DE60130973T2

DE60130973T2 - Verfahren zur analyse der länge eines nucleinsäuremoleküls

Info

Publication number: DE60130973T2
Application number: DE60130973T
Authority: DE
Inventors: Martin Alan Lee; David James Squirrell
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 2000-03-07
Filing date: 2001-03-06
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2021-03-07
Also published as: CN1190500C; EP1266031B1; US7176003B2; HK1055607A1; DE60130973D1; CA2400339A1; ES2291294T3; US20030143574A1; WO2001066795A8; CN1427895A; ATE376068T1; AU2001235856B2; AU3585601A; EP1266031A1; JP2003525621A; GB0005281D0; WO2001066795A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Länge und, wahlweise, des Schmelzpunktes einer Nucleinsäuresequenz und dessen Anwendung beispielsweise zur Bestimmung des prozentualen GC-Gehalts der Sequenz. Das vorliegende Verfahren kann in einer Vielzahl von Diagnose-, Analyse- oder Forschungssituationen angewendet werden.
Die Länge von DNA-Sequenzen kann aus verschiedenen Gründen von Interesse sein. Bei der genetischen Diagnose oder Analyse beeinträchtigen beispielsweise genetische Defekte, die durch Insertionen, Deletionen, Trunkationen oder Duplikationen verursacht sind, die Gesamtlänge eines bestimmten Gens im Genom eines bestimmten Organismus.
Bei Anwendungen in der Forschung wird die genetische Linkage-Analyse oft durchgeführt, um die Beziehung bestimmter Gene innerhalb eines Genoms zu bestimmen. In solchen Fällen kann der Abstand zwischen bestimmten Genen bei der Ermittlung der Funktion und Natur bestimmter Gene von Nutzen sein.
Viele Untersuchungen wurden bezüglich der Telomeren durchgeführt, also der DNA, die sich am Ende des Genoms befindet, welche jedes Mal, wenn sich die Zelle teilt, kürzer zu werden scheint und daher mit dem Alterungsprozeß in Verbindung gebracht wird. In einer bestimmten Probe kann die Länge der telomerischen DNA daher ein Hinweis auf das Alter des Wirts sein, von dem die Probe gewonnen wurde. WO-A-9641016 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Telomer-Länge mittels PCR.
Zu anderen Faktoren, welche die Gesamtlänge einer bestimmten Region der DNA innerhalb eines Genoms ändern können, gehören die Infektion mit einem Virus, das sich selbst in das Wirtsgenom einbaut, und das Vorliegen von Transposons. Die Erfassung des Vorliegens dieser Einheiten kann daher für die Diagnose oder die genetische Analyse von Nutzen sein. Die Länge der Mikrosatellitenregionen bildet die Grundlage für die DNA-Fingerprint-Techniken, die gegenwärtig in der Gerichtsmedizin angewendet werden. In der DNA-Rekombinationstechnologie ist es bei Klonversuchen üblicherweise erforderlich, dass die Nucleinsäuresequenzen vor der Expression in rekombinanten Wirtsorganismen, beispielsweise in Bakterien oder Zellen, in andere Sequenzen, z. B. Vektoren oder Plasmide, eingebaut werden. Erfolgreiche Klone werden üblicherweise durch den Einbau von Selektionsmarkern, z. B. einer Antibiotikumsresistenz, in die Konstrukte identifiziert; sie bieten Mittel zur Identifizierung solcher Wirte, die erfolgreich transformiert wurden.
Gelegentlich treten Fehler beim Klonen auf, und es entsteht eine Verkettung, bei der eine Sequenz in mehr als eine Kopie eingebaut wird (ein spezielles Problem, wenn die Klone unter Verwendung von Restriktionsenzymen erzeugt werden, wodurch Konstrukte mit stumpfen Enden erhalten werden). Alternativ dazu kann eine homologe Rekombination auftreten, die dazu führt, dass ein Teil oder die gesamte Target-Sequenz deletiert wird.
Wenn RT-PCR angewendet wird, ergeben sich ferner alternative Spleiß-Varianten der mRNA, welche die Länge der amplifizierten Gesamtsequenz ändern.
Die Analyse der Länge der Nucleinsäure wird im allgemeinen durchgeführt, indem eine Gelelektrophorese durchgeführt wird, bei der DNA-Fragmente, wahlweise nach der Amplifizierung, aus der Probe genommen werden und auf einem Gel gelassen werden. Dieses Verfahren benötigt eine beträchtliche Zeitspanne, und die Proben müssen aus dem Reaktionsgefäß entfernt werden, wodurch das Risiko einer Kontamination oder Kreuzkontamination besteht, wenn mehr als eine Probe zur selben Zeit getestet wird.
Nucleinsäure-Amplifizierungsreaktionen, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), sind allgemein geläufig. Die PCR ist eine Prozedur zur Erzeugung großer Mengen einer bestimmten DNA-Sequenz, und sie beruht auf den Eigenschaften der Basenpaarung der DNA und dem genauen Kopieren komplementärer DNA-Stränge. Die typische PCR ist ein zyklischer Prozeß mit drei Grundschritten.
Denaturierung: Ein Gemisch, das die PCR-Reagentien (einschließlich der zu kopierenden DNA, der einzelnen Nucleotidbasen (A, T, G, C), geeigneter Primer und des Polymerase-Enzyms) enthält, wird zur Trennung der beiden Stränge der Target-DNA auf eine vorgegebene Temperatur erwärmt.
Reassoziierung: Das Gemisch wird dann auf eine weitere vorgegebene Temperatur abgekühlt, und die Primer finden ihre komplementären Sequenzen auf den DNA-Strängen und binden sich an diese.
Verlängerung: Das Gemisch wird auf eine weitere vorgegebene Temperatur erwärmt. Das Polymerase-Enzym (das als Katalysator wirkt) verbindet die einzelnen Nucleotidbasen mit dem Ende des Primers und bildet so einen neuen DNA-Strang, der zur Sequenz der Target-DNA komplementär ist, wobei die zwei Stränge miteinander verbunden werden.
Solche Verfahren werden in der Forschung, in der Diagnose und in der Gerichtsmedizin in großem Umfang angewendet.
Von den Anmeldern wurde nun ein Weg zur Anwendung von Verfahren wie solchen zur raschen Bestimmung oder Überprüfung der Länge einer Region einer Nucleinsäuresequenz und, falls erforderlich, auch zur Bestimmung des prozentualen GC-Gehalts der Sequenz gefunden.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Analyse der Länge einer bestimmten Region innerhalb einer Nucleinsäure angegeben, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Durchführen einer Vielzahl von Amplifizierungsreaktionen mit einer Probe der Nucleinsäure, bei denen die Region amplifiziert wird, wobei die Zeit der Verlängerungsphase bei jeder Reaktion variiert wird,
b) Überwachen des Fortschritts der Amplifizierungsreaktionen,
c) Bestimmung der Mindestzeit, die erforderlich ist, damit die Verlängerungsphase der Amplifizierung in jedem Reaktionsgemisch vollständig stattfindet, und Korrelieren dieser Zeit mit der Länge der Sequenz, die verlängert wird.

