CN111465696A

CN111465696A - 用于ppo除草剂耐受性的方法和组合物

Info

Publication number: CN111465696A
Application number: CN201880080137.9A
Authority: CN
Inventors: C·T·拉鲁; F·莫施里; J·E·里姆; 周雪峰
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-07-28
Also published as: BR112020010451A2; US20190185873A1; US11124803B2; WO2019118726A2; JP2021506232A; AU2018385604A1; MX2020006287A; KR20200098494A; EP3724341A2; PH12020500549A1; CO2020008550A2; UY38007A; CL2020001566A1; AR113641A1; RU2020123081A; WO2019118726A3; US20220033839A1; CA3026528A1; CL2022002200A1; JP2024020385A

Abstract

本发明涉及生物技术并且提供用于赋予对原卟啉原氧化酶抑制剂除草剂的耐受性的新颖重组DNA分子和工程化蛋白质。本发明还提供了含有所述重组DNA分子的除草剂耐受性转基因植物、种子、细胞以及植物部分，以及其使用方法。

Description

用于PPO除草剂耐受性的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年12月15日提交的美国临时申请号62/599,386的优先权权益，该临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

发明领域

本发明涉及农业、植物生物技术以及分子生物学领域。更具体地说，本发明涉及编码提供对抑制原卟啉原氧化酶的除草剂的耐受性的工程化蛋白质的重组DNA分子，以及其使用方法。

序列表的并入

计算机可读形式的序列表通过电子方式与本申请一起提交，并且以全文引用的方式并入本申请中。序列表含于名为MONS429WO_ST25.txt的文件中，该文件的大小为296千字节(在操作系统MS Windows中测量)并且创建于2018年12月13日。

发明背景

农作物生产通常利用使用生物技术方法形成的转基因性状。可将异源基因(也称为转基因)引入植物中，以产生转基因性状。转基因在植物中表达赋予植物诸如除草剂耐受性等性状。转基因除草剂耐受性性状的实例包括草甘膦耐受性、草铵膦耐受性以及麦草畏耐受性。随着对常用除草剂具有抗性的杂草种类增加，本领域中需要新的除草剂耐受性性状。特别受关注的除草剂包括抑制原卟啉原氧化酶(PPO，EC 1.3.3.4)的除草剂，称为PPO除草剂。PPO除草剂提供对一系列除草剂抗性杂草的控制，从而使赋予对这些除草剂的耐受性的性状在合并有一种或多种其他除草剂耐受性性状的农作系统中特别有用。本发明提供了可用于在植物中提供PPO除草剂耐受性的新颖工程化除草剂耐受性原卟啉原氧化酶。

发明内容

在一个方面中，本发明提供了一种重组DNA分子，所述重组DNA分子包含可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子的异源启动子，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少约50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N。在某些实施方案中，所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有具有至少约50％序列同一性、至少约60％序列同一性、至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约91％序列同一性、至少约92％序列同一性、至少约93％序列同一性、至少约94％序列同一性、至少约95％序列同一性、至少约96％序列同一性、至少约97％序列同一性、至少约98％序列同一性以及至少约99％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N。在一些实施方案中，所述蛋白质包含所述氨基酸取代中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个。在另一实施方案中，所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:24-124和249-263组成的组的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性。在另一实施方案中，所述蛋白质包含HemG类原卟啉原氧化酶。在另一实施方案中，至少一个第一氨基酸取代位于此类HemG类原卟啉原氧化酶的长链插入环中。在另一实施方案中，本发明的重组DNA分子包含在植物细胞的基因组中。

在某些实施方案中，异源启动子(例如在植物细胞中具功能性的启动子)可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N。此类所得DNA分子还可包含转运序列，所述转运序列的功能为定位细胞内的蛋白质。

在另一方面中，本发明提供了一种DNA构建体，所述DNA构建体包含本文所提供的重组DNA分子，诸如包含可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子的异源启动子的重组DNA分子，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N。在另一实施方案中，工程化蛋白质由本文提供的重组DNA分子编码。

在另一方面中，本发明提供了一种转基因植物、种子、细胞或植物部分，所述转基因植物、种子、细胞或植物部分包含本文所提供的重组DNA分子，诸如包含可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子的异源启动子的重组DNA分子，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N。在一个实施方案中，所述转基因植物、种子、细胞或植物部分对至少一种PPO除草剂耐受。在另一实施方案中，PPO除草剂选自由以下组成的组：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯(carfentrazone-ethyl)、甲磺草胺、氟噻甲草酯(fluthiacet-methyl)、丙炔噁草酮(oxadiargyl)、噁草酮、吡草醚(pyraflufen-ethyl)、苯嘧磺草胺以及S-3100。在另一实施方案中，所述转基因植物、种子、细胞或植物部分对至少一种第二除草剂耐受。

在另一方面中，本发明提供了一种用于赋予植物、种子、细胞或植物部分PPO除草剂耐受性的方法，所述方法包括：在所述植物、种子、细胞或植物部分中异源表达本发明的工程化蛋白质。在一些实施方案中，除草剂耐受性是针对选自由以下组成的组的至少一种PPO除草剂：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、丙炔噁草酮、噁草酮、吡草醚、苯嘧磺草胺以及S-3100。

在另一方面中，本发明提供了一种产生除草剂耐受性植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)将植物细胞用本文所提供的重组DNA分子，诸如包含可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子的异源启动子的重组DNA分子转化，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N；以及b)从包含所述重组DNA分子的植物细胞再生植物。在一个实施方案中，所述方法还包括针对PPO除草剂耐受性对所述植物或其后代进行选择的步骤。在另一实施方案中，所述方法还包括使再生的植物与自身或与第二植物杂交以产生后代的步骤。

在另一方面中，本发明提供了一种控制或阻止植物生长区域中的杂草生长的方法，所述方法包括将有效量的至少一种PPO除草剂施用于植物生长区域，所述植物生长区域包含如本文所提供的转基因植物或种子，诸如包含含有可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子的异源启动子的重组DNA分子的转基因植物或种子，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N，其中所述转基因植物或种子对PPO除草剂耐受。在某些实施方案中，PPO除草剂选自由以下组成的组：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、丙炔噁草酮、噁草酮、吡草醚、苯嘧磺草胺以及S-3100。

在另一方面中，本发明提供了一种鉴定编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核甘酸序列的方法，所述方法包括a)将缺乏除草剂耐受性PPO酶活性的大肠杆菌(E.coli)菌株用细菌表达载体转化，所述细菌表达载体包含本文所提供的重组DNA分子，诸如包含可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子的异源启动子的重组DNA分子，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N；以及b)使所述转化的大肠杆菌生长，以鉴定具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。

在另一方面中，本发明提供了一种筛选除草剂耐受性基因的方法，所述方法包括a)使本文所提供的重组DNA分子，诸如包含可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子的异源启动子的重组DNA分子在植物细胞中表达，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N；以及b)鉴定对PPO除草剂展现耐受性的植物细胞。

在另一方面中，本发明提供了一种产生对PPO除草剂和至少一种其他除草剂耐受的植物的方法，所述方法包括a)获得转基因植物，所述转基因植物包含本文所提供的重组DNA分子，诸如包含可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子的异源启动子的重组DNA分子，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N；b)使所述植物与包含对至少一种其他除草剂的耐受性的第二植物杂交，以及c)选择由所述杂交产生的包含对PPO除草剂和至少一种其他除草剂的耐受性的后代植物。

在另一方面中，本发明提供了一种减少除草剂耐受性杂草的发育的方法，所述方法包括a)在作物生长环境中培育转基因植物，所述转基因植物包含本文所提供的重组DNA分子，诸如包含可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子的异源启动子的重组DNA分子，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置处包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N；以及b)将PPO除草剂和至少一种其他除草剂施用于作物生长环境，其中所述作物植物对PPO除草剂和至少一种其他除草剂耐受。在一个实施方案中，PPO除草剂选自由以下组成的组：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、丙炔噁草酮、噁草酮、吡草醚、苯嘧磺草胺以及S-3100。在另一实施方案中，所述至少一种其他除草剂选自由以下组成的组：ACC酶抑制剂、ALS抑制剂、EPSPS抑制剂、合成植物生长素、光合作用抑制剂、谷氨酰胺合成抑制剂、HPPD抑制剂、PPO抑制剂以及长链脂肪酸抑制剂。在另一实施方案中，ACC酶抑制剂为芳氧基苯氧基丙酸酯或环己二酮；ALS抑制剂为磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶或三唑啉酮；EPSPS抑制剂为草甘膦；合成植物生长素为苯氧基除草剂、苯甲酸、羧酸或缩氨基脲；光合作用抑制剂为三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑或脲；谷氨酰胺合成抑制剂为草铵膦；HPPD抑制剂为异噁唑、吡唑啉酮或三酮；PPO抑制剂为二苯醚、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮或嘧啶二酮；或者长链脂肪酸抑制剂为氯乙酰胺、氧乙酰胺或吡唑。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一张以彩色展示的图。在请求并支付必要费用后将由专利局提供本专利或专利申请公布的具有一张或多张彩色图的副本。

图1A和图1B：示出了23种微生物HemG PPO酶的子集的长链插入环的序列比对，保守长链插入环以黑色突出显示。序列相对于H_N90(SEQ ID NO:1)以降序的总体序列同一性进行排列。HemG001和HemG003代表与H_N90具有超过70％的总体序列同一性的HemG PPO蛋白质。接下来的15个未框起的序列代表与H_N90具有50-70％总体序列同一性的HemG PPO蛋白质。最后一个框的5个序列代表与H_N90具有40-50％总体序列同一性的HemG PPO蛋白质。

