BR112020010451A2

BR112020010451A2 - métodos e composições para tolerância a herbicida de ppo

Info

Publication number: BR112020010451A2
Application number: BR112020010451-5A
Authority: BR
Inventors: Clayton T. Larue; Farhad Moshiri; Joel E. Ream; Xuefeng Zhou
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-10-20
Also published as: CA3026528A1; CN111465696A; US20220033839A1; MX2020006287A; CL2022002200A1; US20190185873A1; PH12020500549A1; KR20200098494A; AR113641A1; WO2019118726A3; US11124803B2; EP3724341A4; UY38007A; RU2020123081A; WO2019118726A2; JP2021506232A; AU2018385604A1; CL2020001566A1; JP2024020385A; CO2020008550A2

Abstract

A presente invenção refere-se à biotecnologia e fornece novas moléculas de DNA recombinante e proteínas manipuladas para conferir tolerância a herbicidas inibidores de protoporfirinogênio oxidase. A invenção também fornece plantas, sementes, células e partes de planta transgênicas tolerantes a herbicida contendo as moléculas de DNA recombinante, bem como métodos de uso das mesmas.

Description

UTI Relatório Descritivo de Patente de Invenção para “MÉTO-

DOS E COMPOSIÇÕES PARA TOLERÂNCIA A HERBICIDA DE PPO”. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório Nº 62/599.386 dos Estados Unidos, depositado em 15 de de- zembro de 2017, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se aos campos da agricultura, bi- otecnologia de plantas e biologia molecular. Mais especificamente, a in- venção refere-se a moléculas de DNA recombinante que codificam pro- teínas manipuladas que fornecem tolerância a herbicidas que inibem a protoporfirinogênio oxidase e métodos de uso desta.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0003] Uma forma legível por computador de uma listagem de se- quências é depositada com este pedido por apresentação eletrônica e é incorporada a este pedido por referência na sua totalidade. A listagem de sequência está contida no arquivo MONS429WO STZ25.txt, que tem 296 kilobytes de tamanho (medido no sistema operacional MS Win- dows) e foi criado em 13 de dezembro de 2018.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] A produção de cultura agrícola geralmente usa traços trans- gênicos criados usando os métodos da biotecnologia. Um gene heteró- logo, também conhecido como um transgene, pode ser introduzido em uma planta para produzir um traço transgênico. A expressão do trans- gene na planta confere um traço, como tolerância a herbicidas à planta. Exemplos de traços de tolerância a herbicidas transgênicos incluem to- lerância a glifosato, tolerância a glufosinato e tolerância a dicamba. Com o aumento das espécies de ervas daninhas resistentes aos herbicidas comumente usados, novos traços de tolerância a herbicida são neces- sários no campo. Os herbicidas de interesse particular incluem herbici- das que inibem a protoporfirinogênio oxidase (PPO, EC 1.3.3.4), referi- dos como herbicidas de PPO. Os herbicidas de PPO fornecem o con- trole de um espectro de ervas daninhas resistentes a herbicidas, criando assim um traço que confere tolerância a estes herbicidas particular- mente útil em um sistema de cultivo combinado com um ou mais traços de tolerância a herbicidas. Esta invenção fornece protoporfirinogênio oxidases novas, manipuladas e com tolerância a herbicidas úteis para fornecer tolerância a herbicidas de PPO nas plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de DNA recombinante compreendendo um promotor heterólogo opera- cionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com atividade de protoporfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida, em que a proteína tem pelo menos cerca de 50% de identi- dade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-23 e compreende, pelo menos, uma primeira substituição de aminoácido na posição correspon- dente aos resíduos 125 a 146 de SEQ ID NO:1, em que a substituição é selecionada do grupo que consiste em: L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321, W132K, W132L, W132P, W132R, W1328S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K1358S, K135T, K135V, V136A, M137A, M137C, M1371, M137L, M1378S, M137V, 1138L, 1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L14ON, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, 141V,

M142L, M142S, M142V, R143A, M1I44A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K, e G146N.

Em certas modalidades, a proteína tem pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 60% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 70% de identi- dade de sequência, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequên- cia, pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 96% de identi- dade de sequência, pelo menos cerca de 97% de identidade de sequên- cia, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência e pelo me- nos, cerca de 99% identidade de sequência para uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-23 e compreende pelo menos uma primeira substituição de ami- noácidos em uma posição correspondente aos resíduos 125 a 146 da SEQ ID NO: 1, em que a substituição é selecionada do grupo que con- siste em: L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W132], W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D1I34A, D1I34N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K135S, K135T, K135V, VI36A, M137A, M137C, M137I, M137L, M137S, M137V, 1138L, N1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q0139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L1408S, L140T, L140V, L140W, L140Y, N141V, M142L, M1428S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N.

Em algumas modalidades, a proteína compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, ou pelo menos 10 das referidas substituições de amino- ácidos. Em outra modalidade, a proteína tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos sele- cionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 24-124 e 249-

263. Em outra modalidade, a proteína compreende uma enzima proto- porfirinogênio oxidase de classe HemG. Em uma outra modalidade, pelo menos uma primeira substituição de aminoácidos está localizada em uma alça de inserção de cadeia longa de tal enzima protoporfirinogênio oxidase de classe HemG. Em ainda uma outra modalidade, uma molé- cula de DNA recombinante da invenção é constituída em um genoma de uma célula vegetal.

[0006] Em certas modalidades, um promotor heterólogo, por exem- plo, um promotor funcional em uma célula vegetal, está operacional- mente ligado a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma prote- ína com atividade de protoporfirinogênio oxidase com tolerância a her- bicida, em que a proteína tem pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-23 e compreende, pelo me- nos, uma primeira substituição de aminoácido na posição correspon- dente aos resíduos 125 a 146 da SEQ ID NO:1, em que a substituição é selecionada do grupo que consiste em: L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R1290, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321, W132K, W132L, W132P, W132R, W1328S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K1358S, K135T, K135V, V136A, M137A, M137C, M1371, M137L, M137S, M137V, 1138L, 1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q1329L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I,

L140M, L140N, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, 141V, M142L, M142S, M142V, R143A, M1I44A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K, e G146N. Essa molécula de DNA resultante pode ainda compreender uma sequência de trânsito que funciona para localizar a proteína dentro de uma célula.

[0007] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um construto de DNA recombinante compreendendo uma molécula de DNA recombi- nante fornecida neste documento, tal como uma molécula de DNA re- combinante compreendendo um promotor heterólogo operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com atividade de protoporfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida, em que a proteína tem pelo menos cerca de 50% de identidade de sequên- cia com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-23 e compreende, pelo menos, uma primeira substituição de aminoácido na posição correspondente aos re- síduos 125 a 146 de SEQ ID NO:1, em que a substituição é selecionada do grupo que consiste em: L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321l, W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K1358S, K135T, K135V, V136A, M137A, M137C, M1371, M137L, M1378S, M137V, 1138L, 1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, 1141V, M142L, M142S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N. Noutra modalidade, uma proteína manipulada é codi- ficada pela molécula de DNA recombinante fornecida neste documento.

[0008] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma planta, semente, célula ou parte de planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante fornecida neste documento, tal como uma molécula de DNA recombinante compreendendo um promo- tor heterólogo operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nu- cleico que codifica uma proteína com atividade de protoporfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida, em que a proteína tem pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência com uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-23 e compreende, pelo menos, uma primeira substituição de aminoá- cido na posição correspondente aos resíduos 125 a 146 de SEQ ID NO:1, em que a substituição é selecionada do grupo que consiste em: L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321], W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D1I34A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K135S, K135T, K135V, VI36A, M137A, M137C, M137I, M137L, M137S, M137V, 1138L, 1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, N141V, M142L, M1428, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N.

Em uma mo- dalidade, a planta, semente, célula ou parte de planta transgênica é to- lerante a pelo menos um herbicida de PPO.

Em certas modalidades, o herbicida de PPO selecionado do grupo que consiste em: acifluorfen, fomesafen, lactofen, fluoroglicofen-etila, oxifluorfen, flumioxazin, azafe- nidin, carfentrazona-etila, sulfentrazona, flutiacet-metila, oxadiargila, oxadiazon, piraflufen-etila, saflufenacila e S-3100. Em uma outra moda- lidade, a planta, semente, célula ou parte de planta transgênica é tole- rante a pelo menos um segundo herbicida.

7ITI

[0009] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para con- ferir tolerância ao herbicida de PPO a uma planta, semente, célula ou parte de planta compreendendo: expressar heterologicamente uma pro- teína manipulada da invenção na referida planta, semente, célula ou parte de planta. Em algumas modalidades, a tolerância a herbicida é pelo menos a um herbicida de PPO selecionado do grupo que consiste em: acifluorfen, fomesafen, lactofen, fluoroglicofen-etila, oxifluorfen, flu- mioxazin, azafenidin, carfentrazona-etila, sulfentrazona, flutiacet-metila, oxadiargila, oxadiazon, piraflufen-etila, saflufenacila e S-3100.

[0010] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma planta com tolerância a herbicida, compreendendo as eta- pas de: a) transformar uma célula vegetal com uma molécula de DNA recombinante fornecida neste documento, como uma molécula de DNA recombinante compreendendo um promotor heterólogo operacional- mente ligado a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma prote- ína com atividade de protoporfirinogênio oxidase com tolerância a her- bicida, em que a proteína tem pelo menos 50% de identidade de se- quência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-23 e compreende pelo menos uma primeira substituição de aminoácido em uma posição correspondente aos resí- duos de 125 a 146 da SEQ ID NO: 1, em que a substituição é selecio- nada do grupo que consiste em: L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321l, W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, KI135A, K135Q, K135R, K135S, K135T, K135V, V136A, M137A, M137C, M1371, M137L, M137S, M137V, 1138L, N138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M,

L140N, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, 141V, M142L, M142S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N; e b) regenerar uma planta a partir da célula vegetal que compreende a molécula de DNA recombinante. Em uma modali- dade, o método compreende ainda a etapa de selecionar a referida planta ou uma progênie desta para a tolerância a herbicida de PPO. Em outra modalidade, o método compreende ainda a etapa de cruzar a planta regenerada com ela própria ou com uma segunda planta para produzir progênie.

[0011] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um mé- todo para controlar ou prevenir crescimento de ervas daninhas em uma área de crescimento de planta, compreendendo aplicar uma quantidade eficaz de pelo menos um herbicida de PPO a uma área de crescimento de planta que compreende a planta ou semente transgênica compreen- dendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo um promo- tor heterólogo operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nu- cleico que codifica uma proteína com atividade de protoporfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida, em que a proteína tem pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência com uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-23 e compreende, pelo menos, uma primeira substituição de aminoá- cido em uma posição correspondente aos resíduos 125 a 146 de SEQ ID NO:1, em que a substituição é selecionada do grupo que consiste em: L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321], W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D1I34A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K135S, K135T, K135V, VI36A, M137A, M137C, M137I, M137L, M137S, M137V, 1138L, N1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E,

Q139G, Q139H, Q139K, Q0139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L1408S, L140T, L140V, L140W, L140Y, N141V, M142L, M1428, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N, em que a planta ou sementa transgênica é tolerante ao herbicida de PPO. Em certas modalidades, o herbicida de PPO selecionado do grupo que con- siste em: acifluorfen, fomesafen, lactofen, fluoroglicofen-etila, oxifluor- fen, flumioxazin, azafenidin, carfentrazona-etila, sulfentrazona, flutiacet- metila, oxadiargila, oxadiazon, piraflufen-etila, saflufenacila e S-3100.

[0012] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para identificar uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína com atividade protoporfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida, o método compreendendo: a) transformar uma cepa de E. coli sem atividade enzimática de PPO com tolerância a herbicida com um vetor de expressão bacteriana compreendendo uma molécula de DNA recombinante fornecia neste documento, tal como uma molécula de DNA recombinante compreendendo um promotor heterólogo opera- cionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com atividade protoporfirinogênio oxidase com tolerância a her- bicida, em que a proteína tem pelo menos 50% de identidade de se- quência com uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-23 e compreende pelo menos uma primeira substituição de aminoácidos em uma posição correspondente aos resí- duos 125 a 146 da SEQ ID NO: 1, em que a substituição é selecionada do grupo que consiste em: L1251I, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321l, W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K1358S, K135T, K135V, V136A,

M137A, M137C, M1371, M137L, M1378S, M137V, 1138L, N1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L1408S, L140T, L140V, L140W, L140Y, 141V, M142L, M142S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N; e b) cultivar a referida E. coli transformada para iden- tificar uma proteína possuindo atividade protoporfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida.

[0013] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método para triar um gene com tolerância a herbicida compreendendo: a) expressar uma molécula de DNA recombinante fornecida neste documento, como uma molécula de DNA recombinante compreendendo um promotor he- terólogo operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com atividade de protoporfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida, em que a proteína tem pelo menos 50% de iden- tidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-23 e compreende pelo menos uma primeira substituição de aminoácido em uma posição correspon- dente aos resíduos de 125 a 146 da SEQ ID NO: 1, em que a substitui- ção é selecionada do grupo que consiste em: L125I, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129l, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W132I, W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K135S, K135T, K135V, VIS36A, M137A, M137C, M137l, M137L, M137S, M137V, 1138L, 1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, N141V, M142L, M1428S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A,

G146D, G146H, G146K e G146N; e b) identificar uma célula vegetal a partir da célula vegetal que exibe tolerância a um herbicida de PPO.

[0014] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma planta com tolerância a um herbicida de PPO e pelo menos um outro herbicida compreendendo: a) obter uma planta trans- gênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante fornecida neste documento, como uma molécula de DNA recombinante compre- endendo um promotor heterólogo operacionalmente ligado a uma molé- cula de ácido nucleico que codifica uma proteína com atividade proto- porfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida, em que a proteína tem pelo menos 50% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-23 e compreende em pelo menos uma primeira substituição de aminoácidos em uma posição correspondente aos resíduos 125 a 146 da SEQ ID NO: 1, em que a substituição é selecionada do grupo que consiste em: L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R1298S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321], W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D1I34A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K135S, K135T, K135V, V1IS36A, M137A, M137C, M1371, M137L, M137S, M137V, 1138L, 1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, N141V, M142L, M142S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N; b) cruzar a planta com uma segunda planta compreendendo tolerância a pelo menos um outro herbicida e c) selecionar uma planta de progênie resultante do referido cruzamento que compreende tolerân- cia a um herbicida de PPO e pelo menos um outro herbicida.