Der hier verwendete Ausdruck "vollständig stattfinden" bedeutet, dass die Amplifizierungsreaktion so durchgeführt wird, dass in jedem Zyklus ein der gesamten Region entsprechendes Amplicon erzeugt wird. Allgemein wird die Region dadurch definiert, dass sie Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, die in der Amplifizierungsreaktion verwendet werden, und dass das Volllängenprodukt während einer "vollständigen" Amplifizierungsreaktion erhalten wird.
Beim Verfahren der Erfindung kann ein beliebiges Verfahren zur Überwachung des Fortschritts der Anwendung angewendet werden.
Techniken oder Assays zur Überwachung des Fortschritts von Amplifizierungsreaktionen sind im Stand der Technik bekannt. Viele dieser Assays verwenden Fluoreszenz-Überwachungstechniken, beispielsweise bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Diese Techniken umfassen sowohl Sondenstrang-spezifische als auch generische DNA-Interkalations-Techniken, die bei einigen PCR-Thermozyklusvorrichtungen der zweiten Generation angewendet werden können.
Bei Fluoreszenz-PCR-Methoden werden allgemein DNA-interkalierende Farbstoffe eingesetzt, die eine erhöhte Fluoreszenz zeigen, wenn sie an eine doppelsträngige DNA-Species gebunden sind. Die Fluoreszenzerhöhung infolge einer Zunahme der Massekonzentration der DNA während der Amplifizierungen kann zur Überwachung des Fortschritts der Reaktion und zur Bestimmung der Kopienzahl des ursprünglichen Target-Moleküls herangezogen werden.
Mit diesem Typ von Fluoreszenz-PCR-Methoden kann die Zunahme der Massekonzentration der Nucleinsäuren ohne einen zeitlichen Nachteil überwacht werden. Eine einzige Fluoreszenz-Messung kann bei jeder Reaktion am gleichen Punkt erfolgen. Die Endpunkt-Schmelzkurven-Analyse kann verwendet werden, um Artefakte vom Amplicon zu unterscheiden, und um Amplicons voneinander zu unterscheiden. Dadurch können Produkt-Peaks bei Konzentrationen erkannt werden, die nicht durch Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden können.
Strangspezifische Methoden der Fluoreszenz-PCR nutzen zusätzliche Nucleinsäure-Reaktionskomponenten zur Überwachung des Fortschritts der Amplifizierungsreaktionen. Bei diesen Verfahren kann der Fluoreszenzenergietransfer (FET) als Grundlage für die Erfassung herangezogen werden. Eine oder mehrere Nucleinsäuresonden werden mit Fluoreszenzmolekülen markiert, von denen eines befähigt ist, als Energie-Donor zu wirken, und das andere ein Energie-Akzeptor ist. Diese werden mitunter als Reportermolekül und Quenchermolekül bezeichnet. Das Donor-Molekül wird mit einer speziellen Lichtwellenlänge angeregt, bei der es normalerweise eine Fluoreszenz-Emissionswellenlänge hat. Das Akzeptor-Molekül wird bei dieser Emissionswellenlänge so angeregt, dass es die Emissionsenergie des Donor-Moleküls anhand einer Reihe von distanzabhängigen Energietransfermechanismen aufnehmen kann. Ein spezielles Beispiel des Fluoreszenzenergietransfers, der auftreten kann, ist der Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer, "FREY". Allgemein nimmt das Akzeptor-Molekül die Emissionsenergie des Donor-Moleküls auf, wenn sie sich in enger Nachbarschaft befinden (z. B. am gleichen oder an einem benachbarten Molekül). Die Grundlage der FET- oder FRET-Detektion ist es, die Änderungen bei der Donor-Emissionswellenlänge zu überwachen. Wenn der Akzeptor ebenfalls ein fluoreszierendes Molekül ist, können auch die Akzeptor-Emissionswellenlängen überwacht werden.
Es gibt zwei allgemein verwendete Typen von FET- oder FRET-Sonden, nämlich solche, bei denen zur Trennung des Donors vom Akzeptor Hydrolyse der Nucleinsäuresonden angewandt wird, und solche, bei denen zur Änderung der räumlichen Beziehung zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Molekül Hybridisierung angewandt wird.
Ein spezielles Assay zur Überwachung des Fortschritts einer Amplifizierungsreaktion ist das in dem Patent US 5 538 848 beschriebene Tagman^TM-Assay.
Hydrolysesonden sind als Tagman^TM-Sonden im Handel erhältlich. Sie bestehen aus DNA-Oligonucleotiden, die mit einem Donor- und einem Akzeptor-Molekül markiert sind. Die Sonden sind so ausgebildet, dass sie an eine spezifische Region auf einem Strang eines PCR-Produktes binden. Nach der Reassoziierung des PCR-Primers an diesen Strang verlängert das Taq-Enzym die DNA mit 3'-an-5'-Polymeraseaktivität. Das Taq-Enzym zeigt ferner eine 5'-an-3'-Exonucleaseaktivität. Die Tagman^TM-Sonden sind am 3'-Ende durch Phosphorylierung geschützt, um zu verhindern, dass sie eine Taq-Verlängerung primern. Ist die Tagman^TM-Sonde am Produktstrang hybridisiert, kann auch ein verlängertes Taq-Molekül die Sonde hydrolysieren, wodurch der Donor vom Akzeptor freigesetzt wird, was die Detektionsgrundlage darstellt. In diesem Fall ist das Signal kumulativ, und mit jedem Zyklus der Amplifizierungsreaktion wachsend, nimmt die Konzentration freier Donor- und Akzeptor-Moleküle zu. Allgemein jedoch sind die Erfassungsmethoden, die sich, wie das Tagman^TM-Assay, auf die Hydrolyse stützen, im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung weniger bevorzugt als solche, die Hybridisierungsphänomene verwenden. Der Grund dafür ist, dass Hydrolyseverfahren relativ langsam sind. Es ist daher erforderlich, sicherzustellen, dass Verzögerungen als Ergebnis der Hydrolyse der Sonde bei der Bestimmung berücksichtigt werden, ob die Verlängerungsphase abgeschlossen ist oder nicht.
