn, Kornberg, Radman, Watson, Lewin). Eine unerwartete Feststellung ist die ungewöhnliche und unvorhersagbare Stabilität des doppelten Haarnadelmotivs, beobachtet durch thermische Schmelzmessüngen. Solche chimären Oligonukleotide können eine Anwendung als Gentherapiemittel und als Mittel, um transgene Organismen herzustellen, finden.
ZUSAMMENFASSUNG
Die Erfindung betrifft chimäre Oligonukleotide mit verbesserten physikochemischen und biologischen Eigenschaften und Verfahren zur Verwendung solcher chimärer Oligonukleotide.
Es ist eine erfindungsgemäße Aufgabe, chimäre Oligonukleotide mit erhöhter intramolekularer und intermolekularer Duplexstabilität im Vergleich zu bekannten chimären Oligonukleotiden bereitzustellen.
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, chimäre Oligonukleotide mit Strukturen bereitzustellen, die eine Bildung einer intramolekularen und intermolekularen Helix des A-Typs induzieren.
Es ist eine noch weitere erfindungsgemäße Aufgabe, chimäre Oligonukleotide mit erhöhter Beständigkeit gegenüber Nukleaseabbau im Vergleich zu bekannten chimären Oligonukleotiden bereitzustellen.
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, chimäre Oligonukleotide mit erhöhter chemischer Stabilität, Beständigkeit gegenüber Hydrolyse und Abbau im Vergleich zu bekannten chimären Oligonukleotiden bereitzustellen.
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, chimäre Oligonukleotide mit hochgradig stabilen Doppel-Haarnadelkonformationen, wie durch thermische Schmelzmessungen gemessen, bereitzustellen.
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, chimäre Oligonukleotide mit einer erhöhten Transportgeschwindigkeit in eine lebende Zelle im Vergleich zu bekannten chimären Oligonukleotiden bereitzustellen.
Es ist eine noch weitere erfindungsgemäße Aufgabe, chimäre Oligonukleotide bereitzustellen, die eine Signal-, Markierungs- und Detektionsfähigkeit bereitstellen.
In einem ersten Aspekt werden die vorstehenden und andere erfindungsgemäße Aufgaben durch ein chimäres Oligonukleotid mit einem modifizierten Stammanteil erreicht, einschließlich eines oder mehrerer 2'-O-Alkylribonukleotide, 2'- O-Allylribonukleotide, 2'-Allylribonukleotide, 2'-Aminoribonukleotide, 2'-Halogenribonukleotide, 2'-Methoxyethylribonukleotide, 2'-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotide und 2'-O-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotide. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Chimär des ersten Aspekts einen Stammanteil, der ein oder mehrere 2'-O-Methylribonukleotide enthält.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts enthält der modifizierte Stammanteil ein oder mehrere Nukleotide mit einer α-anomerischen Nukleotidbase oder eine Verzweigungsgruppe.
In einer dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts enthält der modifizierte Stammanteil ein oder mehrere carbocyclische Nukleotide.
In einer vierten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts enthält der modifizierte Stammanteil ein oder mehrere modifizierte Internukleotid-Bindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2'-5'-Bindung, invertierter 3'-3'-Bindung, invertierter 5'-5'-Bindung, Methylphosphonat, nicht-verbrückendem N-substituiertem Phosphoramidat, alkylierter Phosphotriester-verzweigter Struktur, 3'-N-Phosphoramidat und Peptidnukleinsäure, PNA.
In einer fünften bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts enthält der modifizierte Stammanteil ein oder mehrere Nukleobasen-Analoga. Solche Nukleobasen-Analoga umfassen 5-Alkylpyrimidin, 5,6-Dihydrouridin, 5,6-Dihydrothymin, 5-Methylcytosin, 5-Propinyluridin, 5-Propinylcytidin, 2-Thiothymin, Isocytosin, Pseudouridin, Isocytidin, 2-Thiouridin, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, 2-Thioguanin, 2-Thioadenin, 2-Thio-7-deazaadenin, Isoguanin, 7-Deazaguanin, Xanthin, 7-Deazaxanthin, Hypoxanthin, 7-Deazaxanthin, 2,6-Diaminopurin, 2,6-Diamino-7-deazapurin und Universalbasen.
Das erfindungsgemäße chimäre Oligonukleotid umfasst ein oder mehrere Schleifenanteile, umfassend nicht-nukleosidische Polymere.
In einer Ausführungsform weist das erfindungsgemäße chimäre Oligonukleotid ein modifiziertes 3'-Ende und/oder modifiziertes 5'-Ende auf. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das 3'-terminale Nukleotid ein 2',3'-Didesoxynukleotid. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform ist das 5'-Ende des Chimärs durch Einbau einer 5'-5'-Bindung, einer 2'-5'-Bindung oder einer Reporter gruppe, vorzugsweise eines Chromophors, eines Fluoreszenzfarbstoffs oder einer chemilumineszierenden Gruppe oder eines chemilumineszierenden Vorläufers davon modifiziert.
In einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße chimäre Oligonukleotid mit einer Konjugationsgruppe konjugiert. In einer Ausführungsform ist die Konjugationsgruppe eine Gruppe zum Erhöhen von intermolekularer Duplexstabilität, einschließlich kleine Furche-Bindemitteln und Interkalatoren. In einer zweiten Ausführungsform ist die Konjugationsgruppe eine Gruppe zum Erhöhen der Detektierbakeit des Chimärs (Hermanson).
In einem zweiten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Einbringen einer spezifischen Abänderung in eine Zielsequenz, die sich in einem lebenden Organismus befindet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Prokaryonten, einer Pflanze und einem Virus. Das Verfahren umfasst die Schritte (i) Einbringen eines erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotids in den lebenden Organismus und (ii) Überwachen der spezifischen Abänderung der Zielsequenz.
In einem dritten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines nicht-menschlichen transgenen Tiers durch Einbringen einer spezifischen Abänderung in eine Zielsequenz des Tiers. Das Verfahren umfasst die Schritte (i) Einbringen eines erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotids in den Pronukleus einer Eizelle oder in eine embryonale Stammzelle und (ii) Überwachen der spezifischen Abänderung der Zielsequenz.
In einem vierten Aspekt umfasst die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Einbringen einer spezifischen Abänderung in eine Zielsequenz.
Diese und andere erfindungsgemäßen Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden mit Bezug auf die nachstehende Beschreibung, Zeichnungen und angefügten Ansprüche besser verstanden werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 Schematische Struktur eines erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotids in dem Doppel-Haarnadelstrukturmotiv
2 2'-Modifikationen der Ribonukleotidgruppen in dem Stammanteil der erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotide
3 α-anomerische Nukleotide und Verzweigungsgruppen in dem Stammanteil der erfindunangsgemäßen chimären Oligonukleotide
4 Carbocyclische Nukleotiede in dem Stammanteil eines erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotids
5 Anbindungen einer modifizierten Internukleotidbindung in dem Stammanteil eines erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotids
6 Internukleotid-Analoga in dem Stammanteil eines erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotids
7 Pyrimidinnukleobasen-Analoga in dem Stammanteil eines erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotids
8 Purinnukleobasen-Analoga in dem Stammanteil eines erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotids
9 Nicht-nukleosidisches Polymer- und "Tetraschleifen"-Sequenz-Polynukleotid-Schleifenanteil eines erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotids (SEQ ID NO: 15–17)
10 Absorptions-Temperatur-Schmelzkurve für ein 68-Nukleotid-Chimär (oberes Feld) und die entsprechende erste Ableitungskurve (unteres Feld) (SEQ ID NO: 17)
11 Zweistufiges Schmelzverhalten eines chimären Oligonukleotids mit doppelter Haarnadel (SEQ ID NO: 17)
12 Eine Reihe von Chimären. Pfeile zeigen einen Strangbruch in dem unteren Strang an, wobei der 3'-Terminus rechts von dem Pfeil liegt (SEQ ID NO: 1–14)
13 Zirkularer Dichroismus-Spektrum eines 68-Nukleotid-Chimärs (ausgezogene Linie) (SEQ ID NO: 4) und der entsprechenden Gesamt-DNA-Sequenz (gestrichelte Linie) (SEQ ID NO: 11)
Beachte: In den 9–13 entsprechen fette Buchstaben 2'-OMe-Ribonukleosiden. T-Buchstaben in fetter Schriftform sind 2'-OMe-Uridinribonukleoside, U. Nicht-fette Buchstaben sind 2'-Desoxynukleoside (DNA). PEO entspricht Pentaethylenoxid.
