JP6006906B1 - 皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法 - Google Patents

皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法 Download PDF

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Abstract

迅速かつ精度よく、しかも皮脂腺及び毛包選択的にアンドロゲン受容体の活性を制御するための物質を探索する方法の提供。（Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；（Ｂ）該細胞におけるＨＩＦ１αの活性を測定すること；（Ｃ）該（Ｂ）で測定した活性を、対照群におけるＨＩＦ１αの活性と比較すること；及び、（Ｄ）該（Ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＨＩＦ１αの活性を制御する効果を評価すること、を含む皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法。

Description

本発明は、皮脂腺又は毛包選択的にアンドロゲン受容体の活性を制御するための物質を探索する方法に関する。
アンドロゲン受容体（ＡＲ）は、ミネラルコルチコイド（ｍｉｎｅｒａｌｏｃｏｒｔｏｃｏｉｄ）受容体（ＭＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、およびグルココルチコイド受容体（ＧＲ）を含むステロイドホルモン受容体サブファミリーの一部である。内因性ステロイド性アンドロゲン（例、テストステロン及び５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ））は、主要な循環性ホルモンであり、二次性徴を促すほか、様々な生理学的プロセスの調節に重要な役割を果たす。アンドロゲンの皮膚における役割については、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の経口投与が高齢者の皮膚の状態を改善したこと、及び皮膚へのＤＨＥＡ局所投与により、通常は皮脂量が減少する閉経後女性で皮脂量が増加したことが報告されている（非特許文献１）。さらに、アンドロゲン受容体阻害剤を摂取した場合に、頭頂部の毛髪の成長は促進する一方で、それ以外の体毛の成長は阻害され、さらに皮脂分泌量は減少すること、他方、アンドロゲンを摂取した場合では、頭頂部の毛髪の成長は阻害される一方で、それ以外の体毛の成長は促進され、さらに皮脂分泌量は増加することが報告されており、これらのことから、アンドロゲンは皮脂腺と毛に関する特性を包括的に制御していると考えられている（非特許文献２、３）。これまでに、アンドロゲン受容体活性の阻害によりニキビ、脱毛症、又は多毛症を改善するための物質が開発されてきた（非特許文献４、５）。
しかしながら、アンドロゲン受容体活性の阻害は、性腺機能低下による副作用、例えば月経不順、男性の乳房肥大化、精巣萎縮症、性機能不全（精巣、乳腺、子宮、卵巣などの性腺の機能不全）などを生じ得ることから、米国においては、上記皮脂腺と毛の症状の改善のためのアンドロゲン受容体活性阻害剤の使用は認められていない。このため、性腺機能低下による副作用のない、皮脂腺及び毛包組織に選択的なアンドロゲン受容体活性制御剤が望まれている。
ＨＩＦ１α（ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １，ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ）は、低酸素により発現誘導される分子であり、エネルギー代謝、血管新生、アポトーシスなどに関与する多くの遺伝子の転写を活性化することで、細胞の低酸素応答のマスター調節因子として機能している。免疫系において、ＨＩＦ１αが好中球のアポトーシスによる細胞死を抑制する効果を有することが報告されている（非特許文献６）。皮膚において、ＨＩＦ１αが創傷治癒やバリア機能を制御していることも報告されている（非特許文献７）。また、低酸素環境下での解糖系酵素群の発現上昇をＨＩＦ１αが誘導することが報告されている（非特許文献８）。さらにヒトの皮脂腺は、酸素濃度が０．１％〜１．３％と著しく低く、ＨＩＦ１αが発現していることが報告されている（非特許文献９、１０）。しかしながら、皮脂腺及び毛包におけるアンドロゲン受容体と、ＨＩＦ１α又は解糖系酵素との関係は知られていない。
（非特許文献１）Maturitas, 2008, 59:174-181
（非特許文献２）Dermatol Ther, 2008, 21:314-328
（非特許文献３）J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85:2913-2921
（非特許文献４）Cochrane database of systematic reviews, 2001, CD000194
（非特許文献５）Br J Dermatol, 2005, 152:466-473
（非特許文献６）J Exp Med, 2005, 201:105-115
（非特許文献７）J invest Dermatol, 2011, 131:1793-1805
（非特許文献８）Mol Cell, 2010, 40:294-309
（非特許文献９）J Invest Dermatol, 2006, 126:2596-2606
（非特許文献１０）J Invest Dermatol, 2007, 127:2445-2452
本発明は、以下を含む皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法を提供する。
（Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；
（Ｂ）該細胞におけるＨＩＦ１αの活性を測定すること；
（Ｃ）該（Ｂ）で測定した活性を、対照群におけるＨＩＦ１αの活性と比較すること；及び、
（Ｄ）該（Ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＨＩＦ１α活性を制御する効果を評価すること
また本発明は、以下を含む皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法を提供する。
（Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；
（Ｂ’）該細胞におけるＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を測定すること；
（Ｃ’）該（Ｂ’）で測定した活性を、対照群における該因子の活性と比較すること；及び、
（Ｄ’）該（Ｃ’）の結果に基づいて、被験物質の該因子の活性を制御する効果を評価すること
また本発明は、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、あるいは多毛症予防又は改善剤を提供する。
また本発明は、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、あるいは多毛症予防又は改善剤の製造のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用を提供する。
また本発明は、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制、皮脂分泌抑制、ニキビ予防又は改善、脱毛症予防又は改善、あるいは多毛症予防又は改善のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の非治療的使用を提供する。
また本発明は、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制、皮脂分泌抑制、ニキビ予防又は改善、脱毛症予防又は改善、あるいは多毛症予防又は改善に使用するための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を提供する。
また本発明は、対象の皮脂腺細胞又は毛包細胞に、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を投与することを含む、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制方法、皮脂分泌抑制方法、ニキビ予防又は改善方法、脱毛症予防又は改善方法、あるいは多毛症予防又は改善方法を提供する。
解糖系酵素の発現がＡＲ活性に及ぼす影響。 解糖系酵素群の発現に対するＨＩＦ１αの影響。 皮脂腺細胞（ＳＺ９５）におけるＡＲ活性に対するＨＩＦ１αの影響。 前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）におけるＡＲ活性に対するＨＩＦ１αの影響。 レチノイン酸添加によるＨＩＦ１α活性変化。
発明の詳細な説明
本明細書において、「ＨＩＦ１α（ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １，ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ）」とは、ＯＭＩＭに６０３３４８、ＧｅｎｂａｎｋにＮＧ＿０２９４７０．１として登録されているタンパク質、そのホモログ、パラログ又はオルソログをいう。好ましくは、本明細書における「ＨＩＦ１α」とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、低酸素により発現誘導されて転写因子として機能するタンパク質をいう。ＨＩＦ１αは、核内へ移行した後に他のタンパク質とのヘテロ複合体を形成し、ＤＮＡ上のＨｙｐｏｘｉａ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＨＲＥ）と呼ばれる部位に結合することによって、細胞における様々な低酸素応答を誘導する。ＨＩＦ１αにより誘導される因子としては、解糖系酵素が挙げられる。解糖系酵素の例としては、ｅｎｏｌａｓｅ １、ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａ、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ １、ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、及びｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ １が挙げられ、これらはそれぞれ遺伝子ＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＰＧＫ１、ＧＰＩ及びＨＫ１にコードされている。
