CN103146753A - 一种新的腺病毒载体及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的腺病毒载体及其生产方法。该载体生产包括两个主要步骤，一是把外源的基因克隆到穿梭载体里面，二是穿梭载体和腺病毒骨架载体的重组。本发明所用穿梭载体是在pShuttle-CMV载体基础上改进的—pCMV-FH；所用腺病毒骨架载体是在现有腺病毒骨架载体内克隆进了一个表达ISceI的酵母基因；所用重组菌株是SW102。本发明穿梭载体克隆方法及穿梭载体和腺病毒骨架载体的重组方法均采用高通量的生产方法。采用高通量穿梭载体的克隆方法和高通量的重组方法重复操作至第五轮就可以把99%的穿梭载体克隆重组到腺病毒载体之内。本发明的高通量腺病毒载体生产方法重组效率高达85-90%，大幅简化实验步骤，时间也大大缩短，且实验成本明显降低。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种新的腺病毒载体及其生产方法，具体涉及一种高通量腺病毒载体及其生产方法。
背景技术
腺病毒载体是转染人类细胞最有效的，多样化的系统，它被广泛的应用在生物医学研究和基因疗法领域。腺病毒载体能够有效的转染分裂或不分裂的细胞，其转染效率可达到百分之百。腺病毒载体进入细胞后不整合到人类基因组，所以它相对比较安全。
腺病毒的生产比较容易达到很高的滴度，并且能够容纳多达30kb以上的外源基因。腺病毒重组蛋白的表达可以达到20-30%的细胞重量。尽管腺病毒载体有很多优点，但是它的生产过程比较繁琐，生产周期也比较长。一个腺病毒的生产大约需要6-8周的时间。到目前为止还没有高通量的生产技术。
腺病毒是线性的，双链DNA病毒。因为它有三万六千个碱基对，所以直接克隆外源的基因会非常困难。克隆外源基因到腺病毒载体有很多种不同的方式，但最常见的是Agilent的pAdEasyTM系统。这个系统利用大肠杆菌(Escherichia coli)BJ5183和同源重组的方式。重组是在一个含有外源基因的穿梭载体和含有腺病毒基因组的质粒载体之间进行的。然而BJ5183生长缓慢，质粒产量非常微量。因为用来重组的一整套酶在该细胞株中一直处于表达状态并始终存在于细胞内，所以重组后的腺病毒在该细胞内非常不稳定。为了对重组后的DNA做酶切或测序分析，BJ5183提到的微量质粒必须再次转化到一个常用的细菌株里面去获得更多的质粒。在穿梭载体和腺病毒骨架载体在BJ5183细菌内重组之后，正确的重组一般是在琼脂盘上看上去比较小的菌落，但小的菌落很多时候并不是正确的重组。为了找到一个正确的重组，需要挑8-12个菌落做质粒提取，酶切和测序分析。整个重组的效率非常低，过程繁琐复杂。
pAdEasyTM系统中的穿梭载体含有非常有限的几个酶切点，它不能满足对整个人源基因组的克隆。且重组之前穿梭载体需要用PmeI酶切，线性化，但是许多人类的基因本身含有PmeI。重组之后，含有外源基因的腺病毒载体需要用PacI线性化，同样很多人类的基因含有该酶切点。该系统中的穿梭载体远远不能满足对人类整个基因组的腺病毒基因克隆的生产。
此外，其他的常用的腺病毒生产方式虽各有优缺点，但都不能用来做高通量腺病毒的生产。而且与pAdeasyTM系统相比，其他几种方式更难操作，更不可靠。
发明内容
由于目前腺病毒载体的生产过程比较繁琐，生产周期也比较长。一个腺病毒载体的生产大约需要6-8周的时间。到目前为止还没有高通量的生产技术。所以本发明要解决的主要的技术问题就是提供一种高通量高效率的生产腺病毒载体的方法。
由于现有的常用的穿梭载体只有几个常见的酶切点，重组之前和之后分别需要用PmeI和PacI线性化质粒，但很多人类的基因含有这两个酶切点。故需要设计新的少见的酶切点去覆盖人类基因组里面所有的克隆。所以本发明解决的另一个问题是构建一个可以用来克隆整个人类基因组的穿梭载体。
现有穿梭载体的构建效率低，目前的穿梭载体除了不能用来克隆人类所有的基因以外，也无法用来做高通量的生产。所以本发明解决的再一个问题就是提供一种高通量腺病毒穿梭载体的构建方法。
传统的方式是用BJ5183细菌株来做重组。因为重组的整个机制一直处于表达状态，重组后的腺病毒载体在BJ5183细菌内也不稳定。为了达到既可以用来重组，又可以用来做质粒的扩增的目的，就要求参与重组的几个酶只在重组之前作简短的表达，重组之后不再表达，这样腺病毒在这个细菌株内可以稳定扩增。所以本发明解决的还一个问题是采用一种可用于穿梭载体和腺病毒骨架载体重组的细菌株，使其不仅能够用来做腺病毒载体重组，又能够用来进行质粒扩增。
