KR100635878B1 - ｈＮＣＴｍ 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 유래의 hNCTm 치매 유발 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 335 및 338 아미노산이 Asp에서 Ala로, Tyr에서 Ala로 각각 치환된 사람 니카스트린 돌연변이(nicastrin; hNCTm) 유전자에 뇌특이적 NSE 유전자의 프로모터를 연결시켜 제조한 융합 유전자를 마우스의 수정란에 미세주입한 후, 이 수정란을 대리모 마우스의 난관에 이식하여 생산하는 형질전환 치매 마우스에 관한 것이다.
본 발명에 의한 형질전환 치매 마우스는 인간 치매환자의 치매 증상과 유사한 뇌기능 이상, 아밀로이드 β-42의 증가, β-세크리타제의 활성화 및 APP 프로세싱의 이상 발현이 나타나는 것으로서, 치매 질환의 치료제 또는 치매 질환의 조기 진단법 개발에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
치매 * 알츠하이머 질환 * 형질전환 마우스 * APPsw * 아밀로이드 β-42 * 콕스-2 * 캐스파아제-3
Description
도 1A는 본 발명에 따른 hNCTm 유전자를 NSE 프로모토에 연결시킨 NSE/hNCTm의 융합 유전자를 보여준다. 여기에서, 재조합 융합 유전자 NSE/hNCTm 플라스미드의 구조를 나타내는데 돌연변이가 일어난 부분의 염기서열(GCCGCC)을 돌연변이가 없는 야생형 NCT(GACTAC)와 비교해서 나타내었다.
도 1B는 본 발명에 따른 hNCTm 유전자가 삽입된 형질전환 마우스에서의 hNCTm 유전자의 삽입을 PCR법으로 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 hNCTm 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스 및 age-matched 대조군 마우스의 수중 미로 검사(Water Maze Tests) 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 hNCTm 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스 뇌 조직에서의 NCT 발현, 아밀로이드 β-42(Amyloid β-42)의 침적 및 APP 프로세싱의 이상발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과(A) 및 β-세크리타제 활성증가를 확인한 결과이다(B).
본 발명은 인간 유래의 hNCTm 치매 유발 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 335 및 338 아미노산이 Asp에서 Ala로, Tyr에서 Ala로 각각 치환된 사람 니카스트린 돌연변이(nicastrin; hNCTm) 유전자에 뇌특이적 NSE 유전자의 프로모터를 연결시켜 제조한 융합 유전자를 마우스의 수정란에 미세주입한 후, 이 수정란을 대리모 마우스의 난관에 이식하여 생산하는 형질전환 치매 마우스에 관한 것이다.
치매(dementia)는 기억력 장애, 판단력 상실 등 전신기능의 전반적인 장애를 동반하는 질환이다. 치매의 발병 형태는 매우 다양한데, 약 50% 정도는 알츠하이머형 치매(dementia of Alzheimer type), 20∼30%는 혈관성 치매(dementia of Vascular type)이고, 알코올성 치매 및 파킨슨병 치매 등이 있으며, 약 15∼20%는 알츠하이머형 및 혈관성 치매 양쪽성으로 발병하는 것으로 알려져 있다.
이 중 치매의 가장 중요한 발병 형태인 알츠하이머 질환(Alzheimer disease; AD)은 50세 이전에는 증상이 나타나는 경우가 드물지만 60세 이후로는 발생 빈도가 점진적으로 증가하는 노인성 치매질환으로서, 의학기술의 발전 및 삶의 질 향상으로 인한 노인 인구의 증가에 따라 우리나라뿐만 아니라 전세계적으로 발병 인구가 급속히 증가하고 있는 질환이다. 우리나라에서 1995년 65세 이상으로 등록된 알츠하이머 질환 환자수는 241,000명으로 노인 전체 인구의 8.3%를 차지하고 있으며, 2020년에는 619,000명이 될 것으로 예측된 바 있다[보건사회연구원(1995), 후생일보(제 4763) 1998년 12월 28일]. 알츠하이머 질환은 초기에 진단되는 경우에 한해 서만 제한적으로 치료가 가능하기 때문에 이를 조기에 정확하게 진단할 수 있는 방법 및 치료 방법의 개발이 절실히 요구되고 있으나, 이에 대한 발병원인조차 정확하게 밝혀지지 않은 실정이다.
