KR20050014993A

KR20050014993A - ＰＳ２ 돌연변이 유전자 및 ＡＰＰｓｗ 유전자를 발현하는이중 형질전환 치매 마우스

Info

Publication number: KR20050014993A
Application number: KR1020030053437A
Authority: KR
Inventors: 조정식; 김용규; 황대연; 백상기
Original assignee: 식품의약품안전청
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2003-08-01
Publication date: 2005-02-21
Also published as: KR100517831B1

Abstract

본 발명은 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw 유전자를 발현하는 이중 형질전환 치매 마우스에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 뇌특이적 NSE 유전자의 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 인간 유래의 PS2 돌연변이 치매 유발 유전자를 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스와 뇌특이적 NSE 유전자의 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 인간 유래의 APPsw 치매 유발 유전자를 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스를 교배함으로써 생산된 이중 형질전환 치매 마우스에 관한 것이다. 이러한 이중 형질전환 치매 마우스는 상기 두 치매 유전자를 동시에 발현함으로써 인간 치매환자의 치매 증상과 유사한 뇌기능 이상과 아밀로이드 베타-42와 같은 독성 단백질의 발현 증가, MAPK 및 ER의 활성 증가 등의 특성을 나타내는 것으로, 치매 질환의 치료제 또는 치매 질환의 조기 진단법 개발에 매우 유용한 동물 모델로 이용될 수 있다.

Description

ＰＳ２ 돌연변이 유전자 및 ＡＰＰｓｗ 유전자를 발현하는 이중 형질전환 치매 마우스 {Double Transgenic Alzheimer's mice expressing mutant PS2 gene and APPsw gene}

본 발명은 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw 유전자를 발현하는 이중 형질전환 치매 마우스에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 뇌특이적 NSE 유전자의 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 인간 유래의 PS2 돌연변이 치매 유발 유전자를 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스와 뇌특이적 NSE 유전자의 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 인간 유래의 APPsw 치매 유발 유전자를 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스를 교배함으로써 생산된 이중 형질전환 치매 마우스에 관한 것이다.

치매(dementia)는 기억력 장애, 판단력 상실 등 전신기능의 전반적인 장애를 동반하는 질환이다. 치매의 발병 형태는 매우 다양한데, 약 50% 정도는 알츠하이머형 치매(dementia of Alzheimer type), 20∼30%는 혈관성 치매(dementia of Vascular type), 그리고 알코올성 치매, 파킨슨병 치매 등이 있으며, 약 15∼20%는 알츠하이머형과 혈관성 치매 양쪽성으로 발병하는 것으로 알려졌다.

이 중 치매의 가장 중요한 발병 형태인 알츠하이머 질환(Alzheimer disease; AD)은 50세 이전에는 증상이 나타나는 경우가 드물지만 60세 이후로는 발생 빈도가 점진적으로 증가하는 노인성 치매질환으로서, 의학기술의 발전 및 삶의 질 향상으로 인한 노인 인구의 증가에 따라 우리나라뿐만 아니라 전세계적으로 발병 인구가 급속히 증가하고 있는 질환이다. 우리나라에서 1995년 65세 이상으로 등록된 알츠하이머 질환 환자수는 241,000명으로 노인 전체 인구의 8.3%를 차지하고 있으며, 2020년에는 619,000명이 될 것으로 예측된 바 있다[보건사회연구원(1995), 후생일보(제 4763) 1998년 12월 28일]. 알츠하이머 질환은 초기에 진단되는 경우에 한해 제한적으로 치료가 가능하기 때문에 이를 조기에 정확하게 진단할 수 있는 방법과 이의 치료 방법의 개발이 절실히 요구되고 있으나, 이에 대한 발병 원인조차 정확하게 밝혀지지 않고 있는 실정이다.

알츠하이머 질환의 원인은 아직 확실하게 규명되어 있지 않으나 다음 2가지 단백질의 기능이 주목을 받고 있다. 첫째는 아밀로이드 베타-39/43(Amyloidβ-39/ 43, Aβ-39/43)이라고 하는 신경 독성 단백질인데, 이것이 고농도로 농축되어 플라그(plague)를 형성, 뇌의 기억 및 인식을 담당하는 신경세포 부위에 침적되어 뉴런의 DNA에 상해를 일으켜 알츠하이머를 일으킨다는 것이다. 또 하나는 토(tau)라는 실처럼 생긴 가느다란 단백질인데, 이것이 서로 꼬여서 엉킨 모양의 수초(tangle)를 형성하여 단백질이 이상적으로 인산화됨에 따라 뇌신경 세포의 사멸이 초래된다는 것이다.