图2：示出了显示所有可能的mRNA三联体密码子(其中DNA分子中的T在RNA分子中被U代替)和由每个密码子编码的氨基酸的通用遗传密码图表。

图3：示出了由微生物基因组筛选在H_N90(SEQ ID NO:1)的长链插入环中的每个残基处发现的所有变化的图解表示。顶部的黑色框代表天然H_N90序列。H_N90序列下方的框列出了20个氨基酸中的每一个。H_N90序列上方所列的编号指明了相对氨基酸位置。实心灰色阴影代表在≥50％序列同一性组中所鉴定的氨基酸变化。竖灰色条纹阴影代表在40％-50％序列同一性组中所鉴定的氨基酸变化。剩余的白色未填充框代表在起始微生物数据集中在≥40％总体序列同一性下未观察到的氨基酸变化。

图4：示出了从酶功能分析中获得的结果的图解表示。顶部的黑色框代表天然H_N90序列(SEQ ID NO:1)。H_N90序列下方的框列出了20个氨基酸中的每一个。H_N90序列上方所列的编号为相对氨基酸位置。竖灰色条纹阴影指示氨基酸修饰使得酶为非功能性的。浅灰色阴影与黑色字母指示氨基酸修饰引起酶功能受损。深灰色阴影与白色字母指示氨基酸变化使酶保持完全功能性。黑色阴影代表H_N90序列中的天然氨基酸。剩余的白色未填充框代表此分析中未测到的氨基酸变化。

图5：示出了从除草剂耐受性分析获得的结果的图解版本。耐受性是相对于H_N90耐受性加以测量。顶部的黑色框代表天然H_N90序列(SEQ ID NO:1)。H_N90序列下方的框列出了20个氨基酸中的每一个。H_N90序列上方所列的编号为相对氨基酸位置。竖灰色条纹阴影代表0-24的相对耐受性得分，这表明氨基酸修饰几乎不赋予除草剂耐受性。竖灰色条纹阴影代表25-49的相对耐受性得分，这表明氨基酸修饰赋予弱除草剂耐受性。实心浅灰色阴影与黑色字母代表50-74的相对耐受性得分，这表明氨基酸修饰赋予中等除草剂耐受性。实心深灰色阴影与白色字母代表75-100的相对耐受性得分，这表明氨基酸修饰赋予良好除草剂耐受性。具有深灰色阴影和粗黑色边框的框代表显示大于100的相对耐受性得分的氨基酸修饰，这表明氨基酸修饰赋予比H_N90更佳的除草剂耐受性。黑色阴影代表H_N90序列中的天然氨基酸。剩余的白色未填充框代表此分析中未测到的氨基酸变化。

序列简述

SEQ ID NO:1为H_N90的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:10为具有保守长链插入环的微生物HemG PPO酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:23为长链插入环中具有变化的多种HemG PPO酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:249至SEQ ID NO:263为各自将突变合并至长链插入环中的116个重组HemG PPO变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO:125为编码SEQ ID NO:1的DNA序列。

SEQ ID NO:126至SEQ ID NO:147分别为编码SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:23的DNA序列。

SEQ ID NO:148至SEQ ID NO:248和SEQ ID NO:264至SEQ ID NO:278分别为编码SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:249至SEQ ID NO:263的DNA序列。

具体实施方式

提供以下描述和定义以更好地界定本发明并且在本发明的实践中指导本领域的一般技术人员。除非另外说明，否则术语应根据相关领域的一般技术人员的常规用法来理解。

原卟啉原氧化酶在叶绿素与血红素生物合成途径中起作用，其中原卟啉原氧化酶将原卟啉原IX转化为原卟啉IX。除草剂耐受性原卟啉原氧化酶可用于产生对施用一种或多种PPO除草剂敏感的细胞、植物以及种子，并且可用于农业和杂草控制方法中。本发明提供了作为除草剂耐受性原卟啉原氧化酶的新颖工程化蛋白质，以及编码这些新颖工程化蛋白质的重组DNA分子、包含这些新颖工程化蛋白质的组合物以及使用这些新颖工程化蛋白质的方法。举例来说，在一个实施方案中，本发明提供了用于在细胞、植物以及种子中表达的DNA构建体，所述DNA构建体包含编码工程化除草剂耐受性原卟啉原氧化酶的重组DNA分子。在另一实施方案中，本发明提供了具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的工程化蛋白质。在另一实施方案中，本发明提供了用于使用蛋白质工程化和生物信息学工具来获得和改进除草剂耐受性原卟啉原氧化酶的方法和组合物。本发明还提供了用于产生对PPO除草剂耐受的细胞、植物以及种子的方法和组合物，以及使用所述细胞、植物以及种子的杂草控制方法。

本发明提供了新颖工程化蛋白质和编码它们的重组DNA分子。如本文所用，术语“工程化的”是指通常不会存在于自然界中，而是通过人类干预形成的非天然DNA、蛋白质、细胞或有机体。“工程化蛋白质”、“工程化酶”或“工程化PPO”是指在实验室中使用生物技术、蛋白质设计或蛋白质工程化中的一种或多种技术，诸如分子生物学、蛋白质生物化学、细菌转化、植物转化、定点诱变、使用随机诱变、基因组编辑、基因编辑、基因克隆、DNA连接、DNA合成、蛋白质合成以及DNA改组的定向进化构想并形成氨基酸序列的蛋白质、酶或PPO。举例来说，工程化蛋白质可相对于野生型蛋白质的编码序列具有一个或多个缺失、插入或取代，并且每个缺失、插入或取代可由一个或多个氨基酸组成。可使用基因工程化来形成编码具除草剂耐受性并且如本文所描述相对于野生型PPO蛋白质包含至少一个第一氨基酸取代的工程化蛋白质(例如工程化PPO)的DNA分子。

本文提供的工程化蛋白质的实例为包含选自以下的一个或多个氨基酸取代的除草剂耐受性PPO：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N，包括其所有可能的组合，其中一个或多个氨基酸取代的位置是相对于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。在特定实施方案中，本文提供的工程化蛋白质包含此类取代的任何组合中的一者、二者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或更多者。

在一个实施方案中，由本发明提供的工程化蛋白质具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性。如本文所用，“除草剂耐受性原卟啉原氧化酶”意指在一种或多种PPO除草剂存在下原卟啉原氧化酶维持至少一些其原卟啉原氧化酶活性的能力。术语“原卟啉原氧化酶活性”意指催化原卟啉原IX的六电子氧化(除去电子)以形成原卟啉IX，即催化原卟啉原脱氢以形成原卟啉的能力。原卟啉原氧化酶的酶活性可通过本领域中已知的任何手段来测量，例如通过酶分析，其中在一种或多种PPO除草剂存在下原卟啉原氧化酶的产物的产生或原卟啉原氧化酶的底物的消耗经由荧光、高效液相色谱法(HPLC)或质谱法(MS)来测量。用于测量原卟啉原氧化酶的酶活性的分析的另一实例为细菌分析，诸如本文所描述的分析，由此使重组原卟啉原氧化酶在其他情况下缺乏PPO活性的细菌细胞中表达，并且测量重组原卟啉原氧化酶补充此敲除表型的能力。如本文中所用，“hemG敲除菌株”意指缺乏HemG活性以致不能在不含血红素的生长培养基上生长，或使得生长在不存在血红素的情况下相对于包含功能性HemG的在其他方面同基因的菌株可检测地受损的有机体(诸如大肠杆菌)或有机体细胞。例如大肠杆菌的hemG敲除菌株可根据本领域中的知识，例如根据大肠杆菌HemGPPO序列(Ecogene登录号EG11485；Sasarman等,"Nucleotide sequence of the hemG geneinvolved in the protoporphyrinogen oxidase activity of E.coli K12"Can JMicrobiol 39:1155-1161,1993)来制备。

工程化蛋白质可通过改变或修饰野生型蛋白质序列以产生新蛋白质来产生，所述新蛋白质具有一种或多种改良的特性或诸如改变的V_最大、K_m、K_i、IC₅₀、底物特异性、抑制剂/除草剂特异性、底物选择性、与细胞中的其他组分(诸如伴侣蛋白或膜)相互作用的能力以及蛋白质稳定性等有用蛋白质特性的新颖组合。修饰可在蛋白质中的特定氨基酸位置进行，并且可通过用替代氨基酸取代在自然界中(即，在野生型蛋白质中)在相同位置发现的典型氨基酸来进行。可以蛋白质序列中的单个氨基酸取代的形式或与一个或多个其他修饰(诸如一个或多个其他氨基酸取代、缺失或添加)组合实现氨基酸修饰。在本发明的一个实施方案中，工程化蛋白质与野生型蛋白质相比具有改变的蛋白质特性(诸如使得对一种或多种除草剂的敏感性降低的那些蛋白质特性)，或具有赋予表达工程化蛋白质的转基因植物对一种或多种除草剂的耐受性的能力。因此在一个实施方案中，本发明提供了一种具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的工程化蛋白质(诸如PPO酶)以及编码它的重组DNA分子，所述工程化蛋白质具有选自由以下组成的的一个或多个氨基酸取代：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N以及其所有组合，其中一个或多个氨基酸取代的位置是相对于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。在特定实施方案中，本文提供的工程化蛋白质包含此类取代的任何组合中的一者、二者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或更多者，其中修饰在相对于功能与如SEQ ID NO:1中所提供的氨基酸中类似的位置的位置处进行。表1中提供了重组或工程化HemG变体PPO的氨基酸序列。

表1.重组或工程化HemG变体PPO的氨基酸序列.

可通过将要进行突变的PPO酶的氨基酸序列与具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的PPO酶的氨基酸序列比对在任何PPO酶的类似位置进行类似修饰。编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的PPO酶的序列的一个实例为SEQ ID NO:1。图1A和图1B示出了H_N90、SEQ ID NO:1的PPO酶、示例性已知PPO酶(SEQ ID NOs:2-10)以及多种PPO酶(SEQ IDNOs:11-23)的比对。使用如图1A和图1B中所示的序列同一性信息例如在SEQ ID NO:2-23的蛋白质中进行本文所描述的氨基酸修饰以产生具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的PPO酶完全在本领域技术人员的能力范围内。表2中提供了微生物HemG PPO的氨基酸序列。

表2.微生物HemG PPO的氨基酸序列.

