BR112018002769B1 - Molécula de dna e polipeptídeo recombinantes,construto de dna, uso de uma planta, semente, célula, parte de planta transgênica e métodos: de transformação de planta; de triagem para um gene de tolerância a herbicida; de produção de uma planta tolerante a herbicida; para conferir tolerância a herbicida; e para controlar e reduzir o desenvolvimento de ervas daninhas - Google Patents

Abstract

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TOLERÂNCIA A HERBICIDA EM PLANTAS. A presente invenção refere-se à biotecnologia e fornece moléculas de DNA recombinante inovadoras e proteínas geneticamente modificadas para conferir tolerância a herbicidas inibidores de protoporfirinogênio oxidase. A invenção também fornece plantas transgênicas, sementes, células e partes de planta tolerantes a herbicida contendo as moléculas de DNA recombinante, bem como métodos de uso das mesmas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório N°. de Série US 62/212,716, depositado no dia 1° de setembro de 2015, do Pedido Provisório N°. de Série US 62/323,852, depositado em 18 de abril de 2016, e do Pedido Não Provisório N°. de Série US 15/228,993, depositado em 4 de agosto de 2016, cujas descrições estão aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] A listagem de sequências contida no arquivo chamado MONS384WO_sequence_listing.txt, que tem 204 quilobites (medido no MS-Windows) e criada em 3 de agosto de 2016, é depositada com este por meio de envio eletrônico e incorporada aqui por referência.

ANTECEDENTES CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção se refere ao campo da biotecnologia. Mais especificamente, a invenção se refere a moléculas de DNA recombinante que codificam enzimas que fornecem tolerância a herbicidas que inibem protoporfirinogênio oxidase.

TÉCNICA RELACIONADA

[004] A produção cultura agrícola geralmente utiliza traços transgênicos criados usando os métodos da biotecnologia. Um gene heterólogo, também conhecido como transgene, pode ser introduzido em uma planta para produzir um traço transgênico. A expressão do transgene na planta confere um traço, como a tolerância a herbicidas, na planta. Exemplos de traços de tolerância a herbicidas transgênicos incluem tolerância a glifosato, tolerância a glufosinato e tolerância a dicamba. Com o aumento das espécies de ervas daninhas resistentes aos herbicidas comumente usados, novos traços de tolerância a herbicida são necessários no campo. Os herbicidas de interesse particular incluem herbicidas que inibem a protoporfirinogênio oxidase (PPO, EC 1.3.3.4), referidos como herbicidas de PPO. Os herbicidas de PPO fornecem o controle de um espectro de ervas daninhas resistentes a herbicidas, criando assim um traço que confere tolerância a estes herbicidas particularmente útil em um sistema de cultivo combinado com um ou mais traços de tolerância a herbicidas.

[005] Protoporfirinogênio oxidase funciona em ambas as vias de biossíntese de clorofila e heme em que o mesmo converte protoporfirinogênio IX em protoporfirina IX. Após a produção de protoporfirina IX, as vias biossintéticas de clorofila e heme divergem com diferentes íons metálicos incorporados (ferro para heme e magnésio para clorofila). Os segmentos desta via são conservados em procariotas e eucariotas, e muitas das enzimas PPO encontradas em procariotas e eucariotas são relativamente similares. Alguns procariotas (por exemplo, cianobactérias) usam esta via para a produção de clorofila e heme enquanto outros procariotas (por exemplo, Escherichia coli) usam esta via para a produção de heme.

[006] Protoporfirinogênio oxidase insensíveis a herbicidas (iPPOs) foram isoladas de inúmeros procariotas e eucariotas. Sobre uma base estrutural, acredita-se que existem pelo menos três subclasses distintas de enzimas PPO: HemY (M Hansson e L Hederstedt, "Cloning and characterization of the Bacillus subtilis hemEHY gene cluster, which encodes protoheme IX biosynthetic enzymes" Journal of Bacteriology 174(24):8081-8093 (1992)), HemG (A Sasarman, et al., "Mapping of a new hem gene in Escherichia coli K12" Microbiology 113:297-303 (1979)) e HemJ (TO Boynton, et al., "Discovery of a gene involved in a third bacterial protoporphyrinogen oxidase activity through comparative genomic analysis and functional complementation" Applied and Environmental Microbiology 77(14):4795-4801 (2011)). Esta invenção fornece novos iPPOs recombinantes que são membros da família HemY. Apesar de mais de vinte anos de pesquisa e o número de iPPOs identificados até o momento, uma planta de cultivo transgênico que compreende um iPPO recombinante ainda não foi comercializada. Uma plataforma forte de controle de ervas depende, em parte, do desenvolvimento contínuo de pacotes de traços de tolerância a herbicidas. Identificar e utilizar iPPOs para criar traços de culturas transgênicas, portanto, representa um avanço para a agricultura.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de DNA recombinante compreendendo um promotor heterólogo ligado operativamente a uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID N°s: 1-2 e SEQ ID N°: 6-12, em que o polipeptídeo tem atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicidas. Em certas modalidades, o polipeptídeo tem pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, pelo menos 96% de identidade de sequência, pelo menos 97% de identidade de sequência, pelo menos 98% de identidade de sequência, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos escolhida entre as SEQ ID N°s: 1-2 e SEQ ID N°s: 6-12 e tem atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicidas. Em algumas modalidades, é fornecida uma molécula de DNA recombinante, em que a sequência de ácido nucleico é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°s: 26-27, 31-32, 36-46 e 47-48. Em modalidades particulares, a molécula de DNA recombinante codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°s: 1-2 e SEQ ID N°s: 6-12. Um polipeptídeo recombinante que compreende pelo menos 85% de identidade de sequência para o comprimento total de uma sequência de aminoácidos escolhida de entre SEQ ID N°s: 1-2 e SEQ ID N°s: 6-12, em que o polipeptídeo tem atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicidas é, portanto, fornecido pela invenção.

[008] Em certas modalidades, um promotor heterólogo, por exemplo, um promotor funcional em uma célula vegetal, está operativamente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da invenção, por exemplo, um amino sequência de ácido escolhida de SEQ ID N°s: 1-2 e SEQ ID N°s: 6-12, em que o polipeptídeo tem atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicidas. Uma tal molécula de DNA resultante pode ainda compreender uma sequência de direcionamento que funciona para localizar o polipeptídeo em uma célula.

[009] Em um aspecto, a invenção fornece um construto de DNA compreendendo uma molécula de DNA recombinante da invenção. Em uma modalidade, tal construto de DNA compreende, em ligação operável a uma sequência de ácido nucleico da invenção, uma sequência de direcionamento que funciona para localizar o polipeptídeo dentro em uma célula. A construção de DNA pode estar presente no genoma de uma planta, semente ou célula transgênica. Em certas modalidades, o polipeptídeo confere tolerância a herbicida na célula, planta, semente ou parte de planta.

[010] Outro aspecto da invenção fornece uma planta, semente, célula ou parte de planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante da invenção ou um polipeptídeo recombinante da invenção. A planta transgênica, a semente, a célula ou a parte da planta podem assim compreender, isto é, exibir, tolerância a pelo menos um herbicida de PPO. Em algumas modalidades, a planta transgênica, a semente, a célula ou a parte da planta compreendem um traço adicional de tolerância a herbicida transgênico.

[011] Outro aspecto da invenção fornece um método para conferir tolerância a herbicidas a uma planta, semente, célula ou parte de planta compreendendo: expressar heterologamente um polipeptídeo recombinante da invenção na planta, semente, célula ou parte de planta. Em algumas modalidades do método, a planta, semente, célula ou parte da planta compreende atividade de protoporfirinogênio oxidase conferida pelo polipeptídeo recombinante. Em algumas modalidades, a tolerância a herbicida é para pelo menos um herbicida de PPO selecionado do grupo que consiste em acifluorfeno, fomesafeno, lactofeno, fluoroglicofeno-etila, oxifluorfeno, flumioxazina, azafenidina, carfentrazona-etílica, sulfentrazona, flutiacete-metila, oxadiargil, oxadiazona, piraflufeno-etila, saflufenacil e S-3100.

[012] Outro aspecto da invenção se refere a um método de transformação de plantas, que compreende as etapas de: a) introduzir uma molécula de DNA recombinante da invenção em uma célula de planta; e b) regenerar uma planta transgênica a partir daí que compreende a molécula de DNA recombinante. O método pode ainda compreender a etapa de selecionar uma planta que é tolerante a pelo menos um herbicida de PPO. O método também pode compreender ainda uma etapa de cruzar a planta regenerada com ela própria ou com uma segunda planta e coletar a semente do cruzamento.

[013] Ainda outro aspecto da invenção fornece um método para controlar ervas daninhas em uma área de cultivo de plantas compreendendo colocar uma área de crescimento de planta compreendendo a planta ou semente transgênica em contato com pelo menos um herbicida de PPO, em que a planta ou semente transgênica é tolerante a herbicida de PPO e em que as ervas daninhas são controladas na área de cultivo da planta.

[014] É também fornecido um método de identificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína com atividade de protoporfirinogênio oxidase o método compreendendo: a) transformar uma cepa de E. coli tendo desativação de gene para a enzima PPO de E. coli nativa com um vetor de expressão bacteriano compreendendo uma molécula de DNA recombinante que codifica uma proteína de tolerância a herbicida candidato; e b) cultivar a referida E. coli transformada usando um meio bacteriano livre de heme, em que o cultivo usando o referido meio bacteriano identifica uma proteína tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase.

[015] Além disto, é fornecido pela invenção um método de identificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicida, o método compreendendo: a) transformar uma cepa de E. coli com inativação de gene para a enzima PPO de E. coli nativa com uma vetor de expressão bacteriano compreendendo uma molécula de DNA recombinante que codifica uma proteína recombinante; e b) cultivar a referida E. coli transformada usando um meio bacteriano contendo pelo menos um herbicida de PPO, em que o cultivo de bactérias identifica uma proteína tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicidas.

[016] Outro aspecto da invenção se refere a um método de triagem para um gene de tolerância a herbicidas que compreende: a) expressar uma molécula de DNA recombinante da invenção em uma célula vegetal; e b) identificar uma célula vegetal que exiba tolerância a um herbicida de PPO.

[017] Além disto, a invenção fornece métodos de triagem para um gene de tolerância a herbicidas que compreende: a) expressar uma molécula de DNA recombinante da invenção em uma célula bacteriana com falta de HemG, em que a célula bacteriana é cultivada em um meio livre de heme na presença de um herbicida de PPO; e b) identificar uma célula bacteriana que exiba tolerância a um herbicida de PPO.

