CN116516051A - ATAC-seq介导精准靶向编辑在水稻抗病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ATAC‑seq介导精准靶向编辑在水稻抗病中的应用，属于基因编辑技术领域。本发明基于ATAC‑seq，精准靶点设计八个位点，其中四个位点在高ATAC‑seq区域，另外四个靶位点位于低ATAC‑seq区域，提升工作效率，可以实现基因的精准编辑。本发明基于ATAC‑seq结合基因编辑，提高原先靶点设计的精准性以及特异性，可应用于水稻抗病基因的筛选和验证，并精准调控基因表达，实现水稻抗病的目的。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及ATAC-seq介导精准靶向编辑在水稻抗病中的应用。
背景技术
植物尤其是经济作物如水稻等，在生长期内会受到多种病害的影响，如稻瘟病、白叶枯病。但是目前并没有良好的手段能够用来治疗感染稻瘟菌的植物，因此育种学家们致力于提高植物的抗病性。
随着水稻基因组测序的完善，在水稻抗性基因的研究也日益增多。自20世纪60年代以来，研究者从育种材料中筛选到抗稻瘟病基因Pia，Pii和Pik后，现在已培育出F优498、宜香优2115、中科804、隆两优3189等具有优良抗性的水稻新品种，但是而现在R基因也面临着机制解析不清晰以及资源匮乏的现状。同时R基因的抗性在4年左右失效。除此之外，真菌在生长过程中，也在不断地快速进化且变异。尽管多个R基因叠加在一起时，人们培育出优质水稻仍需要更长的时间与成本。
但是基因编辑存在难以精准靶向的问题，以及编码区编辑影响蛋白质本身的结构，并且编辑效率低，常见的解决方案如增加编辑位点等，比如IPA1基因在启动子区编辑，设计39个gRNA，在1510个T1株系中筛选到优质株系。可见后期筛选工作难度极大，需要耗费极大的精力与财力。
发明内容
本发明的目的在于提供ATAC-seq介导精准靶向编辑在水稻抗病中的应用，基于ATAC-seq结合基因编辑，提高原先靶点设计的精准性以及特异性。
本发明提供了ATAC-seq预测结合靶向基因编辑在筛选功能基因和/或鉴定基因功能中的应用。
本发明还提供了一种筛选功能基因的方法，包括以下步骤：在目标基因的启动子区进行ATAC-seq预测，在高ATAC-seq区域和低ATAC-seq区域内各选择4个基因编辑靶位点，分别构建基因编辑载体；
分别将各基因编辑载体转化宿主，对基因编辑后的目标事件进行功能鉴定，得功能基因。
优选的，所述目标基因包括植物基因。
优选的，所述基因编辑靶位点包括基因敲低和/或敲除靶位点。
优选的，所述功能鉴定包括抗性鉴定。
本发明还提供了一种鉴定基因在植物抗病性中作用的方法，包括以下步骤：
对待测基因的启动子区进行ATAC-seq预测，在高ATAC-seq区域和低ATAC-seq区域内各选择4个靶位点，分别构建基因敲除和/或敲低载体；
分别将所述基因敲除和/或敲低载体转化植物，对转化后的植株进行抗病性鉴定。
优选的，所述抗病性鉴定包括鉴定对真菌和/或细胞引发的疾病的抗性。
优选的，当所述植物为水稻时，所述抗病性鉴定包括鉴定对稻瘟病和/或白叶枯病的抗性。
优选的，得到所述抗病性鉴定的结果后，还包括与ATAC-seq预测进行结合。
本发明还提供了ATAC-seq预测结合靶向基因编辑在构建不同抗性植物种质中的应用。
有益效果：本发明基于ATAC-seq介导靶向编辑基因的启动子区，将ATAC-seq与基因编辑技术相结合，提高原先靶点设计的精准性以及特异性，可应用于筛选功能基因，以及鉴定基因的功能，并基于此获得新的种质资源。
本发明实施例中，首先在基因的启动子区进行ATAC-seq的预测，掌握基因的开放染色质程度信息，预测结果会出现高ATAC-seq区域和低ATAC-seq区域的位置；在ATAC-seq区域的范围内，选择八个靶位点，四个靶位点构建一个敲除载体，共构建两个载体；其中四个靶位点位于低ATAC-seq区域，另外四个靶位点位于高ATAC-seq区域；对水稻转化苗进行抗病性鉴定。抗病结果与ATAC-seq结果相联系，发现抗病性明显增强的株系编辑类型的缺失位点位于高ATAC-seq区域，而无明显抗性的株系则编辑在低ATAC-seq区域。抗病结果与ATAC-seq结果相呼应，不仅体现了ATAC-seq在水稻抗病上的综合应用，同时解决了现有编辑技术精准的效率的问题。