알츠하이머 질환의 원인은 아직 확실하게 규명되어 있지 않으나 다음 2가지 단백질의 기능이 주목을 받고 있다. 첫째는 아밀로이드 β-39/43(Amyloid β-39/ 43)이라고 하는 신경 독성 단백질인데, 이것이 고농도로 농축되어 플라그(plague)를 형성, 뇌의 기억 및 인식을 담당하는 신경세포 부위에 침적되어 뉴런의 DNA에 상해를 일으켜 알츠하이머를 일으킨다는 것이다. 또 하나는 토(tau)라는 실처럼 생긴 가느다란 단백질인데, 이것이 서로 꼬여서 엉킨 모양의 수초(tangle)를 형성하여 단백질이 이상적으로 과인산화됨에 따라 뇌신경 세포의 사멸이 초래된다는 것이다.
이 중, AD 질환의 핵심 원인 물질로서 최근 주목을 받고 있는 아밀로이드 β-39/43은 39∼43개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 보다 상세하게는 APP(Amyloid Precursor Protein) 세포외 도메인(extracellular domain)의 28개 아미노산 및 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)의 11∼15개 아미노산으로 구성된다. 따라서, 아밀로이드 β-39/43은 APP 유전자의 프로세싱(processing) 과정에서도 유도되어 형성된다. 이러한 아밀로이드 β-39/43의 형성은 다음의 핵심적인 유전자 및 단백 효소의 기능에 그 원인이 있다. 우선, 아밀로이드 β-39/43의 생성이 증가를 좌우하는 것이 β-세크리타제인데 이 효소를 구성하고 있는 NCT에 의해서 이 효소의 활성이 증가한다.
이러한 치매의 원인을 밝히고, 치료 물질을 개발하기 위해서는 임상실험을 하기 전에 실제로 실험을 할 수 있는 치매 동물 모델의 개발이 필수적이다. 이를 위하여, 미국에서 'Tg2575' 및 '런던형 마우스' 등 2종류의 치매 실험쥐가 개발되어 이용된 바 있으나, 상기 설명한 바와 같은 NSE 조절하의 hNCTm 유전자가 삽입되어 치매가 유발된 치매 실험쥐는 아직까지 개발된 바 없다.
상기와 같은 기술현실을 파악하고 알츠하이머 치매 질환의 진단 및 치료를 위한 동물 모델을 개발하기 위하여 연구한 결과, 본 발명자들은 치매 유발 유전자 인 hNCTm 유전자를 각각 도입시킨 형질전환 치매 마우스를 개발할 수 있었다. 즉, 동물 체내에서 발현되어 치매의 원인이 되는 독성 단백질 중 하나인 아밀로이드 β-42의 생성을 증가시키는 hNCTm 유전자를 각각 NSE 프로모터 조절 하에서 결합시키고 이러한 융합 유전자를 마우스의 수정란에 주입시킨 수정란을 착상시켜 생산한 형질전환 치매 마우스가 치매 환자에게서 관찰되는 다양한 병리학적 특징을 나타냄을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 NSE/hNCTm 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스를 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 특징 및 그 외의 다른 특징들은 후술하는 본 발명의 상세한 설명에 의하여 당업자에게 잘 드러날 수 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뇌특이적 NSE(Neuron-Specific Enolase) 유전자의 뇌특이적 프로모터(promoter)와 hNCTm 치매 유전자를 각각 연결시켜 융합 유전자 NSE/hNCTm를 제조한 다음, 융합 유전자를 마우스의 수정란에 미세주입하고, 이 수정란을 대리모 마우스의 난관에 이식함으로써 형질전환된 치매 마우스를 제조함을 그 특징으로 한다.