[0015] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para reduzir o desenvolvimento de ervas daninhas com tolerân- cia a herbicidas, compreendendo: a) cultivar em um ambiente de cultivo uma planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recom- binante fornecida neste documento, como uma molécula de DNA re- combinante compreendendo um promotor heterólogo operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com atividade protoporfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida, em que a proteína tem pelo menos 50% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1-23 e compreende pelo menos uma primeira substituição de aminoácido em uma posição correspondente aos resí- duos 125 a 146 da SEQ ID NO: 1, em que a substituição é selecionada do grupo que consiste em: L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, 133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K135S, K135T, K135V, V1I36A, M137A, M137C, M1371, M137L, M137S, M137V, 1138L, N138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, 141V, M142L, M142S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N; e b) aplicar um herbicida de PPO e pelo menos um outro herbi- cida ao ambiente de cultivo, em que a planta de cultivo tem tolerância ao herbicida de PPO e ao pelo menos um outro herbicida.

Em uma mo- dalidade, o herbicida de PPO selecionado do grupo que consiste em acifluorfen, fomesafen, lactofen, fluoroglicofen-etila, oxifluorfen, flu- mioxazin, azafenidin, carfentrazona-etila, sulfentrazona, flutiacet-metila, oxadiargila, oxadiazon, piraflufen-etila, saflufenacil e S-3100. Em outra modalidade, o pelo menos um outro herbicida é selecionado de do grupo consistindo em: um inibidor de ACCase, um inibidor de ALS, um inibidor de EPSPS, uma auxina sintética, um inibidor da fotossíntese, um inibi- dor de glutamina sintetase, um inibidor de HPPD, um inibidor de PPO e um inibidor de ácido graxo de cadeia longa. Em uma modalidade adici- onal, o inibidor de ACCase é um propionato de ariloxifenóxi ou uma ci- clohexanodiona; o inibidor de ALS é uma sulfonilureia, imidazolinona, triazolopirimidina ou uma triazolinona; o inibidor de EPSPS é o glifosato; a auxina sintética é um herbicida fenoxi, um ácido benzoico, um ácido carboxílico ou uma semicarbazona; o inibidor de fotossíntese é um tria- zina, uma triazinona, uma nitrila, um benzotiadiazol ou uma ureia; o ini- bidor da síntese de glutamina é o glufosinato; o inibidor de HPPD é um isoxazol, uma pirazolona ou uma tricetona; o inibidor de PPO é um éter difenílico, uma N-fenilftalimida, uma aril-triazinona ou uma pirimidinodi- ona; ou o inibidor de ácidos graxos de cadeia longa é uma cloroaceta- mida, uma oxiacetamida ou um pirazol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016] O arquivo de pedido ou patente contém pelo menos uma fi- gura executada em cor. As cópias desta patente ou publicação de pe- dido de patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pelo escri- tório mediante a solicitação e pagamento da taxa necessária.

[0017] Figura 1A e Figura 1B: Mostra um alinhamento de sequên- cia da alça de inserção de cadeia longa de um subconjunto de 23 enzi- mas HemG PPO microbianas com a alça de inserção de cadeia longa conservada em destaque em preto. As sequências são dispostas por ordem de identidade de sequência global, em relação a H N90 (SEQID NO:1). HemG001 (SEQ ID NO:11) e HemG003 (SEQ ID NO:13) repre- sentam proteínas HemG PPO com identidade de sequência global su- perior a 70% para H N90. As próximas 15 sequências não marcadas, que são H N30 (SEQ ID NO:4), H N40 (SEQ ID NO:5), H N60 (SEQ

ID NO:7), H N20 (SEQ ID NO:3), H N70 (SEQ ID NO:8), HemG005 (SEQ ID NO:15), H N100 (SEQ ID NO:9), HemG002 (SEQ ID NO:12), Hem6Go004 (SEQ ID NO:14), H N110 (SEQ ID NO:10), H N10 (SEQ ID NO:2), HemG006 (SEQ ID NO:16), HemG007 (SEQ ID NO:17), H N50 (SEQ ID NO:6) e HemG013 (SEQ ID NO:23), representam proteínas HemG PPO com identidade de sequência global de 50-70% para H N90. A última caixa de 5 sequências, que são HemG008 (SEQ ID NO:18), HemG009 (SEQ ID NO:19), HemG011 (SEQ ID NO:21), HemG012 (SEQ ID NO:22) e HemG010 (SEQ ID NO:20), representa proteínas HemG PPO com identidade de sequência global de 40-50% para H N90.

[0018] Figura 2: Mostra o gráfico de código genético universal que mostra todos os códons possíveis de MRNA de tripleto (em que T na molécula de DNA é substituído por U na molécula de RNA) e o aminoá- cido codificado por cada códon.

[0019] Figura 3: Mostra uma representação em diagrama de toda a variação encontrada em cada resíduo da alça de inserção de cadeia longa H N90 (SEQ ID NO:1) a partir da triagem genômica microbiana. As caixas pretas na parte superior representam a sequência H N90 na- tiva. As caixas abaixo da lista de sequência H N90 de cada um dos 20 aminoácidos. Os números listados acima da sequência H N90 designa as posições relativas de aminoácidos. O sombreado cinza sólido repre- senta variações de aminoácidos identificadas nos grupos de identidade de sequência de 250%. O sombreado em faixa cinza vertical representa variações de aminoácidos identificadas nos grupos de identidade de se- quência de 40%-50%. As caixas brancas restantes não preenchidas re- presentam variações de aminoácidos não observadas em 240% de identidade de sequência global no conjunto de dados microbiano inicial.

[0020] Figura 4: Mostra uma representação em diagrama dos re- sultados obtidos a partir do ensaio a função da enzima. As caixas pretas na parte superior representam a sequência H N90 nativa (SEQ ID NO: 1). As caixas abaixo da lista de sequência H N90 de cada um dos 20 aminoácidos. Os números listados acima da sequência H N90 são as posições relativas de aminoácidos. O sombreado em faixa cinza vertical indica que a modificação de aminoácido rendeu a enzima não funcional. O sombreado cinza claro com letras pretas indica que a modificação de aminoácido causou função enzimática prejudicada. O sombreado cinza escuro com letras brancas indica a mudança de aminoácido manteve a enzima totalmente funcional. O sombreado preto representa o aminoá- cido nativo na sequência H N90 nativa.

[0021] As caixas brancas restantes não preenchidas representam variações de aminoácidos não testadas neste ensaio.

[0022] Figura 5: Mostra uma versão em diagrama dos resultados obtidos com o ensaio de tolerância a herbicidas. A tolerância foi medida em relação à tolerância a H N90. As caixas pretas na parte superior representam a sequência H N90 nativa (SEQ ID NO: 1). As caixas abaixo da lista de sequência H N90 de cada um dos 20 aminoácidos. Os números listados acima da sequência H N90 são as posições rela- tivas de aminoácidos. O sombreado em faixa cinza vertical representa uma pontuação relativa de tolerância de 0-24, o que indica que a modi- ficação de aminoácido conferiu pouca ou nenhuma tolerância a herbi- cida. O sombreado em faixa cinza horizontal representa uma pontuação de tolerância relativa de 25-49, o que indica que a modificação de ami- noácido conferiu fraca tolerância a herbicida. O sombreado cinza claro sólido com letras pretas representa uma pontuação de tolerância rela- tiva de 50-74, o que indica que a modificação de aminoácidos conferiu tolerância moderada a herbicida. O sombreado cinza escuro sólido com letras brancas representa uma pontuação de tolerância relativa de 75- 100, o que indica que a modificação de aminoácidos conferiu boa tole-

rância a herbicida. Caixas possuindo sombreado cinza escuro e mar- gens pretas grossas representam modificações de aminoácidos que mostram uma pontuação relativa de tolerância superior a 100, o que indica que a modificação de aminoácido conferiu tolerância herbicida melhor do que a de H N90. O sombreado preto representa o aminoá- cido nativo na sequência H N90 nativa. As caixas brancas restantes não preenchidas representam variações de aminoácidos não testadas neste ensaio.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0023] SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácidos de H N90.

[0024] SEQ ID NO:2 através de ID SEQ NO:10 são as sequências de aminoácidos de enzimas microbianas HemG PPO com a alça de in- serção de cadeia longa.

[0025] SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 23 são as sequências de ami- noácidos de diversas enzimas HemG PPO com variação na alça de in- serção de cadeia longa.

[0026] SEQ ID NO:24 através de ID SEQ NO:124 e ID SEQ NO:249 através de ID SEQ NO:263 são as sequências de aminoácidos de 116 variantes HemG PPO recombinantes incorporando cada uma mutação a uma alça de inserção de cadeia longa.

[0027] SEQ ID NO:125 é uma sequência de DNA que codifica SEQ ID NO:1.

[0028] SEQ ID NO:126 através de ID SEQ NO:147 são as sequên- cias de DNA que codificam para SEQ ID NO:2 através de ID SEQ NO:23, respectivamente.

[0029] SEQ ID NO:148 através de ID SEQ NO:248 e ID SEQ NO:264 através de ID SEQ NO:278 são as sequências de DNA que co- dificam para SEQ ID NO:24 através de ID SEQ NO:124 e ID SEQ NO:249 através de ID SEQ NO:263, respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0030] As seguintes descrições e definições são fornecidas para melhor definir a invenção e para orientar aqueles versados na técnica na prática da invenção. A menos que indicado de outra forma, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados na técnica relevante.

[0031] Protoporfirinogênio oxidase funciona em ambas as vias de biossíntese de clorofila e heme, quando converte protoporfirinogênio IX em protoporfirina IX. Protoporfirinogênio oxidases com tolerância a her- bicida são úteis para produzir células, plantas e sementes que não são sensíveis à aplicação de um ou mais herbicidas de PPO e são úteis com os métodos de agricultura e controle de ervas daninhas. A presente in- venção fornece novas proteínas modificadas, que sejam protoporfirino- gênio oxidases com tolerância a herbicidas, bem como as moléculas de DNA recombinante que codificam estas, as composições que compre- endem estas, e métodos de uso delas. Por exemplo, em uma modali- dade, a invenção fornece construtos de DNA que compreendem as mo- léculas de DNA recombinante que codificam protoporfirinogênio oxida- ses manipuladas com tolerância a herbicida para expressão em células, plantas e sementes. Em outra modalidade, a invenção fornece proteínas manipuladas possuindo atividade de protoporfirinogênio com tolerância a herbicida. Em outra modalidade, a invenção fornece métodos e com- posições para o uso de ferramentas de manipulação de proteínas e bioinformática para obter e melhorar protoporfirinogênio oxidases com tolerância a herbicidas. A invenção fornece ainda métodos e composi- ções para produzir células, plantas e sementes com tolerância a herbi- cidas de PPO, e métodos de controle de ervas daninhas usando as cé- lulas, plantas e sementes.

[0032] A invenção fornece proteínas manipuladas e novas e as mo- léculas de DNA recombinantes que as codificam. Como usado neste documento, o termo “manipulado” refere-se a um DNA não natural, pro- teína, célula ou organismo que não seria normalmente encontrado na natureza e foi criado por intervenção humana. Uma “proteína manipu- lada,” “enzima manipulada,” ou “PPO manipulada,” refere-se a uma pro- teína, enzima, ou PPO cuja sequência de aminoácidos foi concebido e criado em laboratório, usando uma ou mais das técnicas de biotecnolo- gia, de criação de proteínas, ou de manipulação de proteínas, tal como a biologia molecular, bioquímica de proteínas, a transformação de bac- térias, a transformação de plantas, mutagênese direcionada ao sítio, evolução dirigida usando mutagênese aleatória, edição de genoma, edi- ção de genes, clonagem de genes, ligação de DNA, síntese de DNA, síntese de proteínas e mistura de DNA. Por exemplo, uma proteína ma- nipulada pode ter uma ou mais deleções, inserções ou substituições em relação à sequência de codificação da proteína de tipo selvagem e cada deleção, inserção ou substituição pode consistir em um ou mais amino- ácidos. A manipulação genética pode ser usada para criar uma molécula de DNA que codifica uma proteína manipulada, tais como PPO manipu- lada que é tolerante a herbicida e compreende, pelo menos, uma pri- meira substituição de aminoácido relativa a uma proteína PPO de tipo selvagem proteína como descrito neste documento.

[0033] Exemplos de proteínas manipuladas fornecidas neste docu- mento são PPOs com tolerância a herbicidas, compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos escolhidas entre L125|I, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P1280Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R1298S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321], W1I32K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y,1133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K135S, K135T, K135V, VI36A, M137A, M137C, M1371, M137L, M137S, M137V, 1138L, 1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H,

Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L1408S, L140T, L140V, L140W, L140Y, N141V, M142L, M1428S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N, incluindo todas as combinações pos- síveis destes, em que a posição da(s) substituição(ões) de aminoácidos é relativa à posição de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1. Em modalidades específicas, uma proteína manipulada fornecida neste do- cumento compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais de qualquer combinação de tais substituições.

[0034] Em uma modalidade, as proteínas manipuladas fornecidas pela invenção têm atividade de protoporfirinogênio oxidase com tolerân- cia a herbicida. Como usado neste documento, “protoporfirinogênio oxi- dase com tolerância a herbicida” significa a capacidade de uma proto- porfirinogênio oxidase de manter pelo menos parte de sua atividade de protoporfirinogênio oxidase na presença de um ou mais herbicidas de PPO. O termo “atividade de protoporfirinogênio oxidase” significa a ca- pacidade de catalisar a oxidação de seis elétrons (remoção de elétrons) de protoporfirinogênio IX para formar protoporfirina IX, ou seja, catalisar a desidrogenação de protoporfirinogênio para formar protoporfirina. À atividade enzimática de uma protoporfirinogênio oxidase pode ser me- dida por qualquer meio conhecido na técnica, por exemplo, por um en- saio enzimático em que a produção do produto de protoporfirinogênio oxidase ou o consumo do substrato de protoporfirinogênio oxidase na presença de um ou mais herbicidas de PPO é medido através de fluo- rescência, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou espec- trometria de massa (MS). Outro exemplo de um ensaio para medir a atividade enzimática de uma protoporfirinogênio oxidase é um ensaio bacteriano, tal como os ensaios descritos neste documento, em que uma protoporfirinogênio oxidase recombinante é expressa em uma cé- lula bacteriana que, de outro modo, não possui atividade de PPO e a capacidade da protoporfirinogênio oxidase recombinante para comple- mentar este fenótipo nocaute é medida. Como usado neste documento, uma "cepa nocaute de hemG" significa um organismo ou célula de um organismo, tal como E. coli, que não possui atividade HemG na medida em que é incapaz de crescer em meio de crescimento isento de heme, ou tal que o seu crescimento é detectavelmente prejudicado na ausên- cia de heme relativamente a uma cepa de outro modo isogênico que compreende um HemG funcional. Uma cepa nocaute de hemG de, por exemplo, E. coli pode ser preparada tendo em vista o conhecimento da técnica, por exemplo, tendo em vista a sequência PPO de E. coli HemG (Número de acesso do Ecogene Nº EG11485; Sasarman et al., "Nucle- otide sequence of the hemG gene involved in the protoporphyrinogen oxidase activity of E. coli KI2" Can J Microbiol 39:1155-1161, 1993).