이 중, AD 질환의 핵심 원인 물질로서 최근 주목을 받고 있는 아밀로이드 베타-39/43은 39에서 43개의 아미노산으로 되어 있는데, APP(Amyloid Precursor Protein)의 세포외 도메인(extracellular domain)의 28개 아미노산과 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)의 11∼15개 아미노산으로부터 구성된다. 따라서, Aβ-39/43는 APP 유전자의 프로세싱(processing) 과정에서도 유도되어 형성되는 것이다. 이러한 Aβ-39/43의 형성은 다음의 핵심적인 유전자 및 단백 효소의 기능에 그 원인이 있다. 우선, 조기유발 AD 유전자인 프리세닐린(presenilins) PS1 및 PS2 중에서 PS2 돌연변이(PS2mt, N141Ⅰ의 Volga German Families)에 의해서 Aβ-39/43의 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 또한 APPsw 발현에 의해서 Aβ-39/43의 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다.

이러한 치매의 원인을 밝히고, 치료 물질을 개발하기 위해서는 임상 실험을 하기 전에 실제로 실험을 할 수 있는 치매 동물 모델의 개발이 필수적이다. 이를 위하여, 미국에서 'Tg2575'및 '런던형 마우스'등 2종류의 치매 실험쥐가 개발되어 이용된 바 있으나, 상기 설명한 바와 같이 PS2 돌연변이 유전자 또는 APPsw 유전자 또는 상기 두 유전자가 동시에 삽입되어 치매가 유발된 치매 모델로서의 실험쥐는 아직까지 개발된 바 없다.

상기와 같은 기술현실을 파악하고 알츠하이머 치매 질환의 진단 및 치료를 위한 동물 모델을 개발하기 위하여 연구한 결과, 본 발명자들은 치매 유발 유전자 인 PS2 돌연변이 유전자 또는 APPsw 유전자를 도입시킨 단일 형질전환 치매 마우스를 개발하는 한편, 상기 두 형질전환 치매 마우스를 교배함으로써 상기 두 유전자가 모두 크로모좀 내로 삽입되어 발현되는 이중 형질전환 치매 마우스를 개발할 수 있었다. 즉, 동물 체내에서 발현되어 치매의 원인이 되는 물질의 생성을 증가시키는 PS2 돌연변이 유전자와 APPsw 유전자를 각각 NSE 프로모터 조절 하에 도입함으로써 상기 두 유전자를 각각 발현하는 형질전환 치매 마우스를 제조하고 이를 교배시켜 상기 두 치매 유전자를 동시에 발현하도록 한 이중 형질전환 치매 마우스가 알츠하이머 표현형을 조기에 발현하고 치매 환자에게서 관찰되는 다양한 병리학적 특징을 나타냄을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw 유전자를 동시에 발현하는 이중 형질전환 치매 마우스를 제공하는데 있다.

상기한 본 발명의 특징 및 그 외의 다른 특징들은 후술하는 본 발명의 상세한 설명에 의하여 당업자에게 잘 드러날 수 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뇌특이적 NSE(Neuron-Specific Enolase) 유전자의 프로모터(promoter)에 기능적으로 연결되어 있는 인간 PS2 돌연변이 치매 유발 유전자(hPS2m)를 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스와 뇌특이적 NSE 유전자의 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 인간 유래의 APPsw 치매 유발 유전자를 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스를 교배함으로써 상기 두 유전자를 모두 발현할 수 있는 이중으로 형질전환된 치매 마우스를 제조함을 그 특징으로 한다.

즉, 본 발명은 이중 형질전환 치매 마우스로서 그 크로모좀 내에 PS2 돌연변이 유전자와 APPsw 유전자가 삽입되어 있고 상기 두 유전자는 뇌특이적 NSE 프로모터에 기능적으로 연결되어 있어 상기 두 유전자가 치매를 유발하는 수준으로 발현되고 그 결과 아밀로이드 베타-42 단백질의 발현이 촉진되고 MAPK 및 ER의 활성이 증가되는 치매 모델 동물로서의 이중 형질전환 치매 마우스를 제공함을 그 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

정상인의 뇌에 존재하는 아밀로이드 전구 단백질(Amyloid precursor protein ;APP)은 대개 α-세크리타제(α-secretase)에 의해 대사되어 분비형인 APPs로 대부분 존재하게 된다. 그러나, 알츠하이머 환자의 뇌에서는 베타 또는 감마 세크리타제(β- or γ-secretase)가 활성화되어 APP가 프로세싱(processing)되는 과정에서 39∼43개의 아미노산으로 구성되는 아밀로이드 베타-39/43(Amyloidβ-39/43)가 다량으로 생산되게 된다. 또한 PS2 유전자의 돌연변이에 의헤서도 아밀로이드 베타-42의 생산이 증가되게 된다.