したがって本明細書において、「ＨＩＦ１αの活性」とは、ＨＩＦ１αによる転写活性をいう。ＨＩＦ１αによる転写活性は、ＨＩＦ１αのＨＲＥへの結合レベル、ＨＩＦ１α遺伝子の発現レベル、又はＨＩＦ１αタンパク質の発現レベルを検出することで測定することができる。
本明細書における「ＨＩＦ１α遺伝子」とは、上記「ＨＩＦ１α」をコードする遺伝子である。本明細書における「ＨＩＦ１α遺伝子」とは、好ましくは、ＧｅｎｂａｎｋにＮＧ＿０２９４７０．１として登録されている遺伝子、そのホモログ、パラログ又はオルソログをいい、より好ましくは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ低酸素により発現誘導され、かつ転写因子として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをいう。
本明細書における「ＨＩＦ１αに誘導される因子」（以下の本明細書において、「ＨＩＦ１α誘導性因子」ともいう）とは、ＨＩＦ１αによってその発現又は活性化が誘導される因子をいい、好ましくはｅｎｏｌａｓｅ １、ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａ、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ １、ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、及びｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ １からなる群より選択される解糖系酵素の少なくとも１種をいう。これらの解糖系酵素をコードする遺伝子としては、ＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＰＧＫ１、ＧＰＩ、及びＨＫ１が挙げられる。
ＥＮＯ１は、ＯＭＩＭ １７２４３０、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＧ＿０２９４７０．１として登録されている遺伝子である。好ましくは、本明細書における「ＥＮＯ１」とは、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ２−ホスホグリセリン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する酵素をコードするポリヌクレオチドをいう。
ＬＤＨＡは、ＯＭＩＭ １５００００、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＧ＿００８１８５．１として登録されている遺伝子である。好ましくは、本明細書における「ＬＤＨＡ」とは、配列番号４で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＬ−ｌａｃｔａｔｅとＮＡＤをｐｙｒｕｖａｔｅとＮＡＤＨに変換する酵素をコードするポリヌクレオチドをいう。
ＰＧＫ１は、ＯＭＩＭ ３１１８００、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＧ＿００８８６２．１として登録されている遺伝子である。好ましくは、本明細書における「ＰＧＫ１」とは、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ１，３−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅを３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅに変換する酵素をコードするポリヌクレオチドをいう。
ＧＰＩは、ＯＭＩＭ １７２４００、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＧ＿０１２８３８．２として登録されている遺伝子である。好ましくは、本明細書における「ＧＰＩ」とは、配列番号６で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅをｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅに変換する酵素をコードするポリヌクレオチドをいう。
ＨＫ１は、ＯＭＩＭ １４２６００、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＧ＿０１２０７７．１として登録されている遺伝子である。好ましくは、本明細書における「ＨＫ１」とは、配列番号７で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつｇｌｕｃｏｓｅをｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅに変換する酵素をコードするポリヌクレオチドをいう。
本明細書において、「ＨＩＦ１αに誘導される因子（又はＨＩＦ１α誘導性因子）の活性」とは、好ましくはｅｎｏｌａｓｅ １、ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａ、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ １、ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、及びｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ １からなる群より選択される解糖系酵素の少なくとも１種の活性をいう。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本明細書において、「脱毛症」とは、頭髪の減少や薄毛を特徴とする症状をいい、「多毛症」とは、ひげ、手足、体幹部などの毛が太く又は長くなることによる毛量の増加を特徴とする症状をいう。
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患もしくは状態の発症の防止、抑制または遅延、あるいは個体の疾患もしくは状態の発症の危険性を低下させることをいう。本明細書において、「改善」とは、疾患もしくは状態の好転、疾患もしくは状態の悪化の防止、抑制または遅延、あるいは疾患もしくは状態の進行の逆転、防止、抑制または遅延をいう。
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には、医師、又は医療従事者若しくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
本発明は、性腺のアンドロゲン受容体を介した副作用の心配がない、皮脂腺及び毛包選択的にアンドロゲン受容体の活性を制御するための物質を探索する方法の提供に関する。
本発明者らは、皮脂腺及び毛包において選択的にアンドロゲン受容体活性に寄与する分子を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、本発明者らは、ＨＩＦ１αが皮脂腺及び毛包において、性腺と比較して顕著に発現が高いこと、及びＨＩＦ１αが皮脂腺細胞及び毛包において、低酸素条件下でアンドロゲン受容体活性を正に制御することを見出した。すなわち、低酸素条件下での細胞のＨＩＦ１α活性レベルを指標とすることにより、皮脂腺及び毛包選択的にアンドロゲン受容体活性を制御することができるアンドロゲン受容体活性制御剤を評価又は選択できることを見出した。
本発明によれば、皮脂腺及び毛包選択的にアンドロゲン受容体の活性を制御する物質を探索することが可能である。本発明の方法により探索されたアンドロゲン受容体活性制御剤は、皮脂腺及び毛に関する症状の制御、例えば、皮脂分泌制御、ニキビ予防又は改善、脱毛症予防又は改善、多毛症予防又は改善、老人性乾皮症予防又は改善などに使用することができる。本発明の方法により探索されたアンドロゲン受容体活性制御剤は、性腺のアンドロゲン受容体を介した副作用を引き起こす危険性が低く、安全に使用することができる。
後述の実施例に示すとおり、ＨＩＦ１αの発現レベルは、性腺と比較して皮脂腺及び毛包において顕著に高かった（実施例１）。本発明者らは、ＨＩＦ１αが、低酸素条件下で皮脂腺のアンドロゲン受容体活性を正に制御することを見出した（実施例４）。また本発明者らは、ＨＩＦ１α活性化によって発現誘導される因子が、皮脂腺のアンドロゲン受容体活性を正に制御することを見出した（実施例２）。一方、アンドロゲンが皮脂腺や毛包に作用して皮脂分泌や毛成長に関与していることはよく知られている（例えば、非特許文献１、２）。したがって、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を変化させる物質は、皮脂腺細胞や毛包細胞選択的にアンドロゲン受容体の活性を変化させ、ひいては、皮脂腺又は毛包細胞におけるアンドロゲン受容体の活性化又は抑制によってもたらされる種々の状態、例えば、皮脂の過剰分泌や分泌減少、ニキビ、脱毛、多毛などを予防又は改善することができる。
本発明は、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を指標として、各種物質のアンドロゲン受容体活性制御作用を評価し、あるいはさらに当該評価に基づいて、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤、又は皮脂腺及び毛に関する症状の制御剤、例えば皮脂分泌制御剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、多毛症予防又は改善剤、老人性乾皮症予防又は改善剤などを選択する方法を提供する。本発明の評価又は選択方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われ得る。
したがって、本発明の一実施形態は、以下：
（Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；
（Ｂ）該細胞におけるＨＩＦ１αの活性を測定すること；
（Ｃ）該（Ｂ）で測定した活性を、対照群におけるＨＩＦ１αの活性と比較すること；及び、