[0035] As proteínas manipuladas podem ser produzidas alterando ou modificando uma sequência de proteínas do tipo selvagem para pro- duzir uma nova proteína com características modificadas ou uma nova combinação de características úteis de proteínas, como Vmax, Km, Ki, IC5o alterado, especificidade do substrato, inibidor/especificidade de herbicida, seletividade de substrato, capacidade de interagir com outros componentes da célula, como proteínas ou membranas parceiras, esta- bilidade de proteínas, entre outros. Modificações podem ser feitas em posições específicas de aminoácidos em uma proteína e podem ser fei- tas substituindo um aminoácido alternativo pelo aminoácido típico en- contrado nessa mesma posição na natureza (ou seja, na proteína do tipo selvagem). Mutações de aminoácidos podem ser feitas como uma única substituição de aminoácido única na sequência de proteína ou em combinação com uma ou mais outras modificações, tais como uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos, deleções ou adições. Em uma modalidade da invenção, uma proteína manipulada possui característi- cas de proteína alteradas, como aquelas que resultam em sensibilidade reduzida a um ou mais herbicidas em comparação com a proteína de tipo selvagem ou capacidade de conferir tolerância a um ou mais herbi- cidas em uma planta transgênica expressando a proteína manipulada. Em uma modalidade, a invenção fornece, portanto, uma proteína mani- pulada como uma enzima PPO que possui atividade protoporfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida, e a molécula de DNA recombinante que a codifica, com uma ou mais substituições de aminoácidos selecio- nadas do grupo que consiste em L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321l, W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K1358S, K135T, K135V, V136A, M137A, M137C, M1371, M137L, M1378S, M137V, 1138L, 1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, 1141V, M142L, M142S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N e todas as combinações destes, em que a posição da(s) substituição(ões) de aminoácidos é relativa à posição de aminoá- cido estabelecida na SEQ ID NO: 1. Em modalidades específicas, uma proteína manipulada fornecida neste documento compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais de qualquer com- binação de tais substituições, em que a modificação é feita em uma po- sição relativa a uma posição relativa a uma posição comparável em fun- ção na qual a sequência de aminoácidos fornecida como SEQ ID NO:

1. As sequências de aminoácidos de PPOs variantes de HemG recom- binantes ou manipuladas são fornecidas na Tabela 1.

Tabela 1. Sequências de Aminoácidos de PPOs de Variante HemG Recombinantes ou Manipuladas.

Variante HemG Sequência de | Sequência de Variante HemG Sequência de | Sequência de Recombinante Aminoácidos DNA (SEQ ID Recombinante Aminoácidos DNA (SEQ ID (SEQ ID NO) NO) (SEQ1ID NO) NO) LR a o LR a e es os so LR o o e LR OR RR e o re | e e a as LR e e Rs LR OR e e es as | Rs e ss ss LR OR os RR o se LR A e e is so Ra [OR mes is ss

Ls a e ese a a LE TR AR o e

[0036] Modificações similares podem ser feitas em posições análo- gas de qualquer enzima PPO por alinhamento da sequência de amino- ácidos da enzima PPO a ser mutada com a sequência de aminoácidos de uma enzima PPO que possui atividade de protoporfirinogênio oxi- dase tolerante a herbicida. Um exemplo de uma sequência codificando uma enzima PPO que possui atividade de protoporfirinogênio oxidase tolerante a herbicida que pode ser usada para o alinhamento é SEQ ID NO:1. As Figuras 1A e 1B mostram um alinhamento de H N90, a en- zima PPO da ID SEQ NO:1, enzimas PPO conhecidas exemplificativas (SEQ ID NOs:2-10) e enzimas PPO diversas (SEQ ID NOs:11-23). Está dentro das capacidades de uma pessoa versada na técnica usar identi- dade de sequência, como mostrado nas Figuras 1A e 1B, para realizar as modificações de aminoácidos descritas neste documento, por exem- plo, nas proteínas de SEQ ID NOs: 2-23, para gerar enzimas PPO que têm atividade de protoporfirinogênio oxidase tolerante a herbicida. Se- quências de Aminoácidos de PPOs HemG microbianas são fornecidas na Tabela 2.

Tabela 2. Sequências de Aminoácidos de PPOs de HemG Microbi- anas.

Sequência de Aminoáci- Sequência de DNA Proteína de HemG PPO dos (SEQ ID NO) (SEQ ID NO) o OO QG eo OQ RR Rg

[0037] Como usado neste documento, o termo “recombinante” re- fere-se a um DNA, proteína, célula, semente ou organismo que não ocorre naturalmente que é o resultado de engenharia genética e que foi criado por intervenção humana. Uma “molécula de DNA recombinante” é uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA que não ocorre naturalmente e, como tal, é o resultado de intervenção hu- mana, como uma molécula de DNA compreendendo pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas entre si. Um exemplo de uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA fornecida neste docu-

mento que codifica uma protoporfirinogênio oxidase tolerante a herbi- cida operacionalmente ligada a um promotor heterólogo. Uma “proteína recombinante” é uma proteína compreendendo uma sequência de ami- noácidos que não ocorre naturalmente e, como tal, é o resultado de in- tervenção humana, tal como uma proteína manipulada. Uma célula, se- mente ou organismo recombinante é uma célula, semente, ou orga- nismo que compreende DNA ou proteína transgênicos ou heterólogos, por exemplo, uma célula vegetal, semente ou planta transgênicas que compreende um construto de DNA ou uma proteína manipulada da in- venção.

[0038] Tal como usado neste documento, “de tipo selvagem” signi- fica que ocorre naturalmente. Uma “molécula de DNA de tipo selvagem” ou “proteína de tipo selvagem” é uma versão natural de uma molécula de DNA ou proteína, ou seja, uma versão de uma molécula de DNA ou proteína pré-existente na natureza. Uma versão do tipo selvagem de uma molécula de DNA ou proteína pode ser útil para comparação com uma molécula de DNA ou proteína recombinante ou manipulada. Um exemplo de uma proteína do tipo selvagem útil para comparação com as proteínas manipuladas fornecidas pela invenção é a enzima PPO de E. cloacae (H N90) fornecida como SEQ ID NO: 1.

[0039] Uma “planta de tipo selvagem” é uma planta de ocorrência natural. Tais plantas de tipo selvagem podem também ser úteis para a comparação com uma planta que compreende uma molécula de DNA ou proteína recombinante ou manipulada. Um exemplo de uma planta de tipo selvagem útil para comparação com plantas compreendendo uma molécula de DNA ou proteína recombinante ou manipulada pode ser uma planta do mesmo tipo que a planta compreendendo a molécula de DNA ou proteína manipulada, tal como uma proteína que confere uma característica de tolerância a herbicida, e, como tal, é genetica- mente distinta da planta que compreende a característica de tolerância a herbicida.

[0040] Em certas modalidades, o termo plantas de tipo selvagem também pode ser usado ou referido como "plantas de controle". Tal como usado neste documento, “controle” significa um controle experi- mental projetado para fins de comparação. Por exemplo, uma planta de controle em uma análise de planta transgênica é uma planta do mesmo tipo que a planta experimental (ou seja, a planta a ser testada), mas não contém a inserção transgênica, a molécula de DNA recombinante ou o construto de DNA da planta experimental. Exemplos de plantas de con- trole úteis para a comparação com plantas transgênicas incluem: para plantas de milho, milho LH244 não transgênico (número de depósito ATCC PTA-1173); para comparação com plantas de soja: soja A3555 não transgênica (número de depósito ATCC PTA-10207); para compa- ração com plantas de algodão: Coker 130 não transgênico (Número de Proteção de Variedade de Planta (PVP) 8900252); para comparação com óleo de canola ou plantas Brassica napus: linhagem restauradora 65037 da variedade Brassica napus não transgênica (Canada Plant Bre- eders' Rights Application 06-5517); para comparação com plantas de trigo: germoplasma Samson de variedade de trigo não trangênico (PVP 1994).

[0041] Como usado neste documento, o termo “DNA” ou “molécula de DNA" refere-se a uma molécula de DNA de fita dupla de origem ge- nômica ou sintética (ou seja, um polímero de bases desoxirribonucleo- tídicas ou uma molécula de polinucleotídeo) lida a partir da extremidade 5” (a montante) até o final da extremidade 3 (a jusante). Como usado neste documento, o termo “sequência de DNA” refere-se à sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA. A nomenclatura usada neste documento corresponde à do título 37 do Código de Regulamentos Fe- derais dos Estados Unidos &$ 1.822 e estabelecida nas tabelas no Pa- drão WIPO ST.25 (1998), Apêndice 2, Tabelas 1 e 3.

[0042] A presente divulgação fornece uma molécula de ácido nu- cleico que codifica uma proteína que possui atividade de protoporfirino- gênio oxidase tolerante a herbicida, com uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em L125I, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P1280, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R1298S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321], W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y,1133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K135S, K135T, K135V, V136A, M137A, M137C, M1371, M137L, M137S, M137V, 1138L, 1138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, 141V, M142L, M1428S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K, e G146N e todas as combinações destes, em que a posição da(s) substituição(ões) de aminoácidos é relativa às po- sições de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO: 1.

[0043] Como usado neste documento, o termo “molécula de DNA codificador de proteína” refere-se a uma molécula de DNA compreen- dendo uma sequência de DNA que codifica uma proteína. Como usado neste documento, o termo “proteína” refere-se a uma cadeia de amino- ácidos ligados por ligações peptídicas (amida) e inclui ambas as cadeias polipeptídicas que são dobradas ou dispostas de uma forma biologica- mente funcional e cadeias polipeptídicas que não o são. Como usado neste documento, uma “sequência de codificação de proteína” significa uma sequência de DNA que codifica uma proteína. Como usado neste documento, uma “sequência” significa um arranjo sequencial de nucle- otídeos ou aminoácidos. Uma “sequência de DNA" pode se referir a uma sequência de nucleotídeos ou à molécula de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos; uma “sequência de proteína” pode se referir a uma sequência de aminoácidos ou à proteína que compreende uma sequência de aminoácidos. Os limites de uma sequência de codificação de proteína são geralmente determinados por um códon inicial de tra- dução no terminal 5' e um códon terminal da tradução no terminal 3'.

[0044] Como usado neste documento, o termo “isolado” refere-se a separar, pelo menos parcialmente, uma molécula de outras moléculas tipicamente associadas a esta no seu estado natural. Em uma modali- dade, o termo “isolado” refere-se a uma molécula de DNA que é sepa- rada dos ácidos nucleicos que normalmente flanqueiam a molécula de DNA no seu estado natural. Por exemplo, uma molécula de DNA que codifica uma proteína que está naturalmente presente em uma bactéria seria uma molécula de DNA isolada se não estivesse dentro do DNA da bactéria da qual a molécula de DNA que codifica a proteína é natural- mente encontrada. Assim, uma molécula de DNA fundida ou operacio- nalmente ligada a uma ou mais moléculas de DNA com as quais não estaria associada na natureza, por exemplo, como resultado de técnicas de transformação de DNA recombinante ou de plantas, é considerada isolada neste documento. Tais moléculas são consideradas isoladas mesmo quando integradas ao cromossomo de uma célula hospedeira ou presentes em uma solução de ácido nucleico com outras moléculas de DNA.

[0045] Quaisquer métodos conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para isolar e manipular uma molécula de DNA ou um fragmento desta, como divulgado neste documento. Por exemplo, a tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar uma molécula de DNA inicial específica ou produzir variantes da molécula original. Moléculas de DNA ou um frag- mento destas também podem ser obtidas por outras técnicas, tais como sintetizando diretamente o fragmento por meios químicos, como é co-

mumente praticado usando um sintetizador de oligonucleotídeos auto- matizado.

[0046] Devido à degeneração do código genético, há uma varie- dade de diferentes sequências de DNA que podem codificar proteínas, tais como as proteínas alteradas ou manipuladas descritas neste docu- mento. Por exemplo, a Figura 2 fornece o gráfico do código genético universal que mostra todos os possíveis códons tripletos de MRNA (em que T na molécula de DNA é substituído por U na molécula de RNA) e o aminoácido codificado por cada códon. As sequências de DNA que codificam enzimas PPO com as substituições de aminoácidos descritas neste documento podem ser produzidas através da introdução de mu- tações na sequência de DNA que codifica uma enzima PPO de tipo sel- vagem usando métodos conhecidos na técnica e as informações forne- cida na Figura 2. Uma pessoa versada na técnica é capaz de criar se- quências de DNA alternativas que codificam as mesmas, ou essencial- mente as mesmas, proteínas alteradas ou manipuladas, como descrito neste documento. Estas sequências de DNA variantes ou alternativas estão dentro do escopo das modalidades descritas neste documento. Como usado neste documento, as referências a “essencialmente a mesma” sequência referem-se a sequências que codificam substitui- ções, deleções, adições ou inserções de aminoácidos que não alteram materialmente a atividade funcional da proteína codificada pela molé- cula de DNA das modalidades descritas neste documento. Variantes alélicas das sequências nucleotídicas que codificam uma proteína de tipo selvagem ou manipulada são também englobadas nas modalidades descritas neste documento. A substituição de aminoácidos que não os especificamente exemplificados ou naturalmente presentes em uma en- zima PPO de tipo selvagem ou manipulada também é contemplada den- tro do escopo das modalidades descritas neste documento, desde que a enzima PPO com a substituição ainda retenha substancialmente a mesma atividade funcional descrita neste documento.