Es stehen verschiedene Formen von Hybridisierungs-Sonden zur Verfügung. Molekulare Beacons sind Oligonucleotide, die komplementäre 5'- und 3'-Sequenzen in der Weise aufweisen, dass sie haarnadelförmige Schleifen bilden. Fluoreszenzmarkierungen an den Enden befinden sich in derart enger Nachbarschaft, dass Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer auftritt, wenn die Haarnadelform ausgebildet wird. Nach der Hybridisierung des molekularen Beacon an eine komplementäre Sequenz werden die fluoreszierenden Markierungen getrennt, so dass kein FRET auftritt, was die Grundlage für die Detektion bildet.
Es können auch Paare markierter Oligonucleotide verwendet werden. Diese hybridisieren in enger Nachbarschaft an einem PCR-Produktstrang und bringen die Donor- und Akzeptor-Moleküle zusammen, so daß FRET auftreten kann. Grundlage für die Detektion ist eine verstärkte Fluoreszenzresonanz. Als Varianten dieses Typs wird ein markierter Amplifizierungs-Primer mit einer einzigen benachbarten Sonde verwendet.
Ein Assay, bei dem eine Kombination aus einer einzelnen markierten Sonde und einem interkalierendem Farbstoff verwendet wird, ist in der internationalen Patentanmeldung PCT/GB 98/03560 beschrieben.
Die internationale Patentanmeldung PCT/GB 98/03560 beschreibt ein Assay zur Erfassung des Vorliegens bestimmter Nucleinsäuresequenzen, das zur quantitativen Bestimmung der Menge an Target-Sequenz in der Probe ausgebildet sein kann. In diesem Assay wird unter Verwendung eines Satzes von Nucleotiden, von denen mindestens eines fluoreszenzmarkiert ist, eine Amplifizierungsreaktion bewirkt. Das Amplifizierungsprodukt weist somit eine eingebaute Fluoreszenzmarkierung auf. Die Reaktion wird in Gegenwart einer Sonde durchgeführt, die mit dem Amplifizierungsprodukt hybridisieren kann, und die ein reaktives Molekül enthält, das zur Absorption von Fluoreszenz vom fluoreszenzmarkierten Nucleotid oder zur Abgabe von Fluoreszenzenergie an das fluoreszenzmarkierte Nucleotid befähigt ist. Die Reaktion kann durch Messung der Fluoreszenz der Probe überwacht werden, weil diese sich im Verlauf der Reaktion ändert, da mehr Produkt gebildet wird, das mit der Sonde hybridisiert und zu einer FET- oder FRET-Wechselwirkung zwischen ihnen führt.
Durch Anwendung dieser Techniken ist es möglich, nicht nur direkt zu detektieren, ob eine bestimmte Target-Sequenz in einer Probe vorliegt (da eine Amplifizierung stattfindet), sondern, durch geeignete Datenmanipulation, auch die Menge quantitativ zu bestimmen oder zu ermitteln, wann eine Amplifizierung abgeschlossen ist. Insbesondere wird in einer graphischen Darstellung, in der die Fluoreszenz gegen Zeit oder Zykluszahl aufgetragen wird, allgemein ein Peak einer sigmoidalen Kurve erzeugt, der steil ansteigt, wenn die Amplifizierung fortschreitet und sich die DNA-Menge in der Probe erhöht, dann aber mit der Sättigung der Amplifizierung ein Plateau erreicht.
Die Polymeraseaktivität in der Verlängerungsphase einer Amplifizierungsreaktion wird als "Prozessierungsleistung" bezeichnet. Das bezieht sich auf die Anzahl Basen pro Sekunde, die in das Produkt eingebaut werden. Das Amplifizierungs-Reaktionsgemisch wird allgemein eine längere Zeit auf der Verlängerungstemperatur gehalten als die benötigte Mindestzeit, die erforderlich ist, um eine Synthese der gesamten Target-Sequenz, d. h. der gesamten durch die Primer vorgegebenen Region, zu ermöglichen.
Indem mehrfache Reaktionen gemäß der Erfindung durchgeführt werden, wird die Zeit, in der die Verlängerungsphase fortschreiten gelassen wird, im gegebenen Fall verringert, bis sie zu kurz wird, um noch die gesamte Sequenz erzeugen zu können.
Das behindert die Amplifizierungsreaktion erheblich. Ein Strang des unvollständigen Amplicon-Produkts bindet keinen der Amplifizierungs-Primer mehr, und wird daher in den folgenden Zyklen nicht mehr verlängert. Die Länge des auf diese Weise erzeugten Amplicon-Produkts ist darüber hinaus kürzer und baut daher nicht mehr so viel Markierungsmaterial, wie z. B. einen interkalierenden Farbstoff, ein, der zur Überwachung des Verfahrens verwendet wird. Wenn im Überwachungsverfahren Sonden eingesetzt werden, können sie nicht an die kurzen Amplicons binden und beeinträchtigen so das erzeugte Signal.
Wenn jede Reaktion überwacht wird, wird bald klar, zu welchem Zeitpunkt die Verlängerungsphase des Verfahrens ungenügend lang ist. Im Einzelnen läuft dann die Amplifizierung nicht mit einer geeigneten Geschwindigkeit ab. Das läßt sich genau bestimmen, wenn die anfängliche Konzentration oder die Kopienzahl des Targets bekannt ist; wenn jedoch das Verfahren der Erfindung angewendet wird, läßt sich das in einfacherer Weise bestimmen, indem die Amplifizierungen mit den Amplifizierungen verglichen werden, bei denen die Zeit der Verlängerungsphase lang genug ist, um die Erzeugung eines Volllängen-Produkts zu ermöglichen.
Darüber hinaus kann das kurze Produkt, das infolge unvollständiger Verlängerungsschritte erzeugt wurde, in den nachfolgenden Reaktionen selbst als Primer wirken. Die Effektivität dieser Reaktion ist niedriger als die einer Reaktion, bei der die Amplifizierung unter Verwendung eines kurzen Primers abläuft. Die Erfassung der PCR-Kopienzahl folgt allgemein der Gleichung: Nc = N(1 + E)C worin bedeuten:

N: die ursprüngliche Kopienzahl/Konzentration,
C: die Anzahl der Zyklen,
E: die Reaktionseffektivität und

^0,6931

Eine Amplifizierungsreaktion, bei der kurze Produkte als sekundäre Primer wirken, zeigt daher eine komplexe Zweiphasen-Kinetik. Durch eine kontinuierliche Überwachung der Fluoreszenz der Verlängerungsphase wird das unmittelbar erkennbar, da der normalerweise reguläre Signalanstieg, der während der Verlängerungsphase der Reaktion auftritt, wenn die Reaktion fortschreitet (s. die nachstehende 5), verzerrt wird, wenn die Reaktion fortschreitet, und da mehr kurzes Produkt erzeugt wird, welches befähigt ist, in nachfolgenden Reaktionen als Primer zu wirken.