附图说明
图1为基于ATAC-seq预测的编辑靶点设计图，(A)为硅饱和诱变热图，显示启动子中每个可能的突变对染色质可及性的预测影响；(B)为RBL1启动子区靶点设计及突变位置图；
图2为启动子编辑材料抗病性鉴定结果图，(A)为稻瘟菌ZB25接种14天后，编辑材料的病斑面积，比例尺：1cm，数据采用t检验进行分析；(B)为白叶枯菌PXO99接种14天后，启动子编辑材料的病斑长度，比例尺：1cm；数据采用t检验进行分析；星号表示差异显著(**P<0.01，****P<0.0001)；
图3为T1纯合编辑株系表型分析结果图；(A)表示叶片生长表型，Pro1和Pro2具有明显的类病斑，比例尺，1cm；(B)表示农艺性状分析结果图，星号表示差异显著，数据采用t检验进行分析；ns，无显著性差异；
图4为Pro1在田间的农艺性状表型图；(A)为WT，rbl1以及Pro1的分蘖、穗部以及种子在田间的表型图，比例尺：1cm；(B)为WT，rbl1以及Pro1的田间农艺性状测定结果图，数据采用t检验进行分析，星号表示差异显著(*P<0.5)；ns，无显著性差异；
图5为WT和Pro1在田间病圃的整株表型以及单株产量测定结果图，比例尺：10cm；数据采用t检验进行分析，星号表示差异显著(****P<0.0001)；
图6为WT和Pro1苗期叶片表型(A)、穗部(B)以及籽粒(C)在田间病圃的表型图，比例尺：10cm，数据采用t检验进行分析，星号表示差异显著(****P<0.0001)；
图7为CRISPR载体构建示意图，(A)表示片段扩增P1-P9，代表含有目的靶点序列的Part1-9；(B)表示目的片段使用FOKI酶切结果图；(C)表示pRGEB32载体使用BSAI酶切结果图；(D)表示阳性转化子筛选检测结果图；(E)表示测序结果图。
具体实施方式
本发明提供了ATAC-seq预测结合靶向基因编辑在筛选功能基因和/或鉴定基因功能中的应用。
本发明在基因的启动子区进行ATAC-seq的预测，掌握基因的开放染色质程度信息，预测结果会出现高ATAC-seq区域和低ATAC-seq区域的位置。本发明对所述ATAC-seq预测的方法并没有特殊限定，实施例中参考已知文献(Zhao,H.,Yao,W.,Ouyang,Y.,Yang,W.,Wang,G.,Lian,X.,Xing,Y.,Chen,L.,and Xie,W.(2015).RiceVarMap:a comprehensivedatabase of rice genomic variations.Nucleic Acids Res 43,D1018-1022.)的方法进行，即根据水稻数据库(https://www.Rice Genome Annotation Project)中查找磷脂酸代谢酶RBL1信息，获得ATG上游启动子序列。将RBL1信息输入到数据库(https://www.RiceVarMap2)获得基因启动子区开放染色质数据，即ATAC-seq数据。
本发明还提供了一种筛选功能基因的方法，包括以下步骤：在目标基因的启动子区进行ATAC-seq预测，在高ATAC-seq区域和低ATAC-seq区域内各选择4个基因编辑靶位点，分别构建基因编辑载体；
分别将各基因编辑载体转化宿主，对基因编辑后的目标事件进行功能鉴定，得功能基因。
本发明所述目标基因优选包括植物基因，实施例中以来源于水稻的RBL1基因(Loc_01g55360)为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明发现在RBL1基因的ATG上游-500bp到-1300bp区域，基因的染色质开放度最大，为高ATAC-seq区域，其他区域为低ATAC-seq区域。