[0047] As moléculas de DNA recombinante da presente invenção podem ser sintetizadas e modificadas por métodos conhecidos na téc- nica, tanto total como parcialmente, onde é desejável fornecer sequên- cias úteis para manipulação de DNA (tais como sítios de reconheci- mento de enzimas de restrição ou sítios de clonagem baseados em re- combinação), sequências preferenciais em plantas (tais como o uso de códons de plantas ou sequências de consenso de Kozak), ou sequên- cias úteis para o projeto de construto de DNA (tais como sequências de espaçador ou de ligação). A presente invenção inclui moléculas de DNA recombinante e proteínas manipuladas com pelo menos 50% de identi- dade de sequência, pelo menos 60% de identidade de sequência, pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% identidade de sequência, pelo menos 91% de identidade de se- quência, pelo menos 92% de identidade de sequência, pelo menos 93% de identidade de sequência, pelo menos 94% de identidade de sequên- cia, pelo menos 95% de identidade de sequência, pelo menos 96% de identidade de sequência, pelo menos 97% de sequência identidade, pelo menos 98% de identidade de sequência e pelo menos 99% de iden- tidade de sequência com qualquer uma das moléculas de DNA recom- binante ou sequências de aminoácidos fornecidas neste documento e com atividade de protoporfirinogênio oxidase tolerante a herbicida. Como usado neste documento, o termo “porcentagem de identidade de sequência” ou “% de identidade de sequência” refere-se à porcentagem de nucleotídeos ou aminoácidos idênticos em um polinucleotídeo linear ou uma sequência de aminoácidos de uma sequência de referência (“consulta”) (ou sua fita complementar) em comparação com uma se- quência de teste (“matéria”) (ou sua fita complementar) quando as duas sequências estão alinhadas de forma otimizada (com inserções, dele- ções ou lacunas adequadas de nucleotídeos ou aminoácidos que totali- zam menos de 20% da sequência de referência na janela de compara- ção). O alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação é bem conhecido por aqueles versados na técnica e pode ser conduzido por ferramentas como o algoritmo de identidade local de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de identidade de Ne- edleman e Wunsch, o método de busca por similaridade de Pearson e Lipman, e por implementações computadorizadas desses algoritmos, como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA, disponíveis como parte do pacote de software Sequence Analysis do GCGOE Wisconsin PackageO (Accelrys Inc., San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar Inc., 1228 S. Park St., Madison, WI 53715), e MUSCLE (versão 3.6) (RC Edgar, “MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput” Nucleic Acids Research 32(5):1792-7 (2004)) por exemplo, com parâ- metros padrão. Uma “fração de identidade” para segmentos alinhados de uma sequência de teste e de uma sequência de referência é o nú- mero de componentes idênticos que são compartilhados pelas duas se- quências alinhadas dividido pelo número total de componentes na por- ção do segmento de sequência de referência que estão sendo alinhado, isto é, toda a sequência de referência ou uma parte menor definida da sequência de referência. A porcentagem de identidade de sequência é representada como a fração de identidade multiplicada por 100. A com- paração de uma ou mais sequências pode ser com uma sequência com- pleta ou uma porção desta, ou com uma sequência mais longa.

[0048] Como usado neste documento, um “construto de DNA” é uma molécula de DNA recombinante que compreende duas ou mais se- quências de DNA heterólogo. Os construtos de DNA são úteis para a expressão do transgene e podem estar compreendidos em vectores e plasmídeos. Os construtos de DNA podem ser usados em vetores para transformação (isto é, a introdução de DNA heterólogo em uma célula hospedeira) para produzir bactérias ou plantas e células transgênicas (e, como tal, também podem estar contidos no DNA de plastos ou em DNA genômico de uma planta, semente, célula ou parte de planta trans- gênicas). Como usado neste documento, um “vetor” significa qualquer molécula de DNA recombinante que pode ser usada para transformação de bactérias ou plantas. As moléculas de DNA fornecidas pela invenção podem, por exemplo, ser inseridas em um vetor como parte de um cons- truto de DNA com a molécula de DNA ligada operacionalmente a um elemento de expressão de gene heterólogo que funciona em uma planta para afetar a expressão da proteína manipulada pela molécula de DNA. Métodos para fazer e usar construtos e vetores de DNA são bem co- nhecidos na técnica e descritos em detalhes, por exemplo, em guias e manuais de laboratório, incluindo Michael R. Green e Joseph Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (quarta edição) ISBN: 978-1- 936113-42-2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2012). Os com- ponentes para um construto de DNA ou um vetor compreendendo um construto de DNA incluem um ou mais elementos de expressão gênica operacionalmente ligados a uma sequência de ácido nucleico passível de transcrição, tal como o seguinte: um promotor para a expressão de um DNA operacionalmente ligado, uma molécula de DNA de codificação de proteínas operacionalmente ligada e uma região 3' não traduzida (UTR) operacionalmente ligada. Os elementos de expressão gênica úteis na prática da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes tipos de elementos: promotor, região 5' UTR, potenciador, líder, elemento de ação cis, íntron, região 3 UTR e um ou mais transgenes marcadores selecionáveis.

[0049] O termo “transgene” refere-se a uma molécula de DNA incor- porada artificialmente ao genoma de um organismo como resultado de intervenção humana, tal como por meio de métodos de transformação de plantas. Como usado neste documento, o termo “transgênico” signi- fica compreender um transgene, por exemplo, uma “planta transgênica” refere-se a uma planta que compreende um transgene no seu genoma, e um “traço transgênico” refere-se a uma característica ou fenótipo transmitido ou conferido pela presença de um transgene incorporado ao genoma da planta. Como resultado de tal alteração genômica, a planta transgênica é algo distintamente diferente da planta de tipo selvagem relacionada, e o traço transgênico é um traço que não se encontra na- turalmente na planta de tipo selvagem. As plantas transgênicas da in- venção compreendem as moléculas de DNA recombinante e as proteí- nas manipuladas fornecidas pela invenção.

[0050] Como usado neste documento, o termo “heterólogo” refere- se à relação entre duas ou mais coisas que não são normalmente asso- ciadas na natureza, por exemplo, que são derivadas de diferentes fontes ou que não são normalmente encontradas na natureza em conjunto de qualquer outra maneira. Por exemplo, uma molécula de DNA ou uma proteína podem ser heterólogas em relação a outra molécula de DNA, proteína, célula, planta, semente ou organismo se não se encontram normalmente na natureza em conjunto ou no mesmo contexto. Em cer- tas modalidades, uma primeira molécula de DNA é heteróloga a uma segunda molécula de DNA se as duas moléculas de DNA não são nor- malmente encontradas em conjunto na natureza no mesmo contexto. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante codificadora de pro- teína é heteróloga em relação a um promotor operacionalmente ligado se tal combinação não é normalmente encontrada na natureza. Da mesma forma, uma proteína é heteróloga em relação a uma segunda proteína operacionalmente ligada, tal como um peptídeo de trânsito, se essa combinação não for normalmente encontrada na natureza. Em ou- tra modalidade, uma molécula de DNA recombinante que codifica uma enzima PPO é heteróloga em relação a um promotor operacionalmente ligado que é funcional em uma célula vegetal se essa combinação não for normalmente encontrada na natureza. Uma molécula de DNA recom- binante também pode ser heteróloga em relação a uma célula, semente ou organismo no qual ela é inserida quando não ocorreria naturalmente naquela célula, semente ou organismo.

[0051] Uma “proteína heteróloga” é uma proteína presente em uma planta, semente, célula, tecido ou organismo em que não ocorre natu- ralmente ou que está operacionalmente ligada a uma proteína com a qual não é naturalmente ligada. Um exemplo de uma proteína heteró- loga é uma enzima PPO manipulada compreendendo pelo menos uma primeira substituição de aminoácido descrita neste documento que é ex- pressa em qualquer planta, semente, célula, tecido ou organismo. Outro exemplo é uma proteína operacionalmente ligada a uma segunda pro- teína, tal como um peptídeo de trânsito ou uma proteína tolerante a her- bicida, com a qual não está naturalmente ligada, ou uma proteína intro- duzida em uma célula vegetal na qual não ocorre naturalmente usando técnicas de engenharia genética.

[0052] Como usado neste documento, “operacionalmente ligado” significa duas ou mais moléculas de DNA ou duas ou mais proteínas ligadas de uma maneira que uma pode afetar a função da outra. Molé- culas de DNA operacionalmente ligadas ou proteínas operacionalmente ligadas podem ser parte de uma única molécula contígua e podem ou não estar adjacentes. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma molécula de DNA codificador de proteína em um construto de DNA onde as duas moléculas de DNA estão dispostas de forma que o promotor possa afetar a expressão do transgene.

[0053] Os construtos de DNA da invenção podem incluir um promo- tor operacionalmente ligado a uma molécula de DNA codificador de pro- teína fornecida pela invenção, onde o promotor conduz a expressão da proteína manipulada. Os promotores úteis na prática da presente inven- ção incluem aqueles que funcionam em uma célula para expressão de uma molécula de DNA operacionalmente ligada, tal como um promotor bacteriano ou vegetal. Promotores de plantas são variados e bem co- nhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aqueles que são indutíveis, virais, sintéticos, constitutivos, temporalmente regulados, espacial- mente regulados ou espaço-temporalmente regulados.

[0054] Em uma modalidade da invenção, um construto de DNA for- necido neste documento inclui uma sequência de DNA que codifica uma sequência de trânsito que é operacionalmente ligada a uma sequência de DNA heterólogo que codifica uma enzima PPO, onde a sequência de trânsito facilita a localização da molécula de proteína dentro da célula. Sequências de trânsito são conhecidas na técnica como sequências de sinal, peptídeos alvo, sequências alvo, sequências de localização e pep- tídeos de trânsito. Um exemplo de uma sequência de trânsito é um pep- tídeo de trânsito de cloroplasto (CTP), uma sequência de trânsito mito- condrial (MTS) ou um peptídeo de trânsito duplo de cloroplasto e mito- condrial. Ao facilitar a localização da proteína dentro da célula, a se- quência de trânsito pode aumentar o acúmulo de proteína recombi- nante, proteger a proteína da degradação proteolítica ou aumentar o nível de tolerância a herbicidas e, assim, reduzir os níveis de lesão na célula, na semente ou no organismo após a aplicação do herbicida. Os CTPs e outras moléculas de direcionamento que podem ser usadas em conexão com a presente invenção são bem conhecidos na técnica. Uma sequência de DNA que codifica uma sequência de trânsito pode ser operacionalmente ligada a uma sequência de DNA que codifica uma enzima PPO como fornecida neste documento. Tal ligação operacional pode envolver a remoção do códon de metionina de partida (ATG) na extremidade 5' da sequência de PPO, embora não seja necessário fazê- lo e a sequência de trânsito vai facilitar a localização da molécula de proteína dentro da célula com ou sem a remoção do códon de metionina de partida.

[0055] Tal usado neste documento, “expressão transgênica”, “ex- pressar um transgene”, “expressão de proteína” e “expressar uma pro- teína” significam a produção de uma proteína através do processo de transcrição de uma molécula de DNA em RNA mensageiro (mMRNA) e a tradução do MRNA em cadeias de polipeptídeos que são finalmente do- bradas em proteínas. Uma molécula de DNA codificador de proteína pode ser operacionalmente ligada a um promotor heterólogo em um construto de DNA para uso na expressão da proteína em uma célula transformada com a molécula de DNA recombinante.

[0056] Em um aspecto, a invenção fornece células, tecidos, plantas e sementes que compreendem as moléculas de DNA recombinante ou as proteínas manipuladas da presente invenção. Essas células, tecidos, plantas e sementes que compreendem as moléculas de DNA recombi- nante ou as proteínas manipuladas exibem tolerância a um ou mais her- bicidas de PPO.

[0057] Um método de produção de tais células, tecidos, plantas e sementes é através da transformação vegetal. Métodos adequados para a transformação de células vegetais hospedeiras para uso com a presente invenção incluem qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula (por exemplo, onde um construto de DNA recombinante é integrado de maneira estável em um cromossomo ve- getal) e são bem conhecidos na técnica. Dois métodos eficazes e am- plamente usados para a transformação celular são a transformação me- diada por Agrobacterium e a transformação mediada por bombardea- mento de microprojéteis. Métodos de bombardeamento de microprojé- teis são ilustrados, por exemplo, nas Patentes US Nº US 5.550.318; US

5.538.880; US 6.160.208; e US 6.399.861. Métodos de transformação mediados por Agrobacterium são descritos, por exemplo, na Patente US

Nº US 5.591.616, a qual é incorporada neste documento por referência na sua totalidade. Uma célula com uma molécula de DNA recombinante ou uma proteína manipulada da presente invenção podem ser selecio- nadas para a presença da molécula de DNA recombinante ou da prote- ína manipulada, por exemplo através da sua atividade enzimática codi- ficada, antes ou após a regeneração de tal célula em uma planta.

[0058] Outro método para produzir as células, plantas e sementes da presente invenção é através da modificação do genoma usando in- tegração específica de sítio ou edição de genoma. A modificação dire- cionada de genomas de plantas mediante o uso de métodos de edição de genoma pode ser usada para criar linhagens vegetais aprimoradas através da modificação do DNA genômico vegetal. Como usado neste documento “integração direcionada por sítio” refere-se a métodos de edição de genoma que permitem a inserção direcionada de um ou mais ácidos nucleicos de interesse permitir em um genoma vegetal. Métodos adequados para alterar uma sequência de DNA de tipo selvagem ou uma sequência transgênica preexistente ou para inserir DNA em um ge- noma vegetal em um sítio cromossômico predeterminado incluem qual- quer método conhecido na técnica. Métodos exemplificativos incluem o uso de nucleases específicas de sequência, tal como nucleases de dedo de zinco, meganucleases manipuladas ou nativas, endonucleases TALE ou endonucleases guiadas por RNA (por exemplo, um sistema de Repetição Palindrômica Curta Agrupada e Regularmente Interespaçada (CRISPR)/Cas9, um sistema CRISPR/Cpf1, um sistema CRISPR/CasX, um sistema CRISPR/CasY, um sistema CRISPR/Cascade). Várias mo- dalidades referem-se a métodos de edição de genoma usando oligonu- cleotídeos de fita única para introduzir modificações precisas de pares de bases em um genoma vegetal, como descrito por Sauer et al., Plant Physiology 170(4):1917—1928 (2016). Métodos de edição de genoma para modificar, deletar ou inserir sequências de ácidos nucleicos no

DNA genômico são conhecidos na técnica.