（Ｄ）該（Ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＨＩＦ１αの活性を制御する効果を評価すること、
を含む皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法である。
また、本発明の別の一実施形態は、上記（Ａ）〜（Ｄ）を含む、皮脂分泌制御剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、多毛症予防又は改善剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤の評価又は選択方法である。
本発明のさらなる実施形態は、以下：
（Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；
（Ｂ’）該細胞におけるＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を測定すること；
（Ｃ’）該（Ｂ’）で測定した活性を、対照群における該因子の活性と比較すること；及び、
（Ｄ’）該（Ｃ’）の結果に基づいて、被験物質の該因子の活性を制御する効果を評価すること、
を含む皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法である。好ましい実施形態において、該ＨＩＦ１αに誘導される因子は、ｅｎｏｌａｓｅ １、ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａ、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ １、ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、及びｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ １からなる群から選択される解糖系酵素の少なくとも１種である。
また、本発明のなお別の実施形態は、上記（Ａ）及び（Ｂ’）〜（Ｄ’）を含む、皮脂分泌制御剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、多毛症予防又は改善剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤の評価又は選択方法である。
本発明の方法において使用される被験物質は、アンドロゲン受容体活性制御剤、皮脂分泌制御剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、多毛症予防又は改善剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。該被験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
本発明の方法で使用される「皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞」としては、哺乳動物から単離された皮脂腺細胞若しくは毛包細胞、又はそれらの培養物が挙げられる。当該皮脂腺細胞若しくは毛包細胞の培養物としては、皮脂腺細胞株、毛包細胞株、皮膚や毛包の組織若しくは器官培養物（単離毛包培養物、器官培養毛包、三次元培養皮膚等）などが挙げられ、好ましくは、確立されたヒト皮脂腺細胞株である。ヒト皮脂腺細胞株の例としては、不死化ヒト由来セボサイト細胞株（例えばＤＳＭ ＡＣＣ２３８３又はＳＺ９５、及びＳＥＢ−１）（特表２００２−５３５９８４号公報、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９９９，１１３：１０１１−１１２０、及びＪ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００３，１２０：９０５−９１４を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
上記皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞が由来する哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サルなどが挙げられ、ヒトが好ましいが、これらに限定されない。
本発明の方法においては、上記皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に低酸素条件下で被験物質を適用する。その具体的な手順の例としては：被験物質を予め添加した培地に該細胞を播種し、低酸素条件下で培養する；該細胞を低酸素条件下で培養している培地に被験物質を添加し、さらに低酸素条件下で培養する；該細胞を通常酸素濃度下で培養している培地に被験物質を添加した後、低酸素条件下でさらに培養する、などを挙げることができる。該細胞が器官培養又は組織培養の細胞である場合、被験物質を、培地に添加する代わりに、該器官や組織に直接投与してもよい。
本発明の方法においては、上記皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞を低酸素条件下で培養することによって、該細胞におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の発現を誘導する。したがって、本発明における「低酸素条件」とは、細胞におけるＨＩＦ１αの発現を誘導できる酸素濃度条件であればよいが、好ましくは細胞培養雰囲気中の酸素濃度が約５％以下、より好ましくは約０．１％〜約５％の条件である。低酸素条件は、酸素濃度コントローラーを備えた培養器によって達成することができる。このような培養器は公知であり、様々なタイプが市販されている（例えば、ＢＩＯＮＩＸ低酸素培養キット；株式会社スギヤマゲン、アネロパック・ケンキ；三菱ガス化学株式会社）。
次いで、本発明の方法においては、上記皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を測定する。好ましくは、ＨＩＦ１αの活性の測定は、ＨＩＦ１αのＨＲＥへの結合レベル、ＨＩＦ１α遺伝子の発現レベル、又はＨＩＦ１αのタンパク質発現レベルの測定によって行われる。このうち、ＨＲＥへの結合レベルを測定する方法が簡便かつ迅速で好ましい。ＨＩＦ１α誘導性因子の活性の測定は、該因子の遺伝子又はそれにコードされるタンパク質の発現レベルの測定によって行われる。好ましくは、ＨＩＦ１α誘導性因子の活性の測定は、ＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＰＧＫ１、ＧＰＩ及びＨＫ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベル、又はこれらの遺伝子にコードされる酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素の発現若しくは酵素活性のレベルの測定によって行われる。
ＨＲＥへのＨＩＦ１α結合活性レベルの測定は、当該分野で公知の方法に従って行えばよい。例えば、ＨＲＥの下流にマーカー遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を作動可能に連結したものを導入した細胞における当該マーカー遺伝子の発現（例えば、ルシフェラーゼ活性）を測定すればよい。ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の発現量は、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の遺伝子の発現量又はタンパク質の発現量を測定することにより求めることができる。ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の遺伝子の発現量は、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量することにより測定することができる。ｍＲＮＡの定量は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、あるいはノーザンブロット解析法によって行うことができる。ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子のタンパク質発現量の測定は、通常の免疫測定法、例えばＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ法、プロテオーム、ウェスタンブロットなどにより行うことができる。このうち、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法が安価かつ簡便である。
本発明の方法において、測定対象の皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞（試験群）におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性は、対照群における活性と比較される。対照群としては、試験群と同じ皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞であって、被験物質に接触させなかったものが挙げられる。対照群におけるＨＩＦ１α活性又はＨＩＦ１α誘導性因子の発現量の測定手順は上述したとおりである。
上記比較の結果、対照群と比べて、試験群でのＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性が増加又は減少していれば、上記被験物質は、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を制御する効果があると評価される。