[018] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de produção de uma planta tolerante a um herbicida de PPO e pelo menos um outro herbicida compreendendo: a) obter uma planta compreendendo uma molécula de DNA recombinante da invenção; b) cruzar a planta transgênica com uma segunda planta que compreende a tolerância ao pelo menos um outro herbicida, e c) selecionar uma planta de progênie resultante deste cruzamento que compreende tolerância a um herbicida de PPO e pelo menos outro herbicida é outro aspecto da invenção.

[019] A invenção também fornece, em outro aspecto, um método para reduzir o desenvolvimento de ervas daninhas tolerantes a herbicidas compreendendo: a) cultivar em um ambiente de cultivo de culturas uma planta da presente invenção que compreende tolerância a um herbicida de PPO, por exemplo, compreendendo uma molécula de DNA da presente invenção, e compreende tolerância a pelo menos um outro herbicida; e b) aplicar um herbicida de PPO e pelo menos um outro herbicida ao ambiente de cultivo, em que a planta de cultivo é tolerante ao herbicida de PPO e ao pelo menos outro herbicida. Em certas modalidades do método, o herbicida de PPO pode ser selecionado do grupo que consiste em acifluorfeno, fomesafeno, lactofeno, fluoroglicofeno-etila, oxifluorfeno, flumioxazina, azafenidina, carfentrazona-etílica, sulfentrazona, flutiacete-metila, oxadiargil, oxadiazona, piraflufeno-etila, saflufenacil e S-3100. Em algumas modalidades do método, o pelo menos outro herbicida é selecionado do grupo que consiste em: um inibidor de ACCase, um inibidor de ALS, um inibidor de EPSPS, uma auxina sintética, um inibidor de fotossíntese, um inibidor de síntese de glutamina, um inibidor de HPPD, um inibidor de PPO e um inibidor de ácidos graxos de cadeia longa. Em modalidades particulares, o inibidor de ACCase é um propionato de ariloxifenóxi ou uma ciclo-hexanodiona; o inibidor de ALS é uma sulfonilureia, imidazolinona, triazoloirimidina ou uma triazolinona; o inibidor EPSPS é o glifosato; a auxina sintética é um herbicida de fenóxi, um ácido benzoico, um ácido carboxílico ou uma semicarbazona; o inibidor de fotossíntese é uma triazina, uma triazinona, uma nitrila, um benzotiadiazol ou uma ureia; o inibidor de síntese de glutamina é glufosinato; o inibidor de HPPD é um isoxazol, uma pirazolona ou uma tricetona; o inibidor de PPO é um éter difenílico, uma N-fenilftalimida, uma aril triazinona ou uma pirimidinadiona; ou o inibidor de ácidos graxos de cadeia longa é uma cloroacetamida, uma oxacetamida ou um pirazol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[020] Figura 1. Resultados de ensaio de sistema de triagem bacteriana de herbicida com herbicidas de PPO. Ensaio de HemG de E. coli (H_N10) (SEQ ID N°: 76), HemY PPO R1N473 (SEQ ID N°: 13), HemY PPO R1N533 (SEQ ID N°: 14); ou HemY PPO R1N171 (SEQ ID N°: 15) na presença de herbicidas de PPO de acifluorfeno, flumioxazina, lactofeno ou fomesafeno.

[021] Figura 2. Resultados de ensaio de sistema de triagem bacteriana de herbicida com herbicidas de PPO. Ensaios de HemY R2N30 (SEQ ID N°: 1), Hem Y R2N40 (SEQ ID N°: 2), HemY R2N70 (SEQ ID N°: 3), HemY R2N90 (SEQ ID N°: 4), HemY R2N100 (SEQ ID N°: 5), e controle negativo Amaranthus tuberculatus (WH) PPO (SEQ ID N°: 80) na presença de herbicidas de PPO de acifluorfeno e S-3100.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[022] SEQ ID N°: 1 é a sequência de aminoácidos de R2N30.

[023] SEQ ID N°: 2 é a sequência de aminoácidos de R2N40.

[024] SEQ ID N°: 3 é a sequência de aminoácidos de R2N70.

[025] SEQ ID N°: 4 é a sequência de aminoácidos de R2N90.

[026] SEQ ID N°: 5 é a sequência de aminoácidos de R2N100.

[027] SEQ ID N°: 6 é a sequência de aminoácidos de uma variante de SEQ ID N°: 1 (R2N30).

[028] SEQ ID N°s: 7-12 são as sequências de aminoácidos de variantes de SEQ ID N°: 2 (R2N40).

[029] SEQ ID N°: 13 é a sequência de aminoácidos de R1N473.

[030] SEQ ID N°: 14 é a sequência de aminoácidos de R1N533.

[031] SEQ ID N°: 15 é a sequência de aminoácidos de R1N171.

[032] SEQ ID N°: 16 é a sequência de aminoácidos de R1N311.

[033] SEQ ID N°: 17 é a sequência de aminoácidos de R1N333.

[034] SEQ ID N°: 18 é a sequência de aminoácidos truncados de R1N473.

[035] SEQ ID N°: 19 é a sequência de aminoácidos truncados de R1N533.

[036] SEQ ID N°: 20 é a sequência de aminoácidos truncados de R1N171.

[037] SEQ ID N°: 21 é a sequência de aminoácidos truncados de R1N333.

[038] SEQ ID N°: 22 é a sequência de aminoácidos truncados de R1N473.

[039] SEQ ID N°: 23 é a sequência de aminoácidos truncados de R1N533.

[040] SEQ ID N°: 24 é a sequência de aminoácidos truncados de R1N171.

[041] SEQ ID N°: 25 é a sequência de aminoácidos truncados de R1N333.

[042] SEQ ID N°s: 26-30 são as sequências de nucleotídeos bacterianos nativos que codificam SEQ ID N°s: 1 a SEQ ID N°: 5, respectivamente.

[043] SEQ ID N°s: 31-35 são sequências de nucleotídeos que codificam SEQ ID N°s: 1-5, respectivamente, submetidas à otimização de códons para expressão de dicotiledôneas.

[044] SEQ ID N°s: 36-42 são sequências de nucleotídeos que codificam SEQ ID N°s: 6-12, respectivamente, submetidas à otimização de códons para expressão de dicotiledôneas.

[045] SEQ ID N°s: 43-46 são sequências de nucleotídeos que codificam SEQ ID N°: 9, submetidas à otimização de códons para expressão de dicotiledôneas.

[046] SEQ ID N°s: 47-51 são sequências de nucleotídeos que codificam SEQ ID N°s: 1-5, respectivamente, submetidas à otimização de códons para expressão de monocotiledôneas.

[047] SEQ ID N°s: 52-56 são as sequências de nucleotídeos bacterianos nativos que codificam SEQ ID N°s: 13-17.

[048] SEQ ID N°s: 57-62 são as sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID N°s: 13-17, submetidas à otimização de códons para expressão de dicotiledôneas.

[049] SEQ ID N°s: 63-67 são as sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID N°s: 13-17, submetidas à otimização de códons para expressão de monocotiledôneas.

[050] SEQ ID N°s: 68-75 são as sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID N°s: 18-25, respectivamente, submetidas à otimização de códons para expressão de dicotiledôneas.

[051] SEQ ID N°: 76 é a sequência de aminoácidos de enzima PPO de E. coli HemG (protoporfirinogênio IX desidrogenase; genbank, N°. de acesso WP_021498199).

[052] SEQ ID N°s: 77-79 são as sequências de nucleotídeos que codificam a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 76.

[053] SEQ ID N°: 80 é a sequência de aminoácidos da protoporfirinogênio oxidase do tipo selvagem de Amaranthus tuberculatus (WH).

[054] SEQ ID N°: 81 é a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 80, submetida à otimização de códons para expressão de E. coli bacteriana.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[055] As seguintes descrições e definições são fornecidas para melhor definir a invenção e para orientar aqueles versados na técnica na prática da invenção. Salvo indicação em contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados na técnica relevante.

[056] A invenção fornece novas moléculas e proteínas de DNA recombinantes que codificam protoporfirinogênio oxidases insensíveis a herbicidas (iPPOs). Por exemplo, a invenção fornece, em uma modalidades, vetores e cassetes de expressão que codificam iPPOs derivadas microbialmente para expressão em células e plantas. São também fornecidos métodos para produzir células e plantas tolerantes a herbicidas de PPO. A invenção também fornece métodos e composições para o uso de ferramentas de engenharia genética de proteínas e bioinformática para obter e melhorar iPPOs.

[057] Em aspectos específicos, a invenção fornece moléculas e proteínas de DNA recombinantes. Tal como aqui usado, o termo "recombinante" se refere a um DNA, proteína, célula, semente ou organismo de ocorrência não natural que é o resultado da engenharia genética e, como tal, normalmente não seria encontrado na natureza. Uma "molécula de DNA recombinante" é uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA que não ocorre naturalmente na natureza e, como tal, é o resultado de uma intervenção humana, tal como uma molécula de DNA constituída por pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas entre si. Um exemplo de uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA proporcionada aqui codificando a protoporfirinogênio oxidase insensível aos herbicidas operativamente ligada a um elemento regulador heterólogo ou outro elemento, tal como um promotor heterólogo. Uma "proteína recombinante" é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que não ocorre naturalmente e, como tal, é o resultado da intervenção humana, tal como uma proteína geneticamente modificada ou uma proteína quimérica. Uma célula, semente ou organismo recombinante é uma célula, semente ou organismo que compreende DNA transgênico, por exemplo, uma célula, semente, planta ou parte de planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante e, portanto, produzida como resultado da transformação da planta.

[058] Tal como aqui usado, o termo "engenharia genética" se refere à criação de um DNA, proteína ou organismo não natural que normalmente não seria encontrado na natureza e, portanto, implica na aplicação da intervenção humana. A engenharia genética pode ser usada para produzir um DNA, proteína ou organismo geneticamente modificado que foi concebido e criado no laboratório usando uma ou mais das técnicas de biotecnologia, como biologia molecular, bioquímica de proteínas, transformação bacteriana e transformação de plantas. Por exemplo, a engenharia genética pode ser usada para criar um gene quimérico que compreende pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas entre si usando uma ou mais das técnicas de biologia molecular, tais como a clonagem de genes, a ligação de DNA e a síntese de DNA. Um gene quimérico pode consistir em duas ou mais moléculas de DNA heterólogas que estão operativamente ligadas, tal como uma sequência de codificação de proteína operativamente ligada a um elemento de expressão de gene, tal como uma sequência de codificação de peptídeo de trânsito ou um promotor heterólogo. A engenharia genética pode ser usada para criar uma proteína geneticamente modificada, cuja sequência de aminoácidos foi criada usando uma ou mais das técnicas de engenharia genética de proteína, como design de proteínas usando mutagênese sítio-dirigida e evolução direta usando mutagênese aleatória e embaralhamento de DNA. Uma proteína geneticamente modificada pode ter uma ou mais deleções, inserções ou substituições em relação à sequência de codificação da proteína de tipo selvagem e cada deleção, inserção ou substituição pode consistir em um ou mais aminoácidos. Em outra modalidade, uma proteína geneticamente modificada pode consistir em dois peptídeos heterólogos que estão operativamente ligados, tal como uma enzima operativamente ligada a um peptídeo de trânsito.