本发明在所述基因的启动子区设计8个靶位点，在高ATAC-seq区域设计4个靶位点，在低ATAC-seq区域设计4个靶位点。本发明优选根据设计的靶位点构建基因编辑载体，实施例中以敲除和/或敲低为例进行说明。
本发明基于遗传转化的方法将上述基因编辑载体转化植株后，优选对转化后的植株进行功能鉴定，所述功能鉴定优选包括抗性鉴定，更优选包括抗病性鉴定，如检测对白叶枯病以及稻瘟病的抗性。
本发明还提供了一种鉴定基因在植物抗病性中作用的方法，包括以下步骤：
对待测基因的启动子区进行ATAC-seq预测，在高ATAC-seq区域和低ATAC-seq区域内各选择4个靶位点，分别构建基因敲除和/或敲低载体；
分别将所述基因敲除和/或敲低载体转化植物，对转化后的植株进行抗病性鉴定。
本发明所述抗病性鉴定优选包括鉴定对真菌和/或细胞引发的疾病的抗性，当所述植物为水稻时，所述抗病性鉴定优选包括鉴定对稻瘟病和白叶枯病的抗性。本发明在得到所述抗病性鉴定的结果后，优选还包括与ATAC-seq预测进行结合，如在本发明实施例中，抗病性明显增强的株系编辑类型的缺失位点位于高ATAC-seq区域，而无明显抗性的株系则编辑在低ATAC-seq区域。抗病结果与ATAC-seq结果相呼应，不仅体现了ATAC-seq在水稻抗病上的综合应用，同时解决了现有编辑技术精准的效率的问题。
本发明还提供了ATAC-seq预测结合靶向基因编辑在构建不同抗性植物种质中的应用。
本发明构建植物种质的方法优选与上述转化相同，在此不再赘述；或者是利用上述方法筛选或鉴定出目标功能基因后，通过对该目标基因进行基因编辑，从而获得不同抗性植物种质。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的ATAC-seq介导精准靶向编辑在水稻抗病中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.基于ATAC-seq的编辑靶点设计：
预测RBL1基因启动子区域在根、幼叶、旗叶、花蕊、穗等五种组织中的开放染色质状态情况。结果如图1所示，该基因在不同组织的表达是一致且稳定的，并没有随着植株生长期的变化而发生改变；且在ATG上游-500bp到-1300bp区域，基因的染色质开放度最大。
基于此，本发明在高ATAC-seq区域设计四个靶位点，在低ATAC-seq区域设计四个靶位点。
方法：CRISPR载体构建方法与公开文章Boosting CRISPR/Cas9 multiplexediting capability with the endogenous tRNA processing system(Xie et al.,2015)相同，如图7所示：
(1)引物设计：
RBL1蛋白对应的基因LOC号：LOC_Os01g55360，设计编辑靶点(表1)，在靶点后gRNAscaffold序列(SEQ ID No.1)：GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC；
共有八个靶位点，靶点序列详见下面表格。其中g11/8/18/13靶点构成一个载体，g6/23/2/34靶点构成一个载体，共计两个载体。
表1所用靶位点序列信息
(2)一轮PCR：引物配对方式为，L5AD5-F和gRNA11/R gRNA11/F和gRNA8/R，gRNA8/F和gRNA18/R，gRNA18/F和gRNA13/R，gRNA13/F和L3AD3-R；L5AD5-F和gRNA6/R，gRNA6/F和gRNA23/R，gRNA23/F和gRNA2/R，gRNA2/F和gRNA34/R，gRNA34/F和L3AD3-R，以PGTR为模板进行PCR扩增，序列如下(SEQ ID No.10)：CCTCTATATCTGGGCCATGGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA TAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，50℃30sec，72℃30sec，32个循环；72℃延伸5min。
表2引物信息