Oligonukleotide, die nukleosidische Schleifen umfassen, wie in den 9–13 dargestellt, fallen nicht in den Umfang der beanspruchten Erfindung.
GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Nun wird genau auf bestimmte bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen Bezug genommen, wobei Beispiele davon in den angefügten Zeichnungen veranschaulicht sind.
I. DEFINITIONEN
Wenn nicht anders angegeben, sollen die nachstehenden Begriffe und Ausdrücke, wie hierin verwendet, die nachstehenden Bedeutungen aufweisen:
Der Begriff "chimäres Oligonukleotid" oder "Chimär", wie hierin verwendet, betrifft ein Oligonukleotid, das Desoxyribonukleotid-, Ribonukleotid- und Nukleosid-Analogon-Monomere enthält. Die Monomere sind über Phosphodiester- und Phosphodiester-Analogon-Bindungen verbunden. Beispiele für Desoxyribonukleotidmonomere umfassen 2'-Desoxyadenosin, 2'-Desoxyguanosin, 2'-Desoxycytidin und Thymidin. Beispiele für Ribonukleotidmonomere umfassen Adenosin, Guanosin, Cytidin und Uridin. Chimäre sind typischerweise etwa 40–200 Monomere lang.
Der Begriff "Nukleotid-Analogon" betrifft Analoga von natürlichen Desoxyribonukleotid- und Ribonukleotidmonomeren, die modifizierte Zucker- und/oder Nukleobasenanteile enthalten, einschließlich in nicht begrenzender Weise 2'-O-Alkylribonukleotid, 2'-O-Methoxyribonukleotid, 2'-O-Allylribonukleotid, 2'-Halogenribonukleotid, 2-Thiopyrimidin, C-5-Propinpyrimidin, 7-Deazapurin, Isocytosin, Nukleoside mit einer α-anomerischen Base und carbocyclisches Nukleotid.
Der Begriff "Watson/Crick-Basenpaarung" betrifft das Muster von spezifischen Paaren von Nukleotiden und Analoga davon, die über Wasserstoffbindungen aneinander binden, z. B. Adenin (A) paart mit Thymin (T) oder Uracil (U) und Guanin (G) paart mit Cytosin (C).
Der Begriff "Phosphodiester-Analogon" betrifft Analoga von natürlichen 3'-5'-Phosphodiester-Internukleotid-Bindungen, die sich in deren Zusammensetzung und/oder Lage einer Anbindung an ein Nukleotid unterscheiden, einschließlich in nicht begrenzender Weise 2'-5'-Bindung, 3'-3'-Bindung, 5'-5'-Bindung, Methylphosphonat, alkylierter Phosphotiester, 3'-N-Phosphoramidat und PNA.
Der Begriff "Markierungsanbindungsstelle" betrifft die Gruppe eines Nukleotids, die das Nukleotid an eine Markierung bindet. Anbindungsstellen können den Zucker-, Internukleotid- oder Nukleobasenanteil des chimären Oligonukleotids umfassen.
Der Begriff "Markierung" betrifft eine Gruppe, die an ein Nukleotid-, Nukleotid-Analogon- oder nicht-nukleosidischen Anteil eines Chimärs angebunden ist. Die Markierung ist zum Ausführen einer Funktion fähig, wie einer Signalgebung zur Detektion des Moleküls durch Mittel wie Fluoreszenz, Chemilumineszenz und elektrochemische Lumineszenz (Kricka). Alternativ dazu ermöglicht die Markierung eine Trennung oder Immobilisierung des Moleküls durch ein spezifisches oder nicht-spezifisches Abfangverfahren, z. B. Biotin/Avidin, Antikörper/Ligand und dergleichen (Hermanson).
Der Begriff "Verzweigungsgruppe" betrifft eine angehängte Oligonukleotidgruppe, die an ein chimäres Oligonukleotid derart angebunden ist, dass das chimäre Oligonukleotid mehr als einen 3'- oder 5'-Terminus enthält. Anbindungsstellen können den Zucker-, Internukleotid- oder Nukleobasenanteil des chimären Oligonukleotids umfassen.
Der Begriff "Stamm" betrifft einen intramolekularen Watson/Crick-Basenpaarungsanteil eines Chimärs, wobei eine stabile, doppelsträngige, selbstkomplementäre Konformation aus der Sequenz ersichtlich ist. Ein Stamm besteht aus zusammenhängenden Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga, die mit zusammenhängenden komplementären Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga in einem Chimär basengepaart sind.
Der Begriff "Schleife" betrifft einen einzelsträngigen, nicht-komplementären Anteil eines Chimärs, bestehend aus Nukleotiden, Nukleotid-Analoga oder einem nicht-nukleosidischen Polymer.
Der Begriff "doppelte Haarnadel" betrifft die Konformation eines Chimärs mit zwei Stammanteilen, die durch einen "Strangbruch" getrennt sind, d. h. eine Stelle, bei der die 3'- und 5'-Enden des Chimärs benachbart sind. Das Doppel-Haarnadelstrukturmotiv eines Chimärs ist durch ein stabilisiertes thermisches Schmelzen aufgrund eines hohen Grads an Selbstkomplementarität und einer Affinität von Nukleotid-Analoga in dem Stammanteil gekennzeichnet. Vergleiche 1.
Der Begriff "Niederalkylgruppe" betrifft lineare oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, z. B. Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, tert-Butyl-, Isobutyl-, sec-Butyl-, Neopentyl-, tert-Pentylgruppen und dergleichen.
Der Begriff "2'-O-Alkylribonukleotid" betrifft ein Ribonukleotid, in dem eine 2'-Position an einem Zucker aus der Gruppe -OR besteht, worin R eine Niederalkylgruppe ist (Sproat 1994). Der Begriff "2'-O-Methoxyethylribonukleotid betrifft ein Ribonukleotid, in dem eine 2'-Position an einem Zucker aus einer Methoxyethylgruppe besteht, die an den Zucker über ein Sauerstoffatom gebunden ist. Der Begriff 2'-O-Allylribonukleotid betrifft ein Ribonukleotid, in dem eine 2'-Position an einem Zucker aus einer Allylgruppe besteht, die an einen Zucker über ein Sauerstoffatom gebunden ist. Der Begriff 2'-Allylribonukleotid betrifft ein Ribonukleotid, in dem eine 2'-Position an einem Zucker aus einer Allylgruppe besteht, die direkt über eine C-C-Bindung an ein 2'-Kohlenstoffatom gebunden ist. Der Begriff 2'-Halogenribonukleotid betrifft ein Ribonukleotid, in dem eine 2'-Position an einem Zucker aus einem Halogenatom, z. B. F und Cl (Williams), besteht. Der Begriff 2'-O-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotid betrifft ein Ribonukleotid, in dem eine 2'-Position an einem Zucker aus einer Verzwei gungsgruppe besteht, die an den Zucker über ein Sauerstoffatom gebunden ist (Damha). Der Begriff 2'-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotid betrifft ein Ribonukleotid, in dem eine 2'-Position an einem Zucker aus einer Verzweigungsgruppe besteht, die an einen Zucker direkt über ein 2'-Kohlenstoffatom gebunden ist. Der Begriff 2'-Aminoribonukleotid betrifft ein Ribonukleotid, in dem eine 2'-Position an einem Zucker aus einer Aminogruppe besteht, die an einen Zucker direkt über ein 2'-Kohlenstoffatom gebunden ist. Vergleiche 2.
Der Begriff "α-anomerische Base" betrifft ein Nukleotid, in dem die natürliche Stereochemie der 1'-Position des Zuckers invertiert ist, d. h., der Heterocyclus und das 5'-Atom liegen in einer trans-Orientierung anstelle einer cis-Orientierung vor (Morvan). Vergleiche 3.
Der Begriff "carbocyclisches Nukleotid" betrifft ein Nukleotid, bei dem das 4'-Sauerstoffatom des Zuckers durch ein Kohlenstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom ersetzt ist (Perbost). Vergleiche 4.
Der Begriff "2'-5'-Bindung" betrifft eine Internukleotidbindung, in der eine 2'-Position eines ersten Nukleotids an eine 5'-Position eines zweiten Nukleotids über eine Phosphodiesterbindung oder ein Analogon davon gebunden ist (Kandimalla, Alul). Vergleiche 5.
Der Begriff "invertierte 3'-3'-Bindung" betrifft eine Internukleotidbindung, in der eine 3'-Position eines ersten Nukleotids an eine 3'-Position eines zweiten Nukleotids über eine Phosphodiesterbindung oder ein Analogon davon gebunden ist (Fröhler, Chaix). Vergleiche 5.