[059] Tal como aqui usado, "insensível a herbicidas" ou "atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível s herbicidas" significa a capacidade de uma protoporfirinogênio oxidase (PPO, EC 1.3.3.4) de manter pelo menos parte da sua atividade de protoporfirinogênio oxidase na presença de um ou mais herbicidas de PPO. O termo "atividade de protoporfirinogênio oxidase" significa a capacidade de catalisar a oxidação de seis elétrons (remoção de elétrons) de protoporfirinogênio IX para formar protoporfirina IX, isto é, catalisar a desidrogenação de protoporfirinogênio para formar protoporfirina. A atividade enzimática de uma protoporfirinogênio oxidase pode ser medida por qualquer meio conhecido na técnica, por exemplo, por um ensaio enzimático em que a produção do produto de protoporfirinogênio oxidase ou o consumo do substrato de protoporfirinogênio oxidase na presença de um ou mais herbicidas de PPO é medido através de fluorescência, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou espectrometria de massa (MS). Outro exemplo de um ensaio para medir a atividade enzimática de uma protoporfirinogênio oxidase é um ensaio bacteriano, tal como os ensaios aqui descritos, em que uma protoporfirinogênio oxidase recombinante é expressa em uma célula bacteriana que, de outro modo, não possui atividade de PPO e a capacidade da protoporfirinogênio oxidase recombinante para complementar este fenótipo de desativação é medida. A insensibilidade a herbicidas pode ser insensibilidade completa ou parcial a um herbicida específico e pode ser expressa como tolerância percentual (%) ou insensibilidade a um herbicida particular de PPO. Tal como aqui usado, uma "protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicidas" ou "iPPO" apresenta insensibilidade ao herbicida na presença de um ou mais herbicidas de PPO.

[060] Tal como aqui utilizado, uma "cepa de desativação de hemG" significa um organismo ou célula de um organismo, tal como E. coli, que não possui atividade de HemG na medida em que não é capaz de crescer em meio de cultivo livre de heme ou de tal forma que o seu cultivo seja deficientemente detectável na ausência de heme em relação a uma cepa de outro modo isogênica compreendendo um HemG funcional. Uma cepa de desativação de hemG de, por exemplo, E. coli pode ser preparada considerando o conhecimento na técnica, por exemplo, considerando a sequência de hemG de E. coli (Ecogene, N° de Acesso EG11485; Sasarman et al., "Nucleotide sequence of the hemG gene involved in the protoporphyrinogen oxidase activity of E. coli K12" Can J Microbiol 39:1155-1161, 1993).

[061] Tal como aqui usado, o termo "transgene" se refere a uma molécula de DNA incorporada artificialmente ao genoma de um organismo devido à intervenção humana, tal como um método de transformação de plantas. Tal como aqui usado, o termo "transgênico" significa compreender um transgene, por exemplo uma "planta transgênica" se refere a uma planta que compreende um transgene no seu genoma e um "traço transgênico" se refere a uma característica ou fenótipo transportado ou conferido pela presença de um transgene incorporado ao genoma da planta. Devido a esta alteração genômica, a planta transgênica é algo distintamente diferente da planta de tipo selvagem relacionada e o traço transgênico é um traço não encontrado naturalmente na planta de tipo selvagem. As plantas transgênicas da invenção compreendem as moléculas de DNA recombinante e as proteínas geneticamente modificadas fornecidas pela invenção.

[062] Tal como aqui usado, o termo "heterólogo" se refere à relação entre dois ou mais itens derivados de diferentes fontes e, portanto, não estão normalmente associados à natureza. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante codificadora de proteína é heteróloga em relação a um promotor ligado operativamente se tal combinação não for normalmente encontrada na natureza. Em outro exemplo, uma molécula de DNA que codifica a proteína ou um polipeptídeo pode ser expressa de forma heteróloga em uma planta, semente, célula ou parte da planta se esta molécula ou polipeptídeo de DNA codificador de proteína não é normalmente expresso em tal planta, semente, célula, ou planta parte na natureza. Uma molécula de DNA recombinante particular pode ser heteróloga em relação a uma célula, semente ou organismo em que está inserido quando não ocorre naturalmente naquela célula, semente ou organismo particular. Um polipeptídeo particular pode ser heterólogo em relação a uma célula, semente ou organismo em que é expresso quando não ocorreria naturalmente na célula, semente ou organismo particular.

[063] Tal como aqui usado, o termo "isolado" se refere a separar pelo menos parcialmente uma molécula de outras moléculas tipicamente associadas à mesma no seu estado natural. Em uma modalidade, o termo "isolado" se refere a uma molécula de DNA que é separada dos ácidos nucleicos que normalmente flanqueiam a molécula de DNA no seu estado natural. Por exemplo, uma molécula de DNA que codifica uma proteína que está naturalmente presente em uma bactéria seria uma molécula de DNA isolada se não estivesse dentro do DNA da bactéria da qual a molécula de DNA que codifica a proteína é naturalmente encontrada. Assim, uma molécula de DNA fundida ou operativamente ligada a uma ou mais moléculas de DNA com as quais não estaria associada na natureza, por exemplo, como resultado de técnicas de transformação de DNA recombinante ou de plantas, é considerada isolada aqui. Tais moléculas são consideradas isoladas mesmo quando integradas ao cromossomo de uma célula hospedeira ou presentes em uma solução de ácido nucleico com outras moléculas de DNA.

[064] Tal como aqui usado, o termo "molécula de DNA codificadora de proteína" se refere a uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína. Uma "sequência codificadora de proteína" significa uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína. Uma "sequência" significa uma disposição sequencial de nucleotídeos ou aminoácidos. Os limites de uma sequência codificadora de proteína podem ser determinados por um códon de iniciação da tradução no terminal 5 'e um códon de parada de tradução no terminal 3'. Uma molécula codificadora de proteína pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos. Tal como aqui usado, "expressão de transgene", "expressar um transgene", "expressão de proteína" e "expressar uma proteína" significam a produção de uma proteína através do processo de transcrição de uma molécula de DNA em RNA mensageiro (mRNA) e a tradução do mRNA em cadeias de polipeptídeos, que são finalmente dobradas em proteínas. Uma molécula de DNA que codifica a proteína pode estar operativamente ligada a um promotor heterólogo em um construto de DNA para uso na expressão da proteína em uma célula transformada com a molécula de DNA recombinante. Tal como aqui usado, "ligado operativamente" significa duas ou mais moléculas de DNA ou dois ou mais polipeptídeos ligados de modo que um possa afetar a função do outro. As moléculas de DNA ligadas operativamente ou os polipeptídeos ligados operativamente podem ser parte de uma única molécula contígua e podem ou não ser adjacentes. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma molécula de DNA codificadora de proteína em um construto de DNA em que as duas moléculas de DNA estão dispostas de tal forma que o promotor possa afetar a expressão do transgene.

[065] Tal como aqui usado, um "construto de DNA" é uma molécula de DNA recombinante compreendendo duas ou mais sequências de DNA heterólogas. Os construtos de DNA são úteis para a expressão do transgene e podem estar compreendidos em vetores e plasmídeos. Os construtos de DNA podem ser usados em vetores com a finalidade de transformação, isto é, a introdução de DNA heterólogo em uma célula hospedeira, para produzir plantas e células transgênicas e, como tal, também podem estar contidos no DNA de plastídeo ou DNA genômico de uma planta transgênica, semente, célula ou planta. Tal como aqui usado, um "vetor" significa qualquer molécula de DNA recombinante que pode ser usada para fins de transformação bacteriana ou vegetal. As moléculas de DNA recombinantes, tal como estabelecidas na listagem de sequências, podem, por exemplo, ser inseridas em um vetor como parte de um construto com a molécula de DNA recombinante operativamente ligada a um elemento de expressão de gene que funciona em uma planta para afetar a expressão da proteína geneticamente modificada codificada pela molécula de DNA recombinante. Métodos gerais úteis para manipular moléculas de DNA para a produção e uso de construtos de DNA recombinante e vetores de transformação de plantas são bem conhecidos na técnica e descritos em detalhes, por exemplo, em guias e manuais de laboratório, incluindo Michael R. Green e Joseph Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Quarta Edição) ISBN:978-1-936113-42-2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EUA (2012). Os componentes para um construto de DNA ou um vetor que compreende um construto de DNA incluem um ou mais elementos de expressão de genes operativamente ligados a uma sequência de ácido nucleico transcritível, tal como o seguinte: um promotor para a expressão de um DNA ligado operativamente, molécula de DNA codificadora de proteínas e uma região não traduzida 3’ operativamente ligada (UTR). Os elementos de expressão de genes úteis na prática da presente invenção incluem, sem limitação, um ou mais dos seguintes tipos de elementos: promotor, 5 'UTR, intensificador, líder, elemento de ação cis, íntron, sequência de segmentação, 3' UTR, e um ou mais transgenes marcadores selecionáveis.

[066] Os construtos de DNA da invenção podem incluir um promotor ligado operativamente a uma molécula de DNA que codifica a proteína fornecida pela invenção, em que o promotor conduz a expressão da molécula de proteína recombinante. Os promotores úteis na prática da presente invenção incluem aqueles que funcionam em uma célula para a expressão de um polinucleotídeo ligado operacionalmente, tal como um promotor de bactéria ou planta. Os promotores de plantas são variados e bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos, constitutivos, regulados temporariamente, regulados espacialmente e/ou regulados espaço-temporalmente.

[067] Em uma modalidade da invenção, um construto de DNA aqui fornecido inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de direcionamento que está operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica uma molécula de polipeptídeo que tem atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicida, em que a sequência de direcionamento facilita a localização da molécula de polipeptídeo dentro da célula. As sequências de direcionamento são conhecidas na técnica como sequências de sinal, peptídeos de direcionamento, sequências de localização e peptídeos de trânsito. Um exemplo de uma sequência de direcionamento é um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP), uma sequência de direcionamento mitocondrial (MTS) ou um peptídeo de direcionamento de cloroplasto e mitocondrial duplo. Ao facilitar a localização de proteína dentro da célula, a sequência de direcionamento pode aumentar o acúmulo de proteína recombinante, proteger a proteína contra degradação proteolítica e/ou aumentar o nível de tolerância a herbicida e, assim, reduzir os níveis de lesão na célula transgênica, semente ou organismo após aplicação de herbicidas.