[0059] Em certas modalidades, a presente invenção fornece a mo- dificação ou substituição de uma sequência de codificação existente, tal como uma sequência de codificação de PPO ou outra inserção transgê- nica existente, em um genoma vegetal com uma sequência que codifica uma proteína manipulada, como uma sequência de codificação de PPO manipulada da presente invenção ou um cassete de expressão compre- endendo tal proteína manipulada. Várias modalidades referem-se ao uso de métodos conhecidos de edição de genoma, como nucleases de dedo de zinco, meganucleases modificadas ou nativas, endonucleases TALE ou endonuclease guiada por RNA (por exemplo, um sistema de Repetição Palindrômica Curta Agrupada e Regularmente Interespaçada (CRISPR)/Cas9, um sistema CRISPR/Cpf1, um sistema CRISPR/CasX, um sistema CRISPR/CasY, um sistema CRISPR/Cascade).

[0060] Várias modalidades podem, portanto, se referir a um cons- truto de DNA recombinante compreendendo um ou mais cassetes de expressão que codificam uma nuclease síitio-específica e, opcional- mente, qualquer proteína(s) associada(s) para realizar a modificação do genoma. Estes um ou mais cassetes que expressam nuclease podem estar presentes na mesma molécula ou vetor que um molde doador para edição modelada ou um cassete de expressão compreendendo a se- quência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PPO, como des- crito neste documento (em cis) ou em uma molécula ou vetor separado (em trans). Vários métodos para integração sítio-direcionada são conhe- cidos na técnica envolvendo diferentes nucleases específicas de se- quência (ou complexos de proteínas ou RNA guia ou ambos) que cortam o DNA genômico para produzir uma quebra de fita dupla (DSB) ou um nick em um sítio ou lócus genômico desejado. Como compreendido na técnica, durante o processo de reparação da DSB ou do nick introduzi-

dos pela enzima nuclease, o DNA, o transgene ou o cassete de expres- são do molde doador podem se integrar ao genoma no sítio do DSB ou do nick. A presença de um ou mais braços de homologia no DNA a ser integrado pode promover a adoção e o direcionamento da sequência de inserção no genoma vegetal durante o processo de reparação por meio de recombinação homóloga, embora um evento de inserção possa ocor- rer através de união de extremidade não-homóloga (NHEJ).

[0061] Como usado neste documento, o termo “agente indutor de quebra de fita dupla” refere-se a qualquer agente que pode induzir uma quebra de fita dupla (DSB) em uma molécula de DNA. Em algumas mo- dalidades, o agente indutor de quebra de fita dupla é uma enzima de modificação genômica sítio-específica.

[0062] Como usado neste documento, o termo “enzima de modifi- cação genômica sítio-específica” refere-se a qualquer enzima que pode modificar uma sequência nucleotídica de uma maneira específica de se- quência. Em algumas modalidades, uma enzima de modificação genô- mica sítio-específica modifica o genoma ao induzir uma quebra de fita simples. Em algumas modalidades, uma enzima de modificação genô- mica sítio-específica modifica o genoma ao induzir uma quebra de fita dupla. Em algumas modalidades, uma enzima de modificação genômica sítio-específica compreende uma citidina-desaminase. Em algumas mo- dalidades, uma enzima de modificação genômica sítio-específica com- preende uma adenina desaminase. Na presente divulgação, enzimas de modificação genômica sítio-específicas incluem endonucleases, re- combinases, transposases, desaminases, helicases e qualquer combi- nação destas. Em algumas modalidades, a enzima de modificação ge- nômica sítio-específica é uma nuclease específica de sequência.

[0063] Em um aspecto, a endonuclease é selecionada a dentre uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma nuclease com efetores do tipo ativador transcricional (TALEN), uma Argonauta

(exemplos não limitantes de proteínas argonautas incluem Argonauta de Thermus thermophilus (TtAgo), Argonauta de Pyrococcus furiosus (PfAgo), Argonauta de Natronobacterium gregoryi (NgAgo), uma nu- clease guiada por RNA, tal como uma nuclease associada a CRISPR (exemplos não limitantes de nuclease associada a CRISPR incluem Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (tam- bém conhecida como Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, emr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX, CasY, seus homólogos ou versões modificadas destas).

[0064] Em algumas modalidades, a enzima de modificação genô- mica sítio-específica é uma recombinase. Exemplos não limitantes de recombinases incluem uma tirosina recombinase ligada a um motivo de reconhecimento de DNA fornecida neste documento que é selecionada do grupo que consiste em uma Cre recombinase, uma Gin recombinase, uma Flp recombinase, e uma Tnp1 recombinase. Em um aspecto, uma Cre recombinase ou uma Gin recombinase fornecidas neste documento são ligadas a um domínio de ligação ao DNA, ou um domínio de ligação ao DNA TALE, ou uma Cas9 nuclease. Em outro aspecto, uma serina recombinase ligada a um motivo de reconhecimento de DNA fornecida neste documento é selecionada do grupo que consiste em uma PhiC31 integrase, uma R4 integrase, e uma TP-901 integrase. Em outro as- pecto, uma DNA transposase ligada a um domínio de ligação ao DNA fornecida neste documento é selecionada do grupo que consiste em TALE-piggyBac e TALE-Mutator.

[0065] Qualquer um dos DNAs de interesse fornecidos neste docu- mento pode ser integrado em um sítio alvo de uma sequência de cro- mossomos através da introdução do DNA de interesse e da enzima de modificação genômica sítio-específica fornecida. Qualquer método for- necido neste documento pode usar qualquer enzima de modificação ge- nômica sítio-específica fornecida neste documento.

[0066] Em um aspecto, a invenção fornece células, plantas e se- mentes que são tolerantes a herbicidas inibidores de PPO. Tais células, plantas e sementes são úteis nos métodos de agricultura, tais como controle de ervas daninhas e produção agrícola.

[0067] Como usado neste documento, “herbicida” é qualquer molé- cula que é usada para controlar, prevenir ou interferir no crescimento de uma ou mais plantas. Herbicidas exemplares incluem inibidores da ace- til-CoA carboxilase (ACCase) (por exemplo, propionatos de ariloxifenóxi e ciclo-hexanodionas); inibidores da acetolactato sintase (ALS) (por exemplo sulfonilureias, imidazolinonas, triazolopirimidinas e triazolino- nas); inibidores de 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (por exemplo glifosato), auxinas sintéticas (por exemplo fenoxis, ácidos benzoicos, ácidos carboxílicos, semicarbazonas), fotossíntese (fotossis- tema II) inibidores (por exemplo triazinas, triazinonas, nitrilas, benzotia- diazóis e ureias), inibidores da glutamina sintetase (GS) (por exemplo glufosinato e bialaphos), inibidores da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) (por exemplo isoxazóis, pirazolonas e tricetonas), inibidores da protoporfirinogênio oxidase (PPO) (por exemplo, difeniléteres, N -fenilf- talimida, aril-triazinonas e pirimidinodionas), inibidores de ácidos graxos de cadeia muito longa (por exemplo cloroacetamidas, oxiacetamidas e pirazóis), inibidores da biossíntese da celulose (por exemplo indazi- flam), inibidores do fotossistema | (por exemplo paraquat), inibidores da montagem de microtúbulos (por exemplo, pendimetalina) e inibidores da fitoeno-dessaturase (PDS) (por exemplo norflurazona), entre outros.

[0068] Como usado neste documento, um “herbicida de PPO” é um químico que é direcionado e inibe a atividade enzimática de uma proto-

porfirinogênio oxidase (PPO), que catalisa a desidrogenação do proto- porfirinogênio IX para formar protoporfirina IX, que é o precursor de heme e clorofila. A inibição da protoporfirinogênio oxidase provoca a for- mação de espécies de oxigênio reativas, resultando em ruptura da membrana celular e, por fim, na morte de células suscetíveis. Herbicidas de PPO são bem conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis. Exemplos de herbicidas de PPO incluem, mas não estão limitados a, difeniléteres (como acifluorfen, seus sais e ésteres, aclonifen, bifenox, seus sais e ésteres, etoxifen, seus sais e ésteres, fluoronitrofen, furiloxi- fen, halosafen, clometoxifen, fluoroglicofen, seus sais e ésteres, lacto- fen, seus sais e ésteres, oxifluorfen e fomesafen, seus sais e ésteres); tiadiazóis (como flutiacet-metila e tidiazimin); pirimidinedionas ou fenilu- racilas (como benzfendizona, butafenacila, etila [3-2-cloro-4-fluoro-5-(1- metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetra-hidropirimidin-3-ilfenóxi]-2- piridilóxilacetato (Número de Registro CAS 353292-31-6 e referido neste documento como S-3100), flupropacila, saflufenacila e tiafenacil); fenilpirazóis (como fluazolato, piraflufen e piraflufen-etil); oxadiazóis (como oxadiargila e oxadiazon); triazolinonas (tais como azafenidin, bencarbazona, carfentrazona, seus sais e ésteres e sulfentrazona); oxa- zolidinedionas (como pentoxazona); N-fenilftalimidas (como cinidon- etila, flumiclorac, flumiclorac-pentila e flumioxazina); derivados de ben- zoxazinona (tais como 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3,4-di-hidro- 3-0Xx0-4-prop-2-inil-2H-1,4-benzoxazin-6-il)-1,3,5-triazinana-2,4-diona); flufenpir e flufenpir-etila; piraclonila; e profluazol. Protoporfirinogênio oxi- dases e células, sementes, plantas e partes de plantas fornecidas pela invenção exibem tolerância a herbicida para um ou mais herbicidas de PPO.

[0069] Como usado neste documento, “tolerante a herbicida” ou “to- lerância a herbicida” significa a capacidade de ser total ou parcialmente não afetado pela presença ou a aplicação de um ou mais herbicidas,

por exemplo, para resistir aos efeitos tóxicos de um herbicida quando aplicado. Uma célula ou organismo é “tolerante a herbicida” se é capaz de manter pelo menos algum crescimento ou fenótipo normal na pre- sença de um ou mais herbicidas. Um traço é um traço de tolerância a herbicida se a sua presença pode conferir uma maior tolerância a um herbicida em uma célula, planta ou semente em comparação com a cé- lula, planta ou semente de tipo selvagem ou de controle. Plantações compreendendo um traço de tolerância a herbicida podem continuar a crescer e são minimamente afetadas pela presença do herbicida. Uma enzima-alvo é “tolerante a herbicida” se exibe uma melhor atividade en- zimática em comparação com uma enzima de tipo selvagem ou de con- trole na presença do herbicida. A tolerância a herbicida pode ser uma insensibilidade parcial ou completa a um herbicida específico e pode ser expressa como uma porcentagem (%) de tolerância ou insensibilidade a um herbicida específico.

[0070] As plantas contempladas que podem ser produzidas com um traço de tolerância a herbicida da presente invenção podem incluir, por exemplo, qualquer planta incluindo plantas de cultivo tais como soja (Glycine max), milho (Zea mays), algodão (Gossypium sp.), e plantas de Brassica, entre outras.

[0071] Os herbicidas podem ser aplicados a uma área de cultivo de planta compreendendo as plantas e sementes fornecidas pela invenção como um método para controlar ervas daninhas. As plantas e sementes fornecidas pela invenção compreendem um traço de tolerância a herbi- cida e, como tal, são tolerantes à aplicação de um ou mais herbicidas de PPO. A aplicação do herbicida pode ser a taxa comercial recomen- dada (1X) ou qualquer fração ou múltiplo desta, tal como duas vezes a taxa comercial recomendada (2X). As taxas de herbicidas podem ser expressas como equivalente ácido por libra por acre (lb ae/acre) ou equivalente ácido por grama por hectare (g ae/ha) ou como libras de ingrediente ativo por acre (lb ai/acre) ou gramas de ingrediente ativo por hectare (g ai/ha), dependendo do herbicida e da formulação. A aplicação de herbicida compreende pelo menos um herbicida de PPO. A área de crescimento de planta pode ou não compreender ervas daninhas no mo- mento da aplicação do herbicida. Uma dose de herbicida(s) de PPO her- bicidamente efetiva para uso em uma área para controle de ervas dani- nhas pode consistir em uma faixa de cerca de 0,1X a cerca de 30X taxa(s) de rótulo ao longo de uma estação de crescimento. A taxa de rótulo de 1X para alguns herbicidas de PPO exemplares é fornecida na Tabela 3. Um (1) acre é equivalente a 2,47105 hectares e uma (1) libra é equivalente a 453,592 gramas. As taxas de herbicida podem ser con- vertidas entre o sistema inglês e o métrico como: (lb ai/ac) multiplicado por 1,12 = (kg ia/ha) e (kg ai/ha) multiplicado por 0,89 = (lb ai/ac). Tabela 3. Herbicidas de PPO Exemplares

[0072] As aplicações de herbicidas podem ser misturadas sequen- cialmente ou em tanque com um, dois ou uma combinação de vários herbicidas de PPO ou qualquer outro herbicida compatível. Várias apli- cações de um herbicida ou de dois ou mais herbicidas, em combinação ou por si só, podem ser usadas ao longo de uma estação de crescimento em áreas que compreendem plantas transgênicas da invenção para o controle de um largo espectro de ervas daninhas dicotiledôneas, ervas daninhas monocotiledôneas ou ambas, por exemplo, duas aplicações (como uma aplicação pré-plantio e uma aplicação pós-emergência ou uma aplicação pré-emergência e uma aplicação pós-emergência) ou três aplicações (como uma aplicação pré-plantio, uma aplicação pré- emergência e uma aplicação pós-emergência ou uma aplicação pré- emergência e duas aplicações pós-emergência).

[0073] Como usado neste documento, uma “erva daninha” é qual- quer planta indesejada. Uma planta pode ser considerada indesejável de forma geral para fins de agricultura ou horticultura (por exemplo, es- pécies Amaranthus) ou pode ser considerada indesejável em uma situ- ação específica (por exemplo, uma planta de cultivo de uma espécie em um campo de uma espécie diferente, também conhecida como uma planta voluntária).

[0074] As plantas, progênies, sementes, células vegetais e partes de plantas transgênicas da invenção também podem conter um ou mais traços adicionais. Traços adicionais podem ser introduzidos cruzando uma planta contendo um transgene compreendendo as moléculas de DNA recombinante fornecidas pela invenção com outra planta contendo um ou mais traços adicionais. Como usado neste documento, “cruzar” significa reproduzir duas plantas individuais para produzir uma planta de progênie. Duas plantas podem, assim, ser cruzadas para produzir pro- gênies que contêm os traços desejáveis de cada progenitor. Como usado neste documento, “progênie” significa a prole de qualquer gera- ção de uma planta precursor, e progênie transgênica compreende um construto de DNA fornecido pela invenção e herdado de pelo menos uma planta precursor.