如本文所用，术语“重组”是指作为基因工程化的结果并且通过人类干预形成的非天然存在的DNA、蛋白质、细胞、种子或有机体。“重组DNA分子”为包含非天然存在并且因此为人类干预的结果的DNA序列的DNA分子，诸如包含彼此异源的至少两个DNA分子的DNA分子。重组DNA分子的实例为可操作地连接至异源启动子的编码除草剂耐受性原卟啉原氧化酶的本文所提供的DNA分子。“重组蛋白质”为包含非天然存在并且因此为人类干预的结果的氨基酸序列的蛋白质，诸如工程化蛋白质。重组细胞、种子或有机体为包含转基因或异源DNA或蛋白质的细胞、种子或有机体，例如包含本发明的DNA构建体或工程化蛋白质的转基因植物细胞、种子或植物。

如本文所用，“野生型”意指天然存在的。“野生型DNA分子”、“野生型蛋白质”为天然存在的DNA分子或蛋白型式，即自然界中预先存在的DNA分子或蛋白质型式。DNA分子或蛋白质的野生型型式可用于与重组或工程化DNA分子或蛋白质比较。可用于与由本发明提供的工程化蛋白质比较的野生型蛋白质的实例为来自如SEQ ID NO:1所提供的阴沟肠杆菌(E.cloacae)的PPO酶(H_N90)。

“野生型植物”为天然存在的植物。此类野生型植物还可用于与包含重组或工程化DNA分子或蛋白质的植物比较。可用于与包含重组或工程化DNA分子或蛋白质的植物比较的野生型植物的实例可为与包含工程化DNA分子或蛋白质(诸如赋予除草剂耐受性性状的蛋白质)的植物类型相同的植物，并且因此在遗传上不同于包含除草剂耐受性性状的植物。

在某些实施方案中，野生型植物还可用作或称为“对照植物”。如本文所用，“对照”意指出于比较目的而设计的实验对照。举例来说，转基因植物分析中的对照植物为与实验植物(即所要测试的植物)类型相同的植物，但不含实验植物的转基因插入、重组DNA分子或DNA构建体。可用于与转基因植物比较的对照植物的实例包括：对于玉米植物，非转基因LH244玉米(ATCC保藏号PTA-1173)；对于与大豆植物比较：非转基因A3555大豆(ATCC保藏号PTA-10207)；对于与棉花植物比较：非转基因Coker 130(植物品种保护(PVP)号8900252)；对于与芥花或甘蓝型油菜(Brassica napus)植物比较：非转基因甘蓝型油菜品种65037恢复系(加拿大植物育种者权利申请06-5517)；对于与小麦植物比较：非转基因小麦品种萨姆森(Samson)种质(PVP 1994)。

如本文所用，术语“DNA”或“DNA分子”是指从5′(上游)端至3′(下游)端读取的基因组或合成来源的双链DNA分子(即，脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或多核苷酸分子)。如本文所用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文所用的命名法对应于美国联邦法规§1.822的标题37，并且阐述于WIPO标准ST.25(1998)附录2的表格表1和表3中。

本公开提供了一种编码具有选自由以下组成的组的一个或多个胺基酸取代的具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N以及其所有组合，其中一个或多个胺基酸取代的位置是相对于SEQ ID NO:1中所示的胺基酸位置。

如本文所用，术语“编码蛋白质的DNA分子”是指包含编码蛋白质的DNA序列的DNA分子。如本文所用，术语“蛋白质”是指由肽(酰胺)键连接的氨基酸的链，并且包括以生物功能方式折叠或排列的多肽链与不以生物功能方式折叠或排列的多肽链两者。如本文所用，“蛋白质编码序列”意指编码蛋白质的DNA序列。如本文所用，“序列”意指核苷酸或氨基酸的依序排列。“DNA序列”可指核苷酸序列或包含核苷酸序列的DNA分子；“蛋白质序列”可指氨基酸序列或包含氨基酸序列的蛋白质。蛋白质编码序列的边界通常由5'端的翻译起始密码子和3'端的翻译终止密码子确定。

如本文所用，术语“分离的”是指至少部分地使分子与在其天然状态下通常与它相关的其他分子分离。在一个实施方案中，术语“分离的”是指DNA分子与在天然状态下通常侧接DNA分子的核酸分离。举例来说，如果编码天然存在于细菌中的蛋白质的DNA分子不在天然地发现编码所述蛋白质的DNA分子的细菌的DNA内，那么它将为分离的DNA分子。因此，在本文中例如因重组DNA或植物转化技术而融合至或可操作地连接至在自然界中不相关的一个或多个其他DNA分子的DNA分子被认为是分离的。此类分子即使在与其他DNA分子一起整合至宿主细胞的染色体中或存在于核酸溶液中时也被认为是分离的。

可使用任何数量的本领域技术人员熟知的方法来分离和操纵如本文中所公开的DNA分子或其片段。举例来说，可使用聚合酶链式反应(PCR)技术来扩增特定起始DNA分子或产生原始分子的变体。还可通过其他技术来获得DNA分子或其片段，诸如通过用化学手段直接合成片段，正如通常通过使用自动寡核苷酸合成仪所实施。

由于遗传密码的简并性，多种不同DNA序列可编码蛋白质，诸如本文所公开的改变或工程化的蛋白质。举例来说，图2提供了显示所有可能的mRNA三联体密码子(其中DNA分子中的T在RNA分子中被U代替)和由每个密码子编码的氨基酸的通用遗传密码图表。可通过使用本领域已知的方法和图2中提供的信息向编码野生型PPO酶的DNA序列中引入突变来产生编码具有本文所描述的氨基酸取代的PPO酶的DNA序列。形成编码相同或基本上相同的如本文所描述的改变或工程化的蛋白质的替代DNA序列完全在本领域技术人员的能力范围内。这些变体或替代DNA序列在本文所描述的实施方案的范围内。如本文所用，提到“基本上相同的”序列是指编码不实质上改变由本文所描述的实施方案的DNA分子编码的蛋白质的功能活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。编码野生型或工程化蛋白质的核苷酸序列的等位基因变体也包含在本文所描述的实施方案的范围内。除具体列举或天然存在于野生型或工程化PPO酶中的那些氨基酸取代外的氨基酸取代也预期在本文所描述的实施方案范围内，只要具有取代的PPO酶仍大体上保留相同的本文所描述的功能活性即可。

本发明的重组DNA分子可完全或部分通过本领域中已知的方法合成并修饰，其中需要提供可用于DNA操纵的序列(诸如限制性内切酶识别位点或基于重组的克隆位点)、植物偏爱序列(诸如植物-密码子使用或Kozak共有序列)或可用于DNA构建体设计的序列(诸如间隔子或接头序列)。本发明包括与本文所提供的重组DNA分子或氨基酸序列中的任一者具有至少50％序列同一性、至少60％序列同一性、至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少91％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性及至少99％序列同一性并且具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的重组DNA分子和工程化蛋白质。如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“序列同一性％”是指当对两个序列进行最佳比对(在比较窗口中具有共计不到参考序列的20％的适当核苷酸或氨基酸插入、缺失或空隙)时，与测试(‘目标’)序列(或它的互补链)相比，在参考(‘查询’)序列(或它的互补链)的线性多核苷酸或氨基酸序列中相同核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对比较窗口的序列的最佳比对为本领域技术人员熟知的并且可通过诸如以下工具来进行：史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)的局部同一性算法、尼德曼(Needleman)和文施(Wunsch)的同一性比对算法、皮尔森(Pearson)和利普曼(Lipman)的相似性检索法以及通过这些算法的计算机实现方式，诸如GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA，这些计算机实现方式可用作例如使用默认参数的

Wisconsin

(Accelrys Inc.,San Diego,CA)、MEGAlign(DNAStar Inc.,1228S.Park St.,Madison,WI 53715)以及MUSCLE(3.6版)(RC Edgar,“MUSCLE:multiple sequencealignment with high accuracy and high throughput”Nucleic Acids Research 32(5):1792-7(2004))的序列分析软件包的一部分。测试序列与参考序列的比对区段的“同一性分数”为两个所比对序列共同拥有的相同组分的数目除以参考序列区段中所比对的部分(即整个参考序列或参考序列的更小的确定部分)中的组分总数目。序列同一性百分比以同一性分数乘以100表示。可将一个或多个序列与全长序列或其部分或与更长的序列比较。

如本文所用，“DNA构建体”为包含两个或更多个异源DNA序列的重组DNA分子。DNA构建体可用于转基因表达并且可包含于载体和质粒中。可将DNA构建体用于载体中以进行转化(即，将异源DNA引入宿主细胞中)以产生重组细菌或转基因植物和细胞(并且因而还可含于转基因植物、种子、细胞或植物部分的质体DNA或基因组DNA中)。如本文所用，“载体”意指可用于细菌或植物转化的任何重组DNA分子。由本发明提供的DNA分子可例如作为具有可操作地连接至异源基因表达元件的DNA分子的DNA构建体的一部分插入载体中，所述异源基因表达元件在植物中起作用以实现由DNA分子编码的工程化蛋白质的表达。制备和使用DNA构建体和载体的方法为本领域中熟知的并且详细描述于例如包括Michael R.Green和Joseph Sambrook,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”(Fourth Edition)ISBN:978-1-936113-42-2,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY(2012)的手册和实验规程中。DNA构建体或包含DNA构建体的载体的组件包括可操作地连接至可转录核酸序列的一个或多个基因表达元件，诸如以下：用于表达可操作地连接的DNA的启动子、可操作地连接的编码蛋白质的DNA分子以及可操作地连接的3'未翻译区(UTR)。可用于实践本发明的基因表达元件包括但不限于以下类型的元件中的一者或多者：启动子、5'UTR、增强子、前导子、顺式作用元件、内含子、转运序列、3'UTR以及一个或多个可选标记物转基因。