뇌에서 기억과 인식을 담당하는 뉴런에 손상을 입히는 독성 단백질인 아밀로이드 베타-42는 다음과 같은 경로를 통하여 뇌신경세포를 사멸시킨다. 먼저, 뇌세포의 소포체 수용체와 결합하여 신경세포를 죽이는 효소인 캐스파제-3을 활성화시킨다. 즉, 아밀로이드 베타-42가 뇌에 축적되면 그 자체의 독성으로 신경세포가 위축되어 신호를 전달하지 못하고 신호전달 라인들이 잘리는 현상이 발생한다. 또, 세포내에 해로운 유리기 산소를 증가시켜 그 독소로 세포를 죽인다.

이처럼 알츠하이머에 치명적인 아밀로이드 베타-42는 프리세닐린 2 유전자(presenilin2 gene; PS2) 및 아밀로이드 전구 단백질(APP) 유전자의 돌연변이와 밀접한 관계에 있는데, 이들의 돌연변이 유전자는 치매를 일으키는 핵심 원인 유전자로 주목받고 있다.

본 발명에서의 PS2 돌연변이 유전자는 인간 알츠하이머 질환을 일으키는데 관여하는 원인 유전자 중 하나인 프리세닐린 2 돌연변이(mutant presenilin2 gene) 유전자이다. PS2 유전자는 사람의 1번 염색체에 위치하고 있는 유전자로, 이 유전자의 돌연변이체가 유전된 사람들은 보통 65세 이전에 알츠하이머 질환이 진전된다.

본 발명에서의 APPsw 유전자는 인간 알츠하이며 질환을 일으키는데 관여하는 원인 유전자 중 하나이다. APP 유전자는 사람의 21번 염색체에 위치하고 있는 유전자로, 이 유전자의 돌연변이체가 유전된 사람들은 보통 65세 이전에 알츠하이머 질환이 진전된다. APP의 돌연변이 형태로서, 670과 671 위치의 아미노산이 KM에서 AL로 치환된 돌연변이 유전자 형태를 APPsw(APP swedish) 유전자라고 한다.

이러한 PS2 변이 유전자 및 APPsw 유전자는 당업계에 알려져 있는 유전자를 임의로 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들면 Genbank 등의 유전자 정보 기관으로부터 서열에 관한 정보를 쉽게 획득할 수 있다. 이들 유전자는 치매 환자로부터 직접 분리한 것을 이용할 수도 있고, 인공적으로 합성한 것을 이용할 수도 있다.

본 발명에서의 NSE 프로모터는 상기 인간 PS2 변이 유전자 및 APPsw 유전자가 동물 모델 내에서 잘 발현될 수 있도록 조절하기 위한 프로모터로, 상기 유전자들은 NSE 프로모터에 기능적으로 연결된다. NSE 프로모터 서열 역시 당업계에 알려져 있는 유전정보 데이터베이스로부터 쉽게 알 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 인간 PS2 변이 유전자 또는 APPsw 유전자와 NSE 프로모터가 서로 결합된 융합 유전자 NSE/hPS2m 또는 NSE/APPsw를 인간을 제외한 각종 동물에 도입할 수 있다. 이러한 동물로는 마우스(mouse) 또는 랫트(rat) 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니고, 바람직하게는 마우스를 이용하는 것이 좋다.

본 발명에서 융합 유전자 NSE/hPS2m 또는 NSE/APPsw는 당업계에 주지된 각종 형질전환 방법에 따라 동물의 크로모좀 내로 삽입시킬 수 있다. 이러한 형질전환 방법의 예를 들면 동물의 수정란에 융합 유전자를 미세주입하는 방법 또는 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 또는 상기 재조합 융합 유전자를 수컷 실험쥐의 정자핵에 주입한 다음 이를 암컷 실험쥐의 난자핵과 결합시켜 수정란을 만든 뒤 이를 다른 대리모 실험쥐에 착상시키는 방법을 이용할 수도 있다. 그러나, 실험을 하는 조작자의 안전성의 측면에서 융합 유전자를 수정란에 미세주입하는 방법이 보다 바람직하다.