[068] CTPs e outras moléculas de direcionamento que podem ser usadas em conjunto com a presente invenção são conhecidas na técnica e incluem, sem limitação, CTP de EPSPS de Arabidopsis thaliana (Klee et al., Mol Gen Genet. 210:437-442, 1987), CTP de EPSPS de Petunia hybrida (della-Cioppa et al., PNAS 83:6873-6877, 1986), a sequência de sinal cab-m7 de milho (Becker et al., Plant Mol Biol. 20:49-60, 1992; PCT WO 97/41228), uma pré-sequência mitocondrial (por exemplo, Silva Filho et al., Plant Mol Biol 30:769-780, 1996), e a sequência de sinal de glutationa redutase de ervilha (Creissen et al., Plant J. 8:167-175, 1995; PCT WO 97/41228).

[069] As moléculas de DNA recombinante da presente invenção podem ser sintetizadas e modificadas por métodos conhecidos na técnica, tanto na totalidade como em parte, onde é desejável fornecer sequências úteis para manipulação de DNA (tais como sítios de reconhecimento de enzimas de restrição ou sítios de clonagem baseados em recombinação), sequências preferenciais em plantas (tais como o uso de códons de plantas ou sequências de consenso de Kozak), ou sequências úteis para o design de construto de DNA (tais como sequências de espaçador ou de ligação). A presente invenção inclui moléculas de DNA recombinante e proteínas geneticamente modificadas com pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, pelo menos 96% identidade de sequência, pelo menos 97% de identidade de sequência, pelo menos 98% de identidade de sequência e pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das moléculas de DNA ou sequências de aminoácidos recombinantes aqui fornecidas e com atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicidas. Tal como aqui usado, o termo "porcentagem de identidade de sequência" ou "% de identidade de sequência" se refere à porcentagem de nucleotídeos ou aminoácidos idênticos em uma sequência de polinucleotídeo ou aminoácido linear de uma sequência de referência ("consulta") (ou a sua cadeia complementar) em comparação com uma sequência de teste ("matéria") (ou sua cadeia complementar) quando as duas sequências estão alinhadas de forma otimizada (com inserções, deleções ou lacunas adequadas de nucleotídeos ou aminoácidos que totalizam menos de 20% da sequência de referência na janela de comparação). O alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação é bem conhecido pelos versados na técnica e pode ser conduzido por ferramentas como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, a busca por método de similaridade de Pearson e Lipman, e por implementações computadorizadas desses algoritmos como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA disponíveis como parte do pacote do software Sequence Analysis do GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., San Diego, CA, EUA), MEGAlign (DNAStar Inc., 1228 S. Park St., Madison, WI 53715), e MUSCLE (versão 3.6) (RC Edgar, "MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput" Nucleic Acids Research 32(5):1792-7 (2004)) por exemplo, com parâmetros padrão. Uma "fração de identidade" para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são compartilhados pelas duas sequências alinhadas divididas pelo número total de componentes na porção do segmento de sequência de referência que está sendo alinhado, isto é, toda a sequência de referência ou uma parte menor definida da sequência de referência. O percentual de identidade de sequência é representado como a fração de identidade multiplicada por 100. A comparação de uma ou mais sequências pode ser a uma sequência de comprimento total ou uma porção da mesma, ou a uma sequência mais longa. As proteínas geneticamente modificadas podem ser produzidas mudando (isto é, modificando) uma proteína de tipo selvagem para produzir uma nova proteína com característica(s) modificada(s), por exemplo, um padrão de localização celular particular, tal como direcionado para o cloroplasto ou mitocôndria, ou uma combinação inovadora de características úteis da proteína, tais como Vmax, Km, Ki, IC50 alterados, especificidade de substrato, especificidade de inibidor/herbicida, seletividade de substrato, capacidade de interação com outros componentes na célula, tais como proteínas ou membranas parceiras, e estabilidade da proteína, dentre outras. Podem ser feitas modificações em posições específicas de aminoácidos em uma proteína e podem ser uma substituição do aminoácido encontrado nesta posição na natureza (ou seja, na proteína do tipo selvagem) por um aminoácido diferente. As proteínas geneticamente modificadas fornecidas pela invenção fornecem, assim, uma nova proteína com uma ou mais características de proteína alteradas em relação a uma proteína similar encontrada na natureza. Em uma modalidade da invenção, uma proteína modificada tem características de proteína alteradas, tais como aquelas que resultam em sensibilidade diminuída a um ou mais herbicidas em comparação com uma proteína de tipo selvagem similar ou capacidade melhorada para conferir tolerância a herbicidas em uma planta transgênica que expressa a proteína geneticamente modificada a um ou mais herbicidas. Em uma modalidade, a invenção fornece uma proteína geneticamente modificada e a molécula de DNA recombinante que codifica a mesma, compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada da Tabela 1 e tendo pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência, cerca de 80% de identidade de sequência, cerca de 85% de sequência identidade, cerca de 90% de identidade de sequência, cerca de 95% de identidade de sequência, cerca de 96% de identidade de sequência, cerca de 97% de identidade de sequência, cerca de 98% de identidade de sequência e cerca de 99% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de aminoácidos produzidas aqui incluídas, incluindo, sem limitação, SEQ ID N°s: 1-2 e 6-12. As mutações de aminoácidos podem ser feitas como uma única substituição de aminoácidos na proteína ou em combinação com uma ou mais mutações, tais como uma ou mais substituições de outros aminoácidos, deleções ou adições. As mutações podem ser realizadas por qualquer método conhecido pelo versado na técnica. TABELA 1: SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDOS.

[070] Tal como aqui usado, "tipo selvagem" significa uma versão similar, mas não idêntica, que ocorre naturalmente. Uma "molécula de DNA de tipo selvagem" ou "proteína de tipo selvagem" é uma versão natural da molécula de DNA ou proteína, ou seja, uma versão da molécula de DNA ou proteína pré-existente na natureza. Um exemplo de uma proteína de tipo selvagem útil para comparação com proteínas geneticamente modificadas fornecidas pela invenção é a protoporfirinogênio oxidase de Arabidopsis thaliana. Uma "planta de tipo selvagem" é uma planta não transgênica do mesmo tipo que a planta transgênica e, como tal, é geneticamente distinta da planta transgênica compreendendo o traço de tolerância a herbicida. Exemplos de uma planta de tipo selvagem útil para comparação com plantas de milho transgênico são milho LH244 não transgênico (número de depósito ATCC PTA-1173) e milho congênito 01DKD2 (I294213) (número de depósito ATCC PTA-7859). Para plantas de soja transgênicas, uma linhagem comparativa exemplificadora seria a soja A3555 não transgênica (número de depósito ATCC PTA-10207) e, para plantas de algodão transgênicas, uma linhagem comparativa exemplificadora seria Coker 130 não transgênico (Número de Proteção de Variedade de Planta 8900252).

PLANTAS TRANSGÊNICAS & HERBICIDAS

[071] Um aspecto da invenção inclui células de plantas transgênicas, tecidos de plantas transgênicas, plantas transgênicas e sementes transgênicas que compreendem as moléculas de DNA recombinante e as proteínas geneticamente modificadas fornecidas pela invenção. Estas células, tecidos, plantas e sementes que compreendem as moléculas de DNA recombinante e as proteínas geneticamente modificadas exibem tolerância a herbicidas a um ou mais herbicidas de PPO e, opcionalmente, tolerância a um ou mais herbicidas adicionais.

[072] Métodos adequados para a transformação de células vegetais hospedeiras para uso com a presente invenção incluem virtualmente qualquer método através do qual o DNA pode ser introduzido em uma célula (por exemplo, onde um construto de DNA recombinante é integrado de forma estável a um cromossomo de planta) e são bem conhecidos na técnica. Um método exemplificador e amplamente utilizado para a introdução de um construto de DNA recombinante em plantas é o sistema de transformação de Agrobacterium, que é bem conhecido pelos versados na técnica. Outro método exemplificador para a introdução de um construto de DNA recombinante em plantas é a inserção de um construto de DNA recombinante em um genoma de planta em um local predeterminado por métodos de integração sítio-dirigida. A integração sítio-dirigida pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por meio de nucleases de dedo de zinco, meganucleases geneticamente modificadas ou nativas, TALE-endonucleases ou uma endonuclease guiada por RNA (por exemplo, um sistema CRISPR/Cas9). As plantas transgênicas podem ser regeneradas de uma célula vegetal transformada pelos métodos de cultura de células vegetais. Uma planta transgênica homozigota em relação a um transgene (ou seja, duas cópias alélicas do transgene) pode ser obtida por autopolinização (autofecundação) de uma planta transgênica que contém um único alelo transgênico com si própria, por exemplo, uma planta R0, para produzir semente R1. Um quarto da semente R1 produzida será homozigoto em relação ao transgene. As plantas cultivadas a partir de germinação de sementes R1 podem ser testadas quanto à zigosidade, usando um ensaio de SNP, sequenciamento de DNA ou um ensaio de amplificação térmica que permita a distinção entre heterozigotos e homozigotos, referido como um ensaio de zigosidade.

[073] Tal como aqui usado, um "herbicida inibidor de PPO" ou "herbicida de PPO" é um químico que alveja e inibe a atividade enzimática de uma protoporfirinogênio oxidase (PPO), que catalisa a desidrogenação de protoporfirinogênio IX para formar a protoporfirina IX, que é o precursor de heme e clorofila. A inibição da protoporfirinogênio oxidase provoca a formação de espécies de oxigênio reativas, resultando em ruptura da membrana celular e, finalmente, na morte de células susceptíveis. Os herbicidas de PPO são bem conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis. Exemplos de herbicidas de PPO incluem, sem limitação, difeniléteres (tais como acifluorfeno, seus sais e ésteres, aclonifeno, bifenox, seus sais e ésteres, etoxifena, seus sais e ésteres, fluoronitrofeno, furiloxifeno, halosafeno, clorometoxifeno, fluorglicofeno, seus sais e ésteres, lactofeno, seus sais e ésteres, oxifluorfeno e fomesafeno, seus sais e ésteres); tiadiazóis (tais como flutiacete-metila e tidiazimina); pirimidinadiononas ou feniluracilas (tais como benzfendizona, butafenacil, [3-2-cloro-4-fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo- 1,2,3,4-tetra-hidropirimidin-3-il)fenóxi]-2-piridilóxi] acetato de etila (número de registo CAS 353292-31-6 e aqui referido como S-3100), flupropacil, saflufenacil e tiafenacil); fenilpirazóis (tais como fluazolato, piraflufeno e piraflufeno-etila); oxadiazóis (tais como oxadiargil e oxadiazona); triazolinonas (tais como azafenidina, bencarbazona, carfentrazona, seus sais e ésteres e sulfentrazona); oxazolidinadionas (como pentoxazona); N-fenilftalimidas (tais como cinidon-etílico, flumicloraque, flumicloraque-pentílico e flumioxazina); derivados de benzoxazinona (tal como 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3,4-di- hidro-3-oxo-4-prop-2-inil-2H-1,4-benzoxazin-6-il)-1,3,5-triazinano-2,4- diona); flufenpir e flufenpir-etila; piraclonil; e profluazol. Protoporfirinogênio oxidases e células, sementes, plantas e partes de plantas fornecidas pela invenção exibem tolerância a herbicidas a um ou mais herbicidas de PPO.