现有的穿梭载体和腺病毒骨架载体之间的重组方法时间长，费用高。目前常用的重组方法有两步，一是穿梭载体和腺病毒骨架载体先在BJ5183细菌中重组，挑8-12个菌体质粒小提；二是再转化到另外一个普通的菌种中作培养，质粒小提，酶切和测序。目前的技术是对基因一个一个的重组，整个周期需要8-10天时间，并需要大量试验试剂。所以本发明解决的最后一个问题是提供一个新的高通量的重组方法，利用本发明方法进行重组，不仅缩短时间，简化了实验步骤，实际的重组效率也大大提高。
为解决上述问题，本发明通过如下技术方案来实施：
本发明高通量穿梭载体的克隆方法是：首先将人类每个基因的ORF用PCR进行扩增，然后把50个大小相似的ORF的PCR产物合到一起，酶切，连接到穿梭载体；转化，细菌培养后，挑96个菌体，质粒小提，进行测序和序列分析；一个96孔板可以得到30-35个不同的克隆，第一轮就能把9，000-10，000个人源的基因克隆到穿梭载体内；对第一轮没有克隆到的基因，根据大小重新把50个克隆合到一起，酶切，连接和转化；重复操作至第五轮就可以把99%的基因克隆到穿梭载体内。
本发明高通量的穿梭载体和腺病毒骨架载体的重组方法是：首先将50个不同的穿梭载体克隆合到一起，用PmeI或ISceI酶切线性化之后，转化到含有腺病毒载体的感受态细菌之内；平板过夜培养，然后挑96个菌体作质粒小提，测序和序列分析；一次转化和96样品分析可以获得30-35个不同的重组腺病毒克隆；对第一次没有得到重组的克隆，再合到一起进行第二轮的重组；以此重复操作至第五轮就可以把99%的穿梭载体克隆重组到腺病毒载体之内。
本发明穿梭载体是在pShuttle-CMV (Agilent Technologies, USA）载体基础上改进的—pCMV-FH。对pShuttle-CMV载体的改造包括在PacI的外面添加SwaI酶切位点，在PmeI之内添加IsceI酶切位点，和外源基因插入酶切点的改变。
其中外源基因插入酶切点的改变是把T7细菌启动子、Kozak序列和用来插入外源基因的5个酶的组合：AsiSI/MluI，AsiSI/RsrII，AsiSI/NotI，AscI/MluI，AsiSI/XhoI，以及His和Flag标签合成之后，用KpnI/XbaI酶切，然后连接到KpnI/XbaI酶切的穿梭载体上。
对pShuttle-CMV载体的改造还包括缩短左、右同源臂和在5’端增加了一个Kozak序列。
对pShuttle-CMV载体的改造还包括插入嘌呤霉素Puromycin的基因、SV40启动子和BGH PolyA 信号。
本发明所用腺病毒骨架载体是在现有腺病毒骨架载体内克隆进了一个表达ISceI的酵母基因。并将该基因置于一个常用的细菌的启动子之下。
在重组过程中，当穿梭载体转化到含有腺病毒骨架载体的细菌之后，腺病毒骨架载体表达的ISceI酶会及时把没有酶切完全的穿梭载体在细菌活体内线性化。这样既增加了重组的效率，也大大减少了背景里没有重组的菌体的数量。因为ISceI酶一直在含有腺病毒骨架载体的感受态细胞中表达。
在现有技术的基础上，本发明优选了一个与现有技术不同的细菌株做重组。本发明穿梭载体和腺病毒骨架载体的重组是在细菌株SW102（美国国家健康总署（National Institutes of Health,N.I.H.））中进行的。该细菌株SW102是对大肠杆菌DH10B改造而来。该细菌株SW102含有一个有缺失的原噬菌体λ，其基因型是DH10B[lcl857(cro-bioA)<>tet]，具有抗四环素药性。
有缺失的原噬菌体λ含有三个必要的重组酶： Gam, Beta, 和 Exo，并且该原噬菌体已经整合到了细菌的染色体上了。Gam, Beta, 和 Exo 三个酶的表达是在一个很严格，可被抑制的启动子控制之下的。可被调控的PL启动子是由一个对温度敏感的λ cI857 抑制因子调控的。在32度的时候，抑制因子很活跃，它抑制PL 下面三个重组基因的表达。当到42度的时候，抑制因子失去活性，致使Gam, Beta, Exo 得到很高的表达。
因为在32度的时候，启动子被抑制，重组的Exo，Bet，Gam三种酶不能表达。在42度诱导的时候，三种重组的酶才能表达。所以细胞内重组的三个酶在制作感受态细胞之前作短暂的诱导，重组之后就不再表达。重组酶在正常生长情况下不再表达，重组后的腺病毒载体也会相对稳定。
本发明腺病毒克隆与质粒克隆一样有很多种用途，且完全可以替代传统的质粒克隆。腺病毒载体可以用来做成基因芯片，进行基因功能和蛋白功能等的研究。
本发明不仅用于人类全基因组腺病毒载体的生产，也适用于其他哺乳动物基因组腺病毒载体的生产。
本发明与现有技术相比具有如下突出的优点：
第一、新构建的穿梭载体为高通量生产提供了条件。我们选择了最稀少的3-4个限制性内切酶作为外源DNA片段的插入。人类几乎所有基因都可以通过这几个组合插入到我们的穿梭载体。现有的穿梭载体只有几个最常见的酶切位点，不能够满足人类所有基因的克隆。且只用PmeI线性化，但人类的许多基因内部含有该酶切点。新构建的载体利用ISceI线性化，因为人类基因组中不含有该酶切位点。除了PacI用来做重组后腺病毒的线性化以外，新的穿梭载体还有一个稀少的SwaI酶切点。