본 발명의 하기 참조예에서는 상기와 같은 치매 유발 유전자인 재조합 융합 유전자 NSE/hPS2m 또는 NSE/APPsw를 BDF1 마우스의 수정란에 미세주입하고, 이와 같이 유전자가 주입된 수정란을 ICR 마우스로 이식하여 각각 단일 형질전환 치매 마우스 새끼를 생산하였다.

그 다음, 상기와 같이 생산된 단일 형질전환 치매 마우스를 서로 교배함으로써 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw 유전자가 NSE 프로모터 조절 하에서 크로모좀 내로 동시에 삽입되어 발현되는 이중 형질전환 치매 마우스를 생산하였다.

상기와 같이 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw 유전자가 동시에 삽입되어 발현되는 이중 형질전환 치매 마우스는 PS2 변이 유전자 및 APPsw 유전자가 NSE 프로모터에 의하여 모두 발현됨으로써 알츠하이머로 인한 다양한 병리현상을 모두 나타내는 치매 유발 마우스 모델이다. 즉, 알츠하이머의 표현형(phenotype)을 측정하여 상기 제조된 PS2 변이 유전자를 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스, APPsw 유전자를 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스 또는 형질전환시키지 않은 정상의 마우스와 비교한 결과, 치매 환자에게서 특징적으로 나타나는 병리현상으로 아밀로이드 베타-42 생성 증가가 확인되었고, 수중 미로 검사(Water Maze Test)를 통하여 뇌기능에도 이상이 있음이 확인되었으며, 또한 MAPK의 활성이 증가하고 ER의 발현이 증가하는 것이 확인되었다. 이를 통하여, 본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스는 치매 환자와 매우 유사한 행동 장애 및 생리학적 특성을 나타내고, 특히 이러한 특성은 상기 두 치매 유발 유전자중 하나의 유전자만을 포함하고 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스에 비하여 더욱 명확한 것임을 알 수 있다.

본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스는 치매 환자가 나타내는 것과 유사한 행동이상을 나타내며, 아밀로이드 베타-42 단백질 뿐 아니라, MAPK의 활성화 및 ER의 발현 증가까지 관찰되는 등 거의 완벽한 치매 증상을 보이는 것이 특징이다. 따라서, 상기와 같은 치매 관련성 물질의 발현 증가와 같은 표현 형질을 이용하는 경우 치매 발병 매커니즘의 연구에 매우 유용하게 이용할 수 있으며, 특히 치매의 치료제 또는 조기 진단법의 개발 등에 유용하게 이용될 수 있다. 현재 국내·외에서 개발되었거나 개발 중인 치매 치료제를 투여하여 인체와 유사한 조건하에서 나타나는 다양한 치매 치료 효과, 즉 아밀로이드 베타-42 축적의 억제, 치매로 인한 행동 이상의 완화, MAPK의 활성의 저해, ER의 발현 저하를 확인함으로써 치매 치료제의 치매 치료 효과를 검정할 수 있으며, 또한 치매 질환의 원인을 연구하는 동물 모델로도 사용 가능하다.

이하, 본 발명의 구성을 제조예 및 시험예를 들어 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 한정하는 것은 아니다.

〔참고예 1〕PS2 돌연변이 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스의 제조

① 유전자의 확보 및 재조합

본 실험에 사용된 유전자 중 NSE 프로모터는 Sutcliffe 박사(Research Institute of Scrippe Clinic)로부터, PS2 돌연변이 유전자 hPS2m(N141I)은 미국 컬럼비아 대학의 김태완 교수로부터 기증받아 사용하였다.

유전자의 재조합은 NSE 프로모터, PS2 유전자, 종결인자의 순서대로 결합하여 사용하였다. PS2 돌연변이 유전자(Levy-Lahad E, Wasco W, Poorkaj P, Romano DM, Oshima J, Pettingell WH, Yu CE, Jondro PD, Schmidt SD, Wang K, et al. (1995) Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimer's disease locus. Science 269(5226):973-977; Gene Bank Accession Number: NM_012486)는 pUHD10-3벡터로부터 제한효소 EcoRI/XbaI으로 절단하여 EcoRI/SpeI으로 절단한 pTet-Splice벡터에 먼저 삽입한 다음, Tet 프로모터를 XhoI/EcoRI으로 절단하여 제거한 후 SalI/EcoRI으로 절단된 NSE 프로모터를 삽입하여 융합 유전자 NSE/PS2m을 완성하였다.