例えば、対照群と比べて、試験群でのＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性が減少していれば、上記被験物質は、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を減少させる効果があると評価される。好ましい実施形態において、試験群におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性が、対照群におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性に対して統計学的に有意に減少していた場合には、被験物質は、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を減少させる効果があると評価される。別の好ましい実施形態において、対照群におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を１００％としたときに、試験群におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８５％以下、さらに好ましくは８０％以下であれば、被験物質は、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を減少する効果があると評価される。
一方、対照群と比べて、試験群でのＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性が増加していれば、上記被験物質は、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を増加させる効果があると評価される。好ましい実施形態において、試験群におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性が、対照群におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性に対して統計学的に有意に増加していた場合には、被験物質は、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を増加させる効果があると評価される。別の好ましい実施形態において、対照群におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を１００％としたときに、試験群におけるＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性が１０５％以上、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１１５％以上、さらに好ましくは１２０％以上である場合に、被験物質は、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を増加する効果があると評価される。
上記評価の結果、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を制御する効果があると評価された被験物質は、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤として選択される。より詳細には、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を減少させる効果があると評価された被験物質は、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、あるいは多毛症予防又は改善剤として選択される。一方、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を増加させる効果があると評価された被験物質は、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性促進剤、皮脂分泌促進剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤として選択される。
ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の活性を減少させる効果がある物質の例としては、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の遺伝子に対するｓｉＲＮＡなどが挙げられる。したがって、ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制、皮脂分泌抑制、ニキビ予防又は改善、脱毛症予防又は改善、あるいは多毛症予防又は改善のために使用することができる。
本発明による上記ｓｉＲＮＡの使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。治療的使用の例としては、脱毛症又は多毛症に罹患したヒト及び非ヒト哺乳動物に対する使用が挙げられる。非治療使用の例としては、美容目的での皮脂分泌抑制、脂性肌の改善、又はニキビ防止のための使用、ならびに美容目的での頭髪の脱毛防止又は体毛低減のための使用が挙げられる。
したがって、本発明のなお別の実施形態は、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤、皮脂分泌抑制方法剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、あるいは多毛症予防又は改善剤である。
本発明のなお別の実施形態は、対象の皮脂腺細胞又は毛包細胞に、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を投与することを含む、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制方法、皮脂分泌抑制方法、ニキビ予防又は改善方法、脱毛症予防又は改善方法、あるいは多毛症予防又は改善方法である。これらの方法における対象としては、ヒト及び非ヒト哺乳動物が挙げられる。好ましくは、該対象としては、皮脂腺又は毛包選択的なアンドロゲン受容体活性抑制を必要とするかそれを所望する対象が挙げられる。より詳細には、皮脂分泌抑制、ニキビ予防又は改善、脱毛症予防又は改善、あるいは多毛症予防又は改善を必要とするかそれを所望する対象が挙げられる。
上記皮脂分泌抑制方法及びニキビ予防又は改善方法においては、好ましくは、該ｓｉＲＮＡは皮脂腺細胞に投与される。上記脱毛症予防又は改善方法においては、好ましくは、該ｓｉＲＮＡは頭部の毛包細胞に投与される。上記多毛症予防又は改善方法においては、好ましくは、該ｓｉＲＮＡは頭部、又は頭部以外の部位（例えば顔、首、腕、手、脚部、足、体幹など）の毛包細胞に投与される。
好ましい実施形態において、上記ｓｉＲＮＡは、経皮投与されるか、又は皮膚へ局所投与される。
好ましい実施形態において、上記非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラットなどが挙げられる。
ＨＩＦ１α又はＨＩＦ１α誘導性因子の遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、公知のソフトウェア（例えば、ｓｉＤｉｒｅｃｔ）、又は合成受託サービス（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、シグマアルドリッチなどより提供）などを利用して設計又は合成することができる。一般に、ｓｉＲＮＡは、２１〜３０塩基、好ましくは２１〜２５塩基程度の短い二本鎖ＲＮＡ（あるいはＲＮＡ／ＤＮＡ）として設計される。ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有していてもよいが、通常、二本鎖の各３’末端に２塩基程度の突出部（オーバーハング）を有する。突出部位はＴＴとして設計されることが多いが、これに限定されない。
本発明で使用され得るｓｉＲＮＡの好ましい例としては、以下の配列のＲＮＡ及びその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖が挙げられる。これらは、ＨＩＦ１α遺伝子に対するｓｉＲＮＡである。
５’−ＣＣＡＧＣＣＧＣＵＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＵＣＡＵＡＵ−３’（配列番号８）
５’−ＧＧＧＡＵＵＡＡＣＵＣＡＧＵＵＵＧＡＡＣＵＡＡＣＵ−３’（配列番号９）
５’−ＧＡＡＡＵＵＣＣＵＵＵＡＧＡＵＡＧＣＡＡＧＡＣＵＵ−３’（配列番号１０）
配列番号８のＲＮＡは、配列番号１の１２０４〜１２２８番塩基に対応している。配列番号９のＲＮＡは、配列番号１の３６０〜３８４番塩基に対応している。配列番号９のＲＮＡは、配列番号１の７００〜７２４番塩基に対応している。
本発明で使用され得るｓｉＲＮＡのさらなる例としては、配列番号１の１２０４〜１２２８番塩基、配列番号１の３６０〜３８４番塩基、又は配列番号１の７００〜７２４番塩基に特異的に結合するＲＮＡとその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖が挙げられる。当該ｓｉＲＮＡの好ましい例としては、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のＲＮＡのいずれかと９０％以上、好ましくは９５％以上配列同一なＲＮＡとその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖が挙げられる。
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の物質、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞以下を含む皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法。
（Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；
（Ｂ）該細胞におけるＨＩＦ１αの活性を測定すること；
（Ｃ）該（Ｂ）で測定した活性を、対照群におけるＨＩＦ１αの活性と比較すること；及び、
（Ｄ）該（Ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＨＩＦ１αの活性を制御する効果を評価すること
＜２＞好ましくは、さらに以下：
（Ｅ）上記（Ｄ）にてＨＩＦ１αの活性を減少させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、あるいは多毛症予防又は改善剤として選択すること、
を含む、＜１＞記載の方法。
＜３＞好ましくは、さらに以下：
（Ｅ）上記（Ｄ）にてＨＩＦ１αの活性を増加させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性促進剤、皮脂分泌促進剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤として選択すること、
を含む、＜１＞記載の方法。