第二、采用新的重组菌株和方法大大提高了重组效率。新的重组菌株有很多优点。新的重组方法效率在85-90%，而传统的的重组效率只有40-50%。由于质粒在细菌株BJ5183中不稳定，并且该菌株不能用来扩增质粒，重组后的质粒需转染到另外一个普通的菌株中扩增，整个过程是8-10天。用细菌株SW102作重组，从两步变成一步，并且只需要2-3天时间。不仅仅是时间的缩短，实验步骤也大大简化。试验试剂也只需原来的1/5-1/8。用新的菌株和方法重组整个成本也会降低，是现有技术的1/5-1/8。
第三、高通量穿梭载体的构建。现有的技术是每次做一个穿梭载体克隆。我们把50个不同的克隆合在一起，每次能得到30-35个穿梭载体克隆。依人类15，000个基因计算，如果一个一个做的话，需要15，000次克隆。如果用我们高通量的方式，只需要500-600次克隆。整个生产成本会是以往技术的1/10-1/20。不仅仅是生产成本，生产时间会是以往技术的1/5-1/10。
第四、高通量腺病毒重组。与高通量穿梭载体的构建相似，最后腺病毒的重组也是把50个不同的克隆合在一起。其效率增加20-30倍，其成本是现有技术的1/10-1/20。采用现有技术，把人类所有的基因制成腺病毒粒子是不太可能的。利用我们新的高通量技术，人类所有的基因可以在6-10个月内制成腺病毒粒子。其成本和时间只是以往技术的1/10。
第五、含有ISceI的腺病毒骨架载体。用现有的技术重组，50%以上的菌落是不正确的重组，重组效率低。用新的腺病毒载体，重组成功率在90%以上。高成功率是我们高通量重组的前提。现有的技术和载体不能用来做高通量重组。
附图说明
图1为穿梭载体图谱。
图2为腺病毒骨架载体图谱。
图3为传统的穿梭载体构建和本发明高通量穿梭载体构建程序和时间比较。
图4为传统腺病毒重组和本发明高通量腺病毒重组程序和时间比较。
图5为所用人全基因组ORF引物。
图6 为NM_000632克隆序列和源基因序列的对比。Query:本发明克隆获得的序列；Sbjct：人NM_000632序列
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明予以进一步说明，应当说明的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求的保护范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，
通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，分子克隆实验指南(第三版)或按照制造厂商的操作指南所建议的方法进行。
实施例1.穿梭载体pCMV-FH
本发明穿梭载体pCMV-FH是在pCMV-Shuttle的基础上采用常规分子生物学技术改造而成的，具体的步骤是：
（1）.缩短左、右同源臂。将载体的左面和右面的重组序列缩短成800个碱基。保留了原质粒1243-2043碱基的右面同源臂和3545-4428碱基的左面的同源臂。采用普通分子生物学引物设计方法来设计引物。在PCR引物两端加入一个PmeI酶切点。PCR扩增之后，把PCR产物自连，然后转化感受态细胞，小提和测序。
（2）.在PmeI酶切点加入一个嘌呤霉素Puromycin基因。把Puromycin的基因、SV40启动子和BGH PolyA 信号，进行体外基因合成。合成产物用PmeI酶切之后，连接到PmeI酶切的缩短后的穿梭载体。该结构的两端除了原有的PmeI酶切点以外，又加了一个IsceI酶切点在PmeI之内。
（3）.外源基因插入酶切点的改变。把基因片段、含有T7细菌启动子、Kozak序列和用来插入外源基因的5个酶的组合：AsiSI/MluI，AsiSI/RsrII，AsiSI/NotI，AscI/MluI，AsiSI/XhoI，以及His和Flag标签合成之后，用KpnI/XbaI酶切，然后连接到KpnI/XbaI酶切的上述穿梭载体。
（4）.SwaI酶切点的插入。PacI酶切点旁边增加一个SwaI酶切点和BstBI酶切点。首先在PacI交界处设计PCR引物，该引物加上了PacI和BstBI。然后用两对引物和上述穿梭载体做PCR扩增。PCR产物在纯化之后，酶连接，转化大肠杆菌，小提，和序列分析。
实施例2.高通量穿梭克隆的构建
采用常规分子生物学技术改造而成完成的，具体的步骤是：