(3)GG反应：将扩增获得的PCR产物纯化后进行GG反应(产物共7μL(25-50ng)；2×T4连接酶Buffer(NEB)10μL；BSA 2μL；BsaI(10U/μL,NEB)0.5μL；T4 DNA连接酶0.5μL)，反应条件为：37℃5min，20℃10min，40个循环；20℃1h。
(4)GG PCR：反应产物加入180μL双蒸水稀释后进行利用S5AD5-F和S3AD3-R对目的片段进行扩增，纯化PCR产物。
(5)酶切酶连：将片段和pRGEB32载体分别用FOKI和BSAI进行酶切，37℃反应2h。酶切完毕后，用包含RBL1基因的酶切片段和酶切的pRGEB32载体做连接反应，其后转化大肠杆菌Top10。通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组CRISPR载体。
结果如图7所示：以PGTR为模板扩增Part1、Part2、Part3、Part4、Part5、Part6、Part7、Part8、Part9(图7中A)。每四个靶位点连接在一起构建目标基因序列，形成GGassembly。将片段和pRGEB32载体分别用FOKI和BSAI在37℃酶切2h(图7中B，C)。酶切完毕后，将片段与pRGEB32载体16℃连接12h，将其连接产物转化于DH5α。转化菌液涂布在卡那抗性的LB培养基中，10h之后长出单克隆菌落。使用引物pRGEB32seqF/R来筛选阳性转化子(图7中D)。结果显示，在12个阳性转化子中，有2个阳性转化子。并对阳性转化子于卡那抗性的LB培养基37℃摇培，12h后保菌提取质粒，送去公司测序(图7中E)。
将得到的两个载体分别转化Kitaake水稻植株，在水稻转化苗中获得图1所示的四种编辑类型，Pro1、Pro2缺失的位置在高ATAC-seq区域中，Pro3、Pro4缺失的位置则在低ATAC-seq区域中。
2.基于ATAC-seq在水稻抗病性(稻瘟病和白叶枯病)中的应用；
2.1病害抗性鉴定
类病斑突变体(Lesionmimic mutant)材料通常在没有病原菌侵染的情况下产生自免疫反应，表现为叶片上出现局部的坏死斑点，类似于植物的超敏反应(hypersensitiveresponse,HR)，严重的甚至造成突变体植株不能正常存活(Bruggeman,Q.,Raynaud,C.,Benhamed,M.,and Delarue,M.(2015).To die or not to die？Lessons fromlesionmimic mutants.FrontPlant Sci 6,24.；Lorrain,S.(2003).Lesion mimicmutants:keys for deciphering cell death and defense pathways in plants？TrendsPlant Sci 8,263-271.)，适合用来克隆植物中的免疫负调控因子，分析植物的免疫分子机制。
结果如图2所示，Pro1和Pro2上苗子初期幼叶上会形成少量的类病斑(图2中A)，这种病斑逐渐蔓延直至布满整个叶片。Pro3和Pro4叶片不存在类病斑表型。
2.2稻瘟病抗性鉴定
同时种植纯合突变体材料、Kitaake(野生型对照)以及rbl1(类病斑突变体阳性对照)，待植株生长到五叶期，进行稻瘟菌打孔接种。此处用的为稻瘟菌小种ZB25。
且水稻rbl1突变体(FN398)是从模式粳稻(Oryza sativa)KitaakeX的快中子诱导突变群体中鉴定出来的，已公布在Li,G.,Chern,M.,Jain,R.,Martin,J.A.,Schackwitz,W.S.,Jiang,L.,Vega-Sanchez,M.E.,Lipzen,A.M.,Barry,K.W.,Schmutz,J.,and Ronald,P.C.(2016).Genome-wide sequencing of 41rice(Oryza sativa L.)mutated linesreveals diverse mutations induced by fast-neutron irradiation.Mol Plant 9,1078-1081.