Der Begriff "5'-5'-Bindung" betrifft eine Internukleotidbindung, in der eine 5'-Position eines ersten Nukleotids an eine 5'-Position eines zweiten Nukleotids gebunden ist (Kandimalla und Agrawal). Vergleiche 5.
Der Begriff "Methylphosphonat" betrifft ein Phosphat-Bindungs-Analogon, in dem eines der nicht-verbrückenden Sauerstoffatome durch eine Methylgruppe ersetzt ist (Dorman). Vergleiche 6.
Der Begriff "nicht-verbrückendes N-substituiertes Phosphoramidat" betrifft ein Phosphat-Bindungs-Analogon, in dem eines der nicht-verbrückenden Sauer stoffatome durch eine -NR₂-Gruppe ersetzt ist, worin R eine Niederalkylgruppe ist. Vergleiche 6.
Der Begriff "alkylierter Phosphotriester" betrifft ein Phosphat-Bindungs-Analogon, in dem eines der nicht-verbrückenden Sauerstoffatome an eine -R-Gruppe gebunden ist, worin R eine Niederalkylgruppe ist. Vergleiche 6.
Der Begriff "3'-N-Phosphoramidat" betrifft ein Phosphat-Bindungs-Analogon, in dem ein Sauerstoffatom, das an eine 3'-Position eines ersten Nukleotids gebunden ist, durch eine -NH-Gruppe ersetzt ist (Gryaznov). Vergleiche 6.
Der Begriff "Peptidnukleinsäure" oder "PNA" betrifft eine Struktur, in der Nukleotidbasen B über Hydroxyethylglycinamid-Bindungen eher als über Ribose- oder Desoxyribosezucker verbunden sind, z. B. die nachstehende Struktur (Nielsen).
Der Begriff "C-5-alkyliertes Pyrimidin" betrifft eine Pyrimidinbase mit einer Alkylgruppe, die an einer C-5-Position vorliegt, z. B. 5-Methyluracil und 5-Methylcytosin (Wang). Vergleiche 7.
Der Begriff "2-Thiopyrimidin" betrifft eine Pyrimidinbase mit einem Schwefelatom, das an einer 2-Position vorliegt, z. B. 2-Thiouridin, 2-Thiothymidin und 2-Thiocytidin (Newman). Vergleiche 7.
Der Begriff "Isocytosin" betrifft eine Cytosinbase, in der ein doppelt gebundenes Sauerstoffatom an einer 4-Position gebunden ist und eine exocyclische Aminogruppe an einer 2-Position gebunden ist. In ähnlicher Weise betrifft der Begriff "Isoguanin" eine Guaninbase, in der ein doppelt gebundenes Sauerstoffatom an einer 2-Position gebunden ist und eine exocyclische Aminogruppe an einer 6-Position gebunden ist (Switzer). Vergleiche 8.
Der Begriff "C-5-Propinpyrimidin" betrifft eine Pyrimidinbase mit einer Propingruppe, die an der 5-Position vorliegt, wobei Propin -C≡C- ist, z. B. C-5-Propincytidin und C-5-Propinthymidin (Wagner). Vergleiche 7.
Der Begriff "7-Deazapurin" betrifft eine Purinbase, in der ein Stickstoffatom, das an einer 7-Position vorliegt, durch ein Kohlenstoffatom ersetzt ist, z. B. 7-Deazaadenin und 7-Deazaguanin (Seela & Driller, Seela & Kehne). Vergleiche 8.
Der Begriff "2,6-Diaminopurin" betrifft eine Purinbase mit Aminogruppen, die an der 2- und 6-Position vorliegen, d. h. 2-Aminoadenosin (Diekmann). Vergleiche 8.
Der Begriff "Universalbase" betrifft eine Nukleotidbase, die eine verringerte basenspezifische Unterscheidung bei einer Watson/Crick-Basenpaarungs-Hybridisierungswechselwirkung zeigt, z. B. 3-Nitropyrol (Nichols) und 5-Nitroindol (Loakes).
Der Begriff "nicht-nukleosidisches Polymer" betrifft ein Polymer, das kein Polynukleotid ist, z. B. Polyethylenoxid, Polypeptid, Polyacrylamid und Polykohlenhydrat. Vergleiche 9.
Die Begriffe "Tetranukleotidschleife" und "Tetraschleife" betreffen Sequenzen mit vier Nukleotiden, die besonders stabile, d. h. mit einer hohen Schmelztemperatur, Haarnadelschleifen bilden (Antao). Vergleiche 9.
Der Begriff "Nukleosid" betrifft eine Verbindung, die aus einer Purin-, Deazapurin- oder Pyrimidinnukleosidbase, z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Deazaadenin, Deazaguanosin und dergleichen, besteht, die an eine Pentose an der 1'-Position gebunden ist, einschließlich 2'-Desoxy- und 2'-Hydroxylformen (Stryer 1981). Der Begriff "Nukleotid", wie hierin verwendet, betrifft einen Phosphatester eines Nukleosids, z. B. Mono-, Di- und Triphosphatester, wobei die herkömmlichste Stelle einer Veresterung eine Hydroxylgruppe ist, die an eine C-5'-Position der Pentose gebunden ist.
Der Begriff "chemilumineszierend" betrifft die Strahlungs- oder Photonen-bildende Fähigkeit einer Verbindung. Typischerweise wird Chemilumineszenz durch einen Vorgang wie einen Bindungsbruch initiiert, der eine instabile Zwi schenverbindung bildet, die sich zersetzt und Strahlung oder ein Photon als Teil des Abklingprozesses des hochenergetischen Zustands freisetzt (Bronstein 1989, Bronstein 1990, Shaap 1990).
Der Begriff "Detektion" betrifft ein Detektieren, Beobachten oder Messen eines Nukleobasen-Oligomers, basierend auf den Eigenschaften einer kovalent angebundenen Detektionsmarkierung. Detektionsmarkierungen umfassen in nicht begrenzender Weise Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. Fluorescein- und Rhodamin-Derivate, Cyaninfarbstoffe, Energietransferfarbstoffe (Stryer 1978), Radioisotope, Spin-Markierungen und dergleichen.
Der Begriff "Abfangen" betrifft ein Abfangen, Immobilisieren, Trennen oder Abtrennen eines Nukleobasen-Oligomers, basierend auf den Eigenschaften einer Abfangmarkierung, die kovalent an das Nukleobasen-Oligomer gebunden ist. Abfangmarkierungen umfassen in nicht begrenzender Weise Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, 2,4-Dinitrophenyl und hydrophobe Modifizierungsmittel wie Cholesterin, Trityl und Trityl-Derivate, Polyethylenglykol, Polylysin, Triglyceride und Kohlenwasserstoffe mit hohem Molekulargewicht.
Wie hierin verwendet, betreffen die Begriffe "Polynukleotid" oder "Oligonukleotid" lineare doppel- und einzelsträngige Polymere von natürlichen Nukleotidmonomeren und Analoga davon, einschließlich Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden, α-anomerischer Formen davon und dergleichen. Gewöhnlich sind die Nukleosidmonomere durch Phosphodiesterbindungen verbunden, wobei, wie hierin verwendet, der Begriff "Phosphodiesterbindung" Phosphodiesterbindungen oder Bindungen, die Phosphat-Analoga davon enthalten, betreffen, einschließlich dazugehöriger Gegenionen, z. B. H⁺, NH₄ ⁺, Na⁺ und dergleichen, falls solche Gegenionen vorhanden sind. Polynukleotide weisen typischerweise eine Größe von wenigen Monomereinheiten, z. B. 8–40, bis mehreren Tausend Monomereinheiten auf.
"Matrizennukleinsäure" betrifft eine jegliche Nukleinsäure, die zum Hybridisieren mit einem Chimär in einer sequenzspezifischen Weise fähig ist. Beispielhafte Matrizennukleinsäuren umfassen DNA und RNA. Spezifischer kann eine Matrizennukleinsäure eine genomische DNA, Messenger-RNA, cDNA, DNA-Amplifikationsprodukte einer PCR-Reaktion und dergleichen sein.
Der Begriff "thermisches Schmelzen" betrifft das Aufbrechen von Wasserstoffbindungen und eine Trennung von Strängen von Nukleinsäure-Basenpaaren in entweder einem intramolekularen oder intermolekularen Konstrukt. Thermisches Schmelzen kann durch eine hyperchrome Wirkung einer erhöhten UV-Absorption gemessen werden, wenn basengepaarte Nukleinsäuren erhitzt werden (Wang). Die Temperatur, bei der die Hälfte der Basenpaare getrennt sind, wird als die "Schmelztemperatur" (Tm) bezeichnet und durch den Wendepunkt oder die erste Ableitung einer Auftragung von Temperatur und Absorption gemessen (10).