术语“转基因”是指因人类干预诸如通过植物转化方法而人工合并至有机体的基因组中的DNA分子。如本文所用，术语“转基因的”意指包含转基因，例如“转基因植物”是指基因组中包含转基因的植物，并且“转基因性状”是指因存在合并至植物基因组中的转基因而带来或赋予的特征或表型。由于此类基因组改变，转基因植物为明显不同于相关野生型植物的植物并且转基因性状为不天然存在于野生型植物中的性状。本发明的转基因植物包含由本发明提供的重组DNA分子和工程化蛋白质。

如本文所用，术语“异源”是指两个或更多个事物之间在自然界中通常不相关，例如衍生自不同来源或通常不以任何其他方式一起存在于自然界中的关系。举例来说，如果通常不一起存在于自然界中或相同背景中，那么DNA分子或蛋白质可相对于另一DNA分子、蛋白质、细胞、植物、种子或有机体为异源的。在某些实施方案中，如果两个DNA分子通常不在相同背景下一起存在于自然界中，那么第一DNA分子对于第二DNA分子为异源的。举例来说，如果编码蛋白质的重组DNA分子与可操作地连接的启动子的组合通常不存在于自然界中，那么编码蛋白质的重组DNA分子相对于可操作地连接的启动子为异源的。类似地，如果蛋白质与第二可操作地连接的蛋白质(诸如转运肽)的组合通常不存在于自然界中，那么蛋白质相对于第二可操作地连接的蛋白质(诸如转运肽)为异源的。在另一实施方案中，如果编码PPO酶的重组DNA分子与可操作地连接的在植物细胞中具功能性的启动子的组合通常不存在于自然界中，那么编码PPO酶的重组DNA分子相对于可操作地连接的在植物细胞中具功能性的启动子为异源的。当重组DNA分子不会天然地存在于它插入其中的细胞、种子或有机体中时，所述重组DNA分子也可相对于所述细胞、种子或有机体为异源的。

“异源蛋白质”为存在于不天然存在于其中的植物、种子、细胞、组织或有机体中或可操作地连接至不天然地与其连接的蛋白质的蛋白质。异源蛋白质的实例为包含本文所描述的至少一个第一氨基酸取代并且在任何植物、种子、细胞、组织或有机体中表达的工程化PPO酶。另一实例为可操作地连接至不天然地与其连接的第二蛋白质(诸如转运肽或除草剂耐受性蛋白质)的蛋白质或使用基因工程化技术引入不天然存在于其中的植物细胞中的蛋白质。

如本文所用，“可操作地连接”意指两个或更多个DNA分子或两种或更多种蛋白质以使得一者可实现另一者的功能的方式相连接。可操作地连接的DNA分子或可操作地连接的蛋白质可为单一连续分子的一部分并且可能相邻或可能不相邻。举例来说，在DNA构建体中启动子与编码蛋白质的DNA分子可操作地连接，其中两个DNA分子如此排列使得启动子可实现转基因的表达。

本发明的DNA构建体可包括可操作地连接至由本发明提供的编码蛋白质的DNA分子的启动子，借此启动子驱使工程化蛋白质表达。可用于实践本发明的启动子包括在细胞中起作用以使可操作地连接的DNA分子表达的那些启动子，诸如细菌或植物启动子。植物启动子为变化的并且为本领域中熟知的并且包括例如可诱导的、病毒的、合成的、组成性的、时间调控的、空间调控的或空间时间调控的那些启动子。

在本发明的一个实施方案中，本文所提供的DNA构建体包括编码转运序列的DNA序列，所述转运序列可操作地连接至编码PPO酶的异源DNA序列，借此转运序列有助于定位细胞内的蛋白质分子。转运序列在本领域中称为信号序列、靶向肽、靶向序列、定位序列以及转运肽。转运序列的实例为叶绿体转运肽(CTP)、线粒体转运序列(MTS)或双重叶绿体和线粒体转运肽。通过促进细胞内的蛋白质定位，转运序列可增加重组蛋白的累积，防止蛋白质发生蛋白降解或提高除草剂耐受性水平，并且由此降低除草剂施用之后细胞、种子或有机体中的损伤水平。可与本发明结合使用的CTP及其他靶向分子为本领域中熟知的。可使编码转运序列的DNA序列可操作地连接至如本文所提供的编码PPO酶的DNA序列。此类可操作的连接可涉及去除PPO序列5'端的起始甲硫氨酸密码子(ATG)，不过不一定这样做，并且在去除或不去除起始甲硫氨酸密码子的情况下转运序列均将有助于定位细胞内的蛋白质分子。

如本文所用，“转基因表达”、“使转基因表达”、“蛋白质表达”以及“使蛋白质表达”意指通过将DNA分子转录至信使RNA(mRNA)中以及将mRNA翻译为多肽链，多肽链最终折叠成蛋白质的过程来产生蛋白质。可在DNA构建体中使编码蛋白质的DNA分子可操作地连接至异源启动子，用于使蛋白质在用重组DNA分子转化的细胞中表达。

在一个方面中，本发明提供了包含本发明的重组DNA分子或工程化蛋白质的细胞、组织、植物以及种子。这些包含重组DNA分子或工程化蛋白质的细胞、组织、植物以及种子对一种或多种PPO除草剂展现耐受性。

一种产生此类细胞、组织、植物以及种子的方法为通过植物转化。适合用于本发明的用于转化宿主植物细胞的方法包括使DNA可被引入细胞中的任何方法(例如其中将重组DNA构建体稳定整合至植物染色体中)并且为本领域中熟知的。两种有效并且广泛使用的用于细胞转化的方法为土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化和微弹轰击介导的转化。举例来说，美国专利号US 5,550,318；US 5,538,880；US 6,160,208；以及US 6,399,861中说明了微弹轰击法。举例来说，以全文引用的方式并入本文中的美国专利号US 5,591,616中描述了土壤杆菌属介导的转化方法。在使此类细胞再生为植物之前或之后，可针对重组DNA分子或工程化蛋白质的存在例如通过它所编码的酶活性选择具有本发明的重组DNA分子或工程化蛋白质的细胞。

产生本发明的细胞、植物以及种子的另一方法为通过使用位点特异性整合或基因组编辑进行基因组修饰。可利用通过使用基因组编辑方法对植物基因组进行靶向修饰通过对植物基因组DNA的修饰来形成改良的植物株系。如本文所用，“定点整合”是指使所关注的一个或多个核酸能够靶向插入植物基因组中的基因组编辑方法。适合用于改变野生型DNA序列或预先存在的转基因序列或用于使DNA在预定染色体位点处插入植物基因组中的方法包括本领域中已知的任何方法。示例性方法包括使用序列特异性核酸酶，诸如锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶或RNA引导的核酸内切酶(例如成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/级联系统)。若干实施方案涉及如由Sauer等,Plant Physiology 170(4):1917–1928(2016)所描述通过使用单链寡核苷酸将精确碱基对修饰引入植物基因组中的基因组编辑方法。用于对核酸序列进行修饰、使核酸序列缺失或将核酸序列插入基因组DNA中的基因组编辑方法为本领域中已知的。

在某些实施方案中，本发明提供了用编码工程化蛋白质的序列(诸如本发明的工程化PPO编码序列)或包含此类工程化蛋白质的表达盒对植物基因组内的现有编码序列(诸如PPO编码序列或另一现有转基因插入物)的修饰或替换。若干实施方案涉及使用已知基因组编辑方法，诸如锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶或RNA引导的核酸内切酶(例如成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/级联系统)。

因此，若干实施方案可涉及一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码位点特异性核酸酶的一个或多个表达盒以及任选的一种或多种任何相关蛋白质以执行基因组修饰。这些核酸酶表达盒可与用于模板化编辑的供体模板或包含编码如本文所描述的PPO蛋白质的核酸序列的表达盒存在于相同的分子或载体中(呈顺式)或存在于单独的分子或载体上(呈反式)。本领域中已知若干用于定点整合的方法涉及不同的序列特异性核酸酶(或蛋白质或引导RNA或两者的复合物)，从而切割基因组DNA以产生双链断裂(DSB)或在所需基因组位点或基因座处产生切口。如本领域中所了解，在修复由核酸酶引入的DSB或切口的过程期间，供体模板DNA、转基因或表达盒可变得在DSB或切口位点处整合至基因组中。要整合的DNA中存在一个或多个同源臂可促使插入序列在修复过程期间被接受并且通过同源重组靶向至植物基因组中，不过插入事件可通过非同源末端连接(NHEJ)来进行。

如本文所用，术语“双链断裂诱导剂”是指可在DNA分子中诱导双链断裂(DSB)的任何剂。在一些实施方案中，双链断裂诱导剂为位点特异性基因组修饰酶。

如本文所用，术语“位点特异性基因组修饰酶”是指可以序列特异性方式对核苷酸序列进行修饰的任何酶。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶通过诱导单链断裂对基因组进行修饰。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶通过诱导双链断裂对基因组进行修饰。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶包含胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶包含腺嘌呤脱氨酶。在本公开中，位点特异性基因组修饰酶包括核酸内切酶、重组酶、转座酶、脱氨酶、解旋酶以及其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶为序列特异性核酸酶。

在一个方面中，核酸内切酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)Argonaute(TtAgo)、强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo)、RNA引导的核酸酶(诸如CRISPR相关核酸酶，CRISPR相关核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、其同源物或其经修饰型式)。

在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶为重组酶。重组酶的非限制性实例包括与DNA识别基序连接的酪氨酸重组酶，本文所提供的选自由Cre重组酶、Gin重组酶、Flp重组酶以及Tnp1重组酶组成的组。在一个方面中，本文所提供的Cre重组酶或Gin重组酶拴系至锌指DNA结合结构域或TALE DNA结合结构域或Cas9核酸酶。在另一方面中，本文所提供的与DNA识别基序连接的丝氨酸重组酶选自由PhiC31整合酶、R4整合酶以及TP-901整合酶组成的组。在另一方面中，本文所提供的与DNA结合结构域连接的DNA转座酶选自由TALE-piggyBac和TALE-突变者(Mutator)组成的组。