抗性鉴定方法：(1)稻瘟菌的培养。将保存有稻瘟菌(ZB25)孢子的纸片接种到燕麦培养基上，于25℃左右暗培养2-3天；待菌丝萌发长出后，进行光照培养；两周内，待稻瘟菌长满整个培养皿时，用含有0.01％Tween-20蒸馏水刮洗菌丝(含有大量分生孢子)，并用双层纱布过滤，利用显微镜和血球计数板计算孢子浓度，将孢子悬浮液浓度调至2×105个孢子/mL，用于稻瘟菌接种。
(2)接种方法参照Fan,J.,Bai,P.,Ning,Y.,Wang,J.,Shi,X.,Xiong,Y.,Zhang,K.,He,F.,Zhang,C.,Wang,R.,Meng,X.,Zhou,J.,Wang,M.,Shirsekar,G.,Park,C.H.,Bellizzi,M.,Liu,W.,Jeon,J.S.,Xia,Y.,Shan,L.,and Wang,G.L.(2018).The Monocot-Specific Receptor-like Kinase SDS2 Controls Cell Death and Immunity inRice.Cell Host Microbe 23,498-510e495.。当水稻四叶期时，在幼苗最新伸展叶片上用鼠耳打孔器在倒二叶上人为制造一个潜在的圆形伤口，并用移液器吸取10μL菌液滴于伤口处并用透明胶带封锁液滴；每株系接种5个，独立重复3次接种；然后转移到28℃高湿条件下继续生长，并于接种14天后调查发病情况。接种。接种14天后，统计叶片被侵染面积。
可视化结果显示，类病斑突变体rbl1的病斑几乎不扩展，抗病性极强；Pro1和Pro2扩展的病斑面积相比较WT更小，而Pro3和Pro4病斑面积分别约为WT的1.2和1.5倍(图2中B)。综上可知，相比较Kitaake，Pro1和Pro2为抗病材料，而Pro3和Pro4无明显抗性。
2.3白叶枯病抗性鉴定
选择白叶枯病原菌PXO99在植物孕穗时进行接种，接种方法参考Luu,D.D.,Joe,A.,Chen,Y.,Parys,K.,Bahar,O.,Pruitt,R.,Chan,L.J.G.,Petzold,C.J.,Long,K.,Adamchak,C.,Stewart,V.,Belkhadir,Y.,and Ronald,P.C.(2019).Biosynthesis andsecretion of the microbial sulfated peptide RaxX and binding to the riceXA21immune receptor.Proc NatlAcad Sci U S A 116,8525-8534.