(1）.PCR用的全长DNA模板（人类全长基因来自：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/的RefSeq数据库）先排列到96孔PCR盘上。3万个ORF引物（购自美国Eurofins/MWG/Operon生物公司，基因及相应引物见附图5）也按照DNA模板的顺序设计。
(2）.以96孔板的模式对15，000个现有的克隆(12，000个来自美国国家健康总署，3，000个来自青岛麦克利生物科技有限公司)进行扩增。为减少PCR过程中的突变，每个基因只扩增15个回合，并且应用高保真聚合酶。（实施例3以NM_000632基因为例对人类全基因组基因PCR进行详细说明）
(3）.根据ORF的大小，每个PCR产物取2微升，把50个大小相似的基因合到一个试管，然后纯化。
(4）.按照酶切点酶切，琼脂胶分离，纯化。
(5）.连接到穿梭载体pCMV-FH并转化感受态细胞。
(6）.挑96 个菌体，用96孔深孔板细胞培养，质粒小提和测序。
(7）.5′端的序列与原来50个ORF的序列对比。
(8）.5′端正确的克隆，然后进行3′端测序。
(9）.5′和3′端都正确的克隆确定为克隆到穿梭载体的克隆。一次能得到30-35个正确的穿梭载体克隆。
实施例3. 人NM_000632基因的克隆
本发明以NM_000632基因为例对人类全基因组基因PCR进行说明，5‘端引物名：NM_000632_SgfI,序列为：GAGAGCGATCGCCATGGCTCTCAGAGTCCTTCTG（SEQ ID NO.2）； 3‘端引物名：NM_000632_MluI，序列为：GAGAACGCGTCTGGGGTTCGGCCCCCGGGGGAC (SEQ ID NO.3)。
（1）采用Fisher Scientific的Phusion高保真酶进行PCR反应。
PCR反应体系30μl
FastStart High Fidelity buffer,5× 6μl
Nucleotide Mix,2.5mM each 2.4μl
Downstream Primer (10μM) 1μl
Upstream Primer(10μM) 1μl
DNA 2μl
Phusion High Fidelity Enzyme Blen(5U/μL) 0.3μl
Water，PCR-Grade up to 30μl
PCR反应条件： 98℃预变性 1 min；98℃变性 20 sec，60℃退火 30 sec，72℃延伸 6 min，15个循环；72℃保温 10min；扩增结束后取部分PCR 产物进行琼脂糖胶检验扩增条带。
（2）PCR产物纯化
采用Roche公司的High pure PCR product purification 试剂盒进行：
1）上述PCR反应结束后，将PCR产物转移至1.5ml离心管中，加无菌去离子水至100μL，加500μl Binding buffer，充分混匀；
2）将过滤柱插入收集管中，将步骤1的溶液全部转移到柱子里，最大转速（至少13,000×g），离心30-60 sec；
3）弃掉收集管中的液体，再将过滤柱插入原收集管中，向柱中加入500μl Wash buffer，最大转速（至少13,000×g），离心1min；
4）弃掉收集管中的液体，再将过滤柱插入原收集管中，向柱中加入200μl Wash buffer，最大转速（至少13,000×g），离心1min；
5）弃掉收集管，将过滤柱插入新的1.5ml离心管中，向柱中加入50-100μl 无菌去离子水，最大转速（至少13,000×g），离心1min；
6）离心管中的即为纯化后的PCR产物。
（3）将纯化后的PCR产物(SEQ ID NO.1)测序表明，该PCR产物与NM_000632基因完全一致（如附图6所示），说明本方法可以成功扩增人类基因。
实施例4. 将表达ISceI的酵母基因克隆进腺病毒骨架载体
（1）骨架载体的构建。首先采用普通分子生物学方法来设计两个PCR引物，两个PCR引物中间加入一个PmeI酶切点，把一个含有左面和右面腺病毒基因组500个碱基（为pAdEasy右面同源臂：3716-4216碱基；左面同源臂：32971-33471碱基）和整个质粒载体的片段PCR扩增，纯化，然后进行自身连接，转化，小提，测序和序列分析。
（2）IsceI引物设计。引物采用普通分子生物学引物设计方法来设计。5’端的引物含有一个常用的细菌的启动子——NEOKAN_promoter（CCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAG
GTTGGGAAGCCCTGCAA）以及24个与IsceI 5’端碱基配对的序列；3’端序列含有一个常用的PolyA信号序列和与IsceI3’端配对的序列。同时在两个引物的两端加了一个BsaI酶切点，确使酶切之后产生与KasI酶切点匹配的序列。
（3）PCR扩增。用以上两个引物和一个合成的IsceI模板作PCR扩增，30个回合。