可通过引入所关注的DNA和所提供的位点特异性基因组修饰酶将本文所提供的所关注的DNA中的任一者整合至染色体序列的目标位点中。本文所提供的任何方法可使用本文所提供的任何位点特异性基因组修饰酶。

在一个方面中，本发明提供了对PPO抑制剂除草剂耐受的细胞、植物以及种子。此类细胞、植物以及种子可用于诸如杂草控制和作物生产等农业方法中。

如本文所用，“除草剂”为用于控制、阻止或妨碍一种或多种植物生长的任何分子。示例性除草剂包括乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂(例如芳氧基苯氧基丙酸酯和环己二酮)；乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂(例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶以及三唑啉酮)；5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂(例如草甘膦)、合成植物生长素(例如苯氧基、苯甲酸、羧酸、缩氨基脲)、光合作用(光合系统II)抑制剂(例如三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑以及脲)、谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂(例如草铵膦和双丙氨膦(bialaphos))、4-羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂(例如异噁唑、吡唑啉酮以及三酮)、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂(例如二苯醚、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮以及嘧啶二酮)、极长链脂肪酸抑制剂(例如氯乙酰胺、氧乙酰胺以及吡唑)、纤维素生物合成抑制剂(例如茚嗪氟草胺(indaziflam))、光合系统I抑制剂(例如百草枯(paraquat))、微管组装抑制剂(例如二甲戊乐灵(pendimethalin))以及八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂(例如达草灭(norflurazone))等。

如本文所用，“PPO除草剂”为靶向原卟啉原氧化酶(PPO)并且抑制其酶活性的化学品，原卟啉原氧化酶催化原卟啉原IX脱氢以形成原卟啉IX，原卟啉IX为血红素和叶绿素的前体。原卟啉原氧化酶的抑制使得形成反应性氧物质，从而引起细胞膜破裂并且最终引起易感细胞死亡。PPO除草剂为本领域中熟知的并且可商购获得。PPO除草剂的实例包括但不限于二苯醚(诸如三氟羧草醚、其盐和酯、苯草醚(aclonifen)、治草醚(bifenox)、其盐和酯、氟乳醚(ethoxyfen)、其盐和酯、氟草醚(fluoronitrofen)、呋氧草醚(furyloxyfen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、氯硝醚(chlomethoxyfen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)、其盐和酯、乳氟禾草灵、其盐和酯、乙氧氟草醚以及氟磺胺草醚、其盐和酯)；噻二唑(诸如氟噻甲草酯和噻二唑草胺(thidiazimin))；嘧啶二酮或苯基尿嘧啶(诸如双苯嘧草酮(benzfendizone)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、[3-2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶氧基]乙酸乙酯(CAS登记号353292-31-6并且在本文中称为S-3100)、氟嘧苯甲酸(flupropacil)、苯嘧磺草胺以及氟嘧硫草酯(tiafenacil))；苯基吡唑(诸如异丙吡草酯(fluazolate)、吡草醚以及吡草醚乙酯)；噁二唑(诸如丙炔噁草酮和噁草酮)；三唑啉酮(诸如唑啶草酮、酰苯草酮(bencarbazone)、唑草酮(carfentrazone)、其盐和酯以及甲磺草胺)；噁唑烷二酮(诸如环戊噁草酮)；N-苯基邻苯二甲酰亚胺(诸如吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟烯草酸(flumiclorac)、氟烯草酸戊酯以及丙炔氟草胺)；苯并噁嗪酮衍生物(诸如1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3,4-二氢-3-氧代-4-丙-2-炔基-2H-1,4-苯并噁嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮)；氟哒嗪草酯(flufenpyr)和氟哒嗪草乙酯(flufenpyr-ethyl)；双唑草腈(pyraclonil)；以及氟唑草胺(profluazol)。由本发明提供的原卟啉原氧化酶和细胞、种子、植物以及植物部分对一种或多种PPO除草剂展现除草剂耐受性。

如本文所用，“除草剂耐受性的”或“除草剂耐受性”意指完全或部分不受存在或施用一种或多种除草剂影响(例如在施用时抵抗除草剂的毒性作用)的能力。如果在存在一种或多种除草剂的情况下细胞或有机体能够维持至少一些正常生长或表型，那么所述细胞或有机体为“除草剂耐受性的”。如果性状的存在可使得细胞、植物或种子对除草剂的耐受性与野生型或对照细胞、植物或种子相比有所改善，那么所述性状为除草剂耐受性性状。包含除草剂耐受性性状的作物可持续生长并且极少因除草剂的存在而受影响。如果目标酶在存在除草剂的情况下相对于野生型或对照酶展现改善的酶活性，那么目标酶为“除草剂耐受性的”。除草剂耐受性可为对特定除草剂完全或部分不敏感，并且可以对特定除草剂的耐受性或不敏感性百分比(％)表示。

所涵盖的可产生的具有本发明的除草剂耐受性性状的植物可包括例如任何植物，包括作物植物，诸如大豆(橹豆(Glycine max))、玉米(玉蜀黍(Zea mays))、棉花(棉属(Gossypium sp.))以及芸苔属(Brassica)植物等。

可将除草剂施用于包含由本发明提供的植物和种子的植物生长区域作为控制杂草的方法。由本发明提供的植物和种子包含除草剂耐受性性状并且因而对一种或多种PPO除草剂的施用具耐受性。除草剂施用可为所建议的商业比率(1X)或其任何分数或倍数，诸如两倍于所建议的商业比率(2X)。除草剂比率可根据除草剂和配分表示为每英亩每磅酸当量(lb ae/英亩)或每公顷每克酸当量(g ae/ha)或表示为每英亩活性成分磅数(lb ai/英亩)或每公顷活性成分克数(g ai/ha)。除草剂施用包含至少一种PPO除草剂。在施用除草剂时植物生长区域可能包含或可能不包含杂草植物。在一个区域中用于控制杂草的一种或多种PPO除草剂的除草有效剂量可由一个生长季节中约0.1X至约30X标记比率的范围组成。表3中提供了一些示例性PPO除草剂的1X标记比率。一(1)英亩等于2.47105公顷并且一(1)磅等于453.592克。除草剂比率可如下在英制与公制之间转换：(lb ai/ac)乘以1.12＝(kgai/ha)和(kg ai/ha)乘以0.89＝(lb ai/ac)。

表3.示例性PPO除草剂

除草剂施用可为依序进行的或与若干PPO除草剂中的一种、两种或组合或任何其他相容除草剂桶混。在生长季节中可将一种除草剂或两种或更多种除草剂组合或单独多次施用用于包含本发明的转基因植物的区域以控制广谱的双子叶杂草、单子叶杂草或两者，例如两次施用(诸如种植前施用和出土后施用或出土前施用和出土后施用)或三次施用(诸如种植前施用、出土前施用以及出土后施用或出土前施用和两次出土后施用)。

如本文所用，“杂草”为任何不希望的植物。植物可对于农业或园艺目的通常被视为不希望的(例如苋属(Amaranthus)物种)或可在特定情况下被视为不希望的(例如不同物种领域内的一个物种的作物植物，也称为自生植物)。

本发明的转基因植物、子代、种子、植物细胞以及植物部分还可含有一种或多种额外的性状。可通过使含有包含由本发明提供的重组DNA分子的转基因的植物与含有一种或多种额外的性状的另一植物杂交来引入额外的性状。如本文所用，“杂交”意指培育两种个别植物以产生子代植物。因此可使两种植物杂交以从每个母体产生含有所需性状的子代。如本文所用，“子代”意指亲本植物的任一代后代，并且转基因子代包含由本发明提供并且从至少一种亲本植物继承的DNA构建体。

还可通过用包含由本发明提供的重组DNA分子的DNA构建体(例如用作为用于植物转化的相同载体的一部分存在的所有DNA构建体)针对所述一种或多种额外的转基因性状对DNA构建体进行共转化或通过将一种或多种额外的性状插入包含由本发明提供的DNA构建体的转基因植物中或反之亦然(例如通过对转基因植物或植物细胞使用植物转化或基因组编辑的方法中的任一者)来引入一种或多种额外的性状。此类额外性状包括但不限于增加的抗虫性、增加的水分利用效率、增加的产量表现、增加的抗旱性、增加的种子质量、改善的营养质量、杂交种子产量以及除草剂耐受性，其中所述性状是相对于野生型植物测量的。示例性额外除草剂耐受性性状可包括对诸如以下的一种或多种除草剂的转基因或非转基因耐受性：ACC酶抑制剂(例如芳氧基苯氧基丙酸酯和环己二酮)、ALS抑制剂(例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶以及三唑啉酮)EPSPS抑制剂(例如草甘膦)、合成植物生长素(例如苯氧基、苯甲酸、羧酸、缩氨基脲)、光合作用抑制剂(例如三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑以及脲)、谷氨酰胺合成抑制剂(例如草铵膦)、HPPD抑制剂(例如异噁唑、吡唑啉酮以及三酮)、PPO抑制剂(例如二苯醚、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮以及嘧啶二酮)以及长链脂肪酸抑制剂(例如氯乙酰胺、氧乙酰胺以及吡唑)等。可用于产生额外除草剂耐受性性状的除草剂耐受性蛋白质的实例为本领域中熟知的并且包括但不限于草甘膦耐性5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(例如CP4EPSPS，2mEPSPS)、草甘膦氧化还原酶(GOX)、草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)、除草剂耐受性乙酰乳酸合酶(ALS)/乙酰羟基酸合酶(AHAS)、除草剂耐受性4-羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、麦草畏单加氧酶(DMO)、草丁膦乙酰转移酶(PAT)、除草剂耐受性谷氨酰胺合成酶(GS)、2,4-二氯苯氧基丙酸双加氧酶(TfdA)、R-2,4-二氯苯氧基丙酸双加氧酶(RdpA)、S-2,4-二氯苯氧基丙酸双加氧酶(SdpA)、除草剂耐受性原卟啉原氧化酶(PPO)以及细胞色素P450单加氧酶。示例性抗虫性性状可包括对鳞翅目、鞘翅目、半翅目、缨翅目、双翅目、膜翅目以及直翅目等目中的一者或多者内的一个或多个昆虫成员的抗性。此类额外性状为本领域技术人员熟知的；例如美国农业部(USDA)动植物健康检查服务部门(APHIS)提供了此类转基因性状的列表。