＜４＞以下を含む、皮脂分泌制御剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、多毛症予防又は改善剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤の評価又は選択方法。
（Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；
（Ｂ）該細胞におけるＨＩＦ１αの活性を測定すること；
（Ｃ）該（Ｂ）で測定した活性を、対照群におけるＨＩＦ１αの活性と比較すること；及び、
（Ｄ）該（Ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＨＩＦ１αの活性を制御する効果を評価すること
＜５＞好ましくは、さらに以下：
（Ｅ）上記（Ｄ）にてＨＩＦ１αの活性を減少させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂分泌抑制剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、あるいは多毛症予防又は改善剤として選択すること、
を含む、＜４＞記載の方法。
＜６＞好ましくは、さらに以下：
（Ｅ）上記（Ｄ）にてＨＩＦ１αの活性を増加させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂分泌促進剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤として選択すること、
を含む、＜４＞記載の方法。
＜７＞好ましくは、上記皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞がヒト由来の細胞である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜８＞好ましくは、上記皮脂腺由来細胞が確立されたヒト皮脂腺細胞株である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞上記低酸素条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が、好ましくは約５％以下、より好ましくは約０．１％〜約５％の条件である、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞好ましくは、上記ＨＩＦ１αの活性の測定が、Ｈｙｐｏｘｉａ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＥｌｅｍｅｎｔへのＨＩＦ１αの結合レベルの測定である、＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞好ましくは、上記ＨＩＦ１αの活性の測定が、ＨＩＦ１α遺伝子の発現レベル又はＨＩＦ１αのタンパク質発現レベルの測定である、＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞好ましくは、上記ＨＩＦ１α遺伝子が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、＜１１＞記載の方法。
＜１３＞好ましくは、上記ＨＩＦ１αが、配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
＜１４＞好ましくは、上記（Ｂ）で測定した活性が、上記対照群における活性に対して統計学的に有意に減少していた場合に、上記被験物質はＨＩＦ１αの活性を減少させる効果があると評価される、＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞好ましくは、上記（Ｂ）で測定した活性が、上記対照群における活性に対して統計学的に有意に増加していた場合に、上記被験物質はＨＩＦ１αの活性を増加させる効果があると評価される、＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１６＞好ましくは、上記対照群におけるＨＩＦ１αの活性を１００％としたときに、上記（Ｂ）で測定した活性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８５％以下、さらに好ましくは８０％以下である場合に、上記被験物質はＨＩＦ１αの活性を減少する効果があると評価される、＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞好ましくは、上記対照群におけるＨＩＦ１αの活性を１００％としたときに、上記（Ｂ）で測定した活性が１０５％以上、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１１５％以上、さらに好ましくは１２０％以上である場合に、上記被験物質はＨＩＦ１αの活性を増加する効果があると評価される、＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１８＞以下を含む皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法。
（Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；
（Ｂ’）該細胞におけるＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を測定すること；
（Ｃ’）該（Ｂ’）で測定した活性を、対照群における該因子の活性と比較すること；及び、
（Ｄ’）該（Ｃ’）の結果に基づいて、被験物質の該因子の活性を制御する効果を評価すること
＜１９＞好ましくは、さらに以下：
（Ｅ’）上記（Ｄ’）にてＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を減少させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、あるいは多毛症予防又は改善剤として選択すること、
を含む、＜１８＞記載の方法。
＜２０＞好ましくは、さらに以下：
（Ｅ’）上記（Ｄ’）にてＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を増加させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性促進剤、皮脂分泌促進剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤として選択すること、
を含む、＜１８＞記載の方法。
＜２１＞以下を含む、皮脂分泌制御剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、多毛症予防又は改善剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤の評価又は選択方法。
（Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；
（Ｂ’）該細胞におけるＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を測定すること；
（Ｃ’）該（Ｂ’）で測定した活性を、対照群における該因子の活性と比較すること；及び、
（Ｄ’）該（Ｃ’）の結果に基づいて、被験物質の該因子の活性を制御する効果を評価すること
＜２２＞好ましくは、さらに以下：
（Ｅ’）上記（Ｄ’）にてＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を減少させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂分泌抑制剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、あるいは多毛症予防又は改善剤として選択すること、
を含む、＜２１＞記載の方法。
＜２３＞好ましくは、さらに以下：
（Ｅ’）上記（Ｄ’）にてＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を増加させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂分泌促進剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤として選択すること、
を含む、＜２１＞記載の方法。
＜２４＞好ましくは、上記皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞がヒト由来の細胞である、＜１８＞〜＜２３＞のいずれか１項記載の方法。
＜２５＞好ましくは、上記皮脂腺由来細胞が確立されたヒト皮脂腺細胞株である、＜１８＞〜＜２３＞のいずれか１項記載の方法。
＜２６＞上記低酸素条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が、好ましくは約５％以下、より好ましくは約０．１％〜約５％の条件である、＜１８＞〜＜２５＞のいずれか１項記載の方法。
＜２７＞上記ＨＩＦ１αに誘導される因子の活性の測定が、
好ましくは、ＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＰＧＫ１、ＧＰＩ、及びＨＫ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベル、又は該遺伝子にコードされる酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素の発現レベル、又は該遺伝子にコードされる酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素の酵素活性レベルの測定である、＜１８＞〜＜２６＞のいずれか１項記載の方法。
＜２８＞好ましくは、
上記ＥＮＯ１遺伝子が、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、
上記ＬＤＨＡ遺伝子が、配列番号４で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、
上記ＰＧＫ１遺伝子が、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、
上記ＧＰＩ遺伝子が、配列番号６で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、