Dieses Produkt kann dann in eine Beziehung mit der Länge der Sequenz gesetzt werden, die untersucht wird, indem sie mit der Aktivität der speziellen Polymerase korreliert wird, die bei der Reaktionstemperatur eingesetzt wird. Typische Polymerasen bauen etwa 500 Basenpaare in weniger als zehn Sekunden bei herkömmlichen Temperaturen ein, wie sie in Amplifizierungsreaktionen wie der PCR anzutreffen sind.
Zu den geeigneten Amplifizierungsreaktionen gehören Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) oder Ligase-Kettenreaktionen (LCR), sind jedoch insbesondere Polymerase-Kettenreaktionen (PCR).
Im Verfahren der Erfindung werden die Vielzahl der Amplifizierungsreaktionen gleichzeitig durchgeführt.
Bis jetzt war die gleichzeitige Durchführung von mehreren unterschiedlichen Amplifizierungsreaktionen nicht möglich, wenn in jedem Gefäß eine unterschiedliche Zeitsteuerung erforderlich war. Der Grund hierfür ist, dass herkömmliche Block-Heizgeräte, die verwendet werden, um die thermischen Zyklen durchzuführen, die gesamte Vielzahl von Reaktionsvertiefungen unter Verwendung des gleichen Zeitprofils nur alle gleichzeitig erwärmen konnten. Es ist bei Block-Heizgeräten generell erforderlich, alle Vertiefungen auf die gleiche Temperatur zu erwärmen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Vielzahl der Amplifizierungsreaktionen in einer Vorrichtung bewirkt, wie sie in WO 98/24548 beschrieben und beansprucht ist.
Bei einer Vorrichtung dieses Typs wird ein elektrisch leitendes Polymer als Mittel zur Erwärmung eines Reaktionsgefäßes verwendet. Elektrisch leitende Polymere sind auf diesem Gebiet der Technik bekannt und sind von Caliente Systems Inc., Newark, USA, erhältlich. Weitere Beispiele für derartige Polymere sind beispielsweise in den Patenten US 5 106 540 und US 5 106 538 offenbart. Geeignete leitende Polymere können Temperaturen bis 300°C ergeben und können somit gut bei PCR-Verfahren verwendet werden, bei denen der typische Temperaturbereich zwischen 30 und 100°C liegt.
Beim Durchleiten von elektrischem Strom durch diese Polymere können sie sich rasch erwärmen. Die Aufheizgeschwindigkeit hängt von der Art des Polymers, den Abmessungen des verwendeten Polymers und der angewandten Stromstärke ab. Das Polymer hat bevorzugt einen hohen spezifischen Widerstand von beispielsweise über 10 000 Ohm·cm^–1. Die Temperatur des Polymers kann durch eine Steuerung der Stärke des durch das Polymer hindurchgehenden elektrischen Stroms einfach geregelt werden, wodurch es während des erwünschten Zeitraums auf einer erwünschten Temperatur gehalten werden kann. Die Geschwindigkeit des Übergangs zwischen den Temperaturen kann ferner nach einer Eichung einfach gesteuert werden, indem ein geeigneter elektrischer Strom, beispielsweise von einer elektronischen Steuerung kontrolliert, geliefert wird.
Wegen der niedrigen thermischen Masse des Polymers kann ferner eine rasche Abkühlung gewährleistet werden.
Die Verwendung eines Polymers als Heizelement in einem Reaktionsgefäß ermöglicht es ferner allgemein, dass die Vorrichtung eine kompaktere Form als die vorhandenen Block-Heizgeräte erhält, was für die Durchführung von chemischen Reaktionen unter Feldbedingungen, wie z. B. unter freiem Himmel, auf einem Fluß, auf dem Boden einer Fabrik oder sogar in einer kleinen Werkstatt, zweckmäßig ist.
Die Reaktionsgefäße können die Form eines Reagenzgefäßes, z. B. eines Glas-, Kunststoff- oder Siliciumgefäßes, haben, wobei nahe am Behälter ein elektrisch leitendes Polymer angeordnet ist. In einer Ausführungsform des Gefäßes ist das Polymer als Hülle ausgebildet, die am Reaktionsgefäß in thermischem Kontakt mit dem Gefäß anliegt. Die Hülle kann entweder eine geformte Abdeckung sein, die so ausgebildet ist, dass sie formschlüssig am Reaktionsgefäß anliegt, oder sie kann als Foliensteifen ausgebildet sein, der um das Reaktionsgefäß herumgewickelt und befestigt wird.
Die Polymer-Hüllen-Anordnung bedeutet, dass zwischen Hülle und Reaktionsgefäß ein enger Wärmekontakt erreicht werden kann. Es wird hierdurch sichergestellt, dass das Gefäß die erwünschte Temperatur, ohne die übliche Verzögerungszeit, die von der Isolatorwirkung der Luftschicht zwischen Reaktionsgefäß und Heizgerät herrührt, rasch erreicht. Ferner kann eine Polymerhülle verwendet werden, die an eine Vorrichtung angepaßt ist, bei der bereits vorhandene Reaktionsgefäße verwendet werden. Insbesondere kann ein Streifen einer flexiblen Polymerfolie um Reaktionsgefäße unterschiedlicher Größe und Form herumgewickelt sein.
Wenn eine Hülle verwendet wird, kann es vorteilhaft sein, wenn diese perforiert oder in irgendeiner Weise netzförmig ist. Hierdurch kann die Flexibilität des Polymers gesteigert werden, und es kann ein noch leichterer Zutritt eines Kühlmediums ermöglicht werden, wenn das Polymer nicht selbst dazu verwendet wird, die Kühlung zu bewirken.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Polymer als integraler Bestandteil des Reaktionsgefäßes vorgesehen. Das Reaktionsgefäß kann aus dem Polymer durch Extrudieren, Spritzgießen oder ähnliche Techniken hergestellt sein. Alternativ dazu kann das Reaktionsgefäß unter Verwendung einer Verbundkonstruktion hergestellt sein, bei der eine Schicht des leitenden Polymers zwischen Schichten des Materials eingeschaltet ist, aus dem das Gefäß hergestellt ist, oder, indem die innere oder die äußere Fläche des Reaktionsgefäßes mit dem Polymer beschichtet ist oder bei der wiederum das Gefäß im Wesentlichen aus dem Polymer gefertigt ist, welches mit einem dünnen Laminat eines PCR-kompatiblen Materials beschichtet ist. Solche Gefäße können durch Laminierung und/oder Abscheidung, z. B. chemische oder elektrochemische Auftragstechniken, wie sie auf diesem Gebiet der Technik geläufig sind, hergestellt werden.
Gefäße, die das Polymer als integralen Bestandteil enthalten, können besonders kompakt gebaut werden.