可在本领域中已知的任何育种方法情况下使用对PPO除草剂耐受的转基因植物和子代。在包含两个或更多个性状的植物株系中，所述性状在包含三个或更多个转基因性状的植物株系中可为独立分隔的、相关联的或两者的组合。正如营养繁殖一般，还涵盖与亲本植物回交和与非转基因植物异交。常用于不同性状和作物的育种方法的描述为本领域技术人员熟知的。为确认特定植物或种子中存在所述一个或多个转基因，可进行多种分析。此类分析包括例如分子生物学分析，诸如南方和北方墨点分析、PCR以及DNA测序；生物化学分析，诸如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫手段(ELISA和西方墨点法)或通过酶功能；植物部分分析，诸如叶或根分析；以及通过分析整个植物的表型。

因回交转化过程实现转基因性状种质渗入植物基因型中。转基因性状已种质渗入其中之植物基因型可被称为回交转化的基因型、系、近交种或杂交种。类似地，缺乏所需转基因性状的植物基因型可被称为未转化的基因型、系、近交种或杂交种。

如本文所用，术语“包含”意指“包括但不限于”。

在已详细描述本发明的情况下，将清楚的是，在不背离随附权利要求书中所确定的本发明范围的情况下，修改、变化以及等效实施方案为可能的。此外，应了解，本公开中的实施例是作为非限制性实施例而被提供。

实施例

实施例1：微生物HemG蛋白质的长链环内的序列多样性

针对蛋白质的长链插入环的多样性对不同的HemG PPO酶集合进行检验。长链插入环为微生物HemG PPO酶的定义特征并且在存在主要保守残基的情况下长约25个残基(Boynton等,Biochemistry(2009)48:6705-6711)。

使用来自各种微生物的1,013个HemG PPO序列的起始集合进行基因组分析。设计算法以捕获蛋白质的总体序列多样性与长链插入环内的多样性。然后基于起始集合内的总体序列相似性将序列分选至多个组中。

为形成第一组，鉴定了起始集合中与具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的HemG PPO H_N90(SEQ ID NO:1)具有≥70％序列同一性的所有序列。然后，重复所述分析以鉴定与第一次分析中所鉴定的任何序列具有≥70％序列同一性的序列。最后，第三次重复检索以鉴定与第二次分析中所鉴定的任何序列具有≥70％序列同一性的序列。将三次分析的结果汇总在一起以形成第一组，所述第一组代表来自≥70％序列同一性分析的三次迭代的序列，总共273个HemG PPO序列。

通过集中于来自起始集合的剩余未分组序列来形成第二组。鉴定了与HemG PPOH_N90具有50％-70％序列同一性的所有序列。然后，重复所述分析以鉴定与第一次分析中所鉴定的任何序列具有≥70％序列同一性的序列。最后，第三次重复检索以鉴定与第二次分析中所鉴定的任何序列具有≥70％序列同一性的序列。将三次分析的结果汇总在一起以形成第二组，所述第二组代表来自所有三次迭代的序列，总共278个HemG PPO序列。

通过集中于来自起始集合的仍剩余的未分组序列来形成第三组。鉴定了与HemGPPO H_N90具有40％-50％序列同一性的所有序列。然后，重复所述分析以鉴定与第一次分析中所鉴定的任何序列具有≥70％序列同一性的序列。进行第三次检索以鉴定与第二次分析中所鉴定的任何序列具有≥70％序列同一性的序列，但这最后一次迭代未捕获来自起始集合的任何额外序列。将两次分析的结果汇总在一起以形成第三组，所述第三组代表来自两次迭代的序列，总共66个HemG PPO序列。

然后使用三组序列来分析长链插入环中的25个氨基酸处存在的变化。对各PPO的长链插入环序列进行鉴定和编译。意外地，发现对于第一组和第二组，此结构域中的序列变化为类似的，尽管这两个组的序列在组合时具有高达50％的总序列变化并且代表551个不同的序列。图3提供在来自三个组的617个序列中在长链插入环中所发现的变化的综述。在长链插入环的25个氨基酸位置中，从617个HemG PPO序列鉴定了211个不同氨基酸。图1A和图1B示出了23个微生物HemG PPO序列的子集的长链插入环(黑色突出显示)的序列比对。

选择一组17个HemG PPO序列来代表在长链插入环中发现的变化。当使用成对序列比对比较时，17种不同的HemG PPO酶的蛋白质序列在全长序列上具有在约15％至98％同一性范围内的同一性百分比。针对原卟啉原氧化酶活性和除草剂耐受性对这17种不同的HemGPPO酶进行了测试。

使用原卟啉原氧化酶细菌筛选系统来测试蛋白质的原卟啉原氧化酶活性并且因此证实它们为功能性PPO酶。此筛选系统使用大肠杆菌菌株中的功能拯救分析，所述大肠杆菌菌株含有关于大肠杆菌HemG PPO酶(在本文中称为H_N10并且对应于SEQ ID NO:2)的基因敲除。将hemG敲除大肠杆菌菌株用各自含有用于PPO酶中的一者的表达盒的细菌表达载体转化并且在LB培养基上培养。hemG敲除大肠杆菌菌株在经典细菌培养基(例如LB培养基)上显示极少的生长，但当细菌培养基补充有游离血红素时或当功能性原卟啉原氧化酶在细胞中表达时可恢复正常生长。使用两种对照用于比较：绿色荧光蛋白(GFP)和未转化的细胞。HemG PPO酶中的两种(HemG014和HemG015)不能拯救hemG敲除大肠杆菌菌株(无原卟啉原氧化酶活性)，两种以较慢的生长显示部分拯救(中间)，并且剩余的13种显示完全拯救表型(功能性)。表4中示出了结果。

设计原生质体除草剂耐受性分析以测试17种不同的HemG PPO酶在植物细胞中的除草剂耐受性。合成编码17种不同的HemG PPO酶的重组DNA分子(针对双子叶植物表达进行密码子优化)并且克隆至植物转化载体中。表达构建体含有可操作地连接至植物启动子、叶绿体转运肽以及3'未翻译区的编码17种不同的HemG PPO酶中的一者的重组DNA分子。用植物转化载体使用标准方法对大豆原生质体进行转化。使转化的原生质体在存在1.0μM浓度的PPO除草剂S-3100或模拟处理(阴性对照)的情况下生长。然后针对PPO除草剂耐受性对原生质体进行分析，相对于设定为100的HemG PPO酶H_N90的得分进行标准化。分两批重复四次进行分析。对每一者的相对耐受性得分取平均值并且计算标准误差(SE)。GFP对照分析的耐受性得分为0，证实在不存在除草剂耐受性蛋白质的情况下大豆原生质体对PPO除草剂不耐受。各种HemG PPO酶(HemG014和HemG015)中的两种未提供耐受性，而另外14种相对于H_N90提供24至89范围内的耐受性得分。表4中示出了结果。

然后使各种HemG PPO酶中的十五种在转基因植物中表达，并且分析转基因植物的PPO除草剂耐受性。合成编码15种不同的HemG PPO酶的重组DNA分子(针对双子叶植物或单子叶植物表达进行密码子优化)并且克隆至植物转化载体中。表达构建体含有可操作地连接至植物启动子、叶绿体转运肽以及3'未翻译区的编码15种不同的HemG PPO酶中的一者的重组DNA分子。

使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和本领域中已知的标准方法用这些载体对玉米细胞进行转化。使再生的R₀转基因幼苗在温室中生长。在约V₂至V₄生长期用PPO除草剂S3100按80g/ha的比率对植物进行喷洒以评估耐受性。在处理之后1-14天针对损伤对植物进行评估并且记录损伤得分。针对所有植物对于各种HemG PPO酶中的每一者，计算目视损伤得分为20％或更低的植物的百分比。将25％或更多的个别植物显示良好耐受性(目视损伤得分为20％或更低)的任何构建体视为有效赋予除草剂耐受性。各种HemG PPO酶中的八种(HemG001、HemG002、HemG003、HemG004、HemG005、HemG006、HemG011以及HemG012)提供了大量对PPO除草剂展现耐受性(在处理之后具有20％或更少损伤)的玉米植物。表4中示出了结果。

使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法用这些载体对大豆细胞进行转化。使再生的R₀转基因幼苗在温室中生长。在约V₂至V₄生长期用PPO除草剂S3100按20g/ha的比率对植物进行喷洒以评估耐受性。在处理之后1-14天针对损伤对植物进行评估并且记录损伤得分。针对所有植物对于各种HemG PPO酶中的每一者，计算目视损伤得分为20％或更低的植物的百分比。将25％或更多的个别植物显示良好耐受性(目视损伤得分为20％或更低)的任何构建体视为有效赋予除草剂耐受性。各种HemG PPO酶中的十种(HemG001、HemG002、HemG003、HemG004、HemG005、HemG006、HemG007、HemG009、HemG011以及HemG013)提供了大量对PPO除草剂展现耐受性(在处理之后具有20％或更少损伤)的大豆植物。表4中示出了结果。