（4）PCR产物纯化，酶切。PCR之后，用PCR纯化柱子作纯化，然后用BsaI 酶切2小时。最后用琼脂胶分离纯化。
（5）骨架载体酶切。用KasI把第(1)步的骨架载体酶切，去磷酸化，然后琼脂胶分离，纯化。
（6）酶连接，转化，确定。把第（4）步和第（5）步的酶切的IsceI片段和骨架载体酶连接过夜，然后进行转化大肠杆菌感受态细胞,小提之后进行酶切鉴定和测序分析。
（7）腺病毒载体酶切。用PacI/ClaI两个酶把腺病毒中的骨架载体切除，并进行琼脂胶分离，纯化。
（8）插入到原来的腺病毒载体。把含有IsceI片段的骨架载体用PmeI线性化之后，和第（7）步的PacI/ClaI酶切的腺病毒载体在SW102细胞中重组。
（9）序列分析鉴定。重组后的菌体进行过夜培养，小提和测序。最终的克隆经过酶切鉴定，确定整个克隆的完整性和IsceI片段的存在。
实施例5. 腺病毒骨架载体转染到细菌株SW102（美国国家健康总署）里面
（1）.从-70度冰箱取出保存的细菌株，划在不含有抗生素的琼脂盘上，32度培养箱中培养过夜（20-24小时）。
（2）.第二天傍晚接种单独的菌体到2毫升不含抗生素的培养液中，放到32度摇床培养箱中培养过夜（15-18小时）。
（3）.制备电转染感受态细胞。
（4）.用50微升的电转染感受态细胞，加入0.5微升的腺病毒骨架载体。
（5）.电转化到细菌里面，并铺50微升的电转化溶液到氨苄西林Ampicillin（50ug/ml）的琼脂胶培养盘上，32度培养过夜（20-24小时）。
（6）.挑单个的菌体制作感受态细胞（实施例6），然后与穿梭载体重组（实施例7）。
实施例6．感受态细胞的制备
将实施例5里得到的已经转染进了腺病毒骨架载体的细菌株SW102，制作成感受态细胞。具体步骤如下：
(1）.制感受态细胞的前一天傍晚，用单个菌体或2-3个菌体接种2-3 毫升CircleGrow 培养液 (50ug/ml ampicillin)。
(2）.第二天一早用1毫升接种到100毫升新鲜的CircleGrow 培养液，放到摇床 (300rpm)一直摇到OD 0.3-0.4。
(3）.细胞长好之后，升温诱导重组酶的表达。
(4）.然后把培养好的细菌迅速在冰水中冷却到零度（用手在冰水中摇晃4-5分钟），之后放到冰上10-20分钟，同时把10%甘油也要放到冰上至少半小时。
(5）.离心细胞用1200g （根据离心机，用尽量低的速度）, 20分钟，离心机也要冷却到0-2度。
(6）.把上清液彻底倒掉，然后非常小心的用冷却好的100ml, 10% 的甘油冲洗一次；小心地用移液管把沉淀的细胞搅起。
(7）.需要用100ml 10%的甘油再冲洗一次（共两次）。
(8）.最后加入2毫升10%甘油，每个1.5ml试管可以分装40微升的细胞.事先把需要的试管放到冰上冷却或放到-20度冰箱冷却。
(9）.用酒精干冰浴迅速冷冻细胞5分钟，然后在-80度冰箱保存。
实施例7．高通量腺病毒载体的重组
(1）.根据ORF的大小，把50个不同的穿梭克隆合到一起， PmeI酶切，或者ISceI酶切线性化。
(2）.琼脂胶分离，纯化。
(3）.转化到实施例6制好的感受态细胞中。
(4）.挑96个菌体，96孔板细胞培养，质粒小提，测序。
(5）.PacI酶切验证和序列分析。
(6）.PacI酶切正确和测序正确的为重组正确的克隆。一次重组能得到30-35个正确的腺病毒克隆。
实施例8.电转导法进行重组
穿梭载体首先用PmeI或IsceI酶切，然后琼脂胶电泳分离，纯化。电转导重组的程序跟一般的方法一样。
(1）.首先把1.5毫升微试管和电转导的Cuvettes放到冰上冷却。
(2）.从-80度冰箱中取出实施例6制备好的感受态细胞，并在冰上让细胞溶化。
(3）.用移液枪分装40微升感受态细胞到每一个事先冷却好的试管中。
(4）.用移液枪加入2微升琼脂胶纯化的穿梭载体到每一个试管，混匀，并保持在冰上。
(5).把电转仪设在以下程序：200Ω, 2.5kV, 25μF或根据生产厂家的要求设置。
(6).用移液枪把感受态细胞轻轻的转移到事先冷却好的Cuvette中，避免产生汽泡。
(7).轻轻将Cuvette滑到电转化的槽中，确信Cuvette两边的金属与电转化槽的金属接触。
(8).按住电转仪的按钮，电击一次，并迅速加入1毫升事先热到37度的SOC培养基。
(9).用移液枪把电转化后的细胞转移到15毫升的试管中在合适的温度培养60分钟，摇床速度设在250转/分。
(10).把100微升培养后的电转化细胞铺到平板上（卡那霉素Kanamycin 30微克/毫升）过夜，或培养18-24小时。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东维真生物科技有限公司