Wenn, wie bei der vorliegenden Erfindung, mehrere Reaktionsgefäße für eine spezielle Reihe von Reaktionen erforderlich sind, können die Reaktionsgefäße in einem Feld angeordnet sein.
Jedes Reaktionsgefäß oder jede Gruppe von Reaktionsgefäßen kann ein eigenes Heizzeit-/Kühlzeit-Profil aufweisen, das dadurch eingestellt wird, dass der an dieses Reaktionsgefäß oder jede Gruppe von Reaktionsgefäßen angelegte Strom eingestellt wird. Hierdurch wird gegenüber Heizgeräten mit festem Block oder Heizgeräten mit turbulentem Luftstrom ein weiterer und besonders wichtiger Vorteil bei Reaktionsgefäßen erzielt, die Polymer verwenden, da die einzelnen Gefäße unabhängig voneinander geregelt werden können und ihr eigenes thermisches Profil haben. Das bedeutet, dass eine relativ kleine Vorrichtung zur gleichzeitigen Durchführung mehrerer PCR-Assays eingesetzt werden kann, obwohl jedes Assay unterschiedliche Arbeitsbedingungen benötigt.
Eine derartige Anordnung ist besonders zur Verwendung beim Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt, da die Vielzahl von Amplifizierungsreaktionen gleichzeitig durchgeführt werden können, obwohl die Zeit, in der jedes Gefäß auf der Verlängerungstemperatur gehalten wird, in jedem Fall eine andere ist.
Bei einer besonders bevorzugten Vorrichtung zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung wird das Polymer selbst beispielsweise durch Spritzgießen zu Vertiefungen geformt, die in eine Platte integriert sind. An jeder Vertiefung ist eine Elektrode angebracht, die bevorzugt so angebracht ist, dass sogar eine Erwärmung der Vertiefung bewirkt werden kann. Die Elektroden können im Bereich des Bodens jeder Vertiefung angeschlossen sein. Die Dicke des Polymers ist unter Berücksichtigung der Steifheit und Formstabilität zweckmäßigerweise so niedrig wie möglich. Hierdurch verringert sich die Zeit, die das Polymer für seine Erwärmung benötigt.
Die zu jeder Vertiefung gehörigen Elektroden können mit einer einzelnen Versorgung verbunden werden, oder mehrere, zu Gruppen von Vertiefungen gehörige Elektroden können mit verschiedenen, unabhängig geregelten Stromversorgungen verbunden sein. Mit dieser Anordnung können die verschiedenen Reaktionen, die unterschiedlich zeitgesteuerte Temperaturstufen benötigen, gleichzeitig durchgeführt werden, da jede Vertiefung oder Gruppe von Vertiefungen ihr eigenes Heizelement besitzt. Ferner können die Zyklusreaktionen rasch bewirkt werden.
Die Platten können eine beliebige Anzahl von Vertiefungen aufweisen, damit sie aber mit der herkömmlichen Praxis übereinstimmen, können sich in der gleichen Platte 96 oder 384 Vertiefungen befinden.
Wenn die Vorrichtung dieses Typs gemäß der Erfindung verwendet wird, wird jede Amplifizierungsreaktion in einer Vertiefung eines Gefäßes mit vielen Vertiefungen bewirkt, und jede Vertiefung wird erwärmt, indem an ein elektrisch leitendes Polymer, welches die Vertiefung bildet oder so ausgebildet ist, dass es die Vertiefung erwärmt, Strom angelegt wird.
Eine geeignete Regeleinrichtung ist eine elektronische Schaltung, die so ausgebildet ist, dass die verschiedenen Reaktionen automatisch durchgeführt werden können.
Das Verfahren der Erfindung kann in Verbindung mit anderen Assay-Methoden durchgeführt werden, bei denen mehrfache Amplifzierungsreaktionen angewendet werden.
So hängt zum Beispiel die Temperatur, bei der sich verschiedene Doppelstränge in einer Reaktion bilden oder destabilisiert werden, stark vom relativen Gehalt der Sequenz an Guanidin (G) und Cytosin (C) ab. Die Bindung, die zwischen diesen Basen entsteht, ist relativ stärker als die Bindung, die zwischen den Basen Adenin (A) und Tyrosin (T) entsteht. Die Temperatur, bei der ein bestimmter Doppelstrang destabilisiert wird oder "schmilzt", hängt demzufolge stark vom GC-Gehalt der Sequenz ab. Der prozentuale GC-Gehalt des Genoms eines Organismus ist ferner eine anerkannte taxonomische Signatur zur Bestimmung der Zugehörigkeit des Organismus, beispielsweise eines Bakteriums, insbesondere bezogen auf die Genus-Ebene.
Durch Bestimmung sowohl der Länge als auch des Schmelzpunktes einer bestimmten Doppelstrang-Nucleinsäure ist es möglich, ihren prozentualen GC-Gehalt zu bestimmen. Schmelzpunktbestimmungen können, wie oben beschrieben, gleichzeitig mit den Längenbestimmungen erfolgen.
Um das zu erreichen, ist es erforderlich, ein geeignetes Markierungssystem zu verwenden, das die Detektion des Punktes ermöglicht, an dem sich Doppelstränge in den Reaktionsgemischen bilden oder destabilisiert werden, und im Reaktionsgemisch sind zweckmäßigerweise Markierungsmittel vorgesehen. Die Markierung ist bevorzugt eine sichtbare Markierung, beispielsweise eine fluoreszierende Markierung wie oben beschrieben, die befähigt ist, die Bildung oder Destabilisierung der Doppelstränge anzuzeigen. Somit kann das Assay zur gleichen Zeit durchgeführt werden wie das Assay der vorliegenden Erfindung unter der Voraussetzung, dass geeignete Markierungen verwendet werden können. All das muß durchgeführt werden, um die beiden Datensätze gleichzeitig zu erfassen, die Signale von den Markierungen während der Amplifizierungsreaktion sowie auch die Reaktionstemperatur zu überwachen und die Daten zu verarbeiten, um alle erwünschten Informationen zu erhalten.
Für kombinierte Assays dieses Typs sind gegenüber Hydrolysesonden Markierungen bevorzugt, die entweder interkalierende Farbstoffe oder Hybridisierungssonden verwenden, da diese die Option bieten, den Punkt sichtbar zu machen, an dem ein Doppelstrang destabilisiert wird.
Ein besonders bevorzugtes Markierungsmittel ist ein interkalierender Farbstoff, wie z. B. SYBRGold^TM oder SYBRGreen^TM oder Ethidiumbromid. Wenn sich bei der Amplifizierungsreaktion Doppelstränge bilden, wird der Farbstoff zwischen den Strängen gebunden und gibt infolgedessen verstärkte Signale ab. Das Signal wird somit verstärkt, wenn sich im Reaktionsgemisch Doppelstränge bilden, und abgeschwächt, wenn sie dann destabilisiert werden. Durch Überwachung sowohl der Temperatur im Reaktionsgefäß als auch des Signals vom Farbstoff läßt sich die Temperatur bestimmen, bei der sich die Doppelstränge bilden oder destabilisiert werden. Das Ergebnis wird dann auf den GC-Gehalt der in der Reaktion amplifizierten speziellen Sequenz bezogen.