② 융합 유전자의 순수분리 및 마우스 수정란에 미세주입

재조합 융합 유전자(recombinant fusion gene) NSE/PS2m를 순수분리하기 위하여 박테리아에서 기원된 유전자 부위를 절단하여 제거하고, 진핵세포 발현 부위만을 수확하여 물에 녹여 사용하였다. 순수분리된 상기 융합 유전자를 4ng/㎕의 농도로 희석하여 마우스(BDF1)의 수정란에 미세주입하였다. 상기 유전자가 주입된 수정란을 가임신한 ICR 마우스에 착상시켜 PS2 돌연변이 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스를 생산하였다.

PS2 돌연변이 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스는 상기와 같은 방법에 따라 제조하거나 또는 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁번호 KCTC 10420BP로 기탁된 수정란으로부터 제조할 수도 있다.

〔참조예 2〕APPsw 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스의 제조

① 유전자의 확보 및 재조합

본 실험에 사용된 유전자 중 NSE 프로모터는 Sutcliffe 박사(Research Institute of Scrippe Clinic)로부터, APPsw 유전자는 미국 컬럼비아 대학의 김태완 교수로부터 기증받아 사용하였다.

유전자의 재조합은 NSE 프로모터, APPsw 유전자, 종결인자의 순서대로 결합하여 사용하였다. APPsw 유전자(Martin C, Tilman O, Christian H, Lisa M, Albert YH, Peter S, Carmen VP, Ivan L, Dennis JS (1992) Mutation of the ??-amyloid precursor protein in familial Alzheimer's disease increases ??-protein production. Nature 360:672-674; Gen Bank Acession Number:Y00264)를 이 유전자에 대하여 특이적인 프라이머(sense:5'-TCTAG ATCGC GATGC TGC-3', antisense:5'-GTCTA GAGTC TAGTT CTGCA-3')를 이용하여 PCR 증폭한 후 TA 벡터에 클로닝하고 XbaI/SpeI로 절단하여 XhoI/EcoRI으로 절단된 pNSE-splice 벡터에 삽입하여 융합 유전자 NSE/APPsw를 완성하였다.

② 융합 유전자의 순수분리 및 마우스 수정란에 미세주입

재조합 융합 유전자(recombinant fusion gene) NSE/APPsw를 순수분리하기 위하여 박테리아에서 기원된 유전자 부위를 절단하여 제거하고, 진핵세포 발현 부위만을 수확하여 물에 녹여 사용하였다. 순수분리된 상기 융합 유전자 NSE/APPsw를 4ng/㎕의 농도로 희석하여 마우스(BDF1)의 수정란에 미세주입하였다. 상기 유전자가 주입된 수정란을 가임신한 ICR 마우스에 착상시켜 APPsw 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스를 생산하였다.

APPsw 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스는 상기와 같은 방법에 따라 제조하거나 또는 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁번호 KCTC 10448BP로 기탁된 수정란으로부터 제조할 수도 있다.

〔제조예 1〕PS2 돌연변이 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스와 APPsw 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스의 교배에 따른 이중 형질전환 치매 마우스의 제조

① 상기 참조예 1 및 2를 통하여 제조한 PS2 돌연변이 형질전환 마우스와 APPsw 형질전환 마우스를 교배하여 산자를 생산하였다.

② 형질전환 마우스의 확인

상기를 통하여 생산된 새끼의 꼬리를 절단하여 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리한 후, 상기 각각의 재조합 유전자에 특이적인 프라이머(Gibco BRL Co. 제작의뢰)를 이용하여 DNA-PCR을 수행하고, 서던 블랏 하이브리디제이션(Southern blot hybridization)을 실시하여 APPsw 유전자 및 PS2 돌연변이 유전자의 삽입을 확인하였다.

상기 재조합 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 서열은 하기와 같다.

APPsw 유전자 특이적 프라이머

sense : 5'-TCGCG ATGCT GC-3'

antisense : 5'-CTCTT CTCAC TGCAT GTCTC-3'

PS2 돌연변이 유전자 특이적 프라이머

sense : 5'-GAGGA AGAAG TGTGT GATGA G-3'

antisense : 5'-CACGA TGACG CTGAT CATGA TG-3'

삽입된 PS2 트랜스 유전자를 서던 블랏 분석으로 검출 및 확인하기 위하여, PS2 산자의 꼬리 게놈 DNA를 EcoRI으로 절단하여 나이트로셀룰로스 막에 전이한 다음 PS2 특이적인 DNA 프로브를 ³²P로 라벨링하여 교잡시켜 특이적인 밴드를 X-레이 필름에 감광시켜 관찰하였다.