본 발명은 형질전환 치매 마우스로서, 그의 크로모좀 내의 hNCTm 유전자가 삽입되어 있고, 이 유전자는 뇌특이적 NSE 프로모터에 기능적으로 연결되어 있어, 상기 hNCTm 유전자가 치매를 유발하는 수준으로 발현되어, 그 결과 아밀로이드 β-42 및 행동이상이 이상발현되고, β-세크리타제 및 APP 프로세싱 이상발현 하는 치매 모델 동물로서의 형질전환 치매 마우스를 제공함을 그 특징으로 한다.
정상인의 뇌에 존재하는 아밀로이드 전구 단백질(Amyloid precursor protein ;APP)은 대개 α-세크리타제(α-secretase)에 의해 대사되어 분비형인 sAPPα로 대부분 존재하게 되나, 알츠하이머 환자의 뇌에서는 β- 또는 β-세크리타제(β- or β-secretase)가 활성화되어 APP가 프로세싱(processing)되는 과정에서 39∼43개의 아미노산으로 구성되는 아밀로이드 β-42가 다량으로 생산된다. 알츠하이머 질환은 이렇게 생성된 아밀로이드 β-42가 뇌 영역 중 기억 또는 인식을 담당하는 뉴런에 고농도로 장기간 축적되면서 이들이 단백질 플라크(plaque) 덩어리를 형성하고 DNA에 상해를 일으킴으로써 발생하는 것으로 알려져 있다. 알츠하이머 환자의 뇌에 서는 hNCTm 유전자에 의하여 생산이 증가된 아밀로이드 β-42에 의하여 행동이상이 촉진되고, β-세크리타제의 발현이 증가할 뿐만 아니라 APP 프로세싱의 이상을 초래한다. 아밀로이드 β-42는 뇌에서 기억과 인식을 담당하는 뉴런에 손상을 입히는 독성 단백질이며 기억장애를 초래한다.
이처럼 알츠하이머에 치명적인 아밀로이드 β-42는 β-세크리타제를 구성하고 있는 NCT의 돌연변이와 밀접한 관계에 있는데, 이 돌연변이 유전자는 치매를 일으키는 핵심 원인 유전자로 주목받고 있다.
본 발명에서의 hNCTm 유전자는 인간 알츠하이머 질환을 일으키는데 관여하는 원인 유전자 중 하나이다. NCT 유전자는 3가지 유형으로 분류하는데, 비당화(unglycosylated)형, 미성숙(immatcure)형, 그리고 성숙형(mature)이 있다. 약 709 아미노산으로 이루어진 트랜스멜브란당단백질(transmembrane glycoprotein)이며 시그날 펩타이드(signal peptide)와 DYIGS를 포함한 소수성도메인(hydrophilic domain)으로 이루어졌다. 이 염기서열은 Genbank 등의 유전자 정보 기관으로부터 서열에 관한 정보를 쉽게 획득할 수 있다. 이와 hNCTm 유전자는 치매 환자로부터 직접 분리한 것을 이용할 수도 있고, 인공적으로 합성한 것을 이용할 수도 있다.
본 발명에서 사용한 NSE 프로모터는 상기 인간 hNCTm 유전자가 동물 모델 내에서 잘 발현될 수 있도록 조절하기 위한 프로모터로서, 상기 hNCTm 유전자는 각각 NSE 프로모터에 기능적으로 연결된다.
본 발명에서는 상기와 같은 hNCTm 유전자와 NSE 프로모터가 서로 결합된 융 합 유전자 NSE/hNCTm를 인간을 제외한 각종 동물에 도입한다. 이러한 동물로는 마우스(mouse) 또는 랫트(rat) 등을 들 수 있으나 랫트는 모델 동물을 만들기 어려우므로 바람직하게는 마우스를 이용하는 것이 좋다.