上記ＨＫ１遺伝子が、配列番号７で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、
＜２７＞記載の方法。
＜２９＞好ましくは、上記（Ｂ’）で測定した活性が、上記対照群における活性に対して統計学的に有意に減少していた場合に、上記被験物質はＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を減少させる効果があると評価される、＜１８＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の方法。
＜３０＞好ましくは、上記（Ｂ’）で測定した活性が、上記対照群における活性に対して統計学的に有意に増加していた場合に、上記被験物質はＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を増加させる効果があると評価される、＜１８＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の方法。
＜３１＞好ましくは、上記対照群におけるＨＩＦ１αの活性を１００％としたときに、上記（Ｂ’）で測定した活性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８５％以下、さらに好ましくは８０％以下である場合に、上記被験物質はＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を減少する効果があると評価される、＜１８＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の方法。
＜３２＞好ましくは、上記対照群におけるＨＩＦ１αの活性を１００％としたときに、上記（Ｂ’）で測定した活性が１０５％以上、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１１５％以上、さらに好ましくは１２０％以上である場合に、上記被験物質はＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を増加する効果があると評価される、＜１８＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の方法。
＜３３＞ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤。
＜３４＞ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、皮脂分泌抑制剤。
＜３５＞ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、ニキビ予防又は改善剤。
＜３６＞ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、脱毛症予防又は改善剤。
＜３７＞ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、多毛症予防又は改善剤。
＜３８＞皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤の製造のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜３９＞皮脂分泌抑制剤の製造のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜４０＞ニキビ予防又は改善剤の製造のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜４１＞脱毛症予防又は改善剤の製造のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜４２＞多毛症予防又は改善剤の製造のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜４３＞皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜４４＞皮脂分泌抑制のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜４５＞ニキビ予防又は改善のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜４６＞脱毛症予防又は改善のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜４７＞多毛症予防又は改善のための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜４８＞上記＜４３＞〜＜４７＞のいずれか１項において、好ましくは、上記使用は非治療的使用である。
＜４９＞皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制に使用するための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種。
＜５０＞皮脂分泌抑制に使用するための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種。
＜５１＞ニキビ予防又は改善に使用するための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種。
＜５２＞脱毛症予防又は改善に使用するための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種。
＜５３＞多毛症予防又は改善に使用するための、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種。
＜５４＞対象の皮脂腺細胞又は毛包細胞に、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を投与することを含む、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制方法。
＜５５＞対象の皮脂腺細胞に、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を投与することを含む、皮脂分泌抑制方法。
＜５６＞対象の皮脂腺細胞に、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を投与することを含む、ニキビ予防又は改善方法。
＜５７＞対象の頭部の毛包細胞に、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を投与することを含む、脱毛症予防又は改善方法。
＜５８＞対象の毛包細胞に、ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を投与することを含む、多毛症予防又は改善方法。
＜５９＞好ましくは、上記対象がヒト又は非ヒト哺乳動物である、＜５４＞〜＜５８＞のいずれか１項記載の方法。
＜６０＞好ましくは、上記投与が経皮投与又は皮膚への局所投与である、＜５４＞〜＜５９＞のいずれか１項記載の方法。
＜６１＞上記＜３３＞〜＜６０＞のいずれか１項において、好ましくは、
上記ＨＩＦ１α遺伝子が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、
上記ＥＮＯ１遺伝子が、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、
上記ＬＤＨＡ遺伝子が、配列番号４で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、
上記ＰＧＫ１遺伝子が、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、
上記ＧＰＩ遺伝子が、配列番号６で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、
上記ＨＫ１遺伝子が、配列番号７で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。
＜６２＞上記＜３３＞〜＜６１＞のいずれか１項において、好ましくは、上記ｓｉＲＮＡは、
配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のＲＮＡ及びその相補鎖からなる、二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖であるか、あるいは、
配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のＲＮＡのいずれかと９０％以上、好ましくは９５％以上配列同一なＲＮＡ及びその相補鎖からなる、二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖である。
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
＜方法＞
参考例１．細胞
ヒト皮脂腺細胞株（ＳＺ９５）は、１０％ＦＢＳ、５ｎｇ/ｍＬ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒを含むＳｅｂｏｍｅｄTM ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）中で培養した。ヒト前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。通常酸素濃度下での培養は、大気中（酸素濃度２０．９％）で行った。低酸素条件下での培養は、アネロパック・ケンキ５％（三菱ガス化学株式会社）、及び角型ジャー（株式会社スギヤマゲン）を用いて、酸素濃度０．１％、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で培養した。ＳＺ９５は、Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｐｒｏｆ．ｈ．ｃ．Ｄｒ．ｈ．ｃ．Ｃｈｒｉｓｔｏｓ Ｃ．Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓより供与された。ＬＮＣａＰはＡＴＣＣより購入した。
参考例２．プラスミドＤＮＡの作製
（１）アンドロゲン受容体遺伝子
ヒトアンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｓｅｐｔｏｒ；ＡＲ）をコードする遺伝子のＯｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｌａｍｅ（ＯＲＦ）領域を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ ｂｉｏ）を用いてＰＣＲで増幅し、次いでＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いてＥｃｏＲＩで処理したｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。目的のプラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌から、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１−ＡＲと名付けた。
（２）解糖系酵素遺伝子
解糖系に関わる酵素ｅｎｏｌａｓｅ １、ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａ、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ １、ａｌｄｏｌａｓｅ Ａ、Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ １、ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、及びＴｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅをコードする遺伝子（それぞれ、ＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１、ＡＬＤＯＡ、ＨＫ１、ＧＰＩ及びＴＰＩ）のＯｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｌａｍｅ（ＯＲＦ）領域を、（１）と同様の手順でｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。目的のプラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌から、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
（３）ＨＩＦ１α活性マーカー遺伝子
ＨＩＦ１α活性測定用のプラスミドＤＮＡであるｐＧＬ４．４２（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＨＲＥの制御下でホタルルシフェラーゼを発現する。ｐＧＬ４．４２中でホタルルシフェラーゼ遺伝子の下流に存在するＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｅｎｈａｎｃｅ／ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒとｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子をＳａｌ１とＢａｍＨ１で切り出し、そこに、ＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒと連結したＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて挿入した。目的のプラスミドＤＮＡが形質転換された大腸菌から、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドＤＮＡをｐＧＬ４．４２（Ｒｌｕｃ）と名付けた。
参考例３．ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲ
細胞から、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いて、添付のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成には、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。リアルタイムＰＣＲでは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。定量した発現量はＲＰＬＰ０の発現量で補正した。
参考例４．ＨＩＦ１α免疫組織化学染色
免疫組織化学染色に用いる組織標本は、凍結切片を作製した後、−２０℃で冷やしたアセトン中で１０分間固定した。その後、ヒストファインキット（ニチレイ）を用いて、添付のプロトコールに従い染色を実施した。抗ＨＩＦ１α抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）は、１／３００に希釈して使用した。発色にはＤＡＢ溶液（１ｍＭ ＤＡＢ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．６）、０．００６％過酸化水素）を用い、カウンター染色にはヘマトキシリン溶液を用いた。組織標本におけるＨＩＦ１αの発現強度を半定量的に解析するために、顕微鏡下でＨＩＦ１α陽性（茶色で染色された細胞）及び陰性（紫色で染色された細胞）の細胞数をカウントした。ＨＩＦ１α陽性／陰性の評価対象とした細胞は、皮脂腺、毛包、卵巣及び精巣におけるＡＲ陽性細胞である、皮脂腺構成細胞、毛包構成細胞、卵巣の卵胞細胞、及び精巣の精細管構成細胞とした。
実施例１．皮脂腺におけるＨＩＦ１αの発現
皮脂腺及び毛包（３５歳男性１名）、精巣組織（３３歳男性１名）、ならびに卵巣組織（３０歳女性１名）の標本を調製した。各組織標本のＨＩＦ１α免疫組織化学染色の結果、皮脂腺及び毛包では、精巣及び卵巣と比較して、ＨＩＦ１αの発現（陽性率）が顕著に高いことが判明した（表１）。
実施例２．解糖系酵素の発現がＡＲ活性に及ぼす影響
Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ ＆ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１２３：５８−６４，２０１１）に記載の手順に従って、ＡＲを過剰発現する細胞を作製し、そのＡＲ活性に対する解糖系酵素発現の影響を調べた。
ＳＺ９５細胞を９６−ｗｅｌｌプレートに播種し、５％チャコール処理血清を含むＳｅｂｏｍｅｄTM ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）に置換した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＡＲの結合配列（ＭＭＴＶ）を含むｐＧＬ４．３６（Ｐｒｏｍｅｇａ）から、薬剤耐性遺伝子Ｈｙｇｒｏを制限酵素で除去し、そこにＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子をクローニングした。上記ＳＺ９５細胞に、該改変ｐＧＬ４．３６と、参考例２（１）で作製したｐｃＤＮＡ３．１−ＡＲと、参考例２（２）で作製した各種解糖系酵素のいずれかのＯＲＦがｐｃＤＮＡ３．１に組み込まれたプラスミドＤＮＡとを、ＶｉａＦｅｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製品添付のプロトコールに従い導入した。コントロールとしては、ｐｃＤＮＡ３．１のマルチプルクローニングサイトに何の配列も含まないプラスミドＤＮＡを導入した。導入から２４時間後に、ＤＨＴ（ジヒドロテストステロン；終濃度１ｎＭ）を含む培地に置換して６時間培養した後、細胞のＡＲ活性を測定した。ＡＲ活性の測定では、細胞のホタルルシフェラーゼ（ＡＲのＭＭＴＶを介した転写活性化の指標）及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（プラスミド導入効率の指標）の発光強度を、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて添付のプロトコールに従って測定した。ホタルルシフェラーゼの発光強度をＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発光強度で除した値を、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）として算出した。コントロールのＲＬＵ値に対する相対ＲＬＵ値を、各細胞のＡＲ活性として取得した。
結果を図１及び表２に示す。コントロールプラスミドを導入した細胞と比較して、ＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＰＧＫ１、ＧＰＩ又はＨＫ１を過剰発現させた細胞では有意にＡＲ活性が上昇した。これまでに解糖系の酵素がＡＲ活性を制御することは報告されておらず、今回初めて皮脂腺細胞においていくつかの解糖系酵素群がＡＲ活性を制御することが明らかにされた。
実施例３．解糖系酵素群の発現に対するＨＩＦ１αの影響
皮脂腺細胞におけるＨＩＦ１αを介した解糖系酵素群発現制御の可能性を検討した。
ＳＺ９５細胞を９６−ｗｅｌｌプレートに播種し、５％チャコール処理血清を含む培地に置換した。該細胞に、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉTM ｓｈｉＲＮＡ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ、１２９３５−４００と１２９３５−２００、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＨＩＦ１αのｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ Ｓｅｌｅｃｔ ＲＮＡｉTM ｓｈｉＲＮＡ、ＨＳＳ１０４７７４とＨＳＳ１０４７７５とＨＳＳ１７９２３１、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製品添付のプロトコールに従い導入した。該細胞を、低酸素条件下（酸素濃度約０．１％）で２４時間培養した。参考例３の手順に従って、細胞からＲＮＡを回収し、実施例２でＡＲ活性を向上させた遺伝子であるＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＰＧＫ１、ＧＰＩ及びＨＫ１の発現をリアルタイムＰＣＲで定量した。
結果を図２及び表３に示す。ＨＩＦ１αの発現を抑制することで、ＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＰＧＫ１、ＧＰＩ及びＨＫ１の発現は有意に減少した。