[0075] Também podem ser introduzidos um ou mais traços adicio- nais através da cotransformação de um construto de DNA para este traço transgênico adicional (ou traços transgênicos adicionais) com um construto de DNA compreendendo as moléculas de DNA recombinante fornecidas pela invenção (por exemplo, com todas os construtos de DNA presentes como parte do mesmo vetor usado para transformação de planta) ou inserindo o traço adicional (ou traços adicionais) em uma planta transgênica compreendendo um construto de DNA fornecido pela invenção ou vice-versa (por exemplo, usando qualquer um dos métodos de transformação de plantas ou edição de genoma em uma planta trans- gênica ou célula vegetal). Tais traços adicionais incluem, mas não estão limitados a, aumento na resistência a insetos, aumento da eficiência de uso de água, aumento da performance de rendimento, aumento do re- sistência à seca, aumento da qualidade da semente, melhoria da quali- dade nutricional, produção de semente híbrida e tolerância a herbicidas, em que a característica é medida em comparação com uma planta de tipo selvagem.

Traços de tolerância a herbicida adicionais exemplares podem incluir tolerância transgênica ou não-transgênica a um ou mais herbicidas tais como inibidores de ACCase (por exemplo, propionatos de ariloxifenóxi e ciclo-hexanodionas), inibidores da ALS (por exemplo, sulfonilureias, imidazolinonas, triazolopirimidinas e triazolinonas), inibi- dores de EPSPS (por exemplo, glifosato), auxinas sintéticas (por exem- plo, fenóxis, ácidos benzoicos, ácidos carboxílicos, semicarbazonas), inibidores de fotossíntese (por exemplo, triazinas, triazinonas, nitrilas, benzotiadiazóis e ureias), inibidores de síntese de glutamina (por exem- plo, glufosinato), inibidores de HPPD (por exemplo isoxazóis, pirazolo- nas e tricetonas), inibidores de PPO (por exemplo éteres difenílicos, N- fenilftalimida, triazinonas de arila e pirimidinedionas) e inibidores de áci- dos graxos de cadeia longa (por exemplo, cloroacetamindas, oxiaceta- midas e pirazóis), entre outros.

Exemplos de proteínas de tolerância a herbicida úteis para a produção de traços de tolerância a herbicida adi-

cionais são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limi- tados a, 5-enolipiruvila chiquimato 3-fosfato sintases tolerantes a glifo- sato (por exemplo, CP4 EPSPS, 2mEPSPS), glifosato oxidoredutases (GOX), glifosato N-acetiltransferases (GAT), acetolactato sintases (ALS)/aceto-hidroxiácido sintases (AHAS) tolerantes a herbicida, 4-hi- droxifenilpiruvato dioxigenases (HPPD), dicamba monooxigenases (DMO), fosfinotricina acetila transferase (PAT), glutamina sintetases (GS) tolerantes a herbicida, 2,4-diclorofenoxiproprionato dioxigenases (TfdA), R-2,4-diclorofenoxipropionato dioxigenases (RdpA), S-2,4-diclo- rofenoxipropionato dioxigenases (SdpA), protoporfirinogênio oxidases (PPO) tolerantes a herbicida e citocromo P450 monooxigenases. Traços de resistência a insetos exemplares podem incluir resistência a um ou mais membros insetos de uma ou mais das ordens Lepidoptera, Cole- optera, Hemiptera, Thysanoptera, Diptera, Hymenoptera e Orthoptera, entre outras. Tais traços adicionais são bem conhecidos por uma pes- Soa versada na técnica; por exemplo, uma lista destes traços transgêni- cos é fornecida pelo Serviço de Inspeção de Saúde Animal e Vegetal (APHIS) do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA).

[0076] Plantas e progênies transgênicas que são tolerantes a herbi- cidas de PPO podem ser usadas com qualquer método de reprodução conhecido na técnica. Nas linhagens vegetais que compreendem dois ou mais traços, os traços podem ser independentemente segregados, ligados ou uma combinação de ambos em linhagens vegetais que com- preendem três ou mais traços transgênicos. O retrocruzamento com uma planta precursora e cruzamento com uma planta não transgênica também são contemplados, assim como a propagação vegetativa. Des- crições de métodos de reprodução que são normalmente usados para diferentes traços e plantações são bem conhecidos por aqueles versa- dos na técnica. Para confirmar a presença dos transgene(s) em uma determinada planta ou semente, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de biologia mo- lecular, tais como Southern e northern blotting, PCR e sequenciamento de DNA; ensaios bioquímicos, tais como detecção da presença de um produto proteico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e wes- tern blots) ou por função enzimática; ensaios de partes de plantas, tais como ensaios de folhas ou raízes; e também, analisando o fenótipo de toda a planta.

[0077] A introgressão de um traço transgênico em um genótipo de planta é alcançada como resultado do processo de conversão por retro- cruzamento. Um genótipo vegetal no qual uma característica transgê- nica foi introgressada pode ser referido como um genótipo, uma linha- gem, um endocruzado ou um híbrido convertido por retrocruzamento. Da mesma forma, um genótipo de planta sem o traço transgênico dese- jado pode ser referido como um genótipo, uma linhagem, um endocru- zado ou um híbrido não convertido.

[0078] Como usado neste documento, o termo “compreendendo” significa “incluindo mas não limitado a”.

[0079] Tendo descrito a invenção em detalhes, será evidente que modificações, variações e modalidades equivalentes são possíveis sem sair do escopo da invenção definido nas reivindicações anexadas. Além disto, deve ser apreciado que os exemplos na presente divulgação são fornecidos como exemplos não limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1: Diversidade de Sequência Dentro da Alça de Cadeia Longa de Proteínas HemG Microbianas

[0080] Um conjunto diverso de enzimas de HemG PPO foi exami- nado para diversidade na alça de inserção de cadeia longa da proteína. A alça de inserção de cadeia longa é uma característica determinante de enzimas HemG PPO microbianas e tem aproximadamente 25 resí- duos de comprimento com resíduos conservados chave (Boynton et a/.,

Biochemistry (2009) 48:6705-6711).

[0081] Uma análise genômica foi realizada usando um conjunto ini- cial de 1.013 sequências de HemG PPO de vários microrganismos. Al- goritmos foram projetados para capturar tanto a diversidade de sequên- cia geral das proteínas e a diversidade dentro da alça de inserção de cadeia longa. As sequências foram então separadas em grupos com base na sua semelhança de sequência geral dentro do conjunto inicial.

[0082] Para criar o primeiro grupo, todas as sequências do conjunto inicial com 270% de identidade de sequência com a HemG PPO H N90 (ID SEQ NO:1), que possui atividade de protopofirinogênio oxidase to- lerante a herbicida, foram identificadas. Em seguida, a análise foi repe- tida para identificar sequências que possuíam 270% de identidade de sequência com qualquer sequência identificada na primeira análise. Por fim, a pesquisa foi repetida uma terceira vez para identificar sequências que tinham 270% de identidade de sequência com qualquer sequência identificada na segunda análise. Os resultados das três análises foram reunidos para criar o primeiro grupo, que representou sequências de três iterações de análises de identidade de sequência 270%, para um total de 273 sequências de HemG PPO.

[0083] O segundo grupo foi criado concentrando-se nas sequências não agrupadas restantes do conjunto inicial. Todas as sequências com 50%-70% identidade de sequência com a HemG PPO H N90 foram identificadas. Em seguida, a análise foi repetida para identificar sequên- cias que possuíam 270% de identidade de sequência com qualquer se- quência identificada na primeira análise. Por fim, a pesquisa foi repetida uma terceira vez para identificar sequências que tinham 270% de iden- tidade de sequência com qualquer sequência identificada na segunda análise. Os resultados das três análises foram reunidos para criar o se- gundo grupo, que representou sequências das três iterações, para um total de 278 sequências de HemG PPO.

[0084] O terceiro grupo foi criado concentrando-se nas sequências não agrupadas ainda restantes do conjunto inicial. Todas as sequências com 40%-50% identidade de sequência com a HemG PPO H N90 fo- ram identificadas. Em seguida, a análise foi repetida para identificar se- quências que possuíam 270% de identidade de sequência com qualquer sequência identificada na primeira análise. Uma terceira pesquisa foi feita para identificar sequências que tinham 270% de identidade de se- quência com qualquer sequência identificada na segunda análise, mas esta última iteração não capturou quaisquer sequências adicionais do conjunto inicial. Os resultados das duas análises foram reunidos para criar o terceiro grupo, que representou sequências de ambas as itera- ções, para um total de 66 sequências de HemG PPO.

[0085] Os três grupos de sequências foram então usados para a análise da variação encontrada em cada um dos 25 aminoácidos na alça de inserção de cadeia longa. A sequência de alça de inserção de cadeia longa de cada PPO foi identificada e compilada. Surpreendentemente, verificou-se que a variação de sequência neste domínio é similar para os primeiro e segundo grupos, embora as sequências destes dois gru- pos, quando combinadas, apresentaram uma variação de sequência ge- ral de até 50% e representaram 551 sequências diversas. A Figura 3 fornece uma visão geral da variação encontrada na alça de inserção de cadeia longa entre as 617 sequências dos três grupos. Entre as 25 po- sições de aminoácidos da alça de inserção de cadeia longa, 211 amino- ácidos diferentes foram identificados das 617 sequências de HemG PPO. A Figura 1A e a Figura 1B mostram um alinhamento de sequência da alça de inserção de cadeia longa (destacado em preto) de um sub- conjunto de 23 sequências microbianas de HemG PPO.

[0086] Um grupo de 17 sequências de HemG PPO foi selecionado para representar a variação encontrada na alça de inserção de cadeia longa. As sequências de proteína das 17 enzimas HemG PPO diversas,

quando comparadas usando alinhamento de sequências em pares, tem uma porcentagem de identidade que varia de aproximadamente 15% a 98% de identidade ao longo de todo o comprimento da sequência. Estas 17 enzimas HemG PPO diversas foram testadas quanto a atividade de protoporfirinogênio oxidase e a tolerância a herbicida.

[0087] Um sistema de triagem bacteriana de protoporfirinogênio oxi- dase foi usado para testar proteínas quanto à atividade de protoporfiri- nogênio oxidase e, assim, confirmar que são enzimas PPO funcionais. Este sistema de triagem usou um ensaio de resgate funcional em uma cepa de E. coli que continha uma inativação genética para a enzima HemG PPO de E. coli (referida neste documento como H N10 e corres- pondendo à SEQ ID NO: 2). A cepa de E. coli de inativação de hemG foi transformada com vetores de expressão bacteriana, cada um con- tendo um cassete de expressão para uma das enzimas PPO e cultivada em meio LB. A cepa de E. coli de inativação de hemG mostrou cresci- mento mínimo em meios bacterianos clássicos (por exemplo, meio LB), mas o crescimento normal pode ser restaurado quando o meio bacteri- ano é suplementado com heme livre ou quando uma protoporfirinogênio oxidase funcional foi expressa nas células. Foram usados dois controles para comparação: Proteína Fluorescente Verde (GFP) e células não transformadas. Duas das enzimas HemG PPO (HemG014 e HemG015) não foram capazes de resgatar a cepa de E. coli de inativação de hemG (sem atividade de protoporfirinogênio oxidase), duas apresentaram um resgate parcial com um crescimento mais lento (intermediário) e as 13 restantes mostraram um fenótipo de resgate completo (funcional). Os resultados são mostrados na Tabela 4.

[0088] Um ensaio de tolerância a herbicida de protoplasto foi proje- tado para testar as 17 enzimas HemG PPO para tolerância a herbicida em células vegetais. Moléculas de DNA recombinante que codificam as 17 enzimas HemG PPO diversas (códons otimizados para a expressão dicotiledônea) foram sintetizadas e clonadas em vetores de transforma- ção de plantas. Os construtos de expressão continham uma molécula de DNA recombinante que codifica uma das 17 enzimas HemG PPO diversas operacionalmente ligada a um promotor vegetal, um peptídeo de trânsito de cloroplasto e uma região não traduzida da extremidade 3'. Protoplastos de soja foram transformados usando métodos padrão com os vetores de transformação de plantas. Os protoplastos transfor- mados foram cultivados na presença do herbicida de PPO S-3100 a uma concentração de 1,0 uM ou tratamentos simulados (controle nega- tivo). Os protoplastos foram então testados quanto a tolerância a herbi- cida de PPO, normalizados relativos à pontuação da enzima HemG PPO H NO90, que foi definida como 100. Ensaios foram realizados em dois lotes em quatro replicações. Pontuações de tolerância relativa tive- ram suas médias calculadas e o erro padrão foi calculado (SE). Os en- saios de controle de GFP tiveram uma pontuação de tolerância de O, confirmando que os protoplastos de soja não foram tolerantes ao herbi- cida de PPO na ausência de uma proteína de tolerância a herbicida. Duas das enzimas de HemG PPO (HemG014 e HemG015) não forne- ceram nenhuma tolerância, enquanto as outros 14 forneceram pontua- ções de tolerância variando de 24 a 89 relativas à H N90. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

[0089] Quinze das enzimas HemG PPO diversas foram então ex- pressas em plantas transgênicas, e as plantas transgênicas foram ana- lisadas quanto à tolerância a herbicida de PPO. Moléculas de DNA re- combinante que codificam as 15 enzimas HemG PPO diversas (códons otimizados para a expressão dicotiledônea) foram sintetizadas e clona- das em vetores de transformação de plantas. Os construtos de expres- são continham uma molécula de DNA recombinante que codifica uma das 15 enzimas HemG PPO diversas operacionalmente ligada a um pro- motor vegetal, um peptídeo de trânsito de cloroplasto e uma região não traduzida 3'.

[0090] As células de milho foram transformadas com esses vetores usando Agrobacterium tumefaciens e métodos padrão conhecidos na técnica. Plântulas transgênicas Ro regeneradas foram cultivadas na es- tufa. As plantas foram pulverizadas no estágio de crescimento de apro- ximadamente V2 a Va com o herbicida de PPO S3100 a uma taxa de 80 g/ha para avaliar a tolerância. As plantas foram avaliadas quanto a lesão 1-14 dias após o tratamento e as pontuações de lesão são registradas. A porcentagem de plantas com pontuações de lesão visual de 20% ou menos foi calculada para todas as plantas para cada uma das enzimas HemG PPO diversas. Qualquer construto em que 25% ou mais das plantas individuais apresentam boa tolerância (pontuações de lesão vi- sual de 20% ou menos) é considerado eficaz para conferir tolerância a herbicidas. Oito das enzimas HemG PPO diversas (HemGo001, HemG002, HemG003, HemG004, HemG005, HemG006, HemG011 e Hem6G012) forneceram um número substancial de plantas de milho que demonstram tolerância a herbicida de PPO (com lesão de 20% ou me- nos após o tratamento). Os resultados são mostrados na Tabela 4.