1.白叶枯病菌(PXO99)的培养采用NB培养基，培养温度为28℃，培养为2-3天后，待白叶枯菌长满整个培养皿时，刮取菌体于灭菌后的ddH2O，混匀调至OD为0.5时，用于接种。
2.接种方法：
采用剪叶法将配好的菌液，用剪刀蘸取菌液于4叶期(苗期)和7叶期的水稻叶片上，每株系接种5株，重复3次，接种14天后调查病斑长度及病叶长度，调查其发病情况。接种12天后，统计材料的病斑扩展长度。
结果如图2中C所示，突变体rbl1扩展长度为1～3cm，抗病性极强。而WT(野生型Kitaake)扩展到15cm左右。在四种突变体材料中，Pro1扩展到7cm左右，约为野生型病斑长度的一半；Pro2扩展到10cm左右；Pro3和Pro4的扩展长度明显长于WT，Pro3扩展到18cm左右；Pro4扩展到16cm左右；综上，Pro1和Pro2突变株系具较强的白叶枯病抗性，Pro3和Pro4株系没有明显的抗性。即，Pro1、Pro2缺失的位置在高ATAC-seq区域中抗病性增强；Pro3、Pro4缺失的位置则在低ATAC-seq区域中抗病性减弱。
3.在植物结实期后，编辑材料的生长表型以及农艺性状
结果如图3所示，编辑材料Pro1、Pro2、Pro3和Pro4在分蘖、粒长、千粒重等表型方面未受到影响，和野生型WT生长一致(图3)。
4.基于ATAC-seq在水稻抗病性(稻瘟病和白叶枯病)以及产量分析在田间的综合应用
以Pro1为例，田间拍摄WT，Pro1和rbl1的分蘖，穗子以及种子表型，如图4中A所示，Pro1明显改善了rbl1的生长表型，并且和WT并没有明显差异。除此之外，对Pro1的农艺性状，包括株高，分蘖，谷粒长度，穗重，穗长，千粒重，结实率，单株产量等进行系统分析。结果如图4中B所示，Pro1在田间生长的各个农艺性状的指标均未受到影响。综上，Pro1编辑材料在田间生长时其表型和产量上和WT无差异。
5.在自然病圃下对比Pro1材料和野生型Kitaake的生长表型。
田间病圃是水稻早田间自然发病的环境。田间病原菌种类繁多，例如稻瘟菌，白叶枯菌，纹枯菌，稻曲菌等。
结果如图5所示，Pro1材料在自然病圃下远比野生型Kitaake生长好，白穗率降低，且发病较弱。病圃下Kitaake以及Pro1株系的单株产量的数据表明，Pro1的单株产量是对照Kitaake的1.6倍。这说明在病圃条件下，Pro1较WT抗病性更强，并且产量更高。
就幼叶、穗部以及籽粒三个主要方面展开分析Pro1在田间病圃的抗性能力。Pro1幼叶相比较WT发病更晚(图6中A)。Pro1每株病穗率严重程度为30％，远低于WT的80％(图6中B)。Pro1和WT每株病粒呈现，WT病粒率严重程度约为75％，大约是Pro1的3.75倍(图6中C)。综上，Pro1编辑株系在田间不降低产量的情况下具有较强的广谱抗病性。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.ATAC-seq预测结合靶向基因编辑在筛选功能基因和/或鉴定基因功能中的应用。
2.一种筛选功能基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：在目标基因的启动子区进行ATAC-seq预测，在高ATAC-seq区域和低ATAC-seq区域内各选择4个基因编辑靶位点，分别构建基因编辑载体；
分别将各基因编辑载体转化宿主，对基因编辑后的目标事件进行功能鉴定，得功能基因。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述目标基因包括植物基因。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述基因编辑靶位点包括基因敲低和/或敲除靶位点。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述功能鉴定包括抗性鉴定。
6.一种鉴定基因在植物抗病性中作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
对待测基因的启动子区进行ATAC-seq预测，在高ATAC-seq区域和低ATAC-seq区域内各选择4个靶位点，分别构建基因敲除和/或敲低载体；
分别将所述基因敲除和/或敲低载体转化植物，对转化后的植株进行抗病性鉴定。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述抗病性鉴定包括鉴定对真菌和/或细胞引发的疾病的抗性。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，当所述植物为水稻时，所述抗病性鉴定包括鉴定对稻瘟病和/或白叶枯病的抗性。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，得到所述抗病性鉴定的结果后，还包括与ATAC-seq预测进行结合。
10.ATAC-seq预测结合靶向基因编辑在构建不同抗性植物种质中的应用。
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