II. STRUKTUR DER CHIMÄREN OLIGONUKLEOTIDE
In Bezug auf 1 enthält das erfindungsgemäße chimäre Oligonukleotid im Allgemeinen ein lineares Chimär 1, einschließlich erster 35 und zweiter 36 Zielkomplementärer Anteile, einen Reparaturanteil 40, der zwischen den Zielkomplementären Anteilen liegt, und erste 15, zweite 20 und dritte 50 Stammanteile. Die ersten 35 und zweiten 36 Ziel-komplementären Anteile, der Reparaturanteil 40 und die ersten 15, zweiten 20 und dritten 50 Stammanteile werden kollektiv hierin als "Stammanteil" bezeichnet. Das Chimär enthält ferner erste 10 und zweite 45 Schleifenanteile, die kollektiv hierin als "Schleifenanteile" bezeichnet werden. Das Chimär enthält ferner ein 3'-Ende 16 und ein 5'-Ende 17, die im Allgemeinen nicht kovalent verbunden sind, sondern in naher Nachbarschaft liegen, wenn das Chimär in einer wasserstoffgebundenen Konformation vorliegt.
Alternativ dazu können die Chimäre eine einzige Haarnadelstruktur aufweisen, d. h. Regionen 5, 10, 15 und 20 sind deletiert. Jedoch ist es, wenn das Chimär eine einzige Haarnadelstruktur ist, da die 3'- und 5'-Enden nicht mehr zueinander benachbart sind, erforderlich, dass sowohl die 3'- als auch 5'-Enden des Chimärs derart modifiziert sind, dass die Enden vor einem Nukleaseabbau geschützt werden.
Vorzugsweise weist jeder der ersten 35 und zweiten 36 Ziel-komplementären Anteile eine Länge von mindestens 4 Nukleotiden, vorzugsweise 8 oder mehr Nukleotiden und am meisten bevorzugt etwa 20 bis 30 Nukleotiden auf. Vorzugsweise beträgt die vereinigte Länge der zwei Ziel-komplementären Anteile mehr als 20 Nukleotide und mehr bevorzugt etwa 40 bis 60 Nukleotide. Die Sequenz der Ziel-komplementären Anteile ist komplementär zu einem Anteil der Zielsequenz. Es wird angenommen, dass die endogenen Reparaturenzyme die Stränge von sowohl dem Chimär als auch dem Ziel trennen und eine herkömmliche Duplex-Bildung zwischen dem Chimär und dem Ziel ermöglichen. In einem wichtigen erfindungsgemäßen Aspekt ist ein Teil der Nukleotide, die die Zielkomplementären Anteile ausmachen, Ribonukleotide oder Ribonukleotid-Analoga.
Der Reparaturanteil 40 liegt zwischen den ersten 35 und den zweiten 36 Zielkomplementären Anteilen und weist eine Länge von etwa 1 bis 10 Nukleotiden auf. Die Sequenz des Reparatuaranteils ist nicht vollständig komplementär zu der Zielsequenz. Eher enthält die Sequenz des Reparaturanteils mindestens eine Nicht-Übereinstimmung zwischen dem Reparaturanteil 40 und der Zielsequenz. Die Sequenz des Reparaturanteils ist im Wesentlichen komplementär zu dem Anteil der Zielsequenz, die verändert werden soll. Die Nukleotide, die den Reparaturanteil ausmachen, sind vorzugsweise Desoxyribonukleotide.
Obwohl 1 ein chimäres Oligonukleotid mit einer einzigen Reparatursequenz und zwei Ziel-komplementären Anteilen zeigt, sind erfindungsgemäß Chimäre mit vielfachen Reparaturanteilen und mehr als zwei Zielkomplementären Anteilen umfasst.
Die ersten 15, zweiten 20 und dritten 50 Stammanteile dienen dazu, ein stabiles intramolekulares Duplexmolekül mit den Ziel-komplementären Anteilen zu bilden. Vorzugsweise enthalten die ersten 15 und zweiten 20 Stammanteile eine GC-Klammer zum Stabilisieren des Duplexmoleküls in der Region der ersten und zweiten Stammanteile, wodurch das Chimär vor einem enzymatischen Verdau geschützt wird, z. B. einem Verdau durch Helikasen und/oder Exonukleasen. Der erste Stammanteil enthält auch ein 3'-Ende 16 des Chimärs.
Die ersten 10 und zweiten 45 Schleifenanteile dienen dazu, den zweiten Stammanteil und den Ziel-komplementären Anteil an den ersten Stammanteil und den dritten Stammanteil derart zu binden, so dass das Chimär eine stabile intramolekulare Duplexstruktur bildet. Die Schleifenanteile weisen vorzugsweise eine Länge von 1 bis 6 Nukleotidäquivalenten, mehr bevorzugt 4 Nukleotidäquivalenten auf. Die Schleifenanteile der erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotide umfassen nicht-nukleosidische Polymere.
A. Modifizierter Stammanteil
Verbesserte physiochemische und biologische Eigenschaften von chimären Vektoren werden erfindungsgemäß dadurch erreicht, dass die chemische Struktur des Stammanteils modifiziert wird. Insbesondere können solche Modifikationen eine Vielzahl von vorteilhaften Merkmalen an die erfindungsgemäßen chimären Vektoren verleihen, einschließlich erhöhter intramolekularer und intermolekularer Duplexstabilität, erhöhter intramolekularer und intermolekularer Bildung einer Helix des A-Typs, erhöhter Beständigkeit gegenüber Nukleaseabbau, erhöhter chemischer Stabilität, erhöhter Transportgeschwindigkeit in eine lebende Zelle und erhöhter Ziel- und Gen-Korrekturhäufigkeit.

1. Modifizierte Zucker Analoga. In den erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotiden ist ein Zuckeranteil eines Teils der Ribonukleotide, die einen Stammanteil eines Chimärs ausmachen, bei der 2'-O-Position eines Nukleosids modifiziert. Oligonukleotide mit 2'-O-modifizierten Nukleosiden wurden als Ribozyme, Nuklease-Beständigkeits-Antisense-Analoga und andere Sonden für einen zellulären Mechanismus untersucht (Lamond et al., Olsen et al., Goodchild). Erwünschte Merkmale von 2'-O-Alkyloligoribonukleosiden umfassen hohe chemische Stabilität, wesentliche RNA- und DNA-Nuklease-Beständigkeit (einschließlich RNase H) und erhöhte thermische Duplexstabilität. Die 2'-O-Methylribonukleoside sind in vielen Arten von RNA vorhanden und werden durch posttranskriptionelle Prozessierung in Bakterien und Eukaryonten gebildet (Limbach).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Teil der Ribonukleotide 2'-O-Alkylribonukleotide, vorzugsweise 2'-O-Methylribonukleotide. Zusätzliche bevorzugte modifizierte Ribonukleotide umfassen 2'-O-Allylribonukleotide, 2'-Allylribonukleotide, 2'-Halogenribonukleotide, 2'-O-Methoxyethylribonukleotide, 2'-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotide und 2'-O-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotide (2).
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist eine 1'-Position eines Desoxyribonukleotids oder Ribonukleotids des Stammanteils des Chimärs modifiziert. In einer bevorzugten Modifikation enthält die 1'-Position eine α-anomerische Nukleotidbase oder eine Verzweigungsgruppe (3).
In einer weiteren bevorzugten Modifikation der Nukleotide des Stammanteils ist das Ribonukleotid oder Desoxyribonukleotid ein carbocylisches Nukleotid ( 4).

2. Modifizierte Internukleotidbindungen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotide sind einige oder alle der Nukleotide, die den Stammanteil des Chimärs ausmachen, über Nicht-Standard-Internukleotidbindungs-Analoga verbunden.

Bevorzugte Nicht-Standard-Internukleotidbindungen umfassen 2'-5'-Bindungen, invertierte 3'-3'- und 5'-5'-Bindungen (5), Methylphosphonat, nicht-verbrückendes N-substituiertes Phosphoramidat, alkylierte Phosphotriester-verzweigte Strukturen, 3'-N-Phosphoramidat (6) und Peptidnukleinsäure (PNA). Mehr bevorzugt sind die Bindungen PNA oder 3'-N-Phosphoramidat aufgrund ihrer hohen Affinität.