또한 APPsw 트랜스 유전자를 서던 블랏 분석으로 검출 및 확인하기 위하여, APPsw 산자의 꼬리 게놈 DNA를 BamHⅠ으로 절단하여 나이트로셀룰로스 막에 전이한 다음 APPsw 특이적인 DNA 프로브를 ³²P로 라벨링하여 교잡시켜 특이적인 밴드를 X-레이 필름에 감광시켜 관찰하였다.

이때, 람다 DNA를 HindⅢ/HaeⅢ으로 절단하여 생기는 알려진 크기의 5.2, 6.2 및 7.1 kb 절편을 블랏의 오른쪽에 나타낸 다음 이것에 대한 상대적 위치를 계산하여 절편의 사이즈를 측정하였다. 3일 동안 -70℃에서 방사선 조사하여 특이적 하이브리디제이션 시그널(specific hybridization signal)을 시각화하였다. 수컷과 암컷을 모두 나타내었다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 생산된 산자는 이중형질전환 마우스 25%, APPsw 형질전환 마우스 25%, PS2 형질전환 마우스 25%, 정상 마우스 25%의 비율로 생산되었다.

도 1의 결과에서도 알 수 있는 바와 같이, hPS2m 및 APPsw 유전자는 NSE 유전자 프로모터의 조절 하에 위치한다. 또한, pNSE-hPS2m로부터 유래한 442bp의 산물과 pNSE-APPsw로부터 유래한 509bp의 산물이 확인되었다(도 1B). 즉, 생산된 쥐의 꼬리 DNA로부터 442bp의 PS2 돌연변이 유전자 산물 및 509bp의 APPsw 유전자 산물을 확인할 수 있다.

이상에서와 같이, NSE/PS2m 융합 유전자를 마우스의 진핵세포 발현 부위로 삽입시켜 형질전환시킴으로써 PS2 돌연변이 유전자를 발현하는 형질전환 마우스 및 NSE/APPsw 융합 유전자를 마우스의 진핵세포 발현 부위로 삽입시켜 형질전환시킴으로써 APPsw 유전자를 발현하는 형질전환 마우스의 교배를 통하여 생산된 이중 형질전환 치매 마우스의 수정란, 즉 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw가 크로모좀 내로 삽입된 이중 형질전환 치매 마우스의 수정란을 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 7월 4일자로 기탁하였으며, 그로부터 기탁번호 KCTC 10495BP를 부여받았다.

〔시험예 1〕이중 형질전환 치매 마우스의 각 조직에서의 PS2m 및 APPsw 유전자의 발현 확인

상기 이중 형질전환 치매 마우스로부터 각 조직을 분리하여 PS2m 및 APPsw 유전자가 조직 특이적으로 발현되는가를 확인하였다. 이를 위하여, 상기 이중 형질전환 치매 마우스의 뇌, 폐, 심장, 간, 신장, 소장, 근육 조직을 이용하여 랫트 NSE 프로모터 조절하의 PS2m 및 APPsw 유전자의 조직별 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 대조군으로서의 β-액틴 시그널 및 그들의 전사체(transcript, 640 bp)를 RNA의 로딩을 보이기 위하여 나타내었다. 다양한 조직에서의 전사체 및 단백질 수준은 Kodak Electrophoresis Documentation 및 Analysis System 120에 의하여 정량화하였다(도2C).

그 결과를 도 2에 나타내었다. PS2m 트랜스유전자의 전사체(도2A) 및 단백질 (도2B) 수준이 폐, 신장 및 근육에서 높게 발현된 데 비하여, APPsw 트랜스유전자의 전사체 및 단백질 수준은 뇌에서 높게 발현되어 뇌-특이적 방식에 의하여 조절됨을 알 수 있다.