본 발명에서 hNCTm 유전자 및 NSE 프로모터가 결합된 융합 유전자는 당업계에 주지된 각종 형질전환 방법에 따라 동물의 크로모좀 내로 삽입시킬 수 있다. 이러한 형질전환 방법의 예를 들면, 동물의 수정란에 융합 유전자를 미세주입하는 방법 또는 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 또한 상기 재조합 융합 유전자를 수컷 실험쥐의 정자핵에 주입한 다음 이를 암컷 실험쥐의 난자핵과 결합시켜 수정란을 만든 뒤 이를 다른 대리모 실험쥐에 착상시키는 방법을 이용할 수도 있다. 그러나, 실험을 하는 조작자의 안전성의 측면에서, 융합 유전자를 수정란에 미세주입하는 방법이 가장 바람직하다.
본 발명에 의한 하기 실시예에서는 상기와 같은 치매 유발 유전자인 인간 hNCTm 유전자 및 NSE 프로모터가 결합된 재조합 융합 유전자 NSE/hNCTm를 BDF1 마우스의 수정란에 미세주입하고, 상기 수정란을 ICR 마우스로 이식하여 형질전환 치매 마우스 새끼를 생산하였다.
상기와 같이 hNCTm 유전자와 NSE 프로모터가 기능적으로 결합된 융합 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스는 hNCTm 유전자가 NSE 프로모터에 의하여 발현됨으로써 알츠하이머로 인한 다양한 병리현상을 모두 나타내는 치매 유발 마우스 모델이다. 상기 hNCTm 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스를 각각 번식시켜 알츠하이머의 표현형(phenotype)을 측정한 결과, 치매 환자에게서 특징적으로 나타나 는 병리현상으로 아밀로이드 β-42(Amyloid β-42)의 독성 단백질 및 β-세크리타제 효소의 발현 증가가 확인되었으며, 수중 미로 검사(Water Maze Test)를 통하여 뇌기능에도 이상이 있음을 확인하였다. 이를 통하여, 본 발명에 따른 형질전환 치매 마우스는 치매 환자와 매우 유사한 행동 장애를 보이는 것을 알 수 있었다.
한편, 본 발명에 따른 형질전환 치매 마우스를 정상 마우스와 교배하는 경우, hNCTm 유전자가 그 다음 세대로 전달된다. 즉, 교배에 의하여 상기 hNCTm 유전자는 유전 가능하다.
본 발명에 따른 형질전환 치매 마우스는 치매 환자가 나타내는 것과 유사한 행동이상을 나타내며, 아밀로이드 β-42 단백질뿐만 아니라, β-세크리타제 효소의 발현 증가까지 관찰되는 등 거의 완벽한 치매 증상을 보이는 것이 특징이다. 따라서, 상기와 같은 치매 관련성 물질의 발현 증가와 같은 표현 형질을 이용하는 경우 치매 발병 매커니즘의 연구에 매우 유용하게 이용할 수 있으며, 특히 치매의 치료제 또는 조기 진단법의 개발 등에 유용하게 이용될 수 있다. 현재 국내·외에서 개발되었거나 개발중인 치매 치료제를 투여하여 인체와 유사한 조건 하에서 나타나는 다양한 치매 치료 효과, 즉 아밀로이드 β-42 축적의 억제, 치매로 인한 행동 이상의 완화 및 β-세크리타제 효소 활성의 저하 효과를 확인함으로써 치매 치료제의 치매 치료 효과를 검정할 수 있으며, 또한 치매 질환의 원인을 연구하는 동물 모델로도 사용이 가능하다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예 및 시험예를 들어 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1] hNCTm 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스의 제조
① 유전자의 확보 및 재조합
본 실험에 사용된 유전자 중 NSE 프로모터는 Sutcliffe 박사(Research Institute of Scrippe Clinic)로부터, NCT 유전자는 RT-PCR 방법으로 사람의 세포주에서 얻어 사용하였다.