3. Nukleobasen Analoga. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotide enthalten einige oder alle der Nukleotide, die den Stammanteil des Chimärs ausmachen, Nukleobasen-Analoga (7 und 8). Bevorzugte Nukleobasen-Analoga umfassen C-5-Alkylpyrimidin, 2,6-Diaminopurin, 2-Thiopyrimidin, C-5-Propinpyrimidin, 7-Deazapurin, Isocytosin und Isoguanin und Universalbase. Vorzugsweise ist das Nukleobasen-Analogon C-5-Alkylpyrimidin, C-5-Propinpyrimidin oder Universalbase.

B. Modifizierte Schleifen
Verbesserte physikochemische und biologische Eigenschaften von chimären Vektoren werden ferner erfindungsgemäß dadurch erreicht, dass modifizierte Schleifenanteile in das Chimär eingebracht werden. Insbesondere stellen solche Modifikationen eine erhöhte intramolekulare Duplexstabilität, eine erhöhte Beständigkeit gegenüber Nukleaseabbau und eine erhöhte Zielsteuerungs- und Genkorrekturhäufigkeit bereit.
Die modifizierten erfindungsgemäßen Schleifenanteile enthalten nicht-nukleosidische Polymere eher als die herkömmlichen, nicht-komplementären Polynukleotidstrukturen, z. B. Poly-T. Die nicht-nukleosidischen Polymere sollten wasserlöslich, in gut charakterisierten einzelnen Größen erhältlich, unter physiologi schen Bedingungen chemisch stabil, Nuklease-beständig, nicht-immunogen, zum Anbinden an Polynukleotide fähig sein und eine stabile Haarnadelbildung beschleunigen. Bevorzugte nicht-nukleosidische Polymere umfassen Polyethylenoxid, PEO (Durand), Polymethylmethacrylat, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol und dergleichen. Ein besonders bevorzugtes nicht-nukleosidisches Polymer ist Polyethylenoxid mit 1 bis 10 Ethylenoxid (EO)-Einheiten, z. B. Triethylenoxid, Pentaethylenoxid (PEO) und Hexaethylenoxid.
Die erfindungsgemäßen modifizierten Schleifen können ferner hochgradig stabile Haarnadelstrukturen enthalten, die dazu dienen, die Stabilität der Schleifenstrukturen zu verbessern, z. B. Sequenzen, die Tetraschleifenstrukturen bilden (9).
C. 5'- und 3'-Enden-Modifikation
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden verbesserte physiochemische und biologische Eigenschaften von chimären Vektoren dadurch erreicht, dass die 5'- und 3'-Enden des Chimärs modifiziert werden. Insbesondere stellen solche Modifikationen eine erhöhte Beständigkeit gegenüber Nukleasenabbau bereit, was zu einer erhöhten Zielsteuerungs- und Genkorrekturhäufigkeit führt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein 3'-Ende des Chimärs durch Einbringen eines 2',3'-Didesoxynukleotids als dem 3'-Endnukleotid modifiziert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das 5'-Ende des Chimärs durch Einbringen einer 5'-5'-Bindung, einer 2'-5'-Bindung oder einer Markierung, vorzugsweise eines Fluoreszenzfarbstoffs oder von Biotin, modifiziert.
D. Chimäre Konjugate
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist ein Chimär mit einer Markierung konjugiert, die dazu dienen kann, die intermolekulare Duplexstabilität zu erhöhen, eine erhöhte Detektierbarkeit und/oder Abfangbarkeit bereitzustellen. Bevorzugte Konjugate zum Erhöhen der intermolekularen Duplexstabilität umfassen kleine Furche-Bindemittel (Sharanabasava), z. B. Hoechst 33258, Interkalatoren (Sun), z. B. Acridin, Ethidium-Derivate und Polykationen, z. B. Spermin (Sund).
Zum Erhöhen der Detektierfähigkeit des Chimärs ist das Chimär vorzugsweise an eine Markierung konjugiert, z. B. einem Fluoreszenzfarbstoff, einschließlich Fluorescein, Rhodamin, Cyanin und dergleichen. Um ein Abfangen oder Immobilisieren zu erleichtern, kann ein Chimär mit Biotin oder einem Peptid konjugiert sein (de la Torre). Die Markierung kann an das Chimär unter Verwendung einer Reihe von bekannten Konjugationsverfahren angebunden werden (Andrus 1995, Hermanson).
III. SYNTHESEVERFAHREN
Im Allgemeinen werden die vorstehend modifizierten Chimäre unter Verwendung bekannter synthetischer Techniken synthetisiert. Genaue Beschreibungen der Chemie, die zur Bildung von Polynukleotiden verwendet wird, sind anderweitig bereitgestellt (Beaucage, Applied Biosystems 1991). Das Phosphoramidit-Verfahren einer Polynukleotidsynthese zum Herstellen der erfindungsgemäßen Chimäre ist aufgrund seines wirksamen und schnellen Koppelns und der Stabilität der Ausgangs-Nukleosidmonomere ein bevorzugtes Verfahren. Die Synthese erfolgt typischerweise mit einer wachsenden Polynukleotidkette, die an einen Festträger gebunden ist, so dass ein Überschuss an Reagenzien, die in der flüssigen Phase vorliegen, leicht durch Filtration entfernt werden kann, wodurch der Bedarf an Aufreinigungsschritten zwischen den Zyklen beseitigt wird.
Das Nachstehende beschreibt kurz die Schritte eines typischen Polynukleotid-Synthesezyklus unter Verwendung des Phosphoramidit-Verfahrens. Zuerst wird ein Festträger mit Säure, z. B. Trichloressigsäure, behandelt, um eine Hydroxyl-Schutzgruppe, z. B. Dimethoxytritylgruppe, zu entfernen, wodurch die Hydroxylgruppe für eine nachfolgende Kopplungsreaktion frei wird. Eine aktivierte Zwischenverbindung wird sodann dadurch gebildet, dass gleichzeitig ein geschütztes Phosphoramidit-Nukleosidmonomer oder ein geschützter Phosphoramidit-Schleifenanteil und eine schwache Säure, z. B. Tetrazol und dergleichen, zu der Reaktion gegeben werden. Die schwache Säure protoniert ein Stickstoffatom des Phosphoramidits, wodurch eine reaktive Zwischenverbindung gebildet wird. Eine Nukleosidaddition ist typischerweise innerhalb von 30 Sekunden abgeschlossen. Als nächstes erfolgt ein Capping-Schritt, der jegliche Polynukleotidketten, die keine Nukleosidaddition unterliefen, terminiert. Ein Cappen erfolgt vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid und 1-Methylimidazol. Die Internukleotidbindung wird sodann von dem Phosphit zu dem stabileren Phosphotriester durch Oxidation unter Verwendung von Iod als dem bevorzugten Oxidationsmittel und Wasser als dem Sauerstoff-Donor umgewandelt. Nach Oxidation wird die Hydroxyl-Schutzgruppe mit einer protischen Säure, z. B. Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure, entfernt und der Zyklus wird wiederholt, bis die Kettenverlängerung abgeschlossen ist. Nach Synthese wird die Polynukleotidkette von dem Träger unter Verwendung einer Base, z. B. Ammoniumhydroxid oder t-Butylamin, abgespalten. Die Abspaltungsreaktion entfernt auch jegliche Phosphat-Schutzgruppen, z. B. Cyanethylgruppen. Schließlich werden die Schutzgruppen an den exocyclischen Amingruppen der Basen dadurch entfernt, dass die Polynukleotid-Lösung in einer Base bei einer erhöhten Temperatur, z. B. 55–65°C, behandelt wird.