Wenn mindestens ein Teil der Sequenz bekannt ist, kann beim Markierungsmittel alternativ dazu der Fluoreszenzenergietransfer (FET) als Grundlage der Detektion, wie oben beschrieben, ausgenutzt werden. Insbesondere in diesem Fall ist jedoch die Markierung zweckmäßigerweise eine Markierung, bei der entweder das Donor-Molekül oder das Akzeptor-Molekül an einer markierten Hybridisierungssonde vorgesehen ist, die bei einer speziellen Temperatur an der Target-Sequenz bindet. Das andere Molekül kann, wie oben beschrieben, einen interkalierenden Farbstoff enthalten. Wenn sich die Sonde an den Target-Strang bindet, gerät der interkalierende Farbstoff in enge Nachbarschaft zur Sonde, und es findet Fluoreszenzenergietransfer satt. Im Ergebnis ist eine Änderung der Fluoreszenz von Donor- und/oder Akzeptor-Molekül festzustellen, die sich umkehrt, wenn die Sonde von der Target-Sequenz "schmilzt". In der internationalen Patentanmeldung PCT/GB 98/03560 sind Systeme, die einzelne markierte Sonden und interkalierende Farbstoffe verwenden, beschrieben und beansprucht.
Alternativ dazu können, wie in der internationalen Patentanmeldung PCT/GB 99/00504 beschrieben ist, die Donor- oder die Akzeptor-Komponente des Markierungsmittels in ein Nucleotid eingeführt werden, das bei der Amplifizierungsreaktion verwendet wird.
Ferner können Hybridisierungssonden, z. B. doppelt markierte Sonden oder "Scorpions" oder eine einige molekulare Beacons, für das Assay für eine kombinierte Längen- und Schmelzpunkt-Analyse geeignet sein.
Spezielle Sonden binden spezielle Target-Sequenzen bei charakteristischen Temperaturen. So können durch die Vornahme einer Reihe von Amplifizierungsreaktionen in Gegenwart unterschiedlicher Sonden und durch Messung der Temperatur, bei der diese Sonden an die Target-Sequenz binden oder von ihr schmelzen, Informationen darüber erhalten werden, ob die Target-Sequenz in der Probe der Target-Sequenz vorliegt oder nicht.
Der spezielle Typ des Markierungssystems, das in einem bestimmten Satz von Amplifizierungsreaktionen verwendet werden kann, hängt von der Natur der Probe, der Länge einer beliebigen konservierten Sequenz oder Target-Sequenz usw. ab. Bei den meisten Anwendungen ist jedoch eine Markierung aus einem interkalierenden Farbstoff bevorzugt, da hierdurch ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Bestimmung der Hybridisierungs- und Schmelzanalyse eines Amplicons erhalten wird.
Im Einzelnen wird bevorzugt das Signal gemessen, das erzeugt wird, wenn das Amplifizierungsprodukt destabilisiert wird, da diese Messung ein klareres Signal ergibt.
Falls erwünscht, kann eine Nucleinsäureprobe mehreren unterschiedlichen Amplifizierungsreaktionen unterzogen werden.
Der hier verwendete Ausdruck "unterschiedliche Amplifizierungsreaktionen" bedeutet, dass unterschiedliche Sequenzen oder Teile von Sequenzen in einer speziellen Probe amplifiziert werden. Allgemeiner ausgedrückt bedeutet das, daß in jeder Reaktion unterschiedliche Amplifizierungs-Primer verwendet werden. Die Amplifizierungs-Primer sind zweckmäßigerweise so ausgebildet, dass sie Sequenzen amplifizieren, von denen bekannt ist, dass sie bei bekannten Species konserviert werden, etwa bei einer Reihe von Species, wie Bakterien, Pilze oder Pflanzen, genommen werden, wenn eine taxonomische Analyse durchgeführt werden soll.
Daher können das Vorliegen, die Länge und der prozentuale GC-Gehalt verschiedener Nucleinsäureregionen in einer Probe gleichzeitig bestimmt werden.
Diese Möglichkeit könnte sich auf dem Gebiet der DNA-Profilierung und der taxonomischen Klassifizierung als besonders nützlich erweisen.
Die oben beschriebene Vorrichtung ist ein ideales Gerät zur Durchführung beliebiger solcher kombinierter Assays, weil nicht nur die Verlängerungszeit steuerbar ist, sondern auch das gesamte Temperaturprofil eingestellt werden kann, um sicherzustellen, dass unterschiedliche Amplifizierungen in jeder Vertiefung oder Gruppe von Vertiefungen stattfinden. Die Regeleinrichtung ist zweckmäßigerweise eine automatische Regeleinrichtung, beispielsweise ein elektronisches Gerät. Wenn für die elektrische Schaltung, die mit dem Polymer verbunden ist, eine programmierbare Steuerung verwendet wird, kann ein vorgegebenes Heizregime, z. B. eine vorgegebene Anzahl von Zyklen vorab bestimmter Temperaturstufen, die über vorgegebene Zeitintervalle zu erzeugen sind, und Haltezeiten können unter Verwendung der Vorrichtung vorprogrammiert werden, einschließlich des Einsatzes verschiedener Temperaturen und Zeitprofile zur gleichen Zeit in unterschiedlichen Vertiefungen in derselben Vorrichtung.
Die Regeleinrichtung kann ein Temperaturüberwachungsgerät, beispielsweise ein Thermoelement, enthalten, das die Temperatur des Reaktionsgefäßes überwacht und diese Information in das Regelsystem einspeist, so dass das erwünschte Regime für Heizen und Abkühlen festgelegt und aufrechterhalten wird.
Alternativ dazu kann die Temperatur des Polymers direkt durch Messung seines spezifischen elektrischen Widerstands, beispielsweise durch Anordnung des Polymer-Heizelements als Widerstand in einer Wheatstone-Brückenschaltung, überwacht werden. Hierdurch entfällt die Notwendigkeit, andere Temperaturmeßgeräte, wie z. B. Thermoelemente, zu verwenden.
Die Vorrichtung umfaßt wahlweise ferner eine künstliche Kühleinrichtung, z. B. einen oder mehrere Ventilatoren. Ferner können Fluoreszenz-Erfassungsgeräte, wie z. B. Luminometer, zur Erfassung der Doppelstrangbildung oder -destabilisierung vorgesehen sein. Sie sind zweckmäßigerweise in enger Nachbarschaft der Vertiefungen angeordnet, so dass Signale von darin befindlichen Reagentien erfaßt werden können.