[074] Os herbicidas podem ser aplicados a uma área de cultivo da planta compreendendo as plantas e sementes fornecidas pela invenção como um método para controlar ervas daninhas. As plantas e sementes fornecidas pela invenção compreendem um traço de tolerância a herbicida e, como tal, são tolerantes à aplicação de um ou mais herbicidas de PPO. A aplicação de herbicida pode ser a taxa comercial recomendada (1X) ou qualquer fração ou múltiplo, como o dobro da taxa comercial recomendada (2X). As taxas de herbicidas podem ser expressas como equivalente de ácido por libra por acre (lb ae/acre) ou equivalente de ácido por grama por hectare (g ae/ha) ou como libras de ingrediente ativo por acre (lb ai/acre) ou gramas de ingrediente ativo por hectare (g ai/ha), dependendo do herbicida e da formulação. A aplicação de herbicida compreende pelo menos um herbicida de PPO. A área de cultivo da planta pode incluir, ou não, plantas de ervas daninhas no momento da aplicação do herbicida. Uma dose eficaz como herbicida de herbicida(s) de PPO para uso em uma área para controle de ervas daninhas pode consistir em uma faixa de cerca de 0,1X a cerca de 30X da faixa de etiqueta durante uma temporada de cultivo. A taxa de etiqueta 1X para alguns herbicidas de PPO exemplificadores é fornecida na Tabela 2. Um (1) acre é equivalente a 2.47105 hectares e uma (1) libra é equivalente a 453,592 gramas. As taxas de herbicida podem ser convertidas entre inglês e métrica como: (lb ai/ac) multiplicado por 1,12 = (kg ai/ha) e (kg ai/ha) multiplicado por 0,89 = (lb ai/ac). TABELA 2: HERBICIDAS DE PPO EXEMPLIFICADORES

[075] As aplicações de herbicidas podem ser sequencialmente ou misturadas em tanque com um, dois ou uma combinação de vários herbicidas de PPO ou qualquer outro herbicida compatível. As múltiplas aplicações de um herbicida ou de dois ou mais herbicidas, em combinação ou sozinha, podem ser usadas durante uma temporada de cultivo em áreas compreendendo plantas transgênicas da invenção para o controle de um amplo espectro de ervas daninhas, ervas monocotiledôneas ou ambas, por exemplo, duas aplicações (como uma aplicação pré-plantio e uma aplicação pós-emergência ou uma aplicação pré-emergência e uma aplicação pós-emergência) ou três aplicações (como uma aplicação pré-plantio, uma aplicação de pré- emergência e uma aplicação pós-emergência ou uma aplicação de pré- emergência e duas aplicações pós-emergência).

[076] Tal como aqui usado, "tolerância" ou "tolerância a herbicidas" significa uma capacidade de a planta, semente ou célula resistir aos efeitos tóxicos de um herbicida quando aplicado. As culturas tolerantes a herbicidas podem continuar a crescer e não são afetadas ou são minimamente afetadas pela presença do produto químico aplicado. Tal como aqui usado, um "traço de tolerância a herbicidas" é um traço transgênico que confere tolerância a herbicidas melhorado a uma planta em comparação com a planta de tipo selvagem. As plantas contempladas que podem ser produzidas com um traço de tolerância a herbicida da presente invenção podem incluir, por exemplo, qualquer planta que inclua plantas de cultivo, tais como soja (por exemplo, Glycine max), milho (maís), algodão (Gossypium sp.) e canola, entre outros.

[077] As plantas transgênicas, progênies, sementes, células vegetais e partes de plantas da invenção também podem conter um ou mais traços transgênicos adicionais. Traços transgênicos adicionais podem ser introduzidos cruzando uma planta contendo um transgene compreendendo as moléculas de DNA recombinante fornecidas pela invenção com outra planta contendo um ou mais traços transgênicos adicionais. Tal como aqui usado, "cruzamento" significa a criação de duas plantas individuais para produzir uma planta de progênie. Duas plantas transgênicas podem, assim, ser cruzadas para produzir progênies que contêm os traços transgênicos de cada progenitor. Tal como aqui usado, "progênie" significa a descendência de qualquer geração de uma planta parental e a progênie transgênica compreende um construto de DNA fornecido pela invenção e herdado de pelo menos uma planta parental. Alternativamente, podem ser introduzidos traços transgênicos adicionais através da cotransformação de um construto de DNA para este(s) traço(s) transgênico(s) adicional(is) com um construto de DNA compreendendo as moléculas de DNA recombinante fornecidas pela invenção (por exemplo, com todos os construtos de DNA presentes como parte do mesmo vetor usado para a transformação da planta) ou inserindo o(s) traço(s) adicional(s) em uma planta transgênica compreendendo um construto de DNA fornecido pela invenção ou vice-versa (por exemplo, usando qualquer um dos métodos de transformação de plantas ou edição de genes em uma planta transgênica ou célula vegetal). Tais traços transgênicos adicionais incluem, sem limitação, resistência a insetos aumentada, eficiência aumentada do uso da água, desempenho aumentado do rendimento, resistência aumentada à seca, qualidade aumentada da semente, melhoria da qualidade nutricional, produção de sementes híbridas e tolerância a herbicidas, em que o traço é medido em relação a uma planta de tipo selvagem. Exemplos de traços adicionais de tolerância a herbicida podem incluir tolerância transgênica ou não transgênica a um ou mais herbicidas, tais como inibidores de ACCase (por exemplo, ariloxifenóxi propionatos e ciclo-hexanodionas), inibidores de ALS (por exemplo sulfonilureias, imidazolinonas, triazoloirimidinas e triazolinonas), inibidores de EPSPS (por exemplo, glifosato), auxinas sintéticas (por exemplo, fenóxis, ácidos benzoicos, ácidos carboxílicos, semicarbazonas), inibidores da fotossíntese (por exemplo, triazinas, triazinonas, nitrilas, benzotiadiazois e ureias), inibidores da síntese de glutamina (por exemplo, glufosinato), inibidores de HPPD (por exemplo, isoxazois, pirazolonas e tricetonas), inibidores de PPO (por exemplo, difeniléteres, N-fenilftalimida, aril triazinonas e pirimidinadionas) e inibidores de ácidos graxos de cadeia longa (por exemplo, cloroacetamidas, oxieacetamidas e pirazóis), dentre outros. Exemplos de traços de resistência a insetos podem incluir resistência a um ou mais insetos dentro de uma ou mais das ordens de lepidópteros, coleópteros, hemípteros e homópteros, dentre outros. Tais traços transgênicos adicionais são conhecidos por um versado na técnica; por exemplo, uma lista destes traços é fornecida pelo Serviço de Inspeção de Saúde Animal e Fitossanitário do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) (APHIS).

[078] Uma célula transformada com um polinucleotídeo da presente invenção, tal como um construto de expressão, pode ser selecionada para a presença do polinucleotídeo ou a sua atividade enzimática codificada antes ou depois da regeneração de tal célula em uma planta transgênica. As plantas transgênicas que compreendem tal polinucleotídeo podem, assim, ser selecionadas, por exemplo, identificando uma planta transgênica que compreende o polinucleotídeo ou a atividade enzimática codificada e/ou apresenta um traço alterado em relação a uma planta de controle de outra forma isogênica. Tal traço pode ser, por exemplo, tolerância a um herbicida de PPO.

[079] As plantas transgênicas e a progênie que contêm um traço transgênico fornecido pela invenção podem ser usadas com quaisquer métodos de reprodução conhecidos na técnica. Nas linhagens de plantas que compreendem dois ou mais traços transgênicos, os traços transgênicos podem ser independentemente segregados, ligados ou uma combinação de ambos em linhagens de plantas compreendendo três ou mais traços transgênicos. Também é contemplada o retrocruzamento com uma planta parental e o cruzamento externo com uma planta não transgênica, assim como a propagação vegetativa. As descrições de métodos de reprodução que são usados para diferentes traços e culturas são bem conhecidas pelos versados na técnica. Para confirmar a presença do(s) transgene(s) em uma determinada planta ou semente, pode ser realizada uma variedade de ensaios. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de biologia molecular, tais como southern e northern blotting, PCR e sequenciamento de DNA; ensaios bioquímicos, tais como a detecção da presença de um produto proteico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e western blots) ou por função enzimática; ensaios de partes de plantas, tais como ensaios de folhas ou raízes; e também, analisando o fenótipo de toda a planta.

[080] A introgressão de um traço transgênico em um genótipo de planta é alcançada como resultado do processo de conversão de retrocruzamento. Um genótipo de planta no qual um traço transgênico foi introgredido pode ser referido como um genótipo, linhagem, cruzamento congênito ou híbrido retroconvertido. Do mesmo modo, um genótipo de planta que não possui o traço transgênico desejado pode ser referido como um genótipo não convertido, linhagem, cruzamento congênito ou híbrido.

[081] Tendo descrito a invenção em detalhes, será evidente que são possíveis modificações, variações e modalidades equivalentes sem se afastar do escopo da invenção definido nas reivindicações anexas. Além disto, deve ser apreciado que os exemplos na presente descrição são fornecidos como exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

[082] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar modalidades da invenção. Deve ser apreciado pelos versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionarem bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas como constituindo modos preferenciais para sua prática. Contudo, os versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que podem ser feitas muitas mudanças nas modalidades específicas que são divulgadas e, ainda, obtêm um resultado semelhante ou similar sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que estão ligados química e fisiologicamente podem ser substituídos pelos agentes aqui descritos com o mesmo resultado ou similar obtido. Todos estes substitutos e modificações similares aparentes para os versados na técnica são considerados dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

EXEMPLO 1: DESCOBERTA DE PROTOPORFIRINOGÊNIO OXIDASE MICROBIANA

[083] As novas protoporfirinogênio oxidases foram identificadas de bases de dados de sequências microbianas usando métodos bioinformáticos e um novo sistema de triagem bacteriana de protoporfirinogênio oxidase. Três sequências que representam uma faixa diversa de protoporfirinogênio oxidases microbianas HemY e a sequência para a protoporfirinogênio oxidase HemY sensível a herbicida de PPO de Arabidopsis thaliana foram usadas para identificar novas sequências putativas de protoporfirinogênio oxidase de bases de dados de sequências microbianas. O uso destas quatro sequências diversas com ferramentas bioinformáticas permitiu a distorção dos resultados da pesquisa na direção de sequências que são mais similares às protoporfirinogênio oxidases microbianas do que as protoporfirinogênio oxidases vegetais, a fim de aumentar a probabilidade de identificar protoporfirinogênio oxidases tolerantes a herbicidas de PPO.