Der Synthesewirkungsgrad wird während der Synthese in Echtzeit dadurch verfolgt, dass das Detritylierungseluat von der Reaktionssäule mit einem Trityl-Leitfähigkeitsmonitor gemessen wird. Durchschnittliche Schrittausbeuten betragen im Allgemeinen mehr als 98%. Hochvernetzte Polystyrolkügelchen mit einem Porendurchmesser von 1000 Å (McCollum, Andrus 1991, Andrus 1993), die bei 12 μmol 3'-Nukleosid/g Träger beladen sind (PE Applied Biosystems, Teil-Nr. 401938), werden verwendet, um etwa 40 unverarbeitete odu-Einheiten (odu = Absorption bei 260 nm eines Volumens von 1 ml in einer Zelle mit einer Weglänge von 1 cm) eines Chimärs bei dem 0,2 μmol-Maßstab (ca. 1,6 mg) zu ergeben. Ein Erhöhen auf einen 1 μmol-Maßstab wird 200 unverarbeitete odu-Einheiten (ca. 8 mg) unter Verwendung eines 3'-Nukleosid-CPG-Trägers mit 1000 Å (PE Applied Biosystems, Teil-Nr. 401440) ergeben. Die Nukleobasen-Schutzgruppen sind für vergleichbare Entschützungsgeschwindigkeiten in konzentriertem Ammoniumhydroxid (1 Stunde bei 65°C) ausgewählt, um einen Abbau oder eine Modifizierung des Chimär-Oligonukleotids zu minimieren. Nach Abspalten und Entschützen werden Chimäre mit einer Länge von bis zu 80 Basen routinemäßig in hoher Reinheit und Ausbeute erhalten.
Die Synthese von Polynukleotiden, die Nukleosid-Analoga, Phosphodiester-Analoga, modifizierte Schleifenanteile, Chimärkonjugate oder Enden-Modifikationen enthalten, ist anderweitig beschrieben. (Vergleiche die vorstehend angegebenen Referenzen, die mit einer jeglichen Modifikation in Verbindung stehen.)
IV. ANALYSE- UND AUFREINIGUNGSVERFAHREN
Eine Einzelbasenauftrennung bei der Analyse und Aufreinigung von chimären Oligonukleotiden ist schwierig. Die zusätzliche Komplexizität von vielfältigen stabilen Konformationen aufgrund einer intramolekularen Wasserstoffbindung kompliziert die Aufgabe einer Aufreinigung des Chimärs weiter. Zum Beispiel sind unter den nicht-denaturierenden, reverse Phase-Bedingungen, die bei einer herkömmlichen HPLC-Auftrennung verwendet werden, viele Konformationen vorhanden, was ein Identifizieren und Sammeln des Produkts kompliziert. Platten-Polyacrylamid-Gelelektraphorese (PAGE) mit 7 M Harnstoff als Denaturierungsmittel kann für die Analyse und Aufreinigung von Chimären verwendet werden. Mehrere odu-Einheiten (etwa 100 μg) können aus einem Elektrophoreselauf dadurch isoliert werden, dass 10–20 unverarbeitete odu-Einheiten auf einem 3 mm dicken Gel aufgetragen werden, die Elektrophorese unter Standardbedingungen erfolgt, die Bande nach Visualisierung unter UV-Licht gegen eine DSC-Platte (EM Science, Teil-Nr. 5735) ausgeschnitten und in Wasser über Nacht bei Raumtemperatur eingeweicht und auf einer Oligonukleotid-Aufreinigungssäule (PE Applied Biosystems, Teil-Nr. 400771) entsalzt und einkonzentriert wird. Eine Anionenaustausch-HPLC auf einem polymerischen Absorptionsmittel (Dionex NucleoPac PA-100, 4 × 250 mm, Dionex Co.) kann eine gute Auflösung, vorhersehbare Elutionsmuster und reproduzierbare Retentionszeiten ergeben. Ein geeignetes Protokoll umfasst das Folgende: Mobile Phase – Lösungsmittel A: 100 mM NaCl, 10 mM NaOH in 10%igem Acetonitril (pH-Wert 12), Lösungsmittel B: 800 mM NaCl, 10 mM NaOH in 10%igem Acetonitril (pH-Wert 12), Elutionsflussgeschwindigkeit = 1,0 ml/min und ein linearer Gradient von 0% B bei 0 min bis 80% B bei 25 min.
Thermische UV-Schmelzexperimente können Tm-Werte aus den differenzierten Schmelzkurven bestimmen (Wang). Thermische Schmelzkurven von Lösungen von chimären Oligonukleotiden zeigen typischerweise einen einzigen scharfen Übergang, übereinstimmend mit einem einfachen Zwei-Zustandsmodell (10). Das doppelte Haarnadelstrukturmotiv enthält zwei Domänen oder helikale Regionen, die unabhängig voneinander schmelzen (11). Die kürzere Helix (5 Basenpaare), die durch eine TTTT-Haarnadelschleife geschlossen ist, schmilzt nahe bei 70°C in dem angegebenen Puffersystem, während die längere Helix (ca. 25 bp), die durch die gleiche TTTT-Haarnadel geschlossen ist, zwischen 62–85°C schmilzt. Die tatsächliche Schmelztemperatur hängt von der Sequenz, Basenzu sammensetzung und den Modifikationen in dem Stammanteil des chimären Oligonukleotids ab. Die 2'-OMe-Substitutionen erhöhen die thermische Stabilität des Duplexmoleküls durch Verändern der Helixstruktur (12). Das Chimär stellt eine 5,5–7,5°C-Stabilisierung gegenüber der entsprechenden Gesamt-DNA-Sequenz bereit (Andrus 1997). Die größere Stabilität des 2'-OMe/DNA-Heteroduplexmoleküls gegenüber dem entsprechenden DNA/DNA-Homoduplexmoleküls kann für die Gen-Korrektur mit hohem Wirkungsgrad während des homologen Rekombinationsvorgangs entscheidend sein, bei dem die 2'-OMe-Regionen mit der Zielsequenz hybridisieren müssen.
Unerwarteterweise sind die gegenwärtig erhältlichen Tm-Vorhersageverfahren für eine Voraussage eines korrekten Tm-Werts der chimären Oligonukleotide nicht geeignet. Ein korrektes Vorhersageverfahren muss die thermodynamischen Beiträge der Stammschleifen und der selbstkomplementären Art der Sequenz zusätzlich zu einer jeden individuellen Wechselwirkung mit dem nächsten Nachbarn in Betracht ziehen. Obwohl diese Information für DNA- und RNA-Sequenzen erhältlich ist (Breslauer, Howley, Sambrook), wurden die erforderlichen Datenmatrizen bis jetzt für hochgradig intramolekular wasserstoffverbundene Nukleinsäure-Analoga wie chimäre Oligonukleotide nicht aufgestellt. Tabelle 1 vergleicht die experimentell bestimmten Tm-Werte der Chimäre (Andrus 1997) von 12 mit drei populären Voraursageverfahren.
Tabelle 1. Vergleich von gemessenen und vorhergesagten Schmelztemperaturen (Tm) für eine Reihe von Chimären (12, SEQ ID NO: 1–7) und die entsprechenden Gesamt-DNA-Sequenzen (12, SEQ ID NO: 8–14). Vorhergesagte Tm-Werte nehmen 25 mM Natrium, 1 μM Oligonukleotid an und umfassen nicht die nicht-basengepaarten TTTT-Haarnadelschleifen oder die 5 bp-Region, die unabhängig schmilzt. Alle Werte sind in °C angegeben.
V. ANWENDUNG DER CHIMÄREN OLIGONUKLEOTIDE
Die erfindungsgemäßen chimären Vektoren finden insbesondere Anwendung als Mittel zum Einbringen einer Sequenzabänderung in eine Zielsequenz, die sich in einem lebenden Organismus befinden. Die Sequenz des Ziel-komplementären Anteils des Chimärs wird so ausgewählt, dass sie komplementär zu der Zielsequenz ist, und die Sequenz der Reparaturanteile des Chimärs ist so ausgewählt, dass die gewünschte Sequenzabänderung bewirkt wird. Die hohe Affinität der Nukleosid-Analoga in den Ziel-komplementären Anteilen 35 und 36 (1) für die Zielsequenz während des homologen Rekombinationsvorgangs steht in direkter Beziehung mit dem Wirkungsgrad der gewünschten Sequenzabänderung. Die Affinität von chimären Oligonukleotiden für eine Zielsequenz wird durch thermische Schmelzmessungen vorhergesagt. Hohe Tm-Werte für chimäre Oligonukleotide können eine wirksame zielgerichtete Gen-Korrektur vorhersagen.
Die Zielsequenz kann sich in einem jeglichen lebenden Organismus befinden, einschließlich in nicht begrenzender Weise eines Prokaryonten, Eukaryonten, einer Pflanze, eines Tiers und eines Virus. Die Zielsequenz kann sich in einem Nukleus einer Zelle befinden, z. B. genomische DNA, oder kann eine extranukleäre Nukleinsäure sein, z. B. ein Plasmid, mitchondriale Nukleinsäure und dergleichen.