Bei der Verwendung werden die Vertiefungen, welche die zu testenden Proben enthalten, zweckmäßigerweise in einem Bereich des Reaktionsgefäßes oder der -platte gehalten, und die Vertiefungen, welche die bekannten Proben zum Vergleich enthalten, werden in einem anderen Bereich des Reaktionsgefäßes angeordnet. Auf diese Weise können die Vergleiche direkt und rasch erfolgen.
Weitere Komponenten der Reaktionsvertiefungen sind Reagentien, die erforderlich sind, damit die Amplifizierungsreaktion stattfinden kann. Sie sind im Stand der Technik wohlbekannt und können, wie oben beschrieben, Amplifizierungs-Primer, Nucleotide, Puffer sowie Markierungsmittel sein.
Das oben beschriebene Verfahren eignet sich besonders zur taxonomischen Klassifizierung und Identifizierung von Organismen. Nucleinsäuren und insbesondere DNA des Organismus werden extrahiert und in eine Reihe von Testvertiefungen eingebracht. Die Bedingungen der Amplifizierungsreaktion und die verwendeten Primer werden so festgelegt, dass in jeder Vertiefung eine Sequenz, von der bekannt ist, dass sie für einen bestimmten Organismus charakteristisch ist oder in einigen Organismen konserviert wird, falls vorhanden, amplifiziert wird. Durch Erhalt von Informationen über die Länge und den prozentualen GC-Gehalt dieser Sequenz, wie oben beschrieben, kann eine schnelle taxonomische Klassifizierung erreicht werden.
In der gleichen Weise kann bei der gerichtsmedizinischen oder genetischen Analyse eine Nucleinsäureprobe, die vom Ort eines Verbrechens oder von einer Person stammt, mit der einer verdächtigten Person oder einem ermittelten Verwandten dieser Person verglichen werden. Durch Bestimmung der Längen und/oder des prozentualen GC-Gehalts ausreichender unterschiedlicher Nucleinsäuresequenzen kann bestimmt werden, ob die Nucleinsäureprobe aus der gleichen Quelle stammt oder mit der Quelle der Nucleinsäureprobe der Vergleichsnucleinsäure verwandt ist.
Die Erfindung wird im folgenden beispielhaft unter Bezug auf die beigefügten schematischen Zeichnungen beschrieben; es zeigen:
1 eine schematische Ansicht einer beim Verfahren der Erfindung verwendeten Vorrichtung,
2 die Art von Ergebnissen, die unter Anwendung des Verfahrens der Erfindung erzielt werden können,
3 die Proportionalität zwischen dem Schmelzpunkt und dem prozentualen GC-Gehalt bei einer vorgegebenen Sequenzlänge,
4 graphische Darstellungen der Schmelzpunkte in Abhängigkeit von Längenmessungen für einen Bereich von Produkten und
5 die Ergebnisse der kontinuierlichen Überwachung einer Amplifizierungsreaktion, wenn die Reaktion vollständig abläuft.
In der Vorrichtung von 1 sind mehrere Vertiefungen 1 in einer Platte 2 vorgesehen, die ein elektrisch leitendes Polymer enthält, die beispielsweise durch Spritzgießen erzeugt wurde und die erwünschte Anzahl von Vertiefungen enthält. Jede Vertiefung ist mit einer Elektrode 3 versehen, mit der der Inhalt der Vertiefung unter Anwendung eines vorgegebenen Heizzyklus durch Hindurchleiten von elektrischem Strom erwärmt werden kann. Der Zyklus in jeder Vertiefung wird durch eine elektronische Schaltung geregelt (nicht dargestellt).
Die elektronische Schaltung regelt die Zeit, in der jede Amplifizierungsreaktion bei der Reaktion auf der Temperatur der Verlängerungsphase gehalten wird.
Wenn der prozentuale GC-Gehalt der Probe gleichzeitig unter Anwendung der Schmelzpunktanalyse analysiert werden soll, können wahlweise ferner unterschiedliche Amplifizierungsreaktionen durch Verwendung unterschiedlicher Primer-Sequenzen in einigen der Vertiefungen vorgenommen werden. Wird das realisiert, kann es bevorzugt sein, einen Bereich 4 der Platte 2 als Probenbereich und einen davon getrennten Bereich als Vergleichsbereich 5 zu bestimmen. In den Vertiefungen im Probenbereich 4 und im Vergleichsbereich 5 wird der gleiche Satz von Amplifizierungs-Reaktionsbedingungen und Primern eingesetzt.
Eine Nucleinsäureprobe wird in jede Vertiefung im Probenbereich 4 eingebracht, während eine oder mehrere Nucleinsäuren bekannten Ursprungs oder bekannter Sequenz einzeln in die Vertiefungen im Vergleichsbereich 5 eingebracht werden. Wie oben beschrieben, werden Amplifizierungs-Primer, Nucleotide, Puffer oder andere Reagentien, die benötigt werden, um eine Amplifizierungsreaktion auszuführen, zusammen mit dem Markierungsmittel in jede Vertiefung gegeben, und insbesondere ein interkalierender Farbstoff.
Dann wird an jedes Reaktionsgefäß geregelt Strom so angelegt, dass es den Wärmezyklus durchläuft und die Amplifizierung mit unterschiedlichen Verlängerungszeiten bewirkt wird. Die Lumineszenz von jeder Vertiefung wird zur Erfassung des Fortschritts der Amplifizierungsreaktion und zur Bestimmung überwacht, ob die Verlängerungszeit lang genug war, um die Amplifizierung ablaufen zu lassen.
Zusätzlich können wahlweise auch Daten hinsichtlich des Schmelzpunktes von gebildeten Doppelsträngen gesammelt werden.
Wenn die Ergebnisse, wie in 2 gezeigt, in einem Diagramm als Lumineszenz in Abhängigkeit von der Zeit angetragen werden, ergeben die Proben-Amplifizierungsreaktionen eine Reihe sigmoidaler Kurven, von denen viele (A, B) ungefähr das gleiche Profil aufweisen, da die Amplifizierungsreaktion normal ablief und eine exponentielle Amplifizierung stattfand. War jedoch die Verlängerungszeit nicht lang genug (D), tritt nur eine lineare Amplifizierung der ursprünglichen Matrize auf. In Grenzfällen (C) ist eine ausgeprägte Verringerung des Amplifizierungs-Reaktionsprofils zu bemerken. Der Grund hierfür ist, dass sich zu diesem Zeitpunkt etwas Produkt erfolgreich bildete, während andere Produkte aber noch zu kurz sind. Diese Zeit kann dann dazu herangezogen werden, die Sequenzlänge zu berechnen.