[084] Foram identificadas noventa e nove novas protoporfirinogênio oxidases putativas da família de PPO HemY usando este método. As sequências que codificam estas enzimas PPO HemY putativas foram comparadas usando o mapeamento de árvore filogenética. Quarenta e quatro enzimas de PPO HemY putativas foram selecionadas para análise posterior devido à sua representação de membros individuais agrupados únicos na árvore filogenética. As sequências de codificação para as quarenta e quatro enzimas de PPO HemY putativas selecionadas foram clonadas em vetores de expressão bacterianos para análise em uma tela de desativação de hemG de E. coli descrita abaixo.

[085] Foi criado um sistema de triagem bacteriana de protoporfirinogênio oxidase para testar proteínas recombinantes para a atividade da protoporfirinogênio oxidase. Este sistema de triagem usou um ensaio de resgate funcional em uma cepa de E. coli que continha uma desativação de gene para a enzima de PPO de E. coli (HemG; SEQ ID N°: 76). A cepa de E. coli de desativação de hemG mostrou crescimento mínimo em meios bacterianos clássicos (por exemplo, meio LB), mas as taxas de crescimento se recuperaram quando o meio bacteriano foi suplementado com heme livre ou quando uma protoporfirinogênio oxidase recombinante foi expressa na E. coli. A cepa de E. coli de desativação de hemG poderia, assim, ser usada com expressão de proteína recombinante para testar proteínas rápido e facilmente para a atividade da protoporfirinogênio oxidase.

[086] A cepa de E. coli de desativação de hemG foi transformada com os vetores de expressão bacterianos contendo as protoporfirinogênio oxidases putativas e plaqueada em meio LB. As proteínas recombinantes foram expressas em E. coli e as taxas de crescimento foram medidas. O crescimento da cepa de E. coli de desativação de hemG transformada em meio LB indicou uma sequência de aminoácidos que confirmou como uma protoporfirinogênio oxidase funcional. Usando este ensaio, um grande número de proteínas novas ou geneticamente modificadas podem ser rastreadas para confirmar e medir a atividade da protoporfirinogênio oxidase. Dez de quarenta e quatro enzimas de PPO novas putativas resgataram a cepa de E. coli de desativação de hemG, confirmando sua atividade como protoporfirinogênio oxidase, e foram selecionadas para caracterização adicional. A Tabela 3 fornece as SEQ ID N°s correspondendo às dez variantes de PPO de HemY selecionadas, a HemG de E. coli, e a PPO de A. tuberculatus. TABELA 3. SEQ ID N°s CORRESPONDENDO A VARIANTES DE PPO DE HEMY

EXEMPLO 2: INSENSIBILIDADE DE INIBIDOR DE PROTOPORFIRINOGÊNIO OXIDASE

[087] Novas protoporfirinogênio oxidases que são tolerantes a herbicidas de PPO foram identificadas usando um sistema de triagem bacteriana de herbicidas. Este sistema de triagem usou um ensaio de crescimento da cepa de E. coli de desativação de hemG em meio líquido LB suplementado com um herbicida de PPO para identificar protoporfirinogênio oxidases que não eram sensíveis ao herbicida de PPO.

[088] A cepa de E. coli de desativação de hemG foi transformada com os vetores de expressão bacterianos contendo as protoporfirinogênio oxidases confirmadas e cultivada em meio líquido LB. Uma quantidade de saturação da forma cristalina purificada de um dos cinco herbicidas de PPO diferentes (acifluorfeno, flumioxazina, lactofeno, fomesafeno e S-3100), que representam três subclasses de química de PPO diferentes, foi adicionada ao meio. As proteínas recombinantes foram expressas e as taxas de crescimento de E. coli foram medidas. As curvas de crescimento (OD600) foram medidas para as diferentes variantes na presença e na ausência dos herbicidas de PPO em pontos no tempo selecionados (por exemplo, oito horas). O crescimento de uma cepa de E. coli de desativação de hemG transformada em meio LB na presença de um herbicida de PPO indica uma protoporfirinogênio oxidase que é uma protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicidas (iPPO).

[089] As novas protoporfirinogênio oxidases putativas foram usadas com este ensaio para testar a insensibilidade aos herbicidas de PPO. A expressão de HemG de E. coli (SEQ ID N°: 76), HemY PPO R1N473 (SEQ ID N°: 13), HemY PPO R1N533 (SEQ ID N°: 14); ou HemY PPO R1N171 (SEQ ID N°: 15) conferiu taxas de crescimento normais na cepa de E. coli de desativação de hemG em meio mínimo na presença de herbicidas de PPO acifluorfeno, flumioxazina, lactofeno ou fomesafeno, indicando, portanto, que estas proteínas eram protoporfirinogênio oxidases altamente insensíveis a herbicidas (iPPO). Dados são fornecidos na Figura 1. As bactérias transformadas com construtos que codificam HemY PPO R1 N311 (SEQ ID N°: 16) ou HemY PPO R1 N333 (SEQ ID N°: 17) não cresceram na presença de qualquer dentre acifluorfeno, flumioxazina, lactofeno ou fomesafeno, indicando que estas proteínas não conferiram tolerância a nenhum destes herbicidas de PPO. A expressão de HemY R2N30 (SEQ ID N°: 1) ou Hem Y R2N40 (SEQ ID N°: 2) conferiram taxas de crescimento normais na cepa de E. coli de desativação de hemG em meio mínimo na presença de acifluorfeno e S-3100, mas, em níveis maiores, estas duas enzimas apresentaram sensibilidade a ambos os herbicidas. A taxa de crescimento foi mais lenta para a cepa de E. coli de desativação de hemG contendo HemY R2N70 (SEQ ID N°: 3), HemY R2N90 (SEQ ID N°: 4), ou HemY R2N100 (SEQ ID N°: 5), mas tolerância a acifluorfeno e S-3100 foi muito melhor do que para a cepa de E. coli de desativação de hemG contendo R2N30 (SEQ ID N°: 1) e R2N40 (SEQ ID N°: 2). Dados são fornecidos na Figura 2. A cepa de E. coli de desativação de hemG expressando a PPO de A. tuberculatus (SEQ ID N°: 80) foi usada como um controle negativo e era sensível a todos os herbicidas de PPO. Com o uso deste ensaio, uma grande quantidade de proteínas novas ou geneticamente modificadas pode ser rastreada para confirmar a atividade da protoporfirinogênio oxidase na presença de herbicida(s) de PPO.

EXEMPLO 3: ENSAIO DE ENZIMA DE PROTOPORFIRINOGÊNIO OXIDASE (PPO)

[090] Protoporfirinogênio oxidases novas foram caracterizadas usando um ensaio de enzimas. Este ensaio usou proteínas PPO de HemY recombinantes com extrato de plastídeo vegetal e substrato de PPO para identificar protoporfirinogênio oxidases que tiveram atividade na presença de um herbicida de PPO.

[091] O extrato de plastídeo vegetal produziu etioplastos e cloroplastos usados que foram preparados a partir de cotilédones etiolados (soja, Glycine max), folhas/coleóptilos etiolados (milho, Zea mays) e folhas apicais desdobradas (A. tuberculatus) geralmente pelo procedimento descrito por Grossmann (2010). Sementes de soja (A3555) e milho (LH244) foram colocadas entre duas folhas de papel de germinação úmido (Anchor Paper Company, Saint Paul, Minnesota, EUA) em um copo de água em contínua escuridão durante oito a dez dias. Plantas de A. tuberculatus foram cultivadas por 30 dias na estufa. O tecido foi coletado, colocado entre folhas de papel úmidas e moído em pó fino com um morteiro e pilão em nitrogênio líquido. O tampão de homogeneização (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, sacarose 500 mM, EDTA 1 mM, cloreto de magnésio 1 mM e albumina de soro bovino a 2 g/litro) foi adicionado ao pó congelado a 4:1 (ml de tampão de homogeneização a g de tecido de peso fresco), misturado vigorosamente e filtrado através de quatro camadas de Miracloth pré-umedecido. O filtrado foi centrifugado a 9299 g durante cinco minutos. O pélete foi ressuspenso em tampão de homogeneização e centrifugado a 150 g durante dois minutos. A solução sobrenadante foi centrifugada a 4000g durante quinze minutos. Todas as etapas de centrifugação foram realizadas a 4°C. O pélete (fração de plastídeo intacta) foi ressuspenso em Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), EDTA 2 mM e 20% (em volume) de glicerina e armazenados em alíquotas a -80°C. A proteína total em preparações de plastídeo foi medida pelo método de Bradford (1976) com albumina de soro bovino como padrão.

[092] As enzimas PPO recombinantes foram expressas na linhagem celular de desativação de HemG de E. coli e extraídas para o ensaio enzimático. As células bacterianas de uma cultura durante a noite foram usadas para inocular 20 ml de meio fresco. Foi permitido que estas culturas crescessem por aproximadamente 48 horas a 20°C até uma cultura densa. As células bacterianas foram coletadas por centrifugação e os grânulos de células armazenados a -80°C até os ensaios enzimáticos serem realizados. Os grânulos bacterianos congelados foram ressuspensos em tampão de extração (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM e MgCl2 1 mM) e sonicados (Sonics VibraCell ™) durante 30 segundos em um banho de gelo com um período de repouso de um minuto entre ciclos. Para E. coli transformada com um construto que codifica HemG de E. coli (SEQ ID N°: 76), as células rompidas foram centrifugadas a 200 g por 2 minutos a 4°C e a solução sobrenadante foi usada para ensaios de enzima PPO após diluição com tampão de extração. Péletes celulares congelados preparados a partir de bactérias transformadas com um construto que codifica R1N473 (SEQ ID N°: 13), R1N171 (SEQ ID N°: 15), R1N533 (SEQ ID N°: 14), R2N30 (SEQ ID N°: 1), R2N40 (SEQ ID N°: 2), R2N90 (SEQ ID N°: 4), ou R2N100 (SEQ ID N°: 5) foram centrifugados a 9400 g durante 10 minutos a 4°C. A fração de pélete desta solução sobrenadante foi preparada por ultracentrifugação a 100000g durante uma hora a 4°C a 7°C e ressuspensa em tampão de extração para ensaios de PPO. A proteína total foi medida pelo método de Bradford (1976) com albumina de soro bovino como padrão.