Um eine Sequenzabänderung in einer Zielsequenz, die sich in einem lebenden Organismus befindet, zu bewirken, muss das Chimär in den lebenden Organismus eingebracht werden. Ein jegliches Verfahren, das ein solches Einbringen bewirkt, kann mit den erfindungsgemäßen Chimären verwendet werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise Elektroporation, DEAE-Dextran, Calciumphosphat-Präzipitation, Liposomen-vermittelte Fusion und direkte Mikroinjektion von Zellen.
Die optimalen Bedingungen zum Bewirken einer gewünschten Sequenzabänderung in einer Zielsequenz können empirisch unter Verwendung eines von einer Vielzahl von Verfahren, die zum Überwachen der Abänderung in der Zielsequenz fähig sind, bestimmt werden (Cole-Strauss, Kmiec, Yoon). Beispielhafte Verfah ren umfassen in nicht begrenzender Weise ein Sequenzieren der Zielsequenz, ein Durchführen eines Oligonukleotid-Ligations-Assays (Whiteley) und allel-spezifische PCR.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann der chimäre Vektor zum Konstruieren von transgenen Tieren verwendet werden. Der chimäre Vektor kann in den Pronukleus eines Eis durch direkte Injektion eingebracht werden (Brinster, Wagner). Alternativ dazu kann der chimäre Vektor in eine embryonale Stammzelle eingebracht werden, chimäre Tiere können durch Aggregation der embryonalen Stammzellen mit normalen Blastozystenzellen hergestellt werden und transgene Tiere können als Nachwuchs der chimären Tiere wiedergewonnen werden (Capecchi).
BEISPIELE
Die Erfindung wird durch eine Betrachtung der nachstehenden Beispiele weiter verdeutlicht, die für die Erfindung rein beispielhaft sein sollen und deren Umfang in keiner Weise begrenzen sollen.
BEISPIEL 1
Synthese von Pentaethylenoxid (PEO)-phosphoramidit B
Synthese von 1-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3,6,9,12-tetraoxapentadecandiol A
Pentaethylenglykol (25,0 g, 103 mmol, Fluka Corporation) wird in 200 ml Dichlormethan (DCM) unter Argon gelöst. Zu dieser Lösung werden 31,5 g (93 mmol, Chem-Impex Co.) 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (DMT-Cl), gelöst in 100 ml DCM mit 30 ml Pyridin, gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt und mit 200 ml wässrigem 5%igem NaHCO₃ und 200 ml Wasser extrahiert. Die sich ergebende organische Phase wird über MgSO₄ getrocknet, auf ein Öl einkonzentriert und durch Säulenchromatographie aufgereinigt, wobei mit Hexan/Ethylacetat mit 0,5% Triethylamin (20 : 80 bis 80 : 20) eluiert wird. Produktenthaltende Fraktionen ergeben 28,1 g (52 mmol, 50%) 1-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3,6,9,12-tetraoxapentadecandiol A als farbloses Öl nach Einkonzentrieren und Trocknen.
Synthese von 1-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-14-O-[(N,N-diisopropylamino)-O-2-cyanethoxyphosphino]-3,6,9,12-tetraoxapentadecandiol B
28,0 g 1-O-DMT-3,6,9,12-tetraoxapentadecandiol (52 mmol) A und 0,9 g Diisopropylammoniumtetrazolid (5,2 mmol) werden in 500 ml DCM gelöst. Zu dieser Lösung werden 17,2 g 2-Cyanethoxy(bis-N,N-diisopropylamino)phosphin (57,0 mmol) gegeben. Das Gemisch wird 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und bei diesem Zeitpunkt wird es durch Verdampfen auf ein Öl einkonzentriert. Das unverarbeitete Öl wird dadurch aufgereinigt, dass es in 200 ml DCM wieder gelöst und durch eine Säule mit 30 g Alumina-B (Woelm Pharma) geleitet wird. Das DCM wird entfernt und das anschließende Produkt wird unter vermindertem Druck getrocknet, um 34,0 g (44 mmol, 85%) 1-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-14-O-[(N,N-diisopropylamino)-O-2-cyanethoxyphosphino]-3,6,9,12-tetraoxapentadecandiol B als leicht gelbes Öl zu ergeben.
BEISPIEL 2
Synthese eines 2'-OMe-Chimärs und 2'-OMe-Chimärs mit nicht-nukleosidischen PEO-Linkern
Chimär-Oligonukleotide werden auf einem ABI 394 DNA/RNA-Synthesegerät (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) mit DNA- und 2'-OMe-RNA-Phosphoramiditnukleosid-Monomeren synthetisiert. Die DNA-Monomere (Teil-Nr. 401183, 400326, 400328, 400329) werden von PE Applied Biosystems (Foster City, CA) erhalten und die 2'-OMe-RNA-Monomere wurden von Glen Research (Sterling, VA) erhalten. Die Nukleobasen-Schutzgruppen sind Benzoylgruppen (A und C) und Dimethylformamidingruppen (G) für sowohl die DNA- als auch 2'-OMe-RNA-Nukleoside. Der nicht-nukleosidische PEO-Linker wird auch als ein Phosphoramidit-Synthon B eingebaut, dessen Synthese vorstehend in Beispiel 1 beschrieben ist. Für jeden Kopplungszyklus der Synthese bei dem 0,2 μmol-Maßstab werden 40 μl 0,1 M Phosphoramiditnukleosid (ca. 3,5 mg) in Acetonitril gleichzeitig mit 120 μl 0,5 M 5-H-Tetrazol in Acetonitril zugeführt. Kopplungszeiten betragen 25 Sekunden für DNA-Nukleoside und 4 Minuten für 2'-OMe-RNA-Nukleoside und das PEO-Synthon B.
Das 60-Nukleotid-Chimär wird wie in 9 synthetisiert, wobei fette Buchstaben 2'-OMe-Ribonukleotid-Positionen entsprechen und (PEO) Pentaethylenoxid entspricht (SEQ ID NO: 15–17). Die T-Basen in den fetten 2'-OMe-Ribonukleotid-Positionen sind tatsächlich 2'-OMe-Uridin, U (9–13). Ein Oligonukleotid-Kettenzusammenbau erfolgt in der 3'- zu 5'-Richtung. Im Fall des PEO-haltigen Chimärs sind zwei verschiedene DNA/RNA-Synthesegeräte erforderlich, um die neun verschiedenen benötigten Monomere unterzubringen, da jedes Instrument nur acht Monomer-Flaschenpositionen aufweist. Nachdem die ersten vier DNA-Monomere zu dem Festträger gegeben wurden, wird der Syntheseeinsatz aus dem ersten Synthesegerät entfernt und zu dem zweiten Synthesegerät übertragen, bei dem das PEO-Koppeln erfolgt. Die Syntheseeinheit wird sodann zu dem ursprünglichen Instrument zurückgeführt und fünf zusätzliche DNA-Monomere werden zugegeben, gefolgt von 10 2'-OMe-RNA-Monomeren, 6 DNA-Monomeren und 10 2'-OMe-RNA-Monomeren in dieser Reihenfolge. Die Syntheseeinheit wird wieder von dem ersten zu dem zweiten Synthesegerät übertragen, ein zusätzliches PEO-Koppeln erfolgt und die Einheit wird zu dem ursprünglichen Instrument zurückgeführt, bei dem 26 zusätzliche DNA-Kopplungen erfolgen.
BEISPIEL 3
Charakterisierung von chimären Oligonukleotiden durch thermisches Schmelzen
Thermische UV-Schmelzexperimente können an drei Chimären durchgeführt werden, um die intramolekularen Tm-Werte in sowohl modifizierten als auch unmodifizierten Chimären zu bestimmen. Die Struktur eines jeden der drei Chimäre ist wie folgt: Chimär 1 (SEQ ID NO: 15) weist die gleiche Struktur wie in 9 auf (L = PEO). Chimär 2 (SEQ ID NO: 18) weist die gleiche Sequenz wie Chimär 1 auf, mit der Ausnahme, dass alle Monomere DNAs sind und jeder der PEO-Schleifenanteile durch vier T-Nukleotide (L = TTTT) ersetzt ist. Chimär 3 (SEQ ID NO: 17) weist die gleiche Sequenz wie Chimär 1 auf, mit der Ausnahme, dass jeder der PEO-Schleifenanteile durch vier T-Nukleotide (L = TTTT) ersetzt ist. Die Experimente erfolgen in Puffer mit 10 mM HEPES, pH-Wert 7,3 und 25 mM NaCl. Eine Absorption bei 260 nm wird als eine Funktion der Temperatur zwischen 30–90°C bei einer Heizgeschwindigkeit von 0,5°C min^–1 auf einem Perkin-Elmer Lambda 12-Spektrometer, das mit einer PC-gesteuerten Peltier-Heizeinheit ausgestattet ist, überwacht. Die Tm-Werte für Chimäre 1, 2 und 3 betragen 77,2°C, 71,0°C bzw. 77,4°C. Die Tm-Differenz zwischen Chimär 2 und Chimär 3 (vgl. 71,0°C und 77,4°C) spiegelt die zusätzliche Stabilität wider, die durch einen Einbau der 2'-OMe-Nukleotide erreicht wird. Die Tm-Ähnlichkeit zwischen dem Chimär 3 und Chimär 1 (vgl. 77,4°C und 77,2°C) spiegelt die Fähigkeit eines PEO-Linkers wider, erfolgreich eine Haarnadelschleife ohne Destabilisierung des Rests des Duplexmoleküls zu bilden.