<120> 一种新的腺病毒载体及其生产方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3459
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
atggctctca gagtccttct gttaacagcc ttgaccttat gtcatgggtt caacttggac 60
actgaaaacg caatgacctt ccaagagaac gcaaggggct tcgggcagag cgtggtccag 120
cttcagggat ccagggtggt ggttggagcc ccccaggaga tagtggctgc caaccaaagg 180
ggcagcctct accagtgcga ctacagcaca ggctcatgcg agcccatccg cctgcaggtc 240
cccgtggagg ccgtgaacat gtccctgggc ctgtccctgg cagccaccac cagcccccct 300
cagctgctgg cctgtggtcc caccgtgcac cagacttgca gtgagaacac gtatgtgaaa 360
gggctctgct tcctgtttgg atccaaccta cggcagcagc cccagaagtt cccagaggcc 420
ctccgagggt gtcctcaaga ggatagtgac attgccttct tgattgatgg ctctggtagc 480
atcatcccac atgactttcg gcggatgaag gagtttgtct caactgtgat ggagcaatta 540
aaaaagtcca aaaccttgtt ctctttgatg cagtactctg aagaattccg gattcacttt 600
accttcaaag agttccagaa caaccctaac ccaagatcac tggtgaagcc aataacgcag 660
ctgcttgggc ggacacacac ggccacgggc atccgcaaag tggtacgaga gctgtttaac 720
atcaccaacg gagcccgaaa gaatgccttt aagatcctag ttgtcatcac ggatggagaa 780
aagtttggcg atcccttggg atatgaggat gtcatccctg aggcagacag agagggagtc 840
attcgctacg tcattggggt gggagatgcc ttccgcagtg agaaatcccg ccaagagctt 900
aataccatcg catccaagcc gcctcgtgat cacgtgttcc aggtgaataa ctttgaggct 960
ctgaagacca ttcagaacca gcttcgggag aagatctttg cgatcgaggg tactcagaca 1020
ggaagtagca gctcctttga gcatgagatg tctcaggaag gcttcagcgc tgccatcacc 1080
tctaatggcc ccttgctgag cactgtgggg agctatgact gggctggtgg agtctttcta 1140
tatacatcaa aggagaaaag caccttcatc aacatgacca gagtggattc agacatgaat 1200
gatgcttact tgggttatgc tgccgccatc atcttacgga accgggtgca aagcctggtt 1260
ctgggggcac ctcgatatca gcacatcggc ctggtagcga tgttcaggca gaacactggc 1320
atgtgggagt ccaacgctaa tgtcaagggc acccagatcg gcgcctactt cggggcctcc 1380
ctctgctccg tggacgtgga cagcaacggc agcaccgacc tggtcctcat cggggccccc 1440
cattactacg agcagacccg agggggccag gtgtccgtgt gccccttgcc cagggggagg 1500
gctcggtggc agtgtgatgc tgttctctac ggggagcagg gccaaccctg gggccgcttt 1560
ggggcagccc taacagtgct gggggacgta aatggggaca agctgacgga cgtggccatt 1620