유전자의 재조합은 NSE 프로모터, hNCTm 유전자 및 종결인자의 순서대로 결합하였으며, hNCTm 유전자는 인간 배아신장 293세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후, 특이적 프라이머[센스:5'-GACTAGTCTCAGCAGAGAGGCAAGATG-3'(서열번호 1), 안티센스:5'-GTCTAGATCAGTTATGACACAGCTCGG-3'(서열번호 2)]를 이용하여 94℃에서 30초간 변성, 62℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 45초간 합성하는 사이클을 28회 수행하여 PCR 증폭한 후, TA 벡터를 XhoI/EcoRI으로 잘려진 pNSE-splice 벡터에 삽입하여 완성하였다.
② 융합 유전자의 순수분리 및 마우스 수정란에 미세주입
재조합 융합 유전자(recombinat fusion gene) NSE/hNCTm을 순수분리하기 위하여 박테리아에서 기원된 유전자 부위를 절단하여 제거하고, 진핵세포 발현 부위만을 수확하여 물에 녹여 사용하였다. 순수분리한 상기 융합 유전자 NSE/hNCTm를 4ng/㎕의 농도로 희석하여 마우스(BDF1)의 수정란에 미세주입하였다. 상기 유전자 가 주입된 수정란을 가임신한 ICR 마우스에 착상시켜 새끼를 생산하였다.
③ 형질전환 마우스의 확인
상기에서 생산된 새끼의 꼬리를 절단하여 genomic DNA를 분리한 후, 상기 재조합 융합 유전자에 특이적인 프라이머[센스:5'-CTGCAGCTCTTGACTCATC-3'(서열번호 3), 안티센스:5'-GGTCAAGGACACTGCAAGACCA-3(서열번호 4)]를 이용하여 94℃에서 30초간 변성, 62℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 45초간 합성하는 사이클을 25회 반복하는 DNA-PCR을 수행하고, 서던 블랏 하이브리드화(Southern blot hybridization)을 실시하여 hNCTm 유전자의 삽입을 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보여지는 바와 같이, 플라스미드 pNSE-hNCTm은 NSE 유전자 프로모터의 조절 하에 위치하고 있는 hNCTm 유전자를 포함하고 있으며, GACTAC가 GCCGCC로 변이되었다(도 1A). 또 DNA-PCR 분석 결과, NSE/hNCTm 트랜스 유전자를 갖는 형질전환 생쥐에서 572bp 크기의 PCR 산물이 확인되었다(도 1B의 #4118 및 #4120).
또한, 상기와 같이 hNCTm 유전자가 확인된 형질전환 마우스를 정상의 마우스와 교배한 결과, 이들 유전자가 후대로 전달됨을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 NSE/hNCTm 융합 유전자를 진핵세포 발현부위로 삽입시켜 형질전환시킨 마우스의 수정란, 즉 NSE/hNCTm 유전자가 크로모좀 내로 삽입된 형질전환 치매 마우스의 수정란을 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2004년 9월 17일자로 기탁하였으며, 그로부터 기탁번호 KCTC 10697BP를 부여받았다.
[시험예 1] 뇌 기능이상의 측정
상기 NSE/hNCTm 형질전환 치매 마우스가 정상적인 쥐와 비교했을 때 뇌 기능에 이상이 있는지의 여부를 확인하기 위해 수중 미로 검사(Water Maze Test)를 실시하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 A 및 D는 수중 미로 검사에서 전방 플랫폼 위치를 가로지르는 도피 지연(escape latency)을 측정한 것이며, 도 2B는 도피 거리(escape distance), 도 2C는 수영 속도(swimming velocity)의 패턴을 측정한 결과이다[평균±3회 실험의 SD, water maze suvjects와 수행된 3회 실험의 메디안 지수(median values) 및 SD는 n=11 P<0.01이다]. 본 발명에 의한 형질전환 치매 마우스의 도피 지연 및 도피 거리는 대조군 마우스에 비하여 더 길게 나타나는 일관적인 경향을 보였다. 그러나, 수영 속도에 있어서는, 형질전환 마우스와 대조군 마우스가 동일한 수준을 보였다.