[093] O substrato de PPO protoporfirinogênio IX (protogênio) foi preparado por redução da protoporfirina comercialmente disponível com amálgama de mercúrio e sódio como descrito por Jacobs e Jacobs (1999). A protopofirina (proto) foi adicionada a hidróxido de potássio a 0,01 N em etanol a 20% e agitada no escuro até dissolver (cerca de 40 minutos). Um volume de 0,8 ml de proto foi colocado em um frasco de polipropileno de 2 ml com uma tampa de rosca com um anel de O e cerca de 1 g (uma espátula com ponta, óleo drenado) de amálgama de mercúrio e sódio (número de produto 451908, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, armazenado sob óleo) foi adicionada. O tubo foi tampado e misturado vigorosamente com um misturador de vórtice e ventilado aproximadamente a cada 30 segundos soltando a tampa até a solução não estar mais fluorescente vermelha sob uma luz UV (cerca de cinco minutos). O frasco de reação foi lavado com argônio e centrifugado brevemente para peletizar o amálgama de sódio restante. A solução sobrenadante foi diluída 1:1 (em volume) com uma solução de DTT a 0,1 M e Tris-HCl a 0,5 M, pH 7,5 e o frasco lavado com argônio. A solução protogênica foi dividida em alíquotas menores em tubos com tampão de polipropileno de 0,5 ml que foram lavados com argônio imediatamente após a inclusão da alíquota. Os tubos tampados foram cobertos com papel alumínio e armazenados a -80°C. Para o ensaio enzimático, as alíquotas protogênicas descongeladas foram armazenadas cobertas de gelo e usadas no mesmo dia. A concentração de protogênio na preparação foi calculada subtraindo a concentração de proto, medida por HPLC de fluorescência (método descrito por Matsumoto, 1994), na solução de protogênio final (tipicamente cerca de 1% de material de partida) a partir da concentração de proto no material de partida e assumindo nenhuma impureza significativa em qualquer amostra. O protogênio preparado e armazenado nestas condições era estável pelo menos seis meses.

[094] Um teste de enzima PPO foi conduzido para medir a atividade de PPO usando o extrato de plastídeo vegetal e preparações de extrato bacteriano com o substrato de PPO. A atividade de PPO foi medida geralmente como descrito por Grossmann (2010). Dez microlitros de extrato de plastídeo (40 μg de proteína total) ou extrato bacteriano (1,1 μg de proteína total para HemG de E. coli (SEQ ID N°: 76); ou 45 a 70 μg de proteína total para R1N473 (SEQ ID N°: 13), R1N171 (SEQ ID N°: 15), R1N533 (SEQ ID N°: 14), R2N30 (SEQ ID N°: 1), R2N40 (SEQ ID N°: 2), R2N90 (SEQ ID N°: 4), ou R2N100 (SEQ ID N°: 5)) foi adicionado ao tampão de ensaio (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, DTT 5 mM, EDTA 1 mM e 0,085% (em volume) de Tween 80) com tampão ou com S-3100 (adicionado como um volume de dois microlitros de uma soluções de estoque de 100X preparada em acetona). O S-3100 de grau analítico foi fornecido por Sumitomo Chemical Company. Todos os ensaios foram realizados em uma concentração final de 1% (em volume) de acetona. Os extratos (plastídeos ou bactérias), tampão e S- 3100 foram incubados a 30°C (extratos de plantas) ou 37°C (extratos bacterianos) durante cinco minutos antes da adição de dois microlitros de protogênio para iniciar o ensaio. Todos os ensaios foram feitos em uma placa de microtitulação de poliestireno preto de 96 cavidades (Costar® 3925, Corning, Inc., Corning, Nova York, EUA) em um volume final de 200 microlitros. Após a adição de protogênios (3 μM para medições de IC50, variável para medições de Km) para todas as cavidades, a placa foi incubada a 30°C (extratos de plantas) ou 37°C (extratos bacterianos) antes de iniciar a coleta de dados. A fluorescência ao longo do tempo foi medida a 30°C (extratos de plantas) ou 37°C (extratos bacterianos) com comprimentos de onda de excitação e emissão de 405 mm e 630 mm, respectivamente, em um Leitor de Microplacas Multimodos SpectraMax® M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, Califórnia, EUA). Um ensaio em branco foi executado adicionando extrato inativado por calor (cinco minutos a 100°C) à mistura de ensaio. Valores Km aparentes de PPO foram calculados usando ajuste de curva de hipérbole retangular usando o pacote de software SoftPro® kinetics (Molecular Devices, Sunnyvale, Califórnia, EUA). Os valores IC50 de S-3100 foram determinados graficamente a partir do gráfico semilogarítmico da concentração de S-3100 versus atividade de PPO.

[095] A afinidade de ligação do substrato (protoporfirinogênio) foi medida como o Km. A sensibilidade da atividade enzimática a herbicida PPO S-3100 foi medida como a concentração dando 50% de inibição da atividade de controle (IC50). O Km para as enzimas de PPO de planta (A. tuberculatus, soja ou milho) e as enzimas de PPO bacterianas (HemG de E. coli (SEQ ID N°: 76), R1N473 (SEQ ID N°: 13), R1N171 (SEQ ID N°: 15), R1N533 (SEQ ID N°: 14), R2N30 (SEQ ID N°: 1), R2N40 (SEQ ID N°: 2), R2N90 (SEQ ID N°: 4) ou R2N100 (SEQ ID N°: 5)) eram similares, na faixa de 0,7 μM a 2,0 μM. Cada uma das três enzimas de PPO de planta eram sensíveis a S-3100 com um IC50 de 0,003 a 0,009 μM. As enzimas PPO bacterianas R2N30 (SEQ ID N°: 1) e R2N40 (SEQ ID N°: 2) tinham um IC50 de 0,02 μM e 0,04 μM, respectivamente, e eram 10 vezes menos sensíveis ao herbicida do que as enzimas de PPO de planta. As enzimas de PPO bacterianas de HemG de E. coli (SEQ ID N°: 76), R1N473 (SEQ ID N°: 13), R1N171 (SEQ ID N°: 15), R1N533 (SEQ ID N°: 14), R2N90 (SEQ ID N°: 4) e R2N100 (SEQ ID N°: 5) tinham um IC50 maior que 100 μM e foram medidas com insensíveis ao herbicida. Dados são fornecidos na Tabela 4. TABELA 4: ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE PPO

EXEMPLO 4: OTIMIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE PROTOPORFIRINOGÊNIO OXIDASES

[096] A otimização de proteína foi usada para melhorar ou alterar as propriedades enzimáticas de protoporfirinogênio oxidases. Um ou mais métodos de engenharia genética de proteína podem ser usados para otimizar as enzimas. Exemplos não limitantes de abordagens de engenharia genética de proteínas incluem Mutações de Triagem de Alanina; Mutações de Triagem de Homologia; Mutações de Triagem de Pro/Gly; Trocas ou Mutações de Região; e combinações destas várias técnicas (consulte M Lehmann e M Wyss, Current Opinion in Biotechnology 12 (4): 371-375 (2001), B Van den Burg e VGH Eijsink, Current Opinion in Biotechnology 13 (4): 333-337 (2002) e Weiss et al., Actas da National Academy of Sciences USA 97 (16): 8950-8954 (2000)). As sequências de ácido nucleico de protoporfirinogênio oxidase geneticamente modificadas podem ser sintetizadas e clonadas em um vetor de expressão bacteriana e usadas para transformar a cepa de E. coli de desativação de hemG para a triagem de resgate bacteriano de alto rendimento como descrito no Exemplo 1. As proteínas geneticamente modificadas que resgatam a cepa de E. coli de desativação de hemG podem ser triadas quanto à sensibilidade a um ou mais herbicidas de PPO usando o teste de crescimento bacteriano como descrito no Exemplo 2. As proteínas geneticamente modificadas que exibem tolerância aos herbicidas de PPO na segunda triagem podem, então, ser expressas como proteína recombinante em um sistema de expressão bacteriana, e a caracterização enzimática pode ser feita usando a proteína purificada como descrito no Exemplo 3. As proteínas geneticamente modificadas que são insensíveis a herbicidas de PPO podem ser selecionadas para clonagem em vetores de transformação de plantas e isso pode ser usado para produzir plantas transgênicas para teste in plant.

[097] Uma biblioteca de sequências de codificação R2N40 aleatoriamente mutagenizadas foi produzida usando um Kit de Mutagênese Aleatório GeneMorph® II (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). A biblioteca resultante de vetores de expressão bacteriana mutagenizados foi usada para transformar a cepa de E. coli de desativação de hemG e esta foi plaqueada em placas de meio LB contendo acifluorifeno. As colônias bacterianas que cresceram no meio de herbicida foram selecionadas, os plasmídeos de transformação foram purificados e os genes mutantes de PPO foram sequenciados. Enzimas R2N40 de PPO de HemY geneticamente modificadas são fornecidas como SEQ ID N°s:7-12.

EXEMPLO 5: EXPRESSÃO E TESTE DE ENZIMAS DE PPO EM PLANTAS DE SOJA

[098] As enzimas de PPO HemY microbianas foram expressas em plantas de soja transgênicas e as plantas transgênicas foram analisadas quanto à tolerância a herbicida de PPO. Um conjunto de construtos para triagem de alto rendimento foi produzido com o mesmo elemento promotor e 3 'UTR operativamente ligado a um dos dez cassetes diferentes que codificam as enzimas de PPO HemY R1N171 (SEQ ID N°: 20); R1N473 (SEQ ID N°: 18); R1N533 (SEQ ID N°: 19); R2N30 (SEQ ID N°: 1, 6); R2N40 (SEQ ID N°: 2, 7); R2N40opt (SEQ ID N°: 9, 10-12); R2N70 (SEQ ID N°: 3); R2N90 (SEQ ID N°: 4); R2N100 (SEQ ID N°: 5); e R1N333 (SEQ ID N°: 21) operativamente ligadas a um de 39 peptídeos de trânsito diferentes. Para a transformação da planta, as sequências de nucleotídeos que codificam as enzimas de PPO de HemY foram submetidas à otimização de códons para a expressão de dicotiledôneas. Isto permitiu a comparação lado a lado das sete enzimas de PPO HemY diferentes com trinta e nove diferentes peptídeos de direcionamento usando o mesmo promotor e elementos de 3'UTR para expressão de gene.

