CN107529550A - 一种基于PiggyBac载体的CD‑19‑CAR‑T系统构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于PiggyBac载体的CD‑19‑CAR‑T系统构建方法：根据PiggyBac载体的特性，查找CD19的单链抗体可变区(scFv)基因片段序列，并设计合成包括来源于CD19抗原特异性的抗体重链和轻链可变区片段由中间连接分子相连组成的单链抗体scFv，中间片段由CD8来源的连接和穿膜片段组成，膜内片段由传递信号的效应分子如CD3ζ组成，将合成的目的基因连接到pMD 18‑T simple vector上，采用酶切、连接和转化的方法，将目的基因连接到PiggyBac载体上，得到目的基因。

Description

一种基于PiggyBac载体的CD-19-CAR-T系统构建方法

技术领域

本发明涉及CD-19-CAR-T系统构建技术，特别是涉及一种基于PiggyBac载体的CD-19-CAR-T系统构建方法。

背景技术

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)是近年来发展起来的新的过继免疫细胞治疗手段，通过基因工程手段修饰T细胞，使其表达嵌合抗原受体，嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。CAR分子大致可分为5代演变：I代，特异性T细胞激活；II代，增加共刺激因子，提高细胞毒性；III代，同时具有两个共刺激因子，提高T细胞增殖能力与杀伤毒性；IV代，整合自杀基因，精确调控，细胞因子释放(如IL-7，IL-15)激活等；V代，通用型CAR。与普通的免疫细胞治疗相比，CAR-T技术具有许多独特的优势，如CAR能非MHC依赖性识别肿瘤抗原，不需要经过APC。肿瘤表面蛋白类和脂类抗原都可以作为靶点；有共刺激分子，能有效增强T细胞增殖。因此该技术被认为是有望彻底攻克人类癌症的独特方法。

目前，CAR-T免疫治疗已在许多临床实验上取得巨大进展。其中，针对B相关抗原CD19阳性的B细胞恶性肿瘤，如急性B-淋巴细胞白血病(B-ALL)，慢性B-淋巴细胞白血病(B-CLL)，B细胞霍奇金氏淋巴瘤(B-HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)，CAR-T-CD19T细胞免疫治疗疗效显著，已有报告显示CAR-T-CD19治疗在成人和儿童复发和难治性B-ALL中可以获得高达90％的完全缓解率(Complete remission，CR)。研究报告也显示，几种用不同结构设计的CAR-CD19的临床试验治疗都显示了相似的良好疗效。有些患者经CAR-T治疗后还获得了持久性缓解，不需要额外的其他治疗。

尽管如此，该治疗仍有许多环节需要改进，如能否找到更好的受体、更好的载体、更好的协同刺激分子等，其中转染载体的安全性和有效性对于临床治疗尤为关键。现今，CAR主要的转染模式包括，慢病毒、逆转录病毒、电转染等方式，病毒载体尽管具有较好的转染效率，但存在因基因组整合引起插入突变的风险，因此，利用非病毒载体结合电转技术，不需要病毒的介入，可获得与病毒感染效率相当甚至更高的转染结果，避免了病毒核酸随机插入宿主细胞，影响细胞正常生长以及后续可能的病变，是提升CAR-T细胞疗法的安全性的重要环节。

PiggyBac(PB)系统是利用PB转座子特有的“剪切和粘贴”机制，使DNA片段在载体和基因组之间“自由”的转移，从而有效介导外源DNA片段对基因组的整合。转座时，转座酶有效的识别特异的转座子序列(ITRs)，与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，“剪切”后脱离，“粘贴”至基因组的TTAA位点。作为一种新的转基因手段，PiggyBac系统具有许多优势：(1)、与病毒载体相比有安全性高、操作方便、成本低等优点；(2)、整合效率高及更高的目的基因表达概率；(3)、负载容量大，更大的目的片段的插入，可实现多基因的共表达；(4)、转基因可长期稳定地表达，转座后没有引起染色体重排等不稳定现象；(5)、更“精确”拷贝数的插入；(6)、再次转座后可自由移除插入片段，实现精确切离；(7)、可用非损伤性的可见标记代替PCR等传统方法在活体中跟踪转基因；(8)、宿主范围广，转座效率高，且基本不依赖于宿主因子。因此，PB转座系统不仅可作为哺乳动物及培养细胞的转基因工具，也是一种较为理想的非病毒类基因治疗载体。基于上述的优势，利用PiggyBac载体构建CD-19-CAR-T势在必行。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于PiggyBac载体的CD-19-CAR-T系统构建方法。

其采用的技术方案如下：

一种基于PiggyBac载体的CD-19-CAR-T系统构建方法：根据PiggyBac载体的的特性，查找CD19的单链抗体可变区(scFv)基因片段序列，并设计合成包括来源于CD19抗原特异性的抗体重链和轻链可变区片段由中间连接分子相连组成的单链抗体scFv，中间片段由CD8来源的连接和穿膜片段组成，膜内片段由传递信号的效应分子如CD3ζ组成，将合成的目的基因连接到pMD 18-T simple vector上，采用酶切、连接和转化的方法，将目的基因连接到PiggyBac载体上，并进行测序来检测合成的目的基因序列是否正确，接着将连接产物转入到大肠杆菌感受态TOP10中，使含有目的片段的PiggyBac载体在大肠杆菌中大量扩增，得到目的基因。