ggggccccag gagaggagga caaccggggt gctgtttacc tgtttcacgg aacctcagga 1680
tctggcatca gcccctccca tagccagcgg atagcaggct ccaagctctc tcccaggctc 1740
cagtattttg gtcagtcact gagtgggggc caggacctca caatggatgg actggtagac 1800
ctgactgtag gagcccaggg gcacgtgctg ctgctcaggt cccagccagt actgagagtc 1860
aaggcaatca tggagttcaa tcccagggaa gtggcaagga atgtatttga gtgtaatgat 1920
caggtggtga aaggcaagga agccggagag gtcagagtct gcctccatgt ccagaagagc 1980
acacgggatc ggctaagaga aggacagatc cagagtgttg tgacttatga cctggctctg 2040
gactccggcc gcccacattc ccgcgccgtc ttcaatgaga caaagaacag cacacgcaga 2100
cagacacagg tcttggggct gacccagact tgtgagaccc tgaaactaca gttgccgaat 2160
tgcatcgagg acccagtgag ccccattgtg ctgcgcctga acttctctct ggtgggaacg 2220
ccattgtctg ctttcgggaa cctccggcca gtgctggcgg aggatgctca gagactcttc 2280
acagccttgt ttccctttga gaagaattgt ggcaatgaca acatctgcca ggatgacctc 2340
agcatcacct tcagtttcat gagcctggac tgcctcgtgg tgggtgggcc ccgggagttc 2400
aacgtgacag tgactgtgag aaatgatggt gaggactcct acaggacaca ggtcaccttc 2460
ttcttcccgc ttgacctgtc ctaccggaag gtgtccacgc tccagaacca gcgctcacag 2520
cgatcctggc gcctggcctg tgagtctgcc tcctccaccg aagtgtctgg ggccttgaag 2580
agcaccagct gcagcataaa ccaccccatc ttcccggaaa actcagaggt cacctttaat 2640
atcacgtttg atgtagactc taaggcttcc cttggaaaca aactgctcct caaggccaat 2700
gtgaccagtg agaacaacat gcccagaacc aacaaaaccg aattccaact ggagctgccg 2760
gtgaaatatg ctgtctacat ggtggtcacc agccatgggg tctccactaa atatctcaac 2820
ttcacggcct cagagaatac cagtcgggtc atgcagcatc aatatcaggt cagcaacctg 2880
gggcagagga gcctccccat cagcctggtg ttcttggtgc ccgtccggct gaaccagact 2940
gtcatatggg accgccccca ggtcaccttc tccgagaacc tctcgagtac gtgccacacc 3000
aaggagcgct tgccctctca ctccgacttt ctggctgagc ttcggaaggc ccccgtggtg 3060
aactgctcca tcgctgtctg ccagagaatc cagtgtgaca tcccgttctt tggcatccag 3120
gaagaattca atgctaccct caaaggcaac ctctcgtttg actggtacat caagacctcg 3180
cataaccacc tcctgatcgt gagcacagct gagatcttgt ttaacgattc cgtgttcacc 3240
ctgctgccgg gacagggggc gtttgtgagg tcccagacgg agaccaaagt ggagccgttc 3300
gaggtcccca accccctgcc gctcatcgtg ggcagctctg tcgggggact gctgctcctg 3360