[099] Os construtos de transformação de plantas foram usados para transformar embriões excisados de soja (germoplasma A3555) utilizando A. tumefaciens e métodos padrão conhecidos na técnica. Quatrocentos explantes foram inoculados para cada construto resultando em doze recipientes por construto. Foi usada uma solução de herbicida de PPO estéril para testes de tolerância a herbicidas. A solução de herbicida consistiu em 0,3 g de S-3100 em concentrado de óleo de cultura (5,0 ml) e 495 ml de água desionizada. Isto foi filtrado através de uma unidade de filtro de cultura de tecido Nalgene® RapidFlow™ de 0,45 mícron e unidade de filtro de membrana de acetato de celulose livre de tensoativo (VWR, Radnor, PA, EUA). A solução estéril resultante foi agitada antes da aplicação.

[0100] Na pós-transformação de cinco semanas, quatro dos doze recipientes de plantas por construto foram aspergidos com duas passagens da solução de herbicida de PPO estéril. As plântulas tratadas foram, então, encerradas no recipiente e receberam pelo menos 15 horas de exposição a luz após aspersão a cada dia por quatro dias. No final do dia quatro após aplicação de S-3100, as plântulas tratadas foram fotografadas e marcadas em uma escala visual de coloração verde (a coloração verde era representativa do tecido de plantas fotossintéticas saudáveis em comparação com o tecido foto- branqueado) versus o dano. Os valores de classificação foram 0 para tolerância fraca, dano alto, baixa coloração verde; 1 para alguma tolerância, dano médio, coloração verde moderada; e 2 para boa tolerância, baixo dano, alta coloração verde. Os resultados da aplicação de herbicidas de S-3100 durante cinco semanas são apresentados na Tabela 5, onde n.d. indica que a análise não foi realizada. Os resultados indicaram que nesta triagem de alto rendimento inúmeros construtos compreendendo as enzimas de PPO de HemY R1N473 (SEQ ID N°: 18); R1N533 (SEQ ID N°: 19); R2N30 (SEQ ID N°: 1, 6); R2N40 (SEQ ID N°: 2, 7); R2N40opt (SEQ ID N°: 9, 10-12); e R2N70 (SEQ ID N°: 3) proporcionaram tolerância ao herbicida de PPO. Os resultados indicaram que nesta triagem de alto rendimento, as enzimas de PPO de HemY R1N171 (SEQ ID N°: 20); R2N90 (SEQ ID N°: 4); R2N100 (SEQ ID N°: 5); e R1N333 (SEQ ID N°: 21) não proporcionaram tolerância ao herbicida de PPO. TABELA 5. CLASSIFICAÇÃO DE TOLERÂNCIA A S-3100 EM 5 SEMANAS PARA PPO DE HEMY

[0101] As plantas nos recipientes não aspergidos correspondentes aos construtos com uma classificação de aprovação alta de 2 e algumas falhas como controles negativos foram transplantadas aproximadamente 7 semanas após a transformação. As plantas R0 foram cultivadas em uma estufa sob condições de enfermagem de longo prazo (luz 18 horas a 26,6°C (80°F) e 6 horas a escuro a 23,3°C (74°F)) por aproximadamente quatro semanas. Na semana onze, as plantas R0 foram aspergidas com duas passagens da mesma solução de herbicida (0,3 g de S-3100) descritas acima. As classificações de lesões de herbicidas foram coletadas sete dias após o tratamento. Qualquer classificação de lesão de 30% ou mais foi equivalente a classificações de lesões de soja não transgênica. Os resultados da aplicação de tolerância ao herbicida na semana onze às plantas R0 são apresentados na Tabela 6, onde n.d. indica que a análise não foi realizada. Os resultados indicaram que plantas que expressam inúmeros construtos compreendendo enzimas de PPO de HemY R2N30 (SEQ ID N°: 1,6); R2N40 (SEQ ID N°: 2, 7); e R2N40opt (SEQ ID N°: 9, 10-12) fornecem tolerância ao herbicida de PPO com uma classificação de lesão abaixo do controle não transgênico. As plantas que expressam a enzima de PPO de HemY R2N30 (SEQ ID N°: 1, 6) forneceram tolerância a herbicidas em 16 dos 19 construtos testados, com classificações de lesão para estas construções de 7% a 25%. As plantas que expressam as enzimas de PPO de HemY R2N40 (SEQ ID N°: 2, 7) e R2N40opt (SEQ ID N°: 9, 10-12) fornecem tolerância a herbicida em 8 dos 11 construtos testados, com classificações de lesão para estes construtos de 20% a 25%. Os resultados indicaram que, nesta triagem de alto rendimento, as plantas que expressam as enzimas de PPO de HemY R1N171 (SEQ ID N°: 20); R1N473 (SEQ ID N°: 18); R1N533 (SEQ ID N°: 19); R2N70 (SEQ ID N°: 3); e R1N333 (SEQ ID N°: 21) tiveram uma classificação de lesão de 30% ou mais equivalente a classificações de lesões de controle não transgênicas e, portanto, não forneceu tolerância a herbicida de PPO. TABELA 6. CLASSIFICAÇÃO DE TOLERÂNCIA A S-3100 EM 11 SEMANAS PARA PPO DE HEMY

Claims (23)

1. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um promotor heterólogo operativamente ligado a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que confere tolerância a herbicida a uma planta transgênica, sendo que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 26-27, 31-32, 36-46 e 47-48 ou uma sequência de ácido nucleico degenerada da mesma que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6-12, e sendo que a proteína apresenta atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicida.

2. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o promotor heterólogo é funcional em uma célula vegetal.

3. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico é operativamente ligada a uma molécula de DNA que codifica uma sequência de direcionamento que funciona para localizar uma proteína operativamente ligada em uma célula.

4. Construto de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1.

5. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA recombinante compreende adicionalmente uma molécula de DNA operativamente ligada que codifica uma sequência de direcionamento que funciona para localizar a proteína em uma célula.

6. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína confere tolerância a herbicida de PPO à referida célula.

7. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o construto de DNA está presente no genoma de uma planta, semente ou célula transgênica.

8. Polipeptídeo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID NOs: 6-12, sendo que o polipeptídeo recombinante apresenta atividade de protoporfirinogênio oxidase insensível a herbicida, e sendo que o referido polipeptídeo recombinante confere tolerância a herbicida a uma planta transgênica.

9. Método para conferir tolerância a herbicida PPO a uma planta, semente, célula ou parte de planta, caracterizado pelo fato de que compreende: expressar de maneira heteróloga na referida planta, semente, célula ou parte de planta, a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida planta, semente, célula ou parte de planta compreende atividade de protoporfirinogênio oxidase conferida pela molécula de DNA recombinante.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a tolerância a herbicida é a pelo menos um herbicida PPO selecionado do grupo que consiste em: acifluorfeno, fomesafeno, lactofeno, fluoroglicofeno-etila, oxifluorfeno, flumioxazina, azafenidina, carfentrazona-etílica, sulfentrazona, flutiacete-metila, oxadiargil, oxadiazona, piraflufeno-etila, saflufenacil e S-3100.

12. Método para transformação de planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) introduzir a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1, em uma célula vegetal; e (b) regenerar uma planta da mesma que compreende a molécula de DNA recombinante.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de selecionar uma planta que é tolerante a pelo menos um herbicida PPO.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de cruzar a planta regenerada com si própria ou com uma segunda planta e coletar semente do cruzamento.

15. Método para controlar ervas daninhas em uma área de cultivo de planta, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a área de cultivo de planta que compreende uma planta ou semente transgênica que compreende a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1, em contato com pelo menos um herbicida PPO, sendo que a planta ou semente transgênica é tolerante ao herbicida PPO e sendo que pelo menos uma primeira erva daninha é controlada na área de cultivo de planta pelo herbicida PPO.

16. Método de triagem para um gene de tolerância a herbicida, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) expressar a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1, em uma célula vegetal; e (b) identificar uma célula vegetal que exibe tolerância a um herbicida PPO.

17. Método de triagem para um gene de tolerância a herbicida, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) expressar uma molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1, em uma célula bacteriana sem HemG, sendo que a célula bacteriana é cultivada em um meio livre de heme na presença de um herbicida PPO; e (b) identificar uma célula bacteriana que exibe tolerância a um herbicida PPO.

18. Método para produção de uma planta tolerante a um herbicida PPO e pelo menos um outro herbicida, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma planta transgênica que compreende a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1; e (b) cruzar a planta transgênica com uma segunda planta compreendendo tolerância ao pelo menos um outro herbicida, e (c) selecionar uma planta de progênie resultando do referido cruzamento que compreende tolerância a um herbicida PPO e ao pelo menos um outro herbicida.

19. Método para reduzir o desenvolvimento de ervas daninhas tolerantes a herbicida, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar em um ambiente de cultura agrícola uma planta transgênica que compreende a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1; e (b) aplicar um herbicida PPO e pelo menos um outro herbicida ao ambiente de cultura agrícola, sendo que a planta de cultura é tolerante ao herbicida PPO e ao pelo menos um outro herbicida.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o herbicida PPO é selecionado do grupo que consiste emacifluorfeno, fomesafeno, lactofeno, fluoroglicofeno-etila, oxifluorfeno, flumioxazina, azafenidina, carfentrazona-etílica, sulfentrazona, flutiacete-metila, oxadiargil, oxadiazona, piraflufeno-etila, saflufenacil e S-3100.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um outro herbicida é selecionado do grupo que consiste em: um inibidor de ACCase, um inibidor de ALS, um inibidor de EPSPS, uma auxina sintética, um inibidor de fotossíntese, um inibidor de síntese de glutamina, um inibidor de HPPD, um inibidor de PPO e um inibidor de ácido graxo de cadeia longa.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ACCase é um propionato de ariloxifenóxi ou uma ciclo-hexanodiona; o inibidor de ALS é uma sulfonilureia, imidazolinona, triazoloirimidina ou uma triazolinona; o inibidor de EPSPS é glifosato; a auxina sintética é um herbicida de fenóxi, um ácido benzoico, um ácido carboxílico ou uma semicarbazona; o inibidor de fotossíntese é uma triazina, uma triazinona, uma nitrila, um benzotiadiazol ou uma ureia; o inibidor de síntese de glutamina é glufosinato; o inibidor de HPPD é um isoxazol, um pirazolona ou uma tricetona; o inibidor de PPO é um difeniléter, uma N-fenilftalimida, uma aril triazinona ou uma pirimidinadiona; ou o inibidor de ácido graxo de cadeia longa é uma cloroacetamida, uma oxiacetamida ou um pirazol.

23. Uso de planta, parte de planta, célula vegetal ou semente compreendendo a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1, e/ou o polipeptídeo recombinante, como definido na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é para cruzar com uma segunda planta, regenerar uma planta transgênica, plantar ou cultivar um campo de plantas transgênicas, produzir produtos de planta ou produzir produtos de consumo.