所述片段设计和合成方法为：通过设计并合成CD19-CAR片段，该片段主要包括对CD19抗原具有特异性的单链抗体片段scFv，myc-tag，CD8来源的跨膜铰链，共刺激因子CD28和4-1BB片段，及细胞内传递信号CD3ζ，然后将CD19-CAR连接到Piggybac载体上。

所述目的基因的基因序列SEQ ID NO.1：

本发明的有益效果为：

采用非病毒类载体PiggyBac系统，避免了使用病毒载体存在的安全隐患，具有更高的安全性和有效性，更加适用于临床治疗。

采用的Nucleofector细胞核技术，能够将外源基因直接导入到细胞核，克服了脂质体转染和普通电穿孔，必须依赖细胞分裂时才有可能使外源基因入核表达的缺陷，细胞具有更高的存活率和增殖效率。

附图说明

图1为本发明基于PiggyBac载体的CD-19-CAR-T质粒设计简图；

图2为本发明阳性克隆进行酶切鉴定图；

图3为本发明测序验证的部分基因序列；

图4为本发明CAR-CD19转染效率、鉴定及分选示例图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的详细描述。

实例1

基于PiggyBac非病毒载体的CD-19-CAR-T的构建方法：根据PiggyBac载体的的特性，查找CD19的单链抗体可变区(scFv)基因片段序列，并设计合成包括来源于CD19抗原特异性的抗体重链和轻链可变区片段由中间连接分子相连组成的单链抗体(single-chainvariable fragment,scFv)，中间片段由CD8来源的连接和穿膜片段组成，膜内片段由传递信号的效应分子如CD3ζ组成。将合成的目的基因连接到pMD 18-T simple vector上，采用酶切、连接和转化的方法，将目的基因连接到PiggyBac载体上，使用载体特异性引物进行PCR扩增并测序来检测合成的目的基因序列是否正确，接着将连接产物转入到大肠杆菌感受态TOP10中，使含有目的片段的PiggyBac载体在大肠杆菌中大量扩增。所述片段设计合成方法为：通过设计合成CD19-CAR片段，该片段主要包括对CD19抗原具有特异性的单链抗体片段scFv，myc-tag，CD8来源的跨膜铰链，共刺激因子CD28和4-1BB片段，及细胞内传递信号CD3ζ，然后将CD19-CAR连接到Piggybac载体上。

构建成功后采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取质粒。取人血清，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，并加入T淋巴细胞培养液，INF-γ，OKT-3和hIL-2进行扩展培养。采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac-CAR-CD19和Piggybac Transposase到T细胞，48小时后，收集细胞，myc-tag荧光抗体标记，使用流式细胞仪坚持CD19-CAR的表达。

构建后的基因时序图如图1所示，实验证明基因序列与设计合成的基因序列完全一致。

目的基因如下：所述目的基因的基因序列SEQ ID NO.1：

SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征

(A)长度：7827bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

图2是构建后挑选阳性克隆进行酶切鉴定图，

图3为验证的部分基因序列。其验证结果的基因序列为：SEQ ID NO.2的信息：

(i)序列特征

(A)长度：285bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

图4是CAR-CD19在T细胞表面表达、鉴定和分选。

从图4中可以得出：

患者1：转染后的CD19-CAR-T为18.7％，磁珠分选选择CD19+CAR T细胞，可以达到81.7％。

患者2：转染后的CD19-CAR-T为15.3％，磁珠分选选择CD19+CAR T细胞，可以达到58.3％。

试验中，淋巴细胞分离液，T淋巴细胞培养液为美国Invitrogen公司产品，Nucleofector细胞转染试剂购自Lonza公司，INF-γ，OKT-3和hIL-2抗体购自PeproTech公司，Myc-tag抗体购自Cell signaling公司，无内毒素质粒大抽试剂盒和凝胶回收试剂盒均购自美国Zymo research公司，PCR试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，各种内切酶和T4连接酶均购自NEB公司。

以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照以上实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种基于PiggyBac载体的CD-19-CAR-T系统构建方法：其特征在于，根据PiggyBac载体的的特性，查找CD19的单链抗体可变区(scFv)基因片段序列，并设计合成包括来源于CD19抗原特异性的抗体重链和轻链可变区片段由中间连接分子相连组成的单链抗体scFv，中间片段由CD8来源的连接和穿膜片段组成，膜内片段由传递信号的效应分子如CD3ζ组成，将合成的目的基因连接到pMD 18-Tsimple vector上，采用酶切、连接和转化的方法，将目的基因连接到PiggyBac载体上，并进行测序来检测合成的目的基因序列是否正确，接着将连接产物转入到大肠杆菌感受态TOP10中，使含有目的片段的PiggyBac载体在大肠杆菌中大量扩增，扩增后得到目的基因。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：通过设计合成CD19-CAR片段，该片段主要包括对CD19抗原具有特异性的单链抗体片段scFv，myc-tag，CD8来源的跨膜铰链，共刺激因子CD28和4-1BB片段，及细胞内传递信号CD3ζ，然后将CD19-CAR连接到Piggybac载体上。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述目的基因的基因序列SEQ IDNO.1：