表4.各种HemG PPO酶的测试

在稳定转化的玉米和大豆(或两者)中所测试的15种不同的HemG PPO酶中，10种被发现有效赋予除草剂耐受性(产生多于25％的目视损伤得分为20％或更低的植物)。这些有效赋予植物除草剂耐受性的HemG PPO酶的序列提供如下：HemG001(SEQ ID NO:11)、HemG002(SEQ ID NO:12)、HemG003(SEQ ID NO:13)、HemG004(SEQ ID NO:14)、HemG005(SEQID NO:15)、HemG006(SEQ ID NO:16)、HemG007(SEQ ID NO:17)、HemG009(SEQ ID NO:19)、HemG011(SEQ ID NO:21)以及HemG013(SEQ ID NO:23)。

实施例2：长链插入环变体的功能表征

HemG蛋白质的长链插入环已被描述为PPO酶功能所必需的并且许多残基被报道为高度保守的(Boynton等,Biochemistry(2009)48:6705-6711)。形成在长链插入环内引入氨基酸变化的重组HemG PPO酶，然后在细菌分析中分析酶功能的变化。

使用实施例2中所描述的原卟啉原氧化酶细菌筛选系统来测试变体蛋白质的原卟啉原氧化酶活性。此分析提供了快速并且容易地分析变体蛋白质的原卟啉原氧化酶活性的手段。

如下设计将突变合并至长链插入环中的重组HemG PPO酶。独立地考虑长链插入环的每个氨基酸并且基于在所述位置所鉴定的变化的量以及所述变化中有多少是在序列组中的哪一个中被发现按优先级进行排列。基于此评估，选择长链插入环中的25个氨基酸中的21个用于诱变。在H_N90序列中形成突变以代表在这21个位置中的每一者处所观测的变化，从而产生109个单氨基酸变体。此外，使用H_N90序列进行丙氨酸扫描诱变以产生在长链插入环中在H_N90中并非已为丙氨酸的每个位置具有丙氨酸的突变体，从而产生10种额外变体。然后将总的119种单氨基酸变异体用于筛选。

然后合成编码119种变体的重组DNA分子并且克隆至细菌转化载体中的表达构建体中。对于每种变体，整个核苷酸序列保持与H_N90核苷酸序列相同，除了用于突变体氨基酸的密码子。表达构建体含有可操作地连接至植物启动子、APG6叶绿体转运肽以及3'未翻译区的编码119种变体的重组DNA分子中的每一者。阳性对照由含有可操作地连接至植物启动子、APG6叶绿体转运肽以及3'未翻译区的H_N90编码序列的表达构建体组成。将每个载体个别地转化至hemG敲除大肠杆菌菌株中。作为阴性对照，将模拟转化(不存在载体)和用于表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体个别地转化至hemG敲除大肠杆菌菌株中。

针对在LB板上恢复hemG敲除大肠杆菌菌株的正常生长的能力对119种变体中的每一者进行筛选。由三个个体以设盲方式并且独立地对所有板进行评分：无生长(变体未补充)、缓慢生长(变体具有降低的酶功能)或正常生长(变体具有完全酶功能并且提供完全补充性)。基于板上的菌落尺寸而非菌落数目来测量生长，并且三个个体同意所有评级。表5示出了分析的结果。在此分析中，119种变体中的105种恢复正常生长，表明这些变体具有完全PPO功能；119种变体中的6种展现显著较慢生长速率的菌落生长，表明这些变体具有降低的PPO功能；并且119种变体中的8种未展现菌落生长，表明这些变体没有PPO功能。正如所料，阳性对照全部显示补充性，不过H_N10构建体生长得比H_N90构建体慢。图4示出了此分析的结果的图解表示。

表5.HemG变体补充性分析

此分析的结果表明，虽然在HemG PPO蛋白质中长链插入环为高度保守的，但在环内的许多残基处在维持酶功能方面存在灵活性。基于说明长链插入环中的残基中的变化引起酶功能损失的公开报告，这是出乎意料的(Zwerschke,D.,Karrie,S.,Jahn,D.以及Jahn,M.(2014)Biosci.Rep.34(4),art:e00124.doi:10.1042/BSR20140081)。在此分析中，特别是具有在位置G123、L125、Y127、I138、L140、I141、M142以及G147处形成的突变的情况下，发现改变的酶功能，表明这些位置中的变化对于改变酶功能为重要的。

实施例3：长链插入环变体的除草剂耐受性表征

形成在长链插入环内引入氨基酸变化的重组HemG PPO酶并且分析在植物中的除草剂灵敏度的变化。设计原生质体除草剂耐受性分析以确定变体是否可赋予在植物细胞中对PPO除草剂的耐受性。

用实施例2中所描述的相同表达构建体但使用植物转化载体使用标准方法对大豆原生质体进行转化。使转化的原生质体在存在1.0μM浓度的PPO除草剂S-3100或模拟处理(阴性对照)的情况下生长。然后针对PPO除草剂耐受性对原生质体进行分析，相对于GFP对照和H_N90来表示(允许得到相对耐受性得分以实现实验之间的比较)。分两批重复四次进行分析。对每一者的相对耐受性得分取平均值并且计算标准误差(SE)。GFP对照分析的耐受性得分为0，证实在不存在除草剂耐受性蛋白质的情况下大豆原生质体对PPO除草剂不耐受。N-N90分析的耐受性得分为100。表6示出了分析的结果。13种变体几乎未赋予耐受性(类似于未转化的对照或GFP对照)，6种变体赋予弱耐受性(类似于不含CTP的H_N90对照)，9种变体赋予边际耐受性(类似于H_N10对照)，并且79种变体赋予良好耐受性(类似于含CTP的H_N90对照)。12种变体具有大于100的相对耐受性得分(优于含CTP的H_N90对照)。这12种变体中的氨基酸变化位于7个残基位置，所述位置中的4个具有超过1种倾向于高于100的变体。这表明这7个氨基酸位点就改善的除草剂耐受性来说特别受关注。图5示出了此分析的结果的图解表示。

表6.HemG变体原生质体分析结果-S3100

选择39种变体(加上对照)的子集用于进一步分析。在类似于上文所描述的S-3100耐受性分析的分析中，针对对三种额外PPO除草剂丙炔氟草胺、甲磺草胺以及乳氟禾草灵的耐受性对这些变体进行测试。将转化的原生质体用丙炔氟草胺(5nM)、甲磺草胺(1μM)以及乳氟禾草灵(1μM)处理。表7示出了分析的结果。在所测试的39种变体中，30种对丙炔氟草胺、甲磺草胺或乳氟禾草灵展现良好耐受性并且9种具有不良耐受性(耐受性得分低于50，指示为“PT”)。在展现良好耐受性的30种变体中，8种对一种或多种除草剂展现的耐受性变化大于相对于S-3100的实验变化。在这8种变体中，4种变体赋予对除草剂中的一者或多者的更高耐受性，这在下表7中指示为“更高”，同时4种变体赋予对除草剂中的一者或多者的更低耐受性，这在下表7中指示为“更低”。指示为“NSD”的变体具有耐受性得分差异小于已知数据点的标准误差的耐受性得分。

表7.HemG变体原生质体分析结果-丙炔氟草胺、甲磺草胺以及乳氟禾草灵

在对丙炔氟草胺、甲磺草胺或乳氟禾草灵的耐受性得分与对S-3100的耐受性得分相比展现显著差异的8种变体中，6种变体位于疏水性残基M137、L140以及M142处。跨残基M137至M142的区域含有大量疏水性残基(尤其是I、L、V、M、A)。此疏水性区域的分析表明这些残基在调节酶变体的功能性方面为唯一重要的。此外，这些残基在调节对不同PPO抑制剂除草剂的耐受性方面为唯一重要的。

可用其他PPO除草剂对转化的原生质体进行攻击，诸如二苯醚(诸如三氟羧草醚、其盐和酯、苯草醚、治草醚、其盐和酯、氟乳醚、其盐和酯、氟草醚、呋氧草醚、氟硝磺酰胺、氯硝醚、乙羧氟草醚、其盐和酯、乳氟禾草灵的盐和酯、乙氧氟草醚以及氟磺胺草醚、其盐和酯)；噻二唑(诸如氟噻甲草酯和噻二唑草胺)；嘧啶二酮或苯基尿嘧啶(诸如双苯嘧草酮、氟丙嘧草酯、[3-2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶氧基]乙酸乙酯(CAS登记号353292-31-6并且在本文中称为S-3100)、氟嘧苯甲酸、苯嘧磺草胺以及氟嘧硫草酯)；苯基吡唑(诸如异丙吡草酯、吡草醚以及吡草醚乙酯)；噁二唑(诸如丙炔噁草酮和噁草酮)；三唑啉酮(诸如唑啶草酮、酰苯草酮以及唑草酮、其盐和酯)；噁唑烷二酮(诸如环戊噁草酮)；N-苯基邻苯二甲酰亚胺(诸如吲哚酮草酯、氟烯草酸以及氟烯草酸戊酯)；苯并噁嗪酮衍生物(诸如1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3,4-二氢-3-氧代-4-丙-2-炔基-2H-1,4-苯并噁嗪-6-基)-1,3,5-三嗪烷-2,4-二酮)；氟哒嗪草酯和氟哒嗪草乙酯；双唑草腈；以及氟唑草胺。可使用模拟处理作为阴性对照。

实施例4：组合变体的功能和除草剂耐受性表征

将变体设计成在HemG PPO序列中的长链插入环内包含两个或更多个氨基酸修饰。然后分析这些组合变体HemG PPO酶以确定PPO活性。合成组合变体HemG PPO DNA序列并且克隆至表达盒中。可将包含表达盒的细菌转化载体转化至hemG敲除大肠杆菌菌株中用于如实施例2中所描述的初始高通量细菌拯救筛选。针对恢复hemG敲除大肠杆菌菌株的正常生长的能力对组合变体进行筛选。

还针对赋予植物细胞对PPO除草剂的耐受性的能力对组合变体HemG PPO酶进行了分析。将含有组合变体HemG PPO DNA序列的表达盒与植物转化载体一起用于转化大豆原生质体。如实施例3中所描述进行原生质体耐受性分析，并且针对赋予植物细胞除草剂耐受性的能力对组合变体进行筛选。