gccctcatca ccgccgcgct gtacaagctc ggcttcttca agcggcaata caaggacatg 3420
atgagtgaag ggggtccccc gggggccgaa ccccagtag 3459
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagagcgatc gccatggctc tcagagtcct tctg 34
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagaacgcgt ctggggttcg gcccccgggg gac 33
Claims (8)
1.一种新的腺病毒载体，其特征在于，一是把外源的基因克隆到穿梭载体里面，二是穿梭载体和腺病毒骨架载体的重组，腺病毒骨架载体内克隆进了一个表达ISceI的酵母基因。
2.如权利要求1所述的一种新的腺病毒载体，其特征在于，所述的外源基因为哺乳动物的基因，或为人类的基因。
3.如权利要求1所述的一种新的腺病毒载体，其特征在于，所述的穿梭载体是pCMV-FH。
4.如权利要求3所述的一种新的腺病毒载体，其特征在于，所述的pCMV-FH是对pShuttle-CMV载体的改造而得，包括在PacI的外面添加SwaI酶切位点，在PmeI之内添加IsceI酶切位点，和外源基因插入酶切点的改变；所述的外源基因插入酶切点的改变是把T7细菌启动子、Kozak序列和用来插入外源基因的5个酶的组合：AsiSI/MluI，AsiSI/RsrII，AsiSI/NotI，AscI/MluI，AsiSI/XhoI，以及His和Flag标签合成之后，用KpnI/XbaI酶切，然后连接到KpnI/XbaI酶切的穿梭载体上；对pShuttle-CMV载体的改造还包括缩短左、右同源臂和在5’端增加了一个Kozak序列；对pShuttle-CMV载体的改造还包括插入嘌呤霉素Puromycin基因、SV40启动子和BGH PolyA 信号。
5.一种权利要求1所述新的腺病毒载体的生产方法，其特征在于，穿梭载体克隆方法及穿梭载体和腺病毒骨架载体的重组方法均采用高通量的生产方法。
6.如权利要求5所述新的腺病毒载体的生产方法，其特征在于，所述的高通量穿梭载体的克隆方法是：首先将人类每个基因的ORF用PCR进行扩增，然后把50个大小相似的ORF的PCR产物合到一起，酶切，连接到穿梭载体；转化，细菌培养后，挑96个菌体，质粒小提，进行测序和序列分析；一个96孔板可以得到30-35个不同的克隆，第一轮就能把9，000-10，000个人源的基因克隆到穿梭载体内；对第一轮没有克隆到的基因，根据大小重新把50个克隆合到一起，酶切，连接和转化；重复操作至第五轮就可以把99%的基因克隆到穿梭载体内。
7.如权利要求5所述新的腺病毒载体的生产方法，其特征在于，所述的高通量的穿梭载体和腺病毒骨架载体的重组方法是：首先将50个不同的穿梭载体克隆合到一起，用PmeI或ISceI酶切线性化之后，转化到含有腺病毒载体的感受态细菌之内；平板过夜培养，然后挑96个菌体作质粒小提，测序和序列分析；一次转化和96样品分析可以获得30-35个不同的重组腺病毒克隆；对第一次没有得到重组的克隆，再合到一起进行第二轮的重组；以此重复操作至第五轮就可以把99%的穿梭载体克隆重组到腺病毒载体之内。
8.如权利要求1所述的一种新的腺病毒载体，其特征在于，所述的腺病毒载体可用来做成基因芯片。
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2013
- 2013-03-18 CN CN 201310064880 patent/CN103146753B/zh active Active
Patent Citations (2)
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Denomination of invention: A new adenovirus vector and its production method Effective date of registration: 20211124 Granted publication date: 20131218 Pledgee: Bank of China Limited Jinan Quancheng Branch Pledgor: MACLEE TECHNOLOGY Inc. Registration number: Y2021980013122 |
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