〔시험예 2〕뇌 기능이상의 측정

상기 이중 형질전환 치매 마우스가 단일 치매 유전자를 가진 마우스, 즉NSE/APPsw 형질전환 치매 마우스 및 NSE/hPS2m 형질전환 치매 마우스와 비교했을 때 뇌 기능에 이상이 있는지의 여부를 확인하기 위해 수중 미로 검사(Water Maze Test)를 실시하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3A 및 3D, 3B, 3C는 각각 수중 미로에서 전방 플랫폼 위치를 가로지르는 도피 지연(escape latency), 도피 거리(escape distance) 및 수영 속도(swimming velocity)의 패턴을 측정한 결과이다[water maze subjects로 수행된 3회 실험의 메디안 지수(median values) 및 SD는 n=3, P<0.01이다]. 8월령의 NSE-PS2/APPsw 이중 형질전환 치매 마우스는 NSE/PS2 및 NSE/APPsm 단일 형질전환 치매 마우스에 비하여 더욱 긴 도피 지연 및 도피 거리를 갖는 일관적인 경향을 나타내었다.

한편, 수영 속도에 있어서는 8월령의 NSE-PS2/APPsw 이중 형질전환 치매 마우스의 수영 속도가 5월령, 6월령 및 7월령의 치매 마우스의 그것에 비하여 약간 더 늦는 것으로 관찰되었다.

상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, NSE-PS2/APPsw 이중 형질전환 치매 마우스는 뇌 기능의 이상으로 인하여 조기에 행동 이상이 나타남을 확인하였다.

〔시험예 3〕이중 형질전환 치매 마우스의 뇌에서의 A??-42 침적 확인

본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스의 뇌에서 치매의 원인이 되는 독성 단백질인 아밀로이드β-42의 침적이 증가하였는가를 도트 블랏(dot blot)과 면역염색으로 확인하였다.

본 발명 이중 형질전환 치매 마우스, NSE/PS2 및 NSE/APPsw 단일 형질전환 치매 마우스 및 대조군 마우스의 뇌로부터 분리한 단백질 40 ㎍을 전이시킨 니트로셀룰로스 필터를 항-인간 Aβ-42 항체와 함께 배양하였다. Aβ-42의 상대적 수준을 획득하기 위한 사진농도측정(densitometry)에 의하여 그 밴드를 정량화하였다. 그 결과를 도 4A에 나타내었다. 또한, Aβ-42의 면역화학 염색(immunochemical staining)을 위하여, 상기 각 마우스로부터 절단한 20 ㎛-두께의 뇌 절편을 항 인간 Aβ-42 일차 항체 및 HRP-컨쥬게이티드 거트 항-래빗 IgG와 함께 배양하였다. 그 결과 조직을 현미경(microscope)으로 관찰하여 도 4B에 나타내었다.

8월령의 이중 형질전환 치매 마우스의 피질부(cortex)와 해마(hippocampus) 에서 Aβ-42 축적의 광범위한 분포 및 축적을 확인할 수 있었다.

〔시험예 4〕이중 형질전환 치매 마우스의 MAPK 활성의 측정

본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스, NSE/PS2 및 NSE/APPsw 단일 형질전환 치매 마우스 및 대조군 마우스에서의 MARK군에 속하는 세 물질 JNK, p38 및 ERK의 활성화를 웨스턴 블럿으로 측정하였다. 이들은 신경 세포의 사멸(neuronal cell death)을 초래하는 것으로 알려져 있다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도5A 및 B는 각각 JNK 및 c-Jun의 활성화 측정 결과이다. 맨 위의 결과는 인(phopho)-JNK 및 인(phospho)-c-Jun에 대항하는 시료당 10㎍의 단백질을 처리한 것이다. 총 JNK 단백질은 그들의 인산화 상태와 무관하게 이들을 인식하는 항체들을 사용하여 측정하였다. 도5C는 p38의 활성화 측정 결과이다. 맨 위의 결과는 인(phospho)-p38에 대한 항체와 함께 배양된 40㎍의 단백질을 처리한 것이다. 아래의 결과는 비교적 일정한 수준을 보이는 총 p38을 나타낸다. 도5D는 ERK 활성화 측정 결과이다. 밴드의 정량화는 MAPK 군의 각각의 활성을 나타내는 것이다. 웨스턴 블럿에 의하여 각 군당 세 개의 시료를 분석하였다(p<0.05).

〔시험예 5〕이중 형질전환 치매 마우스의 ER의 특성

치매환자에서 ER이 증가한다는 연구보고가 있어 ER의 발현을 이중 치매 마우스의 뇌에서 측정한 결과, NSE/PS2 및 NSE/APPsw 단일 형질전환 치매 마우스보다 조기에 발현되는 것이 밝혀졌으며 8월령의 이중 형질전환 치매 마우스에서 ERα 및 ERβ가 현저히 증가하는 것으로 나타났다.