[0091] As células de soja foram transformadas com esses vetores usando Agrobacterium tumefaciens e métodos padrão conhecidos na técnica. Plântulas transgênicas Ro regeneradas foram cultivadas na es- tufa. As plantas foram pulverizadas no estágio de crescimento de apro- ximadamente V2 a Va com o herbicida de PPO S3100 a uma taxa de 20 g/ha para avaliar a tolerância. As plantas foram avaliadas quanto a lesão 1-14 dias após o tratamento e as pontuações de lesão são registradas. A porcentagem de plantas com pontuações de lesão visual de 20% ou menos foi calculada para todas as plantas para cada uma das enzimas HemG PPO diversas. Qualquer construto em que 25% ou mais das plantas individuais apresentam boa tolerância (pontuações de lesão vi- sual de 20% ou menos) é considerado eficaz para conferir tolerância a herbicidas. Dez das enzimas HemG PPO diversas (HemG001, HemG002, HemG003, HemG004, HemG005, HemG006, HemGo007, HemGo009, HemG011 e HemG013) forneceram um número substancial de plantas de soja que demonstram tolerância a herbicida de PPO (com lesão de 20% ou menos após o tratamento). Os resultados são mostra- dos na Tabela 4.

Tabela 4. Teste de Enzimas HemG PPO Diversas Ensaio de Comple- | Pontuação de Tolerân- Milho Soja Genel/Prote- , mentação com PPO cia de Protoplasto Taxa de Aprova- Taxa de Aprova- ma em E. coli (% de H N90 - CTP) ção ção e den a ame | mem nenhum sem dados sem dados

GFP ão ros | somas nenhum 7 sem dados sem dados zio DOC Ro O OC ae | ae

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[0092] Das 15 enzimas HemG PPO diversas testadas em milho e soja (ou ambos) transformados de forma estável, 10 foram identificadas como sendo eficazes para conferir tolerância a herbicidas (produzindo mais do que 25% de plantas possuindo pontuações de lesão visual de 20% ou menos). As sequências destas enzimas HemG PPO que são eficazes para conferir tolerância a herbicidas para plantas são forneci- das como: HemG001 (SEQ ID NO:11), HemG002 (SEQ ID NO:12), HemGo003 (SEQ ID NO:13), HemG004 (SEQ ID NO:14), HemG005

(SEQ ID NO:15), HemG006 (SEQ ID NO:16), HemG007 (SEQ ID NO:17), HemG009 (SEQ ID NO:19), HemG011 (SEQ ID NO:21) e HemG013 (SEQ ID NO:23). Exemplo 2: Caracterização Funcional Variantes de Alça de Inser- ção de Cadeia Longa

[0093] A alça de inserção de cadeia longa da proteína HemG foi descrita como sendo essencial para a função da enzima PPO e muitos dos resíduos são relatados como sendo altamente conservados (Boyn- ton et al., Biochemistry (2009) 48:6705-6711). Enzimas HemG PPO re- combinantes com variações de aminoácidos introduzidas dentro da alça de inserção de cadeia longa foram criadas e, em seguida, analisadas quanto a alterações da função enzimática em um ensaio bacteriano.

[0094] O sistema de triagem bacteriano de protoporfirinogênio oxi- dase descrito no Exemplo 2 foi usado para testar proteínas variantes quanto à atividade da protoporfirinogênio oxidase. Este ensaio fornece um meio para testar proteínas variantes com rapidez e facilidade quanto à atividade de protoporfirinogênio oxidase.

[0095] Enzimas HemG PPO recombinantes que incorporam muta- ções à alça de inserção de cadeia longa foram projetadas como se se- gue. Cada aminoácido da alça de inserção de cadeia longa foi conside- rado independentemente e classificado quanto à prioridade com base na quantidade de variação identificada na posição e quanto da variação foi encontrada em qual dos grupos de sequência. Com base nesta ava- liação, 21 dos 25 aminoácidos na alça de inserção de cadeia longa fo- ram selecionados para a mutagênese. As mutações foram criadas na sequência de H N90 para representar a variação observada em cada uma destas 21 posições, resultando em 109 variantes de aminoácido único. Além disso, uma mutagênese de varredura de alanina foi reali- zada usando a sequência de H N90 para produzir mutantes com uma alanina em cada posição na alça de inserção de cadeia longa que não era uma alanina em H N90, resultando em 10 variantes adicionais. Um total de 119 variantes de aminoácidos únicos foram então usadas para a triagem.

[0096] Moléculas de DNA recombinante que codificam as 119 vari- antes foram então sintetizadas e clonadas como construtos de expres- são em vetores de transformação bacteriana. Para cada variante, toda a sequência nucleotídica completa foi mantida idêntica à sequência nu- cleotídica de H N90, exceto para o códon para o aminoácido mutante. Os construtos de expressão continham cada uma das moléculas de DNA recombinante que codificam as 119 variantes ligadas operacional- mente a um promotor vegetal, um peptídeo de trânsito de cloroplasto APG6 e uma região não traduzida 3'. Os controles positivos consistiram em construtos de expressão contendo a sequência de codificação H N90 operacionalmente ligada a um promotor vegetal, um peptídeo de trânsito de cloroplasto APG6 e uma região não traduzida 3'. Cada vetor foi transformado individualmente na cepa nocaute de E. coli para hemG. Como controles negativos, uma transformação simulada (sem vetor pre- sente) e um vetor para expressão de Proteína Verde Fluorescente (GFP) foram transformados individualmente na cepa de E. coli nocaute para hemG.

[0097] Cada uma das 119 variantes foi triada quanto a sua capaci- dade de restaurar o crescimento normal à cepa nocaute de E. coli para hemG em placas LB. Todas as placas foram pontuadas de forma cega e independente por três indivíduos para não crescimento (variante não complementa), crescimento lento (variante tem função enzimática redu- zida) ou crescimento normal (variante tema função enzimática completa e fornece complementação total). O crescimento foi medido com base no tamanho das colônias, em vez do número de colônias nas placas, e os três indivíduos concordaram em todas as avaliações. A tabela 5 mos-

tra os resultados do ensaio. Neste ensaio, 105 das 119 variantes res- tauraram o crescimento normal, sugerindo que estas variantes têm fun- ção de PPO total; 6 das 119 variantes exibiram crescimento de colônias a uma taxa de crescimento significativamente mais lenta, o que sugere que estas variantes possuem função de PPO reduzida; e 8 das 119 va- riantes não apresentaram nenhum crescimento de colônias, sugerindo que estas variantes não têm nenhuma função de PPO. Todos os con- troles positivos mostraram complementação como esperado, embora o construto de H N10 tenha crescido mais lentamente do que o construto de H N90. A Figura 4 mostra uma representação esquemática dos re- sultados deste ensaio.

Tabela 5. Ensaio de Complementação de Variante de HemG | ara Emnosinas | | ora sra O O OARomnesinee | A O A E E A Lo [RE DOI

FRETE DOI

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[ros es Ds e ee [o se o e ee [rose [e as [e o ma [rose Te ss [e e rermosames | [or e e o eme [oe Ts e e ee os e e me [era [e a o o sermos | [os e e o o me [oa e e o o omeneisimo | re e o me

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[0098] Os resultados deste ensaio sugerem que, embora a alça de inserção de cadeia longa seja altamente conservada em proteínas de HemG PPO, há flexibilidade em muitos dos resíduos dentro da alça em relação à manutenção da função enzimática. Isto foi inesperado com base em relatórios públicos que afirmam que mudanças nos resíduos na alça de inserção de cadeia longa resultam em perda de função enzi- mática (Zwerschke, D., Karrie, S., Jahn, D. e Jahn, M. (2014) Biosci. Rep. 34(4), art:e00124.doi:10.1042/BSR20140081). Neste ensaio, fun- ção enzimática alterada foi encontrada particularmente com mutações que foram feitas nas posições G123, L125, Y127, 1138, L140, 1141, M142 e G147, mostrando que alterações nestas posições são importan- tes para mudar a função enzimática.

Exemplo 3: Caracterização da Tolerância a Herbicidas de Alça de Inserção de Cadeia Longa

[0099] As enzimas HemG PPO recombinantes com variações de aminoácidos introduzidas na alça de inserção de cadeia longa foram criadas e analisadas quanto a alterações na sensibilidade a herbicidas em plantas. Um ensaio de tolerância a herbicida de protoplasto foi pro- jetado para determinar se as variantes poderiam conferir tolerância a um herbicida de PPO em células vegetais.

[00100] Os protoplastos de soja foram transformados usando méto- dos padrão com os mesmos construtos de expressão descritos no Exemplo 2, mas usando um vetor de transformação de plantas. Os pro- toplastos transformados foram cultivados na presença do herbicida de PPO S-3100 em uma concentração de 1,0 uM ou tratamentos simulados (controle negativo). Os protoplastos foram então testados quanto a to- lerância a herbicida de PPO, expresso relativo ao controle de GFP H N90 (permitindo a derivação de uma pontuação de tolerância relativa para permitir comparações entre experimentos). Ensaios foram realiza- dos em dois lotes em quatro replicações. Pontuações de tolerância re- lativa tiveram suas médias calculadas e o erro padrão foi calculado (SE). Os ensaios de controle de GFP tiveram uma pontuação de tolerância de O, confirmando que os protoplastos de soja não foram tolerantes ao her- bicida de PPO na ausência de uma proteína de tolerância a herbicida. Os ensaios N-N90 tiveram uma pontuação de tolerância de 100. A Ta- bela 6 mostra os resultados do ensaio. 13 variantes não conferiram ne- nhuma tolerância (comparável ao controle não transformado ou o con- trole de GFP), 6 variantes conferiram tolerância fraca (comparável ao controle de H N90 sem CTP), 9 variantes conferiram tolerância margi- nal (comparável ao controle de H N10) e 79 variantes conferiram boa tolerância (comparável ao controle de H N90 com CTP). 12 variantes tiveram pontuações de tolerância relativas superiores a 100 (melhor do que o controle de H N90 com CTP). As alterações de aminoácidos nes- tas 12 variantes estão localizadas em 7 posições de resíduo, com quatro das posições tendo mais do que 1 variante tendendo a mais de 100. Isto sugere que estes 7 sítios de aminoácidos são de particular interesse no que diz respeito a tolerância a herbicida melhorada. A Figura 5 mostra uma representação esquemática dos resultados deste ensaio.

Tabela 6. Resultados do Ensaio de Protoplasto Variante de HemG -

S$3100 AA AA AA NT (% de H N90 - CTP) [ara O [ese sm [O

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[0113] Um subconjunto de 39 variantes (mais controles) foi selecio- nado para análise adicional. Estas variantes foram testadas quanto à tolerância para os três herbicidas de PPO adicionais flumioxazin, sulfen- trazona e lactofen em ensaios similares para o ensaio de tolerância de S-3100 descrito acima. Protoplastos transformados foram tratados com flumioxazin (5 nM), sulfentrazona (1 uM) e lactofen (1 uM). A Tabela 7 mostra os resultados do ensaio. Das 39 variantes testadas, 30 apresen- taram boa tolerância para flumioxazin, sulfentrazona ou lactofen e 9 ti-

nham fraca tolerância (pontuações de tolerância inferiores a 50, indica- das como “PT”). Das 30 variantes que apresentaram boa tolerância, 8 apresentaram uma alteração na tolerância a um ou mais herbicidas que era maior do que a variação experimental em comparação com S-3100. Destas 8 variantes, 4 variantes conferiram maior tolerância a um ou mais dos herbicidas, o que é indicado como “Superior” na Tabela 7 abaixo, enquanto 4 variantes conferiram tolerância inferior a um ou mais dos herbicidas, o que é indicado como “Inferior "na Tabela 7 abaixo. As variantes "NSD" tinham pontuações de tolerância em que a diferença na pontuação de tolerância era menor que o erro padrão para um determi- nado ponto de dados. Tabela 7. Resultados do Ensaio de Protoplasto Variante de HemG - Flumioxazin, Sulfentrazona e Lactofen Construto de wT Mudança Posição | Posição Sulfentra- Lacto- HemG AA AA AA NT

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[0114] Das 8 variantes que demonstraram uma diferença significa- tiva na pontuação de tolerância a flumioxazin, sulfentrazona ou lactofen em comparação com a sua pontuação de tolerância a S-3100, 6 varian- tes foram localizadas nos resíduos hidrofóbicos M137, L140 e M142. À região que abrange os resíduos M137 a M142 contém um grande nú- mero de resíduos hidrofóbicos (especialmente |, L, V, M, A). A análise desta região hidrófoba sugere que estes resíduos são excepcional- mente importantes na modulação da funcionalidade da variante enzimá- tica. Além disso, estes resíduos são excepcionalmente importantes na modulação da tolerância a diferentes herbicidas inibidores de PPO.

[0115] Os protoplastos transformados podem ser expostos a outros herbicidas de PPO, tais como difeniléteres (como acifluorfen, seus sais e ésteres, aclonifen, bifenox, seus sais e ésteres, etoxifen, seus sais e ésteres, fluoronitrofen, furiloxifen, halosafen, clometoxifen, fluoroglico- fen, seus sais e ésteres, sais e ésteres de lactofen, oxifluorfen e fomesa- fen, seus sais e ésteres); tiadiazóis (como flutiacet-metila e tidiazimin); pirimidinadionas ou feniluracilas (como benzfendizona, butafenacila,

etila —[3-2-cloro-4-fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-te- tra-hidropirimidin-3-il)fenóxi]-2-piridilóxilacetato (Número de Registro CAS 353292-31-6 e referido neste documento como S-3100), flupropa- cila, saflufenacila e tiafenacil); fenilpirazóis (como fluazolato, piraflufen e piraflufen-etil); oxadiazóis (como oxadiargila e oxadiazon); triazolino- nas (tais como azafenidin, bencarbazona e carfentrazona, seus sais e ésteres); oxazolidinadionas (como pentoxazona); N-fenilftalimidas (como cinidon-etila, flumiclorac e flumiclorac-pentil); derivados de ben- zoxazinona (tais como 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3,4-di-hidro- 3-0x0-4-prop-2-inil-2H-1,4-benzoxazin-6-i1)-1,3,5-triazinano-2,4-diona); flufenpir e flufenpir-etila; piraclonila; e profluazol. Um tratamento simu- lado pode ser usado como um controle negativo. Exemplo 4: Caracterização de Tolerância Funcional e Herbicida de Variantes Combinatórias

[0116] Variantes são projetadas para compreender duas ou mais modificações de aminoácidos dentro da alça de inserção de cadeia longa em uma sequência de HemG PPO. Estas enzimas HemG PPO variantes combinatórias são então testadas para determinar a atividade de PPO. As sequências de DNA de HemG PPO variante combinatória são sintetizadas e clonadas como um cassete de expressão. Um vetor de transformação bacteriano compreendendo o cassete de expressão pode ser transformado na cepa nocaute de E. coli para hemG para a triagem de resgate bacteriana de alto rendimento inicial como descrito no Exemplo 2. As variantes combinatórias são triadas por sua capaci- dade em restaurar o crescimento normal da cepa nocaute de E. coli para hemG.