Wenn gleichzeitig eine Schmelzpunkteanalyse durchgeführt wird, weil unterschiedliche Amplifizierungsreaktionen angewandt werden, können eine Reihe von Kurven der Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Schmelztemperatur erzeugt werden, die dem Schmelzpunkt der verschiedenen Sequenzen entspricht, die in der Nucleinsäureprobe vorliegen. Wie oben beschrieben, ist der Schmelzpunkt eine Funktion sowohl der Länge der Sequenz als auch des GC-Gehalts. Wenn er also mit den Ergebnissen von 2 kombiniert wird, kann der absolute GC-Gehalt der Sequenz bestimmt werden. Der Grund hierfür ist, dass für eine gegebene Sequenzlänge die Beziehung einer direkten Proportionalität zwischen dem prozentualen GC-Gehalt und dem Schmelzpunkt besteht (3).
Die Ergebnisse können als Diagramm dargestellt werden und ergeben ein kombiniertes Längen-/Schmelzprofil der Nucleinsäureprobe, aus dem der prozentuale GC-Gehalt abgeleitet werden kann (taxonomisch wichtig). Ein Beispiel für die Arten vergleichender graphischer Darstellungen, die erstellt werden können, ist in 4 gezeigt. Da die Sequenzlänge zur Mindest-Verlängerungszeit direkt proportional ist, würde man die gleiche graphische Darstellung erhalten, wenn die Ergebnisse der Verlängerungszeit an der x-Achse angetragen würden.
Es ist hier klar, dass die Ergebnisse im Bereich (i) durch kurze Produkte mit relativ hohem prozentualen GC-Gehalt erhalten wurden, während sich die Ergebnisse im Bereich (ii) von kurzen Produkten mit einem niedrigen prozentualen GC-Gehalt ableiten. Die Ergebnisse im Bereich (iii) leiten sich von Produkten relativ großer Länge mit hohem prozentualen GC-Gehalt ab, und die Ergebnisse im Bereich (iv) beruhen auf Produkten relativ großer Länge mit einem niedrigen prozentualen GC-Gehalt.
Wenn Markierungsmittel, wie z. B. interkalierende Farbstoffe, als Signalgebungssystem oder als Elemente des Signalgebungssystems zur Überwachung des Fortschritts der Amplifizierung verwendet werden, können Änderungen der Menge an in einem Reaktionsgefäß vorliegenden Doppelsträngen sehr gut überwacht werden. Nimmt die Menge der Doppelstränge zu, nimmt auch die Intensität des Fluoreszenzsignals zu. Wenn die Fluoreszenz während einer Amplifizierung, z. B. durch PCR, kontinuierlich überwacht wird, ergibt sich ein sehr charakteristisches Muster, wie in 5 dargestellt ist. Während der Reassoziierungsphase der Reaktion tritt infolge der großen Menge an Doppelstrangmaterial im Reaktionsgemisch ein scharfer Fluoreszenz-Peak auf (i). Dieser fällt (ii) während der Schmelzphase signifikant ab, wenn die Doppelstränge destabilisiert werden und interkalierender Farbstoff freigesetzt wird, steigt jedoch während der Verlängerungsphase mit dem Wachstum des doppelsträngigen Amplicons allmählich wieder an. Die Kinetik der Verlängerungsphase ist bei einer effizienten Amplifizierungsreaktion relativ einfach, weshalb die Überwachungskurve während dieser Zeit im Wesentlichen linear ist (iii).
Bei einer unvollständigen Reaktion, bei der die Verlängerungsphase zur Erzeugung eines Volllängen-Amplicons zu kurz ist, kann das unvollständige Produkt in den nachfolgenden Zyklen als Primer zu wirken beginnen. Die Effektivität einer solchen Reaktion ist niedriger als eine Reaktion, bei der ein Primer verwendet wird.
Infolgedessen andern sich Form und/oder Gradient der Fluoreszenzkurve, wenn die Reaktion fortschreitet.
Dieses Signal eignet sich als alternatives oder als bestätigendes Mittel zur Erfassung, welche Reaktionen nicht vollständig abgeschlossen werden, und führt daher auch zu einer Bestimmung der Reaktionszeiten, die weniger als optimal sind.

Claims

Verfahren zur Analyse der Länge einer bestimmten Region in einer Nucleinsäure, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Durchführung einer Vielzahl von Amplifizierungsreaktionen mit einer Probe der Nucleinsäure, in denen die Region amplifiziert wird, wobei die Zeit der Verlängerungsphase in jeder Reaktion unterschiedlich ist, b) Überwachung des Fortschritts der Amplifizierungsreaktionen, c) Bestimmung der Mindestzeit, die erforderlich ist, damit die Verlängerungsphase der Amplifizierung in jedem Reaktionsgemisch vollständig stattfindet, und Korrelieren dieser Mindestzeit mit der Länge der Sequenz, die verlängert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Amplifizierungsreaktionen Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) oder Ligase-Kettenreaktionen (LCR) sind.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Amplifizierungsreaktion eine PCR-Reaktion ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Vielzahl von Amplifizierungsreaktionen gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem jede Amplifizierungsreaktion in einer Vertiefung eines Gefäßes mit mehreren Vertiefungen bewirkt wird und jede Vertiefung durch Zufuhr von Strom zu einem elektrisch leitenden Polymer erwärmt wird, das die Vertiefung darstellt oder das befähigt ist, die Vertiefung zu erwärmen.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Zeit der Verlängerungsphase der Amplifizierungsreaktion in jeder Vertiefung unabhängig steuerbar ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Fortschritt der Amplifizierungsreaktion unter Verwendung eines bei der Reaktion vorliegenden Fluoreszenz-Markierungsmittels überwacht wird.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Markierungsmittel ein interkalierender Farbstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Markierungsmittel eine markierte Sonde ist.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die markierte Sonde eine Hybridisierungssonde ist.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Sonde eine Hydrolysesonde ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem in Schritt (b) der Fortschritt der Verlängerungsphase kontinuierlich überwacht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem Klone, die mit Hilfe der DNA-Rekombinationstechnologie erhalten wurden, einem Screening auf das Vorliegen von Concatemeren unterzogen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Anwendung bei der Diagnose genetischer Defekte oder viraler Infektionen oder beim DNA-Fingerprint.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, welches in der Linkage-Analyse angewandt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Anwendung zur Messung der Länge von Telomeren zur Altersanalyse.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Temperatur, bei der bestimmte Reaktionsprodukte in der Probe Doppelstränge ausbilden oder Doppelstrangformen destabilisieren, festgestellt wird und diese Information, kombiniert mit der Bestimmung der Länge der Sequenz, zur Berechnung des prozentualen GC-Gehalts der Sequenz verwendet wird.