상기 각 마우스의 뇌로부터 단백질을 추출한 다음 항-ERα 및 항-ERβ 항체와 함께 배양하였다. NSE/PS2 및 NSE/APPsw 단일 형질전환 치매 마우스에서의 단백질 수준의 증가는 대조군 마우스의 그것과 비슷하였으나 본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스의 뇌에서의 ERα 및 ERβ 유전자는 매우 높게 발현되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 뇌특이적 NSE 유전자의 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 인간 유래의 PS2 돌연변이 치매 유발 유전자를 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스와 뇌특이적 NSE 유전자의 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 인간 유래의 APPsw 치매 유발 유전자를 발현하는 단일 형질전환 치매 마우스를 교배함으로써 생산된 이중 형질전환 치매 마우스는 상기 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw 유전자가 모두 크로모좀 내에 삽입된 것으로 이를 발현함에 따라 치매 환자의 행동이상을 그대로 나타내며 특히 아밀로이드 베타-42 단백질의 발현 증가, MAPK의 활성 증가 및 ER의 발현 증가 등이 관찰되는 등 거의 완벽한 치매증상을 보이는 뛰어난 효과가 있으므로, 치매 치료제 또는 조기 진단법의 개발 등에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1A는 PS2 돌연변이 유전자가 삽입된 pNSE-hPS2m의 구조 및 APPsw 유전자가 삽입된 pNSE-hAPPsw의 구조이고, 1B는 본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스에서 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw의 삽입을 확인하기 위한 서던 블럿(Southern blot) 실시 결과이다.

도 2는 본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스에서의 PS2m 및 APPsw 유전자의 조직-특이적 발현을 확인한 결과이다.

도 3은 본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스 및 NSE/PS2 및 NSE/APPsw 단일 형질전환 치매 마우스의 수중 미로 검사(Water Maze Tests) 결과이다.

도 4는 본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스의 뇌 조직에서의 아밀로이드 베타-42(Amyloidβ-42)의 침적을 도트 블랏 및 면역염색법으로 확인한 결과이다.

도 5는 본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스, NSE/PS2 및 NSE/APPsw 단일 형질전환 치매 마우스 및 대조군 마우스에서의 MAPK 군에 속하는 세 물질의 활성을 측정한 결과이다.

도 6은 본 발명에 따른 이중 형질전환 치매 마우스, NSE/PS2 및 NSE/APPsw 단일 형질전환 치매 마우스 및 대조군 마우스의 8월령에서의 ERα 및 ERβ의 발현을 측정한 결과이다.

Claims

염색체 안에 인간 유래의 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw 유전자가 삽입되어 있고, 상기 두 유전자는 NSE 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 이중 형질전환된 비인간 동물.
제 1항에 있어서, 상기 이중 형질전환된 비인간 동물은 상기 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw 유전자가 발현되어 치매가 유발된 것을 특징으로 하는 이중 형질전환된 비인간 동물.
제 2항에 있어서, 상기 이중 형질전환된 비인간 동물은 상기 PS2 돌연변이 유전자 및 APPsw 유전자가 발현되어 아밀로이드 베타-42의 발현이 증가하거나 MAPK 활성이 증가하거나 또는 ER의 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 이중 형질전환된 비인간 동물.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비인간 동물은 마우스 (mouse)인 것을 특징으로 하는 이중 형질전환된 비인간 동물.
염색체 안에 인간 유래의 PS2 돌연변이 유전자가 삽입되어 있고 상기 PS2 돌연변이 유전자는 NSE 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 단일 형질전환 마우스 (A)와, 염색체 안에 인간 유래의 APPsw 유전자가 삽입되어 있고 상기 APPsw 유전자는 NSE 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 단일 형질전환 마우스 (B)를 교배하여 생산한 것임을 특징으로 하는 이중 형질전환 치매 마우스.
제 5항에 있어서, 상기 단일 형질전환 치매 마우스 (A)는 기탁번호 KCTC 10420BP으로부터 발생한 것이고 (B)는 기탁번호 KCTC 10448BP의 수정란으로부터 발생한 것임을 특징으로 하는 이중 형질전환 치매 마우스.
제 5항에 있어서, 상기 이중 형질전환 치매 마우스는 기탁번호 KCTC 10495BP의 수정란으로부터 발생한 것임을 특징으로 하는 이중 형질전환 치매 마우스.