実施例４．皮脂腺細胞におけるＡＲ活性に対するＨＩＦ１αの影響
ＳＺ９５細胞を９６−ｗｅｌｌプレートに播種し、５％チャコール処理血清を含む培地に置換した。該細胞に、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ又はＨＩＦ１αのｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製品添付のプロトコールに従い導入した。細胞を２４時間培養した後に、参考例２（１）で作製したｐｃＤＮＡ３．１−ＡＲ、及び実施例２で用いたものと同じＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子をクローニングした改変ｐＧＬ４．３６を、ＶｉａＦｅｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製品添付のプロトコールに従い導入した。２４時間後、細胞をＤＨＴ（終濃度０．１、１、１０ｎＭ）を含む培地に置換し、低酸素条件下（酸素濃度０．１％）において培養した。コントロールとしては、１００％エタノールを含む培地に置換し、低酸素条件下（酸素濃度０．１％）において培養した。２４時間後、実施例２と同様の手順でＲｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）を算出し、各細胞のＡＲ活性として取得した。
結果を図３及び表４に示す。ＨＩＦ１αの発現を抑制した細胞では、０．１〜１０ｎＭのＤＨＴ濃度全てにおいて、ＡＲ活性が有意に低下した。
比較例１．前立腺癌細胞におけるＡＲ活性に対するＨＩＦ１αの影響
前立腺癌細胞ＬＮＣａＰでは、０．１ｎＭ以下の低ＤＨＴ濃度域でＨＩＦ１αがＡＲの活性を制御することが報告されている（Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ ＆ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１２３：５８−６４，２０１１）。しかしながら、通常の生体内におけるＤＨＴ及びテストステロンは、より高濃度で存在すると考えられる（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，１９９４，７９：７０３−７０６；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，１９９８，８３：２２６６−２２７４）。本発明者らは、高ＤＨＴ濃度下のＬＮＣａＰにおけるＨＩＦ１αのＡＲ活性に対する寄与を解析するため、実施例４と同様の実験を行った。その結果、ＬＮＣａＰでは過去の報告同様に、０．１ｎＭのＤＨＴ濃度ではＨＩＦ１αの発現抑制によりＡＲ活性が有意に低下したが、１〜１０ｎＭのＤＨＴ濃度域ではＨＩＦ１αの発現抑制による有意なＡＲ活性の変化は確認されなかった（図４及び表５）。これらの結果より、皮脂腺細胞に発現するＨＩＦ１αは、前立腺癌細胞と比較して広範囲なＤＨＴ濃度域でＡＲ活性を制御することが明らかとなった。一方、通常のＤＨＴ濃度域下では、ＨＩＦ１αは前立腺癌のＡＲ活性を制御しないことが示唆された。
実施例５．皮脂腺細胞におけるＨＩＦ１α活性に対するレチノイン酸の影響
皮脂腺細胞にニキビの改善薬として知られているレチノイン酸（Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１０７：５８３―５９０，１９８２）を添加し、ＨＩＦ１α活性に対する影響を調べた。
ＳＺ９５細胞に、参考例２（３）で作製したＨＩＦ１α活性測定用のプラスミドＤＮＡｐＧＬ４．４２（Ｒｌｕｃ）を導入した。２４時間後、培地にレチノイン酸を添加し、低酸素条件下での培養を実施した。コントロールとしては、１００％エタノール溶媒を添加した培地を使用した。１５時間後、実施例２と同様の手順でＲｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）を算出し、細胞のＨＩＦ１αの活性として取得した。
結果を図５及び表６に示す。コントロールの細胞と比較して、レチノイン酸を添加した細胞においては濃度依存的にＨＩＦ１αの活性が抑制された。

Claims (18)

  1. 以下を含む皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法。
    （Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；
    （Ｂ）該細胞におけるＨＩＦ１αの活性を測定すること；
    （Ｃ）該（Ｂ）で測定した活性を、対照群におけるＨＩＦ１αの活性と比較すること；及び、
    （Ｄ）該（Ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＨＩＦ１αの活性を制御する効果を評価すること
  2. （Ｅ）前記（Ｄ）にてＨＩＦ１αの活性を減少させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、あるいは多毛症予防又は改善剤として選択すること、
    をさらに含む、請求項１記載の方法。
  3. （Ｅ）前記（Ｄ）にてＨＩＦ１αの活性を増加させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性促進剤、皮脂分泌促進剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤として選択すること、
    をさらに含む、請求項１記載の方法。
  4. 前記ＨＩＦ１αの活性の測定が、Ｈｙｐｏｘｉａ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＥｌｅｍｅｎｔへのＨＩＦ１αの結合レベルの測定、ＨＩＦ１α遺伝子の発現レベルの測定、又はＨＩＦ１αのタンパク質発現レベルの測定である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
  5. 前記ＨＩＦ１αが、配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は当該配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
  6. 前記皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞がヒト由来の細胞である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
  7. 前記低酸素条件が、細胞培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
  8. 以下を含む皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法。
    （Ａ）皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞に、低酸素条件下で被験物質を適用すること；
    （Ｂ’）該細胞におけるＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を測定すること；
    （Ｃ’）該（Ｂ’）で測定した活性を、対照群における該因子の活性と比較すること；及び、
    （Ｄ’）該（Ｃ’）の結果に基づいて、被験物質の該因子の活性を制御する効果を評価すること
  9. （Ｅ’）前記（Ｄ’）にてＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を減少させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビ予防又は改善剤、脱毛症予防又は改善剤、あるいは多毛症予防又は改善剤として選択すること、
    をさらに含む、請求項８記載の方法。
  10. （Ｅ’）前記（Ｄ’）にてＨＩＦ１αに誘導される因子の活性を増加させる効果を有すると評価された被験物質を、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性促進剤、皮脂分泌促進剤、あるいは老人性乾皮症予防又は改善剤として選択すること、
    をさらに含む、請求項８記載の方法。
  11. 前記ＨＩＦ１αに誘導される因子の活性の測定が、ＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＰＧＫ１、ＧＰＩ及びＨＫ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベル、又はこれらの遺伝子にコードされる酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素の発現若しくは酵素活性のレベルの測定である、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 前記皮脂腺由来細胞又は毛包由来細胞がヒト由来の細胞である、請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 前記低酸素条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件である、請求項８〜１２のいずれか１項記載の方法。
  14. ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性抑制剤。
  15. ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、皮脂分泌抑制剤。
  16. ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、ニキビ予防又は改善剤。
  17. ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、脱毛症予防又は改善剤。
  18. ＨＩＦ１α遺伝子、ＥＮＯ１遺伝子、ＬＤＨＡ遺伝子、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＰＩ遺伝子及びＨＫ１遺伝子の各々に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、多毛症予防又は改善剤。
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