[0117] As enzimas HemG PPO variantes combinatórias também são testadas quanto à sua capacidade de conferir tolerância a herbici- das de PPO a uma célula vegetal. Um cassete de expressão contendo as sequências de DNA de HemG PPO variante combinatória é usado com um vetor de transformação de plantas para transformar protoplas- tos de soja. O ensaio de tolerância de protoplastos foi realizado como descrito no Exemplo 3, e as variantes combinatórias são triadas quanto à sua capacidade de conferir tolerância a herbicidas às células vegetais. Exemplo 5: Expressão e Teste de Variantes de Enzimas HemG PPO em Plantas

[0118] As variantes de HemG PPO microbianas descritas nos exemplos acima podem ser expressas em plantas transformadas de forma estável, e estas plantas podem ser analisadas para tolerância a herbicida de PPO.

[0119] Vinte e cinco das variantes de HemG PPO microbianas fo- ram testadas em milho ou de soja estavelmente transformados (ou am- bos) para tolerância a herbicida. Os vetores de transformação de plan- tas foram construídos compreendendo uma molécula de DNA recombi- nante que codifica uma variante de enzima HemG PPO (com a sequên- cia de codificação de proteína otimizada para expressão de monocotile- dônea ou dicotiledônea) operacionalmente ligada a um promotor da planta, sequência de trânsito, e 3UTR.

[0120] No milho, as células de milho foram transformadas com os vetores de transformação de plantas usando Agrobacterium tumefaci- ens e métodos padrão conhecidos na técnica. Plântulas transgênicas Ro regeneradas são cultivadas na estufa. As plantas Ro foram pulverizadas no estágio de crescimento de aproximadamente V2 a Va com S3100 a uma taxa de 80 g/ha. As plantas foram então avaliadas quanto a lesão 1-14 dias após o tratamento e as pontuações de lesão foram registra- das. Plantas transgênicas com uma única cópia da inserção de DNA transgênico (ou seja, plantas de evento único) foram identificadas, e plantas Ro que continham apenas uma cópia e passaram no teste de pulverização de herbicida foram criadas para produzir sementes R:.

[0121] Na soja, os embriões excisados foram transformados com os vetores de transformação de plantas usando Agrobacterium tumefaci- ens e métodos padrão conhecidos na técnica. Plântulas transgênicas Ro regeneradas foram cultivadas na estufa. As plantas Ro foram pulveriza- das no estágio de crescimento de aproximadamente V2 a Va com S3100 a uma taxa de 20 g/ha. As plantas foram então avaliadas quanto a lesão 1-14 dias após o tratamento e as pontuações de lesão foram registra- das. Plantas transgênicas com uma única cópia da inserção de DNA transgênico (ou seja, plantas de evento único) foram identificadas, e plantas Ro que continham apenas uma cópia e passaram no teste de pulverização de herbicida foram criadas para produzir sementes R1. Para algumas variantes de enzimas HemG PPO, as plantas R: foram cultivadas na estufa e pulverizadas no estágio de crescimento de apro- ximadamente V2 a Va com S3100 a uma taxa de 60 g/ha. As plantas foram então avaliadas quanto a lesão 1-14 dias após o tratamento e as pontuações de lesão foram registradas.

[0122] Plantas de soja e milho transgênicas com pontuação de le- são visuais de 20% ou menos foram classificados como aprovadas na triagem de tolerância a herbicida, demonstrando assim a tolerância ao herbicida de PPO. Calculou-se a percentagem de plantas totais para cada variante da enzima HemG PPO aprovada na triagem de tolerância a herbicidas. Qualquer construto em que 25% ou mais das plantas indi- viduais apresentam boa tolerância (pontuações de lesão visual de 20% ou menos) é considerado eficaz para conferir tolerância a herbicidas.

[0123] Os testes demonstraram que os resultados obtidos nos en- saios de protoplastos (conduzidos como descrito acima) eram consis- tentes com os resultados obtidos em plantas inteiras, validando o uso do ensaio de protoplastos como uma ferramenta de triagem. Das 25 va- riantes de HemG PPO microbianas testadas em milho e soja (ou ambos) transformadas de forma estável, 20 foram identificadas como sendo efi- cazes para conferir tolerância a herbicidas (produzindo mais do que

25% de plantas possuindo pontuações de lesão visual de 20% ou me- nos). Dessas vinte, 14 tiveram resultados de eficácia mais elevado do que o controle positivo H N90. Os resultados são fornecidos na Tabela

8. Tabela 8. Resultados dos Testes de Variantes de HemG em Plantas de Soja e Milho. Pontuação de Tolerância Soja Milho Construto de HemG de Protoplasto % de Aprovação % de Aprovação LFR O gg | FR [OI go ERR [o gg [FR TT | FR [a o FOR [E FR [ego

[0124] No algodão, embriões excisados (Coker 130) podem ser transformados com esses vetores usando Agrobacterium tumefaciens e métodos padrão conhecidos na técnica. Plântulas transgênicas Ro rege- neradas são cultivadas em estufa e testadas como descrito acima.

7TUTI Outros herbicidas podem ser testados com as plantas transgênicas para tolerância.

Isso pode ser feito, por exemplo, cultivando várias plantas transgênicas para cada HemG PPO e dividindo as plantas em grupos.

Os grupos são pulverizados com herbicida(s) de PPO (um herbicida de PPO por grupo) para avaliar a tolerância.

Por exemplo, as plantas trans- gênicas são pulverizadas aproximadamente na fase de crescimento de 2-4 folhas verdadeiras com lactofen a aproximadamente 220g ai/ha ou 440g ai/ha ou flumioxazin a aproximadamente 210 g/ha ou 420 g/ha.

As plantas são então avaliadas quanto a lesão 1-14 dias após o tratamento e as pontuações de lesão são registradas.

Plantas transgênicas não pulverizadas são usadas para comparação fenotípica com plantas não transgênicas não pulverizadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um promotor heterólogo operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com ativi- dade de protoporfirinogênio oxidase com tolerância a herbicida, em que a proteína tem pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-23 e compreende, pelo menos, uma pri- meira substituição de aminoácido na posição correspondente aos resí- duos 125 a 146 da SEQ ID NO:1, em que a substituição é selecionada do grupo que consiste em: L1251, L125V, R126A, Y127W, P128A, P128D, P128E, P128K, P128L, P128Q, P128R, P128S, P128T, R129A, R129E, R129G, R129H, R129I, R129K, R129L, R129N, R129Q, R129S, Y130L, R131A, W132A, W132F, W1321l, W132K, W132L, W132P, W132R, W132S, W132T, W132V, W132Y, 1133A, D134A, D134N, D134Q, D134T, K135A, K135Q, K135R, K1358S, K135T, K135V, V136A, M137A, M137C, M1371, M137L, M137S, M137V, 1138L, N138M, 1138V, Q139A, Q139C, Q139E, Q139G, Q139H, Q139K, Q139L, Q139M, Q139R, Q139S, L140A, L140C, L140F, L140G, L140H, L140I, L140M, L140N, L140Q, L140S, L140T, L140V, L140W, L140Y, 1141V, M142L, M142S, M142V, R143A, M144A, T145A, G146A, G146D, G146H, G146K e G146N.

2. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 das refe- ridas substituições de aminoácidos.

3. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína tem pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de amino- ácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24-124 e 249-263.

4. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína compre- ende uma enzima protoporfirinogênio oxidase da classe HemG.

5. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivin- dicação 4, caracterizada pelo fato de que a referida substituição de ami- noácido está localizada em uma alça de inserção de cadeia longa na referida enzima.

6. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada pelo fato de que o promotor heterólogo é fun- cional em uma célula vegetal.

7. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivin- dicação 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligada a uma molécula de DNA que codifica uma sequência de trânsito que funciona para localizar a referida proteína dentro de uma célula.

8. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA recombi- nante está compreendida em um genoma de uma célula vegetal.

9. Construto de DNA, caracterizado pelo fato de que compre- ende a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação

1.

10. Proteína manipulada, caracterizada pelo fato de que é codificada pela molécula de DNA recombinante, como definida na rei- vindicação 1.

11. Planta, semente, célula ou parte de planta transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de DNA recom- binante, como definida na reivindicação 1.

12. Planta, semente, célula ou parte de planta transgênica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a planta, semente, célula ou parte de planta transgênica é tolerante a pelo menos um herbicida de PPO.

13. Planta, semente, célula ou parte de planta, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o herbicida de PPO é selecionado do grupo que consiste em: acifluorfen, fomesafen, lactofen, fluoroglicofen-etila, oxifluorfen, flumioxazin, azafenidin, carfen- trazona-etila, sulfentrazona, flutiacet-metila, oxadiargila, oxadiazon, pi- raflufen-etila, saflufenacila e S-3100.

14. Planta, semente, célula ou parte de planta transgênica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta, semente, célula ou parte de planta transgênica é tolerante a pelo menos um segundo herbicida.

15. Método para conferir tolerância ao herbicida de PPO para uma planta, semente, célula ou parte da planta, caracterizado pelo fato de que compreende: expressão heteróloga na referida planta, se- mente, célula ou parte da planta da planta da proteína manipulada, como definida na reivindicação 10.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a tolerância a herbicida é pelo menos a um herbicida de PPO selecionado do grupo que consiste em: acifluorfen, fomesafen, lactofen, fluoroglicofen-etila, oxifluorfen, flumioxazin, azafenidin, carfen- trazona-etila, sulfentrazona, flutiacet-metila, oxadiargila, oxadiazon, pi- raflufen-etila, saflufenacila e S-3100.

17. Método para produzir uma planta tolerante a herbicida, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) transformar uma célula vegetal com a molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1; e b) regenerar uma planta da célula vegetal que compreende a molécula de DNA recombinante.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de selecionar a referida planta ou uma progênie da mesma para tolerância a herbicida de PPO.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de cruzar a planta regene- rada consigo mesma ou com uma segunda planta para produzir a pro- gênie.

20. Método para controlar ou prevenir o crescimento de er- vas daninhas em uma área de crescimento de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de uma quantidade eficaz de pelo menos um herbicida de PPO a uma área de crescimento de plantas que compreende a planta ou semente transgênica, como definida na reivindicação 11, em que a planta ou semente transgênica é tolerante ao herbicida de PPO.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o herbicida de PPO é selecionado do grupo que con- siste em: acifluorfen, fomesafen, lactofen, fluoroglicofen-etila, oxifluor- fen, flumioxazin, azafenidin, carfentrazona-etila, sulfentrazona, flutiacet- metila, oxadiargila, oxadiazon, piraflufen-etila, saflufenacila e S-3100.

22. Método para identificar uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína com atividade de protoporfirinogênio oxidase to- lerante a herbicida, caracterizado pelo fato de que o método compre- ende: a) transformar uma cepa de E. coli em que falta a atividade da enzima PPO tolerante a herbicida com um vetor de expressão bac- teriana compreendendo a molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1; e b) cultivar a referida E. coli transformada para identificar uma proteína com atividade de protoporfirinogênio oxidase tolerante a herbi- cida.

23. Método de triagem para um gene de tolerância a herbi- cida, caracterizado pelo fato de que compreende: a) expressar a molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, em uma célula vegetal; e b) identificar uma célula vegetal que apresenta tolerância a um herbicida de PPO.

24. Método para produzir uma planta tolerante a um herbi- cida de PPO e pelo menos um outro herbicida, caracterizado pelo fato de que compreende: a) obter uma planta, como definida na reivindicação 11; b) cruzar a planta com uma segunda planta compreendendo tolerância a pelo menos um outro herbicida, e c) selecionar uma planta de progênie resultante do referido cruzamento que compreende tolerância a um herbicida de PPO e pelo menos um outro herbicida.

25. Método para reduzir o desenvolvimento de ervas dani- nhas tolerantes a herbicidas, caracterizado pelo fato de que compre- ende: a) cultivar, em um ambiente de cultivo, uma planta, de acordo com a reivindicação 11; e b) aplicar um herbicida de PPO e pelo menos um outro her- bicida ao ambiente de cultivo, em que a planta de cultivo é tolerante ao herbicida de PPO e ao pelo menos um outro herbicida.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o herbicida de PPO é selecionado do grupo que con- siste em acifluorfen, fomesafen, lactofen, fluoroglicofen-etila, oxifluorfen, flumioxazin, azafenidin, carfentrazona-etila, sulfentrazona, flutiacet-me- tila, oxadiargila, oxadiazon, piraflufen-etila, saflufenacila e S-3100.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um outro herbicida é selecionado do grupo que consiste em: um inibidor de ACCase, um inibidor de ALS, um inibidor de EPSPS, uma auxina sintética, um inibidor da fotossíntese, um inibidor de glutamina sintetase, um inibidor de HPPD, um inibidor de PPO e um inibidor de ácido graxo de cadeia longa.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ACCase é um propionato de ariloxifenóxi ou uma ciclohexanodiona; o inibidor de ALS é uma sulfonilureia, imi- dazolinona, triazolopirimidina ou uma triazolinona; o inibidor de EPSPS é o glifosato; a auxina sintética é um herbicida fenoxi, um ácido ben- zoico, um ácido carboxílico ou uma semicarbazona; o inibidor de fotos- síntese é um triazina, uma triazinona, uma nitrila, um benzotiadiazol ou uma ureia; o inibidor da síntese de glutamina é o glufosinato; o inibidor de HPPD é um isoxazol, uma pirazolona ou uma tricetona; o inibidor de PPO é um éter difenílico, uma N-fenilftalimida, uma arila triazinona ou uma pirimidinodiona; ou o inibidor de ácidos graxos de cadeia longa é uma cloroacetamida, uma oxiacetamida ou um pirazol.