상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, NSE/hNCTm 형질전환 치매 마우스와 정상 쥐 사이에서 도피 지연 및 도피 거리 측정치의 현저한 차이가 나타났으며, 결과적으로 본 발명에 의한 형질전환 치매 마우스는 뇌 기능의 이상으로 인하여 행동에 이상이 나타남을 확인하였다.
[시험예 2] 형질전환 치매 마우스의 뇌에서의 아밀로이드 β-42 침적 및 β-세크리타제의 고활성 확인
형질전환 마우스의 뇌에서 치매의 원인이 되는 독성 단백질인 아밀로이드 β-42(Amyloid beta-42)의 침적이 증가하였는가를 면역염색으로 확인하였으며(도 3) β-세크리타제 활성도 증가도 확인하였다(도 3B).
형질전환 마우스 및 대조군마우스의 뇌로부터 분리한 단백질 10 ㎍을 전이시킨 니트로셀룰로스 필터를 항-인간 아밀로이드 β-42 항체와 함께 배양하였다. 아밀로이드 β-42의 상대적 수준을 획득하기 위한 사진농도측정(densitometry)에 의하여 그 밴드를 정량화하였다(도 3A). 각각의 수치는 3회 실험 결과를 평균±SD로 나타낸 것이다(P<0.029). 치매환자의 뇌에서는 APP 프로세싱이 이상발현 하는 것으로 알려져 있는데 이에, NSE/hNCTm 형질전환 치매 마우스에서도 APP 프로세싱 이상이 나타나는가를 웨스턴 블랏팅에 의해 확인하였다. 블랏은 설치류 및 인간 C-99를 인식하는 인간 APP-특이적 항체로 면역염색하였다. 약한 고분자량에서 밴드의 C99-βAPP가 hNCTm-형질전환동물의 뇌에서 발현되었다. 또한 β-세크리타제 효소 활성이 치매 환자에서 나타나는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명에 따른 NSE/hNCTm 형질전환 마우스에서도 β-세크리타제의 효소활성이 나타나는가를 알아보기 위하여 형질전환 마우스 및 대조군 마우스를 대상으로 β-세크리타제 효소활성을 측정하였다. 도 3B에서 β-세크리타제 활성화가 관찰되었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 치매 유발 유전자인 hNCTm 유전자와 NSE 프로모터를 결합시킨 융합 유전자를 마우스 수정란에 주입하여 형질전환 치매 마우스를 제조하였으며, 본 발명에 의한 치매 마우스는 hNCTm 유전자가 과다 발현함에 따라 치매 환자의 행동이상을 그대로 나타내었다. 특히, 발명에 의한 치매 마우스는 아밀로이드 β-42 단백질뿐만 아니라, β-세크리타제 효소의 발현 증가 및 APP 프로세싱 이상까지 관찰되는 등 거의 완벽한 치매증상을 보이는 뛰어난 효과가 있으므로, 치매 치료제 또는 조기 진단법의 개발 등에 유용하게 이용될 수 있다.
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- 인간 유래 NCT 돌연변이 유전자(hNCTm)가 NSE 프로모터에 연결된 서열번호 5의 재조합 융합 유전자를 포함하는 마우스 수정란(KCTC 10697BP).
- (1) 인간 유래 NCT 돌연변이 유전자(hNCTm)를 NSE 프로모터에 연결시켜 서열번호 5의 재조합 융합 유전자를 준비하는 단계;(2) 상기 재조합 융합 유전자를 마우스의 수정란에 미세주입하는 단계; 및(3) 상기 재조합 융합 유전자가 주입된 마우스 수정란(KCTC 10697BP)을 대리모 마우스에 착상시켜 새끼를 생산하는 단계;를 포함하는 형질전환 치매 마우스의 제조방법.
- 제 6항의 제조방법에 의하여 제조되고, 인간 유래 NCT 돌연변이 유전자(hNCTm)가 NSE 프로모터에 연결되어 있는 서열번호 5의 재조합 융합 유전자를 가지는 형질전환 치매 마우스.
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