BEISPIEL 4
Charakterisierung von chimären Oligonukleotiden durch enzymatischen Verdau und HPLC-Analyse
Chimär-Oligonukleotide werden hinsichtlich eines unvollständigen Entschützens, Basenmodifikationen und einer korrekten Basenzusammensetzung durch enzymatischen Verdau mit einem Gemisch aus Schlangengiftphosphodiesterase und bakterieller alkalischer Phosphatase und anschließender HPLC-Trennung der konstituierenden Nukleoside überprüft. Alle 8 Nukleoside können aufgelöst und durch Vergleich mit authentischen Proben durch reverse Phase-HPLC-Analyse zugeordnet werden. Die quantifizierte Basenzusammensetzung der Chimäre ist in enger Übereinstimmung (< 10% gesamter Fehler) mit der Sequenz unter Verwendung bekannter und abgeschätzter Extinktionskoeffizienten für jede der Monomereinheiten (Applied Biosystems 1992, Saenger). Es gibt keine detektierbaren Basenmodifikationen oder detektierte restliche geschützte Desoxynukleoside.
Eine Nukleosidzusammensetzung des Chimärs wurde durch Verdau des Chimärs (0,8 odu-Einheiten) mit Schlangengiftphosphodiesterase (0,1 U), bakterieller alkalischer Phosphatase (0,7 U), 15 mM MgCla, 30 mM Tris, pH-Wert 7,5 bei 37°C für 12 Stunden überprüft. Die HPLC-Proben wurden zweimal mit Ethanol präzipitiert, der Überstand wurde gründlich getrocknet und in H₂O gelöst. Ein geeignetes HPLC-Protokoll ist: Säule – Applied Biosystems Spheri-5^TM C 18, 4,1 × 250 mm, mobile Phase – A: 3% CH₃CN in 0,1 M TEAA, B: 90% CH₃CN in H₂O, Flussgeschwindigkeit – 0,5 ml/min, Gradient – 0% B bei 10 min, 10% B bei 35 min, 100% B bei 60 min.
BEISPIEL 5
Charakterisierung von chimären Oligonukleotiden durch zirkularen Dichroismus und Vergleich mit DNA
Zirkularer Dichroismus wird verwendet, um die Konformation des Doppel-Haarnadelmotivs der chimären Oligonukleotide zu bewerten (Johnson, Ivinov). Das CD-Spektrum der Gesamt-DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 11) zeigt Merkmale, die mit einer Helix des B-Typs übereinstimmen, nämlich gleiche positive und negative Intensitäts-Peaks bei 270 bzw. 240 nm (13). Im Gegensatz dazu zeigt das Spektrum des 2'-OMe-Chimärs (SEQ ID NO: 4) Merkmale, die mit einer Helix des A-Typs übereinstimmen. Es ist bekannt, dass DNA/RNA-Heteroduplexmoleküle eine helikale Struktur des A-Typs aufgrund der konformellen Beschränkungen annehmen, die dem Kohlenhydrat durch die 2'-OH-Gruppe aufgezwungen werden. Der 2'-OMe-Substituent würde ähnliche Beschränkungen aufzwingen (Saenger). Spektren wurden mit einem Jasco J-600-Spektralpolarimeter erhalten. Messungen erfolgten mit einer Zelle mit einer 2 mm-Weglänge bei 25°C. Oligonukleotidproben lagen in 10 mM HEPES, pH-Wert 7,3 und 25 mM NaCl vor.
Obwohl nur einige Ausführungsformen vorstehend genau beschrieben wurden, wird der Fachmann auf dem Gebiet der genetischen Manipulation eindeutig verstehen, dass viele Modifikationen bei der bevorzugten Ausführungsform möglich sind, ohne von der Lehre davon abzuweichen. Alle solche Modifikationen sollen von den nachstehenden Ansprüchen umfasst sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Chimäres Oligonukleotid, umfassend: einen selbst-komplementären Stammanteil, einschließlich eines oder mehrerer Nukleotide, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2'-O-Alkylribonukleotiden, 2'-O-Allylribonukleotiden, 2'-Allylribonukleotiden, 2'-Aminoribonukleotiden, 2'-Halogenribonukleotiden, 2'-O-Methoxyethylribonukleotiden, 2'-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotiden und 2'-O-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotiden, einen oder mehrere Schleifenanteile, die nicht-nukleosidische Polymere umfassen, mindestens ein 3'-Ende und mindestens ein 5'-Ende.
Chimäres Oligonukleotid nach Anspruch 1, umfassend einen Stammanteil, der ein oder mehrere 2'-O-Methylribonukleotide enthält.
Chimäres Oligonukleotid nach Anspruch 1, umfassend einen Stammanteil, der eine oder mehrere α-anomerische Nukleotidbasen oder eine Verzweigungsgruppe enthält.
Chimäres Oligonukleotid nach Anspruch 1, umfassend einen Stammanteil, der ein oder mehrere carbocyclische Nukleotide enthält.
Chimäres Oligonukleotid nach Anspruch 1, umfassend einen Stammanteil, der eine oder mehrere Internukleotid-Bindungen enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2'-5'-Bindung, invertierter 3'-3'-Bindung, invertierter 5'-5'-Bindung, Methylphosphonat, nicht-verbrückendem N-substituiertem Phosphoramidat, alkylierter Phosphotriester-verzweigter Struktur, 3'-N-Phosphoramidat und Peptidnukleinsäure (PNA).
Chimäres Oligonukleotid nach Anspruch 1, umfassend einen Stammanteil, der eine oder mehrere Nukleotide enthält, einschließlich eines Nukleosid-Analo gons, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C-5-Alkylpyrimidinen, 2,6-Diaminopurin, 2-Thiopyrimidin, C-5-Propinpyrimidin, 7-Deazapurin, Isocytidin, Isoguanosin und Universalbase.
Chimäres Oligonukleotid nach Anspruch 1, umfassend einen Stammanteil mit einem 3'-terminalen Nukleotid, wobei das 3'-terminale Nukleotid ein 2',3'-Didesoxynukleotid ist.
Chimäres Oligonukleotid nach Anspruch 1, das ferner Markierungen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluorescein, Rhodamin, Cyanin, Biotin, Dinitrophenyl, Acridin, Digoxigenin und Peptiden.
Chimäres Oligonukleotid nach Anspruch 1, das ferner Markierungen umfasst, ausgewählt aus chemilumineszierenden Vorläufern mit der Struktur
worin R₁ ein Wasserstoff- oder Halogenatom ist, R₂ eine Phosphat-, Galactosid-, Glucosid-, Glucuronid-, Trialkylsilyloxy-, Acyloxygruppe oder ein Wasserstoffatom ist und R₃ eine Methyl-, Ethyl- oder Niederalkylgruppe ist.
Verfahren zum Einbringen einer spezifischen Abänderung in einer Zielsequenz eines lebenden Organismus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Prokaryonten, einer Pflanze und einem Virus, umfassend die Schritte: Einbringen eines chimären Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in den lebenden Organismus und Überwachen der spezifischen Abänderung der Zielsequenz.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zielsequenz in einem Kern einer Zelle lokalisiert ist.
Verfahren zum Herstellen eines nicht-menschlichen transgenen Tiers durch Einbringen einer spezifischen Abänderung in einer Zielsequenz des Tiers, umfassend die Schritte: Einbringen eines chimären Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in den Pronukleus einer Eizelle oder in eine embryonale Stammzelle und Überwachen der spezifischen Abänderung der Zielsequenz.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zielsequenz in einem Kern einer Zelle lokalisiert ist.
Verwendung eines chimären Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Einbringen einer spezifischen Abänderung in einer Zielsequenz.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Zielsequenz in einem Kern einer Zelle lokalisiert ist.