实施例5：变体HemG PPO酶在植物中的表达和测试

可使以上实施例中所描述的微生物HemG PPO变体在稳定转化的植物中表达，并且可分析这些植物的PPO除草剂耐受性。

在稳定转化的玉米或大豆(或两者)中针对除草剂耐受性对微生物HemG PPO变体中的二十五种进行了测试。构建包含可操作地连接至植物启动子、转运序列以及3'UTR的编码变体HemG PPO酶的重组DNA分子(其中蛋白质编码序列针对单子叶或双子叶植物表达进行优化)的植物转化载体。

在玉米中，使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法用植物转化载体对玉米细胞进行转化。使再生的R₀转基因幼苗在温室中生长。在约V₂至V₄生长期用S3100按80g/ha的比率对R₀植物进行喷洒。然后在处理之后1-14天针对损伤对植物进行评估并且记录损伤得分。鉴定了具有单一转基因DNA插入物拷贝的转基因植物(即单事件植物)，并且使仅含有单一拷贝并且通过除草剂喷洒测试的R₀植物自交以产生R₁种子。

在大豆中，使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法用植物转化载体对切除的胚进行转化。使再生的R₀转基因幼苗在温室中生长。在约V₂至V₄生长期用S3100按20g/ha的比率对R₀植物进行喷洒。然后在处理之后1-14天针对损伤对植物进行评估并且记录损伤得分。鉴定了具有单一转基因DNA插入物拷贝的转基因植物(即单事件植物)，并且使仅含有单一拷贝并且通过除草剂喷洒测试的R₀植物自交以产生R₁种子。对于一些变体HemG PPO酶，使R₁植物在温室中生长并且在约V₂至V₄生长期用S3100按60g/ha的比率喷洒。然后在处理之后1-14天针对损伤对植物进行评估并且记录损伤得分。

将目视损伤得分为20％或更低的转基因大豆和玉米植物评分为通过除草剂耐受性筛选，因此对PPO除草剂展现耐受性。计算对于每种变体HemG PPO酶来说通过除草剂耐受性筛选的全部植物的百分比。将25％或更多的个别植物显示良好耐受性(目视损伤得分为20％或更低)的任何构建体视为有效赋予除草剂耐受性。

测试证实从原生质体分析(如上文所描述进行)获得的结果与在整个植物中获得的结果一致，从而验证了原生质体分析为筛选工具的用途。在稳定转化的玉米或大豆(或两者)中所测试的25种微生物HemG PPO变体中，20种被发现有效赋予除草剂耐受性(产生多于25％的目视损伤得分为20％或更低的植物)。在这二十种中，14种具有高于阳性对照H_N90的功效结果。表8中提供了结果。

表8.HemG变体在大豆和玉米植物中的测试结果.

在棉花中，可使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法用这些载体对切除的胚(Coker 130)进行转化。使再生的R₀转基因幼苗在温室中生长并且如上文所描述进行测试。

可在转基因植物情况下针对耐受性对其他除草剂进行测试。这可例如通过使用于每种HemG PPO的多个转基因植物生长并且将植物分成组来进行。将各组用一种或多种PPO除草剂喷洒(每组一种PPO除草剂)以评估耐受性。举例来说，在约2-4真叶生长期用约220gai/ha或440g ai/ha的乳氟禾草灵或约210g/ha或420g/ha的丙炔氟草胺对转基因植物进行喷洒。然后在处理之后1-14天针对损伤对植物进行评估并且记录损伤得分。将未喷洒的转基因植物用于与未喷洒的非转基因植物的表型比较。

Claims

1.一种重组DNA分子，所述重组DNA分子包含可操作地连接至编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核酸分子的异源启动子，其中所述蛋白质与选自由SEQ IDNO:1-23组成的组的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:1的残基125至146的位置包含至少一个第一氨基酸取代，其中所述取代选自由以下组成的组：L125I、L125V、R126A、Y127W、P128A、P128D、P128E、P128K、P128L、P128Q、P128R、P128S、P128T、R129A、R129E、R129G、R129H、R129I、R129K、R129L、R129N、R129Q、R129S、Y130L、R131A、W132A、W132F、W132I、W132K、W132L、W132P、W132R、W132S、W132T、W132V、W132Y、I133A、D134A、D134N、D134Q、D134T、K135A、K135Q、K135R、K135S、K135T、K135V、V136A、M137A、M137C、M137I、M137L、M137S、M137V、I138L、I138M、I138V、Q139A、Q139C、Q139E、Q139G、Q139H、Q139K、Q139L、Q139M、Q139R、Q139S、L140A、L140C、L140F、L140G、L140H、L140I、L140M、L140N、L140Q、L140S、L140T、L140V、L140W、L140Y、I141V、M142L、M142S、M142V、R143A、M144A、T145A、G146A、G146D、G146H、G146K以及G146N。

2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述蛋白质包含所述氨基酸取代中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个。

3.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述蛋白质与选自由SEQ ID NO:24-124和249-263组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

4.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述蛋白质包含HemG类原卟啉原氧化酶。

5.如权利要求4所述的重组DNA分子，其中所述氨基酸取代位于所述酶中的长链插入环中。

6.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述异源启动子在植物细胞中具功能性。

7.如权利要求6所述的重组DNA分子，其中所述核酸分子可操作地连接至编码用于定位细胞内的所述蛋白质的转运序列的DNA分子。

8.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子包含于植物细胞的基因组中。

9.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含如权利要求1所述的重组DNA分子。

10.一种工程化蛋白质，所述工程化蛋白质由如权利要求1所述的重组DNA分子编码。

11.一种转基因植物、种子、细胞或植物部分，所述转基因植物、种子、细胞或植物部分包含如权利要求1所述的重组DNA分子。

12.如权利要求11所述的转基因植物、种子、细胞或植物部分，其中所述转基因植物、种子、细胞或植物部分对至少一种PPO除草剂耐受。

13.如权利要求12所述的转基因植物、种子、细胞或植物部分，其中所述PPO除草剂选自由以下组成的组：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、丙炔噁草酮、噁草酮、吡草醚、苯嘧磺草胺以及S-3100。

14.如权利要求13所述的转基因植物、种子、细胞或植物部分，其中所述转基因植物、种子、细胞或植物部分对至少一种第二除草剂耐受。

15.一种赋予植物、种子、细胞或植物部分PPO除草剂耐受性的方法，所述方法包括：使如权利要求10所述的工程化蛋白质在所述植物、种子、细胞或植物部分中异源表达。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述除草剂耐受性是针对选自由以下组成的组的至少一种PPO除草剂：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、丙炔噁草酮、噁草酮、吡草醚、苯嘧磺草胺以及S-3100。

17.一种产生除草剂耐受性植物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用如权利要求1所述的重组DNA分子转化植物细胞；以及

b)从包含所述重组DNA分子的所述植物细胞再生植物。

18.如权利要求17所述的方法，所述方法还包括针对PPO除草剂耐受性选择所述植物或其子代的步骤。

19.如权利要求17所述的方法，所述方法还包括使再生的植物与自身或与第二植物杂交以产生子代的步骤。

20.一种控制或阻止植物生长区域中的杂草生长的方法，所述方法包括向包含如权利要求11所述的转基因植物或种子的植物生长区域中施用有效量的至少一种PPO除草剂，其中所述转基因植物或种子对所述PPO除草剂耐受。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述PPO除草剂选自由以下组成的组：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、丙炔噁草酮、噁草酮、吡草醚、苯嘧磺草胺以及S-3100。

22.一种鉴定编码具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

a)用包含如权利要求1所述的重组DNA分子的细菌表达载体转化缺乏除草剂耐受性PPO酶活性的大肠杆菌菌株；以及

b)使所述转化的大肠杆菌生长以鉴定具有除草剂耐受性原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。

23.一种筛选除草剂耐受性基因的方法，所述方法包括：

a)使如权利要求1所述的重组DNA分子在植物细胞中表达；以及

b)鉴定对PPO除草剂展现耐受性的植物细胞。

24.一种产生对PPO除草剂和至少一种其他除草剂耐受的植物的方法，所述方法包括：

a)获得根据权利要求11所述的植物；

b)使所述植物与包含对所述至少一种其他除草剂的耐受性的第二植物杂交，以及

c)选择由所述杂交产生的包含对PPO除草剂和所述至少一种其他除草剂的耐受性的子代植物。

25.一种减少除草剂耐受性杂草的发育的方法，所述方法包括：

a)在作物生长环境中培育根据权利要求11所述的植物；以及

b)将PPO除草剂和至少一种其他除草剂施用于所述作物生长环境，其中所述作物植物对所述PPO除草剂和所述至少一种其他除草剂耐受。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述PPO除草剂选自由以下组成的组：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、丙炔噁草酮、噁草酮、吡草醚、苯嘧磺草胺以及S-3100。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述至少一种其他除草剂选自由以下组成的组：ACC酶抑制剂、ALS抑制剂、EPSPS抑制剂、合成植物生长素、光合作用抑制剂、谷氨酰胺合成抑制剂、HPPD抑制剂、PPO抑制剂以及长链脂肪酸抑制剂。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述ACC酶抑制剂为芳氧基苯氧基丙酸酯或环己二酮；所述ALS抑制剂为磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶或三唑啉酮；所述EPSPS抑制剂为草甘膦；所述合成植物生长素为苯氧基除草剂、苯甲酸、羧酸或缩氨基脲；所述光合作用抑制剂为三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑或脲；所述谷氨酰胺合成抑制剂为草铵膦；所述HPPD抑制剂为异噁唑、吡唑啉酮或三酮；所述PPO抑制剂为二苯醚、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮或嘧啶二酮；或者所述长链脂肪酸抑制剂为氯乙酰胺、氧乙酰胺或吡唑。